Academic literature on the topic 'Microscopie haute résolutive'

Cet article décrit le projet de fin d’étude mis au point au sein du Master Réseaux et Télécommunications parcours SYSCOM (Systèmes Communicants) de l’Université de Lille. Le projet vise à développer des solutions hyperfréquences pour la ville intelligente (Smart City). Les développements techniques et scientifiques reposent sur la plate-forme hyperfréquence du GIP-CNFM de Lille qui comprend toutes les installations nécessaires pour mener à bien un projet complet comprenant l'analyse, la conception et la réalisation de composants et circuits hyperfréquences. En particulier, deux projets menés de concert sont décrits. Le premier projet vise à développer un radar hyperfréquence monostatique opérant à 6,2 GHz pour la mesure sans contact des fréquences respiratoire et cardiaque d’un individu. Le deuxième projet ambitionne de développer un microscope électromagnétique original pour le Contrôle Non Destructive (CND) de matériaux à haute résolution spatiale. Un cahier des charges en terme de coût, de performances de mesure et de possibilités d’intégration est défini préalablement avec pour objectif de développer des solutions économiques viables.

La microscopie optique est une technique centrale en biologie cellulaire, mais la diffraction limite sa résolution à environ 200-300 nm. Par conséquent, de nombreuses structures moléculaires telles que les virus, les pores nucléaires ou les microtubules, ne peuvent pas être résolues. La microscopie de localisation à molécule unique (SMLM) offre une résolution spatiale élevée (20 nm ou mieux), permettant de résoudre les structures biologiques à l'échelle moléculaire. Cependant, la SMLM nécessite l'acquisition de plusieurs milliers d’images à base résolution, ce qui limite ses applications aux cellules fixes ou aux structures à dynamique lente. Pour surmonter cette limitation, Ouyang et al. (2018) ont développé une approche d'apprentissage profond appelée ANNA-PALM, capable de reconstruire des images super-résolutives à partir d'un nombre beaucoup plus réduit d'images à basse résolution. Cependant, la méthode ANNA-PALM originale présente plusieurs contraintes. Tout d'abord, cette méthode présente des artefacts lorsqu'elle est appliquée à des images obtenues avec des protocoles ou dans des conditions expérimentales différents des données d'entraînement. Par ailleurs, ANNA-PALMn'a été démontrée que sur des cellules fixes. Ma thèse vise à résoudre ces limitations : 1) en améliorant la robustesse d’ANNA-PALM pour des données issues de laboratoires ou de conditions expérimentales différents et 2) en l’étendant à la visualisation super-résolutive de structures biologiques dynamiques dans les cellules vivantes. 1. Amélioration de la robustesse d'ANNA PALM : notre laboratoire a développé ShareLoc, une plateforme en ligne (shareloc.xyz) qui permet la collecte, la visualisation et la réutilisation des données SMLM acquises par la communauté de microscopie. Dans un premier temps, j’ai validé les fonctionnalités de la plateforme, effectué la curation des données SMLM, implémenté l'ontologie ShareLoc et rédigé la documentation. Ensuite, j'ai ré-entraîné ANNA-PALM sur des images en plus grande quantité et plus variées partagées sur ShareLoc. J’ai évalué quantitativement la qualité des images reconstruites par rapport au modèle original. J'ai démontré une amélioration significative de la robustesse et de la qualité des reconstructions par ANNA-PALM, en particulier pour des images de microtubules prises dans des conditions biologiques différentes de celles des images d'entraînement. 2. Extension d'ANNA-PALM à la reconstruction de films super-résolutifs de la dynamique structurelle en cellules vivantes : pour éviter le floutage dû à la dynamique des structures, chaque image super-résolutive du film reconstruit est basée sur un faible nombre d'images consécutives à basse résolution, ce qui conduit à un sous-échantillonnage important de la structure, qui restreint la résolution. Bien qu'ANNA-PALM puisse reconstruire des images super-résolutives à partir de images sous-échantillonnées, pour les cellules vivantes l’entraînement du modèle et l'évaluation de la qualité des reconstructions sont plus difficiles en raison de l'absence de vérité terrain. Pour relever ces défis, j'ai développé une méthode pour créer des vérités terrain super-résolutives dynamiques à partir d’images SMLM statiques. J'ai appliqué cette stratégie à des données simulées ainsi qu’à des données expérimentales de microtubules. Ensuite, j'ai étendu l’architecture d’ANNA-PALM à des données 3D dont la troisième dimension est le temps, afin d’exploiter l'information temporelle. J'ai utilisé des simulations de microtubules en mouvement pour évaluer quantitativement la qualité des reconstructions par cette approche, en comparaison avec la méthode ANNA-PALM 2D originale, et en fonction de la vitesse des structures et des taux de localisation. Les résultats montrent que l'incorporation d'informations temporelles améliore considérablement la qualité des reconstructions [...]
