Dissertations / Theses: 'Microscopie des cellules vivantes'

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VILLA, ANNA MARIA. "Microscopie confocale par fluorescence de cellules vivantes." Paris 6, 1998. http://www.theses.fr/1998PA066361.

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Abstract:

La distribution des marqueurs moleculaires et des medicaments fluorescents dans le cellules vivantes a ete etudiee par microscopie confocal a balayage (laser scanning confocal fluorescence microscopy - lscfm). En particulier, la distribution intracellulaire de la doxorubicine dans des cellules (k562 et mcf-7) sensibles et resistantes a permis d'etudier le phenomene de la resistance multiple (multidrug resistance, mdr). L'utilisation d'une detection a contage de photon sur le lscfm a permis de reduire la concentration de medicament et aussi la puissance du laser d'excitation afin de garantir la survivance des cellules. La distribution de doxorubicine dans des cellules vivantes est differente de celle dans des cellules fixees. Dans les cellules sensibles la doxorubicine est localisee dans l'appareil de golgi et dans les vesicules acides, tandis que dans les cellules resistantes la cible de la doxorubicine est localisee dans des organelles ponctuels, appeles punctate pattern. Cette distribution ne peut pas correspondre a l'appareil de golgi et non plus aux vesicules acides ou aux lysosomes comme montre dans la these par un etude avec la c6-nbd-ceramide et l'acridine orange. Pour etablir l'origine de la distribution ponctuelle, on a effectuee une etude des mitochondries avec la rhodamine 123, marqueur potentiometrique des mitochondries dans les cellules vivantes. A ete trouve que deux differentes populations de mitochondries caracterisent les cellules sensibles et les resistantes. Une population de mitochondries avec le forme en s habituelle est active dans les cellules sensibles, tandis que seulement une population de mitochondries ponctuels peut etre observee dans la region sous-membranaire des cellules resistantes. Pour mieux comprendre la difference dans les deux populations on a entrepris une etude par lscfm et par microspectrofluorimetrie avec du bromure d'ethidium qui est bien connu pour etre un marqueur des mitochondries dans les cellules vivantes.

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Salehi, Hamideh. "L'étude des cellules vivantes et la dentine humaine par microscopie confocale Raman." Thesis, Montpellier 1, 2013. http://www.theses.fr/2013MON12201/document.

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Abstract:

