Academic literature on the topic 'Origine de réplication – Dissertation universitaire'

Les génomes bactériens évoluent principalement grâce au transfert horizontal de gènes. La conjugaison bactérienne en est un des mécanismes majeurs. Elle est notamment médiée par les éléments intégratifs et conjugatifs (ICE). En plus de leur transfert, les ICE codent d'autres fonctions conférant à leur hôte un avantage adaptatif, comme par exemple des résistances aux antibiotiques dont la diffusion est un enjeu majeur en santé publique. Il est donc nécessaire de comprendre comment les ICE se transfèrent si l'on veut limiter leur dissémination. Le transfert d'un ICE d'une cellule donatrice vers une cellule réceptrice implique son excision du chromosome, son transfert puis son intégration dans les génomes des deux cellules partenaires. Les données de la littérature révèlent que l'initiation de ce transfert est médiée par un complexe nucléoprotéique appelé relaxosome, dont la protéine clé est la relaxase, une transestérase codée par l'élément. Le rôle de la relaxase est d'effectuer une coupure simple brin sur l'ADN de l'ICE au niveau d'un site conservé, appelé nic. Ce clivage libère une extrémité 3'OH libre, servant d'amorce pour initier la réplication en cercle roulant. Le complexe ADN-relaxase est alors dirigé vers le pore de conjugaison. Au cours de ma thèse j'ai étudié un ICE modèle, ICESt3 de Streptococcus thermophilus qui appartient à la superfamille ICESt3/Tn916/ICEBs1, très répandue chez les Firmicutes. Ces ICE possèdent une relaxase non canonique, appartenant à la famille MOBT, apparentée aux initiateurs de réplication à cercle roulant de la famille Rep_trans. L'objectif de ma thèse était d'élucider le fonctionnement de la relaxase RelSt3 afin de décrypter les mécanismes moléculaires d'initiation du transfert conjugatif médié par une relaxase MOBT. Mes recherches ont conduit à l'identification du site de liaison de RelSt3 sur l'origine de transfert (oriT) d'ICESt3. Ce site, appelé bind, a pour originalité d'être distant du site nic, ce qui n'est pas le cas des autres familles de relaxases. RelSt3 présente un domaine HTH à son extrémité N-terminal. J'ai montré que ce domaine est requis pour la fixation de RelSt3 sur le site bind, et important pour son activité catalytique. Des tests de conjugaison ont démontré que ce domaine HTH est crucial pour le transfert conjugatif d'ICESt3. Des prédictions structurales de ce domaine en complexe avec l'ADN ont conduit à l'identification de l'interface d'interaction avec le site bind, confirmée par mutagénèse dirigée. J'ai également démontré que RelSt3 présente une activité de coupure-religature et qu'elle se fixe de façon covalente sur l'extrémité 5' du brin clivé, démontrant ainsi que cette enzyme participe aux étapes initiale et terminale de la conjugaison. Dans la littérature, il a été démontré que les relaxases interagissent fréquemment avec d'autres protéines accessoires, codées par l'ICE ou la bactérie hôte pour former le relaxosome. Le deuxième objectif de ma thèse était d'identifier des partenaires de RelSt3. L'analogie avec ICEBs1 chez Bacillus subtilis a permis d'identifier deux protéines candidates OrfL et OrfM codées par ICESt3, ainsi qu'une hélicase cellulaire, probablement impliquée dans la réplication en cercle roulant, nommée PcrA. Une caractérisation de ces protéines candidates a été effectuée en utilisant des approches biochimiques et biophysiques. Le réseau d'interaction entre l'ensemble de ces protéines a été dressé en utilisant des approches in vitro, ainsi que l'approche double hybride in vivo. Ces données nous permettent d'avoir un premier aperçu des constituants du relaxasome d'ICESt3. J'ai par ailleurs montré que OrfL et OrfM stimulent l'activité catalytique de RelSt3 in vitro, et qu'elles sont toutes les deux essentielles à la conjugaison d'ICESt3.Ce travail nous apporte une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires en jeu lors de la conjugaison d'un ICE pilotée par une relaxase de la famille MOBT
Bacterial genomes evolve mainly through horizontal gene transfer. Bacterial conjugation is one of the major mechanisms for these transfers. Conjugation is mediated by integrative and conjugative elements (ICE). In addition to their transfer function, ICEs encode other functions that may provide an adaptive advantage to their host, such as resistance to antibiotics whose dissemination is a major public health issue. It is therefore necessary to understand how ICEs are transferred in order to limit their dissemination.The transfer of an ICE from a donor cell to a recipient cell requires its excision from the chromosome, its transfer from one cell to the other and then its integration into the genomes of the two partner cells. According to the literature, the initiation