Dissertations / Theses on the topic 'Natural molecules; Plants'

La hibridació natural a plantes és un fenòmen àmplement conegut. És una important font de variabilitat que accelera l'evolució de les espècies. Es creu que és l'origen de moltes angiospermes, entre elles endemismes locals. Per altra banda, també pot tenir efectes negatius per la supervivència d'aquests endemismes, diluint els seus trets direfencials. En aquesta tesi s'estudia la possible hibridació natural que afecta a tres endemismes baleàrics (Viola jaubertiana, Lotus fulgurans i Helichrysum crassifolium), des del punt de vista dels marcadors moleculars basats en ADN i de la morfologia. S'avalua el paper de la hibridació natural la variabilitat, l'origen i la conservació d'aquestes espècies endèmiques.
Natural hybridization is a widely known process in plants. It is an important source of variation promoting species evolution. It is likely to be the origin of many angiosperms, including local endemisms. Oppositely, it is also regarded as a potential threat for endemisms survivorship, diluting their differentail traits. This thesis deals with putative natural hybridization processes involving three Balearic endemics (Viola jaubertiana, Lotus fulgurans i Helichrysum crassifolium), from the points of view of the DNA molecular markers and the morphology. The role of natural hybridization in the variation, origin, and conservation of the above endemics is evaluated.

Plants produce a rich variety of natural products to face environmental constraints. Enzymes of the cytochrome P450 CYP98 family are key actors in the production of phenolic bioactive compounds. They hydroxylate phenolic esters for lignin biosynthesis in angiosperms, but also produce various other bioactive phenolics. We characterized CYP98s from a moss, a lycopod, a fern, a conifer, a basal angiosperm, a monocot and from two eudicots. We found that substrate preference of the enzymes has changed during evolution of land plants with typical lignin-related activities only appearing in angiosperms, suggesting that ferns, similar to lycopods, produce lignin through an alternative route. A moss CYP98 knock-out mutant revealed coumaroyl-threonate as CYP98 substrate in vivo and showed a severe phenotype. Multiple CYP98s per species exist only in the angiosperms, where we generally found one isoform presumably involved in the biosynthesis of monolignols, and additional isoforms, resulting from independent duplications, with a broad range of functions in vitro
Graduate
2017-08-31

A andiroba (Carapa guianensis) é uma espécie arbórea de importância econômica na região Amazônica pelo grande interesse que vem despertando nas indústrias madeireira e cosmética. É uma planta monóica, com floração assincrônica e auto-incompatível. Ela é bastante plástica e se adapta para ocupar diferentes ambientes, sendo encontrada tanto no baixio como na terra firme. Os objetivos do presente estudo foram avaliar a estrutura genética de duas populações naturais de andiroba e quantificar a diversidade genética intrapopulacional, a autocorrelação espacial e o fluxo gênico analisando uma única população em dois ambientes distintos (terra firme e baixio) e em três classes de tamanho (plântulas, jovens e adultos). Para o estudo interpopulacional, foram avaliados 39 indivíduos adultos no município de Porto Acre e 38 em Rio Branco. Já para o intrapopulacional analisaram-se 957 indivíduos do município de Rio Branco. Foram utilizados sete locos polimórficos de microssatélites que permitiram observar 42 alelos em ambas as populações, sendo que as estimativas dos parâmetros genéticos foram muito próximas entre elas. Não foi observada endogamia e a taxa de cruzamento aparente foi alta indicando reprodução por alogamia. A maior parte da variabilidade genética (90,5%) foi encontrada dentro das populações. No entanto, a divergência genética entre as populações (9,5%) foi estatisticamente significativa e pode ser considerada intermediária. Com relação à variabilidade intrapopulacional, observou-se 85 alelos na população Rio Branco, com 67 alelos ocorrendo no ambiente de terra firme e 70 no baixio. A diversidade gênica foi semelhante nas três classes de tamanho na população total e nos dois ambientes, não tendo sido observada endogamia em nenhuma das classes de tamanho dos ambientes. Também não foi observada divergência genética entre as classes de tamanho. Já entre os indivíduos do ambiente de terra firme e os do baixio esta divergência foi baixa (1,63%), mas significativa. A taxa de cruzamento aparente foi alta tanto para os ambientes como para a população total. As analises de autocorrelação espacial dos genótipos revelaram que a população Rio Branco apresentou baixa estruturação espacial, sendo que as árvores localizadas a uma distância de até aproximadamente 370 metros tenderam a ser geneticamente similares. No ambiente de baixio encontrouse este mesmo padrão, com árvores localizadas a uma distância de até 160 metros mostrando-se mais aparentadas entre si. Quando se observou separadamente cada classe de tamanho neste ambiente, verificou-se baixa estruturação na classe dos jovens, e uma disposição quase que aleatória dos genótipos na classe dos adultos. Na terra firme não se observou estruturação espacial dos genótipos em nenhuma das classes. As analises de parentesco das plântulas indicaram que 7,3% dos parentais paternos foram encontrados no ambiente de terra firme e 9,4% no baixio. Este baixo índice encontrado mostra que é grande a quantidade de fluxo gênico vindo de fora da área amostrada. Verificou-se fluxo gênico de longo alcance dentro da população, observando-se uma distância média de até 888,8 metros entre os ambientes. Com base nos conhecimentos gerados sobre a estrutura genética, podem-se estabelecer estratégias de manejo e conservação dessas populações naturais de andiroba.
Crabwood (Carapa guianensis) is a tree of economic importance in the Amazon region, due to the great interest it has been attracting in the wood and cosmetics industries. It is a monoecious species, with asynchronic flowering and self-incompatible. This species is very plastic and adapts to occupy different habitats, and it is found in the lowland and upland habitats. The objectives of this study were to evaluate the genetic structure between two natural populations of crabwood, and to quantify the intrapopulational genetic diversity, the spatial autocorrelation and gene flow of one population, considering two habitats (upland and lowland) and three size classes (seedlings, young plants and adults). For the interpopulational study, 39 adult individuals were evaluated in the municipal district of Porto Acre and 38 in Rio Branco. For the intrapopulational studies, 957 individuals were analyzed in the municipal district of Rio Branco. Seven polymorphic microssatellite loci were used to detect 42 alleles in both populations, were the genetic parameter estimates were very similar to each other. Inbreeding was not observed and the apparent outcrossing rate was high, indicating an outcrossing breeding system for this species. Most of the genetic variability (90.5%) was found to be within populations. However, the genetic divergence between them (9.5%) was statistically significant and can be considered as intermediate. Regarding the intrapopulacional variability, 85 alleles were observed in the Rio Branco population, with 67 alleles occurring in the upland habitat and 70 in the lowland. The genetic diversity was similar in the three size classes in the total population, and in the two habitats. No inbreeding was observed in any of the size classes of either habitat. No genetic divergence was observed between size classes as well. Between individuals of the upland habitat and those of the lowland habitat, this divergence was low (1.63%), but significant. The autocorrelation spatial analysis of the genotypes showed that the Rio Branco population presented low spatial genetic structuring, with the trees located at a distance of approximately 370 meters tending to be genetically similar. In the lowland habitat the same pattern was found, with trees located at a distance of 160 meters tending to be more related between themselves. When each size class of this habitat was observed separately, a low spatial genetic structuring was found in the young classes and an almost random disposal of the genotypes was observed in the adult classes. In the upland habitat, a spatial genetic structure of the genotypes was not observed in any of the size classes. The paternity analysis of the seedlings indicated that 7.3% of the male parents were found in the upland habitat and 9.4% in the lowland. This low index shows that the amount of gene flow coming from outside the sampling area is high. Long-distance gene flow within the population studied was observed, with an average distance of 888.8 m found between habitats. Based in the acquired knowledge on the genetic structure, management and conservation strategies can be established for these natural crabwood populations.

Plants produce a vast number of low-molecular-weight chemicals (so called secondary or specialized metabolites) that confer a selective advantage to the plant, such as defense against herbivory or protection from changing environmental conditions. Many of these specialized metabolites are used for their medicinal properties, as lead compounds in drug discovery, or to impart our food with different tastes and scents. These chemicals are produced by various pathways of enzyme-mediated reactions in plant cells. It is suspected that enzymes in plant specialized metabolism evolved from those in primary metabolism. Understanding how plants evolved to produce these diverse metabolites is of primary interest, as it can lead to the engineering of plants to be more resistant to both biotic and abiotic stress, or to produce more complex small molecule compounds that are difficult to derive. To that end, the first objective was to develop a schema for rational protein engineering using meta-analyses of a well-characterized sesquiterpene synthase family encoding two closely-related but different types of enzymes, using quantitative measures of natural selection on amino-acid positions previously demonstrated as important for neofunctionalization between two terpene synthase gene families. The change in the nonsynonymous to synonymous mutation rate ratio (dN/dS) between these two gene families was large at the sites known to be responsible for interconversion. This led to a metric (delta dN/dS) that might have some predictive power. This natural selection-oriented approach was tested on two related enzyme families involved in either nicotine/tropane alkaloid biosynthesis (putrescine N-methyltransferase) or primary metabolism (spermidine synthase) by attempting to interconvert a spermidine synthase to encode putrescine N-methyltransferase activity based upon past patterns of natural selection. In contrast to the HPS/TEAS system, using delta dN/dS metrics between SPDS and PMT and site directed mutagenesis of SPDS did not result in the desired neofunctionalization to PMT activity. Phylogenetic analyses were performed to investigate the molecular evolution of plant N-methyltransferases involved in three alkaloid biosynthetic pathways. The results from these studies indicated that unlike O-MTs that show monophyletic origins, plant N-MTs showed patterns indicating polyphyletic origins. To provide the foundation for future molecular-oriented studies of urushiol production in poison ivy, the complete poison ivy root and leaf transcriptomes were sequenced, assembled, and analyzed.
Ph. D.

Existe actualmente en el mercado una creciente demanda mundial de híbridos genéticamente estables de la especie ornamental Phalaenopsis sp., es necesario entonces desarrollar más protocolos de propagación masiva mediante embriogénesis somática que aseguren altos porcentajes de propagación sin provocar cambios en el genoma de las plantas regeneradas. El presente trabajo de investigación tuvo como objetivo evaluar la Variación Somaclonal de clones regenerados a partir de embriones inducidos en segmentos de hoja de Phalaenopsis Var. Dudú. Se evaluaron también nueve tratamientos para inducción con dos Reguladores del Crecimiento Vegetal. Los tratamientos evaluados fueron: tres concentraciones de BA (1.0, 2.0 y 3.0 mgL-1) y tres concentraciones de 2,4-D (3.0, 4.0 y 5.0 mgL-1) en explantes jóvenes y maduros. El análisis de los datos de las medias de inducción indica que no existen diferencias estadísticas significativas entre los tratamientos, pero la edad del explante sí influye en la capacidad embriogénica del mismo.
INTRODUCCIÓN La familia Orchidaceae es considerada la más extensa y rica en diversidad debido a que está conformada por más de ochocientos géneros y más de veinte mil especies Las orquídeas tienen dos tipos básicos de crecimiento: simpodial en donde el nuevo crecimiento se produce a partir de una yema axilar en sentido horizontal; y monopodial en el cual el nuevo crecimiento se da a partir de una yema apical en sentido vertical como es el caso de la especie Phalaenopsis (Escobar y Múnera 1991) Phalaenopsis es una especie epífita originaria del sureste de Asia India Indonesia y parte de Australia (Rittershausen y Rittershausen 2004) Estas representan uno de los grupos de plantas más apreciados a nivel mundial por el colorido forma y duración de sus flores (Tirado et al 2005) Sin embargo debido a su crecimiento monopodial la propagación vegetativa se ha dificultado y la reproducción sexual se ha visto agravada por la presencia de altos índices de esterilidad en algunos híbridos (Feria et al 2007) Es por ello que se han desarrollado diversas formas de propagación clonal in vitro de Phalaenopsis por ejemplo: la formación de embriones somáticos a partir de callos hojas ápices radicales ápices meristemáticos yemas florales y cuellos o coronas para su posterior regeneración en plántulas (Tirado et al 2005) 2 La producción masiva de orquídeas se puede lograr mediante el uso de técnicas de micropropagación Sin embargo esto puede llevar a la ocurrencia de Variación Somaclonal (VS) lo que provoca cambios genéticos y en consecuencia variaciones morfológicas o fisiológicas en el producto final (Chen y Chen 2007) Puesto que el tiempo de producción de orquídeas es relativamente largo identificar la VS por los rasgos fenotípicos resulta difícil Por ello se pueden utilizar técnicas moleculares como el Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) el Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP) Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) o la clonación de genes candidatos mediante el uso de primers degenerados y la Reacción de Cadena de la Polimerasa (PCR) basado en la conservación de secuencias de aminoácidos en los genes diana; que permiten identificar mutaciones genéticas o epigenéticas (Chen y Chen 2007)