"L'étude des cellules vivantes et la dentine humaine par microscopie confocale Raman" La microscopie confocale Raman est utilisée pour suivre des médicaments et des nanoparticules dans les cellules et dans les tissus durs. La microscopie Raman est non-invasive, ne nécessite aucun marqueur et permet une imagerie à haute résolution. Dans la première partie de l'étude cette méthode est utilisée pour suivre un médicament anticancéreux, le paclitaxel, au sein d'une lignée de cellules cancéreuses vivantes Michigan Cancer Foundation-7 (MCF-7). Les images Raman ont été traitées par un algorithme de partitionnement des données par k-moyennes pour détecter le paclitaxel dans les cellules. La distribution du paclitaxel dans les cellules est vérifiée par le calcul du coefficient de corrélation de Pearson entre le spectre de référence du traitement et les spectres de l'image entière. Le temps progressif de diffusion du paclitaxel dans toute la cellule est observé. Cette observation demande une étude complémentaire sur l'action pharmaceutique du produit, basé sur la liaison rapide de la tubuline libre au paclitaxel cristallisé. L'apoptose dans les cellules a été suivies par partitionnement de données et par corrélation. Le partitionnement de données a été utilisé pour déterminer la position de mitochondries dans les cellules ; le cytochrome C de distribution à l'intérieur des cellules est basé sur l'analyse de corrélation. L'apoptose des cellules est défini par le cytochrome C dans le cytoplasme de diffusion. Le cytochrome C agit comme un déclencheur pour l'activation en cascade des caspases, et sa libération par les mitochondries est un signe d'apoptose. La Co-localisation de cytochrome C est effectuée après incubation de cellules avec une concentration différente de paclitaxel. L'autre produit étudié est le dioxyde de titane. Le titane est largement utilisé pour les matériaux orthopédiques et dentaires implantés dans le corps humain. Il est inévitable que le sang prenne contact avec la surface de l'implant et des nanoparticules. Les nanoparticules de dioxyde de titane ont été suivies en intracellulaire dans les cellules MCF-7 et TERT épithéliales humaines (lignée orale cellulaire de kératinocytes OKF6/TERT-2). La détection des nanoparticules et leur toxicité ont été étudiées en utilisant deux méthodes d'analyse. La microscopie confocale Raman a également été utilisée pour réaliser l'analyse structurale et chimique de la jonction émail-dentine-résine et de la carie dentaire, grâce à une analyse précise des constituants minéraux et organiques. La microscopie Raman associée à des méthodes d'analyse de données ouvre de nouvelles portes pour la recherche en biologie-santé et en particulier en odontologie
"The Study of living cells and human dentin by confocal Raman microscopy"Confocal Raman microscopy is employed to trace drugs and nanoparticles intracellular and in hard tissues. Raman spectroscopy a non-invasive, label-free and high spatial resolution imaging technique in first part of the study is being used to trace the anticancer drug paclitaxel in living Michigan Cancer Foundation-7 (MCF-7) cells. An analytical method was developed and applied to Raman data acquired. The Raman images were treated by K-mean cluster analysis to detect the drug in cells. Distribution of paclitaxel in cells is verified by calculating the Pearson correlation coefficient between the reference spectrum of the drug and the whole Raman image spectra. A time dependent gradual diffusion of paclitaxel all over the cell is observed suggesting a complementary picture of the pharmaceutical action of this drug based on rapid binding of free tubulin to crystallized paclitaxel. The apoptosis in the cells were followed by post-measurement analysis including K-mean clustering and Pearson correlation coefficient. K-mean clustering was used to determine mitochondria position in cells and cytochrome c distribution inside the cells was based on correlation analysis. Cell apoptosis is defined as cytochrome c diffusion in cytoplasm. Cytochrome c acts as a trigger for the activation of the caspase cascade, and its release from mitochondria is a sign of apoptosis. Co-localization of cytochrome c is done after cell incubation with different concentration of paclitaxel. The other product used was titanium dioxide. Titanium has been widely used for orthopedic and dental implant materials. When biomaterial is implanted into the human body, it is unavoidable that blood will contact the implant surface and nanoparticles. The question is: do these nanoparticles cause toxicity? Titanium dioxide nanoparticles were followed intracellular in MCF-7 cells and TERT epithelial human oral keratinocyte cell line (OKF6/TERT-2). Detection of nanoparticles and their toxicity were studied using two analytical methods. Confocal Raman microscopy were also used to obtain Structural analysis and chemical profile of Enamel – Dentine- Resin and Raman map of decay and sound dentin samples, through accurate analysis of the mineral and organic components. The Raman spectroscopy combined with this novel method developed in this study, will provide accurate finger prints of chemical composition and by post-measurement analysis of the data acquired more information would be obtained, which might open new gates in pharmaceutical and dentistry researches

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Sivéry, Aude. "Dynamique du stress en cellules vivantes." Thesis, Lille 1, 2014. http://www.theses.fr/2014LIL10051/document.

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Abstract:

La cellule lutte à chaque instant contre les perturbations afin de maintenir l'équilibre de son milieu intérieur, et permettre sa survie. L'apparition d'espèces oxydantes ou l'augmentation de la température sont autant de perturbations auxquelles la cellule doit faire face. Mon travail de thèse s'est articulé autour de la dynamique temporelle des stress oxydant et thermique en cellules vivantes. L’originalité de l’équipe où j’ai effectué ma thèse est de proposer une alternative aux photothérapies dynamiques en produisant directement, sans photosensibilisant, de l’oxygène singulet considéré comme l’agent cytotoxique principal. Cette façon de produire directement l’oxygène singulet permet non seulement d’adresser plus directement des questions de dosimétrie qui sont importantes en thérapie mais aussi d’identifier les macromolécules impliquées dans le stress oxydant. Dans une première partie je présenterai des études de cinétique photochimique qui ont permis de déterminer dans différents solvants et en cellule, le taux de production et la réactivité de l'oxygène singulet avec un partenaire spécifique. Dans une seconde partie, je présenterai mes travaux sur la dynamique temporelle de réponse au stress thermique en cellules vivantes. Le développement d’un modèle mathématique minimal de titration du stress thermique couplé à des expériences associant un facteur de transcription clef dans la régulation du stress, nous ont permis de mettre en évidence les contributions des principales réactions impliquées dans le mécanisme de réponse cellulaire au stress thermique
The cell fight everytime against disturbances to maintain the balance of its internal environment and ensure its survival. The appearance of oxidative species or increasing the temperature are all major perturbations which the cell has to face. My thesis is structured around the temporal dynamics of oxidative and thermal stress in living cells. The originality of the team where I did my thesis, is to propose an alternative way to phototherapy dynamic in producing directly, without photosensitizer, singlet oxygen which is considered as the main cytotoxic agent. This way of producing singlet oxygen directly allows to address dosimetry issues that are important in therapy but also, to identify the macromolecules involved in oxidative stress more directly. In the first part ,I will present photochemical kinetic studies that have enable to determine in different solvents and in cells, the production rate and the reactivity of singlet oxygen with a specific partner. In the second part, I will present my work on the temporal dynamics of heat stress response in living cells. The development of a minimal mathematical model of titration of thermal stress coupled with experiments involving a key transcription factor in the regulation of stress, allowed us to identify the main reactions involved in the mechanism of cell response to heat shock

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Proag, Amsha. "Sensibilité de cellules vivantes aux propriétés mécaniques et géométriques de leur environnement." Paris 7, 2012. http://www.theses.fr/2012PA077056.

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Abstract:

Les tissus animaux constituent des systèmes biologiques hautement organisés, où les échelles cellulaire et multicellulaire sont en corrélation constante. Non seulement les cellules régulent leur comportement au moyen de signaux biochimiques : elles transmettent aussi des stimuli mécaniques, via le cytosquelette et les complexes d'adhésion, ce qui conduit à la formation d'une organisation collective tridimensionnelle où cellules et tissu se contraignent mutuellement. Afin d'étudier les aspects mécaniques et géométriques des interactions entre cellules, nous avons cultivé des tissus épithéliaux sur des micro-environnements artificiels. Nous avons fabriqué des substrats microstructurés en polyacrylamide et en polydiméthylsiloxane, de rigidité et de géométrie définies, sur lesquels nous avons fait croître un épithélium de MDCK. Nous avons également modifié les propriétés adhésives de ces substrats pour y confiner une seule cellule et simuler ainsi les contraintes topologiques du tissu sur une cellule individuelle. Après avoir marqué les composants internes gouvernant l'architecture cellulaire, nous avons pu en obtenir des images 3D en microscopie confocale et quantifier la morphologie des cellules. Les distributions de volume des cellules et des noyaux mesurées diffèrent en fonction de leur localisation au sein du tissu, ainsi que de la géométrie et de la rigidité de l'environnement. En modifiant ces paramètres expérimentaux, nous avons pu observer l'effet de contraintes externes sur la morphologie cellulaire. Enfin, nous avons remarqué que le relief du tissu dépendait de la topographie du substrat, et nous en avons proposé un modèle qui lie les deux échelles d'organisation
Animal tissues constitute highly organized biological Systems, where the cellular and rmulticellular levels are in constant interrelation. Not only do cells regulate their behaviour via biochemical signalling: they also transmit mechanical stimuli, through the cytoskeleton and adhesion complexes, which leads to the formation of a tridimensional collective organization where cells and tissues constrain each other. To investigate the mechanical and geometrical aspects of intercellular interactions, we cultivated epithelial tissues on artificial micro-environments. We manufactured polyacrylamide and polydimethylsiloxane microstructured substrates with precise stiffness and geometry, which we grew MDCK epithelia on. We also modulated the adhesive properties of these substrates in order to confine a single cell and simulate the topological constraints of the tissue on an individual cell. After staining the internal components which govern cell architecture, we were able to obtain 3D images using confocal microscopy and to quantify the morphology of the cells. The measured volume distributions of cells and nuclei differed according to their localization within the tissue, as well as to the geometry and stiffness of the environment. Modifying these experimental parameters made it possible to observe the effect of external constraints on cell morphology. Finally, we found that the tissue profile depended on the topography of the substrate, and we suggested a mode! which correlates both organizational levels

