Academic literature on the topic 'Nano-Anticorps'

Le récepteur ILT4 est un point de contrôle immunitaire, principalement exprimé par les cellules myéloïdes du système immunitaire. Dans le contexte cancéreux, ILT4 participe au développement tumoral en maintenant un microenvironnement immunitaire protumoral et en activant directement la prolifération tumorale. L’activation d’ILT4 par la molécule du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH) de classe I non-classique HLA-G induit des cellules myéloïdes tolérogènes. De plus, l’expression ectopique d’ILT4 a été rapportée dans plusieurs types de cancers. L’interaction entre l’angiopoiétine-like2 (ANGPTL2) et l’ILT4 promeut la prolifération de cellules de cancer du poumon non à petites cellules et inhibe leur apoptose. Cibler ce nouveau point de contrôle immunitaire par des anticorps bloquants est donc une approche prometteuse en immunothérapie. A la lumière de certaines limitations des anticorps conventionnels bloquants en thérapies des tumeurs solides, nous avons investigué le potentiel d’inhibiteurs basés sur des VHH. Ce petit format d’anticorps, dérivé des anticorps homodimériques de camélidés, allie les propriétés de spécificité des anticorps à celles des petites molécules. Grâce au criblage par phage-display d’une banque immunologique obtenue par immunisation d’un alpaga, nous avons sélectionné un VHH hautement affin et spécifique pour ILT4, qui inhibe l’interaction entre le récepteur et ses deux ligands. Nous avons démontré l’effet biologique antagoniste du VHH in vitro sur des modèles de cellules tumorales et de macrophages de type M2 protumoraux issus de monocytes. Ces premiers résultats de caractérisation supportent le développement futur de ce nouveau format d’anticorps VHH bloquant ILT4 en immunothérapie antitumorale
ILT4 (Immunoglobulin-Like Transcript 4) is an immune checkpoint receptor mainly expressed by myeloid immune cells. In cancer context, ILT4 participates in tumor development by maintaining a protumoral immuno-microenvironment and directly promoting tumor cell proliferation. ILT4 interaction with the non-classical MCH class I molecule HLA-G induces an immunosuppressive microenvironment by promoting tolerogenic myeloid cells. Moreover, the ectopic expression of ILT4 has been reported in several solid tumors. The activation of ILT4 by Angiopoietin-like-2 (ANGPTL2) promotes non-small cell lung tumor cell proliferation and inhibits cell apoptosis. Targeting this new immune checkpoint with blocking antibodies is therefore a promising cancer immunotherapy approach. In light of several drawbacks of classical IgG blocking antibodies in solid cancer, we investigated the potential of VHH-based inhibitors. This small monoclonal antibody format, derived from camelid homodimeric antibodies, combine the binding capacities of antibodies to the properties of small molecules. After immunization of an alpaca and phage-display screening, we selected a VHH with high affinity and specificity to ILT4 that inhibits the interaction of the receptor with both ligands. We validated the VHH’s biological antagonist activity on tumor cells and monocyte-derived pro-tumoral M2 like macrophages in vitro. These results support the potential of this new VHH-based antibody targeting ILT4 in cancer immunotherapy

