Dissertations / Theses: 'Mieloproliferative'

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Vener, C. "Caratteristiche morfologiche delle sindromi mieloproliferative croniche valutate su biopsie oesteomidollari." Doctoral thesis, Università degli Studi di Milano, 2009. http://hdl.handle.net/2434/54065.

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Baldazzi, Carmen <1980&gt. "Caratterizzazione Citogenetico-Molecolare delle alterazioni cromosomiche 3q26 e 1p36 nelle Sindromi Mieloproliferative." Doctoral thesis, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna, 2013. http://amsdottorato.unibo.it/5691/1/baldazzi_carmen_tesi.pdf.

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Abstract:

L’overespressione dei geni EVI1(3q26) e PRDM16(1p36), è descritta sia in presenza che in assenza di riarrangiamenti 3q26 e 1p36 in specifici sottogruppi citogenetici di LAM, ed è associata ad una prognosi sfavorevole. Lo scopo principale del nostro studio è stato identificare e caratterizzare tramite FISH e RQ-PCR, alterazioni di EVI1 e PRDM16 in pazienti con alterazioni cromosomiche 3q e 1p.Riarrangiamenti di EVI1 si associavano ad alterazioni cromosomiche 3q26, ma, in 6 casi (6/35;17,1%) erano presenti in assenza di coinvolgimenti, in citogenetica convenzionale, della regione 3q26, a causa di meccanismi complessi e/o alterazioni ‘criptiche’. Inoltre, abbiamo identificato quattro nuovi riarrangiamenti di EVI1, tra cui due nuove traslocazioni simili presenti in due fratelli. Riarrangiamenti e/o amplificazioni di PRDM16 erano spesso associate ad alterazioni 1p36 (7/14;50%). L’analisi di EVI1 e PRDM16 è stata estesa ad altri casi con alterazioni -7/7q-, con cariotipo normale, con alterazioni 3q per PRDM16 e con alterazioni 1p per EVI1. L’overespressione di EVI1 era presente solo nel gruppo -7/7q- (10/58;17.2%) ed in un caso si associava ad amplificazione genica, mentre PRDM16 era overespresso in casi di tutti i gruppi analizzati,sia con cariotipi complessi, dove si associava in alcuni casi ad amplificazione genica, sia con cariotipi normali o con singole alterazioni. Il nostro studio dimostra come la FISH permetta di identificare alterazioni dei geni EVI1 e PRDM16, anche in assenza di coinvolgimenti delle regioni 3q26 e 1p36. Riarrangiamenti complessi e/o una scarsa qualità dei preparati citogenetici sono le cause principali per la mancata identificazione di queste alterazioni. La RQ-PCR permette di identificare l’overespressione anche nei casi in cui non sia dovuta ad alterazioni citogenetiche. È importante confermare con FISH e/o RQ-PCR il coinvolgimento di questi due geni, per individuare alla diagnosi pazienti con prognosi sfavorevole e che potranno beneficiare di terapie maggiormente aggressive e/o di trapianto allogenico di cellule staminali.
EVI1 and PRDM16 overexpression has been associated with poor prognosis in myeloid malignancies. The main mechanism is the rearrangement of chromosome bands 3q26 and 1p36, where they are mapped, respectively. Overexpression has also been reported in specific cytogenetic subgroups, without 3q26 and 1p36 abnormalities observable by chromosome banding analysis (CBA). The main aim of this study has been to identify and characterize EVI1 and PRDM16 rearrangements in cases with 3q and 1p cytogenetic abnormalities. EVI1 rearrangements were mainly associated with 3q26 cytogenetic abnormalities, but they have also been demonstrated in 6 cases (6/35;17,1%) without 3q26 cytogenetic involvement, because of complex mechanism and/or ‘cryptic‘ abnormalities. We have also identified new EVI1 rearrangements. Interestingly, two new similar translocations appeared in two brothers. Rearrangements, but also amplifications of PRDM16 resulting in gene overexpression, have often been associated with 1p36 aberrations. EVI1 and PRDM16 analyses have been performed in others cytogenetics subgroups, such as: -7/7q-, normal karyotype, and 3q abnormalities for PRDM16 and 1p for EVI1. EVI1 overexpression was frequent only in -7/7q- group (17.2%;10/58), and in one case was associated with amplification, not seen by CBA, because of metaphases’ poor quality. On the contrary, PRDM16 overexpression has been found in all cytogenetic subgroups, that we have considered. In some cases with complex karyotype, PRDM16 overexpression has been associated with gene amplification. FISH analysis and RQ-PCR have allowed us to identify EVI1 and PRDM16 abnormalities in patients with or without 3q26 and 1p36 abnormalities. Complex rearrangements or metaphases’ poor quality were the main reasons for the failed detection of these abnormalities in CBA. These observations indicate the importance of screening for EVI1 and PRDM16 abnormalities, especially in cases with 3q and 1p cytogenetic abnormalities, to identify at diagnosis patients with poor prognosis that could benefit from more aggressive chemotherapy and/or stem cell transplantation.

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Baldazzi, Carmen <1980&gt. "Caratterizzazione Citogenetico-Molecolare delle alterazioni cromosomiche 3q26 e 1p36 nelle Sindromi Mieloproliferative." Doctoral thesis, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna, 2013. http://amsdottorato.unibo.it/5691/.

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Abstract:

L’overespressione dei geni EVI1(3q26) e PRDM16(1p36), è descritta sia in presenza che in assenza di riarrangiamenti 3q26 e 1p36 in specifici sottogruppi citogenetici di LAM, ed è associata ad una prognosi sfavorevole. Lo scopo principale del nostro studio è stato identificare e caratterizzare tramite FISH e RQ-PCR, alterazioni di EVI1 e PRDM16 in pazienti con alterazioni cromosomiche 3q e 1p.Riarrangiamenti di EVI1 si associavano ad alterazioni cromosomiche 3q26, ma, in 6 casi (6/35;17,1%) erano presenti in assenza di coinvolgimenti, in citogenetica convenzionale, della regione 3q26, a causa di meccanismi complessi e/o alterazioni ‘criptiche’. Inoltre, abbiamo identificato quattro nuovi riarrangiamenti di EVI1, tra cui due nuove traslocazioni simili presenti in due fratelli. Riarrangiamenti e/o amplificazioni di PRDM16 erano spesso associate ad alterazioni 1p36 (7/14;50%). L’analisi di EVI1 e PRDM16 è stata estesa ad altri casi con alterazioni -7/7q-, con cariotipo normale, con alterazioni 3q per PRDM16 e con alterazioni 1p per EVI1. L’overespressione di EVI1 era presente solo nel gruppo -7/7q- (10/58;17.2%) ed in un caso si associava ad amplificazione genica, mentre PRDM16 era overespresso in casi di tutti i gruppi analizzati,sia con cariotipi complessi, dove si associava in alcuni casi ad amplificazione genica, sia con cariotipi normali o con singole alterazioni. Il nostro studio dimostra come la FISH permetta di identificare alterazioni dei geni EVI1 e PRDM16, anche in assenza di coinvolgimenti delle regioni 3q26 e 1p36. Riarrangiamenti complessi e/o una scarsa qualità dei preparati citogenetici sono le cause principali per la mancata identificazione di queste alterazioni. La RQ-PCR permette di identificare l’overespressione anche nei casi in cui non sia dovuta ad alterazioni citogenetiche. È importante confermare con FISH e/o RQ-PCR il coinvolgimento di questi due geni, per individuare alla diagnosi pazienti con prognosi sfavorevole e che potranno beneficiare di terapie maggiormente aggressive e/o di trapianto allogenico di cellule staminali.
EVI1 and PRDM16 overexpression has been associated with poor prognosis in myeloid malignancies. The main mechanism is the rearrangement of chromosome bands 3q26 and 1p36, where they are mapped, respectively. Overexpression has also been reported in specific cytogenetic subgroups, without 3q26 and 1p36 abnormalities observable by chromosome banding analysis (CBA). The main aim of this study has been to identify and characterize EVI1 and PRDM16 rearrangements in cases with 3q and 1p cytogenetic abnormalities. EVI1 rearrangements were mainly associated with 3q26 cytogenetic abnormalities, but they have also been demonstrated in 6 cases (6/35;17,1%) without 3q26 cytogenetic involvement, because of complex mechanism and/or ‘cryptic‘ abnormalities. We have also identified new EVI1 rearrangements. Interestingly, two new similar translocations appeared in two brothers. Rearrangements, but also amplifications of PRDM16 resulting in gene overexpression, have often been associated with 1p36 aberrations. EVI1 and PRDM16 analyses have been performed in others cytogenetics subgroups, such as: -7/7q-, normal karyotype, and 3q abnormalities for PRDM16 and 1p for EVI1. EVI1 overexpression was frequent only in -7/7q- group (17.2%;10/58), and in one case was associated with amplification, not seen by CBA, because of metaphases’ poor quality. On the contrary, PRDM16 overexpression has been found in all cytogenetic subgroups, that we have considered. In some cases with complex karyotype, PRDM16 overexpression has been associated with gene amplification. FISH analysis and RQ-PCR have allowed us to identify EVI1 and PRDM16 abnormalities in patients with or without 3q26 and 1p36 abnormalities. Complex rearrangements or metaphases’ poor quality were the main reasons for the failed detection of these abnormalities in CBA. These observations indicate the importance of screening for EVI1 and PRDM16 abnormalities, especially in cases with 3q and 1p cytogenetic abnormalities, to identify at diagnosis patients with poor prognosis that could benefit from more aggressive chemotherapy and/or stem cell transplantation.

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MALLIA, SELENE. "La genomica su singola cellula rivela la gerarchia e l'architettura clonale nelle Neoplasie Mieloproliferative." Doctoral thesis, Università degli studi di Modena e Reggio Emilia, 2022. http://hdl.handle.net/11380/1278821.

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Abstract:

Le Neoplasie Mieloproliferative (MPN) sono disordini ematologici caratterizzati dalla presenza di mutazioni somatiche che colpiscono le cellule staminali ematopoietiche e comprendono la Policitemia Vera, la Trombocitemia Essenziale e la Mielofibrosi Primaria (PMF). La PMF è una neoplasia eterogenea, contraddistinta dalla presenza di fibrosi midollare, iperplasia megacariocitaria e ematopoiesi extramidollare, e mostra la peggiore prognosi tra tutte le MPN. I pazienti spesso non rispondono ai trattamenti e nel 15-20% dei casi sviluppano una Leucemia Mieloide Acuta (LMA). Le mutazioni ricorrenti, conosciute come “mutazioni drivers”, interessano i geni JAK2, CALR e MPL, ma a complicare il profilo mutazionale intervengono altre alterazioni che sono spesso responsabili del peggioramento del quadro clinico e della trasformazione leucemica. La progressione della malattia e l’evoluzione leucemica nella PMF è accompagnata da un aumento della complessità genomica e dell’eterogeneità clonale. Molti studi hanno confermato come l’ordine di acquisizione delle mutazioni influenzi il decorso clinico. Tuttavia sono ancora poco conosciute le caratteristiche dei cloni che determinano la malattia e che guidano la trasformazione leucemica. Studi recenti hanno dimostrato come la genomica su singola cellula sia una tecnica sensibile per studiare l’eterogeneità clonale e l’evoluzione delle leucemie. Per questa ragione, abbiamo adottato un approccio di genomica su singola cellula per risolvere la complessità clonare della PMF. Dapprima abbiamo sviluppato un metodo di isolamento delle cellule staminali e progenitori ematopoietici CD34+ dal sangue cordonale, di fissazione e marcatura del CD34, al fine di ottenere una popolazione cellulare adatta alla separazione in singole cellule, sfruttando il sistema del DEP-array (Menarini Silicon Biosystem). In seguito, abbiamo confrontato diversi protocolli di amplificazione dell’intero genoma su singola cellula al fine di ottenere un’amplificazione omogenea, minimizzando l’effetto di allele drop out, per proseguire con il sequenziamento Sanger. Usando questa procedura, abbiamo analizzato le cellule CD34+ di un paziente affetto da PMF, positivo per la mutazione JAK2V617F e per altre alterazioni genetiche, caratteristiche delle MPN. Il paziente, nonostante il trattamento con il JAK2-inibitore Ruxolitinib, ha sviluppato una LMA. Al fine di ricostruire la gerarchia e l’architettura clonale, abbiamo analizzato le cellule CD34+ alla diagnosi (T1), durante la fase accelerata (T2) e nella fase di LMA (T3). Grazie alla analisi su singola cellula, abbiamo stabilito che il primo evento mutazionale investa TET2, precedendo la mutazione di JAK2, e probabilmente influenzando negativamente la risposta alla terapia. Abbiamo osservato, inoltre, un aumento dei cloni mutati per TP53 durante la progressione della malattia, suggerendo che siano stati questi cloni a supportare la fase T2. Inaspettatamente, già nella fase T1, abbiamo riscontrato una piccola popolazione cellulare recante una mutazione pro-leucemica su FLT3, alterazione che non era stata evidenziata dall'analisi in NGS ma che verosimilmente ha guidato lo sviluppo della fase T3. Infine, abbiamo evidenziato una mutazione omozigote su SRSF2 non ancora descritta. Tutti i nostri dati, confermano quindi come la genomica su singola cellula sia una tecnologia promettente di analisi della eterogeneità clonale delle MPN e che permetta sia di evidenziare precocemente caratteristiche leucemiche sia di ottenere un quadro chiaro degli eventi mutazioni che interessano i disordini ematologici.
Somatic mutations in Hematopoietic Stem Cells (HSCs) cause Myeloproliferative Neoplasms (MPNs), including Polycythemia Vera, Essential Thrombocythemia and Primary Myelofibrosis (PMF). PMF is a heterogeneous disorder consisting of bone marrow fibrosis, megakaryocyte hyperplasia and extramedullary hematopoiesis and is characterized by the worst prognosis among MPNs. About 15-20% of patients are unresponsive to conventional therapies and develop Acute Myeloid Leukemia (AML). In HSCs the main mutations, identified as “driver mutations” during MPNs pathogenesis, involve JAK2, CALR and MPL genes; in addition, many other genetic alterations contribute to the prognosis worsening and the development of AML. Disease progression and leukemic evolution in PMF results from an increase of the genomic complexity and clonal heterogeneity. Many studies confirmed that the mutational acquisition order affects the clinical outcome. However, the clonal architecture determining disease evolution and the clones guiding leukemic transformation are poorly understood. Recent studies demonstrate that single-cell (sc) genomics is a sensitive technique suitable to study clonal heterogeneity and to detect the evolution of the malignant cells in hematological neoplasms. For this reason, we used the sc-genomics approach to clarify the clonal complexity in PMF. Firstly, we developed a workflow for CD34+ Hematopoietic Stem Progenitor Cells (HSPCs) isolation from cord blood, fixation and immunostaining for CD34, in order to singularly separate the cells by DEP-array system (Menarini Silicon Biosystem) and to obtain a cell population suitable for sc-analysis. Then, we compared different whole genome amplification (WGA) protocols for single cells in order to obtain a uniform DNA amplification for Sanger sequencing and minimize allele drop out effect. Based on this method, we analyzed the CD34+ HSPCs of a PMF patient carrying JAK2V617F and other MPN frequent mutations. This patient was treated with JAK2-inhibitor Ruxolitinib but he was unresponsive to therapy and evolved to AML. In order to reconstruct the clonal hierarchy and architecture, we analyzed CD34+ cells during chronic phase (T1), the accelerated phase (T2) and the AML phase (T3). By means to sc-analysis, we established that TET2 was the first mutated gene, preceding JAK2 mutation, and this probably conferred a lower sensitivity to treatment. Moreover, we identified an increase of the allele burden of the TP53 mutation during disease progression, suggesting that TP53-mutated clones supported the accelerated (T2) phase. Interestingly, we already detected in T1 phase a small cell fraction, undetectable by bulk NGS and carrying the leukemogenic FLT3 mutation, probably driving the T3 phase. Finally, we characterized SRSF2 homozygous mutation that has not been described yet. Altogether our data demonstrate that sc-genomics is a promising method to uncover clonal heterogeneity in MPNs, highlighting the early occurrence of pro-leukemic mutations and to describe the real scenario of mutational events in hematological diseases.

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GENOVESE, ELENA. "Ruolo di Calreticulina Wild-Type nell’emopoiesi fisiologica ed effetto delle mutazioni di Calreticulina nello sviluppo delle Neoplasie Mieloproliferative." Doctoral thesis, Università degli studi di Modena e Reggio Emilia, 2020. http://hdl.handle.net/11380/1199999.

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Abstract:

Calreticulina (CALR) è uno chaperone da 46 kDa residente nel reticolo endoplasmatico responsabile della regolazione del calcio intracellulare e del folding proteico. CALR è anche in grado di regolare diverse funzioni al di fuori dal reticolo, tra cui la risposta allo stress cellulare. Nel 2013 sono state scoperte diverse mutazioni nell’esone 9 del gene CALR nelle Neoplasie Mieloproliferative (MPNs); in particolare sono state individuate 36 tipi diversi di mutazioni nel 60-70% dei pazienti con Trombocitemia Essenziale (ET) e Mielofibrosi Primaria (PMF) non mutati per JAK2 e MPL. Tali mutazioni consistono in inserzioni o delezioni che portano a frameshift con conseguente perdita del dominio C-terminale e della sequenza KDEL. In quest’ottica, l’alterazione strutturale di CALR comprometterebbe la sua funzionalità e la sua localizzazione cellulare. Infatti è stato dimostrato che il residuo C-terminale di CALR mutato interagisce con il recettore della trombopoietina (MPL), inducendo l’attivazione costitutiva della via JAK-STAT. Tuttavia, il preciso meccanismo d’azione dei mutanti di CALR è stato solo parzialmente chiarito e non ci sono informazioni sulla funzione di CALR Wild-Type (WT) durante l’emopoiesi fisiologica. Per chiarire il ruolo biologico di CALR WT nella proliferazione e nel differenziamento dei progenitori emopoietici (HPSCs), abbiamo eseguito esperimenti di silenziamento e overespressione in cellule CD34+ umane. I nostri dati mostrano che l’overespressione di CALR WT è in grado di promuovere il differenziamento eritroide e megacariocitario (MK). Parallelamente, il silenziamento di CALR WT induce una marcata repressione del lineages eritroide e MK. In accordo con questi risultati, l'analisi del profilo d’espressione genica (GEP) ha confermato che CALR WT è in grado di influenzare l'espressione dei geni del differenziamento eritroide e MK. Inoltre, l’analisi trascrizionale ha mostrato la modulazione di diversi geni coinvolti nella risposta allo stress ossidativo, allo stress del reticolo, al danno al DNA e in pathways biologici alla base dello sviluppo delle MPNs. Successivamente, per studiare l’effetto delle mutazioni di CALR sulla sua funzionalità in risposta allo stress ossidativo e del reticolo, abbiamo infettato le cellule K562 con vettori retrovirali esprimenti una delle due varianti mutate più comuni, CALRdel52 o CALRins5. Abbiamo deciso di utilizzare la linea cellulare K562, priva dell’espressione di MPL, per individuare ulteriori vie di segnalazione alla base della trasformazione MPL-mediata. In primo luogo, i nostri dati mostrano che i mutanti di CALR compromettono la capacità di rispondere allo stress del reticolo e riducono drasticamente l'attivazione dell’apoptosi mediata dalla UPR (Unfolded Protein Response). Inoltre abbiamo dimostrato che le mutazioni di CALR causano una maggiore sensibilità allo stress ossidativo con accumulo di danni ossidativi al DNA. Infine, abbiamo studiato la funzione del gene antiossidante OXR1, deregolato nell’analisi di GEP. La downregolazione di OXR1 altera la capacità delle cellule mutate di controbilanciare l’accumulo di specie reattive dell’ossigeno (ROS), suggerendo il possibile coinvolgimento di OXR1 nell’alterata risposta allo stress ossidativo che si osserva nei mutanti di CALR. Nel complesso, i nostri risultati rivelano un nuovo ruolo di CALR WT nella regolazione del differenziamento eritroide e MK, due lineages coinvolti nelle MPNs. Inoltre, i mutanti di CALR incidono negativamente sulla risposta allo stress del reticolo, causando resistenza all’apoptosi. Infine, l’alterata risposta allo stress ossidativo che si osserva nei mutanti di CALR può causare instabilità genomica, promuovendo così la trasformazione tumorale.
Calreticulin (CALR) is a 46 kDa endoplasmic reticulum (ER) chaperone responsible for intracellular calcium regulation and protein folding. CALR is also able to perform different functions outside the ER, such as responses to cellular stress. In 2013, several mutations were discovered in exon 9 of CALR gene in Myeloproliferative Neoplasms (MPNs); notably 36 different types of mutations have been reported in 60-80% of JAK2 and MPL unmutated Essential Thrombocythemia (ET) and Primary Myelofibrosis (PMF) patients. These mutations consist of insertions or deletions that induce a frameshift, resulting in a loss of the C-terminal portion domain and the KDEL sequence. In this view, structural alterations of CALR protein might impair its functionality and its cellular localization. Indeed, recent data demonstrated that C-terminal of CALR mutants interacts with the thrombopoietin receptor (MPL), inducing the constitutive activation of JAK-STAT pathway. However, the precise mechanism of action through which CALR mutants contribute to the development of MPNs has only been partially clarified and there is no available information on the function of Wild-Type (WT) CALR during physiological hematopoiesis. In order to elucidate the biological role of WT CALR in the proliferation and differentiation of hematopoietic stem/progenitor cells (HPSCs), we performed gene silencing and overexpression experiments in human CD34+ cells. Our data demonstrated that WT CALR overexpression is able to enhance erythroid and megakaryocyte (MK) differentiation. Consistently, WT CALR silencing induces a marked repression of MK and erythroid lineages. In agreement with these results, gene expression profile (GEP) analysis confirmed that WT CALR is able to affect the expression of genes of erythroid and MK differentiation. Moreover, transcriptome analysis showed the modulation of several genes implicated in oxidative stress, ER stress response, DNA damage and in several pathways already described as able to play a role in MPN development. Next, to investigate the impact of CALR mutations in oxidative and ER stress response, we transduced K562 cells with vectors expressing one of the two commonest CALR mutated variants, either CALRdel52 or CALRins5. We chose to perform experiments in the K562 cell line, devoid of MPL expression, in order to identify additional pathways whose alterations might cooperate with cellular transformation mediated by MPL activation. Firstly, we demonstrated that CALR mutants reduce the capability to respond to ER stress and significantly decrease the activation of the pro-apoptotic unfolded protein response (UPR) pathway. Then, we showed that CALR mutations induce increased sensitivity to oxidative stress, also driving the accumulation of oxidative DNA damage. Finally, we studied the function of the antioxidant gene OXR1, found deregulated in GEP analysis. The downregulation of OXR1 affects the capability of mutant cells to counterbalance reactive oxygen species (ROS) accumulation, suggesting that lack of OXR1 expression might be one of the molecular mechanisms responsible for the impaired oxidative stress response mediated by mutant CALR. Altogether, our results suggest a new role of WT CALR in the regulation of erythroid and MK differentiation, whose deregulation is crucial in MPNs. Moreover, CALR mutants negatively impact on the ability to respond to ER stress, conferring apoptosis resistance to the cells. Finally, the impairment in oxidative stress response due to CALR mutations can lead to genomic instability, thus promoting cell transformation.

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Pacquola, Enrica. "Correlazione tra "Non Responsività ad Aspirina" e stato mutazionale di JAK2 in pazienti con Neoplasie Mieloproliferative cromosoma Philadelfia negative (MPNs)." Doctoral thesis, Università degli studi di Padova, 2010. http://hdl.handle.net/11577/3421534.

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Abstract:

We studied 440 patients affected by MPNs (PV and ET), in particular regarding thrombotic complications during treatment with low dose of aspirin (100 mg/daily). We found that jak2 mutation is significantly correlated with high thrombotic risk.
Abbiamo studiato 440 pazienti affetti da malattie mieloproliferative (PV ed ET), in particolare analizzando gli eventi trombotici avvenuti durante il trattamento con aspirina a basse dosi (100 mg/die). Abbiamo osservato che la presenza della mutazione del gene jak2 è significativamente correlato ad un elevato rischio trombotico.