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Cardoso, dos Santos Marcelina. "Etude de l’adhésion de vésicules géantes et de cellules vivantes par nanoscopie de fluorescence." Thesis, Troyes, 2015. http://www.theses.fr/2015TROY0012/document.

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Abstract:

L’objectif de mon travail de thèse a été de caractériser l’adhésion de vésicules géantes lipidiques et de cellules vivantes. Dans le but d’obtenir des informations quantitatives sur l’adhésion, j’ai développé deux techniques de nanoscopie de fluorescence basées sur la microscopie TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence). Cette technique repose sur création d’une onde évanescente à proximité d’une interface. J’ai développé pour cela un montage optique, qui permet de contrôler finement les caractéristiques de l’onde évanescente (longueur d’atténuation, état de polarisation, etc.). L’adhésion des vésicules a été étudiée par nTIRF (TIRF normalisé) : les images TIRF sont normalisées par des images en épi-fluorescence. J’ai pu ainsi caractériser l’adhésion non spécifique (interaction électrostatique) et spécifique (interaction biotine-streptavidine) de vésicules sur différentes surfaces fonctionnalisées. Pour quantifier l’adhésion des cellules, j’ai utilisé l’approche VA-TIRF (TIRF à angle variable). Cette dernière consiste à enregistrer une série d’images en régime évanescent à différents angles d’incidence. Ceci nous a permis d’établir une cartographie des distances entre la membrane ventrale d’une cellule et la surface pour différents comportements d’adhésion initiés sur divers substrats : chimiques ou protéiques. Ces deux techniques permettent de mesurer la distance membrane-surface avec une précision nanométrique, ≈20nm, ce qui est particulièrement adapté à l’étude du processus d’adhésion
The aim of my thesis was to characterize the adhesion of Giant Unilamellar Vesicles and living cells. In order to obtain a quantitative information about the state of the adhesion, I developed two fluorescence nanoscopy techniques based on microscopy TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence). This technique consist of creating an evanescent wave in the vicinity of an interface. I developed the experimental setup, which allows an accurate control of characteristics of the evanescent wave (penetration depth, polarization state, etc.). The vesicles adhesion was studied by nTIRF (normalized TIRF). TIRF images are normalized by epi-fluorescence images. I was able to characterize the nonspecific adhesion (electrostatic interaction) and specific adhesion (biotin-streptavidin interaction) of vesicles on different functionalized surfaces. To quantify the adhesion of cells, I used the VA-TIRF approach (variable angle TIRF). The latter is to record a series of images at different angles of incidence in the evanescent regime. This allowed us to map the distances between the ventral membrane of a cell and the surface for different adhesion behaviors initiated on various substrates: chemical or protein. These two techniques permit to measure the membrane surface-distance with the nanometer precision ≈20nm, which is particularly suitable for the study of the adhesion process

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Muro, Eleonora. "Quantum Dots pour le Ciblage en Cellules Vivantes et la Microscopie HiLo Bi-couleur." Phd thesis, Université Pierre et Marie Curie - Paris VI, 2011. http://pastel.archives-ouvertes.fr/pastel-00631485.

