Dissertations / Theses on the topic 'Pectinase enzyme'

O processamento da uva para produção de suco e vinho engloba diferentes processos tecnológicos, como por exemplo, o tratamento enzimático, onde usualmente são utilizadas preparações de enzimas comerciais, buscando-se aprimorar processos como clarificação e extração. Entretanto, esse é um tratamento que demanda elevado tempo de processamento, sendo relevante a busca por novas tecnologias a fim de apurar o processo. O ultrassom pode ser utilizado como uma alternativa para reduzir o tempo de processamento e acrescer qualidade ao produto, pois além de ser uma técnica sustentável, pode proporcionar benefícios no uso combinado com enzimas, favorecendo as reações em decorrência de seus efeitos. Neste trabalho, o uso em conjunto de tratamento enzimático (ET), ultrassom (US), e agitação mecânica (MS) foi avaliado na extração do mosto da uva Cabernet Sauvignon, a fim de compreender os efeitos das técnicas combinadas. Inicialmente, nove preparados enzimáticos comerciais foram caracterizados segundo suas atividades enzimáticas e aplicados para extração do mosto, avaliando a variação de temperatura (40, 50 e 60 °C), tempo (15 e 30 min), e concentração de enzima (0,01 a 2,0 U.g-1). Os melhores resultados foram obtidos com o preparado Zimopec PX5® nas condições de 1,0 U.g-1 de pectinase a 50 °C por 30 min. A extração do mosto apresentou aumento significativo nos parâmetros de qualidade avaliados (cor, sólidos solúveis totais, rendimento de extração, capacidade antioxidante, antocianinas totais) quando os três métodos de extração (US, MS e ET) foram combinados, principalmente na presença do ultrassom. Tendo em vista o efeito sinérgico obtido entre a aplicação enzimática e o ultrassom na extração do mosto, um novo estudo foi conduzido buscando investigar a influência da sonicação na eficiência catalítica das enzimas pectinase (PE), xilanase (XLN) e celulase (CE). Para isso, as atividades enzimáticas foram avaliadas em diferentes pHs e em amostras de enzima e substratos submetidas a um tratamento prévio de sonicação por tempos determinados (0 – 30 min). Os parâmetros cinéticos e termodinâmicos foram estimados, apresentando um efeito positivo do US na atividade das enzimas. A sonicação prévia do substrato contribuiu significativamente para o aumento da atividade de XLN, enquanto a sonicação prévia da enzima melhorou a atividade da CE e PE. Os resultados apresentaram um aumento na velocidade de hidrólise das enzimas com o uso do US, assim como um aumento da eficiência catalítica (Vmax/Km), mostrando o potencial da aplicação do US para ativação das enzimas. De acordo com os resultados obtidos, pode-se afirmar que o ultrassom proporcionou melhorias na extração do mosto, podendo ser utilizado como uma técnica alternativa de processo, bem como apresentou efeitos benéficos sobre as atividades enzimáticas.
Grape processing for juice and wine production encompasses different technological processes, such as enzymatic treatment, that usually uses commercial enzyme preparations to improve clarification and extraction processes. However, this is a treatment that demands high processing time, being relevant the search for new technologies in order to improve the whole process. Ultrasound (US) can be used as an alternative to reduce the processing time and improve the quality of the product, moreover, it can provide benefits in the combined use with enzymes, favoring the enzymatic reactions. In this work, the combined use of enzymatic treatment (ET), ultrasound (US), and mechanical agitation (MS) was studied in order to understand the effects of the techniques on Cabernet Sauvignon must extraction. Initially, nine commercial enzyme preparations were characterized according to their enzymatic activities and applied to must extraction, evaluating temperature (40, 50 and 60 °C), time (15 and 30 min), and enzyme concentration (0.01 to 2.0 Ug-1). The best results were obtained for the preparation Zimopec PX5® under conditions of 1.0 U.g-1 of pectinase at 50 °C for 30 min. A significant increase on quality parameters (color, °Brix, yield, antioxidant capacity, total anthocyanins) was obtained to extraction combining the three methods (US, MS and ET), mainly when US were applied. Based on these previous results, a new study was conducted to investigate the influence of sonication on the catalytic efficiency of the enzymes pectinase (PE), xylanase (XLN) and cellulase (CE). The enzymatic activities were evaluated at different pH and in samples of enzyme and substrates submitted to a previous treatment of sonication by determined times (0 - 30 min). The kinetic and thermodynamic parameters were estimated, showing a positive effect of the ultrasonic treatment on the enzymatic activity. Previous sonication of the substrate contributed significantly to the increase in XLN activity, whereas the previous sonication of the enzyme improved the activity of CE and PE. This research showed the potential benefits of ultrasound treatment on reaction rate and catalytic efficiency (Vmax/Km) improvement of enzymes, attesting that US can be used to increase the catalytic efficiency of pectinase, xylanase and cellulase enzymes. According to the obtained results, it can be affirmed that ultrasound improved the extraction process, and can be applied as an alternative technique, as well as provided beneficial effects on the enzymatic activity.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:24Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-06-11Bitstream added on 2014-06-13T19:56:04Z : No. of bitstreams: 1 pedrolli_db_me_rcla.pdf: 676301 bytes, checksum: a4723de4ae9b6c5b9f1e2619ab7118b5 (MD5)
Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)
O fungo Aspergillus giganteus produz uma única poligalacturonase (PG) quando cultivado em meio líquido com pectina de citrus como única fonte de carbono, e pelo menos três pectina liases (PL) quando cultivado em meio líquido com resíduo de laranja como fonte de carbono. A PG de A. giganteus foi purificada em duas etapas: precipitação de proteínas com 70% de saturação com sulfato de amônio e troca aniônica. A PG purificada apresentou massa molar de 69,7±0,07 kDa. A máxima atividade da enzima foi observada em pH 6,0 a 55-60ºC, sendo essa estável em meio neutro e alcalino. A PG apresentou meias-vidas de 115, 18 e 6 min quando incubada a 40, 50 e 55 ºC, respectivamente. A enzima mostrou-se ativa sobre substratos de qualquer grau de metilação, com maior especificidade para substratos de baixa ou nenhuma metilação, apresentando Vmax 669,6 e 602,8 μmol/mg.min, Km 3,25 e 1,16 mg/mL, kcat 770 e 690 s-1 sobre pectina de citrus 34 % esterificada e ácido poligalacturônico, respectivamente. A PG apresentou atividade exo liberando apenas ácido galacturônico como produto de hidrólise. 2-Mercaptoetanol, DTT, Co2+, Mn2+, Mg2+, NH4 + e Na+ agiram como estimulantes da atividade PG. Já Hg2+, EDTA, citrato de sódio, ácido iodoacético, SDS, Ba2+, Cu2+, Pb2+ e Zn2+ inibiram essa atividade enzimática. A principal pectina liase de A. giganteus, a PL I, foi purificada em três etapas: troca aniônica, troca catiônica e filtração em gel. A massa molar da PL I foi estimada em 55,7±1,4 kDa. A máxima atividade da enzima foi obtida em pH 8,5 a 50ºC. A PL I apresentou meias-vidas de 19, 9 e 6 min a 40, 45 e 50ºC, respectivamente. As maiores atividades da PL I foram observadas em pectinas de citrus com 34 e 72% de metilação, nas quais apresentou Vmax 1.488,1 e 1.129,8 U/mg.min, respectivamente, e Km 4,8 mg/mL para ambos os substratos. O padrão de degradação da pectina...
Aspergillus giganteus produces one polygalacturonase (PG) on liquid medium with citrus pectin as the only carbon source, and at least three pectin lyases (PL) with orange waste. Homogenous PG was obtained after two steps: protein precipitation with 70 % ammonium sulphate saturation and anionexchange chromatography. The purified PG showed molecular weight of 69.7±0,07 kDa. The enzyme exhibited maximal activity at pH 6.0 and 55-60 °C, and was stable in neutral and alkaline medium. The half-live for PG at 40, 50 and 55 °C was 115, 18 and 6 min, respectively. The enzyme was active on substrates with any methyl-esterification degree, and hydrolysed better low esterified and not esterified substrates, showing Vmax 669.6 and 602.8 μmol. mg-1.min-1, Km 3.25 and 1.16 mg/mL, kcat 770 and 690 s-1 on 34 % esterified citrus pectin and polygalacturonic acid, respectively. The unique soluble product released in the reaction with pectin and polygalacturonic acid was monogalacturonic acid, and according to this results the enzyme can be classified as exoPG. PG activity enhanced in presence of 2-mercaptoethanol, DTT, Co2+, Mn2+, Mg2+, NH4 + and Na+, and was completely inhibited in presence of Hg2+. EDTA, sodium citrate, iodoacetic acid, SDS, Ba2+, Cu2+, Pb2+ and Zn2+ inhibited enzyme activity. The main PL from A. giganteus was called PL I and was purified after three steps: anion-exchange and cation-exchange chromatographies, and gel filtration. The purified PL I showed molecular weight of 55.7±1.4 kDa. The enzyme exhibited maximal activity at pH 8.5 and 50 °C, and was stable in neutral and acid medium. The half-live for PL I at 40, 45 and 50 °C was 19, 9 and 6 min, respectively. The enzyme was more active on citrus pectins with 34 and 72% of esterification, showing Vmax 1,488.1 and 1,129.8 U. mg-1.min-1, repectively, and Km 4.8 mg/mL on both substrates. The degradation pathern on 34% esterified...(Complete abstract click electronic access below)