While microscopy has been a central technique for cell biology since centuries, it has long been limited by diffraction to a resolution of ~200-300 nm. As a consequence, many molecular structures, such as viruses, nuclear pores, or microtubules were left unresolved. Single-molecule localization microscopy (SMLM) offers a high spatial resolution (e.g., 20 nm or better), allowing to resolve biological structures at or near the molecular scale. However, SMLM acquisition necessitates acquiring many thousands of low-resolution frames, mostly limiting its applications to fixed cells or to structures undergoing slow dynamics. To overcome this limitation, Ouyang et al. (2018) developed a deep learning-based approach called ANNA-PALM that can reconstruct a super-resolution image from much fewer low-resolution frames. However, the original ANNA-PALM method faced several limitations. First, ANNA-PALM had only been trained and tested on images from our laboratory. Second, the method exhibits artifacts when applied to images obtained using different protocols or experimental conditions than the training data. Third, ANNA-PALM had only been demonstrated on fixed cells. The objectives of my Ph.D. thesis are to address these limitations by 1) improving the robustness of ANNA-PALM reconstructions when applied to data obtained from distinct laboratories and 2) extending ANNA-PALM to reconstruct super-resolved time-lapse image sequences for dynamic biologicalstructures in live cells. 1. Improving the robustness of ANNA PALM: an obvious approach to improve robustness is to retrain the model using a larger and more varied data set. However, SMLM datasets are not usually publicly accessible. To address this, our lab developed ShareLoc, an online platform (shareloc.xyz) that allows the gathering and reuse of SMLM datasets acquired by the microscopy community. I first validated the platform's functionalities, curated SMLM data, implemented a ShareLoc ontology, and wrote relevant documentation. Next, I took advantage of ShareLoc data to retrain ANNA-PALM on larger and more diverse images and quantitatively evaluated the image reconstruction quality compared to the original model. I demonstrated that the robustness and reconstruction quality of ANNA-PALM significantly improved, notably when applied to images of microtubules taken under biological perturbation conditions never seen by the model during training. 2. Extending ANNA-PALM to reconstruct super-resolution movies of moving structures in live cells: achieving high-quality super-resolution reconstructions of structural dynamics is challenging. To avoid motion blur, each frame of the reconstructed movie is defined from localizations in only a small number of consecutive low-resolution frames. This leads to a strong under-sampling of the structures by single molecule localization events and does not enable super-resolution. Although ANNA-PALM can reconstruct high-quality super-resolved images from under-sampled localization data, training ANNA-PALM for live cells is more difficult, because a clear ground truth is lacking. The absence of ground truth also makes it difficult to assess reconstruction quality. To address these challenges, I first developed a method to generate ground truth super-resolution movies from static SMLM images obtained from long acquisition sequences. I implemented and tested this strategy using both simulated and experimental SMLM images. Second, I extended the ANNA-PALM architecture to 3D data, where the third dimension is time, in order to incorporate temporal information. I used simulations of microtubule dynamics to quantitatively evaluate the reconstruction quality of this approach in comparison with the original 2D ANNA-PALM, and as function of structure velocity and localization rates. [...]

