Dissertations / Theses on the topic 'Mycobacterium avium complexes'

Projeto de Pós-Graduação/Dissertação apresentado à Universidade Fernando Pessoa como parte dos requisitos para obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas
As infeções provocadas por micobactérias são das doenças mais antigas que afetam a humanidade, estando descritas há mais de 4000 anos. As micobactérias ditas atípicas (NTM - "non-tuberculous mycobacteria"), nomeadamente as pertencentes ao complexo Mycobacterium avium (MAC), são ubíquas no meio ambiente, sendo impossível evitar a exposição ambiental. Estas bactérias são ingeridas através da água e alimentos, mas também inaladas através de aerossóis. Assim, uma grande parte da população já teve contato com MAC, mas nunca desenvolveu doença. O interesse pelas doenças provocadas por NTM cresceu exponencialmente com o recrudescimento global da epidemia da SIDA, pois muitas são patogénicos oportunistas. A infeção pulmonar é a forma de apresentação mais comum do MAC, mas também pode ocorrer infeção disseminada. De modo a evitar o desenvolvimento de doença oportunista recomenda-se o uso de profilaxia. A difícil eliminação do MAC pelos hospedeiros susceptíveis leva à sua permanência no interior das células fagocíticas e acaba por conduzir à formação de granuloma pulmonar. O diagnóstico diferencial baseia-se em métodos fenotípicos e genéticos. Relativamente ao tratamento, devido à sua camada exterior lipofílica, os medicamentos hidrofílicos apresentam fraca penetração. A terapia habitual utiliza uma combinação de antibióticos, para prevenir o surgimento de resistências. Infections caused by mycobacteria are of the oldest diseases affecting humanity, being described and researched about for over 4000 years. The atypical mycobacteria (NTM - "non-tuberculous mycobacteria"), in particular those belonging to the Mycobacterium avium complex (MAC), are ubiquitous in the environment, thus making it impossbile to avoid environmental exposure. These bacteria are ingested through water and foods but also through inhaled aerosols. Therefore, a large part of the population has had contact with MAC, but never developed any associated diseases. Interest in diseases caused by NTM has grown exponentially with the global resurgence of the AIDS epidemic, because many are opportunistic pathogens. Pulmonary infection is the most common form of presentation of the MAC, but can also be seen as a disseminated infection. To prevent the development of opportunistic infection it is recommended to use prophylaxis. The difficult elimination of susceptible hosts by MAC results in them staying permanently within the phagocytic cells and ultimately leads to the formation of pulmonary granuloms. Differential diagnosis is based on phenotypic and genetic methods. For the treatment, due to its lipophilic outer layer, hydrophilic drugs have poor penetration. The usual therapy uses a combination of antibiotics, to prevent emergence of resistance.

Haja vista a existência de quatro famílias de M. avium molecularmente distintas circulando na população de suínos do Sul do Brasil, a diferença de virulência constatada entre essas quatro famílias, a influência da virulência nos mecanismos de transmissão, as dúvidas existentes a respeito da existência e da importância da transmissão horizontal de M. avium em suínos e do significado desse conhecimento para o estabelecimento de métodos de controle eficientes, o presente projeto tem por objetivos: 1) Padronizar método de isolamento de micobactérias a partir de fezes suínas; 2) Caracterizar a eliminação de M.avium pelas fezes em suínos experimentalmente infectados pela via oral; 3) Verificar se existe transmissão horizontal entre suínos durante a fase de eliminação ativa, através de experimentos envolvendo infecção oral e exposição de animais contactantes; 4) Estudar, através de modelagem matemática, a dinâmica da infecção por M.avium em uma população suína. Como resultados, para cada um dos itens obteve-se: 1) Houve diferença significativa entre os protocolos de recuperação de micobactérias a partir de fezes de suínos (p< 0,05) e o método ácido com ressuspensão em solução de anfotericina B e semeadura em meio de Lowenstein-Jensen com antibióticos apresentou o maior percentual de recuperação (87%); 2) Foram constados dois períodos de eliminação fecal de MAC em suínos: um inicial, relativo à eliminação residual do inóculo, do 1º ao 4º, e um segundo, com início no 18º e término no 62º dias pós-inoculação, este último é resultado de suposta lesão aberta para a luz do intestino; 3) Cinco, dos sete animais contactantes, infectaram-se com o M.avium, estirpe PIG B e 4) A simulação matemática da doença, considerando a transmissão horizontal como mecanismo principal da ocorrência de condenações em matadouro por linfadenite granulomatosa é inconsistente com o que se observa na população. Portanto, o componente ambiental tem papel preponderante na dinâmica das infecções micobacterianas dos suínos produzidos no Brasil.