of ICE transfer is mediated by a nucleoprotein complex called relaxosome, whose key protein is the relaxase, a transesterase encoded by the element. The role of the relaxase is to perform a single-stranded cleavage on the DNA of the ICE at a conserved site, called nic. This cleavage releases a free 3'OH end, used as a primer to initiate rolling circle replication. The DNA-relaxase complex is then driven to the conjugation pore.During my PhD thesis, I studied ICESt3 from Streptococcus thermophilus which belongs to the ICESt3/Tn916/ICEBs1 superfamily, widespread among Firmicutes. These ICEs encode a non-canonical relaxase belonging to the MOBT family, which is related to the rolling circle replication initiators of the Rep_trans family. The general objective of my thesis was to elucidate the function of the RelSt3 relaxase in order to decipher the molecular mechanisms of initiation of conjugative transfer mediated by a MOBT relaxase.My work led to the identification of the RelSt3 binding site on ICESt3 origin of transfer (oriT). This site, called bind, is peculiar in that it is distant from the nic site, which is not the case for other relaxase families. RelSt3 possesses an HTH domain at its N-terminus. I have shown that this domain is required for the binding of RelSt3 to its bind site, and that it is important for its catalytic activity. Conjugation assays demonstrated that this HTH domain is crucial for the conjugative transfer of ICESt3. Structural predictions of the HTH domain in complex with DNA led to the identification of the interaction interface with the bind site, confirmed by mutagenesis. I also demonstrated that RelSt3 exhibits a nicking-closing activity and that it covalently binds to the 5' end of the cleaved strand, demonstrating that this enzyme participates in both initial and final steps of conjugation.In the literature, it has been shown that relaxases interact frequently with other accessory proteins, encoded by the ICE or by the host bacteria, participating in relaxosome formation. The second objective of my thesis was to identify RelSt3 partners. Comparisons with available data on ICEBs1 from Bacillus subtilis allowed to identify two candidate proteins, OrfL and OrfM, that may belong to the relaxosome of ICESt3, as well as a cellular helicase, PcrA , probably involved in the rolling circle replication. A characterization of these proteins was performed using biochemical and biophysical approaches. The interaction network between all of these proteins was established using in vitro approaches, as well as with the in vivo two-hybrid approach. These data provide a first insight into the components of the ICESt3 relaxasome. I also showed that OrfL and OrfM stimulate the catalytic activity of RelSt3 in vitro, and that they are both essential for ICESt3 conjugation.This work lead to a better understanding of the molecular mechanisms required during the conjugation of an ICE driven by a MOBT family relaxase

La recombinaison homologue (RH) est impliquée dans la réparation des cassures double brin à l'ADN, et dans la gestion des fourches de réplication bloquées. Rad51 et BRCA2 en sont deux protéines pivots.J'ai montré que l'inhibition de la RH ainsi que la surexpression de Rad51 sont létales dans les cellules humaines, mais qu'un faible nombre de cellules arrivent à survivre. De plus, dans plusieurs cancers, les gènes de la RH sont mutés (BRCA1/2 dans les cancers du sein et de l'ovaire) ou la surexpression d'un gène de la RH est observée. Mon projet a pour but d'identifier les mécanismes et les causes de la létalité induite par une dérégulation de la RH dans les cellules humaines, ainsi que de comprendre comment certaines cellules arrivent à y survivre. L’analyse du cycle cellulaire et du marquage Histone H3 phosphorylée a révélé que les cellules humaines inactivées pour la RH ou surexprimant RAD51 s’accumulent à la transition G2/M. Parallèlement la vidéomicroscopie a suggéré que les cellules mourraient par apoptose, ce qui a été corroboré par des expériences utilisant l'Annexin-V comme marqueur d’apoptose et par des Western-Blot. Les Western Blots montrent que le checkpoint G2/M est activé, via l'analyse de la cyclineB1 et de cdk1, et que l'apoptose est déclenchée, via l'analyse du clivage de PARP. Mon hypothèse principale de travail étant que la surexpression d'un dominant négatif de Rad51 et possiblement la surexpression du Rad51 WT, entraîne des défauts de réplication dont l'accumulation entraînerait une activation du checkpoint. Des expériences d'incorporation de BrdU et de peignage moléculaire sont venus confirmer mon hypothèse : dans les cellules ayant une dérégulation de la RH, la vitesse de réplication est diminuée et il y a plus de fourches bloquées. Des analyses in-silico ont révélées que les cancers mutés dans la RH sont fréquemment co-mutés dans des gènes impliqués dans le checkpoint G2/M ou dans le redémarrage des fourches. Une liste de gènes candidats, enrichie de résultats de séquençages de fibroblastes de patients FANCD1, a été testée, confirmant l'analyse in-silico