Nous avons développé un microscope tomographique diffractif en réflexion, qui permet d’observer la surface d’un échantillon avec une résolution latérale améliorée comparée à un microscope holographique conventionnel. À partir des même données expérimentales (les hologrammes acquis sous différents angles d’illumination), des mesures à haute précision longitudinale peuvent être réalisées sur la surface d’un échantillon purement réfléchissant, par reconstruction du profil de hauteur à partir de la phase. Cette méthode d’imagerie multimodale présente plusieurs avantages comparée aux mesures en holographie interférométrique classique : amélioration de la résolution latérale sur la partie diffractive, déroulement de phase facilité, réduction du bruit cohérent, l’ensemble étant associé à la grande précision longitudinale fournie par les mesures de phase. Nous montrons ces possibilités en imageant divers échantillons minces
We have developed a tomographic diffractive microscope in reflection, which permits observation of sample surfaces with an improved lateral resolution, compared to a conventional holographic microscope. From the same set of data, high-precision measurements can be performed on the shape of the reflective surface by reconstructing the phase of the diffracted field. doing so allows for several advantages compared to classical holographic interferometric measurements: improvement in lateral resolution, easier phase unwrapping, reduction of the coherent noise, combined with the high-longitudinal precision provided by interferometric phase measurements. We demonstrate these capabilities by imaging various test samples

En microscopie optique la limite classique de résolution, atteinte dès la fin du XIXème, est de l'ordre de 200nm. Actuellement, l'étude de nombreux problèmes biologiques nécessite d'un pouvoir de séparation plus important. Afin de contourner cette limite qui suppose une illumination uniforme de l'échantillon comme de l'objectif et une seule prise d'image (cf. Microscopie plein champ), de nouvelles méthodes d'illumination et d'acquisition ont été développées avec des résultats très encourageants. Ces nouvelles techniques s'appuient sur des illuminations non uniformes de l'échantillon et requièrent l'acquisition de plusieurs images. La technique développée au cours de ce travail de thèse s'appuie sur l'illumination structurée. Cette technique consiste à créer une illumination spatialement périodique au niveau de l'échantillon par l'interférence de deux faisceaux cohérents. La fréquence spatiale caractéristique du motif d'illumination se combine avec les fréquences spatiales de l'échantillon. De ce fait les hautes fréquences spatiales de l'objet, qui correspondent à l'information des petits détails, passeront à travers le système optique qui est défini comme un filtre passe-bas de fréquences spatiales. Ensuite, il suffit de récupérer cette information pour reconstruire une image plus résolue. De cette façon la résolution latérale d'un microscope est augmentée d'un facteur deux. A partir de ce système on propose l'illumination de l'objet avec l'interférence de trois faisceaux cohérents afin de créer au même temps une illumination structurée latérale et axiale. Pour éliminer les composants mécaniques du système d'illumination on propose l'introduction d'éléments optiques programmables. De ce fait, les déplacements des figures d'interférences sont plus précises et rapides. Avec ce système on a réussi à démontrer la localisation des particules le long de l'axe optique de l'objectif tout en conservant le gain en résolution latérale. De même on a réussi a réaliser des coupes optiques avec ce système.