Considering four genetic distinct M. avium families within the swine population of the Southern Brazil, the virulence difference detected among them, the virulence influence on the transmission mechanisms, the current doubts concerning M. avium horizontal transmission existence and importance in swine and about its knowledge meaning in order to stablish efficient control programs, the objectives of the present study were: 1) to set in a standard mycobacterial isolation method from swine feces; 2) to characterize M. avium excretion through feces in swine infected orally; 3) to verify the existence of horizontal transmission among swine during the active elimination phase, by experiments involving oral infection and exposure of contacting animals; 4) to study, through mathematical modelling, M. avium infection dynamics in a swine population. These are the attained results for each of the items: 1) there was a significant difference (p<0.05) between the mycobacterial recovery protocols from swine feces and the acid method with suspension in amphotericin solution and inoculation in Lowenstein-Jensen media with antibiotics presented the greatest recovery percentage (87%); 2) two fecal elimination periods of M. avium in swine feces were observed: an initial one, relative to the residual elimination of the inoculum, within days 1 and 4, and a second one, starting at day 18 and ending at day 62 post inoculation - the last one results from a supposed lesion opened to the intestinal lumen. 3) Five out of seven contacting animals were infected with M. avium; 4) The mathematical simulation of the disease, considering the horizontal transmission as the major mechanism of occurrence of condemnation at slaughterhouses due to granulomatous lymphadenitis is not consistent with what is observed in the population. Therefore, the environmental component plays a preponderant role in the mycobacterial infections dynamics of swine raised in Brazil.

Tendo sido comprovada a existência da famílias molecularmente distintas de M. avium circulando em suínos de região sul do Brasil, e havendo dúvidas a respeito da importância da transmissão horizontal como mecanismo de manutenção da doença, o presente teve por objetivo estudar a virulência dessas estirpes, informação importente para o aperfeiçoamento dos métodos de controle. As estirpes emergiram do estudo caso-controle, onde as tipagens moleculares por RFLP mostraram a existência de quatro famílias de M. avium (PIG-A, B, C e D). Um estirpe representante de cada família foi inoculada pela via intra-peritoneal em 48 hamsters com uma dose de 30.000 U.F.C. por animal. Após 2, 13, 26 e 40 dias da inoculação, 12 hamsters inoculados de cada família foram anestesiados, sacrificados e os agentes foram quantificados no fígado, baço e pulmão. A presença das estirpes foi verificada no sangue e também foram realizados exames histológicos. As estipers PIG-A, B, C e D desenvolveram lesões granulomatosas no fígado e baço nos quatro tempos experimentais; disseminaram-se pela via linfo-hemática, multiplicando-se em fígado, baço e pulmão. Nos quatro tempos experimentais houve diferença entre as contagens de U.F.C./g entre os órgãos (T1: p<0,001; T2: p<0,001; T3: p<0,001 e T4: p<0,001) e as obtidas do baço foram sempre superiores às do fígado e pulmão. Nos quatro tempos experimentais houve diferença entre as contagens de U.F.C./g entre as estirpes (T1: p<0,001; T2: <0,001; T3: p<0,001 e T4: p<0,001) e foi possível construir a seguinte escala decrescente de virulência: PIG-B > PIG-A > PIG-D > PIG-C.
Given that the existence of molecularly different families of M. avium circulating in swine of the south area of Brazil has been proved, and that some doubts remain regarding the importance of the horizontal transmission as mechanism of maintenance of the disease, this work aimed to study the virulence of those strains, an important information for the improvement of the control methods. The strains emerged from a case-control study, when the RFLP molecular typification showed the existence of four families of M. avium (PIG-A, B, C and D). A strain representative of each family was inoculated by intra-peritoneal route in 48 hamsters with a dose of 30.000 C.F.U./animal. After 2, 13, 26 and 40 days post-infection, 12 inoculated hamsters of each family were anesthetized, euthanized and the bacteria were quantified in the liver, spleen and lung. The presence of the strains was verified in the blood and also histological exams were accomplished. The strains PIG-A, B, C and D developed granulomatous lesions in the liver and spleen in the four experimental times; they were disseminated by the linfo-haematic route, multiplying in liver, spleen and lung. In the four experimental times there was difference among the countings of C.F.U./g among the organs (T1: p<0,001; T2: p<0,001; T3: p<0,001 and T4: p<0,001) and that obtained of the spleen were always superiors to the one of the liver and lung. In the four experimental times there was difference among the countings of C.F.U./g among the ancestries (T1: p<0,001; T2: p<0,001; T3: p<0,001 and T4: p<0,001) and was possible to build the following order of decreasing virulence: PIG-B > PIG-A > PIG-D > PIG-C.