Homologous recombination (HR) is involved in repairing DNA double strand breaks, and in protecting and restarting stalled or collapsed replication forks. Rad51 and BRCA2 are two key proteins of HR. I have showed that inhibiting HR, as well as over expressing Rad51, is lethal in human cells, although a very few cells still survive the inhibition. Moreover, many cancers carry mutations in an HR gene (BRCA1/2 in breast and ovary cancers) or over express an HR gene. My project aims to identify the mechanisms and the causes behind the lethality triggered by a dysregulation of HR, and to understand how a few cells manage to survive it. I have determined, through FACS and phosphorylated histone H3 labeling (IF), that HR deficient human cells, or those over expressing Rad51, accumulate at the G2/M checkpoint.At the same time, time-lapse microscopy experiments seemed to indicate that the cells died from apoptosis, which was confirmed by data from experiments using Annexin-V as an apoptosis marker and from Western-Blots. Western-Blots showed that the G2/M checkpoint is activated, through analysis of CyclinB1 and of cdk1, and that apoptosis is triggered, through analysis of PARP cleavage. My main working hypothesis was that overexpressing a dominant negative form of Rad51, and possibly also overexpressing Rad51 WT, would lead to replication defects, whose accumulation would in turn lead to an activation of the checkpoint. BrdU incorporation experients and use of the molecular combing technique confirmed this hypothesis : in HR-dysregulated cells, replication speed is slowed down and there are more stalled forks. In-silico analyses have showed that HR-mutated cancers often carry a second mutation in another gene, involved in either the G2/M checkpoint or in restarting stalled replication forks. Based on these analyses and on results from RNAseq experiments performed on FANCD1 patients' fibroblasts, candidate genes have already been listed, confirming the in-silico analysis

Chez les vertébrés, l'activation des origines de réplication est soumise à une régulation spatiale et temporelle. Dans les embryons précoces de xénope, les origines sont positionnées sans aucune spécificité de séquence et sont activées en clusters à différents moments de la phase S. L'objectif principal de ce travail a consisté à caractériser cette régulation temporelle en analysant d'une part, l'activation des origines au sein de fibres individuelles d'ADN, et d'autre part, la distribution des foyers de réplication au sein de noyaux de spermatozoïde incubés dans des extraits d'œufs de xénope. Grâce à la technique de peignage moléculaire, nous avons comparé la distribution des origines de réplication au début de deux phases S consécutives. L'absence de coïncidence « temporelle » entre les origines démontre que le moment d'activation des origines ne dépend pas de la position génomique et qu'il n'existe pas de régulation épigénétique du moment de réplication à l'échelle des origines. Cependant l'observation d'une coïncidence entre les foyers utilisés au début de deux cycles consécutifs suggère qu'une organisation chromosomique pourrait influencer le moment de réplication. L'analyse de la réplication de l'ADN ribosomique par FISH a fourni un exemple de domaine chromosomique répliqué plus tardivement que l'ADN génomique global. Une structure chromatinienne particulière pourrait expliquer ce retard. Par ailleurs, la fréquence d'initiation à ce locus est deux fois plus faible dans l'espaceur intergénique très riche en G+C que dans la région codante. Au sein de ce locus, il pourrait donc exister des facteurs locaux influençant le positionnement des origines de réplication
In Vertebrates, replication origins are activated according to a spatial and temporal program. In early Xenopus embryos, origins are located at apparently random sequences and are activated in clusters that fire at different times throughout S phase. The main object of the present work is to characterize the temporal regulation of replication in Xenopus egg extracts through analysis of origin activation on single DNA fibers and replication foci distribution in sperm nuclei. Using molecular combing of DNA, we compared the distributions of replication origins fired at the beginning of two following S phases. Absence of significative coincidence between origins shows that the temporal order of replication does not depend on genomic position. Furthermore, no epigenetic central regulates the moment of origin firing. However the detection of coincidence between replication foci labeled at the beginning of two following S phases suggests that the chromosomal organization may influence the replication timing. Using FISH, we showed that the replication of the ribosomic DNA is delayed compared to the replication of whole genomic DNA. An altered chromatin structure may be responsible for this delay. Mapping of origins revealed that initiation frequency is two fold lower in the G+C rich intergenic spacer than in the coding rDNA sequence. At the rDNA, local parameters such as nucleotide composition may influence the localization of replication origins