Les travaux présentés dans cette thèse s’appliquent à la caractérisation de propriétés mécaniques par la microscopie acoustique. Ils décrivent un capteur focalisé innovant qui autorise à la fois une topographie et une imagerie quantitative d’un matériau élastique. L’innovation consiste en la séparation des différents modes de propagation d’un matériau excité par une sonde focalisée multiélément. La mesure par temps de vol de la vitesse de propagation des modes de surfaces de matériaux élastiques et anisotropes offre une possibilité de quantification du module caractérisant l’élasticité : le module de Young. Le dimensionnement de la sonde multiélément qui est décrit ici est rendu possible grâce au développement d’un modèle de champs acoustiques permettant d’anticiper le champ rayonné par chaque élément. Un deuxième modèle traitant de l’étude temporel des signaux reçus par la sonde focalisée est aussi présenté pour vérifier le comportement discriminant de la sonde des différentes ondes pouvant se propager. La mesure de propriétés mécaniques par la sonde focalisée est appliquée à différents échantillons et propose des résultats cohérents avec une grande sensibilité. La possibilité de réaliser des images de propriétés mécaniques est ainsi démontrée. D’abord adaptée pour des fréquences de l’ordre de la trentaine de mégahertz, cette sonde possède un nombre limité d’éléments pour assurer une simplicité de conception et de fabrication permettant par la suite une miniaturisation du capteur pour atteindre des fréquences proches du gigahertz
The work presented in this thesis is applied to the characterization of mechanical properties by acoustic microscopy. It describes an innovative focused sensor that enables both topography and quantitative imaging of an elastic material. The innovation consists in the separation of the different propagation modes of a material excited by a focused multielement probe. Measuring the surface mode propagation velocity of elastic and anisotropic materials thanks to their time of flight provides a possibility of quantifying the module characterizing the elasticity: the Young's modulus. The dimensions of the multielement probe are described here and rely on an acoustic field model developed to anticipate the field radiated by each element. A second model studies the temporal behaviour of the focused probe and also verifies the discrimination of the different waves that propagate. The measurement of mechanical properties by the multielement probe is applied to different samples and provides consistent results with high sensitivity. The ability to produce images of mechanical properties is thus demonstrated. First suitable for frequencies near thirty megahertz, this sensor has a limited number of elements to ensure a simplicity of design and manufacture for a subsequent miniaturization of the sensor to achieve frequencies near the gigahertz

Dans ce manuscrit est présentée l’étude de nouvelles techniques de microscopie tridimensionnelle destinées à l’imagerie à haute résolution (~ 1 µm) de milieux biologiques. Ces techniques sont basées sur la microscopie par cohérence optique, dont le principe est d’exploiter la faible longueur de cohérence d’une source de lumière blanche dans un microscope interférométrique, pour réaliser des coupes tomographiques sans balayage et de manière non destructive d’échantillons diffusants. Une autre méthode, ayant pour ambition de produire des images tomographiques de la présence de structures, avec une résolution spatiale dépassant la limite de diffraction (10-100 nm), a également été étudiée. Elle utilise des nano-particules d’or comme sondes locales multiples pour explorer les contours des structures creuses internes à l’échantillon.

La profondeur possible d’imagerie en laser-scanning microscopie est limitée non seulement par la distance de travail des lentilles de objectifs mais également par la dégradation de l’image causée par une atténuation et une diffraction de la lumière passant à travers l’échantillon. Afin d’étendre cette limite, il est possible, soit de retourner le spécimen pour enregistrer les images depuis chaque côté, or couper progressivement la partie supérieure de l’échantillon au fur et à mesure de l‘acquisition. Les différentes images prises de l’une de ces manières doivent ensuite être combinées pour générer un volume unique. Cependant, des mouvements de l’échantillon durant les procédures d’acquisition engendrent un décalage non seulement sur en translation selon les axes x, y et z mais également en rotation autour de ces même axes, rendant la fusion entres ces multiples images difficile. Nous avons développé une nouvelle approche appelée 2D-SIFT-in-3D-Space utilisant les SIFT (scale Invariant Feature Transform) pour atteindre un recalage robuste en trois dimensions de deux images. Notre méthode recale les images en corrigeant séparément les translations et rotations sur les trois axes grâce à l’extraction et l’association de caractéristiques stables de leurs coupes transversales