La bactérie phytopathogène Dickeya dadantii est responsable de la pourriture molle de nombreux végétaux. Elle sécrète dans le milieu extérieur toute une batterie d’enzymes capables de dégrader les constituants des parois végétales. La première partie de mon travail concerne les féruloyl estérases FaeD et FaeT. Les féruloyl estérases sont responsables de l’hydrolyse de liaisons ester entre l’acide férulique et les chaînes de xylane ou de pectine. En clivant ces liaisons, elles favorisent une dégradation complète de la paroi végétale. L'importance de ces enzymes nous a conduit à rechercher si D. dadantii produit de telles estérases. Le criblage d’une banque de gènes par un test de détection de l’activité féruloyl estérase a permis d’identifier deux gènes qui ont été caractérisés. Alors que faeT est faiblement transcrit dans toutes les conditions, la transcription de faeD est fortement induite en présence d’acide férulique et contrôlée par le régulateur FaeR. Alors que FaeT est une protéine cytoplasmique, FaeD est sécrétée par le système Out qui permet la sécrétion de nombreuses pectinases. Les enzymes FaeD et FaeT ont été surproduites dans E. coli et leurs principales propriétés biochimiques ont été déterminées. La connaissance de la séquence complète du génome de D. dadantii permet d’aborder des études de génomique fonctionnelle. Cette séquence confirme la présence des gènes codant les pectinases déjà caractérisées et révèle que ce génome code de nouvelles pectinases potentielles. La deuxième partie de mon travail concerne le gène pelN identifié par analyse du génome. Les pectate lyases coupent les liaisons glycosidiques du polygalacturonate par une réaction de β-élimination, générant des produits insaturés. Leur mécanisme d’action nécessite des cations comme cofacteur, en général Ca2+. Après clonage du gène pelN, la protéine PelN a été surproduite dans E. coli. Son activité pectate lyase a été prouvée en montrant sa capacité à produire des dérivés insaturés à partir de polygalacturonate ou de pectines plus ou moins méthylées. Cette étude démontre que PelN est la première pectate lyase utilisant les ions Fe2+ comme cofacteur préférentiel. Chez D. dadantii, l’expression du gène pelN dépend de divers régulateurs affectant la synthèse des pectinases, comme PecS ou GacA. PelN est une protéine extracellulaire sécrétée par le système Out. Ces études contribuent à mieux comprendre le rôle respectif des différentes enzymes impliquées dans la dégradation de la paroi végétale et le fonctionnement coopératif de ce système pluri-enzymatique
The phytopathogenic bacterium Dickeya dadantii is responsible for soft rot diseases of various plants. It secretes in the external medium a large array of enzymes which are able to degrade the constituents of the plant-cell wall. The first part of my work was related to the féruloyl esterases FaeD and FaeT. Feruloyl esterases are responsible for the hydrolysis of ester linkages between ferulic acid and the xylan or pectin chains. By cleaving these linkages, they improve the complete degradation of the plant-cell wall. The importance of these enzymes led us to search whether D. dadantii produces such esterases. A gene bank screening using a specific detection test for the feruloyl esterase activity allowed us to identify two genes which were characterized. While faeT is weakly transcribed in all the conditions, the faeD transcription is strongly induced in the presence of ferulic acid and it is controlled by the regulator FaeR. Whereas FaeT is a cytoplasmic protein, FaeD is secreted by the Out system responsible for the secretion of several pectinases. The enzymes FaeD and FaeT were overproduced in E. coli and their main biochemical properties were determined. The determination of the complete sequence of the D. dadantii genome makes it possible to develop functional genomic studies. This sequence confirms the presence of genes encoding the previously characterized pectinases and it reveals that this genome encodes new potential pectinases. The second part of my work was related to the gene pelN identified by genome analysis. Pectate lyases cleave the glycosidic bounds in the polygalacturonate chain by a β-elimination reaction, generating unsaturated products. This reaction mechanism requires cations as cofactor, generally Ca2+. After cloning of the gene pelN, the protein PelN was overproduced in E. coli. Its pectate lyase activity was demonstrated by its capacity to produce unsaturated derivatives from polygalacturonate or pectins. This study showed that PelN is the first pectate lyase that uses Fe2+ ions as the preferential cofactor. In D. dadantii, the pelN expression depends on various regulators controlling the pectinase synthesis, such as PecS or GacA. PelN is an extracellular protein secreted by the Out system. These studies contribute to increase the knowledge on the respective role of the different enzymes involved in the degradation of the plant-cell wall and the cooperative interactions in this pluri-enzymatic system

Nesse trabalho, isolados fúngicos obtidos de vegetais em decomposição foram testados quanto à sua capacidade de produzir pectinases aplicáveis ao tratamento enzimático de sucos de maçã e de mirtilo. Com base na secreção de endo-poligalacturonase (endo-PG), dois isolados identificados e denominados Aspergillus niger LB23 e Aspergillus fumigatus LB39J foram selecionados para uso em processos em estado sólido e submerso, respectivamente. Os extratos enzimáticos dessas linhagens não apresentam teores de aflatoxinas totais (B1, B2, G1, G2) até um limite de detecção de 2 μg/Kg. A preparação enzimática obtida em cultivo em estado sólido de A. niger LB23 apresentou maiores atividades de endo-PG e exo-poligalacturonase (exo-PG) em pH 4,0, enquanto a reação enzimática com os extratos enzimáticos obtidos em cultivos submersos de A. fumigatus LB39J foram favorecidos em pH entre 4,0 e 5,0, para endo-PG, e 5,0, para exo-PG. Com relação à temperatura de reação da preparação pectinolítica de A. niger LB23, endo e exo-PG mostraram melhores desempenhos nas faixas 40-50°C e 50-60°C, respectivamente. Para as poligalacturonases de A. fumigatus LB39J, definiu-se um intervalo entre 40 e 60°C, para endo-PG, e 60ºC, para exo-PG, como as melhores temperaturas. Quando a estabilidade térmica das poligalacturonases presentes em ambas as preparações foi avaliada, observou-se preservação de cerca de 70% das atividades após 150 minutos de exposição a temperaturas de até 40ºC. Foi avaliada a influência de diferentes concentrações de glicose e pectina sobre os resultados do processo em cultivos em estado sólido com A. niger LB23, sendo observado incremento das atividades de endo e exo-PG em meio com 6% (m/m) de pectina e isento de glicose, atingindo-se 65 unidades por grama de meio seco (U/g) e 198 U/g, respectivamente. Em cultivos submersos com A. fumigatus LB39J, maiores atividades foram obtidas em meio com 20 g/L de pectina e sem glicose: 42 U/mL de endo-PG e 32 U/mL de exo-PG. Nas condições definidas para o processo submerso, foram testados diferentes valores de pH inicial do meio. As máximas atividades foram observadas com pH inicial 3,0 para endo-PG (44 U/mL) e 4,0 para exo-PG (37 U/mL). Adicionalmente, em fermentador de bancada, constatou-se que um valor de pH inicial de 4,0, com o valor mínimo sem controle e, após, com o valor máximo controlado em 3,5, proporcionou as maiores atividades com 81 U/mL de endo-PG e 49 U/mL de exo-PG. Comparando-se os extratos enzimáticos produzidos pelas linhagens selecionadas, verificou-se que as pectinases produzidas por A. niger LB23 foram mais eficientes na hidrólise enzimática das substâncias pécticas presentes nos sucos de maçã e mirtilo, proporcionando, maior redução de turbidez (90 e 40%) e viscosidade (40 e 60%) e aumento na clarificação (90 e 55%). Esses resultados indicam o potencial das pectinases de A. niger LB23 para o tratamento enzimático de sucos de frutas, ressaltando-se que o teor de compostos fenólicos e a capacidade antioxidante dos sucos foram, em sua maior parte, preservados após o tratamento.
Submitted by Marcelo Teixeira (mvteixeira@ucs.br) on 2014-06-02T17:45:32Z No. of bitstreams: 1 Tese Ivana Greice Sandri.pdf: 1824755 bytes, checksum: c0fad543a60bbb77cd7beb3d28893487 (MD5)
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In this work, fungus samples isolated from decomposing vegetables were tested with respect to their capacity of producing pectinases to be applied to the enzymatic treatment of apple and bilberry juices. Taking in account the secretion of endo-polygalacturonase (endo-PG), two isolates which were identified and named Aspergillus niger LB23 e Aspergillus fumigatus LB39J were selected for solid-state and submerged cultivations, respectively. The enzymatic extracts from these strains did not present total aflatoxin (B1, B2, G1, G2) levels up to detection limit of 2 μg/Kg. The enzyme preparation obtained from solid-state cultivation of A. niger LB23 showed the largest activities of both endo-PG and exo-polygalacturonase (exo-PG) at pH 4.0, whereas the reaction with submerged A. fumigatus L39J enzymatic extracts was favoured at pH between 4.0 and 5.0 for endo-PG and 5.0 for exo-PG. With respect to the reaction temperature for A. niger LB23 pectinolytic preparation, endo and exo-PG showed the best performances at the ranges 40-50ºC and 50-60ºC, respectively. For A. fumigatus L39J polygalacturonases, a range from 40 to 60ºC, for endo-PG, and 60ºC, for exo-PG, were defined as the best temperatures. When the thermal stability of polygalacturonases present in both preparations was evaluated, preservation of about 70% of activities was observed after exposing the enzymes to temperatures up to 40ºC for 150 minutes. The influence of different glucose and pectin concentrations on the results of the solid-state process with A. niger LB23 was assessed and an increment in endo and exo-PG activities were observed in medium containing 6% (w/w) of pectin and absence of glucose, with activities of 65 units per gram of dry medium (U/gdm) and 198 U/gdm being achieved. In submerged cultivation of A. fumigatus LB39, highest enzyme activities were obtained in medium with 20 g/L of pectin and without glucose: 42 U/mL for endo-PG and 32 U/mL for exo-PG. In the conditions defined for the submerged process, different medium initial pH values were tested. Maximum activities were observed at initial pH of 3.0 for endo-PG (44 U/mL) and 4.0 for exo-PG (37 U/mL). Furthermore, in bench bioreactor, it was observed that an initial pH of 4.0, with uncontrolled minimum value and, afterwards, maximum value controlled at 3.5 led to the largest enzyme production with 81 U/mL of endo-PG and 49 U/mL of exo-PG. By comparing the enzymatic preparations produced by the selected strains, it was noticed that the pectinase produced by A. niger LB23 were more efficient for the hydrolysis of pectic substances present in both apple and bilberry juices, since it improved reduction of turbidity (90 and 40%) and viscosity (40 and 60%) and increasing clarification (90 and 55%), respectively. These results indicate the potential of A. niger LB23 pectinases for the enzymatic treatment of fruit juices, being remarkable that both the level of phenolic compounds and antioxidant capacity of juices were mostly preserved after treatment.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:54Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-09-22Bitstream added on 2014-06-13T20:24:23Z : No. of bitstreams: 1 silva_d_dr_rcla.pdf: 1167994 bytes, checksum: eca15b5bfad71b8173fe9d808385fd94 (MD5)
Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)
A poligalacturonase (PG) é uma pectinase que degrada a molécula de pectina atuando internamente , ao acaso, liberando oligossacarídeos (Endo-PG) ou por ataque a partir da extremidade não redutora da cadeia, liberando moléculas de ácido galacturônico (Exo-PG). As pectinases, como várias outras enzimas, têm sido obtidas a partir de microrganismos, em processos fermentativos em estado sólido (FES) e fermentação submersa (FSM). A purificação e caracterização destas enzimas podem possibilitar o estudo das diferenças de suas propriedades funcionais, bem como, permitem avaliar suas possibilidades de aplicação, em diferentes condições, em processos industriais. Este trabalho teve por objetivos estudar a produção, purificação e caracterização da PG produzida por Penicillium viridicatum RFC3 através de FES e FSM. Para FSM foram testados os resíduos agroindustriais (farelo de trigo, bagaço de laranja, uma mistura de ambos) a 3% (p/v) além da água amarela (resíduo do processamento da indústria cítrica) no seu estado bruto e com diluições (2, 4 e 10x). Os pHs iniciais foram corrigidos para 4,5, 5 e 5,5 e a fermentação ocorreu por 24 - 96 h. A ANOVA mostrou que o extrato do bagaço de laranja (pH 5,5 e 96 h) foi o melhor meio para a produção da PG em FSM. A purificação da PG produzida em FSM iniciou-se pela ultrafiltração do extrato bruto (membranas de 50 e 10 kDa, repectivamente) seguida pela aplicação da amostra em uma coluna de filtração em gel Sephadex G75 e posterior aplicação em uma Q Sepharose. A fração isolada e desorvida revelou, após 2 eletroforese (PAGE-SDS) a homogeneidade da banda cuja massa molar foi estimada em 92,24 kDa e pI de 5,4. A enzima mostrou ser uma exopoligalacturonase (Exo-PG) com pH e temperatura ótimos em 5,0 e 50-55ºC.
The polygalacturonase (PG) is a pectinase that degrade pectin acting internally, releasing olygossacharide (Endo-PG) or by atack to a non reducing chain extremity, releasing galacturonic acid (Exo-PG). The pectinases, like many others enzymes, have been obtained from microorganisms by solid state fermentation (SSF) and submerged fermentation (SMF). The purification and characterization of these enzymes besides the study of differences of its functional properties permit its application on industrial process, on different conditions. This work aimed the study of production, purification and characterization of PG from Penicillium viridicatum RFC3 by SSF and SMF. In SMF they were assayed agroindustrial wastes (wheat bran, orange bagasse and a mixture of both) at 3% (w/v 1:1) and citric industry liquid waste (yellow water) in crude state and with dilutions (2, 4 and 10x). It was also evaluated the variation of the initial pH of the medium (4.5, 5.0 nd 5.5) and the time of fermentation (24 96 h). The ANOVA test revealed that the culture medium composed by orange bagasse extract, at pH 5.5 and 96 h, was the best condition for production of PG in SMF. The purification process of PG from SMF was carried out by the ultrafiltration of the crude extract (50 and kDa membranes, respectively) and by gel filtration in Sephadex G75 and Q Sepharose columns. The fraction with PG activity show by eletrophoresis (SDSPAGE), an homogeinity of a band with estimated molar mass of 92.24 KDa and pI 5.4. The enzyme revealed to be an Exo-PG with optimal pH and temperature of 5.0 and 50-55 °C. It also revealed to be Ca2+ dependent, which increased its 4 activity and stability. The Km of the enzyme was 1.30 and 1.16 mg/ml on Ca2+ presence. The Vmax was 1.76 and 2.07 ?mol/min/mg when Ca2+ was added. The better fermentation conditions in SSF was wheat bran mixed with orange bagasse (1:1 w/w) at 80% moisture as an culture medium and 336h of fermentation.