Orientador: Catalina Romero Lopes
Banca: Edson Seizo Mori
Banca: Rogério Abdallah Curi
Resumo: O Arachis Pintoi é uma leguminosa forrageira de alta qualidade, apresentando valores de 18 a 25% de proteína bruta, 60 a 67% de digestibilidade "in vitro" da matéria seca e 60 a 72% de digestibilidade da energia bruta, além de apresentar grande aceitabilidade pelos animais. O valor nutritivo do A. Pintoi é mais alto quando comparado com gramíneas e leguminosas tropicais. No sistema de produção animal em pasto a utilização de leguminosa forrageira deve ser valorizada pela qualidade de produção e pelo alto valor nutritivo que é oferecido à dieta e também pelo aporte de nitrogênio atmosférico incorporado aos ecossistemas das pastagens. O uso de leguminosas em pastagens, no Brasil, ainda é muito limitado, seja porque o portfólio de cultivares é pequeno, ou porque o preço da semente ou do material vegetativo é elevado. Neste trabalho foram avaliados quatro genótipos de A. Pintoi (G1, G2, G3 e G4) oriundos de pré-seleção de um híbrido natural da espécie, utilizando o marcador molecular microssatélite visando à seleção de plantas homozigotas para, a partir delas, seguir o processo de melhoramento em cada genótipo para obtenção de linhagens puras. Foram utilizados nesta avaliação 14 locos de microssatélites dos quais, dez mostraram-se polimórficos e quatro monomórficos. O número de alelos observado variou de 1 a 11 por loco, com um total de 85 alelos e média de 8,5 por loco. A heterozigose observada variou de 0,3377 no loco AP183CV a 0,8701 no loco AP190CV com média de 0,6403. As plantas de maior homozigose foram selecionadas para dar continuidade ao processo de melhoramento e após avaliação agronômica poderão ser lançadas como potenciais cultivares de A. Pintoi. Considerando-se somente as plantas com homozigose superior a 70%, foi possível selecionar cinco plantas do genótipo G1 ...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo)
Abstract: Not available.
Mestre

Les rhamnolipides produits par Pseudomonas aeruginosa sont des glycolipides ayant des propriétés élicitrices des réactions de défense de la vigne et d'Arabidopsis thaliana dont le mode de perception est inconnu. En tant que composés amphiphiles, uneinteraction avec la membrane plasmique a été proposée. Au niveau fondamental, il est démontré ici par une approche de biophysique utilisant la RMN du solide et des simulations de dynamique moléculaire in silico, que le caractère amphiphile des RLs favorise leur insertion au sein de modèles lipidiques de membranes de plantes, qui ne sont pas déstabilisés par leur présence. De plus il a été observé, par la réalisation de puces à ADN sur A. thaliana, que la perception de ces composés induisait une reprogrammation transcriptionnelle précoce de grande ampleur. En vue de démontrer l'intérêt agronomique des RLs pour la protection d'une plante de grande culture, leur activité sur le colza (Brassica napus) a également été étudiée. Des marqueurs caractéristiques de la mise en place des réponses de défense ont été observés, ainsi qu'un effet de protection detissus foliaires contre le pathogène B. cinerea, ce qui renforce le potentiel des RLs comme agents de biocontrôle pour la protection des Brassicacées
Pseudomonas aeruginosa rhamnolipids are glycolipids known to trigger defense responses in grapevine and Arabidopsis thaliana but their mode of perception by plants is still unknown. As amphiphilic compounds, rhamnolipids have been proposed to interactdirectly with plasma membrane lipids. Here we show, by a biophysical approach involving solid state NMR and in silico molecular dynamic simulations, that the insertion of rhamnolipids does not disturb the dynamic of plant plasma membrane models. Inorder to characterize early gene expression modifications triggered by rhamnolipids a micro-array study on A. thaliana was realized, revealing a large transcriptional change. The potential of rhamnolipids to protect the agronomical plant Brassica napus was also investigated. Rhamnolipid triggering of chemical and physical defenses associated with efficient protection against the opportunistic pathogenic fungus Botrytis cinerea, used as a model, was shown. Those results highlight a real potential of RLs as biocontrol agents for Brassicaceae protection

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:14Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-10-16Bitstream added on 2014-06-13T18:43:18Z : No. of bitstreams: 1 otto_jcs_me_botib.pdf: 386043 bytes, checksum: b844456cf5a9d4dd7bae254693548355 (MD5)
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)
O Arachis Pintoi é uma leguminosa forrageira de alta qualidade, apresentando valores de 18 a 25% de proteína bruta, 60 a 67% de digestibilidade “in vitro” da matéria seca e 60 a 72% de digestibilidade da energia bruta, além de apresentar grande aceitabilidade pelos animais. O valor nutritivo do A. Pintoi é mais alto quando comparado com gramíneas e leguminosas tropicais. No sistema de produção animal em pasto a utilização de leguminosa forrageira deve ser valorizada pela qualidade de produção e pelo alto valor nutritivo que é oferecido à dieta e também pelo aporte de nitrogênio atmosférico incorporado aos ecossistemas das pastagens. O uso de leguminosas em pastagens, no Brasil, ainda é muito limitado, seja porque o portfólio de cultivares é pequeno, ou porque o preço da semente ou do material vegetativo é elevado. Neste trabalho foram avaliados quatro genótipos de A. Pintoi (G1, G2, G3 e G4) oriundos de pré-seleção de um híbrido natural da espécie, utilizando o marcador molecular microssatélite visando à seleção de plantas homozigotas para, a partir delas, seguir o processo de melhoramento em cada genótipo para obtenção de linhagens puras. Foram utilizados nesta avaliação 14 locos de microssatélites dos quais, dez mostraram-se polimórficos e quatro monomórficos. O número de alelos observado variou de 1 a 11 por loco, com um total de 85 alelos e média de 8,5 por loco. A heterozigose observada variou de 0,3377 no loco AP183CV a 0,8701 no loco AP190CV com média de 0,6403. As plantas de maior homozigose foram selecionadas para dar continuidade ao processo de melhoramento e após avaliação agronômica poderão ser lançadas como potenciais cultivares de A. Pintoi. Considerando-se somente as plantas com homozigose superior a 70%, foi possível selecionar cinco plantas do genótipo G1...
Not available.

Hymenaea courbaril (Caesalpinaceae) é uma espécie tropical madeireira que apresenta grande plasticidade fenotípica observada taxonomicamente na forma de seis variedades. Nove loci microssatélites foram utilizados para estudar a estrutura espacial e a distribuição da estrutura genética dentro e entre populações de Hymenaea courbaril var. stilbocarpa e Hymenaea courbaril var courbaril, no Brasil e no Panamá, respectivamente. Os níveis de diversidade genética obtidos nas cinco populações estudadas foram elevados, em média ∃ He = 0,744. Observou-se que a maior parte da variabilidade está contida dentro das populações e não entre as variedades estudadas. Desse modo, a diferenciação foi maior dentro de populações pertencentes a uma mesma região ( θ p / R =0,084) que entre regiões ( θ R =0,034). Adicionalmente, foram detectados significantes déficits de heterozigotos e elevados coeficientes de coancestria, associadas a um baixo tamanho efetivo em todas as populações estudadas. As análises moleculares indicaram diferenciação significativa, porém baixa, entre as variedades, tendo em vista a distância geográfica entre as mesmas e a plasticidade fenotípica observada. As análises de autocorrelação espacial revelaram a existência de uma forte estruturação entre os genótipos. Considerando o atual estágio de conservação da espécie e o grau de degradação na escala da paisagem, foram detectados efeitos “bottlenecks” e elevados níveis de endogamia nas populações. Desta forma, recomenda-se que estratégias para conservação genética dessas variedades levem em consideração a distribuição espacial combinando metodologias complementares de conservação “in situ” e “ex situ”.
Hymenaea courbaril (Caesalpinaceae) is a tropical timber species, having substantial phenotypic plasticity expressed morphologically into six varieties. Nine microsatellite loci were used for the assessment of the spatial structure and patterns of genetic structure within and among populations of Hymenaea courbaril var. stilbocarpa and Hymenaea courbaril var. courbaril in Brazil and Panamá respectively. Levels of genetic diversity, found in the five populations studied, were high, in average ∃ He = 0,744. Most of the variation was found within populations and not between the two varities. The genetic differentiation was also larger within populations belonging to the same region ( θ p / R =0,084) that between regions ( θ R =0,034). Significant deficit of heterozygotes and high levels of coancestry due to small effective population size in all study populations were also found. Spatial autocorrelational analysis had shown a strong degree of genetic structure among the genotypes. Molecular analysis had detected a significant, but small, differentiation between varieties, even considering the geographic distance and the phenotypic plasticity observed. Considering all the results found, the current conservation status of this species and the degree of degradation at landscape level, it is more likely that the combination of these factors had contributed for the manifestation of the bottleneck effect detected and the high levels of endogamy. Therefore it is highly recommended that strategies for genetic conservation of this species take into account its patterns of spatial distribution and combine in-situ and ex-situ efforts for conservation complementary conservation strategies.

This study investigated whether participation in the Partnership for Research and Education in Plants (PREP), a long-term authentic plant research project, in conjunction with explicit verses implicit instruction can change high school students' conceptions of the nature of science (NOS). The participants included a total of 134 students comprised of three groups from 10 total classes over the course of two academic years. Participants in four classes (two each year) participated in PREP and received explicit instruction on NOS. Participants in four other classes (two each year) participated in PREP and received implicit only instruction on NOS. Additionally, two classes (one each year) of high-achieving freshmen participated in PREP and received explicit instruction on NOS. This third group was used as a comparative group to the other two groups, due to their high achievement in middle school math and science. The treatment for all three groups spanned 8 weeks and included participation in an authentic plant research project. An open-ended questionnaire (modified Views of Nature of Science - VNOS), in conjunction with semi-structured interviews, was used to assess students' conceptions before and after the intervention. Results showed that all three groups improved their conceptions of NOS equally. The high-achieving group began with significantly higher-scoring views prior to the completion of the intervention, and improved to the same degree as the other two groups. A comparison of the explicit group to the implicit only group showed that there was no significant difference in their improvement, as both groups improved equally. Implications for the teaching and learning of NOS are discussed.

Made available in DSpace on 2014-07-29T16:24:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 taryana.pdf: 5876234 bytes, checksum: 626e6debe969770d6329c335e12d0cad (MD5) Previous issue date: 2006-08-24
The Species Palicourea coriacea (Cham) K,Shum is a species little know, it is belonging to the Rubiaceae family, popularly known as douradinha. The popular use medicine in the therapy of kidneys illnesses. The popular name douradinha is associated with the color of the bracts and of the stem and the species occurs in Cerrado s Bioma, however in different environments. Studies about the genetic diversity and its distribution in natural populations of P. coriacea are of extreme importance for the definition of adequate strategies of handling and cultivation, however they do not exist in literature, studies of this nature. This work had as objective to evaluate the genetic structure from nine natural populations of P. coriacea, collected in States of Goiás and Bahia and to evaluate the genetic diversity of these populations through markers RAPD. The P. coriacea species presented one high level of genetic diversity, or heterozygosity waited by Nei (1972) that it varied between 0,259 and 0,338 in the populations, with equal on average value the 0,296. The AMOVA disclosed that 23% of the total variability is meeting each other between populations. Although the estimates of apparent gene flow (Nm) have disclosed values inferior to one, on the other hand, equal the 0,83. The analyses of Bayesian Statistics had disclosed to a value of f (FIS) equal the 0,98 suggesting the possibility of this species has behavior like autogamous species. The analyses of grouping of the populations using Bayesian and AMOVA statistics disclosed that it does not exist a correlation between geographic distance and genetic distance all the nine populations they grouping, eventually, not obeying its geographic origin. Then, the hypothesis previously formulated of that geographically next populations would be genetic next, was discarded for the results gotten for the Mantel test where it got a correlation of 0,155. In addition, this relatively high inter populations differentiation allows to recommend to a strategy ex situ of the genetic variability using the biggest possible number of populations. In what, the conservation says respect in situ must be taken in account characteristic genetic and demographic of this species considering that this fact implies in the possibility of a continuous evolution and in the development of new adaptable strategies. It is necessary to have conscience on the distribution of the genetic diversity of these areas with intention to not only promote polities for preservation of found natural populations in national parks, but yes to private preservation of the legal reserves and properties.
A espécie Palicourea coriacea (Cham.) K. Schum é uma espécie pouco conhecida cientificamente, pertencente à família Rubiaceae, popularmente conhecida como douradinha. É utilizada pela medicina popular na terapia de doenças renais. O nome popular douradinha está associado à cor das brácteas e do caule e a espécie ocorre no bioma Cerrado, porém em diferentes fitofisionomias. Estudos sobre a diversidade genética e sua distribuição em populações naturais de P. coriacea são de extrema importância para a definição de estratégias adequadas de manejo e cultivo, porém não existem, na literatura, estudos dessa natureza. Este trabalho teve como objetivo avaliar a estrutura genética de nove populações naturais de P. coriacea, coletadas nos Estados de Goiás e Bahia e avaliar a diversidade genética dessas populações utilizando marcadores RAPD. A espécie P. coriacea apresentou um alto nível de diversidade genética, ou heterozigosidade esperada de Nei (1972) que variou entre 0,259 e 0,338 nas populações, com um total geral igual a 0,296. A AMOVA revelou que 23 % da variabilidade total se encontram entre populações e 77 % se encontra dentro de populações. As estimativas de fluxo gênico aparente (Nm) foram inferiores a um, ou seja, igual a 0,83. As análises do índice de fixação (f) por abordagem bayesiana forneceram valores médio igual a 0,98 sugerindo a possibilidade dessa espécie se comportar como uma espécie autógama. As análises de divergência genética e padrão espacial das populações utilizando as matrizes de θB e ΦST par a par revelou que não existe uma correlação entre distância geográfica e distância genética todas as nove populações se agrupam aleatoriamente, não obedecendo a sua origem geográfica. Assim, a hipótese previamente formulada de que populações geograficamente próximas teriam que ser geneticamente próximas, foi descartada pelos resultados obtidos no teste de Mantel onde a correlação foi igual a 0,155. Assim essa diferenciação interpopulacional relativamente alta permite recomendar uma estratégia de amostragem para a conservação ex situ da variabilidade genética, utilizando o maior número de populações possível. No que diz respeito a conservação in situ, deve ser levado em conta características genéticas e demográficas dessa espécie, considerando que esse fato implica na possibilidade de uma evolução contínua e no desenvolvimento de novas estratégias adaptativas. É necessário ter conhecimento sobre a distribuição da diversidade genética destas áreas com o intuito de auxiliar nas políticas para preservação não somente de populações naturais encontradas em parques nacionais, mas também preservação das reservas legais e propriedades privadas.