bidimensionnelles. Pour évaluer la qualité du recalage, nous avons également développé un simulateur d’images de laser-scanning microscopie qui génère une paire d’images 3D virtuelle dans laquelle le niveau de bruit et les angles de rotations entre les angles de rotation sont contrôlés avec des paramètres connus. Pour une concaténation précise et naturelle de deux images, nous avons également développé un module permettant une compensation progressive de la luminosité et du contraste en fonction de la distance à la surface de l’échantillon. Ces outils ont été utilisés avec succès pour l’obtention d’images tridimensionnelles de haute résolution du cerveau de la mouche Drosophila melanogaster, particulièrement des neurones dopaminergiques, octopaminergiques et de leurs synapses. Ces neurones monoamines sont particulièrement important pour le fonctionnement du cerveau et une étude de leur réseau et connectivité est nécessaire pour comprendre leurs interactions. Si une évolution de leur connectivité au cours du temps n’a pas pu être démontrée via l’analyse de la répartition des sites synaptiques, l’étude suggère cependant que l’inactivation de l’un de ces types de neurones entraine des changements drastiques dans le réseau neuronal
Although laser scanning microscopy is a powerful tool for obtaining thin optical sections, the possible depth of imaging is limited by the working distance of the microscope objective but also by the image degradation caused by the attenuation of both excitation laser beam and the light emitted from the fluorescence-labeled objects. Several workaround techniques have been employed to overcome this problem, such as recording the images from both sides of the sample, or by progressively cutting off the sample surface. The different views must then be combined in a unique volume. However, a straightforward concatenation is often not possible, because the small rotations that occur during the acquisition procedure, not only in translation along x, y and z axes but also in rotation around those axis, making the fusion uneasy. To address this problem we implemented a new algorithm called 2D-SIFT-in-3D-Space using SIFT (scale Invariant Feature Transform) to achieve a robust registration of big image stacks. Our method register the images fixing separately rotations and translations around the three axes using the extraction and matching of stable features in 2D cross-sections. In order to evaluate the registration quality, we created a simulator that generates artificial images that mimic laser scanning image stacks to make a mock pair of image stacks one of which is made from the same stack with the other but is rotated arbitrarily with known angles and filtered with a known noise. For a precise and natural-looking concatenation of the two images, we also developed a module progressively correcting the sample brightness and contrast depending on the sample surface. Those tools we successfully used to generate tridimensional high resolution images of the fly Drosophila melanogaster brain, in particular, its octopaminergic and dopaminergic neurons and their synapses. Those monoamine neurons appear to be determinant in the correct operating of the central nervous system and a precise and systematic analysis of their evolution and interaction is necessary to understand its mechanisms. If an evolution over time could not be highlighted through the pre-synaptic sites analysis, our study suggests however that the inactivation of one of these neuron types triggers drastic changes in the neural network

De nos jours, l'industrie de la catalyse a besoin de comprendre ce qui se passe à l'échelle moléculaire pour améliorer un procédé à l'échelle industrielle. L'analyse locale montre une grande capacité dans ce domaine, particulièrement le SECM (Scanning Electrochemical Microscopy) ou microscopie électrochimique, une technique locale fréquemment appliquée aux études d'électrocatalyse ces dernières années. Dans ce travail, la fabrication d’ultramicroélectrodes (UME) sondes de 300 nm et leurs caractérisations a été entreprise. Des courants limites de diffusion de l’ordre de 70 pA ont pu être mesurés. Le coefficient de diffusion de plusieurs médiateurs redox a été déterminé. L'électrogénération du peroxodisulfate à partir du H2SO4 concentré sur des réseaux de microélectrodes de diamant dopé (BDD-MEA) a été étudiée. Le peroxodisulfate est détecté au voisinage de la microélectrode génératrice en BDD, avec la sonde en or du SECM, seulement quand le potentiel du réseau est supérieur à 2,1 V vs. AgCl/Ag. L'intérêt principal du travail avec des MEAs vient du fait que la densité et l'efficacité des courants sont comparables avec ceux observés dans la production industrielle du peroxodisulfate. Les études locales montrent que la génération du peroxodisulfate est liée à la formation d’espèces activées par la surface selon un mécanisme réactionnel complexe. Ensuite, une méthode de détection photo-électrochimique basée sur des UME-fibres optiques pour étudier l'influence de radicaux libres dans ce mécanisme d’électrogénération a été développée. Enfin, une combinaison entre la voltammétrie cyclique à haute vitesse de balayage et le SECM a été faite pour réaliser des mesures transitoires