Depuis une décennie, GBF1 a émergé comme étant un facteur cellulaire essentiel à la réplication de plusieurs virus à ARN de polarité positive (ARN(+)), issus de différentes familles. GBF1 est un facteur d’échange nucléotidique de petites protéines G de la famille Arf, connu pour son action régulatrice des étapes précoces de la voie de sécrétion. En étudiant le virus de l’hépatite C (VHC) comme virus modèle, nous avons montré que le rôle de GBF1 dans la réplication virale est distinct de sa fonction régulatrice de la voie de sécrétion. En effet,GBF1 participe à la réplication du VHC par l’intermédiaire de la paire Arf4 et Arf5, alors que c’est la paire Arf1et Arf4 qui est impliquée dans la voie sécrétion. Pour déterminer si ce mécanisme d’action est conservé parmi les virus à ARN(+), nous avons d’abord montré que GBF1 est impliquée dans l’infection par le virus de la fièvre jaune (YFV), le virus sindbis (SINV), le coronavirus 229E humain (HCoV-229E) et le coxsackievirus B4(CVB4). Puis, nos résultats indiquent que les infections YFV, SINV et HCoV-229E dépendent, tout comme le VHC, des protéines Arf4 et Arf5. Toutefois, le YFV et le SINV utiliseraient également une autre paire d’Arf,Arf1 et Arf4, lors de leur cycle viral. Par ailleurs, l’infection par le coxsackievirus B4 (CVB4) est dépendante de GBF1 mais ne semble pas dépendre des protéines Arf. Bien que GBF1 soit un facteur crucial pour la réplication des virus ARN(+), son mécanisme d’action ne semble donc pas être conservé.La paire Arf4-Arf5 semble impliquée dans la réplication de plusieurs virus à ARN(+). Cependant, ces deux Arf ont été très peu étudiées, contrairement à la protéine Arf1. Nous faisons l’hypothèse que la paire Arf4-Arf5 agit en régulant une série d’effecteurs spécifiques qui sont importants pour la réplication virale. Nos résultats montrent que la déplétion simultanée de Arf4 et de Arf5 perturbe la morphologie de l’appareil de Golgi, qui devient condensé, et des gouttelettes lipidiques (GL), qui s’accumulent et grossissent en périphérie cellulaire.Toutefois, une analyse lipidomique de cellules déplétées de Arf4 et Arf5 montre une composition lipidique inchangée, ce qui suggère un effet sur la morphologie des GL et non pas sur le métabolisme des lipides. Une analyse transcriptomique nous a permis de mettre en évidence une série de protéines, dont l’expression est modulée, suite à la déplétion de Arf4 et Arf5. Nous avons évalué l’implication potentielle de certaines d’entre elles dans l’infection du VHC, mais aucune ne s’est révélée importante pour ce virus. En conclusion, nos résultats ont permis de mettre en évidence de nouvelles fonctions de GBF1, médiées par la paire de protéines Arf4 et Arf5. Arf4 et Arf5 sont impliquées dans la régulation de la morphologie de l’appareil de Golgi et des GL ainsi que dans la réplication de plusieurs virus à ARN(+). Il reste à évaluer si ces fonctions sont indépendantes les unes des autres ou liées entre elles et quels effecteurs spécifiques elles font intervenir
GBF1 has recently emerged as a cellular factor essential for the replication of single-stranded positive-sense RNA ((+)RNA) viruses from different families. GBF1 is a guanine-nucleotide exchange factor of small G proteins of the Arf family, known to regulate the early secretory pathway. By studying the hepatitis C virus (HCV) as a model, we have shown that the role of GBF1 in viral replication is distinct from its regulatoryfunction of the sercretory pathway. Indeed, GBF1 function in HCV replication is mediated by Arf4 and Arf5,whereas another pair, Arf1 and Arf4, mediates the regulation of the secretion. To determine if this mechanism ofaction is conserved among (+)RNA viruses, we showed that GBF1 is involved in yellow fever virus (YFV),sindbis virus (SINV), human coronavirus 229E (HCoV-229E) and coxsackievirus B4 (CVB4) infection. Our results indicate that YFV, SINV and HCoV-229E infections are Arf4 and Arf5 dependent, as we previouslyshowed for HCV. However, YFV and SINV would also use another Arf pair, Arf1 and Arf4, during their lifecycle. In addition, CVB4 infection depends on GBF1, but doesn’t seem to depend on any Arf. Although GBF1 is required for (+)RNA viruses