Doutoramento em Biologia
A vinha, Vitis vinifera L., abriga naturalmente um ecossistema microbiano complexo ou microbioma, tais como microrganismos neutros, fitopatogenos ou benéficos. Entre os fitopatogenos, aqueles implicados nas doenças do lenho da videira (GTDs) são responsáveis pelas doenças mais destrutivas, para o qual não existem tratamentos altamente eficazes. Por outro lado, os microrganismos benéficos (BCAs) podem desempenhar papéis específicos na proteção das plantas contra estes agentes. Neste sentido, o atual desafio consiste em compreender como estes BCAs interagem com a planta e qual o seu potencial biotecnológico para o desenvolvimento de novas estratégias de proteção da planta. Neste contexto, o objetivo deste estudo visou primeiramente analisar profundamente as comunidades microbianas associadas com a videira ao longo do seu ciclo de crescimento até à fermentação do vinho e, em seguida, compreender as interações entre vinha-BCAs-GTDs. Para isso, dois potenciais BCAs isolados da videira foram testados contra diferentes espécies de Botryosphaeriaceae e, em seguida, caracterizados relativamente ao seu potencial de colonização, de indução dos mecanismos de defesa da planta, na presença ou não do fitopatogeno (D. seriata F98.1), e análise do respetivo genoma. Os resultados demonstraram que o microbioma da videira é altamente dinâmico ao longo do ciclo de crescimento da planta. Como esperado, a biodiversidade microbiana é maior nos solos, e estas comunidades diferem significativamente daquelas presentes nas folhas e mostos vínicos. Contudo, alguns destes microrganismos são partilhados, o que sugere a existência de um microbioma comum. Diferentes isolados foram obtidos, pertencendo na sua maioria ao género Bacillus, Streptomyces e Aureobasidium. A videira é naturalmente colonizada por microrganismos com potencial antagonista de várias espécies de Botryosphaeriaceae. Entre estes, destacam-se os isolados Streptomyces sp. Fito_S127B e A. pullulans Fito_F278, que foram selecionados como potenciais BCAs. Estes microrganismos produzem diferentes enzimas extracelulares importantes para as atividades de controlo biológico e são capazes de colonizar com sucesso a videira: Fito_S127B coloniza a rizosfera, enquanto que Fito_F278 coloniza desde as raízes até às folhas. A inoculação artificial da videira com D. seriata F98.1 mostrou que o comprimento das lesões necróticas causadas pelo fitopatogeno são significativamente reduzidas na presença de Fito_S127B. Em contrapartida, a espécie Fito_F278 foi menos eficaz. Estes BCAs ativaram algumas respostas de defesa específicas da videira, o que permitiu uma resposta mais rápida e sólida da planta contra o agente fitopatogénico. A análise do genoma destes microrganismos permitiu averiguar diferentes genes que codificam compostos bioativos altamente importantes para o controlo biológico. De uma forma geral, este estudo abrange novos conhecimentos relativos à estrutura das comunidades microbianas associadas à videira e às suas interações. Para além disso, destaca que a videira ostenta naturalmente microrganismos com um controlo biológico promissor e que estes podem promover respostas de defesa importantes na planta. Neste sentido, estes resultados permitem não só uma melhor compreensão das interações da videira-BCAs-GTDs, mas também representam um forte contributo e avanço para o desenvolvimento de novas estratégias da gestão da vinha, tais como as doenças do lenho.
Vitis vinifera L. is a widely cultivated fruit crop, that naturally harbours a complex microbial ecosystem or plant microbiome, such as neutral, phytopathogenic or beneficial microorganisms. Among phytopathogens, those implied in Grapevine Trunk Diseases (GTDs) are responsible for the most destructive diseases worldwide, and currently no highly effective treatments are available. Beneficial microorganisms (BCAs) may play specific roles on plant protection against phytopathogens though, the present challenge is to understand how such BCAs interact with plant and their biotechnological potential for development of innovation strategies. In this context, the aim of this study was firstly to unveil the microbial communities associated with grapevine along its growth cycle until wine fermentation and, secondly, to better understand the grapevine – BCAs – GTDs interactions. Two potential BCAs isolated from grapevine were tested against Botryosphaeriaceae species and then deep characterized, namely for their colonisation potential, induction of defence mechanisms in grapevine, in the presence or not of D. seriata F98.1, and their genome analysis. Results showed that grapevine microbiome was very dynamic along the growth cycle. As expected, the microbial biodiversity was higher in soils, and these microbial communities differed significantly from those of leaves and wine musts. A proportion of microbial communities was shared within these structures, suggesting the existence of a core microbiome. Several isolates were then obtained from grapevine which mostly belonged to Bacillus, Streptomyces and Aureobasidium genera. Some of them significantly decreased in vitro the mycelium growth of several Botryosphaeriaceae species, such as Streptomyces sp. Fito_S127B and A. pullulans Fito_F278 which were highly effective and thus selected as potential BCAs. These strains showed to produce a high range of extracellular enzymes with biocontrol value, and were able to successfully colonize grapevine: Fito_S127B was an epiphyte from rhizosphere, while Fito_F278 colonised grapevine from roots to leaves. The artificial inoculation of green stems with D. seriata F98.1 on cutting plants showed that the necrotic lesions length caused by the pathogen was significantly reduced by Fito_S127B, in contrast to Fito_F278, which was less effective. Furthermore, these BCAs activated some specific defence responses of grapevine, allowing a more rapid and solid response of plant against the pathogen. The genome analysis also showed that these BCAs strains are an important source of bioactive compounds of biocontrol value. Overall, this study brought new insights on the structure of microbial communities of grapevine and their interactions. Moreover, highlighted that grapevine is a natural source of microorganisms with a promising biocontrol against GTDs, and that they can promote plant defence responses. Thus, these findings provide not only a better understand of the grapevine- BCAs- GTDs interactions but also a strong contribution to future GTDs management strategy.

O palmiteiro (Euterpe edulis Mart.) é uma espécie nativa da Mata Atlântica cujas populações naturais encontram-se degradadas pelo extrativismo. Considerando a escassez de informações relativas às conseqüências genéticas da exploração de palmito, o objetivo deste estudo foi avaliar o impacto do processo de exploração sobre os níveis de diversidade, estrutura genética e tamanho efetivo de populações da espécie. Também foram estudados aspectos genéticos do recrutamento de plantas e o sistema reprodutivo da espécie. O estudo foi realizado em duas localidades do Estado de Santa Catarina, nos municípios de São Pedro de Alcântara e Ibirama. Em cada localidade foram escolhidas duas áreas de ocorrência natural de E. edulis, uma sem influência antrópica e outra que sofreu exploração de palmito, totalizando quatro populações. Os sistemas de exploração foram: (i) extrativismo - onde todos os indivíduos acima de 2 m de altura são cortados, incluindo plantas reprodutivas; and (ii) manejo - onde somente indivíduos acima de 9 cm de DAP são cortados, com a manutenção de 50 plantas reprodutivas por hectare. Em cada população foram examinadas plântulas, jovens e adultos, usando oito locos microssatélites e dez locos alozímicos. Os resultados revelaram que a espécie se reproduz por alogamia ( m tˆ = 0,996 para microssatélites e m tˆ = 1,000 para isoenzimas), porém a ocorrência de cruzamentos entre indivíduos aparentados (até 5%) e cruzamentos biparentais (10%) indica a ocorrência de cruzamentos não aleatórios. Em locos alozímicos, observaram-se as seguintes amplitudes de variação das estimativas de diversidade entre as categorias: Aˆ : 3,05 a 3,15; e Hˆ : 0,416 a 0,431; o Hˆ : 0,378 a 0,403. Em locos microssatélites, a variação observada foi a seguinte: Aˆ : 14,12 a 14,72; e Hˆ : 0,781 a 0,785; o Hˆ : 0,678 a 0,709. Nas populações não exploradas, houve um aumento na freqüência de heterozigotos na direção do estádio adulto, o que sugere a ação da seleção favorecendo o aumento de heterozigotos. Valores altos e significativos do índice de fixação ( fˆ ) foram observados, especialmente nos marcadores microssatélites, indicando desvios do equilíbrio de Hardy-Weinberg. De modo geral, ambos os marcadores revelaram um aumento dos valores de fˆ nas populações exploradas, especialmente entre as plântulas. As estimativas ST Gˆ e ST Rˆ não revelaram alterações na estrutura genética das populações exploradas e demostraram uma divergência genética inferior a 5% na maioria das comparações aos pares, em ambos os marcadores. O tamanho efetivo ( e Nˆ ) dos indivíduos adultos por hectare foi superior a 110 nas populações não pertubadas, enquanto nas populações exploradas, o tamanho efetivo por hectare foi reduzido para 45, sob manejo, e 14, sob extrativismo. Porém, o tamanho efetivo total das populações exploradas ainda é elevado, o que explica a manutenção dos altos níveis de diversidade nessas populações. Finalmente, a informação genética conjunta desses marcadores demonstrou que os efeitos da exploração foram pouco pronunciados até o momento em relação aos níveis de diversidade e estrutura genética das populações de E. edulis. Entretanto, a redução da população de cruzamentos resultou em alterações no comportamento reprodutivo dos indivíduos, promovendo um aumento nos níveis de endogamia nas coortes mais jovens das populações exploradas. Contudo, os resultados obtidos neste estudo indicaram questões adicionais a serem estudadas. Em função do elevado nível de variabilidade dos locos microssatélites observado em E. edulis, recomenda-se aumentar o tamanho das amostras visando otimizar a informação genética proporcionada por esses marcadores. Além disso, novos estudos são necessários sobre os efeitos do manejo tecnificado, uma vez que os resultados obtidos podem ter sido influenciados por outros eventos de exploração ocorridos no passado e pelas populações existentes nas proximidades devido ao elevado fluxo gênico da espécie.
Heart-of-palm tree (Euterpe edulis Mart.; Arecaceae) is a native species of the Atlantic forest whose natural populations are degraded by extractivism. Regarding the relative scarcity of information on the genetic consequences of palm heart exploitation, the aim of this study was to investigate the effects of two exploitation systems - extractivism and management - on the levels of variability, genetic structure and effective size of Euterpe edulis Mart. populations. We also investigated genetic aspects of the plant recruitment and the reproductive system of the species. Four natural populations of E. edulis with different histories of disturbance were surveyed in the districts of São Pedro de Alcântara and Ibirama, Santa Catarina, Brazil. At both sites, we sampled an undisturbed and an exploited population. The exploitation systems were: (i) extractivism - where most individuals higher than 2 m are harvested, including reproductive plants; and (ii) management - where only individuals with more than 9 cm of DBH are harvested, with the maintainance of 50 reproductive plants per ha. Three categories of plants, from seedlings to adults, were examined using eight microsatellite loci and ten allozyme loci. Results demonstrated the preferentially allogamic behaviour of the species ( m tˆ = 0.996 for microsatellites and m tˆ = 1.000 for allozymes), but the occurrence of matings among related individuals (5%) and biparental matings (10%) indicated the existence of non-random matings in this species. For allozymic loci, the following diversity estimates were obtained among the categories: Aˆ : 3.05 to 3.15; e Hˆ : 0.416 to 0.431; o Hˆ : 0.378 to 0.403. For microsatellites, the estimates were as follows: Aˆ : 14.12 to 14.72; e Hˆ : 0.781 to 0.785; o Hˆ : 0.678 to 0.709. In undisturbed populations, there was an increase in heterozygote frequency towards the adult stages, suggesting the action of natural selection favouring such heterozygote increase. Highly significant values of fixation index ( fˆ ) were observed, mainly at microsatellite loci, indicating departures from Hardy-Weinberg expectation. Both markers displayed an increase of fˆ values in the exploited populations, especially for seedlings. The estimates of interpopulation genetic variation ( ST Gˆ ; ST Rˆ ) revealed that more than 95% of the molecular genetic variability of the species is distributed within populations, and there was no evidence of changes in genetic structure of the exploited populations. Effective size ( e Nˆ ) per hectare of the adult individuals was higher than 110 in the two undisturbed populations, while in the exploited populations the effective size per hectare was reduced to 45 under management, and 14 under extractivism. However, the total effective size of the exploited populations was still high, which explains the maintenance of high diversity levels in these populations. Finally, the genetic information from both markers displayed small pronounced effects of the exploitation process on variability and population genetic structure of E. edulis, with the exception of an increase in the inbreeding levels among seedlings and juveniles of the exploited populations. However, our results raised further questions for study. Because of the hypervariability of microssatellite loci used in this work, we would recommend an increase in the sample size (>100) in order to optimize the genetic information provided by these markers. Moreover, new investigations are necessary on the effects of management, since the results from this study could have been influenced by other exploitation events that have occurred in the past and by the existence, due to the high gene flow of the species, of surrounding undisturbed populations.