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Meireles, Catarina Filipa Amorim. "Doenças Mieloproliferativas." Master's thesis, Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar, 2009. http://hdl.handle.net/10216/52824.

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Meireles, Catarina Filipa Amorim. "Doenças Mieloproliferativas." Dissertação, Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar, 2009. http://hdl.handle.net/10216/52824.

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Angona, Figueras Anna. "Caracterización de los progenitores hematopoyéticos CD34+ en las neoplasias mieloproliferativas y su papel en la evolución de la carga mutacional." Doctoral thesis, Universitat Autònoma de Barcelona, 2017. http://hdl.handle.net/10803/403818.

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Abstract:

Las neoplasias mieloproliferativas (NMP) son enfermedades clonales de la célula madre hematopoyética que se caracterizan por la proliferación de una o más de las líneas mieloides. Se acuerdo con la clasificación actual de la OMS, las NMP cromosoma Filadelfia negativas clásicas incluyen la policitemia vera (PV), la trombocitemia esencial (TE) y la mielofibrosis primaria (MFP). En el año 2005 se describió la mutación p.V617F del gen JAK2 presente en el 95% de los pacientes con PV y en la mitad de los casos de TE y MFP. Más recientemente, se han descrito mutaciones que afectan al gen MPL y mutaciones en el gen de la CALR en los pacientes con TE y MFP JAK2 no mutadas. Todas estas mutaciones se consideran mutaciones driver o conductoras de las NMP. Adicionalmente, se han descrito otras mutaciones somáticas que no actúan primariamente en la proliferación celular, pero que pueden modificar el efecto de las mutaciones driver. Las NMP JAK2V617F mutadas se caracterizan por la coexistencia de progenitores clonales JAK2V617F mutados y no mutados. El conocimiento de la carga mutacional de JAK2V617F y de las mutaciones non-driver a nivel de los progenitores hematopoyéticos podría proporcionar información sobre la base biológica de los cambios clínicos evolutivos, especialmente, la transformación a mielofibrosis y leucemia aguda. Asimismo, la carga mutacional a nivel progenitor también podría influir en la respuesta al tratamiento. Algunos autores postulan que las NMP CALR mutadas son una entidad distinta de las JAK2 mutadas, tanto desde el punto de vista biológico, como clínico y pronóstico. Estas observaciones podrían ser la consecuencia de un comportamiento diferente a nivel de los progenitores hematopoyéticos. En este contexto, el presente trabajo de investigación ha caracterizado las subpoblaciones de progenitores hematopoyéticos (CD34+CD38- y CD34+CD38+) de pacientes con NMP JAK2 y CALR mutadas y se ha correlacionado la carga mutacional con la fase evolutiva de la enfermedad, la presencia de mutaciones adicionales y con la presencia de dominancia clonal. Asimismo, se han evaluado las diferencias en el tamaño del clon mutado de los progenitores mutados de acuerdo con el genotipo JAK2 o CALR. Finalmente, se ha investigado el efecto del tratamiento con inhibidores de JAK2 en la evolución de la carga mutacional a nivel progenitor. Los resultados del primer trabajo mostraron que el porcentaje de células CD34+ con mutación V617F del gen JAK2 en los pacientes con PV aumenta durante la evolución de la enfermedad y que en la MF post-PV existe un predominio de progenitores hematopoyéticos mutados probablemente como consecuencia de la expansión de los clones homocigotos. Finalmente, se observó que en el momento del diagnóstico de la PV puede existir hematopoyesis clonal debido a la expansión de clones con mutaciones adicionales. En el segundo trabajo pudimos demostrar que la proporción de progenitores hematopoyéticos mutados es diferente de acuerdo con el genotipo de las NMP. Los pacientes con mutación de CALR se caracterizan por una expansión de los progenitores mutados, mientras que los pacientes con TE y PV JAK2V617F presentan un pequeño porcentaje de progenitores mutados con una alta capacidad de diferenciación. Por último, analizamos la evolución de la carga mutacional de JAK2V617F en una serie de 7 pacientes con NMP durante los primeros 12 meses de tratamiento con un inhibidor de JAK2 (Ruxolitinib). Los resultados obtenidos sugieren que dicho fármaco tiene una escasa capacidad de modificar la carga mutacional de JAK2V617F en las células CD34+ en los pacientes con PV y MF.
Myeloproliferative neoplasms (MPN) are clonal diseases that origin from hematopoietic stem cell and are characterized by a proliferation of one or more of the myeloid cell types. According to the current WHO Classification, classic Philadelphia negative MPN include polycythemia vera (PV), essential thrombocythemia (TE) and primary mielofibrosis (PMF). In 2005, JAK2V617F mutation was described in 95% of PV patients and in half of ET and PMF patients. More recently, mutations affecting MPL or CALR gene have been reported in patients with JAK2V617F negative TE and PMF. All these mutations are considered driver mutations. In addition, other somatic mutations that do not act primarily on cell proliferation, but can modify the effect of the driver mutations, have been described. JAK2V617F MPN are characterized by the coexistence of normal and JAK2V617F-mutated progenitors. Knowledge of the mutational allele burden of JAK2V617F at the progenitor level could provide information on the biological basis of evolutionary clinical changes, especially myelofibrotic and acute leukemia transformation. Moreover, the mutational load at the progenitor level may also influence treatment response. Finally, some authors postulate that CALR mutated MPN are a distinct entity from a biological, clinical and prognostic point of view from JAK2V617F MPN. These observations could be the consequence of a different behaviour at the level of hematopoietic progenitors. In this sense, this work has characterized different subpopulations of hematopoietic progenitor cells (CD34+CD38- and CD34+CD38+) from patients with JAK2V617F and CALR-mutated MPN and their mutational allele burden has been correlated with disease status, presence of additional mutations and presence of clonal dominance. Also, we compared the mutational allele burden at the progenitor level according to the genotype (JAK2 or CALR). Finally, we evaluated the effect of the treatment with JAK2 inhibitors on the JAK2V617F mutant allele burden of the progenitor cells. In our first study, we showed that the percentage of CD34+ cells carrying JAK2V617F mutation increases during the evolution of the disease in PV patients. Moreover, we could demonstrate that the transformation to myelofibrosis is characterized by a predominance of JAK2V617F progenitor cells probably due to the expansion of homozygous clones. Finally, we observed that at the time of PV diagnosis there may be clonal hematopoiesis due to the expansion of clones with additional mutations. In the second study, we could show that the proportion of mutated hematopoietic progenitors is different according to the genotype. Patients with CALR-mutated MPN are characterized by an expansion of mutated progenitors, whereas patients with JAK2V617F ET and PV present a low percentage of mutated progenitors with a high differentiation capacity. Finally, we analysed the evolution of the mutational allele burden of JAK2V617F in 7 patients with MPN during the first 12 months of treatment with JAK2 inhibitor (Ruxolitinib). The results suggest that ruxolitinib has a minimal effect on the JAK2V617F mutant allele burden variation in CD34+ cells.

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Moura, Lívia Gonzaga. "Expressão de Galectinas-1 e 3 em Neoplasias Mieloproliferativas." Universidade de São Paulo, 2012. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/60/60135/tde-25022013-094107/.

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Abstract:

Doenças Mieloproliferativas Crônicas são desordens hematológicas malignas caracterizadas pela alteração na célula-tronco hematopoética e independência ou hipersensibilidade dos progenitores hematopoéticos a citocinas. Em 2008 a OMS renomeou esse grupo como Neoplasias Mieloproliferativas (NMPs), no qual estão inclusas as entidades nosológicas Policitemia Vera (PV), Trombocitemia Essencial (TE) e Mielofibrose Primária (MFP), doenças alvo desse estudo. Apesar dos avanços no diagnóstico das NMPs e nos mecanismos envolvidos com a fisiopatologia dessas doenças, sua patogênese permanece desconhecida. Alterações na maquinaria apoptótica parecem estar envolvidas em na fisiopatologia das NMP e por isso a compreensão dos mecanismos de regulação da apoptose e a interferência das galectinas-1 e 3 nesse processo, em pacientes com NMPs, é relevante para a busca de novos alvos terapêuticos. Neste contexto, os objetivos deste trabalho foram: avaliar em leucócitos de sangue periférico e células tronco hematopoéticas CD34+ de medula óssea dos pacientes com PV, TE e MFP os níveis de expressão das LGALS1 e LGALS3 e a concentração de galectina-3 plasmática. Foram determinadas as correlações dos níveis de expressão de LGALS1 e LGALS3 e da concentração da galectina-3 plasmática com os níveis de expressão do RNAm das moléculas reguladoras da apoptose e com os dados clínico-laboratoriais dos pacientes como a concentração de hemoglobina, percentagem de hematócrito, porcentagem de alelos mutados JAK2V617F, contagem de leucócitos e esplenomegalia. A expressão de LGALS1 estava diminuída em células CD34+ em PV e MFP e em leucócitos de sangue periférico de pacientes com MFP. Os pacientes de TE apresentaram aumento na expressão de LGALS3 em leucócitos de sangue periférico e alta concentração de galectina-3 no plasma. Houve correlação entre os níveis de expressão de LGALS1 e a porcentagem de alelos mutados e a contagem de leucócitos, em pacientes com PV. Foi detectada a correlação entre os níveis de expressão de LGALS3 a porcentagem de alelos mutados e o tamanho do baço, em pacientes com MFP. Com relação aos genes reguladores da apoptose, foram observadas correlações entre os níveis de expressão de LGALS1 e BCL-2 em células CD34+ de pacientes PV e entre LGALS3 e A1, MCL-1, BAX e C-FLIP em leucócitos de de pacientes com TE. Os resultados obtidos indicam que as NPM apresentam expressão diferencial de LGALS1 e LGALS3 e sugerem a associação entre a expressão de galectinas e o status da mutação JAK2V617F, principalmente em pacientes com MFP
Chronic myeloproliferative diseases are haematological malignant disorders characterized by the presence of an altered haematopoietic stem cell and independence or hypersensibility of their hematopoietic progenitors to cytokines. In 2008, WHO renamed this group of diseases as Myeloproliferative Neoplasms (MPN) in which is included Polycythemia Vera (PV), Essential Thrombocythemia (ET) and Primary Myelofibrosis (PMF). There have been advances concerning the knowledge about the mechanisms involved in MPN pathophysiology, however their pathogenesis remains unknow. Deregulation in apoptotic machinery seems to be involved in MPN pathophysiology. Fully understanding of apoptotic machinery and the influence of galectin-1 and 3 in this process in NMP patients might unveil novel targets for manipulation. The aims of the present study were to evaluate in leukocytes and CD34+ hematopoietic stem cells from PV, ET and PMF patients the LGALS1 and LGALS3 expression levels, the Galectin-3 plasma levels and to correlate LGALS1 and LGALS3 expression levels with galectin-3 plasma levels, apoptosis-related genes expression, JAK2 mutation status and clinic-laboratorial parameters. PV and PMF patients showed decreased expression levels of LGALS1 in CD34+ cells and also decreased LGALS1 expression levels in PMF leukocytes. ET patients presented an increased expression level of galectin-3 in leukocytes and plasma. We detected the correlations between LGALS3 gene expression with JAK2 allele burden and with leukocytes number in PV patients. We also observed in PMF patients the correlation between LGALS3 expression levels with JAK2 allele burden and spleen size. We also detected the correlation between LGALS1 expression levels BCL-2 gene expression in PV CD34+ HSC cells and between LGALS3 expression and A1, MCL-1, BAX and C-FLIP gene expression in TE leukocytes. Taken together, the results suggest the LGALS1and LGALS3 differential expression in NMP and the relation between JAK2V617F status with galectins expression, especially in PMF patients.

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Brás, Gil de Paiva. "Neoplasias mieloproliferativas: perfil genotípico e fenotípico das trombocitemias essenciais." Master's thesis, Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar, 2010. http://hdl.handle.net/10216/62250.

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Silva, Andreia Gabriela Carvalho Coelho da. "Importância da mutação JAK2 V617F nas doenças mieloproliferativas clássicas." Master's thesis, Universidade de Aveiro, 2010. http://hdl.handle.net/10773/8743.

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Abstract:

Mestrado em Biologia Molecular e Celular
Os Síndromes Mieloproliferativos (SMP) são um grupo de doenças heterogéneas nas quais se verifica uma produção excessiva de células sanguíneas pelos precursores hematopoieticos. A Policitémia Vera (PV), a Trobocittémia Essencial (TE), a Mielofibrose Idiopática (MF) e a Leucemia Mielóide Crónica (LMC) são conseideradas SMP clássicas que apresentam características clínicas e biológicas comuns. Ao contrário da LMC, cuja etiologia está relacionada com a proteína constitutivamente activa BCR-ABL, o mecanismo molecular da PV, TE e MF permaneceu por muito tempo desconhecido. O grande número de estudos respeitantes ás SMP resultou em 2005 na descrição de uma mutação pontual no exão 14 do gene Janus Kinase 2 (JAK2), denominada JAK2 V617F, recorrente em pacientes com SMP clássicas BCR-ABL negativos. Esta mutação leva à activação constitutiva da proteína JAK2. Estudos recentes revelam que a mutação JAK2 V617F está presente em 83-95% de doentes com PV, 50 a 70% de doentes com TE e em cerca de 50% de doentes com MF. Os objectivos deste estudo consistem em determinar a frequência da mutação JAK2 V617F numa população de doentes dos HUC-EPE com diagnóstico de PV, TE e MF, comparar a frequência obtida com a literatura, avaliando deste modo a eficácia da metodologia usada e demonstrar que esta mutação é estatísticamente significativa nos SMP clássicos Ph-. O estudo incidiu sobre um grupo de 475 doentes aos quais foi solicitada a análise da mutação JAK2 V617F no periodo decorrente de Junho de 2006 e Maio de 2010. A metodologia usada consistiu na extracção de ADN genómico, seguida de uma reacção de PCR utilizando primers que permitiram a amplificação dos alelos normal e mutado, e sua subsequente identificação através de uma electroforese com posterior coloração utilizando nitrato de prata. Posterior análise dos resultados determinou uma frequência da mutação JAK2 V617F de 74%, 66% e 42% em pacientes com PV, TE e MF respectivamente. Utilizando o teste Qui-Quadrado de Pearson foi possivel demonstrar que: existe uma associação entre a mutação e o sexo feminino nos doentes com PV; relacionando a mutação com a doença verificou-se que a heterozigotia tem uma forte associação com a TE enquanto que a homozigotia tem associação com a PV. Por fim estabeleceu-se uma forte associação desta mutação com as SMP Ph-, ou seja, para α= 0,05 foi obtido P<0,001. Para provar estatísticamente a eficácia da metodologia usada efectuou-se o teste Qui-Quadrado de Aderência no qual X2(observado)= 4,69, inferior ao X2 (crítco)= 5,99. Este resultado é extremamente relevante pois determina que não existe necessidade de implementar outra técnica, que seria bastante mais dispendiosa, e no presente não seria vantajosa. Futuramente quando a terapía passar pelo uso de proteínas inibidoras de JAK2, será necessário efectuar um estudo semelhante para averiguar se a metologia qualitativa usada é suficiente para fazer a monitorização terapêutica.
The Myeloproliferative Syndromes are a heterogeneous group of diseases in which there was an overproduction of blood cells by hematopoietic precursors. Polycythemia Vera (PV), the Essential Trobocittémia (TE), Idiopathic Myelofibrosis (MF) and Chronic Myelogenous Leukemia (CML) are classic SMP that have in common clinical and biological characteristics. Unlike the LMC, whose etiology is associated with the protein constitutively active BCR-ABL, the molecular mechanism of PV, ET and IM long still remain unknown. The large number of studies relating to SMP led in 2005, to the description of a point mutation in exon 14 of gene Janus Kinase 2 (JAK2), known as JAK2 V617F, in patients with recurrent classic SMP Ph-. This mutation leads to constitutive activation of JAK2 protein. Recent studies shown that JAK2 V617F is present in 83-95% of patients with PV, 50 to 70% of ET patients and in 50% of patients with IM. The objectives of this study were to determine the frequency of JAK2 V617F in a patient population of HUC-EPE diagnosed with PV, ET and MF, comparing the frequency obtained with the literature, thereby assessing the effectiveness of the methodology used. The study focused on a group of 475 patients who were asked to JAK2 V617F mutation analysis in the period from June 2006 to May 2010. The methodology used consisted in a extraction of genomic DNA, followed by a PCR reaction using primers that allowed the amplification of normal and mutated alleles, and their subsequent identification by an electrophoresis and staining using silver nitrate. Further analysis of the results determined a frequency of JAK2 V617F in 74%, 66% and 42% in patients with PV, ET and IM respectively. Using the Pearson chi-square test was possible to demonstrate that: the mutation has an association with female gender in PV patients, observing the relationship between the disease and the mutation was found that heterozygosity has a strong association with TE whereas homozygosity is associated with the PV. Finally we established a strong association of this mutation with Ph-SMP, to α= 0.05 was obtained a P<0,001. To statistically prove the effectiveness of the methodology was carried out a Chi-square test where X2 (observed) = 4.69 was lower than the X2 (insidious) = 5.99. This result is extremely important because it determines that there was no need to implement a quantitative technique, it would be far more expensive, and this would not be advantageous. In the future when therapy over the use of protein inhibitors of JAK2, we must perform a similar study to see whether the qualitative methodology used is enough to make the therapeutic monitorization.

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Brás, Gil de Paiva. "Neoplasias mieloproliferativas: perfil genotípico e fenotípico das trombocitemias essenciais." Dissertação, Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar, 2010. http://hdl.handle.net/10216/62250.

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Rocha, Adriana Queiroz Arantes. "Caracterização do papel das células Natural Killer nas neoplasias mieloproliferativas." Universidade de São Paulo, 2017. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17154/tde-23032018-112408/.

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Abstract:

As células Natural Killer (NK), quando estimuladas por meio de seus receptores, rapidamente produzem citocinas e quimiocinas, incluindo IFN?, TNF?, TGF?, GMCSF, MIP1?, MIP1?, IL-10 e outras, as quais podem afetar a função de outras células hematopoéticas. Considerando as evidências recentes de que as célulastronco hematopoéticas (CTH) respondem diretamente à sinalização de várias citocinas, acreditamos que a produção de citocinas mediada pelas células NK possa regular a função da CTH e que a sua desregulação possa favorecer a transformação maligna. As neoplasias mieloproliferativas (NMP) negativas para o rearranjo t(9;22)/BCR-ABL1, incluindo as entidades Policitemia Vera (PV), Trombocitemia Essencial (TE) e Mielofibrose Primária (MFP), são doenças hematopoéticas originadas de alteração clonal da CTH, e podem servir de modelo para o estudo dessa regulação NK-CTH. Além de mutações que ativam vias de proliferação e sobrevivência celular, como a mutação JAK2V617F, presente em mais da metade das NMP, outros mecanismos contribuem para a patogênese e manutenção da doença, tais como mutações adicionais e regulação da hematopoese neoplásica pelo microambiente da medula óssea. Este último inclui não apenas células do estroma, mas também células do sistema imune. Dessa forma, com objetivo de investigar a potencial contribuição das células NK para a patogênese das NMP, caracterizamos células do sangue periférico de pacientes com NMP do Ambulatório de Hematologia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, bem como células esplênicas obtidas de animais de um modelo murino condicional knockin de expressão heterozigótica da Jak2V617F (Jak2VF) quanto à frequência, expressão de receptores e função das células NK. Observamos menor porcentagem de células NK e maior expressão do receptor inibitório NKG2A nos animais Jak2 wt/VF. Pacientes portadores de NMP apresentaram número absoluto de células NK-CD16+ reduzido em relação aos controles saudáveis. O número de células NK-CD16+ foi menor na MFP em relação aos controles e à TE, particularmente naqueles portadores da mutação JAK2V617F. Encontramos menor expressão do receptor de ativação NKG2D nos portadores de PV positivos para a mutação JAK2V617F. Houve menor expressão do receptor de ativação NKp46 nos portadores de NMP, particularmente nos portadores da mutação JAK2V617F, e nos pacientes com MFP. Observamos também menor expressão do receptor NKG2A nos portadores de TE negativos para a mutação JAK2V617F. Em concordância com a redução de células NK, a porcentagem de linfócitos totais mostrou-se reduzida nos pacientes com NMP, particularmente nos portadores de MFP, independentemente da mutação JAK2V617F. Encontramos redução percentual e absoluta do subtipo de células NK CD56brightCD16- (cuja principal função é secretória) nos pacientes com NMP, especialmente na presença da mutação JAK2V617F, nos pacientes com PV e MFP, e menor frequência absoluta do subtipo CD56-CD16bright (com função primariamente citotóxica) nos portadores de MFP. Em contraste, não verificamos deficiência citotóxica das células NK dos animais Jak2 wt/VF em relação aos controles Jak2 wt/wt. Adicionalmente, as células NK dos animais Jak2-mutados demonstraram menor capacidade de secreção da citocina MIP-1?, reconhecida por regular a função de CTH, em relação aos animais controle. Finalmente, houve expressão significativamente aumentada do gene MyD88 nos animais mutados em relação aos controles, sugerindo que a via de sinalização dos receptores do tipo Toll (TLR) pode estar envolvida na regulação NKCTH nas NMP. Em resumo, detectamos deficiência numérica e funcional de células NK em células primárias murinas e humanas de NMP. Nossos achados sugerem potencial regulação da hematopoese maligna pelas células NK nestas neoplasias e podem contribuir para a identificação de novas estratégias terapêuticas que possam interferir nesta complexa interação.
Natural Killer (NK) cells, when stimulated by their receptors, rapidly produce cytokines and chemokines, including IFN?, TNF?, TGF?, GM-CSF, MIP1?, MIP1?, IL-10 and others, which may affect the function of other hematopoietic cells. Considering the recent evidence that hematopoietic stem cells (HSC) directly respond to cytokine signaling, we hypothesized that NK cells mediated cytokine production can regulate HSC function and that their dysregulation may favor malignant transformation. BCR-ABL1-negative myeloproliferative neoplasms (MPN), including Polycythemia Vera (PV), Essential Thrombocythemia (ET) and Primary Myelofibrosis (PMF), are hematopoietic diseases originated from HSC clonal transformation, and thus can serve as a model for studying this NK-HSC regulation. In addition to mutations that activate cell proliferation and survival pathways, such as the JAK2V617F mutation, present in more than half of MPN cases, other mechanisms contribute to the pathogenesis and maintenance of the disease, such as additional mutations and regulation of neoplastic hematopoiesis by the bone marrow microenvironment. This latter includes not only stromal cells but also cells of the immune system. Therefore, in order to investigate the potential contribution of NK cells to the pathogenesis of MPN, we characterized the frequency, receptor expression and function of NK cells from patients with MPN from the Clinical Hospital of the Medical School of Ribeirão Preto, University of São Paulo, as well as from splenic cells obtained from animals of a conditional knockin murine model of Jak2V617F heterozigous expression. Lower percentage of NK cells and higher NKG2A inhibitory receptor expression was observed in Jak2 wt/VF animals as compared to Jak2 wt/wt controls. In agreement, patients with MPN presented reduced absolute numbers of NK-CD16+ cells when compared to healthy controls. The number of NKCD16+ cells was lower in the PMF than in controls or ET patients, particularly in those bearing the JAK2V617F mutation. We found lower expression of the NKG2D activatory receptor in PV patients with the JAK2V617F mutation. There was lower expression of the NKp46 activatory receptor in MPN patients, particularly in those with the JAK2V617F mutation, and in PMF patients. We also observed reduced expression of the NKG2A receptor in non-JAK2 mutated ET patients. In agreement with the NK cell reduction, the percentage of total lymphocytes was reduced in patients with MPN, particularly in PMF, regardless of the JAK2V617F mutation. We found an absolute decrease of the CD56brightCD16- NK subtype (whose main function is secretory) in patients with MPN, especially when the JAK2V617F mutation was present, in patients with PV and PMF. Also, lower absolute frequency of CD56-CD16bright NK subtype (primarily cytotoxic) was found in PMF patients. In contrast, we did not find cytotoxic deficiency in the Jak2 wt/VF NK cells as compared to the Jak2 wt/wt controls. In addition, Jak2-mutated NK cells presented reduced ability of secreting the cytokine MIP-1?, known to regulate HSC function. Finally, there was significantly increased expression of the MyD88 gene in the Jak2-mutated animals as compared to controls, suggesting that the Toll-like receptors (TLR) signaling pathway may be involved in NK-HSC regulation in MPN. In summary, we detected numerical and functional deficiency of NK cells in murine and human primary cells of MPN. Our findings suggest a potential regulation of malignant hematopoiesis by NK cells in these neoplasms and may contribute to the identification of new therapeutic strategies that may target this complex interaction.