Chez les patients traités par un régime posologique, La concentration sérique moyenne et l'écart type de la concentration SMX était 161,01 ± 69,154 mg/L et de 5,788 ± 2,74 mg/L pour le TMP. La concentration minimale inhibitrice 90% (CMI 90) était de 10 mg/L pour le cotrimoxazole et la sulfadiazine contre Mycobacterium tuberculosis. Toutes les mycobactéries étaient inhibées par 20 mg/L de cotrimoxazole et de sulfadiazine. Les CMI de l'ivermectine contre 13 souches complexe M. tuberculosis ont varié entre 10 et 40 mg/L. En outre, tous isoler M. tuberculosis étaient résistants à la squalamine avec CMI > 100 mg/L. Dans une autre partie nous avons montré que tous les isolats du complexe Mycobacterium avium étaient résistants au triméthoprime avec une CMI > 200 mg/mL. Le cotrimoxazole, le sulfaméthoxazole et la sulfadiazine ont montré une CMI respectivement de 10 mg/L, 25 mg/L et 20 mg/L, à l'exception de Mycobacterium chimaera qui présentait une CMI de 10 mg/L pour ces molécules. La comparaison de la séquence du gène de la dihydroptéroate synthase de M. intracellulare et M. chimaera a montré seulement quatre changements d'acides aminés
Firstly, we measured the serum concentration of Sulfamethoxazole (SMX)-Trimethoprim (TMP) in patients treated with high dosage regimen. The mean values and standard deviation for SMX concentration was 161.01± 69.154 mg/L and of 5.788 ± 2.74 mg/L for TMP. Susceptibility testing yielded a minimum inhibitory concentration 90% (MIC90) of 10 mg/L for cotrimoxazole and sulfadiazine. All M. tuberculosis complex mycobacteria (MTC) were inhibited by 20 mg/L cotrimoxazole and sulfadiazine. Also, the MICs of ivermectin varied between 10 and 40 mg/L, against 13 MTC mycobacteria. Moreover, all M. tuberculosis isolate were resistant to squalamine with MIC > 100 mg/L. Also, all Mycobacterium avium complex (MAC) isolates were resistant to trimethoprim with MIC > 200 mg/L. Cotrimoxazole, sulfamethoxazole and sulfadiazine exhibited MIC of 10 mg/L, 25 mg/L and 20 mg/L, respectively against all tested MAC isolates except for Mycobacterium chimaera which exhibited MICs of 10 mg/L for these molecules. Comparing the DHPS gene sequence in M. intracellulare and M. chimaera type strains and clinical isolates yielded only four amino acid changes

Les amibes libres sont des eucaryotes unicellulaires qui hébergent des mycobactéries environnementales. Cette association permet aux mycobactéries de résister aux conditions défavorables après sélection de stratégies de contournement de la phagocytose au profit des mycobactéries qui utilise les amibes comme “cheval de Troie”. Nous avons montré que 26 espèces de mycobactéries étaient capables de survivre dans les trophozoïtes et dans les kystes d’Acanthamoeba polyphaga. Nous avons ensuite sélectionné les mycobactéries du complexe Mycobacterium avium (MAC) comme prototypes des interactions avec les amibes. Dans un premier travail, nous avons identifié les espèces du MAC par une approche polyphasique basée sur le séquençage partiel du gène rpoB. Cette séquence permet de différentier les espèces et les sous espèces du MAC avec une divergence de 0. 7-5. 1% au sein des souches de références. Parmi les 100 isolats cliniques étudiés, ce cut-off a permis d’identifier 83% de M. Avium, 2% de M. Chimaera, 8% de M. Intracellulare et 7 souches atypiques. Nous avons ensuite montré que 5/7 des souches atypiques étaient représentatives de trois nouvelles espèces que nous avons nommées : M. Marseillense, M. Bouchedurhonense et M. Timonense. Ce travail a été appliqué à la description d’adénopathie à M. Colombiense. Nous avons enfin étudié les interactions des 8 espèces du MAC avec A. Polyphaga et nous avons montré qu’elles étaient toutes capable de se multiplier et de survivre dans les trophozoïtes et les kystes d’A. Polyphaga. En conclusion le séquençage du gène rpoB constitue un outil moléculaire performant pour la détection de nouvelles espèces dans le MAC et l’étude de leurs interactions avec les amibes.

A mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP), é uma subespécie do complexo M. avium, que provoca a doença de Johne, uma enterite crónica em ruminantes e suspeita-se estar envolvida no desenvolvimento doença inflamatória intestinal crónica em humanos particularmente, na doença de Crohn. Devido a complexidade desta micobactéria é, importante o desenvolvimento de novas técnicas poderosas para a sua deteção e identificação, de maneira a obterem-se respostas mais concretas na associação desta subespécie de micobactéria a doença de Crohn. Neste trabalho através de uma revisão bibliográfica, descreve, primeiramente num contexto geral, a taxonomia e características gerais das micobactérias, focalizando-se numa abordagem sobre MAP, a sua capacidade de causar doença inflamatória intestinal, o diagnóstico e tratamento desta doença, e a importância que esta subespécie pode ter no desenvolvimento da doença de Crohn em particular. A obtenção de cura total dos doentes com CD seria um notável desenvolvimento no mundo da medicina. Para isso é necessária a prossecução dos estudos e a obtenção de conclusões mais objetivas.
The mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP), is a subspecies of the M. avium complex, which causes Johne's disease, a chronic ruminant enteritis and is suspected to be involved in the development of chronic inflammatory bowel disease in humans, particularly Crohn's disease. Due to the complexity of this mycobacterium, its important to develop powerful new techniques for its detection and identification in order to obtain more concrete responses in the association of this mycobacterial subspecies with Crohn's disease. In this paper, through a literature review, it describes, firstly in a general context, the taxonomy and general characteristics of mycobacteria, focusing on an approach to MAP, its ability to cause inflammatory bowel disease, the diagnosis and treatment of this disease, and the importance that this subspecies may have in the development of Crohn's disease in particular. Achieving total cure for CD patients would be a remarkable development in the medical world. This requires further studies and more objective conclusions.