Made available in DSpace on 2014-12-17T15:42:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 FabianoESG_TESE.pdf: 2562039 bytes, checksum: f41fc74bb604ad5b4eb0383a80628c68 (MD5) Previous issue date: 2010-03-30
Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico
Among the new drugs launched into the market since 1980, up to 30% of them belong to the class of natural products or they have semisynthetic origin. Between 40-70% of the new chemical entities (or lead compounds) possess poor water solubility, which may impair their commercial use. An alternative for administration of poorly water-soluble drugs is their vehiculation into drug delivery systems like micelles, microemulsions, nanoparticles, liposomes, and cyclodextrin systems. In this work, microemulsion-based drug delivery systems were obtained using pharmaceutically acceptable components: a mixture Tween 80 and Span 20 in ratio 3:1 as surfactant, isopropyl mirystate or oleic acid as oil, bidistilled water, and ethanol, in some formulations, as cosurfactants. Self-Microemulsifying Drug Delivery Systems (SMEDDS) were also obtained using propylene glycol or sorbitol as cosurfactant. All formulations were characterized for rheological behavior, droplet size and electrical conductivity. The bioactive natural product trans-dehydrocrotonin, as well some extracts and fractions from Croton cajucara Benth (Euphorbiaceae), Anacardium occidentale L. (Anacardiaceae) e Phyllanthus amarus Schum. & Thonn. (Euphorbiaceae) specimens, were satisfactorily solubilized into microemulsions formulations. Meanwhile, two other natural products from Croton cajucara, trans-crotonin and acetyl aleuritolic acid, showed poor solubility in these formulations. The evaluation of the antioxidant capacity, by DPPH method, of plant extracts loaded into microemulsions evidenced the antioxidant activity of Phyllanthus amarus and Anacardium occidentale extracts. For Phyllanthus amarus extract, the use of microemulsions duplicated its antioxidant efficiency. A hydroalcoholic extract from Croton cajucara incorporated into a SMEDDS formulation showed bacteriostatic activity against colonies of Bacillus cereus and Escherichia coli bacteria. Additionally, Molecular Dynamics simulations were performed using micellar systems, for drug delivery systems, containing sugar-based surfactants, N-dodecylamino-1-deoxylactitol and N-dodecyl-D-lactosylamine. The computational simulations indicated that micellization process for N-dodecylamino-1- deoxylactitol is more favorable than N-dodecyl-D-lactosylamine system.
Dos novos f?rmacos lan?ados no mercado a partir de 1980, cerca de 30% apresentam origem natural ou semissint?tica. Entre 40 e 70% destes novos prot?tipos de f?rmacos (naturais ou sint?ticos) apresentam baixa solubilidade aquosa, o que pode inviabilizar a sua utiliza??o comercial. Uma das alternativas encontrada pela ind?stria farmac?utica foi a veicula??o dessas subst?ncias a partir de ve?culos ou sistemas de libera??o de f?rmacos, tais como: micelas, microemuls?es, lipossomos, nanopart?culas e ciclodextrinas. Neste trabalho, sistemas microemulsionados biologicamente compat?veis foram obtidos utilizando a mistura Tween 80 e Span 20, na propor??o 3:1, como tensoativo, miristato de isopropila ou ?cido ol?ico como fase oleosa, ?gua bidestilada, e em alguns sistemas, etanol como cotensoativo. Tamb?m foram obtidos sistemas auto-microemulsificantes (SMEDDS) utilizando propilenoglicol ou sorbitol como cotensoativo. As microemuls?es obtidas foram caracterizadas quanto ao comportamento reol?gico, tamanho das got?culas e condutividade el?trica. O produto natural bioativo trans-desidrocrotonina (DCTN), bem como extratos e fra??es das esp?cies vegetais Croton cajucara Benth (Euphorbiaceae), Anacardium occidentale L. (Anacardiaceae) e Phyllanthus amarus Schum. & Thonn. (Euphorbiaceae), foram solubilizados satisfatoriamente nos sistemas microemulsionados obtidos, enquanto que outros produtos tamb?m isolados da esp?cie Croton cajucara, trans-crotonina e ?cido acetilaleurit?lico, n?o apresentaram resultados satisfat?rios em termos de solubilidade. A avalia??o da propriedade antioxidante, pelo m?todo do DPPH, dos extratos vegetais incorporados nos sistemas microemulsionados obtidos evidenciou a capacidade antioxidante dos extratos de Phyllanthus amarus e Anacardium occidentale, bem como a atua??o dos sistemas microemulsionados, que para o caso do extrato etan?lico de Phyllanthus amarus dobrou a sua atividade antioxidante quando solubilizado em microemuls?es. O extrato hidroalco?lico de Croton cajucara incorporado em um sistema auto-microemulsificante mostrou atividade bacteriost?tica frente a col?nias de bact?rias Bacillus cereus e Escherichia coli. Adicionalmente, foi realizado um estudo de simula??o computacional por Din?mica Molecular de sistemas micelares para uso farmacol?gico contendo tensoativos derivados de a??cares, N-dodecilamino-1-deoxilactitol e N-dodecil- -lactosilamina, que indicou que o processo de miceliza??o do primeiro sistema ? mais favor?vel que o segundo.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
CHAPTER I - The aqueous extract prepared from Schizolobium parahyba (Sp) leaves, a native plant from Mata Atlantica forest (Brazil), was tested to analyze its ability to inhibit some biological and enzymatic activities induced by Bothrops alternatus and Bothrops moojeni snake venoms. Sp chromatography in Sephadex LH 20 resulted in 3 fractions: F1 (methanolic fraction); F2 (methanol:water fraction, 1:1 v/v); and F3 (aqueous fraction). These fractions were analyzed in terms of its capacity of inhibit the venoms fibrinogenolytic activity. Sp inhibited 100% of lethality, blood incoagulability, hemorrhagic and indirect hemolytic activities for a 1:10 ratio (venom/extract, w/w), and coagulant activity in a 1:5 ratio (venom/extract, w/w) induced by venoms. Venoms fibrinogenolytic activity were also neutralized by Sp in a 1:10 ratio, resulting in total protection of Bβ chain and partial protection for the fibrinogen Aα chain. However, larger ratios of extract/proteins have caused a complete vanishing of all fibrinogen chains possibly caused by Sp precipitation. Interaction tests have demonstrated that for certain extract/proteins ratios Sp precipitates proteins non-specifically suggesting the presence of tannins, which are very likely responsible for the excellent inhibiting effects of the analyzed ophidian activities. Therefore, the fractioning of Sp was carried out aiming at separating these compounds that mask the obtained results. F1 inhibited 100% the venom fibrinogenolytic activity without presenting protein precipitation effect; F2 demonstrated only partial inhibition of these venoms activities. Finally, F3 did not inhibit fibrinogen proteolysis, but presented strong protein precipitating action. We conclude that Sp, together with tannins, also contains other compounds which can present specific toxin inhibition action of snake venoms. CHAPTER II - Do extrato aquoso liofilizado das folhas de Schizolobium parahyba foram isolados quatro compostos ativos, isoquercitrina, miricetina-3-O-glicosídeo, catequina e galocatequina, por cromatografia em Sephadex LH 20 seguido de HPLC semipreparativo em coluna C-18 e identificados por RMN do 1H e 13C. Essa é a primeira vez que estas substâncias são relatadas nesta espécie assim como suas atividades antiofídicas. Após isolamento foram todas testadas frente a atividade hemorrágica e fibrinogenolítica da peçonha de Bothrops alternatus (Bal). Na proporção 1:30 (Peçonha/fração, m/m) a isoquercitrina inibiu parcialmente a atividade hemorrágica; a miricetina-3-O-glicosideo e a catequina não foram capazes de inibir a hemorragia induzida pela Bal e a galocatequina, por sua vez, apresentou uma eficiente neutralização desta atividade da peçonha. Na proporção de 1:100 (Peçonha/fração, m/m) ficou evidenciado o efeito de inibição total da ação fibrinogenolítica da peçonha pela miricetina-3-O-glicosideo; a isoquercitrina não protegeu a proteólise da cadeia Aα do fibrinogênio e inibiu parcialmente a degradação da cadeia Bβ enquanto a catequina e a galocatequina inibiram parcialmente a degradação da cadeia Aα e totalmente a da cadeia Bβ. Dessa forma concluímos que a galocatequina e a miricetina-3-O-glicosideo são excelentes inibidores de toxinas hemorrágicas e fibrinogenolíticas respectivamente. Estudos vindouros como o de modelagem molecular e cristalização de raio-X usando toxinas isoladas e estas substâncias poderão ser de grande importância para o desenho de novas drogas auxiliares do tratamento com soro antiofídico ou para melhor elucidação da relação estruturafunção das toxinas destes venenos.
CAPÍTULO I - O extrato aquoso preparado das folhas de Schizolobium parahyba (Sp), uma planta nativa da Mata Atlântica (Brasil), foi testado para avaliar sua habilidade de inibir algumas atividades biológicas e enzimáticas induzidas pelas peçonhas brutas de Bothrops alternatus e Bothrops moojeni. Cromatografia de Sp em coluna de Sephadex LH 20 resultou em 3 frações: F1 (fração metanólica); F2 (fração metanol : água, 1:1 v/v) e F3 (fração aquosa). Estas frações foram analisadas quanto a capacidade de inibir a atividade Fibrinogenolítica das peçonhas. Sp inibiu em 100% a letalidade, a incoagulabilidade sanguínea, a atividade hemorrágica e hemolítica indireta na proporção de 1:10 (peçonha/extrato, m/m) e atividade coagulante na proporção de 1:5 (peçonha/extrato, m/m) induzidas pelas peçonhas. A atividade fibrinogenolítica das peçonhas também foi neutralizada por Sp na proporção de 1:10, resultando em proteção total da cadeia Bβ e parcial da Aα do fibrinogênio. No entanto, proporções maiores de peçonha/extrato mostraram desaparecimento de todas as cadeias do fibrinogênio numa possível precipitação causada por Sp. Os testes de interação extrato/proteínas demonstraram que em determinadas proporções de extrato/proteínas Sp precipita proteínas inespecificamente, sugerindo a presença de taninos, os quais muito provavelmente são os responsáveis pelo excelente efeito inibidor das atividades ofídicas analisadas. Assim, com o intuito de separar estes componentes que mascaram os resultados obtidos, foi realizado o fracionamento de Sp. F1 inibiu em 100% a atividade fibrinogenolítica das peçonhas e não apresentou efeito de precipitação de proteínas; F2 demonstrou inibição parcial desta atividade das peçonhas e F3 não inibiu a proteólise do fibrinogênio, mas apresentou forte ação precipitante de proteínas. Concluímos, assim que Sp, além de taninos, também contém outros compostos e que estes podem apresentar ação específica de inibição de toxinas de peçonhas de serpentes. CAPÍTULO II - Do extrato aquoso liofilizado das folhas de Schizolobium parahyba foram isolados quatro compostos ativos, isoquercitrina, miricetina-3-O-glicosídeo, catequina e galocatequina, por cromatografia em Sephadex LH 20 seguido de HPLC semipreparativo em coluna C-18 e identificados por RMN do 1H e 13C. Essa é a primeira vez que estas substâncias são relatadas nesta espécie assim como suas atividades antiofídicas. Após isolamento foram todas testadas frente a atividade hemorrágica e fibrinogenolítica da peçonha de Bothrops alternatus (Bal). Na proporção 1:30 (Peçonha/fração, m/m) a isoquercitrina inibiu parcialmente a atividade hemorrágica; a miricetina-3-O-glicosideo e a catequina não foram capazes de inibir a hemorragia induzida pela Bal e a galocatequina, por sua vez, apresentou uma eficiente neutralização desta atividade da peçonha. Na proporção de 1:100 (Peçonha/fração, m/m) ficou evidenciado o efeito de inibição total da ação fibrinogenolítica da peçonha pela miricetina-3-O-glicosideo; a isoquercitrina não protegeu a proteólise da cadeia Aα do fibrinogênio e inibiu parcialmente a degradação da cadeia Bβ enquanto a catequina e a galocatequina inibiram parcialmente a degradação da cadeia Aα e totalmente a da cadeia Bβ. Dessa forma concluímos que a galocatequina e a miricetina-3-O-glicosideo são excelentes inibidores de toxinas hemorrágicas e fibrinogenolíticas respectivamente. Estudos vindouros como o de modelagem molecular e cristalização de raio-X usando toxinas isoladas e estas substâncias poderão ser de grande importância para o desenho de novas drogas auxiliares do tratamento com soro antiofídico ou para melhor elucidação da relação estruturafunção das toxinas destes venenos.
Mestre em Genética e Bioquímica