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Fenerich, Bruna Alves. "Inibição farmacológica dos substratos do receptor de insulina em neoplasia mieloproliferativa JAK2V617F." Universidade de São Paulo, 2017. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17138/tde-02042018-111147/.

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Abstract:

A mutação recorrente JAK2V617F é a lesão molecular com maior impacto na fisiopatologia das neoplasias mieloproliferativas (NMP) BCR ABL1 negativas. A ausência de resposta clínica completa ao inibidor seletivo de JAK1/2, ruxolitinibe, indica a necessidade de novas abordagens terapêuticas. Dados recentes sugerem que IGF1R/IRS representa um potencial alvo de inibição para o tratamento das NMP: (i) o substrato do receptor de insulina 2 (IRS2) coopera com JAK2V617F na transformação maligna em NMP; (ii) a desregulação da via de sinalização de IGF1R induz NMP. O composto NT157 foi desenvolvido para inibir IRS1/2 e apresentou efeitos antineoplásicos em neoplasias sólidas. Os objetivos deste trabalho foram avaliar os efeitos celulares e moleculares do tratamento com o inibidor de IRS1/2, NT157, isolado e em combinação com ruxolitinibe, em NMP JAK2V617F. Células HEL e SET2 JAK2V617F foram tratadas com veículo, NT157 e/ou ruxolitinibe e submetidas à avaliação da viabilidade celular, apoptose, proliferação, clonogenicidade, ciclo celular, expressão gênica e/ou expressão/ativação proteica. Células primárias de pacientes com policitemia vera foram submetidos a tratamento com NT157 e avaliação de formação espontânea de colônias eritroides. O efeito do NT157 in vivo foi avaliado utilizando modelo de xenotransplante de células HEL em camundongos NSG. A análise estatística foi realizada através do teste ANOVA ou t de Student. Em células HEL e/ou SET2 JAK2V617F, o tratamento com NT157 promoveu redução da viabilidade, clonogenicidade e proliferação celular, aumentou a apoptose e resultou em parada do ciclo celular em G2/M (p?0,05). Exposição ao NT157 resultou em inibição da fosforilação de STAT3, STAT5 e ERK e na modulação da expressão de 23 oncogenes (CCND1, MYB e WT1) e genes supressores tumorais (CDKN1A, JUN e FOS) em células HEL (p?0,05). O tratamento combinado com ruxolitinibe não apresentou efeito potencializador, sendo que a redução da viabilidade nas condições de combinação corresponde ao efeito das monoterapias nas linhagens celulares avaliadas. Em células primárias de pacientes com policitemia vera (n=3), NT157 reduziu a formação espontânea de colônias eritroides (p?0,05). O tratamento in vivo com veículo ou NT157 na dose de 70mg/kg, 3 vezes por semana, via intraperitoneal, em modelos de xenotransplante com células HEL em camundongos NSG (n=5 para cada grupo) não apresentou efeitos antineoplásicos. Em conclusão, a inibição farmacológica de IRS1/2 apresentou efeitos antineoplásicos significativos em modelos de linhagens celulares e amostras primárias de pacientes com NMP JAK2V617F. A inibição farmacológica combinada de IRS1/2 e JAK1/2 não potencializou o efeito antineoplásico das monoterapias nos processos celulares investigados. Os resultados dos estudos in vivo em modelos de xenotransplante indicam a necessidade de estudos de farmacocinética e farmacodinâmica para o NT157. Os efeitos moleculares identificados permitiram uma melhor compreensão sobre os mecanismos de ação da droga NT157 em NMP.
The recurrent V617F mutation in JAK2 is a major contributor to the pathogenesis of BCR-ABL1 negative myeloproliferative neoplasms (MPN). Absence of complete clinical response to ruxolitinib, a JAK1/2 inhibitor, highlights the need for targeting other signaling pathways that contribute to JAK2. Recent data indicate that IGF1R/IRS is a potential target in MPN: (i) insulin receptor substrate 2 (IRS2) cooperates to malignant transformation induced by JAK2V617F, (ii) IGF1R signaling upregulation induces MNP phenotype. NT157 is a synthetic compound designed as IRS1/2 inhibitor and was able to induce anti-neoplastic effects in solid tumors. We, herein, aimed to characterize the molecular and cellular effects of NT157 treatment, combined or not with ruxolitinib, in MPN JAK2V617F. HEL and SET2 JAK2V617F cells were treated or not with vehicle, NT157 and/or ruxolitinib and submitted to evaluation of cell viability assay, apoptosis, proliferation, clonogenicity, cell cycle, gene expression and protein expression/activation. Primary cells from polycythemia vera (PV) patients (n=3) were exposed to NT157 treatment and evaluated for erythropoietin-independent colony formation. NT157 effects in vivo were evaluated in a xenograft model of leukemogenesis induced by HEL cells in NSG mice. Statistical analysis was performed using ANOVA or Student\'s t test. In MPN cell lines, NT157 treatment significantly decreased cell viability, clonogenicity and cell proliferation, increased apoptosis and cell cycle arrest in G2/M (all p<0.05). NT157 exposure resulted in inhibition of STAT3, STAT5 and ERK phosphorylation. NT157 also modulated the expression of 23 oncogenes (CCND1, MYB and WT1) and suppressor tumor genes (CDKN1A, FOS and JUN) in HEL cells (p?0.05). In both cell lines, the combined treatment, NT157 plus ruxolitinib, did not potentiate the effects of monotherapies. In primary cells from polycythemia vera patients, NT157 exposition reduced spontaneous erythroid colony formation (all p<0.05). In vivo treatment with vehicle or NT157 (70mg/kg intraperitoneal), three times a week, showed no antineoplastic effects in NSG mice transplanted with HEL cells (n = 5 for each group). In summary, the IRS1/2 pharmacological inhibitor NT157 displayed remarkable antineoplastic effects in JAK2V617F cells lines and MPN primary cells. The combined treatment of NT157 plus ruxolitinib did not present potentializing effects when compared to the monotherapy. The results of in vivo treatment using a xenograft model highlight the need for pharmacokinetic and pharmacodynamic studies for the NT157 compound. The molecular effects identified allowed a better understanding about the mechanisms of NT157 action in MPNs.

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FRANÇA, NETO Pedro Luiz de. "Caracterização clínica e molecular de pacientes com neoplasia mieloproliferativa crônica- cromossomo Ph- negativo." Universidade Federal de Pernambuco, 2016. https://repositorio.ufpe.br/handle/123456789/25780.

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A descoberta da mutação JAK2V617F foi um marco diagnóstico para pacientes com neoplasias mieloproliferativas crônicas (NMPC) – cromossomo Filadélfia (Ph) negativo. Esta mutação encontra-se, presente em quase todos os pacientes com policitemia vera (PV, 97%) e em cerca de 50% dos pacientes com trombocitemia essencial (TE) e mielofibrose primária (MFP). Posteriormente, outras mutações foram descritas de maneira mutuamente exclusiva, como: alterações no éxon 12 do gene JAK2, no gene codificador para receptor da trombopoetina (MPL) e no gene calreticulina (CALR). Ainda que a caracterização molecular desses pacientes seja uma ferramenta diagnóstica imprescindível, permanece sob estudo as implicações que essas alterações causam no fenótipo da doença. Neste trabalho realizamos a caracterização molecular de 260 pacientes com NMPC Ph-negativo e associamos esses achados às características clínicas e laboratoriais. Para a mutação JAK2V617F, a caracterização molecular foi realizada por meio de reação em cadeia da polimerase seguido por digestão com enzima de restrição (BsaXI). Sequenciamento Sanger foi utilizado para mutações no éxon 12 do gene JAK2 e no éxon 9 do gene CALR utilizamos. A mutação JAK2V617F foi identificada em 87% (60/69) dos pacientes com PV e 50% (94/189) dos pacientes com TE e MFP. As mutações no gene CALR foram encontradas em 42% (37/88) dos pacientes com TE e MFP JAK2V617F negativos e para os que também não tinham mutações no gene CALR foi feita a pesquisa no gene MPL, onde 16/48 apresentaram mutações. Ao associar os achados moleculares com as características clínicas, os pacientes com TE CALRᵐᵘᵗ apresentaram ao diagnóstico maior contagem de plaquetas (P=0,002) e menor número de leucócitos (P=0,016); nos pacientes com MFP JAK2V617F positivo, a contagem de leucócitos se mostrou aumentada (P=0,01) em comparação aos outros grupos. Com nossos dados foi possível caracterizar a coorte quanto ao status mutacional e características clínicas, valideo-a de acordo com os critérios preconizados pela OMS, além de mostrar as diferenças clínicas e laboratoriais existentes com base nos marcadores moleculares diagnósticos, dados que irão auxiliar no acompanhamento e conduta terapêutica dos pacientes.
The discovery of JAK2V617F mutation was a hallmark in diagnostic for patients with Myeloproliferative neoplasm (MPN) – Philadelphia (Ph) cromossome negative. Such mutation is present in the majority of patient with policythemia vera (PV) e about 50% of patients with essencial thrombocytemia (ET) e primary mielofibrosis (PMF). Subsequently, other mutations were described in a mutual exclusive manner, such as mutations in éxon 12 of JAK2, in the MPL gene which encoding thrombopoetin receptor e CALR gene. Although the molecular characterization of these patients is meatory for diagnosis proposes, it is unclear if these alterations are responsible for the disease phenotype. Here, we performed the molecular characterization of 260 patients with MPN Ph – negative e correlate these findings with clinical e laboratorial features. JAK2V617F mutation was perform by polymerase chain reaction – restriction fragmente lenght polymorfism with restriction enzyme (BsaXI). Sanger sequencing was applied for screening exon 12 e éxon 9 mutation of JAK2 e CALR gene, respectively. JAK2V617F mutation was identified in 87% (60/69) of patients with PV e 50% (94/189) in those with ET e PMF. The CALR mutation was identify in 42% (37/88) of patients with ET e PMF JAK2V617F negative e to which were also negative for CALR was performed the analisys of MPL. Patients with CALRᵐᵘᵗ ET presented high platelet counts at diagnosis (p=0,002) e lower white blood cells (WBC) counts (p=0,016). Patients with PMF JAK2V617F positive, showed higher WBC counts (P=0,01). In summary, we were able to characterize at molecular level our patients, following the WHO criteria; we hope that with such data, we could provide a more reliable genetic lescape for our patients, which we believe to be translate into better management e therapeutic conduct in our setting.

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Martínez, Avilés Luz. "Clonalidad hematopoyética en la policitemia vera y la trombocitemia esencial y su papel en la transformación mielofibrótica." Doctoral thesis, Universitat Autònoma de Barcelona, 2015. http://hdl.handle.net/10803/323364.

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Abstract:

Las neoplasias mieloproliferativas (NM) son enfermedades clonales originadas en una célula madre hematopoyética caracterizadas por la proliferación de células maduras de una o varias líneas mieloides y que presentan cierto riesgo de progresión a leucemia aguda o a presentar fallo medular debido a la aparición de mielofibrosis, durante la evolución de la enfermedad. En el año 2005 se describió la mutación JAK2V617F que se detecta en el 95% de la Policitemia Vera (PV) y en el 60% de la Trombocitemia Esencial (TE) y la Mielofibrosis Primaria (MFP). Posteriormente, se describieron otros marcadores moleculares implicados en vías de señalización (LNK, SOCS, CBL), en procesos epigenéticos (TET2, ASXL1, IDH1, IDH2, EZH2) o en la maquinaria del splicing del ARN mensajero (SF3B1, SRSF2, U2AF1). En general, estos marcadores se observan en bajos porcentajes en las NM y ninguno es específico de estas enfermedades. Más recientemente, a finales del año 2013, se reportó la presencia de mutaciones en el gen CALR en un 49-84% de las TE y un 67-88% de las MFP JAK2V617F negativas, convirtiéndose en el segundo marcador molecular más frecuente de las NM. Desde su descubrimiento, la mutación JAK2V617F ha sido un criterio para el diagnóstico de las NM clásicas (PV, TE, MFP). Dada su elevada frecuencia, las mutaciones en CALR ya se han propuesto como futuro criterio diagnóstico a incluir en las próximas guías de clasificación de la OMS, mientras que el papel a nivel diagnóstico de otros marcadores es más limitado. Sin embargo, existen varios estudios que reportan que la presencia de alteraciones adicionales a JAK2 o CALR pueden tener un papel en la progresión de la TE o la PV a mielofibrosis o leucemia aguda mieloide. El objetivo principal del trabajo fue identificar si la detección de una hematopoyesis clonal puede tener un papel en la transformación de las NM. Los dos primeros trabajos se basaron en el estudio de una cohorte de pacientes, principalmente con TE JAK2V617F negativos. Lo resultados mostraron que la presencia de alteraciones en nuevos marcadores moleculares como TET2, ASXL1, IDH1/2 y c-CBL son infrecuentes en este grupo de pacientes. También se observó que en la TE JAK2V617F negativa, la detección de clonalidad hematopoyética mediante el análisis del patrón de inactivación del cromosoma X, analizando el polimorfismo del gen HUMARA, se asocia a mayor riesgo de transformación mielofibrótica. Además, aunque los resultados no fueron estadísticamente significativos, se observó cierta tendencia a la asociación entre presentar alteraciones distintas a JAK2V617F y la transformación de la enfermedad. En el tercer trabajo, se realizó un estudio mutacional de nuevos marcadores, en una cohorte de pacientes con mielofibrosis post-trombocitémica (MF post-TE) y mielofibrosis post-policitémica (MF post-PV) y se comparó con el de los pacientes con NM en fase crónica. Los resultados mostraron que la presencia de mutaciones en los genes del spliceosoma son infrecuentes en la TE y PV en fase crónica, y que existe un perfil de mutaciones de los genes de la maquinaria del splicing distinto entre los pacientes con MFP y los pacientes con MF post-TE o MF post-PV. De forma similar, en el grupo de TE y PV con mielofibrosis secundaria, no se pudo demostrar significación estadística entre la presencia de mutaciones adicionales a JAK2 y el riesgo de transformación mielofibrótica. Aun así, cabe destacar que la incidencia de mutaciones era superior en los pacientes evolucionados respecto a los de fase crónica, acorde también a lo descrito en la literatura.
Myeloproliferative neoplasms (MPN) are clonal diseases originated from a hematopoietic stem cell characterized by proliferation of mature cells of one or more myeloid lineages and presenting a risk of progression to acute leukemia or bone marrow failure due to the appearance of myelofibrosis, during the evolution of the disease. In 2005, the JAK2V617F mutation was described in 95% of Polycythemia Vera (PV) and 60% of Essential Thrombocythemia (ET) and Primary Myelofibrosis (PMF) patients. Later, other molecular markers involved in cell signaling pathways (LNK, SOCS, CBL), epigenetic processes (TET2, ASXL1, IDH1, IDH2, EZH2) and in the splicing machinery of messenger RNA (SF3B1, SRSF2, U2AF1) were described. In general, these markers are found in MPN in low percentages and none of them is specific for these diseases. More recently, in late 2013, the presence of mutations in the CALR gene were reported in 49-84% of ET and 67-88% of PMF JAK2V617F negative, becoming the second most frequent molecular marker in MPN. Since its discovery, the JAK2V617F mutation has been a criterion for the diagnosis of classical MPN (PV, ET, PMF). Given its high frequency, mutations in CALR have already been proposed as a diagnostic criteria to be included in the next guide of the MPN WHO’s classification, while the diagnostic relevance of other markers is more limited. However, several studies have reported that the presence of additional alterations to JAK2 or CALR may have a role in the progression of ET and PV to MF or LAM. The main objective of this work was to identify whether the detection of a clonal hematopoiesis may have a role in the transformation of a MPN. The first two works were based on the study of a cohort of patients, mainly with JAK2V617F negative ET. Results showed that the presence of alterations in new molecular markers as TET2, ASXL1, IDH1/2 and c-CBL are infrequent in this group of patients. In addition, it was also observed that the detection of clonal hematopoiesis, by analyzing the X chromosome inactivation pattern (analyzing the HUMARA gene polymorphism), in JAK2V617F negative ET, is associated with an increased risk of myelofibrotic transformation. Moreover, although results were not statistically significant, a tendency to association between the presence of additional alterations to JAK2V617F and transformation of the disease was also observed. In the third study, a mutational study of multiple genes was performed in a cohort of patients with post-thrombocythemic myelofibrosis (post-ET MF) and post-polycythemic myelofibrosis (post-PV MF) and compared with that of patients with chronic phase MPN. Results showed that the presence of mutations in the spliceosome genes are uncommon in ET and PV in chronic phase, and that it exists a different mutational profile in the splicing machinery genes between PMF patients and post-ET MF or post-PV MF patients. Similarly, in the group of ET and PV patients who evolved to MF, statistical significance between the presence of additional mutations to JAK2 and the risk of myelofibrotic transformation could not be demonstrated. However, it was noted that the incidence of mutations in patients with secondary myelofibrosis was higher than in patients with ET or PV in chronic phase, accordingly to what has been previously described.

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Nunes, Natália de Souza. "Expressão dos genes da via mTORC1 e seu envolvimento nas Neoplasias Mieloproliferativas." Universidade de São Paulo, 2016. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/60/60135/tde-06052016-142247/.

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Abstract:

As Neoplasias Mieloproliferativas (NMPs) se caracterizam por apresentarem acúmulo de eritrócitos, leucócitos e plaquetas morfologicamente normais e seus precursores. Nos últimos anos vários estudos buscaram conhecer os mecanismos celulares e moleculares envolvidos na fisiopatologia e evolução dessas desordens, com o intuito de encontrar marcadores de diagnóstico, prognóstico e terapias eficazes. A mutação pontual no gene que codifica a enzima Janus Kinase 2 (JAK2 V617F), presente em aproximadamente 90% dos pacientes com PV e em 50% dos pacientes com TE e MF, foi o principal achado genético anormal associado a essas doenças. Essa mutação resulta na ativação constitutiva da enzima JAK2 e na desregulação da proliferação celular e resistência à apoptose. Nosso grupo de pesquisa descreveu em PV, TE e MF a expressão alterada de genes reguladores da apoptose e dados da literatura indicam que a desregulação do ciclo celular contribui para a fisiopatologia das NMPs. Nesse projeto o intuito foi investigar a associação da via de sinalização m-TOR com as alterações do ciclo celular e via JAK/STAT nas NMPs. A via de sinalização m-TOR participa dos processos celulares de sobrevivência e proliferação. A estratégia experimental foi avaliar a expressão de genes e proteínas, reguladores da via m-TOR, em leucócitos de pacientes com NPMC e linhagens celulares JAK2+ tratadas com inibidores de JAK2 e AKT. Para determinar a relação da via m-TOR nas NMPs foi escolhido o gene eIF4E, alterado nessas doenças, para observar sua modulação diante da inibição farmacológica nas linhagens celulares JAK2 positivas. Os resultados desse estudo contribuem para a descrição de novos alvos terapêuticos dependentes e indepentendes da atividade quinase JAK2 e para o melhor conhecimento da participação da via de sinalização m-TOR na fisiopatologia das NMPs.
The myeloproliferative neoplasms (MNPs) are characterized by accumulation of erythrocytes, leukocytes and platelets morphologically normal and their precursors. In recent years several studies have sought to understand the cellular and molecular mechanisms involved in the pathophysiology and progression of these disorders in order to find diagnostic and prognostic markers and effective therapies. The point mutation in the gene encoding the enzyme Janus kinase 2 (JAK2 V617F), present in approximately 90% of PV patients and in 50% of patients with ET and MF was the main abnormal genetic finding associated with these diseases. This mutation results in constitutive activation of JAK2 enzyme and the deregulation of cell proliferation and resistance to apoptosis. Our research group described in PV, ET and MF altered expression of apoptosis regulatory genes and literature data suggest that deregulation of the cell cycle contributes to the pathophysiology of MNPs. In this project the aim was to investigate the signaling pathway of the association m-TOR with the changes of the cell cycle and JAK / STAT in NMPs. The signaling pathway participates in the m-TOR cell survival and proliferation processes. The experimental strategy was to evaluate the expression of genes and proteins, regulators of m-TOR pathway in leukocytes from patients with and NPMC cell lines treated with the JAK2 JAK2 + and AKT inhibitors. To determine the relationship of m-TOR pathway with MNPs has been selected the eIF4E gene deregulated in these disorders to observe their modulation in pharmacologically inhibited cells lines JAK 2 positive. Results of this study contribute to the description of new therapeutic targets of dependent and independent JAK2 kinase activity and to a better understanding of the signaling pathway of participation m-TOR in the pathophysiology of NMPs.

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Maher, Michael. "An epigenetic approach to fatty acid metabolism in haematological malignancies." Doctoral thesis, Universitat de Barcelona, 2021. http://hdl.handle.net/10803/673704.

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Abstract:

The role of fatty acids to overcome stress and contribute to disease progression is becoming increasingly evident in haematological diseases. Further, epigenetic factors play an important role in the aetiology of myelodysplastic syndromes (MDS) and the transformation to secondary acute myeloid leukaemia (sAML). To investigate this in the MDS/sAML cell line, SKK-1, we employed a shRNA knockdown screen to target 912 epigenetic regulators. We then coupled this loss-of-function approach to a fatty acid metabolism-based assay with which we were able to cell-sort the SKK-1 cells based on the fatty acid uptake. Here I describe the methodology of this epigenetics-metabolism approach and our efforts to validate candidate hits from the screen that were predicted to be modulators of fatty acid uptake. Following testing using single gene knockdowns of the top genes from the screen, we were not able to identify epigenetic regulators that significantly alter fatty acid uptake. In parallel, we characterised metabolic and genetic parameters of triple-sorted low (TS LOW) and high (TS HIGH) fatty acid uptake sub- populations. However, during the course of the study, we discovered latent contamination by another myeloid cell line, U-937, in our SKK-1 parental cells and TS LOW and TS HIGH sub-populations. Therefore, we interpreted results from the characterisation study with the knowledge that we had mixed cellular populations. I describe the steps we took to first identify the cell line and then our further characterisation of single cell clones of TS LOW and TS HIGH. Interestingly, we observed distinct cytogenetic profiles between single clones of TS LOW and TS HIGH, namely trisomy 8, which is a highly relevant chromosomal aberration in myeloid malignancies. Overall, this study provides a novel approach to investigate epigenetic and metabolic interactions in blood malignancies. We also find metabolically distinct sub-populations that differ by a disease-relevant karyotype.

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Marchiani, Mariana. "Estudo do perfil genético de pacientes com Neoplasias Mieloproliferativas (NMP) cromossomo Filadélfia negativo." Universidade de São Paulo, 2016. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/5/5167/tde-02052016-124952/.