Tese de mestrado, Microbiologia Aplicada, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2019
Nos últimos anos tem-se verificado um aumento do número de casos de doença devido a infeção por micobactérias não-tuberculosas (MNT). Enquanto microrganismos patogénicos oportunistas apresentam uma grande variedade de hospedeiros, podendo infetar seres humanos e outros animais, sendo a sua presença ubíqua em diversas fontes ambientais como o solo, a água, entre outros. No caso do Homem, os indivíduos imunocomprometidos são os mais suscetíveis a infeções por MNT não havendo evidências de transmissão entre indivíduos. Do ponto de vista clínico, estas infeções manifestam-se sobretudo na forma de infeção respiratória podendo também ocorrer infeção em outros órgãos e, sobretudo em indivíduos imunocomprometidos, ocorrer infeção disseminada. O complexo Mycobacterium avium (MAC) é o principal complexo de micobactérias não-tuberculosas, sendo Mycobacterium avium e Mycobacterium intracellulare as principais espécies deste complexo. A espécie M. avium é ainda dividida nas subespécies M. avium subsp. silvaticum, M. avium subsp. hominissuis, M. avium subsp. avium e M. avium subsp. paratuberculosis. A comparação e diferenciação de isolados clínicos de M. avium e de M. intracellulare nem sempre é fácil quer devido à sua proximidade filogenética, quer devido à baixa taxa de crescimento dos isolados destas espécies. Assim, para este fim, recorre-se frequentemente a alguns métodos genéticos, baseados sobretudo na técnica do PCR, e a algumas técnicas fenotípicas das quais se destacam os testes de suscetibilidade a diversos antibióticos. No presente trabalho procurou-se caraterizar a estrutura populacional e os níveis de resistência de um conjunto de isolados clínicos de microrganismos pertencentes ao MAC em Portugal, nomeadamente M. avium e M. intracellulare. Para essa finalidade, começou-se por realizar a identificação de 24 isolados clínicos de M. intracellulare e identificar, ao nível da subespécie, os 22 isolados clínicos de M. avium obtidos de diversos laboratórios e hospitais na região de Lisboa. Procurou-se inicialmente identificar cada um destes isolados através da amplificação de vários loci dentro dos quais se destacam as sequências de inserção IS900, IS901, IS1245 e IS1311. Foram obtidos cinco perfis de amplificação incompatíveis com as espécies aqui estudas sendo que, cinco isolados clínicos de M. intracellulare e dois isolados clínicos de M. avium não poderam ser identificados com recurso a este método, havendo a suspeita que entre os isolados clínicos de M. intracellulare poderia haver isolados pertencentes à espécie M. chimaera, uma vez que esta espécie aparece, devido às limitações do teste GenoType, frequentemente mal identificada como M. intracellulare. Assim, com o objetivo de discriminar entre M. intracellulare e M. chimaera em isolados inicialmente identificados como M. intracellulare por recurso ao teste GenoType, procurou-se de seguida discriminar e avaliar a prevalência de M. chimaera na amostra estudada através da amplificação do gene SR1 (específico de M. chimaera). Verificou-se amplificação deste gene em nove dos 24 isolados inicialmente identificados como M. intracellulare, sugerindo assim que estes isolados devem pertencer na verdade à espécie M. chimaera. Contudo, nenhum destes nove isolados correspondeu aos cinco isolados com os perfis de amplificação das sequências de inserção incompatíveis com a espécie pelo que, seguidamente, se procedeu à amplificação, purificação e sequenciação do locus ITS e do gene hsp65 (este apenas para um grupo menor de isolados). Neste teste foram incluídos todos os 24 isolados de M. intracellulare, três isolados de M. avium e as estirpes de referência M. avium ATCC25291 e 104. A combinação destes métodos apenas não permitiu identificar ao nível da subespécie dois isolados de M. avium tendo ainda sido possível confirmar a identificação de 11 isolados de M. intracellulare. Foi ainda possível verificar que entre os isolados inicialmente identificados como M. intracellulare, nove pertencem à espécie M. chimaera, dois pertencem à espécie M. colombiense e um pertence à espécie M. marseillense. Assim, de todos os isolados clínicos estudados no presente trabalho apenas um apresentou identificação inconclusiva, uma vez que os resultados obtidos para este isolado nos diferentes métodos testados foram inconsistentes. Posteriormente, procurou-se comparar e diferenciar os isolados clínicos através de métodos genotípicos e/ou fenotípicos. A tipagem fenotípica de todos os isolados de M. avium (incluindo as duas estirpes de referência de M. avium) e M. intracellulare foi feita através de testes de suscetibilidade a diversos antibióticos, nomeadamente: claritromicina, etambutol, moxifloxacina, rifampicina, rifabutina e amicacina. Os resultados obtidos foram bastante semelhantes aos obtidos na literatura, tendo a claritromicina e amicacina sido os antibióticos a apresentar a menor percentagem de isolados resistentes e a maior percentagem de isolados sensíveis (70,83 % e 85,42 %, respetivamente). Em contra partida, o etambutol e a rifabutina foram os antibióticos com a maior percentagem de isolados resistentes (70,83 %) tendo a percentagem de isolados sensíveis sido de 4,17 % e 22,92 %, respetivamente. Verificou-se ainda que para a claritromicina, rifabutina e etambutol a maioria dos isolados possui uma CMI acima do pico sérico máximo no ser humano o que sugere, que em caso de infeção no Homem, estes isolados podem