replication, its mechanism of action appears not to be conserved.The Arf4-Arf5 pair appears to be involved in the replication of several (+)RNA viruses. However, these twoproteins have been poorly studied so far, contrary to Arf1. Our hypothesis is that the Arf4-Arf5 pair regulatesspecific effectors involved in viral replication. Our results indicate that Arf4 and Arf5 simultaneous depletionalters the morphology of the Golgi apparatus, which becomes condense, and of lipid droplets (LD), whichaccumulate and grow bigger at the cell periphery. However, a lipidomic analysis of Arf4 and Arf5 depleted cellsdisplayed an unaltered lipid composition, which suggests a morphologic impact on LD, rather than a disruptionof the lipid metabolism. A transcriptomic analysis identified proteins up- or down-regulated after Arf4 and Arf5 depletion. We assessed the function of some of these proteins in HCV replication, but none of them proved implicated.In conclusion, our results hightlighed new GBF1 functions, mediated by the pair Arf4-Arf5. Arf4 and Arf5 are involved in regulating the morphology of Golgi complex and of LDs, as well as the replication of (+) RNA viruses. It remains to assess if these functions are independent or related to each other, and which specific effectors they use

L’infection par le virus de l’hépatite C (HCV) évolue dans la plupart des cas en hépatite chronique et peut conduire à une cirrhose ou un carcinome hépatocellulaire. Malgré les grandes avancées dans le traitement de l’hépatite C qui permettent d’inhiber ou même de bloquer l’évolution de cette infection vers la chronicité, l’absence de vaccin ainsi que sa répartition sur la surface du globe nous permet de classer cette pathologie en problème majeur de santé publique. La majorité des traitements actuels ciblent les protéines virales et leur fonction. Cependant un grand nombre de mécanismes du cycle viral de HCV reste à élucider.Comme pour la grande majorité des virus à ARN de polarité positive, la réplication de HCV a lieu dans des membranes cellulaires modifiées. Le remaniement de ces membranes est en lien étroit avec la voie de sécrétion précoce de la cellule. Il a été montré que GBF1, un facteur d’échange nucléotidique des protéines G de la famille Arf qui régulent la dynamique membranaire, est un facteur nécessaire à la réplication de HCV. L’inhibition de GBF1 par la bréfeldine A (BFA) inhibe la voie de sécrétion des protéines cellulaires néosynthétisées et inhibe aussi la réplication de HCV. Pour étudier le rôle de GBF1 pendant l’infection nous avons établi des lignées résistantes à la BFA. Deux de ces lignées étaient 100 fois plus résistantes que les lignées parentales à l’apoptose induite par la BFA, à l’inhibition de la sécrétion des protéines et à l’inhibition de l’infection par HCV. Ce phénotype était dû à une mutation ponctuelle dans le domaine catalytique sec7 de GBF1 de ces lignées. Un autre groupe de lignées était partiellement résistantes à l’inhibition de la sécrétion des protéines par la BFA tout en conservant un niveau d’infection proche de celui des lignées parentales dans les mêmes conditions. Ces résultats suggèrent que la fonction de GBF1 pendant l’infection HCV ne serait pas réduite à la régulation de la voie de sécrétion, évoquant ainsi un rôle additionnel de GBF1 nécessaire pour la réplication de HCV.Par ailleurs, nous avons pu montrer à l’aide des mutants de délétion de la protéine GBF1, que l’activité catalytique du domaine sec7 était nécessaire. Ceci suggère l’implication d’une protéine de la famille Arf dans l’activation de l’infection HCV via GBF1. L’implication de Arf dans l’infection HCV a été confirmée par la surexpression de dominants négatifs de la protéine Arf1 et par l’inhibition de l’activité de l’ArfGAP1 (régulateur des Arf) par l’inhibiteur spécifique QS11.Nous avons ensuite testé l’implication des différents Arf sensibles à l’inhibition par la BFA (Arf1, 3 ,4 et 5), dans l’infection HCV à l’aide de si-RNA. Il a été montré que ces protéines Arf possèdent des fonctions redondantes. Nos résultats confirment l’implication de Arf1 et indiquent que les 3 autres protéines sont aussi impliquées dans l’infection HCV. D’une manière intéressante, la déplétion combinée des Arf inhibe fortement l’infection HCV suggérant ainsi un rôle essentiel de certaines protéines Arf, probablement en activant des facteurs cellulaires nécessaires à l’étape de réplication. L’étude des facteurs cellulaires impliqués dans l’infection HCV permet de mieux comprendre l’étape de réplication et par conséquent le cycle viral de HCV. Par ailleurs, l’étude de ces facteurs pourrait permettre le développement éventuel de stratégies antivirales ciblant des facteurs de la cellule hépatique indépendamment du génotype viral, limitant ainsi le risque d’émergence de variants résistants au traitement