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Abstract:

As neoplasias mieloproliferativas (NMPs) Filadelfia negativo como a policitemia vera (PV), trombocitemia essencial (TE) e mielofibrose primária (MFP) são desordens clonais da célula tronco hematopoiética caracterizadas pela produção excessiva de células mielóides diferenciadas. Este fenômeno ocorre devido à uma mutação somática (JAK2V617F) que ativa a via JAK-STAT de transdução de forma constitutiva. Esta mutação é mais frequente na PV, ocorrendo em 95% dos casos, e em 50% dos casos de TE e MFP. Outro defeito genético que ocorre é a mutação no receptor de trombopoetina, MPL. As mutações em MPL podem ser germinativas ou somáticas e menos de 10% dos pacientes com TE e MFP apresentam essa alteração genética. Entretanto, grande parte dos pacientes com TE e MFP que não apresentam mutação em JAK2V617F ou MPL podem apresentar mutações somáticas no gene CALR. Em adição às mutações somáticas que causam mieloproliferação, outras alterações genéticas em genes que funcionam como reguladores epigenéticos são encontrados nas NMPs nos genes TET2, IDH1, IDH2 e ASLX1. Objetivo: Estabelecer um perfil genético em pacientes com NMP através da avaliação de mutações nos genes JAK2, CALR, MPL, IDH1, IDH2, TET2 e ASXL1 assim como estabelecer uma correlação laboratorial destas na PV, TE e MFP. Casuística e Métodos: Foram utilizadas amostras de sangue periférico de 104 pacientes que foram enviadas para o Laboratório de Biologia Tumoral do Serviço de Hematologia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo para avaliação diagnóstica. Quinze dos 104 pacientes são de pacientes com PV (14,4%), 20/104 (19,2%) com MFP, 20/104 (19,2%) com TE e 49/104 (47,1%) com outras doenças hemtológicas. Foi feita a avaliação da prevalência de mutações somáticas, seja por sequenciamento ou análise de fragmentos, nos genes JAK2 (exon 12 e Y931C), MPL, IDH1, IDH2, CALR, TET2 e ASXL1. PCR-RFLP foi realizada para identificação de mutações em JAK2V617F. Resultados: A mutação JAK2V617F foi observada em 30 (28,8%) pacientes (12 PV, 11 TE e 7 MFP), a mutação JAK2 exon 12 foi observada em apenas um (0,96%) paciente com PV, mutação JAK2Y931C em 4 (3,8%) pacientes (1 PV, 2 TE e 1 MFP) e 8 (7,7%) pacientes apresentaram mutações em CALR (3 TE e 5 MFP). Mutações nos genes epigenéticos como IDH1 foram observadas em 9 (8,7%) pacientes (2 TE, 2 MFP, 1 SMD, e 4 pacientes com suspeita de NMP), mutações em IDH2 estão presentes em 5 (4,8%) pacientes (2 TE, 1 SMD/leucemia e 4 pacientes com suspeita de NMP), mutações em ASXL1 foram identificadas em 13 (12,5%) pacientes (1 PV, 3 TE, 2 MFP, 3 SMD/leucemias e 4 com suspeita de NMP) e finalmente, mutações em TET2 foram encontradas em 33 (31,7%) pacientes (3 PV, 5 TE, 4 MFP, 8 SMD/leucemias e 13 pacientes com suspeita de NMP). Além disso, no caso da PV, os pacientes que apresentam mutações em JAK2V617F apresentam valores aumentados de plaquetas (mediana de 5,41 x 105/mm3 plaquetas) em relação aos pacientes sem a mutação (mediana de 2,06 x 105/mm3 plaquetas), com diferença estatística (p=0,031). Pacientes do mesmo grupo que apresentam mutações em TET2 apresentam, opostamente aos com mutações em JAK2V617F, menores valores de plaquetas (mediana de 1,75 x105/mm3 plaquetas) em relação aos pacientes sem mutações no gene TET2 (mediana de 5,41 x 105/mm3 plaquetas), com diferença estatística (p=0,048). No caso da MFP, os pacientes que apresentam mutações em JAK2V617F apresentam valores maiores de leucócitos (mediana de 1,09 x104/mm3 leucócitos) do que os pacientes que não apresentam a mutação (mediana de 6,99 x103/mm3 leucócitos) com diferença estatística (p=0,046), já os pacientes que apresentam mutações no gene ASXL1 apresentam valores menores de hemácias (mediana de 2,43 x106/mm3 hemácias) em relação aos pacientes que não apresentam mutação (mediana de 3,71 x106/mm3 hemácias) com diferença estatística (p=0,042). Conclusão: O trabalho permitiu fornecer um perfil genético dos pacientes com NMP estudados. Além disso, é possível observar que algumas mutações epigenéticas podem influenciar em diferenças clínicas
Myeloproliferative neoplasms (MPNs) Philadelphia (Ph) chromosome negative, such as polycythemia vera (PV), essential thrombocythemia (ET) and primary myelofibrosis (PMF) are clonal disorders of hematopoietic stem cell characterized by increased proliferation of differentiated myeloid cells. This phenomenon occurs due somatic mutation (JAK2V617F) that constitutively stimulates the JAK-STAT signaling pathway. This mutation is more frequent in PV, around 95%, and between 50% in ET and PMF. Other genetic aberration can be observed in the thrombopoietin (TPO) receptor MPL. Mutations in MPL can be in the germline line or somatic and less than 10% of patients with TE or PMF would harbor this genetic alteration. Otherwise, patients with TE or PMF without JAK2V617F or MPL mutation could present somatic mutations in calreticulin (CALR). In addition to somatic mutations that cause myeloproliferation, other genetic alterations that function as epigenetic regulators were identified in genes as TET2, IDH1, IDH2 e ASLX1 in MPN. Objective: Establish genetic profile in patients with diagnosis of PV, ET, and PMF through genetic alterations in the following genes: JAK2, MPL, CALR, IDH1, IDH2, TET2 e ASXL1, and correlate those alterations with demographic characteristic of the study population. Casuistic and Methods: Peripheral blood samples from 104 patients referred to the Tumor Biology Laboratory of the Department of Hematology of Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo for diagnostic investigation were analyzed. Fifteen out 104 samples were from PV patients (14.4%), 20/104 (19.2%) in PMF, 20/104 (19.2%) in ET and 49/104 (47.1%) with other hematologic diseases. Identification of somatic mutations was made, either by direct sequencing or fragment analysis in JAK2 (exon 12 and Y931C), MPL, IDH1, IDH2, CALR, TET2 and ASXL1. PCR-RFLP was performed to identify JAK2V617F mutation. Results: JAK2V617F mutation was observed in 30 (28.8%) patients (12 PV, 11 ET and 7 PMF), JAK2 exon 12 in only one (0.96%) patient with PV, JAK2Y931C in 4 (3.8%) patients (1 PV, 2 ET and 1 PMF), and 8 patients (7.7%) presented CALR mutation (3 ET and 5 PMF). Mutations in the epigenetic genes as IDH1 were observed in 9 (8.7%) patients (2 ET, 2 PMF, 1 MDS and 4 patients with suspected MPN), IDH2 mutations were present in 5 (4.8%) patients (2 ET, 1 MDS/leukemia, and 4 patients with suspected MPN), ASLX1 mutations were identified in 13 (12.5%) patients (1 PV, 3 ET, 2 PMF, 3 MDS/leukemia and 4 with suspected MPN) and finally, TET2 mutations were present in 33 (31.7%) patients (3 PV, 5 ET, 4 PMF, 8 MDS/leukemia, and 13 with suspected MPN). In addition, patients with PV who harbor JAK2V617F have increased platelet counts (median 5.41 x 105/mm3 platelets) compared to those without the mutation (median 2.06 x 105/mm3 platelets, p=0.031). Patients in the same group with TET2 mutation, as opposed to those with JAK2V617F, presented low platelets counts (median of 1.75 x 105/mm3 platelets) compared to those without TET2 mutation (median 5.41 x 105/mm3 platelets, p=0.048). Presence of JAK2V617F in patients diagnosed with PMF have a greater number of leukocytes (median 1.09 x104/mm3 leukocytes) when compared to patients without the mutation (median 6.99 x 103/mm3 leukocytes, p=0.046). Patients with PMF who presented mutations in ASXL1 gene have a lower number of red blood cells (median of 2.43 x 106/mm3) compared to patients without mutations in the same gene (median 3.71 x 106/mm3, p=0.042). Conclusion: The present study allows us to provide a genetic profile of patients with MPN. Furthermore, it is possible to observe that some epigenetic mutations could influence in some clinical differences

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Rodrigues, Leane Perim. "An??lise de microves??culas purificadas do plasma de pacientes com mielofibrose quanto a presen??a de miRNAs e quanto ao impacto na migra????o de c??lulas-tronco mesenquimais." Universidade Cat??lica de Bras??lia, 2017. https://bdtd.ucb.br:8443/jspui/handle/tede/2286.

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Myelofibrosis is a hematological disease inserted in the group of myeloproliferative neoplasias. It has as main characteristic fibrosis of the bone marrow, consequence of a variety of histological changes presented in the medullary microenvironment. The pathophysiology of myelofibrosis involves the activation of signal transduction pathways and nowadays several mutations such as JAK2V617F, CalR and MPL have been associated with this process. Recent studies have shown that microvesicles produced by body cells may be associated with the cellular communication process. These microvesicles carry in their content proteins, lipids and RNA capable of regulating diverse cellular processes. The literature shows that several miRNAs present in the microvesucular content can regulate the hematopoiesis of normal stem cells and also of compromised progenitors, having an important role in the pathogenesis of some acquired hematological neoplasias such as myeloproliferative diseases. With the objective of investigating the presence of specific miRNAs in microvesicles excreted in the peripheral blood plasma of patients with myelofibrosis, microvesicles were isolated from the plasma by ultracentrifugation and by means of molecular biology techniques it was possible to validate the presence of these microbes. Real-time PCR assays were performed to evaluate the expression of specific miRNAs (miR-146b, miR-221, miR-143 and miR-150) in the microvesic contents. In order to analyze the functional activity of MVs, the cell migration assay was performed, aiming at the progression of pathology and tumor invasiveness. The results show that there is no increase in the microvesicular concentration in peripheral blood when comparing the group of patients with the control group. The data found show that miR-146b and miR-150 are differentially expressed in patients with myelofibrosis, being little expressed. However, miR-221 and miR-143 didn???t show amplification in the technique, which leads to the conclusion that these miRNAs are specific to the medullary microenvironment or aren???t released in the microvesicular content. Regarding the migration test, the result shows that there was no influence of the microvesicles in the process of cell proliferation and migration and it can be considered that the microvesicles isolated in our study may not present this role because they are not exclusively of the bone marrow environment. As future prospects, assays with microvesicles removed from the bone marrow can be performed.
A Mielofibrose ?? uma doen??a hematol??gica inserida no grupo de neoplasias mieloproliferativas. Possui como principal caracter??stica a fibrose da medula ??ssea, consequ??ncia de uma variedade de mudan??as histol??gicas apresentadas no microambiente medular. A fisiopatog??nese da Mielofibrose envolve a ativa????o de vias de transdu????o de sinais e nos ??ltimos anos v??rias muta????es como a JAK2V617F, a CalR e a MPL foram associadas a doen??a. Estudos recentes demonstraram que microves??culas produzidas por c??lulas do organismo podem estar associadas ao processo de comunica????o celular. Estas microves??culas transportam em seu conte??do prote??nas, lip??dios e RNA capazes de regular variados processos celulares. A literatura mostra que diversos miRNAs presentes no conte??do microvesucular podem regular a hematopoiese de c??lulas-tronco normais e tamb??m de progenitores comprometidos, tendo um papel importante na patog??nese de algumas neoplasias hematol??gicas adquiridas como as doen??as mieloproliferativas. Com objetivo de investigar a presen??a de miRNAs espec??ficos em microves??culas excretadas no plasma de sangue perif??rico de pacientes portadores de mielofibrose, microves??culas foram isoladas do plasma por m??todo de ultracentrifuga????o e por meio de t??cnicas de biologia molecular foi poss??vel confirmar a presen??a destas. Ensaios com PCR em tempo real foram realizados afim de avaliar a express??o de miRNAs espec??ficos (miR-146b, miR-221, miR-143 e miR-150) no conte??do das microves??culas e para analisar a atividade funcional das M.Vs foi realizado o ensaio de migra????o celular que visa avaliar progress??o da patologia e a invasividade tumoral. Os resultados obtidos mostram que n??o h?? aumento da concentra????o microvesicular em sangue perif??rico quando comparado o grupo de pacientes com o grupo controle. Os dados encontrados mostram que o miR-146b e o miR-150 apresentam-se diferencialmente expressos em pacientes com mielofibrose, com pouca express??o. J?? o miR-221 e o miR-143 n??o apresentaram detec????o na t??cnica, o que o que leva a concluir que estes miRNAs s??o pr??prios do microambiente medular ou n??o s??o liberados no conte??do microvesicular. Quanto a ensaio de migra????o o resultado mostra que n??o houve influ??ncia das microves??culas no processo de prolifera????o e migra????o celular e pode ser considerado que as microves??culas isoladas em nosso estudo podem n??o apresentar este papel por n??o serem exclusivamente do ambiente medular. Como perspectivas futuras, ensaios com microves??culas retiradas da medula ??ssea poder??o ser realizados.

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Santos, Leonardo Caires dos [UNIFESP]. "Estudo citogenético e pesquisa de mutações nos genes JAK2 e MPL em Policitemia vera, Mielofibrose primária e Trombocitemia essencial." Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2010. http://repositorio.unifesp.br/handle/11600/9496.

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Abstract:

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:04Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-06-30
Objetivos: Descrever as alteracoes cromossomicas em policitemia vera (PV), trombocitemia essencial (TE) e mielofibrose primaria (MF). Verificar se a taxa de anormalidades cromossomicas e ampliada pela FISH nos casos com cariotipo normal e ausencia de metafases. Detectar a incidencia da mutacao JAK2 V617F em PV, TE e MF; de mutacoes no exon 12 do JAK2 em PV e de mutacoes MPL W515K/L em TE e MF. Correlacionar as alteracoes citogeneticas e moleculares encontradas com o grau de fibrose medular nos casos de MF; numero de leucocitos, plaquetas, hemoglobinas; e idade, ao diagnostico, em todos pacientes. Metodo: O estudo foi realizado em 20 casos de PV, 17 de TE e 21 de MF. O cariotipo por banda G foi realizado em amostras de medula ossea, semeadas em cultura de curta duracao (24h), sem mitogenos e processadas de forma habitual (Chauffaille, 2006). Parte da amostra (1mL) foi destinada a FISH, com sondas para as regioes: 20q12, 20q13.12, 13q14.3, 13qter (subtelomerica), 8p11.1-q11.1 (ƒ¿-satellite) e 9q12 (satellite III). A pesquisa das mutacoes JAK2V617F e MPL W515K/L foi realizada em DNA de sangue periferico, por PCR em tempo real, utilizando-se o kit JAK2 MutaScreenTM (Ipsogen). A pesquisa de mutacoes no exon 12 do JAK2 foi realizada por sequenciamento direto. Resultados: As alteracoes cromossomicas foram observadas em 11,8% das PV, 17,6% das MF e nenhuma das TE, nao havendo relacao entre dados clinicos avaliados e alteracoes cromossomicas. As anormalidades cromossomicas nao foram ampliadas pela FISH. JAK2 V617F foi observada em 90% das PV, 42,8% das MF e 47% das TE. Os pacientes com PV JAK2 V617F negativos apresentaram menores niveis de plaquetas em relacao aos PV V617F positivos (p<0,0001). MF V617F positivos apresentaram maiores graus de fibrose do que os V617F negativos (p=0,003). Nao foi detectada a presenca de mutacoes no exon 12 do JAK2 em pacientes com PV. MPL W515L foi observada em um caso de MF e em um de TE. Nao foi encontrada a mutacao MPL W515K nos pacientes com TE e MF. A paciente com TE MPL W515L positivo nao apresentou quadro clinico diferente dos demais pacientes com TE, enquanto que a paciente com MF MPL W515L positivo apresentou quadro clinico mais agressivo quando comparada aos demais pacientes com MF. O numero de alteracoes clonais nao mostrou diferenca quanto aos dados clinicos avaliados. Conclusoes: Os diferentes tipos de alteracoes clonais em neoplasias mieloproliferativas exaltam seus diferentes mecanismos fisiopatogenicos, auxiliando no diagnostico e compreensao da biologia destas doencas. Este estudo permitiu a caracterizacao citogenetica e molecular de PV, MF e TE.
Introcuction: Polycythemia vera (PV), essential thrombocythemia (ET) and myelofibrosis (MF) are clonal disorders of hematopoietic stem cell and clinical and biological aspects have in common that hinder their diagnosis, however, cytogenetic and molecular studies represent important tools to assist in this procedure. Therefore, the investigation of the presence of JAK2 V617F, mutations in exon 12 of JAK2, MPL W515K of MPLW515L and cytogenetic alterations per karyotype and FISH can provide a more detailed view for the diagnosis and prognosis of these diseases. In this study such cytogenetic and molecular changes were correlated with degree of fibrosis in cases of MF, the number of leukocytes, platelets, hemoglobin and age at diagnosis in PV, ET and MF Method: The karyotype by G-band was performed on samples of bone marrow, grown in culture for short duration (24h) without mitogens and processed as usual (Chauffaille, 2006). The sample (1 ml) was intended to FISH with probes for the regions: 20q12, 20q13.12, 13q14.3, 13qter, 8p11.1-q11.1 and 9q12. The investigation of JAK2 V617F and MPL W515K/L mutations was performed on DNA from peripheral blood by real time PCR, using the kit MutaScreenTM JAK2 (IPSOGEN). The search for mutations in exon 12 of JAK2 was performed by direct sequencing. Results: Chromosomal abnormalities were observed in 11.8% of PV, 17.6% of MF and none of the ET, no relation between clinical data and assessed chromosomal alterations. Chromosomal abnormalities were not amplified by FISH. JAK2 V617F was observed in 90% of PV, 42.8% of MF and 47% of ET. Patients with JAK2 V617F negative PV showed lower levels of platelets in relation to V617F positive PV (p <0.0001). MF V617F negative and MPL W515L positive showed higher degrees of fibrosis than V617F negative (p =0.003). Was not detected the presence of mutations in exon 12 of JAK2 in PV patients. MPL W515L was observed in a case of MF and a TE. No MPL W515K mutation was found in patients with ET and MF. The ET patient MPL W515L positive showed no clinical different from other patients with ET, whereas the patient with MF MPL W515L showed positive clinical more aggressive when compared to other patients with MF. The number of clonal abnormalities showed no difference in the clinical data evaluated. Conclusions: Different types of clonal abnormalities in myeloproliferative neoplasms exalt their different pathophysiological mechanism, aiding in the diagnosis and understanding of the biology of these diseases. This study allowed the cytogenetics and molecular characterization of PV, MF and ET.
TEDE
BV UNIFESP: Teses e dissertações

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SILVA, Juan Luiz Coelho da. "Impacto clínico e laboratorial de mutações no gene ASXL1 em pacientes com neoplasias mieloproliferativas." Universidade Federal de Pernambuco, 2016. https://repositorio.ufpe.br/handle/123456789/19535.

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Abstract:

Submitted by Fabio Sobreira Campos da Costa (fabio.sobreira@ufpe.br) on 2017-07-12T15:39:14Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) Dissertação Juan Luiz Coelho da Silva.pdf: 2693101 bytes, checksum: b946d507d9f21698d6349e8ecf91e259 (MD5)
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FACEPE
Algumas evidências destacam mutações no gene ASXL1 como um evento importante na evolução clínica de pacientes com neoplasias hematológicas, particularmente em leucemias mieloides agudas e síndrome mielodisplásicas. Contudo, seu impacto prognóstico em neoplasias mieloproliferativas (NMP) ainda é pouco explorado. Aqui, nós caracterizamos 208 pacientes com NMP cromossomo Filadélfia (Ph) negativo (policitemia vera, PV; trombocitemia essencial, TE; mielofibrose primária, MFP), de acordo com mutações no gene ASXL1, e correlacionamos esses achados com características clinico-laboratoriais desses pacientes. A pesquisa das mutações foi realizada por sequenciamento sanger, em que polimorfismos germinativos e mutações sinonímias foram excluídas das análises. Mutações no ASXL1 foram detectadas em 22/208 pacientes (10%), das quais quatro foram observadas em pacientes com PV (4/54; 7%), onze em pacientes com TE (11/123; 9%) e sete com MFP (7/31; 22%). As características clínicas e laboratoriais foram similares entre pacientes com ASXL1 mutado e não mutado. Quando as entidades foram avaliadas individualmente (PV, TE e MFP), observou-se associação entre mutações no ASXL1 e idade mais avançada em pacientes com TE (P = 0,049) e desenvolvimento de esplenomegalia em pacientes com MFP (P = 0,026). Com uma mediana de seguimento de 5,1 anos (IC95%: 4,5 a 7,3 anos), 136 pacientes (65%) desenvolveram algum tipo de manifestação clínica, sendo o desenvolvimento de complicações vasculares o mais frequente (n=54; 26%), seguido por esplenomegalia (n=47; 22%), eventos hemorrágicos (n=30; 14%) e trombose (n=21; 10%). Mutações no gene ASXL1 não foram associadas com o desenvolvimento das referidas manifestações. Dentro deste seguimento, apenas dois pacientes evoluíram para síndrome mielodisplásica e um para leucemia mieloide aguda, todos sem mutações no gene ASXL1.
Accumulating evidences report mutation in ASXL1 as an important predictor to clinical outcomes of patients with hematological malignancies, particularly acute myeloid leukemia and myelodysplastic syndrome. However, the prognostic impact in myeloproliferative neoplasm (MPN) remains underexplored. Here, we evaluated clinical and laboratory features of 208 Philadelphia negative MPN patients (polycythemia vera, PV; essential thrombocythemia, ET; primary myelofibrosis, PMF), according to mutations in ASXL1. Screening for ASXL1 mutations were performedby Sanger sequencing. Germline variations were excluded. ASXL1 mutations were detected in 22/208 patients (10%), of which four in PV patients (4/54-7%), 11 in ET patients (11/123-9%) and seven in PMF (7/31-22%). Baseline features were similar between ASXL1-mutated and non-mutated patients. Evaluated individually (PV, ET, PMF), we observed that ET patients harboring ASXL1 mutations were older (P = 0,049) than ASXL1 non-mutated patients. Similarly, PMF patients presented higher frequency of splenomegaly in ASXL1mutated group (P = 0,026). No other features were associated with ASXL1mutations. The median follow-up was 5,1 years (CI95%: 4,5-7,3 years). One hundred and thirty six patients (65%) developed some of the clinical common manifestations, which the most frequent was vascular complications (n=54; 26%), followed by splenomegaly (n=47; 22%), bleeding (n=30;14%) and thrombosis (n=21;10%). ASXL1 mutations were not associated with development of such events. In our cohort, only two patients have evolved for myelodysplastic syndrome and one for acute myeloid leukemia, all of them without mutations in ASXL1.

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Álvarez, Larrán Alberto. "Papel de la activación leucocitaria y plaquetaria en la trombosis de los síndromes mieloproliferativos crónicos." Doctoral thesis, Universitat de Barcelona, 2008. http://hdl.handle.net/10803/2245.

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Abstract:

INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS:

La causa fundamental de la trombosis en la policitemia vera y la trombocitemia esencial es el aumento de la viscosidad sanguínea secundaria a la eritrocitosis así como el incremento del número de plaquetas y las alteraciones funcionales de las mismas. Sin embargo, estudios recientes sugieren un posible papel al respecto de los granulocitos. Se desconoce si, al igual que en la PV y la TE, los pacientes con mielofibrosis primaria tienen un riesgo aumentado de trombosis. El objetivo de la presente tesis consiste en analizar la activación de los granulocitos, las plaquetas y la interacción leucocito-plaqueta en pacientes con SMPC con y sin trombosis a fin de contribuir al conocimiento de los mecanismos que intervienen en la patogenia de la trombosis en dichos enfermos.
En este contexto, nos planteamos realizar tres trabajos de investigación con los siguientes objetivos:

1. Analizar la activación de los granulocitos y la interacción leucocito-plaqueta en pacientes con PV, con y sin trombosis del eje esplenoportal o síndrome de Budd-Chiari, a fin de contribuir al conocimiento de los mecanismos que intervienen en la patogenia de la trombosis en dichos enfermos.