permanecer ativos uma vez que o antibiótico não atinge níveis séricos inibitórios. A comparação genotípica foi feita apenas para isolados clínicos de M. avium recorrendo-se à tipagem por MIRU-VNTR e MATR-VNTR. Além da comparação dos isolados, pretendia-se também verificar se os métodos de tipagem genotípica referidos possuem um poder discriminatório suficiente para comparar e diferenciar isolados. A análise de sequências MIRU-VNTR permitiu observar a existência de 15 perfis MIRU-VNTR distintos. Obteve-se um total 11 isolados distribuídos em três clusters tendo os restantes isolados apresentado um perfil único. A tipagem por MATR-VNTR apresentou um poder discriminatório superior uma vez que se verificou a existência de 18 perfis distintos e a distribuição de nove isolados por quatro clusters. A combinação dos dois métodos possibilitou obter o maior poder discriminatório possível, com recurso a estas sequências VNTR, sendo que apenas dois isolados permaneceram em cluster tendo os restantes apresentado perfis únicos. Os resultados obtidos mostraram que tanto a tipagem por MIRU-VNTR como a tipagem por MATR-VNTR possuem um poder discriminatório suficiente para diferenciar a maioria dos isolados, tendo-se obtido o maior poder discriminatório quando os dois métodos foram combinados. Verifica-se então, que amostra de estudo é bastante diversa e possui uma baixa clonalidade uma vez que só dois isolados permaneceram em cluster. A diversidade da amostra ocorreu tanto a nível genotípico como a nível fenotípico tornando assim difícil perceber de que forma estes isolados se encontram relacionados.
In recent years there has been an increase in the number of cases of disease of nontuberculous mycobacterial infection (NTM). These mycobacteria are opportunistic pathogenic microorganisms that have a wide variety of hosts, being able to infect humans and animals. They can be found in the most various environments, such as, soil and water. In the case of humans, immunocompromised individuals are the most susceptible to MNT infections, despite not existing any evidence of person-to-person transmission. From the clinical point of view, those infections are mainly manifested at the respiratory level, and may also infect other organs, and in some cases, especially in immunocompromised individuals, disseminated infection may occur. The Mycobacterium avium complex (MAC) is the main nontuberculous mycobacterial complex, being Mycobacterium avium and Mycobacterium intracellulare the main species of this complex. The species M. avium is further divided into subspecies M. avium subsp. silvaticum, M. avium subsp. hominissuis, M. avium subsp. avium and M. avium subsp. paratuberculosis. Comparison and differentiation of clinical isolates of M. avium and M. intracellulare is not easy either because of their phylogenetic proximity or the low growth rate of isolates. Thus, for this purpose, some genotypic methods, mainly based on PCR, are frequently used, as well as some phenotypic techniques, such as susceptibility tests to various antibiotics. The present work aimed to characterize the population structure and resistance levels of a set of clinical isolates of microorganisms belonging to MAC in Portugal, namely M. avium and M. intracellulare. To this end, we began to identify 24 clinical isolates of M. intracellulare and to identify, at subspecies level, the 22 clinical isolates of M. avium obtained from various laboratories and hospitals in the Lisbon region. Initially, we sought to identify each of these isolates by amplifying several loci within which the IS900, IS901, IS1245 and IS1311 insertion sequences stand out. Five amplification profiles incompatible with the species studied were obtained. Five clinical isolates of M. intracellulare and two clinical isolates of M. avium could not be identified using this method, and it is suspected that among the clinical isolates of M. intracellulare there could be isolates belonging to the species M. chimaera, as this species appears, due to the limitations of the GenoType test, often misidentified as M. intracellulare. Thus, in order to discriminate between M. intracellulare and M. chimaera in isolates initially identified as M. intracellulare by the GenoType test, we then sought to discriminate and evaluate the prevalence of M. chimaera in the sample studied by amplifying the SR1 gene (M. chimaera specific). This gene was amplified in nine of the 24 isolates initially identified as M. intracellulare, thus suggesting that these isolates should in fact belong to the M. chimaera species. However, none of these nine isolates matched the five isolates with species-incompatible insertion sequence amplification profiles, so the amplification, purification and sequencing of the ITS locus and the hsp65 gene (this one only for a smaller group) were performed. All 24 isolates of M. intracellulare, three isolates of M. avium and the reference strains M. avium ATCC25291 and 104 were included in this test. The combination of these methods alone did not allow the identification of two isolates of M. avium at subspecies level. It was still possible to confirm the identification of 11 isolates of M. intracellulare. It was also possible to verify that among the isolates identified as M. intracellulare, nine belong to the species M. chimaera, two belong to the species M. colombiense and one belongs to the species M. marseillense. Thus, of all the clinical isolates studied in the present work, only one presented inconclusive identification, since the