Les GTPases de la sous famille RHOA participent à la régulation de nombreuses voies de signalisation qui contrôlent la dynamique du cytosquelette cellulaire et une grande diversité de fonctions telles que la prolifération, la division, la migration et la polarité cellulaires. Ce sont de véritables interrupteurs moléculaires qui, en réponse à un stimulus, changent de conformation tridimensionnelle pour activer leurs protéines effectrices cibles. Elles existent donc sous deux formes, une forme inactive liant le GDP et une forme active, liant le GTP. La proportion de forme active est extrêmement régulée au niveau spatial et temporel dans une cellule et représente moins de 10% de sa totalité. Depuis près de 20 ans, le seul outil disponible pour étudier leur activation est constitué par le domaine de liaison d'un effecteur, le RBD. Peu stable, faiblement soluble et peu adaptable, de nouveaux outils sont nécessaires afin de mieux comprendre la fine régulation de ces protéines. Les anticorps à simple domaine, VHH ou nanobodies, sont caractérisés par leur stabilité, solubilité, haut rendement de production et versatilité de fonctionnalisation. A partir d'une nouvelle banque d'anticorps à simple domaine optimisée pour la production d'intracorps, nous avons isolés différents clones capables de reconnaître in vitro et de bloquer in cellulo la forme active de ces protéines. L'un de ces clones permettra le développement d'un nouvel outil de mesure de l'activité de ces protéines in vitro tandis qu'un autre, in cellulo, permettra de mieux comprendre la régulation spatiale et temporelle des protéines endogènes
RHOA small GTPase belongs to a subfamily acting as a molecular switch activating major signaling pathways that regulate cytoskeletal dynamics and a variety of cellular responses such as cell cycle progression, cytokinesis, migration and polarity. RHOA activity resides in a few percent of GTP loaded protein, which is finely tuned by a crosstalk between regulators of the GTPase cycle. Manipulating a single RHO at the expression level often induces imbalance in the activity of other RHO GTPases, suggesting that more specific tools targeting these active pools are needed to decipher RHOA functions in time and space. We decided to use single domain antibodies, also known as VHH or nanobodies, as a new tool for studying RHOA activation. We produced and screened a novel fully synthetic phage display library of humanized nanobodies (NaLi-H1) to develop conformational sensors of the GTP loaded active conformation of RHO subfamily. We obtained several high affinity nanobodies against RHOA's active form which we characterized as RHO active antibodies in vitro and RHO signaling blocking intrabodies in cellulo. These new tools will facilitate and improve our current knowledge of this peculiar protein subfamily and will be a paradigm for the study of other RHO related small GTPases