No presente trabalho, a produção de pectinases por Aspergillus niger LB-02-SF em estado sólido foi estudada em biorreator de tambor rotativo em escala de bancada. Adicionalmente, a extração e a concentração do extrato enzimático foram avaliadas. Com o extrato concentrado por ultrafiltração, formulações com KCl e glicerol foram testadas quanto à conservação da atividade enzimática e à eficiência no tratamento de sucos de frutas. Com respeito à produção das pectinases em biorreator, os parâmetros de operação avaliados foram: a agitação, a temperatura do cultivo, o volume de ocupação (30, 50 e 70%) e o fluxo específico de ar (0,18, 0,36, 0,54, 0,72 e 0,90 LkgM – litros de ar por kg de meio por minuto). Ensaios sem e com agitação do biorreator (frequência de 1 rpm por 5 minutos, a cada 120 minutos) indicaram que, para o volume de ocupação de 30%, a agitação leva ao aumento do crescimento fúngico e à redução da produção de enzimas, enquanto que com 50% de ocupação, comportamento oposto foi observado. Com 70% de ocupação, não foi observada diferença significativa entre as atividades pectinolíticas obtidas com e sem agitação, sendo que, em ambos os casos, a produção foi prejudicada pela insuficiente aeração do meio. O intervalo entre os eventos de agitação foram avaliados para o volume de ocupação em 70%, não sendo observada diferença significativa na produção de pectinases nos intervalos de 120 minutos (condição padrão) e 90 minutos. Para um intervalo de 60 minutos, a atividade reduziu-se em aproximadamente 58%. Os cultivos com controle de temperatura em 34oC e sem controle indicaram que a produção enzimática foi favorecida com a elevação natural da temperatura do cultivo, um aspecto que pode estar relacionado a uma condição de estresse que levaria à maior produção enzimática. Fluxos específicos de ar entre 0,18 e 0,90 LkgM foram testados em ensaios com 30 e 50% de volume de ocupação do biorreator. Maior crescimento fúngico foi atingido quando o biorreator foi carregado com menor volume de ocupação. Com o fluxo intermediário de 0,54 LkgM, as maiores atividades enzimáticas para ambos os volumes de ocupação foram atingidas; porém, a ocupação de 50% do volume resultou na maior atividade pectinolítica, 178,2 U/g, com uma atividade de 133,4 U/g sendo medida com 30% de ocupação. No estudo sobre a extração de pectinases do meio sólido, com água pH 4, sob agitação de 200 rpm, foi observado que tempos entre 15 e 120 minutos apresentaram resultados similares. Os resultados atingidos apontam que para maior produção enzimática o biorreator deve ser operado com 50% de ocupação, fluxo específico de ar de 0,54 LkgM e intervalos entre as agitações de 120 minutos. Temperaturas de extração de 20, 30 e 40oC não influenciaram na extração de proteínas, porém a atividade de pectinases foi reduzida em 40% a 40oC, possivelmente em razão da termoestabilidade da enzima. Entre as razões de extração sólido / líquido avaliadas, o valor de 1/10 foi a que resultou na maior atividade enzimática solubilizada, sendo recuperados 81% da atividade pectinolítica presente no meio. Nos ensaios de concentração, a ultrafiltração do extrato concentrado sem qualquer tratamento prévio resultou em recuperação de 59% das enzimas e em fluxo final de permeado da ordem de 11 L/m2/h. Por outro lado, o protocolo de operação que incluía o uso de carvão ativado e microfiltração, apresentou recuperação de enzimas de 74% e fluxo final de permeado de 24 L/m2/h, demonstrando a importância dos pré-tratamentos na ultrafiltração. Previamente à preparação das formulações enzimáticas, um volume de 30 L de extrato bruto foi concentrado 103 vezes por ultrafiltração, com recuperação enzimática de 69%, e um extrato com 663 U/mL foi obtido. Este extrato concentrado foi formulado com 20, 30, 40 e 50% (m/m) de glicerol e 2% (m/m) de KCl e avaliado, por 59 semanas, quanto à conservação da atividade a 5°C. Ao final do período de teste, a amostra controle (sem aditivos) teve queda de 25% da atividade além de apresentar contaminação microbiana, enquanto as formulações mantiveram a atividade em torno de 100% durante todo o experimento. A formulação com 50% de glicerol foi utilizada na maceração de uva bordô e na despectinização de sucos de maçã, uva rosada e amora, demonstrando comportamento similar aos encontrados com as preparações comerciais Novozym 33095 e Pectinex Ultra SP-L utilizadas como referência.
Submitted by Ana Guimarães Pereira (agpereir@ucs.br) on 2015-06-12T13:40:01Z No. of bitstreams: 1 Tese Patricia Poletto.pdf: 3241164 bytes, checksum: 9357cad3cf87872921762739e3076144 (MD5)
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Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior.
In the present work, the production of pectinases by Aspergillus niger LB-02-SF in solid-state cultivation was studied using a rotating drum bench bioreactor. Furthermore, extraction and concentration of enzymes by ultrafiltration were evaluated. Formulations with the concentrated extract, KCl and glycerol were assayed with respect to the maintenance of activity level and the efficiency in the treatment of fruit juices. With respect to the production of enzymes in bioreactor, the operational parameters evaluated were agitation, cultivation temperature, occupation volume (30, 50 and 70%) and specific air flow (0.18, 0.36, 0.54, 0.72 e 0.90 LkgM – liter of air per kilogram of medium per minute). Tests without and with agitation of the bioreactor (1 rpm per 5 minutes each 120 minutes) indicated that, with occupation volume of 30%, agitation leads to increasing fungal growth and decreasing enzyme production, whereas with 50% of occupation an opposite behavior was noticed. With 70% of occupation volume, no significant difference was observed among the pectinolytic activities achieved with and without agitation, the production being hindered in both cases by the insufficient aeration of medium. The interval between agitation events was evaluated for an occupation volume of 70% and no significant difference in enzyme production was observed for the intervals of 90 and 120 minutes (standard condition). For the interval of 60 minutes, the activity was reduced in approximately 58%. The cultivations with temperature control at 34oC and without control indicated that enzyme production was favored with the natural increase of medium temperature, an aspect that could be related to a stress condition that would lead to a higher enzyme production. Specific air flows between 0.18 and 0.90 LkgM were evaluated for 30 and 50% of bioreactor occupation volume. Larger fungal growth was observed when the bioreactor was loaded with the smallest occupation volume. With the intermediate flow of 0.54 LkgM, the highest enzyme activities were achieved for both occupation volumes; however, the occupation volume of 50% resulted the higher activity of 178.2 U/g, with an activity of 133.4 U/g being measured for 30% of occupation. The results achivied indicated that for a higher enzyme production, the bioreactor should be conducted with 50% of occupation volume, specific airflow of 0.54 LkgM and interval between the agitations of 120 minutes. In the study on the extraction of pectinases from the solid medium with water pH 4, under agitation, it was observed that extraction times from 15 to 120 minutes presented similar results. The extraction temperatures of 20, 30 and 40oC did not influence protein extraction, but pectinase activity was reduced in 40% at 40oC, possibly due to the low enzyme thermostability. Among the extraction ratios of solid/liquid assessed, the value 1/10 resulted in the highest enzyme activity solubilized, with recovery of 81% of the pectinolytic activity that was present in the medium. In the concentration tests, ultrafiltration of concentrated extract with no previous treatment resulted in 59% of enzyme activity recovery and in a final permeate flux of about 11 L/m²/h. On the other hand, the operation protocol that included the use of activated charcoal, microfiltration and ultrafiltration presented enzyme recovery of 74% and final permeate flux of 24 L/m2/h, results that demonstrate the importance of pre-treatments in this process. Previously to the preparation of enzyme formulations, a volume of 30 L of enzyme extract was 103-fold concentrated by ultrafiltration, with 69% of enzyme recovery, and a final 663-U/mL extract was obtained. This concentrated extract was formulated with 20, 30, 40 and 50% (w/w) of glycerol and 2% (w/w) of KCl and evaluated for 59 weeks with respect to the enzyme activity conservation at 5ºC. At the end of the test period, the blank sample (with no additives) presented an activity decrease of 25% and also microbial contamination, whereas the formulations preserved 100% of the initial activity along the experiment. The 50%-glycerol formulation was used for Bordô grape maceration and for depectinization of apple, Rosé grape and blackberry juices, showing statistically similar results to those obtained with the commercial preparations Novozym 33095 and Pectinex Ultra SP-L used as reference. The results attained in this work pointed out to the possibility of scaling-up this process, from the enzyme production in solid-state cultivation to the achievement of an enzyme formulation that has shown potential to be used in the industry of fruit juice.