La résistance aux antimicrobiens est l’un des défis majeurs du XX1eme siècle. Pseudomonas aeruginosa est inscrit sur la liste des organismes pathogènes qui deviennent résistants aux antibiotiques conventionnels. De nouvelles stratégies visant à atténuer la virulence sans perturber la croissance et la viabilité bactériennes, également connues sous le nom de stratégie anti-virulence, sont développées. Les plantes sont connues pour produire de nombreux métabolites secondaires. Des extraits de fruits de Pistachia Lentiscus originaires d'Algérie et de 40 extraits de plantes originaires du Nord-Chili ont été criblés pour leur capacité à atténuer la production de la pyocyanine, un facteur de virulence majeur de P. aeruginosa, dans le but d’évaluer leur potentiel effet antivirulence. Les extraits sélectionnés (Pistacia lentiscus, Azorella atacamensis, Baccharis grisebachii, Haplopappus rigidus et Parastrephia terestiucula), ont été fractionnés et l’ensemble de ces extraits et fractions a montré une atténuation de la production d’autres facteurs de virulence (élastase, rhamnolipides), qui a pu être attribuée, au moins partiellement à une diminution de la communication bactérienne via le mécanisme du quorum sensing. Ces extraits et fractions altèrent également la fluidité membranaire de P. aeruginosa. Cet effet anti-virulence a été validé dans un modèle d'infection cellulaire, et sur le nématode Caenorhabditis elegans. Dans toutes ces conditions, la croissance de P. aeruginosa n'a pas été affectée. Un profilage chimique des extraits et fractions de P. lentiscus et d'A atacamensis a révélé la présence d'acide gingkolique et de diterpenoides de type azorellane/mulinane comme potentiels composés bioactifs. De futures études visent à identifier les composés bioactifs sur P. aeruginosa H103, ainsi que sur un panel de souches cliniques, et à évaluer un potentiel effet potentialisateur de l'activité des antibiotiques. Ces travaux visent in fine à proposer ces composés d’origine végétale comme adjuvants dans le traitement des infections à P. aeruginosa
Antimicrobial resistance has become a great challenge in therapeutic medicine so much so that the World health organization forecasts the possibility of a post-antibiotic era where minor injuries may lead to mortality. Pseudomonas aeruginosa is among the list of organisms that are highly resistant to conventional antibiotics, partly due to its broad genome, which facilitates the elaboration of virulence determinants and rapid adaptation to various environments, in addition to its inherent resistance mechanisms. In view of this, alternative measures of controlling microbial virulence activities using novel approaches that do not disturb its growth and viability, also known as anti-virulence strategy, are gaining wider attention. Since plants are repositories of several metabolites with chemical defense system against environmental pathogens, through ethnobotanical led studies, the effect of Pistacia lentiscus fruit extracts originating from Algeria and forty plant extracts originating from North-Chile were biologically and chemically evaluated with the aim of deciphering their anti-virulence effects against P. aeruginosa. Furthermore, this study tried to gain more insight into the bioactive compounds and possible mechanism of action. From the results obtained, selected plant extracts attenuated P. aeruginosa mainly pyocyanin activity and /or elastase and rhamnolipids virulence production which appears to be associated with the inhibition of quorum sensing activities and the alteration in membrane activities. The anti-virulence effect of the selected extracts (P. lentiscus, Azorella atacamensis, Baccharis grisebachii, Haplopappus rigidus and Parastrephia terestiucula) were also validated in biological models of infections where they mediated the toxicity of P. aeruginosa towards A549 human monolayer cells and/or Caenorhabditis elegans nematode. Interestingly, growth of the pathogen was not affected. Further chemical profiling of P. Lentiscus, and A atacamensis extracts revealed the presence of gingkolic acid and azorellane/mulinane diterpenoids as the putative bioactive compounds. Future studies intend to explore these extracts and their derived compounds on the potentiation of antibiotic activity in a panel of clinical strains. In general, this study sets the pace for the possible use of these plant extracts as adjuvants in treatment of P. aeruginosa infections

Ce travail porte principalement sur l'étude de la partie triterpénique de trois résines végétales naturelles et commercialement disponibles, l'oliban, la dammar et la mastic, par diverses techniques analytiques (IRTF, CLHP/UV, CLHP/UV/Fluorimétrie etCPG-SM). Une étude fluorimétrique a été réalisée sur ces trois résines via réaction de greffage d'un marqueur de fluorescence(chlorure de dansyle), ce qui a permis de détecter les molécules triterpéniques par fluorimétrie, de diminuer leur seuil de détection et d'obtenir une empreinte digitale fluorimétrique spécifique pour chaque résine étudiée. Ce protocole a été appliqué avec succès sur un échantillon archéologique (G14) et le matériel résineux a été identifié (résine oliban, espèce B. frereana). La partie triterpénique a été extraite par divers procédés d'extraction (le reflux, le Soxhlet et les ultrasons) en utilisant trois différents solvants (le méthanol, le n-hexane et le d-limonène) dans le but de déterminer les conditions optimales pour l'extraction et l'identification des molécules triterpéniques par CLHP/UV. Deux colonnes de phase inverse ont été testés dans ce travail : une colonne classique RP-18 (Merck) et une colonne "core-shell" Kinetex (Phenomenex) pour essayer d'optimiser les conditions d'analyse. La colonne Kinetex a permis une diminution de temps d'analyse de 73% pour l'oliban et de 70% pour la dammar et la mastic, ce qui représente un résultat très encourageant. Le protocole optimisé a été appliqué avec succès sur l'échantillon archéologique G12 supposé contenir de la mastic, ce qui a été confirmé par les analyses CLHP/UV et CPG-SM. Une étude quantitative de rendement et d'aire relative du pic a été également réalisée. Les extraits ont été analysés par CLHP/UV etCPG-SM. Pour l'analyse en CPG-SM, la préparation des échantillons a été faite à travers la formation des dérivés TMS(triméthylsilylés) dans le but de créer une base de données de dérivés TMS pour les résines dammar et mastic. L'identification des composés caractérisés dans ce travail a été faite selon la littérature spécialisée, les tR et les spectres UV correspondants. Led-limonène, un solvant "vert", a été utilisé pour la première fois pour l'extraction de ce genre de matériaux, à notre connaissance et il permet une formation directe des dérivés TMS, en présence de solvant d'extraction. Au même temps, sep téchantillons artistiques supposés contenir un vernis à base d'une résine naturelle, en provenance de la Galerie Nationale de Sarajevo (Bosnie-Herzégovine) ont été analysés et seulement pour un de ces sept échantillons, il a été mis en évidence la présence d'une gomme-résine naturelle. L'étude scientifique des échantillons bosniens agrandira la documentation sur l'Art et sur le patrimoine culturel de Bosnie-Herzégovine, qui rencontre une période difficile depuis la dernière guerre (1992-1995)

International Doctoral Program: Biological Sciences, Agricultural Production Chains-From Fork to Farm (AgriChains)
Hypericum perforatum L. is a reservoir of high-value secondary metabolites, with a rapidly increasing interest for both researchers and the pharmaceutical industry. Hence, improving the production of these compounds via genetic manipulation is a challenging task. However, a major drawback is the recalcitrance of H. perforatum L. to Agrobacterium tumefaciensmediated transformation. Hence, in the presented study, H. perforatum L. was chosen as model plant to investigate the molecular mechanisms underlying plant recalcitrance to bacterial infection, by identifying and characterizing key genes involved in these responses. Phenolic oxidative coupling protein (Hyp-1), a pathogenesis-related (PR) class 10 family gene, was selected from a forward subtractive cDNA library from H. perforatum L. suspension cells elicitated with A. tumefaciens. The role of Hyp-1 in defense against A. tumefaciens was analyzed in transgenic Nicotiana tabacum and Lactuca sativa plants overexpressing Hyp-1, and in Catharanthus roseus silenced for the homologous Hyp-1 gene, CrIPR. Results showed that transformation efficiency of A. tumefaciens was greatly decreased in tobacco and lettuce plants overexpressing Hyp-1. However, silencing of CrIPR in C. roseus led to induction of CrPR-5 and an increased resistance to Agrobacterium infection. Moreover, the expression of core genes regulating several defense pathways was analyzed in Hyp-1 transgenic tobacco plants. Overall, overexpressing of Hyp-1 led to an ample down-regulation of key genes involved in auxin signaling (NtaTIR1, NtaAFR8), microRNA(miR)-based gene silencing (NtaAGO1, NtamiR160, NtamiR164ab), detoxification of reactive oxygen species (NtaFe-SOD), phenylpropanoid pathway (NtaPAL1, NtaPAL4 and NtaCHS) and PRs (NtaPR10 and NtaPR1). Moreover, Hyp- 1 was detected in the nucleus, plasma membrane and the cytoplasm of epidermal cells by confocal microscopy. In parallel, a Polygalacturonase inhibiting protein (PGIP) from H. perforatum L. was selected from the same cDNA library. The role of HpPGIP in defense against A. tumefaciens was analyzed in transgenic N. tabacum plants overexpression HpPGIP, and in Nicotiana benthamiana heterogeneous silenced for the homologous BoPGIP. Results showed that the transformation efficiency of A. tumefaciens was greatly decreased in tobacco overexpressing HpPGIP. However, silencing of BoPGIP in N. benthamiana led to induction of NbPRs and increased resistance to A. tumefaciens. Moreover, the expression of core genes regulating several defense pathways was analyzed in HpPGIP transgenic tobacco plants. Overall, plants overexpressing HpPGIP showed increased expression of the key genes involved in the synthesis of secondary metabolites lignin and flavonoids (NtaPAL1,4, NtaCCR and NtaCHS), ROS pathway (NtaAPX and NtaFe-SOD), as well as microRNA-mediated gene silencing pathway (NtaAGO1 and NtamiR164c). Additionally, plants overexpression Hyp-1- PGIP, showed enriched secondary metabolism and ROS defense pathways, by especially upregulating NtaCAD and NtaCAT, respectively. The expression of genes from JA signaling pathway (NtaLOX) and miroRNA-mediated gene silencing pathway (NtaAGO1) was also upregulated in these plants. In the present study, it was also demonstrated that HpPGIP protein localizes at plasma membrane, cytoplasm and nucleus. To further understand the molecular mechanisms involved in A. tumefaciens and H. perforatum L. interaction, the expression of core genes involved in plant defense pathways including secondary metabolism, gene silencing, ROS pathways and other defense genes (Hyp-1 and HpPGIP) was investigated. Results indicated that resistance of H. perforatum L. cells to infection by A. tumefaciens involves the induction of several genes encoding key enzymes of secondary metabolism, including those mediating not only the synthesis of xanthones (HpPAL and HpBPS), but also hypericin (HpOKS and HpPKS2) and melatonin (HpIGPS), ROS pathway (HpAOX) and other defense genes (Hyp- 1 and HpPGIP). Moreover, transcript levels of RDR6 and SGS3 associated to the gene silencing pathway, sense-post-transcriptional gene silencing (S-PTGS) and trans acting siRNAs (tasiRNA) pathway, together with HpAGO5, were not affected during the defense response. This study was complemented by quantifying the expression of these defense genes in H. perforatum L. plants with or without dark glands, which are known to accumulate large amounts of secondary metabolites, hence contributing to plant defense ability. Results supported the key role of these glands in gifting the host plant with resistance to pathogens, by highly accumulating secondary metabolites like xanthone (HpPAL and HpBPS) and hypericin (HpOKS and HpPKS2), together with a stimulation of the ROS pathway (HpCAT) and of the expression of other genes directly associated to the defense response (HpHyp-1 and HpPGIP). In summary, the present study provided a better understanding on the functional roles of Hyp- 1 and HpPGIP, enlightening their role in plant defense and on the network of events underlying the molecular responses of H. perforatum L. upon interaction with A. tumefacien.
Hypericum perforatum L. é uma planta com um vasto reservatório de metabolitos secundários de valor acrescentado, suscitando um crescente interesse na investigação científica e na indústria farmacêutica. Desta forma, melhorar a produção destes compostos através da manipulação genética é uma tarefa desafiadora. No entanto, um dos maiores entraves a esta tarefa consiste na recalcitrância de H. perforatum L. à transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens. No presente estudo, H. perforatum L. foi selecionado como modelo para investigar os mecanismos moleculares que estão na base da recalcitrância das plantas à infecção bacteriana, através da indentificação e caracterização de genes-chave envolvidos na resposta ao stresse biótico. Uma Phenolic oxidative coupling protein (Hyp-1), pertencente à família pathogenesis-related (PR) class 10 foi selecionada de uma biblioteca subtrativa de cDNA de suspensões celulares de H. perforatum L. elicitadas com A. tumefaciens. A função de Hyp-1 na defesa contra A. tumefaciens foi analisada em plantas transgénicas de tabaco e de alface com sobrexpressão deste gene, e em plantas de Catharanthus roseus com o gene homólogo CrIPR silenciado. Os resultados mostraram que a eficiência de infeção de A. tumefaciens diminuiu drasticamente em plantas de tabaco e de alface com sobrexpressão do Hyp-1. No entanto, o silenciamento do gene CrIPR em C. roseus resultou numa indução do gene CPR-5 e conduziu a um aumento da resistência à infecção por Agrobacterium. Adicionalmente, a expressão de gene-chave reguladores dos mecanismos de defesa da planta foram analisados nas plantas de tabaco com sobrexpressão do gene Hyp-1. De um modo geral, estas plantas apresentaram uma repressão na expressão de genes envolvidos na sinalização das auxinas (NtaTIR1, NtaAFR8), no silenciamento de genes mediado por microRNAs (NtaAGO1, NtamiR160, NtamiR164ab), na destoxificação de espécies reativas de oxigénio (NtaFe-SOD), na via fenilpropanóide (NtaPAL1, NtaPAL4 e NtaCHS) e em genes da família PR (NtaPR10 e NtaPR1). Verificou-se ainda que a proteína Hyp-1 está localizada no núcleo, na membrana plasmática e no citosol de células da epiderme, como observado por microscopia de fluorescência de proteínas de fusão. Em paralelo, uma Polygalacturonase inhibiting protein (PGIP) de H. perforatum L. foi também selecionada da mesma biblioteca de cDNA. O papel do HpPGIP na defesa contra A. tumefaciens foi analizada em plantas tabaco com sobrexpressão deste gene, e em plantas Nicotiana benthamiana com silenciamento do gene homólogo, BoPGIP. Os resultados mostraram que a eficiência de infeção de A. tumefaciens diminuiu significativamente nas plantas com sobrexpressão do HpPGIP. No entanto, o silenciamento do gene BoPGIP em N. benthamiana conduziu a uma indução da expressão de NbPRs, bem como do aumento da resistência a A. tumefaciens. Foi ainda estudada a expressão de genes-chave da regulação das vias de defesa em plantas transgénicas de tabaco sobrexpressando o gene HpPGIP. Verificou-se que estas plantas apresentavam uma sobrexpressão de genes envolvidos na biossíntese de metabolitos secundários como a lenhina e os flavonóides (NtaPAL1,4, NtaCCR e NtaCHS), na via dos ROS (NtaAPX e NtaFe-SOD), e no silenciamento de genes mediado por microRNAs (NtaAGO1 e NtamiR164c). Foi observada ainda a indução da expressão dos genes NtaCAD e NtaCAT, bem como de genes envolvidos nas vias de sinalização do ácido jasmónico (NtaLOX). No presente estudo verificou-se que a proteína HpPGIP está localizada na membrana plasmática, no citoplasma e no núcleo das células. Para melhor compreender os mecanismos envolvidos neste processo, a expressão de genes-chave envolvidos na resposta da planta ao stress biótico foi determinada em suspensões celulares de H. perforatum L. elicitadas com A. tumefaciens, incluindo genes das vias do metabolismo secundário, de silenciamento de genes, do metabolismo dos ROS e de outras vias de defesa, incluindo o Hyp-1 e HpPGIP. Os resultados mostraram diferenças na expressão de vários genes envolvidos nas vias de biossíntese de xantonas (HpPAL e HpBPS), hipericina (HpOKS e HpPKS2) e melatonina (HpIGPS), bem como no metabolismo dos ROS (HpAOX), e na defesa da planta (Hyp-1 e HpPGIP). Foi ainda observado que os níveis de transcritos dos genes RDR6 e SGS3 associados à via de silenciamento de genes não foram afetados, bem como do gene SPTGS e HpAGO5. O presente estudo foi complementado pela quantificação da expressão destes genes em plantas de H. perforatum com ou sem estruturas glandulares, onde se acumulam grandes quantidades de metabolitos secundários, contribuindo assim para a capacidade de defesa da planta. Os resultados suportaram o papel fundamental destas estruturas na resposta da planta ao stresse biótico, verificando-se sobrexpressão de genes da via de produção de xantonas (HpPAL e HpBPS) e hipericina (HpOKS e HpPKS2), bem como uma estimulação da via dos ROS (HpCAT) e dos genes caracterizados neste estudo (HpHyp-1 e HpPGIP). Em suma, o presente trabalho contribuiu para melhor compreender o papel dos genes Hyp-1 e HpPGIP na defesa da planta contra stresse biótico, e a sua influência na regulação da rede de eventos moleculares que estão na base da recalcitrância de H. perforatum L. à infeção por A. tumefaciens.
The author acknowledges the financial support provided by the FCT-Portuguese Foundation for Science and Technology (SFRH/BD/52561/2014), under the Doctoral Programme “Agricultural Production Chains – from fork to farm” (PD/00122/2012).