2. Determinar la incidencia de trombosis en los pacientes con MFP, comparándola con la de la población general, y analizar los factores de riesgo para su aparición.

3. Investigar si los pacientes con MFP presentan una activación leucocitaria, plaquetaria, endotelial y de la coagulación similar a la existente en la PV y la TE.

4. Determinar si en la MFP la posible sobreexpresión de dichos parámetros de activación se correlaciona con la presencia de la mutación del gen JAK2.

RESUMEN TRABAJO 1:

La policitemia vera (PV) se caracteriza por una intensa proliferación de la serie eritroide y, a veces, de la megacariocítica y granulocítica, siendo las complicaciones trombóticas la causa fundamental de morbilidad y mortalidad en estos pacientes. Dentro de las trombosis de la PV, las que afectan a las venas suprahepáticas (síndrome de Budd-Chiari, SBC) o a las del eje esplenoportal (TP) se encuentran entre las complicaciones más graves de la enfermedad, siendo, de hecho, la PV la principal causa de este tipo de trombosis.
La causa fundamental de la trombosis en la PV es el aumento de la viscosidad sanguínea, debido al incremento en el número de hematíes y plaquetas, junto a las alteraciones funcionales de éstas. Sin embargo, estudios recientes sugieren un posible papel de los granulocitos. Así, se ha descrito un aumento de la activación leucocitaria en los pacientes con PV, demostrado por un incremento en la expresión del antígeno CD11b en la membrana de los neutrófilos y de la fosfatasa alcalina granulocitaria, así como del contenido de elastasa celular y plasmática. En estos enfermos se observó asimismo un aumento de ciertos marcadores plasmáticos de hipercoagulabilidad, en concreto, el complejo trombina-antitrombina, el fragmento 1+2 de la protrombina (F1+2) y el dímero-D.
Con la finalidad de dilucidar los mecanismos involucrados en la génesis del SBC y la TP de los pacientes con PV, en el presente trabajo de investigación se estudió la expresión de CD11b granulocitario, el metabolismo oxidativo de los neutrófilos y el porcentaje de complejos leucocito-plaqueta circulantes en 17 pacientes afectos de PV que habían presentado SBC o TP. Como grupos control se estudiaron 16 pacientes con PV sin ningún antecedente de trombosis, 20 pacientes con SBC/TP en los que se había descartado la existencia de un síndrome mieloproliferativo crónico concomitante y 20 individuos sanos. Los resultados obtenidos mostraron que la expresión del antígeno CD11b granulocitario, el metabolismo oxidativo de los neutrófilos y el porcentaje de complejos leucocito-plaqueta circulantes eran significativamente más altos en los pacientes con PV que en los pacientes sin síndrome mieloproliferativo o los controles sanos. Además, la expresión de CD11b granulocitario, tanto basal como tras estímulo con F-MLP, fue significativamente más elevada en los pacientes con PV y trombosis que en los pacientes con PV sin trombosis. Estos resultados sugieren que la activación leucocitaria, y en concreto la sobreexpresión del antígeno CD11b, pueden desempeñar un papel en la patogenia del SBC y la TP en la PV.

RESUMEN TRABAJO 2:

La policitemia vera (PV), la trombocitemia esencial (TE) y la mielofibrosis primaria (MFP) son síndromes mieloproliferativos crónicos cromosoma Filadelfia negativos que comparten ciertas características clínicas y biológicas. En este sentido, el reciente descubrimiento de la mutación V617F del gen JAK2 en el 95% de los pacientes con PV y en la mitad de los enfermos con TE y MFP ha venido a apoyar la agrupación de estas tres entidades en una posición nosológica común.
Desde el punto de vista clínico, dos de estos SMPC, la PV y la TE, se asocian a un riesgo aumentado de trombosis, siendo las complicaciones trombóticas la principal causa de morbilidad y mortalidad en estos pacientes. Así, en torno al 40% de los pacientes con PV y al 30% de los enfermos con TE presentan trombosis, bien en el momento del diagnóstico o a lo largo de la evolución de la enfermedad.
Con respecto a la MFP, no existen trabajos realizados en series amplias en los que se haya estudiado de forma específica la incidencia real de trombosis y los factores de riesgo asociados a la aparición de dicha complicación. A partir de estudios realizados en series de escaso tamaño y de la observación de que los pacientes con MFP podían presentar trombosis tras la esplenectomía, algunos autores han sugerido que los pacientes con MFP podrían tener un mayor riesgo de trombosis. Sin embargo, el aumento en la incidencia de trombosis podría estar en relación con la edad avanzada de la mayoría de los pacientes con MFP, por lo que podría no existir una diferencia real con respecto a la población general. Por otro lado, se ha referido en la MFP que la presencia de la mutación V617F de JAK2 se asocia a un mayor riesgo trombótico, lo cual sugiere que, al igual que en la PV y la TE, los mecanismos involucrados en la patogénesis de la trombosis descritos en estas enfermedades también podrían intervenir en la MFP.
El objetivo del presente estudio fue determinar la frecuencia y el tipo de trombosis en la MFP, así como los factores asociados a su aparición. Para ello se revisaron las historias clínicas de 155 pacientes diagnosticados de forma consecutiva en el servicio de Hematología del Hospital Clínic. Con un seguimiento mediano de 4,2 años, se observaron un total de 31 complicaciones trombóticas (19 arteriales y 12 venosas) en 18 pacientes. En 6 enfermos la trombosis fue simultánea al diagnóstico de MFP o la precedió en pocos meses, mientras que en 14 la trombosis constituyó una complicación que apareció en el curso evolutivo de la enfermedad. Con respecto a la población general, los pacientes con MFP presentaron un riesgo significativamente incrementado de presentar trombosis venosa profunda y accidentes vasculares cerebrales. La trombocitosis, la presencia de factores de riesgo cardiovascular y la fase celular de la mielofibrosis fueron las variables que se asociaron de forma significativa a un riesgo mayor de trombosis en el análisis multivariado. La probablidad actuarial de trombosis a los 5 años fue del 9,6% para la serie global, 19,4% para los pacientes con plaquetas > 450x109/L, 17,4% para los pacientes con algún factor de riesgo vascular y 14,9% para los pacientes con mielofibrosis en fase celular. Estos resultados indican que los pacientes con MFP presentan un riesgo incrementado de desarrollar complicaciones trombóticas, siendo el riesgo más alto en las formas hiperproliferativas de la enfermedad y en los pacientes con factores de riesgo cardiovascular.

RESUMEN TRABAJO 3:

En la PV y la TE se ha demostrado la existencia de un aumento en los marcadores de activación leucocitaria y plaquetaria, correlacionándose el grado de activación de algunos de estos marcadores con la presencia de la mutación V617F de JAK2 y el antecedente de trombosis. El hecho de que las tres enfermedades compartan una etiopatogenia común, a partir de la adquisición de la mutación de JAK2, y que recientemente hayamos descrito que en la MFP existe también un aumento de complicaciones trombóticas sugieren que en esta enfermedad podría existir asimismo una sobreexpresión de dichos marcadores de activación. Con la finalidad de determinar si en la MFP existe un aumento en la activación leucocitaria, plaquetaria, endotelial y de la coagulación, se estudió una cohorte constituida por 26 pacientes afectos de MFP y un grupo control formado por 22 sujetos sanos. Las parámetros evaluados incluyeron la determinación de la P-selectina (basal y tras estímulo con agonistas plaquetarios), la expresión del antígeno CD11b granulocitario, los complejos leucocito-plaqueta circulantes y la concentración plasmática de P-selectina, CD40L, factor tisular, trombomodulina, fragmento 1+2 de la protrombina (F1+2) y dímero-D.
Los pacientes con MFP mostraron una expresión de P-selectina basal más elevada y un porcentaje mayor de complejos monocito-plaqueta que los controles sanos, siendo las diferencias estadísticamente significativas. La expresión de CD11b en neutrófilos y monocitos fue significativamente más alta en los pacientes con MFP JAK2 positiva que en los pacientes con MFP JAK2 negativa o en los controles. Además, la concentración plasmática de trombomodulina y de F1+2 fue significativamente más alta en la MFP que en los individuos sanos, mostrando, a su vez, los pacientes con la mutación un valor de F1+2 significativamente mayor que los pacientes sin la mutación. De los anteriores resultados se puede concluir que los pacientes con MFP presentan parámetros de activación leucocitaria, plaquetaria, endotelial y de la coagulación similares a los observados en la PV y la TE y que algunos de estos parámetros se correlacionan con la presencia de la mutación V617F del gen JAK2.

CONCLUSIONES:

1. La expresión del antígeno CD11b granulocitario está notablemente incrementada en los pacientes con PV que presentan síndrome de Budd-Chiari o trombosis del eje esplenoportal. Dicha alteración podría intervenir en la patogenia de la trombosis de la PV al facilitar la adhesión de los granulocitos al endotelio y las plaquetas.

2. En comparación con la población general, los pacientes con MFP presentan un riesgo aumentado de presentar trombosis venosas profundas e infarto cerebral.

3. En los sujetos con MFP el riesgo de trombosis es mayor en aquellos con formas hiperproliferativas de la enfermedad y en los que presentan factores de riesgo cardiovascular concomitantes.

4. Los pacientes con MFP presentan datos de activación leucocitaria, plaquetaria, endotelial y de la coagulación similares a los previamente descritos en los enfermos con PV y TE.

5. En la MFP la presencia de la mutación V617F del gen JAK2 se asocia a una sobreexpresión del antígeno CD11b y a una concentración plasmática elevada del fragmento 1+2 de la protrombina.

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Leal, Cristina Tavares. "Identificação da família BCL2 como alvo terapêutico no tratamento das neoplasias mieloproliferativas associadas à mutação da JAK2V617F." Universidade de São Paulo, 2017. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17154/tde-06042018-114114/.

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Abstract:

As neoplasias mieloproliferativas (NMPs) negativas para o rearranjo t(9;22)/BCRABL1, incluindo Policitemia Vera (PV), Trombocitemia Essencial (TE) e Mielofibrose Primária (MFP), são doenças hematopoéticas clonais e estão frequentemente associadas à mutação JAK2V617F. Apesar dos avanços no conhecimento da fisiopatologia após a descoberta da mutação JAK2V617F e do desenvolvimento de inibidores da JAK2, o tratamento permanece não curativo. Sabe-se que as célulastronco mais primitivas nas NMPs são responsáveis pela iniciação da doença e que a expansão dos precursores mieloeritróides contribui para o fenótipo clínico. Dados recentes obtidos com ensaios in vitro mostram que as proteínas da família BCL2, reguladoras da apoptose mitocondrial, desempenham um papel relevante na patogênese das NMPs. Acreditamos que a expressão anômala de BCL2 nas células progenitoras hematopoéticas (CPH) das NMPs pode contribuir para a patogênese desse grupo de doenças. Avaliamos a expressão gênica, por meio de PCR em Tempo Real, da família BCL2 (genes antiapoptóticos BCL-xL e BCL2 e o pró-apoptótico BIM) nas diferentes subpopulações de progenitores hematopoéticos murinos (de um modelo condicional knockin de expressão heterozigótica condicional da Jak2V617F) e de pacientes portadores de NMPs bem como sua contribuição para o fenótipo da doença e resposta ao inibidores da JAK2 (com a droga ruxolitinibe) e/ou inibição da família BCL2 (com o inibidor de BCL2 obatoclax). Não encontramos diferença de expressão basal dos genes BCL2, BCL-xL e BIM nas células CD34+ bem como nas subpopulações de células CD34+38-/+ de pacientes com NMPs, independente da presença da mutação JAK2V617F, em relação às células CD34+ e subpopulações CD34+38-/+ dos controles (p>0.05). Nas células CD34+ de pacientes com TE encontramos aumento de expressão de BCL2 em relação às células CD34+ pacientes com MFP (p=0.03). No modelo transgênico de camundongos Jak2 wt/VF (que apresentam uma NMP semelhante à PV) e Jak2 wt/wt (controles), comparamos a expressão diferencial dos genes da família Bcl2 em precursores hematopoéticos imaturos (LSKs) e progenitores mieloides mais maduros (MPs). A expressão do BclxL em MPs de camundongos wt/VF foi maior em relação à subpopulação de células LSKs e em relação as duas subpopulações de células dos controles (p=0.0011). Não houve diferença significativa de expressão do Bcl2 nas subpopulações de células LSKs e MPs de animais wt/VF e wt/wt (p=0.12). Observou-se menor expressão de Bim em LSKs em relação às células MPs dos animais mutados (p=0.026), diferença essa não observada entre os controles Jak2 wt/wt. O tratamento isolado com inibidor de JAK2 ou de BCL2 resultou em aumento de expressão do Bim nas CPH (LSKs e MPs) de camungongos Jak2 wt/VF em relação aos animais Jak2 wt/wt. Este aumento da expressão de Bim foi ainda mais evidente após o tratamento das células com a combinação das duas drogas quando comparadas às células não tratadas ou tratadas com um dos dois inibidores, sendo maior em animais doentes do que em animais controles (p<0.0001). A análise do efeito do tratamento com os inibidores de JAK2 e BCL2 na indução de apoptose por meio de citometria de fluxo (marcação com anexina/7-AAD) revelou que as células LSKs foram mais resistentes à apoptose tardia do que as células MPs independentemente da mutação da JAK2 (p<0.05). O tratamento com obatoclax resultou em indução de apoptose diferentemente do que foi observado com o tratamento com ruxolitinibe (p=0.594) nas células MPs de animais Jak2 wt/VF. Ademais, o tratamento combinado com ruxolitinibe e obatoclax resultou no aumento da apoptose nas células MPs dos animais com fenótipo de PV (Jak2 wt/VF) em relação aos animais Jak2 wt/wt (p=0.05). Em conclusão, demonstramos que a resistência à apoptose nas NMPs ocorre desde as CPH iniciadoras da doença. Nossos resultados sugerem que a modulação da apoptose mitocondrial pode ser uma nova estratégia terapêutica para pacientes com NMP em combinação aos inibidores de JAK2, na medida em que atua tanto nas CPH que iniciam a doença como nos MPs, responsáveis pelos sinais e sintomas de mieloproliferação.
Myeloproliferative Neoplasms (MPNs) negative for t(9;22)/BCR-ABL1 rearrangement, including Polycythemia Vera (PV), Essential Thrombocythemia (ET) and Primary Myelofibrosis (PMF), are clonal hematopoietic diseases and are often associated with the JAK2V617F mutation. Despite advances in the pathophysiology knowledge after the discovery of the JAK2V617F mutation and the development of JAK2 inhibitors, treatment remains non-curative. It is known that MPN primitive stem cells are essential for the initiation of the disease and that the expansion of the myeloeritroid precursors contributes to the clinical phenotype. Recent data, obtained with in vitro assays, showed that BCL2 family proteins, regulators of mitochondrial apoptosis, play a relevant role in the pathogenesis of MPNs. We believe that the anomalous expression of BCL2 in hematopoietic progenitor cells (HPCs) of MPNs may contribute to their pathogenesis. We evaluated BCL2 family (antiapoptotic genes BCL-xL and BCL2 and the pro-apoptotic BIM) gene expression by real-time PCR in different subpopulations of hematopoietic progenitors from a conditional Jak2V617F knockin murine model and from patients with MPNs as well as their contribution to the disease phenotype and response to JAK2 inhibitors (with ruxolitinib) and/or to the inhibition of the BCL2 family (with the BH3-mimetic obatoclax). We found no difference in the basal expression of the BCL2, BCL-xL and BIM in CD34+ cells as well as in subpopulations of CD34+ 38-/+ cells from patients with MPNs, regardless of the presence of the JAK2V617F mutation. In CD34+ cells obtained from patients with ET, we found an increase of BCL2 expression when compared to CD34+ cells with PMF (p=0.03). In the Jak2 wt/VF transgenic mice (that develop a MPN similar to PV) and Jak2 wt/wt controls, we compared the differential expression of Bcl2 family genes in immature hematopoietic precursors (LSKs) and more mature myeloid progenitors (MPs). Expression of Bcl-xL in MPs of wt/VF mice was greater when compared to LSKs and to the two progenitor subpopulations of control cells (p=0.0011). There was no significant difference in Bcl2 expression between the subpopulations of LSKs and MPs from wt/VF and wt/wt animals (p=0.12). Lower Bim expression in LSKs than in MPs was observed in samples from JAK2-mutated animals (p=0.026). Such difference was not observed between the Jak2 wt/wt subpopulations. Treatment with JAK2 or BCL2 inhibitors alone resulted in increased Bim expression in LSKs and MPs of the Jak2 wt/VF mice when compared to Jak2 wt/wt animals. This increase in Bim expression was even more evident when these cells were treated with the combination of the two drugs as compared to single treatment with one of the two inhibitors, being higher in mutaded than control animals (p<0.0001). The analysis of apoptosis by flow cytometry (annexin / 7-AAD labeling) revealed that LSK cells were more resistant to late apoptosis than MP cells regardless of the JAK2 mutation (p<0.05). Treatment with obatoclax resulted in greater apoptosis induction than it was observed with ruxolitinib treatment (p=0.594) on MP cells of Jak2 wt/VF animals. In addition, the combined treatment with ruxolitinib and obatoclax resulted in increased apoptosis in MP cells of animals with the PV phenotype (Jak2 wt/VF) as compared to the Jak2 wt/wt animals (p=0.05). In conclusion, we demonstrated that resistance to apoptosis in MPNs occurs at the level of the hematopoietic progenitors that initiate the disease. Our results suggest that modulation of mitochondrial apoptosis may be a new therapeutic strategy for MPN patients in combination with JAK2 inhibitors, as it acts on both the disease initiating and more mature progenitors, responsible for the clinical findings of myeloproliferation.

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Didone, Alline. "Estudo comparativo entre diferentes metodologias na detecção da mutação JAK2V617F em Neoplasias Mieloproliferativas Crônicas BCR-ABL1 negativo." Universidade de São Paulo, 2015. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/5/5167/tde-03022016-143712/.

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Abstract:

As Neoplasias mieloproliferativas (NMP) representam um vasto grupo de doenças clonais hematológicas malignas com três elementos principais: Policitemia vera (PV), Trombocitemia essencial (TE), e Mielofibrose Primária (MFP). JAK2 é uma proteína citoplasmática com atividade de tirosina quinase com função na transdução de várias vias na hematopoiese. A identificação da mutação do gene JAK2 (JAK2V617F) nas PV, TE e MFP representa um importante avanço para a compreensão da biologia destas NMPs. Variações marcantes na frequência desta mutação são observadas entre os diferentes estudos e acredita-se que um dos fatores responsáveis por estas diferenças seja a sensibilidade do método utilizado. Atualmente, diversas técnicas para detecção de JAK2V617F têm sido utilizadas, testadas e validadas quanto à sua sensibilidade e especificidade, entre elas: PCR RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphysm), ARMS PCR (Amplification-Refractory Mutation System), HRM (High-Resolution Melt Analysis) e Sequenciamento pela técnica de Sanger. Neste estudo foram realizadas todas as metodologias citadas anteriormente para a detecção da mutação de JAK2V617F em amostras de sangue de 136 pacientes (PV=20; MFP=20; TE=28; suspeita de NMP=68). Os resultados obtidos foram concordantes para as quatro técnicas empregadas nos pacientes com PV e MFP, já nos pacientes com TE as metodologias PCR-ARMS e PCR-HRM detectaram a mutação JAK2V617F em 67,8% enquanto o PCR-RFLP e o Sequenciamento pela técnica de Sanger foi 71,4% e 64,2% respectivamente. Nos casos onde houve suspeita diagnóstica de NMP também foram encontradas discordâncias entre as metodologias PCR-RFLP (4,4%) e PCR-HRM (1,5%) quando comparadas ao PCR-ARMS (3%) e o Sequenciamento (3%). O PCR-ARMS foi considerado nesse estudo como a melhor técnica para a detecção da mutação JAK2V617F, devido o menor risco de contaminação cruzada durante a reação, baixo tempo de execução, além da sua capacidade de determinação da carga alélica de JAK2, importante para o acompanhamento do paciente
Myeloproliferative neoplasms (MPN) represent a large group of clonal hematologic malignant diseases with three main members: Polycythemia Vera (PV), Essential Thrombocythemia (ET), and Primary Mielofibroses (PMF). JAK2 is a cytoplasmic tyrosine kinase protein and is important in different signal transduction pathways. Identification of JAK2V617F mutation in PV, ET and PMF is an important advance for understanding the biology of MPN. Differences in the frequency of this mutation are reported among different studies and it is believed that technical sensitivity could be the major reason for this variability. Currently, several techniques for detection of JAK2V617F have been developed, tested and validated for their sensitivity and specificity, including: PCR-RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphysm), PCR-ARMS (Amplification Refractory Mutation System), PCR-HRM (High-Resolution Melt analysis) and Sanger Direct Sequencing. The present study, evaluated all four molecular diagnostic methods mentioned above blood samples from 136 patients (PV=20; MFP=20; ET=28 and other MPN=68). Comparable results were observed for PV and PMF when all technics were applied. Patients with diagnosis of ET JAK2V617F mutations were detected in 67.8% when PCR-ARMS and PCR-HRM were used whilst PCR-RFLP and direct sequencing detected 71.4% and 64.2% respectively. In 68 patients with suspicion of MPN discordant results were seen between PCR-RFLP (4.4%) and PCR-HRM (1.5%) when compared to PCR-ARMS (3%) and direct sequencing (3%) related to JAK2V617F frequency. In conclusion PCR-ARMS was considered the most reliable methodology for JAK2V617F detection by presenting the lowest risk for cross contamination, less laborious, and the ability in determining allele burden that is becoming an important tool for risk stratification

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Moreno, Belmonte María José. "Determinantes celulares, plasmáticos y genéticos de riesgo de trombosis y hemorragia en pacientes con neoplasias mieloproliferativas crónicas filadelfia negativo." Doctoral thesis, Universidad de Murcia, 2010. http://hdl.handle.net/10803/10976.

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Abstract:

Las Neoplasias Mieloproliferativas Crónicas Filadelfia negativo clásicas comprenden la trombocitemia esencial, la policitemia vera y la mielofibrosis primaria y se caracterizan por la expansión clonal de la célula madre pluripotente, produciendo como resultado una hipercelularidad medular de predominio de una línea específica; la trombosis y el sangrado son parte de la historia natural de este grupo de enfermedades, constituyendo sus principales causas de morbimortalidad. Trabajos recientes han sugerido un papel del componente celular, de marcadores genéticos y de proteínas anticoagulantes en la patogenia de la trombosis en estos pacientes, pero los datos son escasos y contradictorios. Los estudios de estas variables en la patología hemorrágica es aún más limitada. Nuestra hipótesis era que se podrían buscar y definir biomarcadores de riesgo de trombosis y de hemorragia, tanto a nivel celular, plasmático, como genético, que ayudaran a trazar el perfil individual de riesgo de estas complicaciones hemostáticas.

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Lima, Luciene Terezina de. "Expressão gênica de metaloproteinases e de seus reguladores em neoplasias mieloproliferativas: associação com biomarcadores de angiogênese e status mutacional." Universidade de São Paulo, 2016. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/9/9136/tde-06062016-081348/.