[Truncated abstract] Australia produces 87% of the world’s lupins (Lupinus angustifolius) which have the potential to be an excellent source of protein and energy in animal diets. However, feed manufacturers and poultry producers cannot use more than about 5% lupins in broiler and 7% in layer diets. The main reason is because 34% of the lupin grain comprises complex cell-wall polysaccharides that are indigestible. The main component of cell walls in lupins is pectin (33%). Poultry cannot digest pectin because they don't secrete the appropriate enzymes so their ability to use lupins is limited. Undigested pectins increase the viscosity of digesta in the bird's digestive tract, which in turn reduces the digestibility of dry matter and efficiency of feed utilisation. Pectins also increase water-holding capacity, a characteristic directly related to water intake and wet droppings. In this thesis, I tested the general hypothesis that breakdown of cell walls and pectins will improve the nutritive value of lupins for broilers and layers and reduce wet droppings. This hypothesis was tested in six experiments by treating lupins with specific exogenous enzymes (pectinases) or mechanical-heat treatment (expansion) plus pectinase. In the first experiment, attempts to break down the cell walls and pectins using four doses of pectinase, specifically polygalacturonase (PG), succeeded in improving the nutritive value of whole and dehulled lupins for egg layers. The lowest dose, 0.6g/kg diet, was the most effective dose for reducing water intake, wet droppings, the viscosity of the digesta and the number of soiled eggs. ... Equivalent figures for layers were 14, 15, 5 and 8%, indicating that the pectinases were slightly more effective in layers than broilers. For diets containing 20% dehulled lupins, pectinases were also very effective at breaking down both pectin and cell walls to release nutrients and, concomitantly, reducing water intake and wet droppings, but the magnitude of the responses was slightly less than with the 10% dehulled lupin diets. For diets containing 30% dehulled lupins, although the pectinases again were effective at breaking down pectin and cell walls and reducing viscosity, they did not reduce water intake or wet droppings. This might be due to the large amounts of nonmethylated pectic polysaccharides, which make up two thirds of the cell walls, by increasing water-holding capacity particularly when dehulled lupins are included in the diet at high levels (up to 30%). These polysaccharides might be broken down by appropriate enzymes. This hypothesis is worth testing in the future. Overall, the results of my study supported the general hypothesis. These in vivo results are conclusive and consistent. They show that an optimum combination of PME and PG is capable of including dehulled lupins up to 20% in broiler and layer diets without any nutritional or hygienic problems. The strategies I developed have proven very useful for breaking down the cell walls and pectins, improving the nutritive value of lupins for broilers and layers, and reducing wet droppings. By using the optimum combination of two pectinases, it should be possible to make substantial improvements in the nutritive value of lupins for broilers and layers, most importantly by reducing excessive water intake and wet droppings associated with feeding dehulled lupins. Without pectinases, the amount of dehulled lupins used in poultry diets is fairly small (7%), but if pectinases are used, this upper limit can be lifted to 20%.

La aplicación de enzimas en la industria constituye una de las aportaciones más recientes en las tecnologías de producción, debido a su elevada eficiencia catalítica, a que su uso no daña el medio ambiente y a su alta rentabilidad económica.
En los últimos años ha aumentado de forma importante la aplicación de enzimas microbianos en la industria. La mayoría de estos enzimas son degradadores de polisacáridos de la pared celular vegetal, como celulosas, hemicelulosas y pectinas.
La pectina es un polímero formado principalmente por cadenas de ácido galacturónico, parcialmente esterificado. Las pectinasas son las enzimas que degradan la pectina.
El principal objetivo de la tesis fue caracterizar pectinasas con potencial aplicación industrial. Para ello, primero se realizó el análisis de los sistemas degradadores de pectina de las cepas bacterianas Paenibacillus sp. BP-23 y Bacillus sp. BP-7, aisladas previamente por el grupo de investigación a partir de suelo de arrozal del Delta del Ebro.
El sistema pectinolítico de ambas cepas mostró una multiplicidad de bandas, motivo por el cual, se procedió a la clonación, purificación y caracterización de pectinasas a partir de las cepas analizadas y de Bacillus subtilis 168. Los estudios realizados indican que PelA de Paenibacillus sp. BP-23 e YvpA de Bacillus subtilis son enzimas nuevos, con características diferentes a las pectato liasas conocidas, que permiten identificar un subgrupo de enzimas dentro de las pectato liasas de la familia PL3. La inusual elevada actividad sobre pectina de los dos enzimas estudiados en este trabajo los hace buenos candidatos para aplicaciones biotecnológicas relacionadas con la degradación de pectina de sustratos naturales.
En el contexto de la utilización creciente de enzimas en la industria se planteó la producción del más activo de ellos, la pectato liasa PelA, en cantidades elevadas para poder realizar ensayos de aplicación industrial, utilizando cepas huésped de Bacillus subtilis. Con este fin se construyeron vectores lanzadera que replican tanto en Bacillus subtilis como en Escherichia coli.
Los resultados obtenidos en este trabajo suponen una aproximación a la tarea de sobreproducir pectato liasas, lo que ha permitido la identificación de problemas específicos de la expresión de los enzimas en estudio y posibilitarán la construcción futura de nuevas cepas recombinantes de productividad y rendimiento aumentado.

Pectins are linear polymers of alpha-D-galacturonic acid. They are found in the middle lamella and primary cell wall of plant tissues and they are degraded by pectinases.
The aim of the thesis was the caracterization of pectinases with a potencial applications in the industry.
Therefore, we analysed the petinolytic system of the bacterial strains Paenibacillus BP-23 and Bacillus BP-7, previously isolated from a rice field.
The pectinolytic system of both strains a multiple glycanase system, some enzymes of which have been cloned and characterized.
Paenibacillus sp BP-23 PelA and Bacillus subtilis YvpA, belong to pectate lyases PL3 family, and show and unusual features among pectin and pectate lyases. For this reason, we constructed several shuttles which were used to overexpres PelA in Bacillus subtilis.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:54Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-11-27Bitstream added on 2014-06-13T20:04:36Z : No. of bitstreams: 1 freitas_pm_dr_rcla.pdf: 670514 bytes, checksum: 22df87c8cdf056a03825df30dc778c89 (MD5)
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)
O fungo Rhizomucor pusillus A 13.36, quando cultivado por fermentação em estado sólido utilizando farelo de algodão como fonte de carbono por 72 horas, produziu altos níveis de poligalacturonase (18,6U/g). Essa enzima apresentou atividade máxima em pH 5,5 e em 55oC. A poligalacturonase bruta apresentou estabilidade na faixa de pH entre 4,5 e 6,5, com uma atividade residual de 91,3% no pH 6,5, e também até 70oC por 1h, com atividade residual de 80% nas temperaturas de 55 a 60oC. Esta enzima foi purificada por concentração e uma combinação de procedimentos de gel filtração e cromatografia de troca-iônica. A massa molecular da enzima foi 53,7kDa. A focalização isoelétrica mostrou uma única banda cujo ponto isoelétrico (pI) foi 3,8. A atividade máxima da enzima purificada também ocorreu em pH 5,5 e a 55oC. A enzima purificada foi estável na faixa de pH 4,5 a 6,5, com atividade residual na faixa de 80 a 100%, e também até 70oC por 1h, com atividade residual de 100% nas temperaturas de 55 a 60oC. A enzima purificada foi totalmente inibida por Ca2+, Cu2+, Hg2+ e 80% inibida por Fe2+ e Ag+. Mg2+ estimulou a atividade da poligalacturonase em 100%. Entre os substratos avaliados, a pectina de citrus (D.E. 92%) foi o que mais estimulou a ação da enzima. A afinidade por pectinas de alta esterificação e a ausência de atividade quando o ácido poligalacturônico foi usado como substrato, indica que a enzima purificada é uma polimetilgalacturonase. Os resultados obtidos pela cromatografia de papel demonstraram que a polimetilgalacturonase purificada possui o modo de clivagem endo/exo misto. O Km com pectina de citrus foi 10,78mg mL-1 e a Vmax foi 2379,04μmolmin-1mg-1. As possíveis aplicações desta enzima incluem composição de detergentes, processamento têxtil e de fibras de celulose, degradação ou modificação de material vegetal, aditivo...
Rhizomucor pusillus A 13.36 produced high levels of polygalacturonase (18.6U/g) in solid state fermentation in medium composed by cotton bran for 72 hours. This enzyme showed maximal activity at pH 5.5 and 55oC. Crude polygalacturonase was stable from pH 4.5 to 6.5, with remaining activity of 91,3% at pH 6.5, and stable until 70oC for 1h, with remaining activity of 80% at 55-60oC. This enzyme was purified by concentration and a combination of gel filtration and ion exchange chromatographic procedures. The molecular mass of the enzyme was 53.7kDa. Isoelectric focusing showed a single band with an isoelectric point (pI) of 3.8. The purified enzyme also showed maximum activity at pH 5.5 and 55oC. The purified enzyme was stable from pH 4.5 to 6.5, with remaining activity range of 80 to 100%, and stable until 70oC for 1h, with remaining activity of 100% at 55-60oC. The purified enzyme was totally inhibited by Ca2+, Cu2+, Hg2+ and 80% inhibited by Fe2+ and Ag+. Mg2+ increased poligalacturonase activity in 100%. Citrus pectin (D.E. 92%) was found to be the preferred substrate among the different substrates tested in the enzyme assay. The affinity for high pectin esterification and the lack of activity when polygalacturonic acid was used as substrate, indicates that the enzyme is a polymethylgalacturonase. The results obtained by paper chromatography showed that the purified polymethylgalacturonase has the mixed endo/exo mode of cleavage. The Km with citrus pectin was 10.78mg mL-1 and the Vmax was 2379.04μmolmin-1mg- 1. The possible applications of this enzyme include the composition of detergents, textile and cellulosic fiber processing, degradation or modification of plant material, animal feed additive and wine and juice processing.