results obtained for this isolate in the different tested methods were inconsistent. Subsequently, we sought to compare and differentiate clinical isolates by genotypic and / or phenotypic methods. Phenotypic typing of all M. avium isolates (including the two reference strains of M. avium) and M. intracellulare was performed by testing the susceptibility to various antibiotics, namely: clarithromycin, ethambutol, moxifloxacin, rifampicin, rifabutin and amikacin. The results obtained were very similar to those obtained in the literature, having clarithromycin and amikacin been the antibiotics with the lowest percentage of resistant isolates and the highest percentage of sensitive isolates (70.83% and 85.42%, respectively). In contrast, ethambutol and rifabutin were the antibiotics with the highest percentage of resistant isolates (70.83%) with the percentage of sensitive isolates being 4.17% and 22.92%, respectively. It was also found that for clarithromycin, rifabutin and ethambutol most isolates have a MIC above Cmax suggesting that in case of infection in humans, these isolates may remain active as the antibiotic does not reach inhibitory serum levels. Genotypic comparison was performed only for clinical isolates of M. avium using MIRU-VNTR and MATR-VNTR typing. In addition to the comparison of isolates, we also intended to verify whether the referred genotyping methods have sufficient discriminatory power to compare and differentiate isolates. MIRU-VNTR sequence analysis showed 15 distinct MIRU-VNTR profiles. A total of 11 isolates were distributed in three clusters and the remaining isolates presented a unique profile. MATR-VNTR typing had a higher discriminatory power as there were 18 distinct profiles and the distribution of nine isolates by four clusters. The combination of the two methods made it possible to obtain the highest discriminatory power possible, using these VNTR sequences, and only two isolates remained clustered while the others presented unique profiles. The results showed that both MIRU-VNTR typing and MATR-VNTR typing have sufficient discriminatory power to differentiate most isolates, and the highest discriminatory power was obtained when the two methods were combined. Thus, it is verified that the study sample is quite diverse and has a low clonality since only two isolates remained in cluster. The diversity of the sample occurred at both genotypic and phenotypic levels, making it difficult to understand how these isolates are related.

Trabalho Final do Curso de Mestrado Integrado em Medicina, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, 2015
In the first years after de discovery of HIV and AIDS, the infection turned out to be one of the major causes of death worldwide. Nowadays, due to the widespread use of cART, the infection has become a chronic and manageable disease. Nevertheless, as cART is not yet fully available to every HIV positive patient, one must be able to recognize and treat patients in advanced states of the disease. Gastrointestinal symptoms, such as anorexia, dysphagia, diarrhea or abdominal pain are common in patients with AIDS and most of them have an infectious cause, due to their immunosuppressed state. However, as they are at a higher risk to acquiring infectious diseases, and because these symptoms do rarely point to a specific etiology, the diagnosis is challenging. Further, HIV by itself, causes damage to gastrointestinal mucosa, worsening and enhancing any eventual secondary envolvment. Mycobacterium avium complex (MAC) may cause pulmonary or gastrointestinal infection in patients with AIDS, and it is included as an AIDS defining illness. The literature on this behalf revealed a distinct pathological pattern for disseminated MAC; that it may exacerbate HIV entheropathy and eventually worsening the malabsorption syndrome in a disseminated/terminal stage of HIV infection, predicting an ominous prognosis, even in the presence of effective therapy.
Nos primeiros anos após a descoberta de VIH/sida, esta entidade tornou-se numa das maiores causas de óbito a nível mundial. Hoje em dia, devido ao uso generalizado da TARc, a infecção tornou-se uma doença crónica e controlável. Não obstante, esta ainda não está totalmente disponível para todos os doentes VIH positivos, pelo que devemos ser capazes de reconhecer e tratar doentes em estados avançados da doença. A sintomatologia gastrointestinal, tal como a anorexia, disfagia, diarreia, dor abdominal são comuns em doentes com VIH/sida. A maior parte destes sintomas tem uma causa infecciosa, devido ao seu estado de imunossupressão inerente à infecção. A multiplicidade de possíveis causas para estes sintomas, bem como a inespecificidade dos mesmos, tornam o diagnóstico um desafio. Entretanto, VIH, por si só também é lesivo para a mucosa gastrointestinal, mesmo sem qualquer outra infecção comprovada, eventualmente agravando infecções oportunistas localmente. Mycobacterium avium complex (MAC) pode causar infecção pulmonar ou gastrointestinal em doentes com SIDA, e está incluído nas doenças definidoras de SIDA. A fim de apurar o verdadeiro potencial patológico e gastroenterológico da MAC disseminada em doentes com SIDA, revi a literatura sobre a entidade, o tendo apurado o padrão patológico da MAC; disseminada, o qual pode exacerbar a enteropatia induzida por VIH e, eventualmente, agravar a síndrome de má absorção numa fase disseminada /terminal da infecção pelo VIH, a predizendo de um prognóstico desfavorável, mesmo na presença de terapia eficaz.