L’un des enjeux du XXI siècle concerne la compréhension de la machine cellulaire. Le principal problème à l’heure actuelle que rencontrent les biologistes est la diffraction due à la nature ondulatoire de la lumière qui limite la résolution des instruments optiques. Dans cette thèse, nous avons montré pour la première fois que l’up-conversion présent dans les nanoparticules dopées terres rares pouvaient dépasser la limite d’Abbe. Nous avons montré que la résolution latérale dans notre microscope pouvait dépasser λ/5 bien supérieure à la limite d’abbe. Ce concept permet d’atteindre des résolutions proches de 180 nm pour des processus à 4 photons. Ces résultats sont intéressants, ils permettent d’obtenir des résolutions proches d’un microscope confocal, tout en conservant l’excitation infrarouge de faible puissance de l’ordre de quelques µW, permettant de nous s’affranchir d’un laser femto-seconde, et donc de développer un microscope multi-photon à bas cout
Major bottleneck in microscopic imaging is the limited lateral resolution due to the diffraction of light. To overcome this limit, here we demonstrate the up-conversion process in the rare earth doped nanoparticles, which may serve as an original fluorescence source mechanism. Rare earth doped nanoparticles, have been reported to serve as efficient bio-labels for cellular and small animal imaging. In this work, we demonstrate that non-linearity of up-conversion allows achieving high lateral resolution in the images using multiphoton microscopy, demonstrating significant improvement in lateral resolution, using low pumping laser power. This new technique may serve as another approach for high-resolution optical imaging

Ce travail consiste en l'étude et la mise en oeuvre d'une microscopie optique en champ proche utilisant des nano- antennes annulaires dans le but de distinguer les composantes électriques et magnétiques du champ électromagnétique, détectées au voisinage d'un échantillon. Nous présentons la genèse de la microscopie en champ proche en mettant en avant l'importance des caractéristiques intrinsèques du système d'éclairage employé mais également le rôle primordial du nanocollecteur en interaction avec le champ électromagnétique. Les antennes étant un des enjeux majeurs dans l'art de détecter les champs électromagnétiques, nous donnons ensuite une cartographie des antennes dans différents domaines de fréquences ainsi que leurs applications respectives en champ proche. Puis nous exposons les étapes nécessaires à la fabrication d'une nano-antenne annulaire métallique aux dimensions spécifiques, à l'extrémité d'une fibre optique. La description du système d'éclairage et du montage général de caractérisation nous amène enfin à présenter l'étude d'un nouveau type de sonde que constitue une nano-antenne annulaire usinée à l'extrémité d'un micro-axicon fibré. En exploitant les propriétés d'un faisceau de Bessel polarisé polychromatique, nous accédons aux propriétés de collection de la structure annulaire. Nous mettons en évidence le fait que ces antennes peuvent collecter spécifiquement la composante longitudinale du champ électrique en polarisation radiale ou du champ magnétique en polarisation orthoradiale. L'analyse des propriétés magnétiques et électriques d'échantillons en microscopie optique champ proche s'annoncent, de ce fait, sous un nouveau jour
This work consists of the study and the implementation of a near-field optical microscopy using annular nano-antennas to distinguish electric and magnetic components of the electromagnetic field, detected close to a sample. We present near-field microscopy by advancing the importance of intrinsic characteristics of an illumination system, and also the role of nanocollector in interaction with electromagnetic field. The antennas are one of major stake in the art to detect electromagnetic fields, then we give antennas mapping in various scope frequencies and their respective applications for near-field microscopy. We explain the fabrication in four steps of a metallic annular nano-antenna with specific size at the extremity of an optical fiber. After describing the illumination system and the experimental setup for the optical characterization, we present the study of a new typical probe: an annular nano-antenna at the extremity of fiber micro-axicon. By running the polychromatic polarized Bessel beam properties, we can access to collection properties due to the annular structure. We show that a nano-antenna can selectively collect the longitudinal component of the electric field from a radially polarized beam and the longitudinal component of the magnetic field from an azimuthally polarized beam. Therefore, we can expect a new analyze for electric or magnetic properties of samples in near-field scanning optical microscopy