Orientador: Eleni Gomes
Banca: Eleonora Cano Carmona
Banca: Hamilton Cabral
Banca: Daniela Alonso Bocchini Martins
Banca: Maria de Lourdes T. de M. Polizeli
Resumo: O fungo Rhizomucor pusillus A 13.36, quando cultivado por fermentação em estado sólido utilizando farelo de algodão como fonte de carbono por 72 horas, produziu altos níveis de poligalacturonase (18,6U/g). Essa enzima apresentou atividade máxima em pH 5,5 e em 55oC. A poligalacturonase bruta apresentou estabilidade na faixa de pH entre 4,5 e 6,5, com uma atividade residual de 91,3% no pH 6,5, e também até 70oC por 1h, com atividade residual de 80% nas temperaturas de 55 a 60oC. Esta enzima foi purificada por concentração e uma combinação de procedimentos de gel filtração e cromatografia de troca-iônica. A massa molecular da enzima foi 53,7kDa. A focalização isoelétrica mostrou uma única banda cujo ponto isoelétrico (pI) foi 3,8. A atividade máxima da enzima purificada também ocorreu em pH 5,5 e a 55oC. A enzima purificada foi estável na faixa de pH 4,5 a 6,5, com atividade residual na faixa de 80 a 100%, e também até 70oC por 1h, com atividade residual de 100% nas temperaturas de 55 a 60oC. A enzima purificada foi totalmente inibida por Ca2+, Cu2+, Hg2+ e 80% inibida por Fe2+ e Ag+. Mg2+ estimulou a atividade da poligalacturonase em 100%. Entre os substratos avaliados, a pectina de citrus (D.E. 92%) foi o que mais estimulou a ação da enzima. A afinidade por pectinas de alta esterificação e a ausência de atividade quando o ácido poligalacturônico foi usado como substrato, indica que a enzima purificada é uma polimetilgalacturonase. Os resultados obtidos pela cromatografia de papel demonstraram que a polimetilgalacturonase purificada possui o modo de clivagem endo/exo misto. O Km com pectina de citrus foi 10,78mg mL-1 e a Vmax foi 2379,04μmolmin-1mg-1. As possíveis aplicações desta enzima incluem composição de detergentes, processamento têxtil e de fibras de celulose, degradação ou modificação de material vegetal, aditivo... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo)
Abstract: Rhizomucor pusillus A 13.36 produced high levels of polygalacturonase (18.6U/g) in solid state fermentation in medium composed by cotton bran for 72 hours. This enzyme showed maximal activity at pH 5.5 and 55oC. Crude polygalacturonase was stable from pH 4.5 to 6.5, with remaining activity of 91,3% at pH 6.5, and stable until 70oC for 1h, with remaining activity of 80% at 55-60oC. This enzyme was purified by concentration and a combination of gel filtration and ion exchange chromatographic procedures. The molecular mass of the enzyme was 53.7kDa. Isoelectric focusing showed a single band with an isoelectric point (pI) of 3.8. The purified enzyme also showed maximum activity at pH 5.5 and 55oC. The purified enzyme was stable from pH 4.5 to 6.5, with remaining activity range of 80 to 100%, and stable until 70oC for 1h, with remaining activity of 100% at 55-60oC. The purified enzyme was totally inhibited by Ca2+, Cu2+, Hg2+ and 80% inhibited by Fe2+ and Ag+. Mg2+ increased poligalacturonase activity in 100%. Citrus pectin (D.E. 92%) was found to be the preferred substrate among the different substrates tested in the enzyme assay. The affinity for high pectin esterification and the lack of activity when polygalacturonic acid was used as substrate, indicates that the enzyme is a polymethylgalacturonase. The results obtained by paper chromatography showed that the purified polymethylgalacturonase has the mixed endo/exo mode of cleavage. The Km with citrus pectin was 10.78mg mL-1 and the Vmax was 2379.04μmolmin-1mg- 1. The possible applications of this enzyme include the composition of detergents, textile and cellulosic fiber processing, degradation or modification of plant material, animal feed additive and wine and juice processing.
Doutor

Une activité pectine-méthyl-estérase ioniquement liée à la paroi végétale du lin a été extraite de cals et de jeunes plantes de lin. Cette activité enzymatique libère une fonction carboxylique à partir d'un méthyl ester de galacturonate. 6 isoformes de pI variant de 5,5 à plus de 9 sont observées. Une forme, de point isoélectrique supérieur à 9, a été partiellement purifiée, ses caractéristiques, masse moléculaire, proche de 67000, une affinité de 0,27% pour une forme et de 0,072% pour l'autre isoenzyme. Les formes neutres présenteraient un mode d'action différent de celui de la forme basique. La répartition de ces isoenzymes dans la plante est hétérogène. Toutes les isoenzymes sont observées dans les cotylédons et dans l'apex de l'hypocotyle. Dans la racine et la base de l'hypocotyle, seul l'isoforme basique est révélée après focalisation isoélectrique. Compte tenu de leurs différentes caractéristiques, un rôle possible est proposé pour ces différentes formes

Orientador: Eleni Gomes
Banca: Eleonora Cano Carmona
Banca: Rubens Monti
Banca: Iracema de Oliveira Moraes
Banca: Márcia Luzia Rizzatto
Resumo: A poligalacturonase (PG) é uma pectinase que degrada a molécula de pectina atuando internamente, ao acaso, liberando oligossacarídeos (Endo-PG) ou por ataque a partir da extremidade não redutora da cadeia, liberando moléculas de ácido galacturônico (Exo-PG). As pectinases, como várias outras enzimas, têm sido obtidas a partir de microrganismos, em processos fermentativos em estado sólido (FES) e fermentação submersa (FSM). A purificação e caracterização destas enzimas podem possibilitar o estudo das diferenças de suas propriedades funcionais, bem como, permitem avaliar suas possibilidades de aplicação, em diferentes condições, em processos industriais. Este trabalho teve por objetivos estudar a produção, purificação e caracterização da PG produzida por Penicillium viridicatum RFC3 através de FES e FSM. Para FSM foram testados os resíduos agroindustriais (farelo de trigo, bagaço de laranja, uma mistura de ambos) a 3% (p/v) além da água amarela (resíduo do processamento da indústria cítrica) no seu estado bruto e com diluições (2, 4 e 10x). Os pHs iniciais foram corrigidos para 4,5, 5 e 5,5 e a fermentação ocorreu por 24 - 96 h. A ANOVA mostrou que o extrato do bagaço de laranja (pH 5,5 e 96 h) foi o melhor meio para a produção da PG em FSM. A purificação da PG produzida em FSM iniciou-se pela ultrafiltração do extrato bruto (membranas de 50 e 10 kDa, repectivamente) seguida pela aplicação da amostra em uma coluna de filtração em gel Sephadex G75 e posterior aplicação em uma Q Sepharose. A fração isolada e desorvida revelou, após 2 eletroforese (PAGE-SDS) a homogeneidade da banda cuja massa molar foi estimada em 92,24 kDa e pI de 5,4. A enzima mostrou ser uma exopoligalacturonase (Exo-PG) com pH e temperatura ótimos em 5,0 e 50-55ºC
Abstract: The polygalacturonase (PG) is a pectinase that degrade pectin acting internally, releasing olygossacharide (Endo-PG) or by atack to a non reducing chain extremity, releasing galacturonic acid (Exo-PG). The pectinases, like many others enzymes, have been obtained from microorganisms by solid state fermentation (SSF) and submerged fermentation (SMF). The purification and characterization of these enzymes besides the study of differences of its functional properties permit its application on industrial process, on different conditions. This work aimed the study of production, purification and characterization of PG from Penicillium viridicatum RFC3 by SSF and SMF. In SMF they were assayed agroindustrial wastes (wheat bran, orange bagasse and a mixture of both) at 3% (w/v 1:1) and citric industry liquid waste (yellow water) in crude state and with dilutions (2, 4 and 10x). It was also evaluated the variation of the initial pH of the medium (4.5, 5.0 nd 5.5) and the time of fermentation (24 96 h). The ANOVA test revealed that the culture medium composed by orange bagasse extract, at pH 5.5 and 96 h, was the best condition for production of PG in SMF. The purification process of PG from SMF was carried out by the ultrafiltration of the crude extract (50 and kDa membranes, respectively) and by gel filtration in Sephadex G75 and Q Sepharose columns. The fraction with PG activity show by eletrophoresis (SDSPAGE), an homogeinity of a band with estimated molar mass of 92.24 KDa and pI 5.4. The enzyme revealed to be an Exo-PG with optimal pH and temperature of 5.0 and 50-55 °C. It also revealed to be Ca2+ dependent, which increased its 4 activity and stability. The Km of the enzyme was 1.30 and 1.16 mg/ml on Ca2+ presence. The Vmax was 1.76 and 2.07 ?mol/min/mg when Ca2+ was added. The better fermentation conditions in SSF was wheat bran mixed with orange bagasse (1:1 w/w) at 80% moisture as an culture medium and 336h of fermentation
Doutor

The theoretical part of work is focused on the issue of biomass which can be used for energy purposes, inparticular agricultural waste, as well as can serve as a substrate for biogas station. It also deals with proteomics, its goals and approaches, separation methods. The aim of this work was to measure each sample of enzyme activity of biomass, which are used as a raw materials for biogas plants and their proteomic identification.