The hepatitis C virus (HCV) infection progresses in most of the cases into a chronic hepatitis and can lead to cirrhosis or hepatocellular carcinoma. Despite the recent improvement of hepatitis C treatments, which inhibit or even block the progress of this infection into a chronic stage, a vaccine still not available and the worldwide distribution of the disease makes the hepatitis C a major public health problem. Most of the available treatments target viral proteins. However many mechanisms of the HCV life cycle remain unclear.As for many positive RNA viruses, HCV replication occurs in reorganized cellular membranes. These membrane rearrangements are closely linked to the early secretory pathway of the cell. It has been shown that GBF1, an exchange factor of small G proteins of the Arf family that regulates the membrane dynamics in the secretory pathway, is required for HCV replication. GBF1 inhibition by brefeldin A (BFA) inhibits the secretion of newly synthesized proteins and also inhibits HCV replication. To investigate the role of GBF1 in HCV infection, we isolated cell lines resistant to BFA. Two of these cell lines were 100 times more resistant than the parental cells to BFA-induced apoptosis, inhibition of proteins secretion and inhibition of HCV infection. This resistance was due to a point mutation in the catalytic sec7 domain of GBF1 of these cells. Another group of resistant cells was showing a partial resistance to the inhibition of proteins secretion while maintaining their sensitivity to the inhibition of HCV infection in the same conditions. These results suggest that GBF1 might fulfill another function, in addition to the regulation of the secretory pathway, during HCV replication. Using GBF1 deletion mutants we showed that the catalytic activity of the sec7 domain of GBF1 is required for HCV infection. This suggests that the function of GBF1 during HCV replication is mediated by Arf activation. The involvement of Arf was confirmed with the overexpression of restricted mutants of Arf1 and by the inhibition of ArfGAP1, another regulator of Arf function. We then tested the possible involvement of different Arfs (Arf1, 3, 4 and 5) in HCV infection. It has been reported that Arfs have redundant functions. The results confirm the involvement of Arf1 and indicate that all the other BFA-sensitive Arfs (Arf3, Arf4 and Arf5) are also involved in HCV infection. The combined knockdown of Arfs strongly inhibited HCV replication, showing that the Arf proteins are working together in HCV replication probably by activating several host factors required for the virus life cycle.The study of cellular factors required for HCV infection is crucial to better understand the interaction of the virus with the host cell and thus the whole HCV life cycle. This could help to develop new therapies targeting the host cell, regardless of viral genotypes and reducing the risk of emergence of new resistant forms

La réplication de l’ADN est un processus cellulaire fondamental qui assure la duplication fidèle de l’information génétique. Différentes perturbations peuvent interférer avec la progression de la fourche de réplication menaçant ainsi l’intégrité du génome. Pour éviter le blocage du réplisome, les polymérases réplicatives peuvent être remplacées par des polymérases translésionnelles (TLS) mutagènes mais capables de franchir différents types de lésions. Parmi les polymérases TLS, Polζ est unique car son absence entraine une létalité embryonnaire chez la souris suggérant qu’elle a acquis une fonction essentielle au cours de l’évolution. Cependant, sa fonction et sa régulation dans les cellules mammifères restent méconnues. Dans ce travail, nous avons montré que la phase S est perturbée en absence de REV3L, avec une modification du programme temporel de la réplication au niveau de régions génomiques répliquées en milieu-fin de phase S. Ce défaut de réplication est associé à une augmentation de la mutagénèse et des modifications du paysage épigénétique. Nous avons de plus mis en évidence que REV3L interagit avec les composants de l’hétérochromatine et est localisé au niveau des régions péri-centromériques, ce qui suggère que Polζ participe à la réplication de l’hétérochromatine et limite ainsi l’instabilité génomique. Dans une seconde partie, nous avons découvert que la protéine REV3L est clivée de manière post-traductionnelle par l’endopeptidase TASP1 générant deux polypeptides capables de s’hétérodimériser pour former un complexe stable qui, en association avec Rev7, représente probablement le complexe actif de Polζ. Aussi, nous avons observé que REV3L est finement régulée de manière endogène ou après exposition à un stress génotoxique à de multiples niveaux : (1) au niveau transcriptionnel, (2) par le clivage par TASP1, (3) par des phosphorylations post-traductionnelles. Finalement, l’ensemble de ces découvertes met en lumière un mécanisme de régulation unique contrôlant la fonction d’une polymérase mutagène dans les cellules mammifères. Ces résultats sont particulièrement importants étant donné que Polζ est un facteur impliqué dans les mécanismes de résistance des tumeurs face aux chimiothérapies