Les produits d'origine naturelle sont de plus en plus recherchés et testés pour leur potentiel thérapeutique. Les peptides issus de venins de scorpions capables de moduler l'activité des canaux ioniques constituent de robustes outils biologiques essentiels pour une meilleure compréhension des mécanismes de fonctionnement de ces canaux transmembranaires, sélectifs notamment au sodium. Ils représentent parfois les molécules majeures du venin responsables de son effet hautement toxique qui se manifeste par des syndromes cardiogéniques et d'un œdème pulmonaire souvent fatal pour l'Homme. En modulant l'activité des canaux ioniques ces molécules sont potentiellement capables d'agir sur les processus cellulaires qui leur sont associés. Dans une première partie de ce travail, nous nous sommes intéressés au mécanisme d'interaction de la toxine AahII du venin du scorpion Androctonus australis hector (Aah) avec le canal sodique voltage-dépendant NaV1.5 et de son effet sur l'activité électrophysiologique de ce canal. Nous avons en particulier étudié la capacité du nanoanticorps anti-AahII (NbAahII 10 ou Nb10) à neutraliser l'interaction AahII/NaV1.5. Dans une seconde partie, nous avons investigué l'effet de différentes fractions peptidiques issues du venin de Aah sur la viabilité des cellules cancéreuses mammaires humaines. La toxine AahII est considérée comme l'α-toxine la plus active du venin de scorpion Aah. Elle a notamment été décrite pour ralentir l'inactivation des canaux sodiques NaV. Le nanoanticorps Nb10 a été développé afin de neutraliser l'effet de la toxine AahII. L'efficacité du Nb10 a été évaluée in-vivo sur des souris, mais son mécanisme d'action au niveau cellulaire reste inconnu. Nos travaux ont confirmé que AahII ralentit de manière dose dépendante l'inactivation des canaux sodiques NaV1.5 surexprimés dans des cellules HEK293, sans modifier l'amplitude du courant au pic d'une part et ont montré que le Nb10 neutralise l'effet de la toxine AahII sur la cinétique d'inactivation du canal d'autre part. L'analyse bioinformatique du complexe d'interaction de NaV1.5/AahII montre que la AahII partage la même surface d'interaction avec le Nb10, ce qui suggère fortement que ce dernier déplace dynamiquement la toxine AahII de son site de liaison sur le canal NaV1.5. Au niveau physiopathologique, nous avons montré que le traitement des cellules cancéreuses mammaires humaines MDA-MB-231 avec le Nb10 prévient l'augmentation de l'invasion cellulaire induite par AahII. Dans la seconde partie de ce travail, les 3 majeures fractions issues du venin de scorpion Aah, préalablement isolées par chromatographie à basse pression (M1, M2 et AahG50), ont été testées sur la viabilité et la migration des lignées cellulaires cancéreuses mammaires humaines, MCF-7 et MDA-MB-231. Ces fractions n'ont pas eu d'effet sur la migration cellulaire mais ont induit des effets très biphasiques sur la viabilité cellulaire, démontrant de manière intéressante des effets synergiques ou antagonistes des peptides qui les composent. Afin de purifier les peptides d'intérêts, une purification supplémentaire des fractions a été réalisée par chromatographie à haute pression (HPLC). Au total, trois polypeptides ont été identifiées pour induire une diminution de la viabilité des cellules cancéreuses mammaires et feront l'objet d'investigation plus poussée. En conclusion, nos résultats ont permis d'élucider les mécanismes physiologiques et moléculaires de neutralisation de l'α-toxine AahII par le nanoanticorps Nb10. De plus, nous avons pu identifier trois molécules peptidiques issues du venin de scorpion Aah possédant des propriétés anticancéreuses. Ces travaux se poursuivront par une étude structurale permettant d'élucider à une échelle tridimensionnelle, les topologies moléculaires sous-jacentes
Natural molecules are increasingly being researched and tested for their therapeutic potential. Scorpion venoms derived peptides modulating ion channels activity are robust biological essential tools for a better understanding of the action mechanisms of these transmembrane channels, particularly sodium channels. They represent sometimes the major molecules of the venom responsible for its highly toxic effect which manifests with cardiogenic syndromes and pulmonary edema often fatal for humans. By modulating ion channels activity, these molecules are potentially able to act on the cellular processes associated with them. In the first part of this work, we have studied the mechanism of interaction of the AahII toxin from the scorpion venom of Androctonus australis hector (Aah), with the voltage-gated sodium channel NaV1.5 and its effect on the electrophysiological activity of this channel. In particular, we studied the ability of the anti-AahII nanoantibody (NbAahII 10 or Nb10) to neutralize the AahII/NaV1.5 interactions. In the second part, we investigated the effect of different peptide fractions from Aah venom on the viability of human breast cancer cells. The toxin AahII is the most active α-toxin from the North African scorpion Androctonus australis hector that slows the fast inactivation of NaV channels. To fight scorpion envenomation, an anti-AahII nanobody named NbAahII10 (Nb10) was developed. The efficiency of this nanobody has been evaluated in vivo on mice, but its mechanism of action at the cellular level remains unknown. Our work confirmed that the AahII toxin slows the fast inactivation of the adult cardiac NaV1.5 channels, expressed in HEK293 cells, in a dose-dependent manner, while current amplitude was not affected, and showed that Nb10 can fully reverse the effect of the AahII toxin on the channel inactivation kinetics. Bioinformatic analysis of the NaV1.5/AahII interaction complex shows that AahII shares the same interaction surface with Nb10, which strongly suggests that Nb10 dynamically replaces the AahII toxin from its binding site on the NaV1.5 channel. At the pathophysiological level, we showed that treatment of human breast cancer cells MDA-MB-231 with Nb10 prevents the increase in cell invasion induced by AahII. In the second part of this work, the 3 major fractions from Aah scorpion venom, previously isolated by low-pressure chromatography (M1, M2, and AahG50), were tested on the viability and migration of human breast cancer cell lines, MCF-7 and MDA-MB-231. These fractions did not affect cell migration but induced very biphasic effects on cell viability, interestingly demonstrating synergistic or antagonistic effects of their component peptides. To purify the peptides of interest, additional purification of the fractions was performed by high-pressure chromatography (HPLC). In total, three polypeptides were identified to induce a decrease in breast cancer cell viability and will be further investigated. In conclusion, our results elucidated the physiological and molecular mechanisms of α-toxin AahII neutralization by the Nb10 nanoantibody. In addition, we were able to identify three peptide molecules from the scorpion venom Aah with anticancer properties. This work will continue with a structural study to elucidate the underlying molecular topologies at a three-dimensional scale