Made available in DSpace on 2018-08-01T21:59:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_11961_Dissertação Lucas Carvalho Trindade - PPGFis (2).pdf: 9990680 bytes, checksum: a02add814af0828b765718f180e67605 (MD5) Previous issue date: 2018-02-23
Este trabalho descreve o desenvolvimento de uma simulação computacional, desenvolvida através do programa GROMACS. Mais especificamente, estudamos os resultados da simulação computacional referente a evolução do raio de giro da proteína Pectina Metilesterase (PME) do tomate em função da pressão aplicada, mantendo a temperatura fixa. Foi realizada uma descrição sobre os modelos físicos utilizados pelo programa. Também foi descrito, de forma suscinta, características sobre sistemas e estruturas dos aminoácidos e proteínas. As simulações computacionais consideraram uma temperatura de 26, 85oC e pressões aplicadas de 1 bar, 1 kbar, 3 kbar, 5 kbar, 7 kbar, 9 kbar e 10 kbar. As simulações trabalharam com um tempo de ação da pressão de até 100 pico segundos. Os resultados da simulação computacional indicaram uma redução não linear do raio de giro da enzima Pectina Metilesterase (PME) do tomate de acordo com o aumento da pressão aplicada, mantendo temperatura fixa.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:23Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-04-25Bitstream added on 2014-06-13T20:08:23Z : No. of bitstreams: 1 monteiro_ac_me_rcla.pdf: 419901 bytes, checksum: 6e17ba68310913d5db3d8de5269a40dd (MD5)
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)
As pectinases são enzimas com importantes aplicações econômicas, especialmente na indústria alimentícia. Pectinases termoestáveis, produzidas por microrganismos termofílicos, apresentam uma série de características que favorecem sua aplicação em processos industriais, como, por exemplo, estabilidade em ampla faixa de pH e temperatura e maior tolerância a agentes químicos desnaturantes de proteínas. Contudo, os principais microrganismos empregados na produção de poligalacturonases (PGs) são fungos mesofílicos. O presente trabalho teve por objetivo realizar um estudo comparativo de produção de PGs em fermentação em estado sólido (FES) por fungos mesofílicos e termofílicos. Foram utilizados os fungos mesofílicos Aspergillus niger NRRL 3112 e Penicillium itallicum IZ 1584, reconhecidos como bons produtores de PGs, os termofílicos Thermomyces lanuginosus ROB e Rhizomucor pusillus A13.36 e o termodúrico Aspergillus fumigatus N31. Os microrganismos foram cultivados em FES em farelo de trigo, os mesofílicos a 27ºC e os demais a 45ºC, por períodos de 10 a 15 dias. Os maiores produtores de PG foram P. itallicum IZ 1584 (51U/g) e A. fumigatus N31 (59,40 U/g). As PGs dos fungos termofílicos apresentaram maiores valores de temperatura ótima e maior termoestabilidade que as dos mesofílicos. T. lanuginosus produziu PG com maior valor de temperatura ótima (70ºC). A. fumigatus produziu a PG mais termoestável, que conservou 100% da atividade original após 1 h de incubação a 50ºC em ausência de substrato. Cromatografias em filtração em gel e zimogramas revelaram a expressão de 7 isoformas de PG em A. niger NRRL 3112, 3 isoformas em P. itallicum IZ 1584, T. lanuginosus ROB e R. pusillus, e 2 isoformas em A. fumigatus N31.
Pectinases are enzymes with important economic applications, especially in food industry. Termostable pectinases, produced by termophilic microorganisms, display an array of characteristics that support their application in industrial processes, such as stability through a wide pH and temperature range, as well as higher tolerance to protein denaturating chemical agents. However, the major microoganisms employed in polygalacturonases (PGs) prodution are mesophilic fungi. The present work aimed to make a comparative study of PG production by mesophilic and thermophilc fungi in Solid-State Fermentation (SSF). The fungi employed were the mesophilic Aspergillus niger NRRL 3112 and Penicillium itallicum IZ 1584, both known as good PGs producers, the thermophilic Thermomyces lanuginosus ROB and Rhizomucor pusillus A13.36 and the termoduric Aspergillus fumigatus N31. The fungi were bred in wheat bran in SSF, the mesophilic at 27ºC and the others at 45ºC, during periods of 10 to 15 days. The higher PGs producers where P. itallicum IZ 1584 (51U/g) and A. fumigatus N31 (59,40 U/g). PGs of thermophilc fungi have shown higher values of optimum temperature and termostability than mesophilic PGs. T. lanuginosus produced PG with the higher value of optimum temperature for activity (70ºC). A. fumigatus have shown the most thermostable PG, which mantained 100% of its original activity after 1 h of incubation at 50ºC in absence of substrate. Gel filtration chromatography and zymograms revealed the expression of 7 PG isoforms for A. niger, 3 isoforms for P. itallicum IZ 1584, T. lanuginosus ROB and R. Pusillus, and 2 isoforms for A. fumigatus N31.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES
The pepper (Capsicum annuum L.) has commercial importance, by having sources of vitamins, minerals and fiber. However, a post-harvest problem, excessive softening which reduces the life and favors action pathogens such as Pectobacterium caratovorum subsp. caratovorum- Pcc, causal agent of soft rot, a major disease of post-harvest chili that is favored by the reduction of firmness. One technique that has recently been used for firmly maintaining the application is pectin methyl esterase (PME) with the addition of a calcium solution prologando thus reducing its lifetime and pathogen attack. The objective of this study was to use methyl pectin esterase (PME) exogenous associated with calcium chloride in maintaining firmness and control of Pectobacterium caratovorum subsp. caratovorum about pepper. The first experiment was conducted in a completely randomized design in a 4x5 factorial scheme with three replications for 12 days, evaluated every three days. In the second experiment, the test was conducted in a completely randomized design in a factorial 5x5 with three replications. In the first study the fruits of pepper were subjected to vacuum infusion method with pressure of 200 mmHg for 5 minutes, and following evaluated the loss of weight (PMF), fruit firmness (FF), skin color ( CC), soluble solids (SS), pH, total acidity (TA) and activity of SMEs. In the second test the fruits of pepper were subjected to vacuum infusion method with pressure of 200 mmHg for five minutes, then the fruits were inoculated with the PCC then held the fruit firmness analysis (FF), SME activity and the severity of the disease in chili (SD). The fruits obtained in general a reduction of over time firmly in all treatments but was found significant effect in maintaining the fruit firmness when treated in vacuum infusion with calcium chloride, without altering the physicochemical characteristics, as soluble solids content, total acidity and activity of SMEs, slowing the fruit ripening process. The fruits when treated with vacuum infusion with calcium chloride associated with pectin methyl esterase was not favorable because it altered the physicochemical properties chili, highlighting the decline of firmness, thus deteriorating the quality of the fruit. Regarding inoculation Pcc in the fruit was observed inhibition of growth of this pathogen, prolongation of fruit and better firmness treated fruits infusion over calcium inoculation Pcc chloride.
O pimentão (Capsicum annuum L.) tem grande importância comercial, por possuir fontes de vitaminas, minerais e fibras. Contudo, possui problema pós-colheita, o amolecimento excessivo que reduz a vida útil e favorece ação de patógenos como a Pectobacterium caratovorum subsp. caratovorum- Pcc, agente causal da podridão-mole, uma das principais doenças da pós-colheita do pimentão que é favorecida pela redução da firmeza. Uma técnica que vem sendo utilizada recentemente para a manutenção da firmeza é aplicação da pectina metil esterase (PME) com a adição de solução de cálcio prologando, assim, a sua vida útil e diminuindo o ataque do patógeno. Assim, o objetivo do trabalho foi utilizar a pectina metil esterase (PME) exógena associada ao cloreto de cálcio na manutenção da firmeza e no controle da Pectobacterium caratovorum subsp. caratovorum sobre o pimentão. O primeiro experimento foi realizado em delineamento inteiramente casualizado em esquema fatorial 4x5 com três repetições, durante 12 dias, avaliados a cada 3 dias. No segundo experimento, o ensaio foi realizado em delineamento inteiramente casualizado no esquema fatorial 5x5 com três repetições. No primeiro trabalho os frutos de pimentão foram submetidos ao método de infusão a vácuo com pressão de 200 mmHg por 5 minutos, e por seguinte avaliou-se a perda de massa fresca (PMF), firmeza do fruto (FF), cor da casca (CC), teor de sólidos solúveis (SS), pH, acidez total, (AT) e atividade de PME. No segundo ensaio os frutos de pimentão foram submetidos ao método de infusão a vácuo com pressão de 200 mmHg por cinco minutos, posteriormente os frutos foram inoculados com a Pcc em seguida realizou-se as análises de firmeza do fruto (FF), atividade de PME e a severidade da doença no pimentão (SD). Os frutos obtiveram de forma geral uma redução da firmeza ao longo do tempo em todos os tratamentos, porém foi verificado o efeito significativo na manutenção da firmeza dos frutos quando tratados em infusão a vácuo com cloreto de cálcio, não alterando as características físico-químicas, como o teor de sólidos solúveis, acidez total e atividade de PME, retardando o processo de amadurecimento do fruto. Os frutos quando tratados com infusão a vácuo com cloreto de cálcio associado à pectina metil esterase não foi favorável, pois alterou as propriedades físico-químicas do pimentão, com destaque para o declínio da firmeza, deteriorando assim a qualidade do fruto. Em relação à inoculação da Pcc no fruto, observou-se uma inibição do crescimento desse patógeno, prolongamento do fruto e uma melhor firmeza nos frutos tratados com infusão de cloreto de cálcio mais a inoculação da Pcc.

La salinisation des sols est une situation préoccupante rencontrée dans plusieurs régions du monde où la pression sur l'eau devient de plus en plus forte, notamment en raison des changements climatiques et de la nécessité d'augmenter le rendement des cultures face à une population mondiale croissante. La présence d'un excès de sels dans le sol affecte les mécanismes physiologiques de la plante réduisant ainsi la production végétale. Une meilleure connaissance des mécanismes de défense des plantes en réponse au stress salin s'avère indispensable pour fournir des stratégies efficaces dans l'amélioration des cultures. La paroi végétale, première barrière physique entre le compartiment cellulaire végétal et l'environnement, a un rôle essentiel dans les mécanismes de croissance et de différentiation cellulaire et aussi en réponse à différents stress, dont le stress salin. La paroi végétale est une structure complexe et dynamique constituée principalement de polysaccharides (cellulose, hémicelluloses et pectines). Les pectines peuvent être méthylestérifiées et acétylées, les degrés de méthylestérification (DM) et d'acétylation (DA) sont contrôlés in muro par des enzymes spécifiques, les pectine méthylestérases (PME, EC 3.1.1.11) et acétylestérases (PAE, EC 3.1.1.6). Quelques données de la littérature montrent l'implication des pectines et du degré de méthylestérification de ces dernières, dans la tolérance au stress salin. Ces travaux avaient pour objectif d'incrémenter les données parcellaires actuelles sur le rôle de la paroi en réponse au stress salin. Trois stratégies d'étude distinctes ont été mises en place en choisissant comme modèle d'étude la plante glycophyte Arabidopsis thaliana. D'une part, la variabilité naturelle entre deux écotypes communs d'Arabidopsis thaliana (Wassilewskija, Ws et Columbia, Col-0) en réponse au stress salin a été caractérisée par une approche intégrative établissant une corrélation entre les résultats obtenus via des analyses physiologiques, biochimiques, métabolomiques et protéomiques. Les résultats ont montré une meilleure tolérance du stress salin associée au fond génétique Ws, avec un stade de développement plus avancé, une meilleure détoxification des espèces réactives à l'oxygène et une paroi plus riche en hémicelluloses et lignines. D'autre part, une approche de génétique inverse a été développée afin de déterminer les rôles fonctionnels des enzymes de modification des pectines AtPME3 et AtPAE7 dans la réponse au stress salin. Les résultats ont mis en évidence une perturbation du remodelage de la paroi par le stress salin. En effet, le stress salin induit une modulation des activités des enzymes de modification des pectines associée à une altération du patron de méthylestérification des pectines mais également à une réduction plus importante des homogalacturonanes et une augmentation des arabinanes par rapport aux plantes témoins. Enfin, une approche plus informative associant le métabolisme pariétal, la voie de détoxification des ions sodium, et l'impact des ions calcium sur la paroi a été menée afin de caractériser le remodelage pariétal induit par le stress salin chez le mutant hypersensible Atsos1 dont le gène SOS1 code un antiport Na+/H+ responsable de l'exclusion du Na+ à l'extérieur de la cellule. Les résultats préliminaires montrent une activité PME et PAE plus faibles que chez les plantes témoins en réponse au stress salin. Cela s'accompagne d'une réduction des acides galacturoniques et des résidus mannose. Ces résultats montrent que le remodelage des pectines et le mannose, semblent jouer un rôle prépondérant dans la tolérance au stress salin. L'ensemble des données confirme le rôle essentiel de la paroi et l'implication du calcium dans la tolérance au stress salin chez ce mutant
Soil salinization is a alarming situation encountered in several regions of the world where the pressure on water is becoming increasingly strong, especially due to climate change and the need to increase crop yields to face a global growing population. Excess of salt in soil affects plant physiological mechanism thus reducing plant production. A better knowledge of plant defense mechanism in response to salt stress is crucial to provide efficient strategies in crop yield. The plant cell wall is the first physical barrier between the plant cell compartment and the environment and plays an essential role in cell growth and development but also in response to various stresses, including salt stress. The cell wall is a highly complex and dynamic structure, mainly composed of polysaccharides (cellulose, hemicelluloses and pectins). Pectins can be methylesterified and acetylated, and their degree of methylesterification (DM) and acetylation (DA) can be modulated in muro by specific enzymes, pectin methylesterases (PMEs, EC 3.1.1.11) and acetylesterases (PAEs, EC 3.1. 1.6). Some parcelar data from the literature showed the role of pectins and their degree of methylesterification in tolerance to salt stress. The aim of this work was to provide new insights on the role of the cell wall in response to salt stress in the glycophyte Arabidopsis thaliana. Three distinct strategies were developed. Firstly, the natural variation between two common accessions of Arabidopsis thaliana (Wassilewskija, Ws and Columbia, Col-0) in response to salt stress has been characterized using an integrative approach establishing a correlation between physiological, biochemical, metabolomics and proteomics analyses. The results showed a better tolerance to salt stress associated with the genetic background Ws with an older developmental stage, a more efficient detoxification of reactive oxygen species and a higher content of xylan, mannan and lignin within the wall. Secondly, a reverse genetics approach has been developed to determine the contribution of two pectin remodeling enzymes, AtPME3 and AtPAE7 in salt tolerance. The results showed changes in the cell wall sugar composition as a reduction in homogalacturonan and an increase in arabinan in both atpme3 and atpae7 mutants after a long exposure to salt. Additionaly, salt stress induces a modulation of the PRE activities with an alteration of the pectin methylesterification pattern indicating a role of PME and PAE in cell wall integrity under salinity. Finally, a more informative approach combining cell wall metabolism, pectin remodeling enzymes, sodium ion detoxification pathway, and impact of calcium ions on cell wall integrity was carried out to characterize the role of the cell wall in the sodium hypersensitive mutant Atsos1. The SOS1 gene encodes a Na+/H+ antiporter which is involved in Na + exclusion. Preliminary results revealed that PME and PAE activities remained unchanged in atsos1 unlike the wild-type where the activites increased. That was associated with a reduction in pectin and mannan in atsos1, which was recovered by Ca2+ supply. All these data suggest the key role of atsos1 to maintain cell wall integrity under salt stress