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Abstract:

As neoplasias mieloproliferativas (NMPs) BCR-ABL1 negativas compreendem a mielofibrose primária (PMF), trombocitemia essencial (TE) e a policitemia vera (PV). A patogênese e progressão dessas NMPs não estão completamente elucidadas. As metaloproteinases de matriz (MMPs) degradam a matriz extracelular, ativando citocinas e fatores de crescimento que, por sua vez, participam da tumorigênese e angiogênese. O objetivo deste estudo foi avaliar a relação da expressão gênica das MMPs, TIMPs, HIF1-α e SPARC com os marcadores angiogênicos bFGF e VEGFA em pacientes com MF e TE, considerando o status mutacional; bem como avaliar a regulação desses genes em camundongos submetidos à hipóxia, e em modelos HIF1-α(-/-) e VHL(-/-). Foram incluídos 21 pacientes com MF, 21 com MF pós-TE, 6 com MF pós-PV, 23 com TE e 78 indivíduos controle. As análises realizadas foram: dosagem sérica e expressão de RNAm de MMP2, MMP9, TIMP1, TIMP2 e SPARC, hemograma, determinação da proteína C reativa ultrassensível, determinação das concentrações de VEGFA e bFGF e avaliação das mutações nos genes JAK2, cMPL e CALR. A avaliação da densidade microvascular da medula óssea foi feita em 30 dos pacientes incluídos. Os pacientes com MFP, MFPTE e TE apresentaram maior expressão de MMP2, SPARC, TIMP1, TIMP2 e bFGF quando comparados aos seus controles (P<0,05), enquanto MMP9 foi mais expressa nos pacientes com MFPTE e TE (P= 0,011 e P=0,047, respectivamente). Os pacientes com TE apresentaram maior expressão de HIF1-α e VEGFA em relação ao grupo controle (P<0,05). Pacientes com MF JAK2V617F positivos apresentaram maiores concentrações de MMP9, TIMP2, bFGF e VEGFA quando comparados aos pacientes portadores de mutações na CALR (P<0,05). Os pacientes com TE JAK2V617F positivos apresentaram maiores concentrações de MMP2 e TIMP2 (P=0,049 e P=0,020, respectivamente). As concentrações das proteínas estudadas não apresentaram correlação com a carga alélica de JAK2V617F e nem com a densidade microvascular da medula óssea. Células de medula óssea de camundongos submetidos à hipóxia apresentaram maior expressão de MMP2 e TIMP1 comparados aos camundongos em normóxia. Camundongos VHL(-/-) apresentaram aumento na expressão dos genes MMP2, MMP9, TIMP1, TIMP2 e VEGFA. Diferentemente, embriões HIF1-α(-/-) não foram considerados um bom modelo para este estudo devido ao envolvimento das MMPs na embriogênese/organogênese. Frente aos resultados encontrados, pode-se sugerir que a maior expressão de MMP2, SPARC e de bFGF estão associadas às NMPs. A mutação JAK2V617F foi associada a maiores concentrações de MMPs, TIMP2 VEGFA e bFGF. HIF1-α foi mais expresso na PV e na TE, sugerindo uma possível regulação da expressão das MMPs e TIMPs nessas doenças.
Myeloproliferative neoplasms (MPNs) BCR-ABL1-negative include primary myelofibrosis (PMF), essential thrombocythemia (ET) and polycythemia vera (PV). The mechanisms underlying the pathology and disease progression in MPN are not completely elucidated. The matrix metalloproteinases (MMPs) cleave extracellular matrix, activating cytokines and growth factors that, in turn, regulate tumorigenesis and angiogenesis. The aim of this study was to evaluate the relationship of MMPs, TIMPs, HIF1-α and SPARC gene expression with angiogenic markers bFGF and VEGFA in patients with MPN considering their mutational status; as well as to assess the regulation of these genes in animal models HIF1-α and VHL knockouts. Twenty-one MF, 21 MF post-ET, 6 MF post-PV, 23 ET patients and 78 controls were enrolled. The analysis performed in peripheral blood were: serum and mRNA expression of MMP2, MMP9, TIMP1, TIMP2 and SPARC, blood count, high-sensitivity C-reactive protein determination and VEGFA and bFGF measurements in plasma. We also evaluate mutations in JAK2, MPL and CALR. The assessment of microvascular density (MVD) in bone marrow was performed in 30 patients. Patients with MFP, MFPET and ET presented higher expression of MMP2, SPARC, TIMP1, TIMP2 and bFGF compared to their controls (P <0.05), while MMP9 expression was higher in patients with MFPET and ET (P=0.011 and P=0.047, respectively). Higher expression of HIF1-α and VEGFA was found in ET patients compared to the controls (P <0.05). PMF JAK2V617F patients had higher concentrations of MMP9, TIMP2, bFGF and VEGFA compared to CALR mutated ones (P <0.05). ET patients JAK2V617F positive had higher levels of MMP2 and TIMP2 (P=0.049 and P=0.020, respectively). The JAK2V617F allele burden was not associated with MVD in the bone marrow. Bone marrow cells from mice in hypoxia condition showed higher MMP2 and TIMP1 expression compared to the control. VHL(-/-) mice exhibited increased expression of MMP2, MMP9, TIMP1, TIMP2 and VEGFA. In contrast, the HIF1-α(-/-) embryos were not considered an applicable model for this study due to MMPs role in embryogenesis/organogenesis. In view of these findings, we can conclude that increased expression of MMP2, SPARC and bFGF are associated with MPN. The JAK2V617F mutation was associated with higher concentrations of MMPs, TIMP2 VEGFA and bFGF. HIF1-α is upregulated in PV and ET and perhaps regulate the MMPs and TIMPs expression in these diseases.

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Basquiera, Ana Lisa. "Supervivencia a largo plazo de pacientes con Síndromes Mieloproliferativos Crónicos Filadelfia Negativos y su relación con variables clínico-patológicas." Doctoral thesis, Basquiera AL. Supervivencia a largo plazo de pacientes con Síndromes Mieloproliferativos Crónicos Filadelfia Negativos y su relación con variables clínico-patológicas [Internet]. Universidad Nacional de Córdoba; 2017 [citado el 13 de febrero de 2020]. Disponible en: https://rdu.unc.edu.ar/handle/11086/6509, 2017. http://hdl.handle.net/11086/6509.

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Abstract:

Tesis - Doctor en Medicina y Cirugía - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Médicas, 2017 120 h. : il., gráf.
Fil: Basquiera, Ana Lisa. Hospital Privado Universitario de Córdoba; Argentina.
Fil: Basquiera, Ana Lisa. Sociedad Italiana de Beneficencia. Hospital Italiano de Buenos Aires; Argentina.
Los sindromes mieloproliferativos crónicos (SMP) Filadelfia negativos clásicos incluyen tres neoplasias hematológicas caracterizadas por exceso de proliferación de progenitores del linaje mieloide: policitemia vera (PV), trombocitemia esencial (TE) y mielofibrosis primaria (MFP). En el presente estudio multicéntrico y prospectivo se incluyeron 102 pacientes con diagnóstico de SMP con el objetivo de estudiar variables clínicas y patológicas asociadas con supervivencia a largo plazo. Al momento de la inclusión se estudió la presencia de la mutación V617F del gen JAK2 y otras mutaciones del gen JAK2. En una mediana de seguimiento de 11,5 años, se registraron eventos trombóticos, hemorrágicos, progresión hematológica y otros tumores primarios. Los resultados obtenidos demostraron que los pacientes positivos para la mutación JAK2V617F tuvieron mayor edad, mayor prevalencia de hipertensión arterial, mayor valor de glóbulos blancos y fosfatasa alcalina leucocitaria. La mutación se asoció a mayor riesgo de trombosis y ello se trasladó a una supervivencia libre de eventos trombóticos inferior para los pacientes JAK2V617F positivos. La incidencia de transformación fibrótica a 10 años para los pacientes con PV y TE fue de 5,9%. La incidencia de progresión a mielodisplasia y leucemia aguda para todos los pacientes fue de 2,5% a 10 años. Para todos los pacientes la edad mayor o igual a 60 años se asoció a inferior supervivencia global y en pacientes con PV también la trombosis arterial. Se demostró que las causas de muerte de estos pacientes no sólo estuvieron relacionadas a la progresión de la malignidad primaria sino también a causas no malignas (eventos cardiovasculares) o malignidades secundarias no hematológicas.
Philadelphia chromosome-negative chronic myeloproliferative neoplasms (MPN) are hematological malignancies characterized by excessive proliferation of myeloid progenitor cells. The three classical entities are: polycythemia vera (PV), essential thrombocythemia (ET) and primary mielofibrosis (PMF). In this multicenter and prospective study 102 patients with diagnosis of classical MPN were included. The purpose of this study was to analyze the impact of clinical and pathological variable on long-term survival. At inclusion, JAK2V617F and others JAK2 mutations were studied in all patients. In a median of follow-up of 11.5 years, vascular events, hematological progression and others primary tumors were registered. The results showed that JAK2V617F mutation positive patients were older and had a higher rate of arterial hypertension, white cell counts, and alkaline phosphatase score. JAK2V61F was associated with a higher risk of thrombosis and a lower thrombotic event free survival. The 10-year cumulative incidence of fibrotic transformation for patients with PV and ET was 5.9% and the 10-year cumulative incidence of myelodysplasia and leukemia transformation was 2.5%. For all patients, age equal or more than 60 years old was associated with inferior overall survival; in patients with PV also the arterial thrombosis affected the overall survival. Causes of death of this cohort were related not only to the progression of hematological.

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Campos, Paula de Melo 1983. "Investigação de vias de sinalização tirosinoquinase em neoplasias mieloproliferativas crônicas BCR-ABL1 negativas : interação JAK2/IRS2 e mutações em KIT." [s.n.], 2015. http://repositorio.unicamp.br/jspui/handle/REPOSIP/312628.

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Abstract:

Orientadores: Fabíola Traina, Sara Teresinha Olalla Saad
Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas
Made available in DSpace on 2018-08-27T21:37:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Campos_PauladeMelo_D.pdf: 6042513 bytes, checksum: b12134db0721f177eb0c2116e7fdf5e2 (MD5) Previous issue date: 2015
Resumo: As neoplasias mieloproliferativas crônicas BCR-ABL1 negativas (NMP) apresentam como característica comum a ocorrência de proliferação celular exacerbada, mantendo a capacidade de diferenciação mieloide terminal. Em parcela significativa dos casos, a ativação da proliferação celular ocorre pelo aumento da atividade tirosinoquinase de proteínas específicas. Entretanto, a heterogeneidade molecular observada nos pacientes e as respostas clínicas insatisfatórias observadas em parte dos casos com os tratamentos vigentes sugerem que mecanismos adicionais, como interações proteicas não descritas e novas mutações, possam estar envolvidos na fisiopatologia destas neoplasias. Neste trabalho, objetivamos estudar as vias de ativação tirosinoquinase em policitemia vera (PV), trombocitemia essencial (TE) e mielofibrose primária (MFP) (subprojeto 1), e em mastocitose sistêmica (subprojeto 2). O foco principal do subprojeto 1 consistiu em avaliar, em NMP, a associação JAK2/IRS2, previamente descrita em células não hematológicas após estímulo, bem como o envolvimento de IRS2 em vias de proliferação celular e apoptose. Utilizamos modelos de linhagens celulares leucêmicas humanas com JAK2 mutado (JAK2V617F) e JAK2 selvagem (JAK2WT), submetendo-as a inibição gênica por shRNA entregue por lentivírus e ao tratamento com o inibidor seletivo de JAK1/2 ruxolitinib. As células foram então submetidas à avaliação da viabilidade celular por MTT, e da apoptose por citometria de fluxo (anexina V/PI e caspase-3) e por imunobloting (caspase-3 clivada). A expressão do mRNA de IRS2 foi avaliada por PCR em tempo real em amostras de células CD34+ de sangue periférico de 99 pacientes com diagnóstico de PV, TE e MFP, e em 28 doadores normais. Através de imunoprecipitação e microscopia confocal, observamos a associação constitutiva entre JAK2 e IRS2 nas células JAK2V617F, mas não nas células JAK2WT. Em células JAK2V617F, a inibição de IRS2 por lentivírus diminuiu significativamente a fosforilação de STAT5, reduziu a viabilidade celular, aumentou as taxas de apoptose, e potencializou os efeitos de ruxolitinib. Não houve mudanças nas taxas de viabilidade celular e apoptose nas células JAK2WT inibidas para IRS2. A expressão do mRNA de IRS2 foi significativamente maior nos pacientes com TE em relação aos doadores normais, e em pacientes com NMP portadores da mutação JAK2V617F em relação aos pacientes com JAK2WT. Estas evidências sugerem que IRS2 possa participar das vias de sinalização celular nas NMP através de interação direta com JAK2. A inibição farmacológica de IRS2, isoladamente ou em conjunto com ruxolitinib, é ferramenta potencial no tratamento de pacientes com PV, TE e MFP. No subprojeto 2, nosso objetivo consistiu em investigar mutações no gene KIT em um caso de mastocitose sistêmica familiar seguido em nosso serviço, em que mãe (caso 1) e filha (caso 2) apresentavam extensa infiltração cutânea e da medula óssea por mastócitos, bem como avaliar a sensibilidade dos mastócitos neoplásicos ao tratamento com os inibidores de tirosinoquinase (ITK) imatinibe, dasatinibe e PKC412. Através de sequenciamento por Sanger, identificamos a mutação KITK509I em células de medula óssea total, CD3+ de sangue periférico e mucosa oral de ambas pacientes. Os pais do caso 1 apresentaram KIT selvagem. O tratamento in vitro por 4, 8 ou 12 dias de células totais de medula óssea dos casos 1 e 2 com os ITK avaliados resultou em menor viabilidade celular, avaliada por MTT, e em redução da fosforilação de P70S6K com todas as drogas testadas. Entretanto, apenas o imatinibe evidenciou resposta consistente na indução de apoptose. Foi iniciado tratamento dos casos 1 e 2 com imatinibe 400mg/dia via oral. Três meses após o início, houve normalização da pele e da medula óssea; após dois anos de seguimento, as pacientes mantêm-se em remissão. Embora rara, a mutação KITK509I deve ser pesquisada em todos os casos de mastocitose sistêmica familiar. O imatinibe pode ser considerado como droga de primeira escolha nestes casos
Abstract: The BCR-ABL1 negative chronic myeloproliferative neoplasms (MPN) are characterized by increased cellular proliferation with preserved terminal myeloid differentiation. In most cases, the activation of cell proliferation is caused by an increased tyrosine kinase activity of specific proteins. However, patients' molecular heterogeneity and the incomplete clinical responses observed in part of the cases using the current treatments suggest that additional mechanisms, such as unknown protein interactions and new mutations, can be involved in the pathophysiology of MPN. In this study, our main goal was to investigate tyrosine kinase activation pathways in polycythemia vera (PV), essential thrombocythemia (ET) and primary myelofibrosis (PMF) (subproject 1), and in systemic mastocytosis (subproject 2). The focus of subproject 1 consisted in the investigation of JAK2/IRS2 association in MPN, already described in non-hematological cells following extrinsic stimulus, and in evaluating IRS2 function in MPN cell proliferation and apoptosis. JAK2 wild-type (JAK2WT) and JAK mutated (JAK2V617F) human leukemia cell lines were transduced with lentivirus-mediated shRNA targeting IRS2, and treated with vehicle (DMSO) or with the selective JAK1/2 inhibitor ruxolitinib. Cells were then submitted to evaluation of cell viability (MTT) and apoptosis (anexin V/PI and caspase-3 by flow cytometry, and cleaved caspase-3 by immunoblotting). IRS2 mRNA expression was evaluated by real time quantitative PCR in CD34+ peripheral blood cells of 99 patients with PV, ET and PMF, and in 28 healthy donors. Through immunoprecipitation/immunobloting and confocal microscopy, we observed the constitutive JAK2/IRS2 association in JAK2V617F cells, but not in JAK2WT cell lines. In JAK2V617F, IRS2 silencing significantly decreased phospho-STAT5, reduced cell viability, induced apoptosis, and potentiated the effects of ruxolitinib treatment. No differences in cell viability and apoptosis ratios were observed in IRS2 silenced JAK2WT cells. IRS2 mRNA expression was significantly higher in ET patients when compared to healthy donors, and in patients harboring JAK2V617F mutation in relation to JAK2WT. These evidence suggest that IRS2 participate in MPN cell signaling pathways through its interaction with JAK2. IRS2 pharmacological inhibition, alone or in combination with ruxolitinib, may be a potential tool in the treatment of PV, ET and PMF patients. In subproject 2, our main goal was to seek for KIT mutations in a case of systemic familial mastocytosis, followed in our outpatient clinics, in which the mother (case 1) and the daughter (case 2) had extensive skin and bone marrow infiltration by mast cells. Also, we aimed to evaluate in vitro sensitivity of neoplastic mast cells to the treatment with the tyrosine kinase inhibitors (TKI) imatinibe, dasatinibe and PKC412. Using Sanger sequencing analysis, we identified the KITK509I mutation in total bone marrow, peripheral blood CD3+ and oral mucosa cells in both patients. The parents of case 1 had wild type KIT. The in vitro treatment of total bone marrow cells of cases 1 and 2 with TKI for 4, 8 and 12 days resulted in reduced cell viability, as evaluated by MTT, and in reduced phosphorylation of P70S6K for all tested drugs. However, only imatinibe consistently induced apoptosis in both cases. Patients were started on imatinibe 400mg orally per day. Three months following imatinibe treatment, there was a complete reversion of skin and bone marrow mast cells infiltration; after two years of follow-up, cases 1 and 2 remain in complete remission of the systemic mastocytosis. Although rare, KITK509I mutation should be investigated in all cases of familial systemic mastocytosis. Imatinibe is a good first choice for the treatment of these cases
Doutorado
Fisiopatologia Médica
Doutora em Ciências

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Pedrazzani, Fabiane Spagnol. "Impacto da análise molecular da mutação JAK2V617F no diagnóstico de neoplasias mieloproliferativas crônicas de acordo com os critérios da OMS 2016." reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFRGS, 2016. http://hdl.handle.net/10183/157653.

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As neoplasias mieloproliferativas (NMPs) são um grupo de doenças derivadas de uma transformação clonal de célula tronco hematopoiéticas no qual a linhagem celular mielóide é predominantemente expandida no sangue periférico. As NMPs Philadelphia-negativas incluem policitemia vera (PV), trombocitemia essencial (TE) e mielofibrose primária (MFP) que compartilham muitas características hematológicas, clínicas e evolutivas. A mutação da JAK2 (JAK2V617F) está presente em cerca de 95% dos pacientes com PV, entre 50 a 70% com TE e 40 a 50% com MFP. No entanto, os testes moleculares para diagnóstico são muitas vezes um desafio devido ao alto custo e a disponibilidade de equipamentos especializados. Objetivo: Verificar o impacto do teste molecular da mutação JAK2V617F para o diagnóstico de NMPs nos pacientes atendidos no Hospital de Clínicas de Porto Alegre. Métodos: Foram avaliados 87 pacientes com suspeita de NMPs. As amostras de sangue periférico foram analisadas para a mutação JAK2V617F pelo método genético molecular de PCR alelo-específico e os resultados correlacionados com os dados clínico-laboratoriais. Para estabelecimento do diagnóstico, foram utilizados os critérios da Organização Mundial da Saúde (OMS) de 2016. Resultados: Dos 87 pacientes avaliados, 27,6% foram diagnosticados como PV, 39,1% como TE, 4,6% como MFP e 28,7% não contemplavam os critérios para o diagnóstico NMPs. A comparação da utilização do teste da mutação JAK2V617F mostrou que, apenas 41,7% dos pacientes com PV sem utilizar o teste, teriam sido diagnosticados comparados a 91,7% utilizando este teste como um dos critérios no diagnóstico final (p = 0,004). Na TE e na MFP, este critério não foi estatisticamente significativo. Conclusão: O teste molecular para a mutação de JAK2V617F no nosso hospital teve um impacto significativo no diagnóstico dos pacientes com PV, mostrando ser uma ferramenta importante para o diagnóstico final desta NMP.
Myeloproliferative neoplasms (MPNs) are a group of disorders derived from a clonal transformation of stem cell on which myeloid cell lineage is predominantly expanded in the peripheral blood. Philadelphia-negative MPNs include polycythemia vera (PV), essential thrombocythemia (ET), and primary myelofibrosis (PMF) which share many hematological, clinical, and evolutionary characteristics. The JAK2 mutation (JAK2V617F) is present in about 95% of patients with PV, between 50 to 70% with ET and 40 to 50% PMF. However, the molecular diagnostic tests are often a challenge due to the high cost and the availability of specialized equipment. Objective: To verify the impact of molecular testing of the JAK2V617F mutation for the diagnosis of MPNs in patients attended at Hospital de Clinics, Porto Alegre. Methods: A total of 97 patients were evaluated with suspected of MPNs. The peripheral blood samples were analyzed for the JAK2V617F mutation by the molecular genetic allelespecific PCR method and the results correlated with the clinical-laboratory data. To establish the diagnosis, the 2016 World Health Organization (WHO) criteria were used. Results: Of the 87 patients evaluated, 27.6% were diagnosed as PV, 39.1% as ET, 4.6% as PMF and 28.7% did not meet criteria for MPNs diagnosis. Comparison of the use of the JAK2V617F test showed that only 41.7% of patients with PV without the mutation test were diagnosed compared to 91.7% using this test as one of the criteria for the final diagnosis (p = 0.004). In the ET and the PMF, this criterion was not statistically significant. Conclusion: The molecular test for the JAK2V617F mutation in our hospital had a significant impact in the diagnosis of patients with PV, showing to be an important tool for the final diagnosis of this MPN.

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Freitas, Renata Mendes de. "Análises de mutações no gene JAK2 em pacientes com diagnóstico clínico de Policitemia Vera atendidos em um único centro da cidade de Juiz de Fora." Universidade Federal de Juiz de Fora, 2014. https://repositorio.ufjf.br/jspui/handle/ufjf/737.

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CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
As Neoplasias Mieloproliferativas são originadas por uma proliferação clonal de um progenitor hematopoético. Descrita inicialmente em 1951 como “Doenças Mieloproliferativas” e reavaliada pela Organização Mundial da Saúde em 2011, as Neoplasias Mieloproliferativas agrupam a Policitemia Vera, Trombocitemia Essencial e Miefibrose Primária em um subgrupo chamado de BCR-ABL negativo. De acordo com a revisão dos critérios adotados para o diagnóstico das Neoplasias Mieloproliferativas a presença da mutação JAK2 V617F é considerada critério de maior importância para o diagnóstico do subgrupo BCR-ABL negativo representando um marcador clonal. A Policitemia Vera é principalmente diagnosticada por um aumento na massa eritrocitária independente de fator estimulante, aumento de leucócitos no sangue periférico, esplenomegalia e trombocitose. Ocorre, geralmente, em homens e mulheres com faixa etária de 60 anos, com incidência de 0,7 a 2,6/100.000 habitantes/ano. A mutação V617F no gene JAK2 produz uma proteína alterada que ativa constitutivamente a via JAK-STAT e outras vias downstream de modo que, as proteínas de ativação transcricional e transdutoras de sinal (STAT do inglês Signal Transducerand Activator of Transcription) são fosforiladas posteriormente impactando na expressão de genes envolvidos na regulação da apoptose e proteínas regulatórias, além de alterar a taxa de proliferação das células hematopoéticas. Neste trabalho foram selecionados 26 pacientes com Policitemia Vera, os quais foram atendidos na cidade de Juiz de Fora, Minas Gerais. Foram realizadas análises de mutações no gene JAK2 a partir do material genético isolado do sangue periférico. Os dados clínicos de cada paciente foram relacionados entre si e correlacionados com os dados moleculares.
Myeloproliferative neoplasms (MPN) are caused by a clonal proliferation of a hematopoietic progenitor. First described in 1951 as “Myeloproliferative Diseases” and reevaluated by the World Health Organization in 2011 (WHO, 2011), the Myeloproliferative Neoplasms gather the Polycythemia Vera, Essential Thrombocythemia and Primary Mielofibrose in a subgroup called negative BCR-ABL. According to WHO the revised diagnosis criteria for myeloproliferative neoplasms, the presence of JAK2 V617F mutation, is considered the most important criterion for the diagnosis of negative BCR-ABL subgroup representing a clonal marker. The Polycythemia Vera is primarily diagnosed by an independent stimulating factor in red cells mass increasing, followed by an increase of leukocytes in peripheral blood, spleen and thrombocytosis. It usually occurs in men and women of all age groups with higher incidence in 60-year-old patients ranging from 0.7 to 2.6/ 100.000 hab/year. The V617F mutation in the JAK2 gene produces an altered protein that activates constitutively the JAK-STAT pathway and other pathways downstream as a result the protein transcriptional activation and signal transduction (STAT) are subsequently phosphorylated causing impact in the expression of genes involved in regulation of apoptosis and regulatory proteins, as well as altering the rate of proliferation of hematopoietic cells. In this study 26 patients with Polycythemia Vera were selected in Juiz de Fora, Minas Gerais. The peripheral blood was used for genetic material isolation (JAK2 mutation). The clinical data of each patient were related to each other and correlated with the molecular data.