Dissertação de mestrado em Biologia Molecular, Biotecnologia e Bioempreendedorismo em Plantas
The Pine Wood Nematode (PWN) Bursaphelenchus xylophilus is the causal agent of Pine Wilt Disease (PWD), which threatens several conifer species around the world leading to great ecological and economical losses. Pinus pinaster (maritime pine), one of the major forest species in Portugal, is susceptible to the PWN infection. The importance of controlling the evolution of the disease as well as its spreading to other countries motivated the initiation of a national breeding program to address this problem. Over five hundred adult trees have been selected as candidate PWN resistant trees for this program from a PWD highly affected area. In this study, seedlings derived from a candidate resistant tree were used in an inoculation experiment to assess susceptibility/tolerance to PWN infection. From the set of inoculated plants, some apparently tolerant plants were selected along with susceptible ones to conduct expression analyses of selected transcripts potentially involved in the response mechanisms against PWN infection, and that might explain the susceptibility or tolerance towards PWD. Samples from the selected susceptible and tolerant P. pinaster plants were sent for small RNA and degradome next-generation sequencing. Differential expression analysis of the identified small RNAs between susceptible and tolerant plants was performed, and target transcripts for the differentially expressed small RNAs were predicted using computational approaches. Transcripts were also selected from a previous study that identified expressed sequence tags differentially expressed in P. pinaster susceptible plants versus plants from a tolerant species, Pinus pinea, inoculated with PWN. Expression analysis of small RNA targets and transcripts putatively involved in the response mechanism to PWD allowed the identification of genes with different expression profiles between susceptible and tolerant P. pinaster plants, that are apparently linked to the differential behavior of those plants to PWN infection. This study provides valuable information for future research to elucidate the response mechanisms to PWD, and to identify potential marker genes that, linked to a marker-assisted selection of trees, can be an effective approach to accumulate tolerance-related genes in a population or an individual, and contribute to the future establishment of pine forests tolerant to the PWD.
O Nemátode da Madeira do Pinheiro (NMP) Bursaphelenchus xylophilus é o agente causal da Doença da Murchidão do Pinheiro (DMP), que ameaça várias espécies de coníferas em todo o mundo levando a grandes perdas ecológicas e económicas. Pinus pinaster (pinheiro bravo), uma das principais espécies florestais em Portugal, é suscetível à infeção pelo NMP. A importância de controlar a evolução da doença, bem como a sua propagação para outros países motivaram o início de um programa de melhoramento nacional para fazer face a este problema. Mais de quinhentas árvores adultas foram selecionadas como árvores candidatas resistentes ao NMP, no âmbito deste programa, de uma área altamente afetada pela DMP. Neste trabalho, plantas jovens provenientes de uma árvore candidata resistente foram usadas num ensaio de inoculação para avaliar a suscetibilidade/tolerância à infeção com o NMP. Das plantas inoculadas, foram selecionadas algumas plantas aparentemente tolerantes à infeção, juntamente com algumas suscetíveis, para realizar análises de expressão de transcritos potencialmente envolvidos nos mecanismos de resposta à infeção com o NMP, e que poderão explicar a suscetibilidade ou tolerância à DMP. Amostras das plantas de P. pinaster suscetíveis e tolerantes selecionadas foram enviadas para sequenciação de nova geração de pequenos RNAs e do degradoma. A análise da expressão diferencial dos pequenos RNAs identificados entre plantas suscetíveis e tolerantes foi efetuada, e transcritos-alvo dos pequenos RNAs diferencialmente expressos foram previstos usando abordagens computacionais. Também foram selecionados transcritos de um estudo anterior que identificou “expressed sequence tags” diferencialmente expressas em plantas suscetíveis de P. pinaster versus plantas de uma espécie tolerante, Pinus pinea, inoculadas com o NMP. A análise de expressão dos alvos de pequenos RNAs e transcritos putativamente envolvidos no mecanismo de resposta à DMP permitiu a identificação de genes com diferentes perfis de expressão entre plantas de P. pinaster suscetíveis e tolerantes, que estão aparentemente relacionados com o comportamento diferencial destas plantas face à infeção com o NMP. Este estudo fornece informação importante para futura investigação relativa aos mecanismos de resposta à DMP e para a identificação de potenciais genes marcadores que, ligada a uma seleção de árvores assistida por marcadores, poderá ser uma estratégia efetiva para acumular genes relacionados com a tolerância numa população ou indivíduo, e contribuir para o estabelecimento futuro de florestas de pinheiros tolerantes à DNP.

The submersed aquatic plants Eurasian watermilfoil (Myriophyllum spicatum) and Hydrilla (Hydrilla verticillata) are a nuisance in waterways of the U.S. Biological control with plant pathogens is a proven method for the management of aquatic plants. An attempt was made to identify lectins of Eurasian watermilfoil and Hydrilla tissues in hopes of characterizing a means of specific attachment to fungal pathogens on the target plants. Four fungal isolates (Fusarium roseum, Macrophomena phaseolina, Colletotrichum gloeosporioides and Mycoleptodiscus terrestris) were evaluated for the ability to attach and infect Eurasian watermilfoil and Hydrilla. Lectins were isolated from total protein by affinity chromatography. Lectin activity was evaluated for agglutination of the human ABO blood groups and fungal mycelium. Eurasian watermilfoil lectin was evaluated for its ability to inhibit fungal growth. No specific attachment was detected on Hydrilla tissues. F. roseum attached specifically to Eurasian watermilfoil tissues. All four fungi were pathogenic on Hydrilla tissues after seven days in test tube bioassays. All but F. roseum were pathogenic on Eurasian watermilfoil. Lectins specific for $\alpha$-L-fucose were isolated from both Eurasian watermilfoil and Hydrilla. The Eurasian lectin has a molecular weight of 48 Kd. The Hydrilla lectin is a complex of two proteins with molecular weights of 67 Kd and 50 Kd. Both Eurasian and Hydrilla lectins agglutinated type O red blood cells. Hydrilla lectin has no affect on mycelial suspensions of the four fungi, while Eurasian lectin agglutinated all fungi except M. phaseolina. The existence of lectins in the aquatic plants Hydrilla verticillata and Myriophyllum spicatum has been demonstrated. Plant lectins play a role in plant-pathogen association through attachment and/or recognition. Where attachment is specific and the lectin agglutinates the fungus, disease resistance occurs. This evidence supports the theory that recognition through plant lectins is a host defense mechanism.

Indiana University-Purdue University Indianapolis (IUPUI)
Polyacetylenic natural products, compounds containing multiple carbon-carbon triple bonds, have been found in a large collection of organisms. Radiochemical tracer studies have indicated that these bioactive metabolites are synthesized from fatty acid precursors through a series of uncharacterized desaturation and acetylenation steps. To date, there are three main pathways believed to be involved in acetylenic natural product biosynthesis. However, it is apparent that the crepenynic acid pathway is the origin of a vast majority of the known plant and fungal acetylenic products. This investigation provides concrete evidence that the polyacetylenic natural products found in the fungus Fistulina hepatica and the medicinal plant species Echinacea purpurea are biosynthesized from crepenynic acid. Through heterologous expression in Yarrowia lipolytica, two acetylenases capable of producing crepenynic acid were identified from E. purpurea. Furthermore, heterologous expression of two diverged desaturases isolated from F. hepatica, uncovered a ∆12-acetylenase and the first multifunctional enzyme capable of ∆14-/∆16- desaturation and ∆14-acetylenation.

碩士
中國醫藥大學
生態暨演化生物學研究所碩士班
101
Artemisia morrisonensis （AM）is an endemic alpine species of Artemisia in Taiwan and is proposed to have wide range of therapeutic effects on liver related disease. However, the active constituent of A. morrisonensis against hepatitis B virus (HBV) is still remained unknown. The aims of this study were attempted to elucidate the anti-viral mechanism of natural occurring constituents against HBV from A. morrisonensis and the molecular phylogenetic analysis of Artemisia related species was also be conducted. Initially, the extracts of AM-AQ, AM-EA1, AM-EA2, AM-EA3, AM-EA4 and pure compound AM-EA22-3 were obtained from A. morrisonensis and tested their cytotoxicity on HepG2 2.2.15 cells during 9-day treatment. The cytotoxic effect was occurred during the treatment of HepG2 2.2.15 with AM-EA and EA3 whose dose was higher than 40 μg/ml, and with AM-EA2 higher than 10 μg/ml after 9-day treatment. The cytotoxic effect of AM-EA22-3 was only observed in the doses more than 160 μg/ml. However, there is no apparent cytotoxic effect on cells that with AM-AQ, AM-EA1, and AM-EA4 during treatment. On the other hand, the conditioned media from non-cytotoxic treatment of AM-EA2, AM-EA3, and AM-EA22-3 were collected to measure the secreted level of HBsAg and HBeAg. The results indicated that all of these constituents reduced the secretion of viral antigens (HBsAg and HBeAg) in a dose dependent manner. Furthermore, viral DNA of secredted viral particle was isolated from cell cultural media after non-cytotoxic treatment and detected with Real-Time PCR in order to determine the effect of AM constituents on replicative viral DNA level. The results indicated that all of these three extracts exhibit the inhibitory effect on HBV viral DNA replication. To examine the anti-viral mecanism of these three AM constituents (AM-EA2, AM-EA3, and pure compound AM-EA22-3), HBV viral promoter-luciferase reporter transfected Huh7 cell was used as model to test whether the treatment of these constituents have effect on viral gene promoters’ activity. The results indicated that the promoters correspond to HBV Core, X, and PreS were significantly up-regulated by AM-EA3 and AM-EA22-3. Furthermore, treatment of AM-EA2 specifically increases the HBV Core and PreS promoters’ activity. The activation of HBV viral mRNA levels was also detected in Northern blot during treatment. The previous study have shown that the increase of PreS relative to S promoters’ activity will lead to the overexpression of large surface protein and cause the intracellular accumulation of viral particle and induce endoplasmic reticular (ER) stress. To examine this possibility, HBV transfected Huh7 cell were treated with AM-EA2, AM-EA3 and AM-EA-22-3 and Western blot was conducted to analyze the expressed level of viral surface proteins (HBsAg) and ER stress induced GRP proteins. The results indicated that treatment of these two extracts and one pure compound significantly decreased the level of GRP78 protein, but slightly increase GRP94 portein level in Huh7 cells. However, the expression level of three froms of viral surface proteins (SHBs, MHBs and LHBs) in treated cells has no apparent change. In addition, the accumulation of viral surface antigen (HBsAg) was observed during treatment. These results suggest that the anti-hepatitis B virus mechanism of A. morrisonensis might mediate through the regulation of viral gene expression and induce ER stress and lead to the intracellular accumulation of viral particle. Taken together, the bioactive constituents of A. morrisonensis could serve as resources of therapeutic agent in the drug of development on virus-caused hepatitis. In the molecular phylogenetic analysis, four closely-related species of Artemisia and four Compositae species were chosen and the Internal Transcribed Spacer (ITS) sequences within these species were cloned and sequenced for phylogenetic analysis. The results revealed that A. oligocarpa and A. capillaries were co-evolved with A. morrisonensis, suggesting the possible naturally occurred constituents of these three Artemisia species may possess similar constituents against HBV.