Tese de Doutoramento em Ciências Veterinárias
As micobacterioses causam sérias preocupações na produção animal e na vida selvagem, em todo o mundo. As infeções micobacterianas têm sido descritas em centenas de espécies de animais selvagens podendo afetar todos os animais vertebrados. Como estas infeções são de carácter crónico, a melhor estratégia de controlo passa pela identificação precoce dos animais infetados, melhorando a metodologia de diagnóstico e tornando efetivos os programas de controlo. Com o desenvolvimento das técnicas de biologia molecular aplicadas à microbiologia, o conhecimento da ecologia das micobactérias avançou rapidamente em todas as áreas. Na medicina humana a reação em cadeia de polimerase (PCR) é aceite como técnica de diagnóstico, substituindo ou complementando o isolamento bacteriano e o método de Ziehl-Neelsen. As espécies do género Mycobacterium responsáveis pela tuberculose nos humanos e outros animais são incluídas no complexo Mycobacterium tuberculosis. As espécies do complexo Mycobacterium avium causam uma variedade de patologias, incluindo lesões típicas de tuberculose em humanos e aves, infeções disseminadas em pacientes imunodeprimidos, linfadenites em humanos e outros mamíferos e paratuberculose em ruminantes. O objetivo do presente trabalho é compreender melhor o papel dos mamíferos selvagens na epidemiologia das micobacterioses zoonóticas e não zoonóticas na vida selvagem, em Portugal. A presente tese está estruturada em cinco capítulos. O capítulo I consiste na revisão geral sobre a classificação e biologia, epidemiologia, sinais clínicos, patologia, técnicas de diagnóstico, e preocupações de saúde pública das micobactérias dos complexos Mycobacterium tuberculosis e Mycobacterium avium, em mamíferos selvagens. O capítulo II é dedicado ao complexo Mycobacterium tuberculosis (MTC). Este capítulo está dividido em três estudos: O Capítulo II.1 descreve um estudo alargado sobre a presença de Mycobacterium bovis na população selvagem em Portugal. Neste trabalho foi estudada uma população de 2116 mamíferos selvagens e a prevalência encontrada por espécie foi: 26.9% na raposa vermelha (Vulpes vulpes), 20.0% no Saca-rabos (Herpestes ichneumon), 21.4% no javali (Sus scrofa) e 38.3% no veado europeu (Cervus elaphus). Os resultados deste estudo confirmam a presença de Mycobacterium bovis em carnívoros selvagens, em Portugal. No capítulo II.2 foi confirmada a infeção disseminada por Mycobacterium bovis em raposas vermelhas em Portugal, demonstrando-se pela primeira vez a ocorrência de infeção natural no cérebro destes animais. No capítulo II.3 foi demonstrado, pela primeira vez, a infeção por Mycobacterium bovis em saca-rabos. O capítulo III é dedicado ao complexo Mycobacterium avium (MAC). Este capítulo está dividido em sete estudos: No capítulo III.1 pesquisou-se a presença de anticorpos contra as espécies do complexo Mycobacterium avium em mamíferos selvagens mortos por atropelamento, encontrados mortos ou resultantes da atividade cinegética. A seroprevalência resultante foi de 4.7% e os anticorpos contra MAC foram detetados em raposa vermelha, lontra europeia (Lutra lutra), texugo europeu (Meles meles) e javali. No capítulo III.2 foi desenvolvido um estudo para determinar a ocorrência de MAP em carnívoros selvagens em Portugal, utilizando amostras de 74 animais mortos por atropelamento. A ocorrência de animais infetados foi de 27% (n=20). MAP foi isolado na raposa vermelha, na fuinha (Martes foina), na lontra europeia, no saca-rabos, e no texugo europeu. Nos Capítulos III.3 e III.4 foi demonstrada, pela primeira vez em Portugal, a presença de Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) na Lontra europeia. A presença de MAP foi confirmada por cultura bacteriológica e detetada por biologia molecular em múltiplos órgãos. Os capítulos III.5 e III.6 fazem parte de uma série de estudos que pretendem determinar a prevalência da paratuberculose em veados. Com este propósito, foram realizadas necropsias a 877 veados e foram feitas colheitas de vários órgãos para posterior pesquisa de MAP utilizando técnicas de biologia molecular, microbiologia e histopatologia. MAP foi detetado por PCR IS900 em 81.1% das amostras de rim de veado positivas no esfregaço de Ziehl-Neelsen. No Capítulo II.7 pesquisou-se a presença de MAP em 589 javalis e 45 animais foram classificados de infetados por cultura bacteriológica e/ou PCR. De acordo com os nossos resultados, 37.9% dos animais infetados foram aprovados para consumo humano. O Capítulo IV aborda os estudos sobre lesões granulomatosas. Este capítulo está dividido em quatro estudos: nos Capítulos IV.1 e IV.2 foi avaliada a resposta inflamatória crónica nos gânglios mesentéricos de javalis com linfadenite granulomatosa. Os parâmetros morfológicos das lesões foram registados e foi avaliada a expressão dos anticorpos anti-CD3 e anti-CD79α. Os granulomas observados encontram-se principalmente no estadio III e IV e as percentagens e padrões de distribuição de anti-CD3 e anti-CD79α são semelhantes em lesões onde MAP e MTC estão presentes. No Capítulo IV.3 encontra-se descrito, pela primeira vez, a coinfecção por Corynebacterium pseudotuberculosis, Mycobacterium bovis, e MAP confirmada por biologia molecular em veados. No Capítulo IV.4 foram analisados gânglios linfáticos de javalis com linfadenite granulomatosa, mas com resultados negativos na cultura micobacteriana e PCR. Amostras de tecidos foram analisados por PCR e cultura bacteriana para deteção de Nocardia spp. e duas amostras foram positivas para Nocardia spp. em PCR. Este é o primeiro caso documentado de nocardiose em javalis. Estes resultados realçam a necessidade do diagnóstico diferencial das lesões granulomatosas em animais selvagens. O capítulo final (Capítulo V- Conclusões) inclui uma conclusão global da nossa investigação enfatizando os aspetos mais relevantes e significativos. Concluindo, os estudos apresentados neste trabalho pretendem fornecer uma visão mais aprofundada das micobacterioses em mamíferos selvagens.