Orientador: Eleni Gomes
Banca: Eleonora Cano Carmona
Banca: Hamilton Cabral
Resumo: As pectinases são enzimas com importantes aplicações econômicas, especialmente na indústria alimentícia. Pectinases termoestáveis, produzidas por microrganismos termofílicos, apresentam uma série de características que favorecem sua aplicação em processos industriais, como, por exemplo, estabilidade em ampla faixa de pH e temperatura e maior tolerância a agentes químicos desnaturantes de proteínas. Contudo, os principais microrganismos empregados na produção de poligalacturonases (PGs) são fungos mesofílicos. O presente trabalho teve por objetivo realizar um estudo comparativo de produção de PGs em fermentação em estado sólido (FES) por fungos mesofílicos e termofílicos. Foram utilizados os fungos mesofílicos Aspergillus niger NRRL 3112 e Penicillium itallicum IZ 1584, reconhecidos como bons produtores de PGs, os termofílicos Thermomyces lanuginosus ROB e Rhizomucor pusillus A13.36 e o termodúrico Aspergillus fumigatus N31. Os microrganismos foram cultivados em FES em farelo de trigo, os mesofílicos a 27ºC e os demais a 45ºC, por períodos de 10 a 15 dias. Os maiores produtores de PG foram P. itallicum IZ 1584 (51U/g) e A. fumigatus N31 (59,40 U/g). As PGs dos fungos termofílicos apresentaram maiores valores de temperatura ótima e maior termoestabilidade que as dos mesofílicos. T. lanuginosus produziu PG com maior valor de temperatura ótima (70ºC). A. fumigatus produziu a PG mais termoestável, que conservou 100% da atividade original após 1 h de incubação a 50ºC em ausência de substrato. Cromatografias em filtração em gel e zimogramas revelaram a expressão de 7 isoformas de PG em A. niger NRRL 3112, 3 isoformas em P. itallicum IZ 1584, T. lanuginosus ROB e R. pusillus, e 2 isoformas em A. fumigatus N31.
Abstract: Pectinases are enzymes with important economic applications, especially in food industry. Termostable pectinases, produced by termophilic microorganisms, display an array of characteristics that support their application in industrial processes, such as stability through a wide pH and temperature range, as well as higher tolerance to protein denaturating chemical agents. However, the major microoganisms employed in polygalacturonases (PGs) prodution are mesophilic fungi. The present work aimed to make a comparative study of PG production by mesophilic and thermophilc fungi in Solid-State Fermentation (SSF). The fungi employed were the mesophilic Aspergillus niger NRRL 3112 and Penicillium itallicum IZ 1584, both known as good PGs producers, the thermophilic Thermomyces lanuginosus ROB and Rhizomucor pusillus A13.36 and the termoduric Aspergillus fumigatus N31. The fungi were bred in wheat bran in SSF, the mesophilic at 27ºC and the others at 45ºC, during periods of 10 to 15 days. The higher PGs producers where P. itallicum IZ 1584 (51U/g) and A. fumigatus N31 (59,40 U/g). PGs of thermophilc fungi have shown higher values of optimum temperature and termostability than mesophilic PGs. T. lanuginosus produced PG with the higher value of optimum temperature for activity (70ºC). A. fumigatus have shown the most thermostable PG, which mantained 100% of its original activity after 1 h of incubation at 50ºC in absence of substrate. Gel filtration chromatography and zymograms revealed the expression of 7 PG isoforms for A. niger, 3 isoforms for P. itallicum IZ 1584, T. lanuginosus ROB and R. Pusillus, and 2 isoforms for A. fumigatus N31.
Mestre

Ce travail est une contribution à l'étude de la dégradation enzymatique des pigments anthocyaniques de jus de fruits rouges par différentes préparations pectinolytiques industrielles d'Aspergillus niger. Cette dégradation est due à la présence d'activités secondaires de type glycosidasique: [Bêta]-glucosidases, [Bêta]-galactosidases, [Alpha]-rhamnosidases et [Alpha]-arabinosidases. L'hydrolyse des sucres en position 3 et/ou 5 conduit à la libération de l'anthocyanidine, molécule instable, qui se scinde via la forme chalcone en dérivés du benzaldéhyde et de l'acide benzoïque issus des noyaux A et B de l'aglycone, une étude systématique par HPLC de la décoloration enzymatique de différents pigments anthocyaniques a permis d'établir leur schéma de dégradation en montrant notamment que l'hydrolyse des anthocyanes diglycosylées en 3 ou en 3 et 5 s'effectue de façon séquencée par des [Bêta]-glycosidases spécifiques. Par chromatographie d'interaction ionique et hydrophobe, une fraction protéique enrichie en activités anthocyanasiques a été isolée. La détermination des caractéristiques cinétiques (Km, Vmax), montre que les [Bêta]-glucosidases et les [Bêta]-galactosidases ont une affinité légèrement supérieure pour les dérivés glycosylés de la cyanidine comparativement à ceux de la malvidine. Ces activités anthocyanasiques sont fortement inhibées par la [Delta]-gluconalactone et la [Delta]-galactonolactone mais faiblement par le glucose et le galactose

Le gène KDSA code pour l'acide 3-desoxy-D-manno-octulosonique 8-phosphate (Kdo-_P) synthase qui synthétise le précurseur phosphorylé du Kdo, un constituant indispensable et indissociable de la membrane externe des bactéries à Gram négatif. Chez les plantes, le rôle du Kdo reste méconnu, mais il entre dans la composition d'un polysaccharide pectique complexe : le rhamnogalacturonane II, indispensable à la structuration du réseau de pectines de la paroi primaire. L'étude de l'enzyme KDSA a été réalisée chez la tomate (Lycopersicon esculentum Mill. ) et chez Arabidopsis thaliana. Son expression est préférentiellement associée aux cellules en division et son rôle, potentiellement associé à la biosynthèse du RG-II, serait très important puisqu'aucune plante mutante, dépourvue d'activité Kdo-8-P synthase, n'a pu être isolé. Une étude préliminaire de la Kdo transférase, enzyme terminale de la voie de biosynthèse du Kdo a aussi été réalisée et les premiers résultats seront discutés
The KDSA gene codes for the 3-deoxy-D-manno-octulosonic acid 8-phosphate (Kdo-8-P) synthase which synthesizes the phosphorylated precursor of Kdo, an essential and indissociable component of the outer membrane in Gram-negative bacteria. In plants, the role of Kdo is largely misunderstood ; however it is a constituent of a complex pectic polysaccharide : rhamnogalacturonan II, essential for the structuration of the pectin bnetwork in primary cell wall. The study of the KDSA enzyme has been performed in tomato (Lycopersicon esculentum Mill. ) and in Arabidopsis thaliana. The expression of KDSA was shown to be preferentially associated with dividing cells. Its function is thought to be of great importance since no null mutant plants, lacking the Kdo-8P synthase activity, could be isolated. A preliminary study of the Kdo transferase has been performed. This enzyme is the last one of the biosynthetic pathway of Kdo and the first results will be discussed