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Barcelos, Michelle Maccarini. "Importância da investigação da mutação JAK2V617F em pacientes com neoplasia mieloproliferativa crônica BCR/ABL negativa e sua associação com a expressão da proteína antiapoptótica survivina como marcador diagnóstico." reponame:Repositório Institucional da UFSC, 2012. http://repositorio.ufsc.br/xmlui/handle/123456789/94948.

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Abstract:

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Farmácia, Florianópolis, 2011
Made available in DSpace on 2012-10-25T18:25:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 290078.pdf: 1716302 bytes, checksum: 4c8d93eaf73b6f70dca15d139b2d391a (MD5)
As neoplasias mieloproliferativas crônicas (NMPC) são neoplasias originadas por uma proliferação clonal de um progenitor hematopoiético pluripotencial. Em 1951, William Dameshek descreveu a relação existente entre a policitemia vera (PV), a trombocitemia essencial (TE) e a mielofibrose primária (MFP), propondo que essas doenças, juntamente com a leucemia mieloide crônica (LMC) e a eritroleucemia, fossem agrupadas em uma categoria geral de síndromes mieloproliferativas. No entanto, ao longo dos anos, essa classificação foi reavaliada e, atualmente, a PV, a TE e a MFP são denominadas neoplasias mieloproliferativas crônicas (NMPCs) BCR/ABL negativas. De acordo com a revisão dos critérios adotados para o diagnóstico das NMPCs, realizado pela Organização Mundial da Saúde (OMS), em 2008, a presença da mutação JAK2V617F é considerada critério de maior importância para o diagnóstico de PV, e, na TE e MFP representa um marcador clonal. A JAK2V617F ativa constitutivamente a proteína transdutora de sinal STAT3, que está relacionada com a expressão da proteína antiapoptótica survivina e com a progressão maligna. Assim, o objetivo deste trabalho foi investigar a prevalência da mutação JAK2V617F em pacientes com diagnóstico de NMPC BCR/ABL negativa, e associar com a expressão da proteína antiapoptótica survivina, como marcador diagnóstico, e com dados laboratoriais e clínicos dos pacientes. Do total de 54 casos incluídos no estudo, 32 casos (59,3%) apresentaram a mutação JAK2V617F e 22 casos (40,7%) foram negativos. A neoplasia de maior prevalência foi a TE, sendo diagnosticada em 61,1% dos casos, seguida da PV, diagnosticada em 26% dos casos. Não foi observada diferença estatística significativa da presença da mutação entre homens (57,7%) e mulheres (60,7%). Os indivíduos positivos para a mutação JAK2V617F apresentaram uma mediana de idade maior (61,5 anos) do que os indivíduos sem a mutação (52,5 anos). Os resultados deste trabalho não mostraram nenhuma associação entre a presença da mutação JAK2V617F e a ocorrência de trombose e/ou esplenomegalia. A presença da mutação JAK2V617F não está associada com a ocorrência de anormalidades laboratoriais nos indivíduos com MFP; já os pacientes positivos para mutação JAK2V617F e diagnosticados com PV e TE tiveram aumento significante na contagem de eritrócitos e plaquetas, aumento na mediana de idade e na leucometria, respectivamente. A expressão da proteína survivina não foi detectada nas medulas ósseas dos indivíduos deste estudo, independente da presença ou ausência da mutação JAK2V617F. As evidências obtidas nesse estudo permitem concluir que, diferente da importância bem definida como valor diagnóstico, a relevância prognóstica da presença da mutação JAK2V617F nos casos de NMPCs BCR/ABL negativa permanece controversa. Além disso, a investigação da expressão da proteína survivina em biópsia de medula óssea não serve como um bom marcador para o diagnóstico dos pacientes com NMPC BCR/ABL negativa.

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Zamora, Plana Lurdes. "Caracterització Biològica de la Trombocitemia Essencial i la Policitemia Vera." Doctoral thesis, Universitat Autònoma de Barcelona, 2005. http://hdl.handle.net/10803/3667.

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Abstract:

El concepte de síndromes mieloproliferatives cròniques (SMPC) engloba un conjunt d'entitats hematològiques amb característiques clíniques i evolutives molt similars i d'etiopatogènia probablement comú. Es tracta de processos caracteritzats per l'expansió clonal d'una cèl·lula mare (stem cell) pluripotent, que dóna com a resultat una hipercel·lularitat medul·lar amb predomini d'una o més línies que arriben a diferenciar-se en elements madurs. Totes les SMPC es troben subjectes a evolució clonal però en un grau força variable: un 90% d'evolució a leucèmia aguda en la leucèmia mieloide crònica front un 1-2% a la trombocitèmia essencial. Les SMPC clàssiques comprenen quatre entitats: la leucèmia mieloide crònica (LMC), la mielofibrosi idiopàtica (MI), la policitèmia vera (PV) i la trombocitèmia essencial (TE). Aquesta tesi pretén caracteritzar biologicament millor la PV i la TE.
La PV és el resultat de la proliferació anormal d'una cèl·lula mare pluripotent, que dóna lloc a una hemopoesi clonal d'hematies, granulòcits i plaquetes, amb predomini d'hiperplàsia eritroide sobre la resta de línies hemopoètiques.
La TE és una SMPC caracteritzada per un increment persistent de la xifra de plaquetes i per una hiperplàsia megacariocítica en la medul·la òssia.
Un dels criteris diagnòstics majors de la PV i majoria dels criteris diagnòstics de la TE són criteris d'exclusió. Aquest fet fa que constantment s'estiguin buscant nous biomarcadors que ajudin al diagnòstics d'aquestes patologies. Les tècniques que s'han utilitzat en aquestes tesi amb aquest propòsit han sigut:
1. Citogenètica convencional:
- PV: Al moment del diagnòstic entre el 13-18% dels pacients presenten un cariotip alterat mitjançant tècniques de citogenètica convencional. Les alteracions més freqüents són: del(20q) (25%), trisomia 8 (16%), trisomia 9 (16%) (tampoc era rar trobar les dues trisomies 8 i 9 juntes en el mateix pacient), duplicacions de bandes inespecífiques d'1q o trisomies d'1q (10%), seguit per del(13q), del(11q), del(7q), del(5q) i trisomia 21.
- TE: Al moment del diagnòstic entre el 5% i 10% dels casos presenten alteracions cromosòmiques. Entre les alteracions citogenètiques més descrites en la TE trobem les delecions dels braços llargs dels cromosomes 20 (del(20q)) i 13 (del(13q)) i les trisomies 8 i 9.
2. Hibridació in situ fluorescent:
- PV: El percentatge de pacients amb alteracions cromosòmiques que es detecten mitjançant la tècnica de FISH varia entre 14.3% i 71.5% en funció de cada sèrie.
- TE: El percentatge de pacients amb alteracions cromosòmiques que es detecten mitjançant la tècnica de FISH varia entre 15% i 55% en funció de cada sèrie.
3. Estudi de clonalitat mitjançant el gen HUMARA:
- PV: El percentatge de clonalitat entre les pacients afectes de PV oscil·la entre el 41% i el 73%.
- TE: El percentatge de clonalitat entre les pacients afectes de TE oscil·la entre el 18.7% i el 68%.
La tècnica més útil com a nou biomarcador ha estat l'estudi de clonalitat mitjançant el gen HUMARA. Ara bé, la recerca constant de possibles biomarcadors (ex. PRV-1, JAK2...) poden superar la eficacia d'aquesta tècnica.
Essential thrombocythemia (ET) and polycythemia vera (PV) are chronic myeloproliferative disorders (MPD) arising from the clonal expansion of a pluripotential stem cell. Specific genetic lesions have not been recognized for both disorders, so, diagnostic criteria still are based on the presence or absence of particular clinical and laboratory features
In recent years, there have been attempts to find new positive criteria that could help in the diagnosis of ET and PV, such as spontaneous in vitro colony formation of erythroid and megakaryocytic progenitors, conventional cytogenetics, fluorescence in situ hybridization techniques and analysis of X-chromosome inactivation patterns (XCIPs). This thesis wants to better characterize PV and ET. For this propose it has been used the following methodologies:
1. Conventional Cytogenetics:
- PV: At diagnosis between 13-18% of patients has an abnormal karyotype with conventional cytogenetics methodologies. The most frequent abnormalities are del(20q) (25%), trisomy 8 (16%), trisomy 9 (16%) (we can also find both alterations together in the same patient), duplications of unspecific bands from 1q or trisomy 1q (10%), del(13q), del(11q), del(7q), del(5q) and trisomy 21.
- TE: At diagnosis between 5-10% of patients has an abnormal karyotype with conventional cytogenetics methodology. The most frequent abnormalities are del(20q)), del(13q) and trisomy 8 and 9.
2. Fluorescent in situ hybridization:
- PV: The percentage of patients with abnormalities detected by FISH goes from 14.3% to 71.5% depending on the series.
- TE: The percentage of patients with abnormalities detected by FISH goes from 15% to 55% depending on the series.
3. Clonality study with HUMARA gene:
- PV: The percentage of clonality between patients goes from 41% to 73%.
- TE: The percentage of clonality between patients goes from 18.7% to 68%.
The most useful technique as a biomarker has been the clonality study with the HUMARA gene. But the constant investigation of new possible biomarkers (ex. PRV-1, JAK2...) could be even more useful than this one.

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Nunes, Natália de Souza. "Expressão de microRNAs em leucócitos e células CD34+ em Policitemia Vera." Universidade de São Paulo, 2012. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/60/60135/tde-29032012-112002/.

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Abstract:

A Neoplasia Mieloproliferativa Crônica (NMPC)- Politemia Vera é uma desordem clonal caracterizada pelo acúmulo de eritrócitos, leucócitos, plaquetas e progenitores normais na ausência de um estímulo definido. Apesar dos avanços no diagnóstico de PV e da descrição de mecanismos envolvidos no estabelecimento da doença sua patogênese permanece desconhecida entretanto, alterações no mecanismo regulador da apoptose parecem estar envolvidos em sua fisiopatologia. A compreensão acerca do funcionamento da maquinaria apoptótica e sua possível regulação por microRNAs em pacientes com Policitemia Vera parece revelar novos alvos para estudo e consequentemente transformar-se em novas terapias para a doença. Neste contexto os objetivos deste trabalho foram avaliar em leucócitos de sangue periférico e células CD34+ de medula óssea dos pacientes de PV: (1) a quantificação da expressão de microRNAs cujos alvos são RNAs associados a regulação da apoptose; (2) Correlação dos níveis de expressão dos miRNAs com os de RNAm das moléculas pró e antiapoptóticas da família Bcl-2 e dos receptores de morte; (3) Correlação dos níveis de expressão dos miRNAs com os seguintes dados clínico-laboratoriais dos pacientes: concentração de hemoglobina, hematócrito e percentagem da mutação JAK2. Os pacientes com Policitemia Vera apresentam aumento de expressão dos microRNAs 29c, 16, 21, 26a, 130b e let-7d e diminuição de miR15a e 34c em leucócitos de sangue periférico; Aumento de expressão dos miRs 29c, 16 e 21; diminuição na expressão de miR 130b e let-7d em células CD34+ ; alteração na expressão de genes pró e anti-apoptóticos em leucócitos de sangue periférico com aumento de a1, mcl-1 e diminuição de bcl-2, ciap-2, bax e fas-L,alteração na expressão de genes pró e anti-apoptóticos em células CD34+ com aumento de expressão de fas, bid, mcl-1, bcl-xl e c-flip; diminuição na expressão de bik. Observamos diminuição na expressão protéica de BCL-2 em pacientes quando comparado aos indivíduos controle.Notamos também a correlação entre a alteração na expressão de microRNAs e seus respectivos genes alvo e destes com parâmetros hematológicos analisados. Os linfócitos dos pacientes de PV apresentam maior resistência a apoptose do que os indivíduos controles quando induzidos por: Actinomicina, etoposídeo, citarabina e cicloheximida. Concluindo, os dados obtidos sugerem a participação dos microRNAs na regulação da maquinaria apoptótica e a participação desta desregulação na fisiopatologia da PV. Estes resultados contribuem para o melhor entendimento da fisiopatologia da PV e serão úteis futuramente para o desenho de novos alvos terapêuticos e descrição de marcadores de prognóstico.
Polycythaemia vera (PV) is a clonal disorder characterized by an accumulation of normal red and white cells, platelets, and their progenitors in absence of a definable stimulus. Despite the advances in PV diagnosis and the description of the mechanisms involved in disease establishment its pathogenesis remains unclear. The apoptosis deregulation might have a role in PV physiopathology. Fully understanding the basic apoptotic pathway and its potential regulation by microRNA in PV patients cells might unveil targets for manipulation, which may be translated into novel therapies for disease.The aims of this study were to avaluate in leukocytes and CD34+ cells: (1) The microRNA expression whose RNA target are associated with apoptosis regulation (2) Correlation between microRNA expression and the mRNA levels of anti and pro-apoptotic family Bcl-2 expression and death receptors; (3) Correlation between microRNA expression and the clinical data of patients: hemoglobin concentration, hematocrit and JAK2 percentage. Patientes with Polycythemia Vera shows increased expression of microRNAs 29c, 16, 21, 26a, 130b and let-7d and 34c and 15a decrease in peripheral leukocytes; incresead expression of miRs 29c, 16 and 21, decrease in miR130b and let-7d expression in CD34+ cells; deregulation in pro and anti-apoptotic gene expression in peripheral leukocytes with increase in a1, mcl-1 and decrease in bcl-2, ciap-2, bax and fas-L, deregulation in pro and anti-apoptotic gene expression in CD34+ cells with increased expression of fas, bid, mcl-1, bcl-xl and c-flip and decreased expression of bik. Decreased in proteic expression of BCL-2 in peripheral leukocytes of patients when compared to controls. Correlation between de deregulated expression of microRNA and their genes target and those with hematological parameters. Lymphocytes from PV patients shows higher resistance to apoptosis than controls when induced by: Actinomicin, etoposide, cytarabine and cycloheximide. In conclusion the data suggest the involvement of microRNA in apoptosis regulation and the involvement of apoptosis machinery in the PV pathophysiology. These results will contribute for a better understanding of PV pathophysiology and will be useful for the discover of future therapies.

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Tognon-Ribeiro, Raquel. "Alterações da expressão de apoptomirs, de genes e proteínas pró- e anti-apoptóticos em Mielofibrose e Trombocitemia Essencial." Universidade de São Paulo, 2011. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/60/60135/tde-01112011-165228/.

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Abstract:

As Neoplasias Mieloproliferativas Crônicas (NMPC) Trombocitemia Essencial (TE), Mielofibrose (MF) - são desordens hematopoéticas resultantes da expansão clonal da célula tronco hematopoética alterada. Essas doenças caracterizam-se pela independência dos progenitores hematopoéticos aos estímulos dos fatores de crescimento e citocinas e pela proliferação exacerbada das células da linhagem mielóide com maturação preservada. Os mecanismos moleculares e celulares envolvidos na patogênese e progressão da TE e MF não foram ainda esclarecidos, mas o mieloacúmulo presente nessas doenças parece estar associado à alteração de proliferação e apoptose celular. Nesse contexto, os objetivos deste trabalho foram avaliar em células CD34+ da medula óssea e leucócitos dos pacientes com TE e MF: (1) a expressão de apoptomirs e de genes pró- e anti-apoptóticos pertencentes à via intrínseca e extrínseca da apoptose pela metodologia de RT-PCR em tempo real; (2) expressão de proteínas pró- e anti-apoptóticas por Western-blot; (3) o perfil de sensibilidade das células mononucleares à apoptose induzida por diferentes agentes apoptogênicos pela técnica de citometria de fluxo e (4) correlacionar os resultados obtidos com dados clínico-laboratoriais dos pacientes e com a expressão do gene PRV-1. Em TE, nas células CD34+, foi detectado aumento da expressão de a1, mcl-1, bid, bok e noxa e diminuição de bax em relação aos controles. Nos leucócitos, foi detectada a elevação da expressão de a1, bcl-2, bcl-w e bcl-xL, bad e bok e diminuição de bid e bimEL. Em comparação com o grupo controle, os pacientes com MF apresentaram maior expressão dos genes a1, bcl-w bak, bok e noxa e menor de bcl-2 nas células CD34+. Nos leucócitos dos pacientes com MF foi verificado aumento da expressão dos genes bcl-2, bcl-w e bcl-xL, bad e bok. O c-iap-1 apresentou maior expressão nas células CD34+ dos pacientes com MF e TE, enquanto que o c-iap-2 estava elevado nos leucócitos e células CD34+. Foi ainda detectada a expressão diferencial em TE e MF dos genes pertencentes a via de receptor de morte, como a maior expressão dos genes fas, fas-L, faim e dr4 nas células CD34+ dos pacientes e menor expressão do fas-L e trail nos leucócitos dos pacientes com TE e MF. Os resultados indicaram associação da expressão do gene PRV-1 com a mutação JAK2V617F e com a expressão dos genes a1, bcl-w, bik, bax, c-iap-2 e trail. Com relação à expressão proteica, BCL-XL estava aumentada e TRAIL diminuída em leucócitos de pacientes com MF enquanto que a molécula BID estava diminuída em leucócitos de pacientes com TE. Os miRNA26a, let 7d e miR15a estavam mais expressos nos leucócitos de pacientes com TE e MF. Em pacientes com TE o miR130b estava elevado e o mIR16 diminuído, enquanto que nos pacientes com MF o miR198 estava aumentado. Os linfócitos dos pacientes com TE e MF apresentaram maior resistência à apoptose estimulada por: actinomicina, etoposídeo, teniposídeo, citarabina e estaurosporina do que os linfócitos dos controles. Em conclusão, os dados obtidos sugerem a ligação da alteração do processo de apoptose celular, com a expressão do gene PRV-1 e status da mutação JAK2V617F. Esses resultados contribuem para o melhor entendimento da fisiopatologia das NMPC visto que associam a fisiopatologia da TE e MF com a resistência das células alteradas à apoptose. Essas informações serão úteis no futuro, possibilitando o desenho de novos alvos terapêuticos e a descrição de novos marcadores de prognóstico.
Chronic Myeloproliferative Neoplasms (cMPN) - Essential Thrombocythemia (ET), Primary Myelofibrosis (PMF) and Polycythemia Vera (PV) - are clonal hematopoietic stem cell malignancies characterized by an accumulation of mature myeloid cells in bone marrow and peripheral blood. It seems that apoptotic machinery deregulation contribute to ET and PMF pathogenesis. Despite the advances in the molecular knowledge, the physiopathology of these diseases remains unknown. This study investigated cellular and molecular mechanisms involved in apoptosis process regulation in bone marrow haematopoietic progenitor CD34+ cells and leukocytes from ET and PMF patients. The specifics aims were: (1) to evaluate death receptors family members and Bcl-2 related genes expression as well apoptosis-related microRNAs by Real Time PCR; (2) apoptosis-related protein expression by Western Blot; (3) access mononuclear cells apoptosis resistance by flow cytometry and (4) to correlate the results with JAK2V617F mutation, PRV-1 gene expression and as well clinical data. In ET CD34+ cells, we found overexpression of a1, mcl-1, bid, bok e noxa and a decrease of bax compared to controls, while in leukocytes a1, bcl-2, bcl-w e bcl-xL, bad e bok expression was increased and bid and bimEL expression was lower than in controls. In PMF, a1, bcl-w bak, bok e noxa were overexpressed and bcl-2 downregulated in CD34+ cells. In PMF leukocytes bcl-2, bcl-w e bcl-xL, bad e bok mRNA levels were increased. c-iap-1 was increased in ET and PMF CD34+ cells and c-iap-2 expression elevated in ET and PMF CD34+ cells and leukocytes. Death receptor related genes showed overexpression of fas, fas-L, faim and dr4 in patients CD34+ cells and downregulation of fas-L and trail in ET and PMF leukocytes. We found differential expression of several genes between patients JAK2V617F positive and negative, as well we found correlation between gene expression and JAK2V617F allele burden, white blood cells and platelets count and splenomegaly. PRV-1 gene was overexpressed in ET and PMF leukocytes and showed correlation with JAK2V617F mutation and a1, bcl-w, bik, bax, c-iap-2 and trail gene expression. Regarding protein expression, BCL-XL was increased and TRAIL decreased in PMF leukocytes and BID was decreased in ET leukocytes. miRNA26a, let 7d e miR15a was overexpressed in ET and PMF leukocytes, while miR130b was increased only in ET and miR198 only in PMF. miR16 was downregulated in ET leukocytes comparing to controls. We also detected a resistance to apoptosis-inducers in ET and PMF lymphocytes and we observed correlation between apoptosis percentage and the expression of many studied genes. In conclusion, the results indicate the participations of Bcl-2 family genes and Death Receptor pathway genes, as well PRV-1 and JAK2V617F mutation in these disorders, which contribute to elucidate cMPN physiopathology and might lead to the discovery of new cMPN therapies and molecular markers.

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Salgado, Isa Sofia Ribeiro. "Deteção de mutações nos genes JAK2 e MPL por high resolution melting." Master's thesis, Universidade de Aveiro, 2013. http://hdl.handle.net/10773/12628.

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Abstract:

Mestrado em Biologia Aplicada
As NMPs representam um grupo heterogéneo de doenças clonais caracterizadas pela expansão e produção excessiva de eritrócitos, granulócitos e/ou plaquetas sanguíneas na medula óssea. Em 2005, foi identificada a mutação V617F no gene JAK2 numa elevada frequência de doentes com NMP, em especial nos doentes com PV (65-97%), TE (23-57%) e MFP (35-57%). A deteção da mutação V617F no gene JAK2 e de outras mutações funcionalmente similares, isto é, mutações no exão 12 do gene JAK2 e no exão 10 do gene MPL, foram recentemente incluídas pela Organização Mundial de Saúde, nos critérios de diagnóstico para a PV, TE e MFP. Várias técnicas têm sido descritas e aplicadas à pesquisa destas mutações. A técnica de AS-PCR (PCR alelo-específico) é considerada uma técnica de diagnóstico capaz de detetar uma mutação heterozigótica presente em apenas 1-3% das células. Recentemente, o HRM foi descrito como uma técnica simples, rápida, de baixo custo e com elevada sensibilidade e especificidade na identificação e/ou deteção de mutações. Este estudo teve como principal objetivo avaliar a eficácia da técnica de HRM na deteção da mutação V617F-JAK2, das mutações no exão 12 do gene JAK2 e do exão 10 do gene MPL, numa série de 160 amostras de doentes com diagnósticos de NMP. A técnica de HRM demonstrou uma especificidade de 100% e uma sensibilidade ligeiramente inferior (98,4%) na deteção da mutação V617F, quando comparada com a técnica utilizada por rotina no GDPN para a deteção desta mutação (AS-PCR). Na pesquisa de mutações no exão 12 do gene JAK2 e exão 10 do gene MPL, a técnica de HRM permitiu detetar 100% dos casos com mutação. Os resultados deste estudo sugerem que o HRM tem uma utilização limitada na deteção da mutação V617F do gene JAK2, embora se tenha revelado uma técnica adequada ao rastreio rápido das mutações do exão 12 do gene JAK2 e do exão 10 do gene MPL. No presente estudo, foram detetadas mutações nos genes JAK2 e MPL em 80,6% dos doentes com PV, em 32,0% dos doentes com TE, em 33,3% dos doentes com MFP e em 33,3% dos doentes com NMP não classificadas.
Myeloproliferative neoplasms (MPNs) are a heterogeneous group of clonal diseases characterized by increased and excessive proliferation of erythrocytes, granulocytes and/or platelets in the bone marrow. In 2005, several groups identified the presence of the V617F mutation in the JAK2 gene in a significant proportion patients with PV (65-97%), ET (23-57%) and PMF (35-57%). Detection of the JAK2 mutation or other functionally similar mutation, such as JAK2 exon 12 mutations or MPL exon 10 mutations, have recently been included in the essential diagnostic criteria for PV, ET and PMF by the World Health Organization. Several techniques have been used to detect these mutations. AS-PCR (allele specific PCR) is considered a diagnostic tool capable of detecting a heterozygous mutation present in only 1-3% of mutated cells. Recently, HRM was described as a simple, fast and cost effective technique with high sensitivity and specificity that allows the detection and identification of mutations. The present study aimed at the evaluation of HRM as a diagnostic tool to detect JAK2-V617F, JAK2 exon 12 mutations or MPL exon 10 mutations, in 160 samples of MPNs patients. HRM revealed a 100% specificity and a slightly lower sensitivity (98,4%) in the V617F mutation detection when compared to AS-PCR. HRM detected all positive cases with JAK2 exon 12 mutations or MPL exon 10 mutations. Our results suggest that HRM is of limited use to detect the JAK2-V617F mutation. However, it is a suitable technique for mutation screening of JAK2 exon 12 mutations or MPL exon 10 mutations. In this study, JAK2 and MPL mutational frequency was 80,6% in PV, 32,0% in TE, 33,3% in PMF and in unclassifiable MPNs patients.