Dissertação de Mestrado em Engenharia do Ambiente
O ozono (O3) troposférico é um poluente secundário cujas concentrações têm vindo a aumentar nas últimas décadas e prevê-se que continuem a aumentar nos próximos anos. Os dados da rede de monitorização de qualidade do ar da Agência Portuguesa do Ambiente revelam que em Portugal, durante os meses da Primavera e Verão, as concentrações de O3 ultrapassam em vários locais os limiares de protecção à vegetação recomendados pela União Europeia, entre os quais Lamas de Olo e Monte Velho. No entanto, o impacto deste poluente na vegetação continua por estudar. Na estação de Lamas de Olo, situada no interior do Parque Natural do Alvão, são registados os níveis de ozono mais elevados do país, tendo em 2005 sido registada neste local a concentração horária mais elevada da Europa. Este Parque, situado numa região montanhosa do Nordeste Transmontano, possui elevada riqueza e diversidade de espécies vegetais que importa conhecer e preservar. É actualmente reconhecido que não é possível prever o impacto do ozono na vegetação com base apenas na concentração ambiental do poluente, pois o seu impacto depende de variáveis ambientais e factores biológicos que determinam a sensibilidade das plantas ao ozono. Um processo simples de estimar a fitotoxicidade do ozono em determinado local consiste na sua biomonitorização, utilizando plantas que exibem sintomas de danos foliares distintos em resposta específica à exposição a este poluente, como os cultivares de tabaco Bel W3 e Bel B, sensível e tolerante ao ozono, respectivamente. Todavia, as plantas obtidas a partir de semente podem exibir variação intrapopulacional na sensibilidade ao ozono, afectando o seu desempenho como biomonitor. Uma forma de ultrapassar esta dificuldade consiste em utilizar as técnicas de cultura in vitro para a obtenção de biomonitores mais homogéneos. A existência de clones de Bel W3 e Bel B, obtidos por cultura in vitro, permitiu realizar dois estudos distintos. No primeiro estudou-se a variabilidade genética (marcadores RAPDs) entre plantas obtidas por semente e obtidas por micropropagação, para os dois cultivares. Os resultados mostraram um claro agrupamento das amostras com base no binómio origem/genótipo, evidenciando as plantas de micropropagação grande uniformidade genética, com similaridade genética entre os 0,987 e 1 para Bel W3 e Bel B, respectivamente. No segundo estudo realizaram-se três ensaios de biomonitorização do ozono com plantas de tabaco de ambas as cultivares (obtidas por semente e por micropropagação) em Lamas de Olo e Monte Velho. Além da análise de danos foliares, procedeu-se também à análise molecular com marcadores RAPDs (Bel W3). A exposição ao ozono resultou na ocorrência de danos foliares visíveis nas plantas Bel W3, em ambos os locais, o que indica um potencial efeito fitotóxico do ozono para vegetação local. As plantas Bel B não apresentaram danos ou apresentaram danos marginais. Estes danos foram observados tanto no material de semente como no de micropropagação, não se verificando diferenças na variabilidade das respostas de ambos os tipos de plantas. A análise molecular do material exposto evidenciou um agrupamento independente do processo de produção do material mas assente no binómio período de ensaio/local do ensaio, com as amostras misturadas de forma quase homogénea no seio de cada grupo.
Ambient concentrations of tropospheric ozone, a secondary atmospheric pollutant, have been increasing during the last decades and it is expected that they will continue to rise in the foreseeable future. Available data from the Environmental Portuguese Agency’s air quality monitoring network show that in Portugal during the spring and summer months current critical levels for ozone are regularly exceeded in several locations, such as Lamas de Olo and Monte Velho. However, the impact of the pollutant on vegetation remains to be investigated. The highest ozone levels observed in the country have been recorded in the Lamas de Olo monitoring station, located at the Alvão Natural Park. In 2005, this station registered the highest one-hour ozone concentration in Europe. This Park, located in a mountainous region in the Northeast of Portugal, has an extremely rich and diverse vegetation of significant conservation value. It is now recognized that it is not possible to accurately assess and predict the impact of O3 on vegetation based on the pollutant’s atmospheric concentrations alone. This is because the impact of O3 is dependent from environmental variables and from biological factors that determine plant sensitivity to the pollutant. A simple approach to estimate the potential degree of ozone phytotoxicity in a given region is to biomonitor O3 pollution using plants that exhibit distinctive foliar injury symptoms in a specific response to ozone exposure, such as tobacco cultivars Bel W3 (O3 sensitive) and Bel B (O3 tolerant). However, plants propagated by seeds may exhibit intrapopulation variation in their sensitivity to ozone. This variation may affect performance or the accuracy of tobacco plants as a useful biomonitor. However, in vitro culture techniques can provide more uniform tobacco plants for ozone biomonitoring. Tobacco clones were obtained by in vitro culture, and used in two different studies. In the first study, we investigated the genetic variability (molecular markers RAPDs) between tobacco plants originated from seeds and from micropropagation, from both O3 sensitive and O3 tolerant cultivars. The results showed distinct groups based on origin/genotype: the plants originated from micropropagation were highly uniform with a genetic similarity of 0,987 (Bel W3) and 1 (Bel B). In the second study we conducted three ozone biomonitoring trials with tobacco plants (originated from seeds and from micropropagation) both at Lamas de Olo and Monte Velho. In addition to the analysis of visible foliar injury we was also performed a molecular analysis with RAPD markers (Bel W3). Ozone exposition induced visible foliar injury in Bel W3 plants, at both sites, indicating that ozone ambient levels can be potentially phytotoxicity to local sensitive plant receptors. There were no or negligible injuries in Bel B plants. The injuries in Bel W3 plants were observed in both plants originated from seeds and micropropagation, and the intra-population variability of O3-induced leaf damage was similar between the two types of plants. The molecular analysis resulted in the formation of groups independent from the origin of the plants, based instead on trial period/ trial site, with plants from different origins (seed and micropropagation) present in each group.

El interés por la conservación de las comunidades ribereñas del río Paraná ha llevado a la identificación de nuevas especies para la flora argentina durante los últimos años. En el noreste de Argentina y sureste de Paraguay, se han identificado poblaciones de Calophyllum brasiliense Cambess. (Calophyllaceae) en remanentes de selvas higrófilas, especie arbórea típica de selvas inundables y tolerante a la inundación. El objetivo de este trabajo fue caracterizar la variabilidad genética de seis poblaciones, tres argentinas, dos paraguayas y una mexicana, a través de marcadores moleculares y establecer relaciones filogeográficas entre ellas, con el fin último de contribuir en la planificación de estrategias de conservación. Se obtuvieron 56 loci RAPDs a partir de los cuales se estimaron parámetros genéticos clásicos para dos de las poblaciones. La heterocigosidad esperada total fue baja (He=0,273), al igual que el índice de diversidad de Shannon (I=0,406). La diferenciación interpoblacional fue muy elevada (ϕST=0,283), encontrándose el 78% de la variabilidad genética dentro de las poblaciones. Quedó demostrado además que la población de San Ignacio presenta estructuración genética espacial dentro de los 20 m de distancia, información relevante en el diseño de estrategias de conservación in situ y ex situ. Por otro lado, se describieron las secuencias de siete regiones intergénicas y una intrónica del genoma cloroplástico, en suma 1.749 pb, cuatro de las cuales mostraron diferencias nucleotídicas. No obstante, se escogió el intrón del gen trnL para realizar el análisis filogeográfico de las seis poblaciones, que permitieron estimar la diversidad nucleotídica (π=0,00237) y haplotípica (Hd=0,296). Se identificaron tres haplotipos que discriminaron las poblaciones argentinas, paraguayas y mexicana. Las variantes haplotípicas encontradas en el presente trabajo nos llevaron a reconsiderar y plantear un modelo de las rutas de dispersión geográfica y colonización de C. brasiliense en el pasado, a través del río Paraná como de vías alternativas.
In recent years the growing interest in Paraná River’s riparian forest conservation led to the discovery of new plant species in Argentina. In the hygrophile forest remnants from Northeastern part of Argentina and Southeastern area of Paraguay, populations of Calophyllum brasiliense Cambess. (Calophyllaceae), a typical flood lowlands species, were identified. The aims of this work were to characterize and compare the genetic variability within and among six populations of C. brasiliense, three from Argentina, two from Paraguay and one from Mexico, using molecular markers and to infer phylogeographic relationships among populations, in order to contribute with the planning of conservation strategies. Classic genetic population parameters were estimated once 56 RAPDs loci were obtained. The total expected heterozygosity (He=0,273) and the Shannon diversity index (I=0,406) obtained were low. On the other hand, interpopulation differentiation was high (ϕST=0,283), and 78% of genetic variability observed was within populations. At the same time the spatial genetic analysis demonstrated that the population from San Ignacio is genetically structured at distances shorter than 20 m, being this data relevant for the design of in situ and ex situ conservation projects. Besides, seven intergenic and one intronic chloroplast genome regions were described, adding up a total of 1.749 pb. Four of these regions showed nucleotide differences. However, only the trnL intron was selected for the phylogeographic analysis, being possible to estimate the nucleotide (π=0,00237) and haplotypic diversity (Hd=0,296). Finally, three haplotypes were identified through which Argentinean, Paraguayan and Mexican populations could be differentiated. The haplotypic variants that have been found in the present work led us to reconsider and propose a model on C. brasiliense’ geographic dispersion and colonization used in the past, both through the Paraná River and alternative routes.

Frente a las consecuencias indeseables del control químico, la demanda pública de alimentos más sanos y el cambio actual de los paradigmas productivos, la tendencia es sustituir total o parcialmente los fungicidas sintéticos por métodos alternativos no contaminantes, en el marco del Manejo Integrado. El trigo es el cereal de mayor distribución geográfica en el mundo y su demanda irá en aumento debido al incremento de la población mundial. La región triguera en la Argentina abarca una zona muy amplia con condiciones favorables para la aparición de diversas enfermedades. Una de ellas, de origen fúngico, es la Septoriosis ó Mancha de la hoja del trigo (Septoria tritici Roberge in Desmaz. anamorfo; Mycosphaerella graminicola (Fuckel) J. Schroeter, in Cohn teleomorfo). A nivel mundial, ocasiona daños que oscilan entre 31 y 54% de reducción en el rendimiento y en Argentina entre 17 y 50% dependiendo del estado fenológico en el que ocurre la infección. El método utilizado tradicionalmente para el control de la enfermedad es la aplicación de productos químicos sintéticos. El uso masivo de estos productos favoreció la aparición de patógenos resistentes además de las graves consecuencias la contaminación del ambiente. Utilizando microorganismos antagonista, el control biológico, ha tomado relevancia en estos últimos años. Las especies del género Trichoderma son los antagonistas más utilizados para el control de enfermedades de plantas, producidas por hongos, debido a su ubicuidad, a su facilidad para ser aisladas y cultivadas, a su crecimiento rápido en un gran número de sustratos y a que no atacan a plantas superiores. Estas especies basan sus propiedades antagónicas en la activación de mecanismos muy diversos. Uno de ellos es que pueden ejercer el biocontrol de hongos fitopatógenos indirectamente, compitiendo por el espacio y los nutrientes, modificando las condiciones ambientales, estimulando el crecimiento de las plantas y sus mecanismos de defensa. Otra medida, es mediante el micoparasitismo, por la penetración directa de las hifas al hospedador y/o por producción de enzimas extracelulares. El objetivo de este trabajo es presentar un estudio integrado, que combine propiedades: morfológicas, fisiológicas y moleculares de los aislamientos nativos de T. harzianum, para ser utilizarlos como eficientes agentes de control biológico. En este estudio se evaluaron 240 aislamientos de Trichoderma obtenidas de muestras de suelo de diferentes localidades de la región triguera argentina. La capacidad antagónica se ensayó en plántulas de trigo, en invernaculo. Para seleccionar las cepas de Trichoderma harzianum se tuvo en cuenta la capacidad de reducir en un 50 % tanto la superficie necrosada como la cobertura picnidial generada por M. graminicola. Se obtuvieron de esta manera 37 cepas del antagonista. Los resultados presentados hasta el momento evidencian la importancia de resistencia sistémica inducida (RSI) actuando en la defensa de la planta contra M.graminicola. Para la identificación de los aislamientos de Trichoderma se utilizó la técnica de PCR con los cebadores forward THITS-F2 y reverse THITS-R3 los cuales permiten identificar específicamente a T. harzianum. Para la caracterización genética intraespecífica se utilizaron marcadores ISSR. Con los resultados obtenidos se agruparon las cepas, en tres grupos de similitud. Estos grupos no presentaron correspondencia con el origen geográfico, ni con el año de aislamiento y ni con los distintos niveles de antagonismos. Los resultados de la caracterización morfocultural, el crecimiento radial y el color de las colonias, la coloración del medio de cultivo y el tamaño y la forma de los conidios no presentaron diferencias con las descripta en la taxonomía clásica para la especie T. harzianum. La presencia de las clamidosporas y su ubicación en el micelio, fue la característica que demostró mayor variación en el presente estudio. El 27% de las 37 cepas estudiadas no formaron clamidosporas durante el tiempo de duración del ensayo. De aquellas cepas que si las formaron, el 59% se ubicaron de manera intercalar y el 26% tanto terminales como intercalares. Sólo el 15% de las cepas formaron clamidosporas terminales. Los aislamientos se caracterizaron fisiológicamente en base a los siguientes parámetros: crecimiento de las colonias en diferentes fuentes carbonadas y nitrogenadas, crecimiento de las mismas bajo condiciones extremas de temperatura y pH. Los resultados presentaron escasa variabilidad por sí solos y no generaron una discriminación entre las cepas. La caracterización de la actividad enzimática destacó a dos cepas (2 y 8) como capaces de producir altos niveles de β-1-3 glucanasa, quitinasa y proteasa. Es importante resaltar en este estudio la relación encontrada entre las cepas cuando se integraron los atributos morfológicos, fisiológicos y moleculares. Con esta combinación se pudo observar una clara correspondencia entre ellas y su origen geográfico. Como ejemplo de ello, las cepas que integran el grupo I se encuentran divididas en dos ramas bien diferenciadas. Así las cepa 1, 5, 8 y 12 pertenecen a la localidad de Los Hornos y las cepas 160, 162, 165, 170 y 177 a la de Lobería. Con los resultados obtenidos en este trabajo se reconocieron una serie de propiedades (morfológicas, fisiológicas y moleculares) que sumadas a la identificación tradicional de T. harzianum, servirán para ampliar la caracterización de las cepas de esta especie como agentes de biocontrol y seguir su evolución en el tiempo y en medio ambiente cuando éstas se apliquen con fines biotecnológicos.