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Financiadora de Estudos e Projetos
Plant cell wall confers to the cell plant, structural support as well as protection against pathogens and phytophagous. Among the cell wall polysaccharides includes pectic substances, which are composed of partially methyl-esterified galacturonic acid residues linked by α-1,4 glycosidic bonds. These enzymes are often synthesized by phytophatogenic micro-organisms for invasion of host plant or by own plant for modeling plant cell wall. The pectic substances are the major component of middle lamella and are natural degraded by pectinases action. Pectin methylesterase (PME) catalysis removes methyl-ester groups, and the Endo-polygalacturonase (Endo-PG) promoves the randomly hydrolysis reaction of α-1,4 bonds. One of the most importante agricultural pest species of the family Curculionidae (Coleoptera: Curculionidae) is Sphenophorus levis, the sugarcane weevil. The larvae of this insect penetrate into the rhizome and build galleries in the stem, decreasing productivity and causing the death of the plant. Large damages to the crop like that are significant in the costs of products derived from sugarcane. Considering the impact of this pest in the sugarcane crop and the absence of efficient method for control, new strategies for controlling are still necessary. The analysis of the cDNA library of S. levis larvaes shows the presence of one PME and one Endo-PG genes that we called Sl-PME and Sl-EndoPG respectively. Considering the importance of studies of insect pests and the extensively use of theses pectinases in different industry fields, we performed the characterization of genomic sequences coding for S. levis pectinases (Sl-Pectinases). It was also carried out the production and characterization of a Sl-PME and a Sl-EndoPG recombinant, expressed in heterologous system. We also accomplished analysis of gene expression by qRTPCR in different stages of development as well as different tissues, and phylogenetic studies between Sl-Pectinases and other pectinases from different kingdoms. The Sl- Pectinases sequences identified, show more similar to homologous insect genes deposited in the GenBank, especially with Sitophilus oryzae. The phylogenetic analysis indicates that the insect group is more correlated with bacteria group and fungi group respectively to PMEs and EndoPGs sequences. Pectinases genomic sequences revealed two introns for Sl-EndoPG gene with 53 and 166 bp, but no one for Sl-PME gene. Both of Sl-Pectinases Recombinant showed catalytic activity. The recombinant Sl-EndoPG shows optimal activity at pH 5,06 ± 0,27 and 49,74 ± 2,49 oC, but extremely low thermostability. For the polygalacturonic acid no-methylated as substract, the enzyme revealed Km = 3,88 mg.mL-1, Vmax = 21.96 μM.s-1 e Kcat = 3.137 s-1; for the citrus pectin partially methylated as substract, the enzyme presented Km = 4,98 mg.mL-1, Vmax = 17,19 μM.s-1 e Kcat = 2.456 s-1. Results in expression analysis suggest that S. levis pectinases have a digestive enzymes role, actting on the midgut. The present work represents the first pectinases of insect produced in Pichia pastoris heterologous system and characterized as optimal conditions of activity, thermostability and kinetic parameters.
A parede celular vegetal confere à célula vegetal suporte estrutural, proteção contra patógenos e fitófagos. Dentre os polissacarídeos da parede celular vegetal são inclusas as substâncias pécticas, as quais são compostas por resíduos de ácido galacturônico, parcialmente esterificados, ligados em série via ligações glicosídicas α- 1,4. As substâncias pécticas são o maior componente da lamela média e são naturalmente degradadas pela ação enzimática das pectinases. A Pectina metilesterase (PME) catalisa a remoção dos grupos metil-ester, e a Endo- Poligalacturonase (Endo-PG) promove a reação de hidrólise aleatória das ligações α- 1,4. Essas enzimas são comumente sintetizadas por micro-organismos fitopatógenos para invasão ao hospedeiro ou pelas próprias plantas para modelamento da parede celular vegetal. Na agricultura, uma das mais importantes espécies pragas da família Curculionidae (Coleoptera: Curculionidae) é o Sphenophorus levis, o bicudo da canade- açúcar. As larvas deste inseto penetram no rizoma e constroem galerias ao longo do colmo, causando queda na produtividade ou até mesmo a morte da planta. Grandes danos na cultura como esses são significativos nos custos de produtos derivados da cana-de-açúcar. Considerando o impacto dessa praga na cultura e a ausência de eficientes métodos de controle, novas estratégias ainda são necessárias no combate à praga. A análise de uma biblioteca de cDNA de larvas do inseto S. levis mostrou a presença de genes codificantes para uma PME e uma Endo-PG, os quais nomeamos de Sl-PME e Sl-EndoPG respectivamente. Devido a importância nos estudos de insetos pragas e a extensa aplicação das pectinases em diversos campos industriais, foi promovida a caracterização das sequências genômicas codificantes para as pectinases de S. levis (Sl-Pectinases). Também foi realizada a produção e caracterização de uma Sl-PME e uma Sl-EndoPG recombinantes, expressas em sistema heterólogo. Além disso, foram conduzidas análises de expressão gênica por qRT-PCR em diferentes estágios de desenvolvimento e diferentes tecidos; e estudos filogenéticos entre as Sl-Pectinases e outras pectinases de diferentes reinos. As sequências das Sl-Pectinases identificadas apresentaram maior similaridade com genes homólogos de insetos depositados no GenBank, principalmente como o Sitophilus oryzae. A análise filogenética indicou que o grupo dos insetos é mais correlacionado com o grupo das bactérias e com o grupo de fungos, respectivamente para as sequências PMEs e Endo-PGs. As sequências genômicas das pectinases revelaram dois introns para Sl-EndoPG com 53 e 166 pb, mas nenhum para o gene Sl- PME. Ambas as Sl-Pectinases Recombinantes apresentaram atividade catalítica. A Sl- EndoPG recombinante mostrou maior atividade em pH 5,06 ± 0,27 e 49,74 ± 2,49 oC, mas baixa termoestabilidade. Para o substrato ácido poligalacturônico não metilado, a enzima revelou Km = 3,88 mg.mL-1, Vmax = 21.96 μM.s-1 e Kcat = 3.137 s-1, para o substrato pectina de citrus parcialmente metilada, a enzima apresentou Km = 4,98 mg.mL-1, Vmax = 17,19 μM.s-1 e Kcat = 2.456 s-1. Os resultados da análise de expressão sugerem que as pectinases de S. levis são enzimas digestivas atuantes no intestino médio. Este trabalho representa as primeiras pectinases de inseto produzidas em sistema heterólogo de Pichia pastoris e caracterizadas quanto a condições ótimas de atividade, termoestabilidade e parâmetros cinéticos.

Le but de l’étude est la séparation de deux activités pectinolytiques à partir de préparations commerciales produites chez Aspergillus Niger. Nous devions produire une solution de pectinestérase exempte d’activité polygalacturonase afin de l’utiliser dans un procédé de clarification de jus de fruits. La méthode de séparation utilisée est la chromatographie liquide. Nous avons constaté un fractionnement de ces enzymes sur des supports classiques de types échangeurs d’ions et hydrophobes, mais il y a toujours une activité polygalacturonase résiduelle avec la pectinesterase. Nous avons ensuite tenté une résolution de ces enzymes sur un support protéique pouvant présenter plusieurs types d’interactions simultanée. Nous avons utilisé pour cela de l’albumine bovine sérique immobilisée sur du sépharose 4B. Les enzymes interagissent à Ph 4. 5 en tampon acétate. La pectinestérase est éluée du support par un tampon phosphate Ph 8. La polygalacturonase est éluée du support par un détergent Triton X 100. La pectinestérase interagit ioniquement sur les sites cationiques de l’albumine. La polygalacturonase, de même, interagit de façon ionique sur les charges positives de l’albumine et subit une interaction secondaire hydrophobe amplifiée par une faible concentration en ions phosphates. Les protéines d’activité polygalacturonase interagissent avec les groupes carboxyliques à pH 4,5 sur l’albumine ne subissent pas l’interaction hydrophobe. Elles sont éliminées par une chromatographie sur un support échangeur de cation. Le profil chromatographique varie en fonction de l’état de pureté de l’albumine et de l’espèce animale productrice. Une conformation ouverte de l’albumine est nécessaire ; elle est provoquée par l’action d’une forte charge positive, ici l’ion trisaminométhane tamponné avec du bicarbonate de sodium. Ainsi, en couplant les supports de carboxyméthyl séphadex et d’albumine bovine sépharose, nous observons une fraction de pectinestérase débarrassée d’activité depolymérisante.

Dans le but de mieux cerner les caractéristiques physiologiques des champignons filamenteux pectolytiques cultivés en fermentation en milieu solide, une étude du développement et de la synthèse de pectinases par différentes moisissures a été réalisée. Trois souches d'Aspergillus, deux de Penicillium, une de Rhizopus ont été retenues pour mener à bien cette étude. Aspergillus niger a été utilisé comme modèle pour l'étude de la physiologie de la croissance sur de la bagasse de canne a sucre imprégnée d'un milieu de culture à base de pectine. L'évolution des caractéristiques physico-chimiques du milieu, la production de biomasse, la respiration et la production d'enzymes pectolytiques ont été étudiées. Le complexe enzymatique produit a été caractérisé par le dosage des pectinestérases et des polygalacturonases, associé à l'étude de la dégradation de la pectine au cours de la fermentation par la technique HPLC. Des observations au microscope électronique à balayage du milieu de culture à différents temps de fermentation ont permis de mettre en évidence les phases du cycle de reproduction du champignon, et de caractériser le mode de développement des moisissures sur de tels supports solides. L'étude de la respiration, par l'analyse des gaz effluents des fermenteurs, a permis de corréler directement le pourcentage de gaz carbonique dégagé, aux différentes phases de croissance des champignons. La respirométrie permet aussi de caractériser les différentes souches pour leur aptitude à dégrader la pectine, et à mesurer leur taux de croissance spécifique sur ce substrat carboné, directement en milieu solide. Une étude de l'influence de l'activité de l'eau sur la croissance de ces moisissures, a été menée sur boites de Petri, à l'aide de différents dépresseurs de l'Aw (glucose, glycérol, PEG 200, PEG600). Les courbes de vitesse de croissance radiale des différentes souches ont été établies pour les différents dépresseurs, dans une gamme d'Aw allant de 0,85 à 1, et montrent l'importance de ce paramètre sur la croissance des moisissures cultivées en milieu solide.

La maturite de la baie de raisin conditionne la qualite de la vendange et son aptitude a etre transformee. Les parois cellulaires du pericarpe de la baie sont responsables de la structure et de la fermete, leur evolution etant impliquee dans le ramollissement et la maturation. Des baies ont ete prelevees a douze stades de developpement depuis la periode herbacee jusqu'a la maturite technologique afin de caracteriser l'evolution de l'etat physiologique des parois. La baie d'ugni blanc suit une courbe de croissance en double sigmoide classique et elle est caracterisee par une accumulation de materiel parietal neo-synthetise quasi continue. Concernant les parois, le developpement de la baie est caracterise par une diminution importante de galactose et du degre de methylesterification (dm). Les enzymes potentiellement responsables des modifications parietales observees, ainsi que leur activite transcriptionnelle ont ete etudiees. Un clone de pectine methylesterase (pme) a ete identifie comme un marqueur precoce du ramollissement. Les activites transcriptionnelle et enzymatique de ce clone ont ete correlees a la diminution du dm des pectines parietales, suggerant un role de la pme dans l'elongation et/ou la structure des parois. Le galactose parietal, originaire des chaines laterales des pectines, diminue en accord avec l'augmentation concomitante de l'activite -galactosidase. Le transcrit codant pour cette enzyme est specifiquement exprime lors de la phase herbacee. La caracterisation moleculaire et enzymatique de la polygalacturonase (pg) semble indiquer qu'elle ne participe pas directement a la maturation. Ces travaux ont conduit a l'isolement de clones specifiques de periodes clefs du developpement de la baie de raisin. Cette etude a egalement permis de suggerer que la baie de raisin etait un modele original pour la comprehension du developpement des fruits, puisque la maturation semble independante de la pg.

Le procédé de liquéfaction des fruits, nécessite l'emploi d'enzymes pectinolytiques, considérées comme des auxiliaires technologiques. L’optimisation de l'hydrolyse enzymatique passe par une meilleure connaissance de la paroi cellulaire du fruit. La paroi cellulaire de la fraise a été isolée du fruit par une extraction à l'alcool. Le matériel ainsi obtenu (MIA) a été soumis à des extractions successives par l'acide trans-1,2-diamino-cyclohexane-n,n,n',n'-tétraacétique, un tampon succinate pH 4,8, l'acide chlorhydrique dilué à chaud et la soude diluée à froid. L’analyse des différents extraits a permis de montrer que 87% des pectines solubles de la fraise sont extractibles par un agent chélatant du calcium (CDTA). Ces pectines sont faiblement méthylées et peu ramifiées. Les pectines les plus ramifiées nécessitent des conditions d'extraction plus drastiques (HCl et NaOH dilués). Le fractionnement par chromatographie échangeuse d'ions a permis de montrer que certaines fractions pectiques sont riches en oses neutres pouvant provenir des hémicelluloses (xylose, glucose), et en protéines. Les résultats obtenus permettent de suspecter la présence de liaisons entre les pectines, les hémicelluloses et les protéines au sein de la paroi cellulaire. La liquéfaction de la paroi (MIA) et de l'extrait insoluble dans le CDTA à l'aide d'enzymes industrielles a mis en évidence, outre la synergie entre les activités pectinolytiques et cellulolytiques, l'importance des activités hémicellulolytiques et protéolytiques. Ces études ont permis de mettre au point une nouvelle formulation enzymatique permettant d'améliorer le rendement d'extraction du jus et d'optimiser la stabilité des anthocyanes (couleur) au cours du stockage. En outre, cette étude a montré l'effet néfaste de la pasteurisation et de la concentration sur la couleur des jus