Ces dernières années, grâce aux progrès réalisés dans l'humanisation des anticorps monoclonaux recombinants (Acm-r), ceux-ci ont vu leur utilisation thérapeutique s'accroître, notamment dans le traitement du cancer. Parmi ces Acm-r, le rituximab (MabThera®, Rituxan®) est le premier à avoir obtenu une autorisation de mise sur le marché en Europe et aux Etats-Unis. Il s'agit d'un anticorps chimérique de type IgG1 kappa dirigé contre l'antigène de surface CD20 exprimé par plus de 95% des cellules lymphoïdes B. Le rituximab utilisé seul ou en association avec de la chimiothérapie a montré son efficacité dans le traitement des lymphomes de faible et de haute malignité. Néanmoins, lorsqu'il est utilisé en monothérapie, 30 à 50% des patients ne répondent pas au traitement. Plusieurs hypothèses ont été évoquées pour expliquer cette variabilité de réponse, parmi lesquelles l'importance de la masse tumorale, un faible niveau d'expression du CD20, la présence de formes solubles de CD20 ou encore de faibles concentrations sériques de rituximab. Ainsi, l'exposition au médicament et la masse tumorale pourraient être des facteurs de variabilité thérapeutique à prendre en compte pour optimiser individuellement le traitement des patients atteints de lymphome malin non hodgkinien.

L'objectif général de ce travail de thèse a été d'analyser les rôles respectifs du volume tumoral et des paramètres pharmacocinétiques dans la réponse au rituximab en utilisant des moyens d'imagerie adaptés aux modèles murins et à la cancérologie.

Dans une première partie de mise au point du modèle, nous avons utilisé une lignée lymphomateuse T (EL4) syngénique de souris C57Bl6J, transduite par le CD20 humain que nous avons transfectée avec le gène de la luciférase (EL4-huCD20-Luc). Nous avons ensuite défini les conditions expérimentales (nombre de cellules, voie d'administration, dose de luciférine de potassium, fond génétique, périodicité des examens) permettant de reproduire chez la souris le développement d'un lymphome agressif et disséminé à larges cellules B létal dans un délai de 30 à 40 jours après inoculation. Nous avons mis au point une méthode de quantification de l'intensité de bioluminescence des foyers tumoraux en prenant en compte le coefficient d'absorption de la lumière propre à la localisation anatomique de chaque tumeur lymphomateuse.

Dans une seconde partie nous avons étudié l'effet thérapeutique du rituximab sur ce lymphome. Une seule injection de rituximab à dose progressivement croissante (de 150 µg à 1000 µg) a été réalisée 13 jours après l'inoculation des cellules lymphomateuses (temps nécessaire au développement d'un lymphome quantifiable par imagerie de bioluminescence). La concentration de rituximab circulant a été évaluée par une méthode ELISA adaptée à l'analyse de faibles volumes de plasma et à un modèle murin. Dans ce modèle, nous avons montré qu'il existait une relation entre la dose administrée et la survie des souris, la totalité des souris étant survivantes à la dose de 1000 µg. C'est à 500 µg que nous avons retrouvé la plus grande variabilité de réponse au rituximab avec environ 23% de souris totalement guéries, 59% en réponse partielle et 18% avec une maladie en progression. Pour l'ensemble des souris recevant cette dose, nous avons déterminé précisément le volume tumoral au moment de l'injection du rituximab et évalué les concentrations de rituximab au décours du traitement. Nous avons ainsi montré qu'il existait une relation significative entre le volume tumoral au moment de l'injection et la réponse au rituximab ; les souris présentant les plus faibles volumes tumoraux ayant une meilleure réponse et une survie prolongée. L'analyse de l'évolution des concentrations de rituximab au cours du temps nous a permis de montrer une très grande variabilité d'exposition à l'anticorps semblable à l'observation faite chez l'homme. Nous avons modélisé les concentrations de rituximab et la progression des foyers tumoraux par la construction d'un modèle concentration/effet (PK-PD) nous ayant permis de démontrer l'existence d'une relation entre l'efficacité du rituximab et le volume tumoral avant traitement.

Enfin dans un troisième volet nous avons utilisé le modèle cellulaire EL4-huCD20-Luc afin d'évaluer in vitro l'usage de particules d'oxydes de gadolinium ou de particules d'oxydes de gadolinium et de bore. Nous avons montré les qualités d'agents de contraste de ces particules pour l'imagerie à résonance magnétique. Nous avons aussi analysé l'important effet rayonnant de ces particules lors d'une irradiation sous un faisceau de neutrons après une étape d'internalisation des particules au sein des cellules.