DNA replication is a fundamental process that ensures accurate duplication of the genetic information. Various perturbations can impede replication fork progression, and thus threatening genome integrity. To prevent fork collapse, replicative DNA polymerases can be replaced by error-prone DNA polymerases called translesion (TLS) polymerases, able to bypass DNA damage at the cost of increased mutations. Among TLS polymerases, Polζ is unique because inactivation of its catalytic subunit, REV3L, leads to embryonic lethality in mice underscoring its biological importance. However, little is known about its function and regulation in mammalian cells. We showed that loss of REV3L impairs S phase progression with a disruption of replication timing at specific genomic loci that replicate in mid-late S-phase, and this is associated with increased mutagenic events and aberrant epigenetic landscape. We also revealed that REV3L interacts with heterochromatin components and localizes in pericentromeric regions, suggesting that Polζ contributes to replicate heterochromatin regions to limit genome instability. In a second part, we discovered that REV3L protein is proteolytically processed by the endopeptidase TASP1 to generate two polypeptides that heterodimerize to form a stable complex that associates with REV7, likely representing the active complex of Polζ. We also found that REV3L is finely regulated in physiological conditions and after genotoxic stress at multiple levels: (1) transcriptionally, (2) proteolytically by TASP1 and (3) post-translationally by phosphorylation. Altogether these findings highlight a unique mechanism to control the function of an error-prone polymerase in mammalian cells. These data are particularly important given that Polζ is an important factor for tumor resistance to chemotherapeutic agents

L'instabilité du génome est une caractéristique du cancer et est associée aussi à des maladies neurodégénératives. Dans la communauté scientifique, il existe un consensus général que le stress de réplication de l’ADN (SR), qui peut survenir à cause de l’exposition de la cellule à divers agents génotoxiques exogènes ou endogènes, est un facteur clé de l’instabilité génomique. L'organisation et la dynamique du génome peuvent également favoriser le SR dans certaines circonstances.Des exemples de régions génomiques où l'achèvement de la réplication est particulièrement difficile sont les sites fragiles communs (SFC), des loci qui ont tendance à former des cassures ou des discontinuités dans les chromosomes mitotiques, notamment dans des conditions de SR. Récemment, une pléthore de protéines qui protègent le génome du SR qui, lorsqu’elles sont mutées, peuvent conduire à l’instabilité du génome a été identifiée. Ces dernières années, les scientifiques ont découvert qu'une source de SR, et d'instabilité génomique par la suite, est la transcription surtout si elle n’est pas séparée au niveau spatio-temporel de la réplication. L'anémie de Fanconi (AF) est une maladie héréditaire rare caractérisée par une insuffisance de la moelle osseuse, des anomalies congénitales et une prédisposition au cancer, causée par des mutations dans l'un des 22 gènes FANC identifiés. l'AF est caractérisée par une fragilité chromosomique et une hypersensibilité aux agents pontants de l'ADN (inter-strand crosslinks, ICL). En outre les protéines FANC ont un rôle dans la résolution des dommages de l'ADN survenant durant la réplication et la transcription, et dans la coordination des deux processus. De manière intéressante, les points de cassure chromosomiques dans les cellules des patients AF chevauchent fréquemment le SFC. Aux SFC la protéine FANCD2 est recrutée avec les endonucléases spécifiques de structure SLX4, XPF–ERCC1 et MUS81–EME1, pour résoudre des intermédiaires de réplication qui peuvent causer des défauts de ségrégation chromosomique. De plus, FANCD2 au niveau des SFC limite la formation des boucles à ARN (R-loops). Les R-loops ont des fonctions régulatrices, mais constituent également une menace pour la stabilité du génome lorsqu'elles se produisent de manière non contrôlée. Les R-loops sont surveillées par des facteurs de résolution comme la sénataxine (SETX), une ARN:ADN hélicase mutée chez des patients atteints de pathologies neurologiques. SETX est impliquée dans plusieurs voies de maintien du génome analogues à celles régulées par les protéines