Mycobacterial species are raising serious concerns in livestock and wild animals worldwide. In wildlife, mycobacterial infection has been reported in hundreds of species and likely has the potential to occur in every vertebrate. Since this infection is of a chronic nature the best strategy to control the infection is through early identification of infected animals, and better diagnostic measures are required for effective control programs. With the development of new molecular methods for detecting and characterizing microorganisms, the ecology of mycobacteria has rapidly advanced in all areas. In human medicine, polymerase chain reaction (PCR) assays are accepted diagnostic standards, replacing or complementing culture isolation and acid-fast staining. The mycobacterial species that produce tuberculosis in humans and animals are included in the Mycobacterium tuberculosis complex (MTC). Mycobacteria from the Mycobacterium avium complex (MAC) cause a variety of diseases including tuberculosis-like disease in humans and birds, disseminated infections in immunocompromised patients, lymphadenitis in humans and mammals and paratuberculosis in ruminants. The aim of the present work was to gain a better understanding of the role of free-living mammalian species in the epidemiology of wildlife mycobacteriosis in Portugal. The present work is structured in five chapters. Chapter I presents a general review of the classification and biology, epidemiology, clinical signs, pathology, diagnostic techniques, and public health concerns of Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium avium complexes in wild mammals. Chapter II focuses on the MTC. This chapter is divided into three studies: Chapter II.1 contains large population surveys of Mycobacterium bovis in Portugal by testing samples from hunted animals and specimens which were found already dead. In this study we investigated 2,116 wild mammals and prevalence by species was: 26.9% in red fox, 20.0% in Egyptian mongoose, 21.4% in wild boar (Sus scrofa) and 38.3% in red deer (Cervus elaphus). These results confirm the presence of Mycobacterium bovis infection in wild carnivores in Portugal. Chapter II.2 confirms the presence of disseminated Mycobacterium bovis in red foxes and it is the first report in the world on natural infection in the brains of these animals. Also for the first time, Chapter II.3 demonstrates Mycobacterium bovis infection in Egyptian mongoose. Chapter III is dedicated to the MAC, and is divided into seven studies: Chapter III.1 analyses the presence of antibodies against MAC in wild mammals killed on roads and by hunters, or found dead in east-central Portugal. The seroprevalence obtained was 4.7% and antibodies against MAC were detected in red fox, Eurasian otter (Lutra lutra), European badger (Meles meles), and wild boar. In Chapter III.2 a survey is conducted to determine the occurrence of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) in wild carnivores in Portugal by testing samples from 74 road-killed animals. The occurrence of infected animals was 27% (n=20). MAP was isolated in red fox, beech marten (Martes foina), Eurasian otter, Egyptian mongoose and European badger. In Chapter III.3 and III.4 the infection of Eurasian otters with MAP in Portugal is demonstrated for the first time. The presence of MAP was confirmed by isolation in bacteriological culture and detected by molecular methods in multiple organs. Chapter III.5 and III.6 are part of a wider set of studies designed to assess the prevalence of paratuberculosis in free ranging red deer. For that purpose, 877 free-ranging red deer were submitted to necropsy and sampled through molecular methods, microbiology and histopathology. MAP was detected by IS900 PCR in 81.1% of the Ziehl-Neelsen positive kidneys. Chapter III.7 analyses 589 free-ranging wild boar for the presence of MAP and 45 animals were classified as infected, indicated by positivity in the culture and/or in PCR. According to our results, 37.9% of the infected animals were approved for human consumption. Chapter IV focuses on granulomatous lesions. This chapter is divided into four studies: Chapters IV.1 and IV.2 were conducted to evaluate the chronic inflammatory response in the mesenteric lymph nodes of wild boar with granulomatous lymphadenitis. Morphological parameters of the lesions were recorded, and the expression of anti-CD3 and anti-CD79α antibodies was evaluated. The granulomatous lesions consisted mainly in stage III and stage IV granulomas and similar percentages and distribution patterns of CD3 and CD79 occurred in lesions where MAP and MTC were present. In Chapter IV.3 a coinfection of Corynebacterium pseudotuberculosis, M. bovis, and MAP confirmed by molecular methods in red deer is described for the first time. Chapter IV.4 is dedicated to the analysis of wild boar lymph nodes with granulomatous lymphadenitis, but negative to mycobacteria in culture and PCR. Tissues samples were tested by PCR and culture for detection of Nocardia spp. and two samples had positive results for Nocardia spp. in PCR. This is the first documented case of nocardiosis in wild boar. These results emphasize the need for the differential diagnosis of the lymph nodes granulomatous lesions in wild animals. The final Chapter (Chapter V – Concluding remarks) is a comprehensive conclusion of our investigation, emphasizing the most relevant and significant findings. The studies presented in the present work provide further insights into the mycobacterial infections in wildlife mammals.
Foundation for Science and Technology (FCT, Portugal).