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Bertozzi, Irene. "Biomolecular and histological features in pediatric essential thrombocythemia: adequacy of who diagnostic criteria." Doctoral thesis, Università degli studi di Padova, 2017. http://hdl.handle.net/11577/3422265.

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Abstract:

Myeloproliferative neoplasms (MPN), Essential Thrombocythemia (ET), Polycythemia Vera (PV) and primary myelofibrosis (PMF), are clonal disorders of the hematopoietic stem cell. In the recent years, somatic mutations of JAK2, CALR and MPL genes have been found in these diseases. However, these mutations do not allow the discrimination between the different diseases, being present in more than one form. World Health Organization (WHO) criteria, in fact, request in addition to the molecular study, a complete bone marrow histological evaluation. Pediatric ET is a rare disorder with an incidence about 60 times lower than the adult form albeit with similar blood finds. In children with ET, the incidence of JAK2V617F and CALR mutations is significantly lower than in adults, while hereditary cases characterized by MPL mutations are relatively more common. So far the histological evaluation of the bone marrow has not been exhaustively explored in this setting of patients. The aim of the present study was to evaluate the adequacy of current WHO criteria in pediatric ET exploring both the incidence of driver mutations and bone marrow features in a large cohort of children with a clinical diagnosis of ET. Our study was built in two steps: (i) a biomolecular study of a pediatric population with a clinical diagnosis of ET performed by Italian pediatricians, expert in hematological disorders and (ii) a histological evaluation strictly adherent to WHO criteria of BM features of a sub group of these children. Firstly, biomolecular studies of 89 children with a clinical diagnosis of ET, all having a sustained increase in platelet count (>450 x10^9/L) with no demonstrable reactive or secondary cause and no familial history of MPN or thrombocytosis, were evaluated to our central laboratory. In the second phase of our work we collected naïve bone marrow (BM) biopsies of 20 children with a clinical diagnosis of ET (PedET) and, as controls, BM of 6 children (PedST) with reactive/secondary thrombocytosis, 18 children (Norm) with a normal BM histology and 36 adults (AdsET) with WHO-diagnosed ET. All BM biopsies were reviewed by two MPN’s expert pathologists, blinded to the cause of each child’s thrombocytosis. In the biomolecular study we found that 23 patients (25,8%) had a clonal disease. The JAK2V617F mutation was identiﬁed in 14 children, 1 child had the MPLW515L mutation, and 6 had CALR mutations. The HUMARA monoclonal X-chromosome inactivation pattern was demonstrate in 6 patients (two with JAK2V617F and two with CALR mutations). The other 66 patients (74,2%) had persistent thrombocytosis with no clonality. There were no clinical or hematological differences between the clonal and non-clonal patients. From the histological point of view, while cellularity was increased in all pediatric cases compared to adults (p<0.001), megakaryocytes (MK) density was higher in PedET (37.5 MK/mm2) than in PedST (9.2 MK/mm2) (p<0.001). Moreover, MK clusters (100%) and BM fibrosis (30%) were observed only in PedET but not in PedST and in Norm. The BM histology was similar in PedET and AdsET. On a whole, BM histology confirmed the diagnosis of ET in 15 children, suggested a PV in 1 child, a PMF in 3 (1 grade 1 and 2 grade 0) and secondary thrombocytosis in one. Our study shows that children with ET are mostly non-clonal, however, the relative proportion of ET-speciﬁc mutations in the clonal children was much the same as in adults. Histological WHO criteria are able to identify ET, PMF and PV and distinguish ST from primary thrombocytosis, also in pediatric population. Therefore, WHO criteria seem suitable in all age groups, making both complete biomolecular evaluation and BM assessment mandatory in children with suspected ET.
Le Neoplasie Mieloproliferative (MPN), sono disordini clonali della cellula staminale emopoietica, caratterizzate dalla proliferazione di una o più linee mieloidi e sono Trombocitemia Essenziale (ET), Policitemia Vera (PV) e Mielofibrosi Idiopatica (PMF). I criteri diagnostici per le MPN dell’adulto si sono evoluti nel tempo di pari passo con l’acquisizione di nuove conoscenze clinico-laboratoristiche e biomolecolari di tali patologie. Negli ultimi anni sono state descritte mutazioni somatiche a carico dei geni JAK2, CALR e MPL, tuttavia queste mutazioni non consentono una distinzione accurata in quanto presenti in più di una MPN. Nei più recenti criteri diagnostici WHO, di conseguenza, accanto allo studio biomolecolare, è necessaria una completa valutazione della biopsia osteo-midollare (BOM). La ET pediatrica è una malattia rara con un’incidenza stimata di circa 60 volte inferiore alla forma dell’adulto. L’incidenza delle mutazioni di JAK2 e di CALR è significativamente inferiore nei bambini con ET rispetto agli adulti, mentre sono relativamente più numerosi i casi ereditari caratterizzati da mutazioni di MPL. Ad oggi in questi pazienti non è stata ancora esplorata esaustivamente la rilevanza della valutazione istologica del midollo. Lo scopo del nostro studio è stato quello di verificare l’adeguatezza dei criteri WHO nella popolazione pediatrica esplorando sia l'incidenza delle mutazioni principali che le caratteristiche della BOM in un'ampia casistica di bambini con diagnosi clinica di ET. Il nostro lavoro è stato costruito in due momenti: (i) uno studio biomolecolare in bambini con diagnosi clinica di ET fatta da Pediatri Italiani esperti in disordini ematologici e (ii) una valutazione istologica della BOM in un sottogruppo di questi bambini, applicando rigorosamente i criteri WHO. Nella prima parte dello studio abbiamo valutato 89 bambini con diagnosi clinica di ET con un incremento prolungato della conta piastrinica (>450 x10^9/L) in assenza di cause secondarie o reattive e senza familiarità per MPN o trombocitosi. I campioni stati sono stati centralizzati presso il nostro laboratorio per lo studio biomolecolare completo. Nella seconda fase, abbiamo collezionato le BOM di 20 bambini con diagnosi clinica di ET (PedET) e, come controlli, di 6 bambini con trombocitosi reattiva (PedST), 18 bambini (Norm) con istologia midollare nella norma e 36 adulti con diagnosi di ET in accordo con in criteri WHO (AdsET). Tutte le BOM sono state rilette in cieco da due patologi esperti in MPN. Nello studio biomolecolare in 23 pazienti (25,8%) è stata dimostrata la presenza di un marker di clonalità: 14 bambini erano positivi per la mutazione JAK2V617F, 1 bambino aveva la mutazione MPLW515L e 6 avevano mutazioni di CALR. Inoltre, sei pazienti sono risultate clonali allo studio dell’inattivazione del cromosoma X (due portatrici anche la mutazione JAK2V617F e due con mutazioni di CALR). Gli altri 66 pazienti (74,2%) presentavano una trombocitosi persistente senza evidenza di clonalità. Non sono state dimostrate differenze clinico-ematologiche tra i pazienti clonali e non clonali. Dal punto di vista istologico, la cellularità è risultata più alta in tutti i casi pediatrici rispetto agli adulti (p <0.001), mentre la densità megacariocitaria (MK) è risultata più alta nei PedET (37,5 MK/mm2) rispetto a PedST (9.2 MK/mm2) (p <0,001). Inoltre, i cluster di MK (100%) e la fibrosi midollare (30%) sono stati osservati solo in PedET, essendo sostanzialmente assenti sia in PedST che Norm. L’istologia della BOM è risultata pressoché sovrapponibile in PedET e AdsET. Tra i bambini con PedET, l’istologia della BOM ha confermato in 15 casi la diagnosi di ET, in 1 caso è risultata suggestiva per PV, in 3 casi per PMF (1 grado 1 e 2 grado 0) ed in un caso per trombocitosi secondaria. Il nostro studio conferma che, sebbene la maggior parte dei bambini non presenti un marker di clonalità, le mutazioni classiche delle MPN sono presenti anche nella ET pediatrica con una proporzione simile a quella delle forme dell’adulto. I criteri istologici WHO sono in grado, anche nella popolazione pediatrica, di identificare ET, PV e PMF e di distinguere forme primitive e secondarie di trombocitosi. In conclusione, i criteri WHO sembrano adeguati per tutte le fasce d’età. Ciò impone una completa valutazione biomolecolare ed istologica anche nei bambini con sospetta ET.

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GUGLIELMELLI, PAOLA. "Correlazioni tra genotipo e fenotipo nelle sindromi mieloproliferative croniche Ph-negative." Doctoral thesis, 2010. http://hdl.handle.net/2158/599006.

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BARTALUCCI, NICCOLO'. "Studio della via di segnalazione Akt/mTOR nelle Neoplasie Mieloproliferative Croniche." Doctoral thesis, 2012. http://hdl.handle.net/2158/653109.

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Abstract:

Lo studio oggetto di questa tesi di dottorato è stato incentrato sulla valutazione degli effetti dell’inibizione delle vie di segnalazione intracellulare JAK/STAT e Akt/mTOR nelle Neoplasie Mieloproliferative Croniche tramite l’utilizzo di inibitori selettivi delle citate vie segnalatorie. Lo studio è stato condotto su linee cellulari, cellule primarie da pazienti e sul modello murino SCID BaF3 JAK2V617F dimostrando l’efficacia dell’inibizione combinata delle due vie di segnalazione in tali patologie.

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BOGANI, COSTANZA. "Caratterizzazione di alterazioni molecolari relative alla patogenesi delle Neoplasie Mieloproliferative Croniche." Doctoral thesis, 2009. http://hdl.handle.net/2158/653344.

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Abstract:

Il primo obiettivo dello studio è stato di chiarire il ruolo svolto dal sistema CXCR4-SDF1 nella abnorme circolazione di cellule CD34+ nei pazienti con PMF. Il secondo obiettivo dello studio è stato di analizzare il coinvolgimento della pathway PI3K/AKT/mTOR nella deregolazione funzionale dei progenitori ematopoietici di pazienti con Policitemia Vera e Mielofibrosi Primaria.

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Paoli, Chiara. "Sviluppo e gestione di studi clinici indipendenti di Fase I/II nelle Neoplasie Mieloproliferative Croniche." Doctoral thesis, 2018. http://hdl.handle.net/2158/1119815.

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Abstract:

Le malattie mieloproliferative sono patologie neoplastiche rare, che possono colpire ogni fascia di età, ma con incidenza crescente stimata essere pari a 1.8 casi/100.000 persone-anno in Europa, e sono caratterizzate da una serie di mutazioni a carico di geni come JAK2, presente nella quasi totalità dei pazienti affetti da Policitemia Vera (PV; 95%) e in una proporzione significativa di pazienti affetti da Trombocitemia Essenziale (ET; 55%) e Mielofibrosi Primaria (PMF; 65%), oppure MPL, presente nel, 5-8% di ET e PMF, o calreticulina (CALR) presente nel 20-25% dei casi con ET e PMF. Tali mutazioni causano l’attivazione disregolata della via di segnalazione JAK/STAT, che rappresenta quindi un bersaglio molecolare negli studi pre-clinici (target-based), su cui testare l’attività di nuove molecole per studi farmacologici. Tale screening si è molto arricchito grazie all’incremento delle conoscenze sui pathways molecolari che regolano la proliferazione cellulare oltre la via classica JAK/STAT. I farmaci Ruxolitinib (inibitore di JAK2) ed Everolimus (inibitore di mTOR) rientrano nella così detta “target therapy”, ovvero molecole capaci di agire direttamente su un meccanismo chiave coinvolto nella patogenesi delle Malattie Mieloproliferative Croniche. L’esperienza su questi farmaci, derivante da studi pre-clinici, ha permesso di elaborare e progettare due studi clinici rispettivamente di fase II e fase Ib-II: - “Safety and efficacy of ruxolitinib in splanchnic vein thrombosis associated with myeloproliferative neoplasms (SVT-RUXO)”; - “A phase Ib-II, open-label, multi-center, dose-finding study to assess the safety and efficacy of the oral combination of Ruxolitinib and EVErolimus in subjects with a primary MYelofibrosis, post- polycythemia vera-myelofibrosis , or post- essential thrombocythemia-myelofibrosis (REVEMY)”. Partendo dal presupposto che gli studi clinici nascono dall’esigenza di innovare la terapia e rispondere ai bisogni di salute dell’individuo, è indubbio che una organizzazione ben strutturata, come quella di una Clinical Trial Unit (CTU), possa permettere di svolgere le attività connesse alla gestione di uno studio clinico, a garanzia di elevati standard di qualità. Il processo della ricerca clinica è basato infatti su una organizzazione molto complessa di figure professionali, obiettivi e risorse. Per poter gestire i due studi oggetto del presente dottorato, nel rispetto delle normative vigenti in materia di Sperimentazione, è stato necessario svolgere attività di Clinical Research Process Management, sviluppando procedure operative standard (SOP) interne al mio gruppo di ricerca. Il mio lavoro è quindi iniziato dalla organizzazione e strutturazione di una CTU per la quale ho preparato tutte le necessarie procedure scritte e relative checklist, in accordo alle linee guida della Buona Pratica Clinica, con l’obiettivo di facilitare l’operatività, agire secondo le indicazioni della normativa vigente, ma soprattutto agire con sicurezza per i pazienti ed efficacia. Questa iniziale attività si è concretizzata operativamente nella gestione e conduzione di uno studio clinico, SVT-RUXO, i cui risultati sono stati pubblicati di recente e attraverso il quale è stato possibile dimostrare la sicurezza ed efficacia di ruxolitinib in pazienti con trombosi splancnica associata a neoplasia mieloproliferativa.

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GUARNOTTA, Carla. "Ruolo delle cellule staminali mesenchimali del midollo osseo nella storia naturale delle Neoplasie Mieloproliferative Philadelphia negative." Doctoral thesis, 2012. http://hdl.handle.net/10447/100751.

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PIERI, LISA. "Study of new molecular alterations on Philadelphia-negative chronic myeloproliferative neoplasms." Doctoral thesis, 2013. http://hdl.handle.net/2158/804681.

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Abstract:

Lo studio si è basato su tecnologia di SNP array per identificare regioni cromosomiche oggetto di alterazioni di copy number in un’ampia casisitica di pazienti con neoplasie mieloproliferative croniche Ph-negative, sia nella fase cronica di malattia sia soprattutto nella transizione ad una leucemia acuta. Sulla base di una di queste anomalie identificate, sono poi state condotte ulteriori ricerche che hanno permesso di identificare una nuova anomalia molecolare, non descritta in precedenza, che genera un trascritto chimerico di fusione che è in avanzata fase di caratterizzazione. In this study SNP array technology was used to identify chromosomal regions subject to copy number alterations in a wide number of patients with Ph-negative chronic myeloproliferative neoplasms, both in the chronic phase of the disease and in the transition to acute leukemia. On the basis of these first results, further studies were conducted that allow to identified a new molecular defect, not previously described, which generates a chimeric fusion transcript that is in an advanced stage of characterization.

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Lamas, António Luís dos Santos. "Alterações genéticas e epigenéticas nas neoplasias mieloproliferativas." Master's thesis, 2015. https://repositorio-aberto.up.pt/handle/10216/81826.

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Lamas, António Luís dos Santos. "Alterações genéticas e epigenéticas nas neoplasias mieloproliferativas." Dissertação, 2015. https://repositorio-aberto.up.pt/handle/10216/81826.

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ANTONIOLI, ELISABETTA. "Nuovi target terapeutici nelle malattie mieloproliferativa croniche Ph negative." Doctoral thesis, 2011. http://hdl.handle.net/2158/653295.

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Abstract:

La ricerca ha avuto la fianlità di analizzare il potenziale d'uso di di alcune nuove molecole, come i JAK1 e JAK2 inibitori, gli inibitori di mTOR, gli inibitori delle iston deacetilase e l’aplidina, sia in vitro che in vivo, in pazienti affetti da neoplasie mieloproliferative croniche, al fine di valutarne la sicurezza e l’efficacia, come nuovi potenziali trattamenti

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Cardoso, Adalberto Nuno Santos. "Neoplasias mieloproliferativas cromossoma filadélfia negativas : do diagnóstico ao prognóstico." Master's thesis, 2018. http://hdl.handle.net/10451/41746.

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Abstract:

Trabalho Final do Curso de Mestrado Integrado em Medicina, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, 2018
As neoplasias mieloproliferativas cromossoma de Filadélfia negativas (NMP-Ph-) são patologias hematopoiéticas crónicas caracterizadas pela expansão clonal de células mielóides maduras, de linhagem diferente consoante o subtipo de doença. Com a revisão da classificação das neoplasias mielóides crónicas pela OMS em 2016, a subcategoria das NMP-Ph- inclui a Policitemia vera (PV), a Trombocitemia essencial (TE), Mielofibrose primária (MFP) e Mielofibrose primária pré-fibrótica (pre-MFP). A história natural destas doenças é caracterizada por uma hematopoiese extramedular e complicações trombohemorrágicas, sendo que os eventos potencialmente mais graves são a evolução para mielofibrose ou a transformação em leucemia mielóide aguda. A informação genómica tem tido um papel principal na descoberta das mutações promotoras dos mecanismos fisiopatológicos destas patologias, tendo começado com a descoberta das mutações da tirosina cinase JAK2 (mutação JAK2V617F e no exão 12), no gene do recetor da trombopoietina (MPL) e diferentes tipos de mutações do gene da calreticulina (CALR).(9) O surgimento das técnicas de nova geração na sequenciação de genes, permitiu a identificação de novas mutações adicionais, nomeadamente em genes envolvidos na regulação epigenética ou sinalização intracelular, mas que não são específicas das NMP-Ph-. Foi já identificada uma assinatura de “alto risco molecular” em doentes com MFP, composta por mutações em cinco genes (ASXL1, EZH2, IDH1, IDH2 e SRSF2) que predizem pior sobrevivência global e risco aumentado de transformação leucémica. Veremos de que forma estas alterações genéticas contribuem e influenciam o prognóstico dos doentes com NMP-Ph-, e como a informação de variáveis clínicas e/ou moleculares é utilizada na elaboração dos modelos de prognóstico. O Trabalho Final exprime a opinião do autor e não da FML.
Philadelphia chromosome negative myeloproliferative neoplasms (MPN-Ph-) are chronic myeloproliferative neoplasms characterized by clonal expansion of an abnormal hematopoietic progenitor cell, of different myeloid lineage depending on the disease subtype. With the 2016’s WHO revised classification of chronic myeloid neoplasms, MPN-Ph- is an operational sub-category which includes Polycythemia vera (PV), Essential thrombocythemia, Primary myelofibrosis (PMF), and prefibrotic Primary myelofibrosis (pre-PMF). Their natural history is characterized by extramedullary hematopoiesis, thrombo-hemorrhagic complications, but the most potentially aggressive events are a propensity to transform into myelofibrosis and leukemic transformation into acute myeloid leukemia. Genomic information has played a major role in the discovery of principal pathogenetic driver mutations of MNP-Ph-, beginning with the JAK2 tyrosine kinase (JAK2V617F and exon 12), thrombopoietin receptor gene (MPL) and different types of calreticulin’s gene mutations (CALR). The development of next generation sequencing has allowed the identification of several additional acquired mutations in Ph-negative MPNs, namely epigenetics regulators, intracellular signaling, or spliceosome genes’, however these mutations are not restricted to MNP-Ph-. A “high molecular risk” signature was recently identified in patients with PMF, composed by mutations in five genes (ASXL1, EZH2, IDH1, IDH2 e SRSF2), who have significantly shorter overall survival and enhanced risk of transformation to acute leukemia. We shall see how these genetic alterations affect and determine the MNP-Ph- patients’ prognosis, and how this information is translated into prognostic models. This Final Work expresses the author’s opinion and not that of FML.

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Virtuoso, João Nunes da Silva. "Alterações genéticas com interesse prognóstico nas doenças mieloproliferativas crónicas bcr-abl negativas." Master's thesis, 2014. http://hdl.handle.net/10451/24124.

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Abstract:

Trabalho Final do Curso de Mestrado Integrado em Medicina, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, 2014
The chronic myeloproliferative diseases ( PV , ET and MFP ) are characterized by excessive proliferation of one or more cells of the myeloid line cells having a normal maturation. In 2005 was identified a genetic alteration , Janus kinase 2 ( JAK 2 ) , which led to several studies and subsequently to the discovery of other genetic changes , such as TET2 , CBL , MPL , IDH1 and 2 , LNK , ASXL1 , EZH2 , DNMT3A , IKFZ1 and TP53. The relevance to the prognosis of disease progression and therapeutic intervention in these pathologies level has been studied . The CBL , LNK , IDH1 and 2 , ASXL1 , EZH2 , DNMT3A , and TP53 mutations IKFZ1 are apparently related to a worse prognosis and a higher risk of progression to AML. There has also been a significant therapeutic benefit in the use of inhibitors of JAK2 for the symptomatic control and improving the quality of life of patients with myeloproliferative disorders . The same may occur if possible therapy directed at other mutations with prognostic and therapeutic importance . It is believed that with the understanding of all these processes , may eventually establish new criteria for diagnosis and prognosis, as well as improve their therapeutic approach.
As doenças mieloproliferativas crónicas (a PV, a TE e a MFP) são caracterizadas por uma proliferação excessiva de uma ou mais células da linha mieloide, tendo as células uma maturação normal. No ano 2005 identificou-se uma alteração genética, cinase janus 2 (JAK 2), que levou à realização de vários estudos e posteriormente à descoberta de outras alterações genéticas, como são os casos das TET2, CBL, MPL, IDH1 e 2, LNK, ASXL1, EZH2, DNMT3A, IKFZ1 e TP53. A sua importância ao nível do prognóstico, da progressão da doença e de intervenção terapêutica nestas patologias, tem sido alvo de estudo. As mutações CBL, LNK, IDH1 e 2, ASXL1, Ezh2, Dnmt3a, IKFZ1 e TP53 estão, aparentemente, relacionadas com um pior prognóstico e maior risco de progressão para LMA. Tem-se verificado ainda um grande benefício terapêutico na utilização dos inibidores de JAK2 no controlo sintomático e na melhoria da qualidade de vida dos doentes com doenças mieloproliferativas. O mesmo poderá ocorrer se for possível uma terapêutica dirigida para outras mutações com importância prognóstica e terapêutica. Crê-se que com a compreensão de todos estes processos, se poderão eventualmente estabelecer novos critérios de diagnóstico e prognóstico, bem como melhorar a sua abordagem terapêutica.

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Figueiredo, Inês Fernandes Carmo de Carvalho. "Neoplasias mieloproliferativas BCR-ABL negativas: A propósito de um caso clínico - "case report"." Master's thesis, 2015. https://repositorio-aberto.up.pt/handle/10216/81844.

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Dissertations / Theses on the topic 'Mieloproliferative'

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