FANC, telles que la coordination de la réplication avec la transcription et la réparation des ICL.En outre, SETX agit de concert avec BRCA1 (FANCS) au niveau des sites de terminaison de la transcription pour permettre une terminaison fidèle, et forme des foyers nucléaires en réponse au SR, fonctions critiques pour le maintien du génome. La perte de fonction de SETX est liée l’infertilité chez les souris (une caractéristique également présente chez les souris et les patients AF). Compte tenu des processus cellulaires et moléculaires communs auxquels participent la voie FANC et SETX, nous avons émis l’hypothèse qu’il existe une relation fonctionnelle entre les deux dans le maintien de la stabilité du génome. Je montre que l'absence de SETX induit des cassures spontanées des chromosomes. Les régions impliquées dans ces ruptures sont ciblées par FANCD2, qui participe à la résolution de l'ADN sous-répliqué pendant la mitose, empêchant ainsi la mauvaise ségrégation des chromosomes et permettant aux cellules de continuer à proliférer. Je montre également que FANCD2 favorise la synthèse d'ADN mitotique qui dépend des MUS81 et XPF. La déplétion concomitante de FANCD2 et SETX inhibe la prolifération cellulaire, un effet qui semblerait spécifique des cellules transformées. Par conséquent, l’interaction létale synthétique entre SETX et FANCD2 que j'ai découverte pourrait être exploitée dans le traitement du cancer
Genomic instability is an enabling characteristic of cancer and a common feature of neurodegenerative diseases. In the scientific community, there is a general consensus that DNA replication stress (RS), which arises following the cell’s exposure to various exogenous and endogenous genotoxic agents, is a key driver of genomic instability.Interestingly, the genome organization and dynamics per se can also favor RS under some circumstances. Examples of genomic regions where completion of replication is particularly challenging are common fragile sites (CFS), genomic loci that tend to form breaks, gaps, or constrictions on mitotic chromosomes under RS conditions. Recently, a plethora of proteins that guard the genome from RS, which if mutated can induce genome instability have been identified. In more recent years, scientists have discovered that a key source of RS, and subsequently genomic instability, is transcription, especially if not spatially and temporally separated from replication. Fanconi Anemia (FA) is a rare inherited bone marrow failure disease characterized by congenital abnormalities and cancer predisposition, caused by mutations in any of the 22 identified FANC genes. FA is characterized by chromosome fragility and hypersensitivity to DNA interstrand-crosslinking (ICL) agents. Furthermore, the FA proteins play roles in resolving DNA damage arising during replication and transcription, and in coordinating both processes. Interestingly, breakpoints occurring in FA cells frequently overlap CFS. At CFS, FANCD2 is recruited with structure-specific endonucleases SLX4, XPF–ERCC1 and MUS81–EME1 to process replication intermediates that can lead to chromosome segregation defects. In addition, FANCD2 at CFSs limits the formation of R-loops. R-loops play key regulatory roles, but may also pose a threat to the genome when they occur in an unscheduled manner. R-loops are monitored by resolving factors such as senataxin (SETX), a RNA:DNA helicase mutated in neurodegenerative diseases. SETX is implicated in several genome maintenance pathways analogous to those regulated by FANC proteins. Prominent functions shared by SETX and FANC proteins include the coordination of replication with transcription and the repair of ICLs. In addition, SETX functions in concert with BRCA1 (FANCS) to allow faithful transcription termination, and forms nuclear foci in response to replication stress, both critical for the maintenance of the genome. Loss-of-function of SETX also causes infertility in mice (a phenotype common to FA mice and patients). Taking into account the common cellular processes that the FANC pathway and SETX participate in, we asked whether there is a functional relationship between them in the maintenance of the genome stability. I show that the absence of SETX induces spontaneous breaks on mitotic chromosomes. The regions involved in these breaks are targeted by FANCD2, which participates in resolution of under-replicated DNA during mitosis, preventing chromosome mis-segregation and allowing cells to continue proliferating. I also show that FANCD2 promotes mitotic DNA synthesis that is dependent on MUS81 and XPF. Co-depleting FANCD2 and SETX impairs cell proliferation, an effect that appears specific to transformed cells. Therefore, I uncovered a synthetic lethal interaction between SETX and FANCD2 that may be exploited in cancer therapy