La familia Calyceraceae es un pequeño grupo ca. 54 especies endémicas Sudamérica austral. La mayoría de ellas se distribuye a lo largo de la cordillera de los Andes y Patagonia a partir del sur de Perú, aunque algunas especies presentan distribución chaqueña, alcanzando la costa atlántica y algunos enclaves de las selvas paranaense y atlántica en Brasil. Las Calyceraceae están estrechamente relacionadas con las Asteraceae, una de las cinco familias más ricas en especies de Angiospermas y una de las familias botánicas con mayor importancia económica. El subclado Calyceraceae + Asteraceae comparte varias sinapomorfías: las flores dispuestas en inflorescencias capituliformes rodeadas por brácteas involucrales, las anteras connadas en un anillo que rodea el estilo, con dehiscencia introrsa y presentación secundaria de polen, el polen espinulado o liso con concavidades intercolpares, ovarios uniloculares con un único óvulo, y cipselas con un cáliz persistente modificado. Recientes análisis filogenéticos han demostrado que el subclado Calyceraceae + Asteraceae queda incluido en el clado MGCA (Menyanthaceae + Goodeniaceae + Calyceraceae + Asteraceae), un grupo monofilético con alto nivel de soporte. Las Calyceraceae se distinguen de las Asteracae principalmente por su óvulo péndulo (erecto en las Asteraceae), el estigma indiviso, punctiforme o capitado (dividido en dos ramas en las Asteraceae, que a veces no se separan simiulando un estigma indiviso), y la presencia de un tubo estaminal más o menos desarrollado (muy raro en las Asteraceae). Si bien las Calyceraceae se distinguen claramente como familia, no sucede lo mismo con sus géneros. Diversos problemas de interpretación de su morfología, más la variación morfológica de algunas de sus especies con amplia distribución geográfica, han desdibujado los límites entre los géneros (todos ellos basados en taxonomía alfa). Así, la familia Calyceraceae necesita una revisión de su morfología, de la taxonomía de sus especies y una reevaluación de sus géneros dentro de un marco filogenético, que permita proponer una clasificación natural y desarrollar hipótesis de evolución morfológica. De este modo, se propuso realizar una revisión taxonómica detallada de todas las especies de esta familia, más un análisis filogenético exploratorio combinando caracteres morfológicos y moleculares. Para la revisión taxonómica detallada, se efectuó una recopilación y revisión exhaustiva del material bibliográfico relacionado con la diversidad y taxonomía de la familia (catálogos, floras, tratamientos taxonómicos parciales y protologos), se procedió a la búsqueda y reconocimiento de ejemplares tipo, se estudiaron plantas vivas en su hábitat; se examinaron especímenes de varios herbarios, se observaron caracteres vegetativos y reproductivos de los ejemplares de herbario y de plantas vivas en su hábitat de las especies conocidas de la familia Calyceraceae. Como resultados de la revisión taxonómica, se reconocieron 47 especies distribuidas en los 6 géneros tradicionales. Cada especie se delimitó claramente, actualizando las listas sinonímicas, efectuando las lectotipificaciones necesarias y realizando descripciones ampliadas y detalladas para cada una de ellas. Además, se señalaron sus respectivas áreas de distribución geográfica con comentarios acerca de su hábitat y se presentaron discusiones acerca de los caracteres morfológicos entre especies similares y cómo diferenciarlas. Se publicaron dos especies nuevas para ciencia y una nueva combinación; se establecieron 25 nuevas sinonimias y se realizaron 21 lectotipificaciones y una neotipificación. Finalmente se confeccionó una clave artificial para identificar las 47 especies reconocidas de Calyceraceae. Para el análisis filogenético exploratorio, se realizó un el análisis cladístico de las 47 especies de la familia Calyceraceae reconocidas en esta tesis (con algunas excepciones dependiendo de la disponibilidad de datos para unas pocas especies raras). La elección de los grupos externos se basó en la selección de taxones hermanos de Calyceraceae, pertenecientes al clado MGCA. Se identificaron 37 caracteres exomorfológicos variables entre las especies y se definieron sus estados homólogos. Para los datos moleculares se trabajó con material coleccionado en sílica gel o material de herbario de 35 taxones, representando todos los géneros de Calyceraceae. También se obtuvieron secuencias de Genbank. Se amplificaron, mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), secuencias nucleotídicas correspondientes a espaciadores intergenes del cloroplasto: trnS–trnG y trnH–psbA. El análisis cladístico se basó en el criterio de máxima parsimonia. Se realizaron análisis con datos morfológicos, moleculares y combinados. Para cada análisis se obtuvieron árboles de consenso estricto y de mayoría (50%). Para evaluar la homoplasia de los caracteres en los árboles se obtuvieron los índices de consistencia y de retención. Para calcular el soporte de las ramas en los árboles óptimos se usó Jackknife Parsimony. Para calcular el soporte de las ramas en los árboles óptimos resultantes del análisis morfológico se usó Bremer support. De acuerdo con los resultados del análisis filogenético, la estructura de la inflorescencia de tipo cefalodio se agrega a las sinpomorfías de ls Calyceraceae. De los seis géneros tradicionalmente aceptados, sólo Acicarpha es monofilético; Boopis, Calycera, Gamocarpha, Moschopis y Nastanthus son géneros polifiléticos. La mayoría de los caracteres morfológicos son altamente homoplásicos. Con excepción de la forma columnar del receptáculo y la presencia de flores estaminadas en el centro de la inflorescencia (sinapomorfías de Acicarpha), los caracteres utilizados en taxonomía clásica para delimitar los géneros de Calyceraceae no permiten delimitar grupos naturales. Sin embargo, surgieron algunos pocos nuevos caracteres morfológicos con valor taxonómico: la presencia de pelos (especialmente en el pedúnculo y el involucro), la ubicación de los nectarios, la presencia de una secreción glutinosa en los tallos y las hojas, y en menor medida la forma de la base de las anteras, la nervadura central de los sépalos. Otro caracteres con valor taxonómico en ls Asteraceae, como el ápice de las anteras, las brácteas del receptáculo, la proporción del hipanto y de la porción lobada de la corola (éstos dos últimos como indicadores de la estructura general de la corola), resultaron altamente homoplásicos y no permitieron delimitar grupos naturales. Se reconocen dos grandes grupos monofiléticos dentro de Calyceraceae, especies con glándulas nectaríferas estaminales (clado A) y especies con glándulas nectaríferas hipantiales (clado B). Dentro del clado A se reconocen dos grupos monofiléticos: el clado 1, integrado por el género Acicarpha junto con su especie hermana Boopis anthemoides; y el grupo de plantas formado por las especies “Glutinosas” del clado 2 junto con su especie hermana Moschopis leyboldi y las dos variedades de Boopis gracilis (en su mayoría de distribución austral). Dentro del clado B se reconocen tres grupos monofiléticos: el grupo de especies “Pubescentes”, que incluye especies de los géneros Boopis y Calycera (clado 3); el clado 4, que incluye a Moschopis monocephala y algunas especies del género Calycera; y el clado 5, que incluye varias especies de los géneros Nastanthus, Boopis y Gamocarpha. Todos los clados del análisis combinado, inclusive los de bajo soporte, presentan coherencia en la distribución geográfica de sus especies. Los resultados del análisis filogenético sugieren que son necesarios cambios profundos en la taxonomía de la familia, para delimitar nuevamente y enmendar los géneros que la integran.

Ligand-protein inverse docking has recently been introduced as a computer method for identification of potential protein targets of a drug. A protein structure database is searched to find proteins to which a drug can bind or weakly bind. Examples of potential applications of this method in facilitating drug discovery include: (1) identification of unknown and secondary therapeutic targets of a drug, (2) prediction of potential toxicity and side effect of an investigative drug, and (3) probing molecular mechanism of bioactive herbal compounds such as those extracted from plants used in traditional medicines. This method and recent results on its applications in solving various drug discovery problems are reviewed.
Singapore-MIT Alliance (SMA)

Dissertação de mestrado, Biologia Molecular e Microbiana, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Universidade do Algarve, 2015
No nosso dia-a-dia a estabilidade do nosso genoma está constantemente a ser atacada por vários agentes provenientes de fatores endógenos e exógenos, ao organismo. De entre estes agentes encontram-se os mutagénios químicos que causam mutações ao nível do DNA, por meio de reações químicas, o que pode alterar os mecanismos normais das células e consequentemente originar muitas doenças, nomeadamente cancro. Estes agentes estão presentes no ambiente, mas derivam essencialmente de drogas, como tabaco, álcool e substâncias ilícitas, e fármacos clínicos. Um dos grandes desafios, hoje em dia, é a exploração de novos agentes, que possam tratar uma variedade de doenças degenerativas ou melhorar a qualidade de vida em idades avançadas. A resistência à terapia é frequente na quimioterapia do cancro, impulsionando grupos de investigação na procura de novos compostos com novos mecanismos de ação anti cancro e com menos efeitos secundários. Assim, a comunidade científica centrou-se na exploração de plantas medicinais, usadas já pelos nossos antepassados, para fins curativos, devido aos seus compostos biologicamente ativos. De entre esses compostos, destacam-se os alcalóides, os terpenos e os fenóis. Estes compostos podem causar efeitos benéficos, pois estão associados a diversas atividades, das quais a atividade antioxidante, anticitotóxica e antigenotóxica são as mais frequentes, mas os mecanismos responsáveis por estas e outras atividades reportadas estão por aprofundar. Portanto, o nosso objetivo focou-se no estudo da atividade protetora de extratos vegetais, como extrato de Ginkgo biloba (GB), Dittrichia viscosa (IV) e Melissa officinalis (MO), contra stresse genotóxico provocado por dois agentes químicos, camptotecina (CPT) e nitroprussiato de sódio (SNP). Os ensaios foram realizados em dois modelos biológicos diferentes: na levedura Saccharomyces cerevisiae e na levedura Schizosaccharomyces pombe. Para investigar os efeitos protetores dos diferentes extratos, nos dois modelos biológicos, efetuaram-se ensaios de viabilidade, juntamente com camptotecina e nitroprussiato de sódio. O efeito antigenotóxico foi testado através do ensaio cometa, apenas na levedura S. cerevisiae e os mecanismos de proteção dos extratos envolveu a determinação da viabilidade celular, em estirpes mutantes, da levedura Sch. pombe, afetadas em mecanismos de regulação e reparação da resposta a danos de DNA. Os nossos resultados sugerem que CPT e SNP são substâncias que levam à perda de viabilidade celular e provocam danos no DNA, como se verificou nos ensaios de viabilidade e ensaio cometa. Os extrato de GB e IV mostraram proteção contra CPT, podendo essa proteção ser por indução da recombinação homóloga, como sugerem os resultados de ausência de proteção em mutantes afetados nesta via de reparação de DNA. Relativamente ao SNP, os extratos de GB e MO apresentam um efeito sinergístico, ou seja, potenciam o efeito do SNP quando adicionados em conjunto, como se observou no aumento da perda de viabilidade, enquanto que o extrato de IV parece proteger as células danificadas pelo SNP. A levedura Sch. pombe mostrou ser um melhor modelo para este ensaio do que a levedura S. cerevisiae.

The thesis was focused on the microevolutionary mechanisms that contribute to morphological diversity in selected members of the sedge family (Cyperaceae). Natural hybridization, evidenced from both morphological characters and molecular markers, was revealed to be a potentially important source of diversification in the tropical spikerushes of Eleocharis subgenus Limnochloa. High levels of phenotypic plasticity of clonal growth but rare genetic (ecotypic) differentiation among contrasting morphotypes were found in the polymorphic species Carex nigra, which implied that taxonomic splitting of the species was unreasonable.