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Abstract:

Les Quantum Dots (QDs) sont des nanocristaux de semiconducteurs qui possèdent des propriétés optiques hors du commun. Leur utilisation comme sondes en biologie nécessite leur solubilisation dans l'eau, grâce à une chimie de surface adaptée, qui influence la taille finale du QD, ses propriétés optiques et son interaction avec l'environnement biologique. Nous avons développé un nouveau ligand, l'acide dihydrolipoïque-sulfobétaïne (DHLA-SB), qui permet d'obtenir des QDs à la fois petits, stables dans une vaste gamme de pH, dans des solutions saturées en sel et dans le temps, et avec une très faible adsorption non spécifique sur les cellules. Nous avons observé et caractérisé le comportement intracellulaire des QDs DHLA-SB au cours du temps et nous l'avons comparé à celui de deux autres classes de QDs : cette étude a clairement montré l'influence de la chimie de surface sur le devenir intracellulaire des nanoparticules et a révélé une stabilité accrue des QDs DHLA-SB. Nous nous sommes également intéressés à la fonctionnalisation des QDs avec la streptavidine (SA) ou la biotine afin de marquer spécifiquement des cellules vivantes ou fixées. Les QDs-SA DHLA-SB obtenus ont permis de suivre un récepteur membranaire ou encore de marquer de façon spécifique une protéine biotinylée à l'intérieur de cellules vivantes, bien plus efficacement qu'avec les QDs-SA commerciaux (Invitrogen). Enfin, nous avons proposé d'utiliser les QDs DHLA-SB pour améliorer une technique de microscopie à illumination structurée, la microscopie HiLo bicouleur, et obtenir une coupe optique (type image confocale) d'échantillons biologiques épais en une seule image.

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D'Augustin, de Bourguisson Ostiane. "Caractérisation de la dynamique de l'ADN-glycosylase OGG1 et de résidus responsables de son interaction avec l'ADN en cellules vivantes." Electronic Thesis or Diss., Rennes 1, 2022. http://www.theses.fr/2022REN1B060.

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Abstract:

L’ADN est constamment soumis à de nombreux stress, menaçant son intégrité et, par conséquent, le bon fonctionnement cellulaire. Pour y faire face, la cellule dispose de tout un arsenal de voies de réparation. L’une des altération du génome les plus fréquentes est l’oxydation de la guanine en 8-oxoguanine (8-oxoG). La 8-oxoG possède un fort potentiel mutagène du fait de son appariement préférentiel avec l’adénine au lieu de la cytosine lors de la réplication. Ainsi, elle doit être détectée et réparée à temps pour éviter la fixation dans le génome de mutation par transversion G:C vers T:A. Cette lésion appairée à une cytosine est détectée et excisée par la 8-oxoguanine ADN-glycosylase (OGG1), ce qui initie la réparation par excision de base. Si le fonctionnement d’OGG1 a été largement étudié in vitro et que de nombreuses données structurales sont disponibles, très peu d’études se sont penchées sur la dynamique de cette protéine au sein du noyau cellulaire. Le but de ma thèse était donc de caractériser la dynamique de recherche de la 8-oxoG par OGG1 et d’identifier les éléments (résidus ou fonctions) régulant cette dynamique. Ainsi, j’ai pu montrer que l’interaction avec l’ADN était un élément majeur de la recherche de la 8-oxoG par OGG1, et que muter les résidus impliqués dans l’interaction avec l’ADN perturbait la dynamique d’OGG1 et sa capacité à trouver et exciser la 8-oxoG. De même, la reconnaissance de la 8-oxoG, mais également celle de la cytosine lui faisant face, jouent toutes deux un rôle important dans le fonctionnement de l’ADN-glycosylase et son recrutement à la zone de dommages. Enfin, le motif NNN, très conservé mais très peu caractérisé jusqu’ici semble être essentiel à l’association spécifique avec la 8-oxoG mais pas à la dynamique de recherche
DNA is constantly subjected to various stress, threatening its integrity, and consequently, the proper functioning of the cell. In order to preserve the genomic integrity, the cell can activate a large set of repair pathways. One of the most common genomic alteration is the base modification 8-oxoguanine (8-oxoG), an oxidized form of guanine. It is highly mutagenic, due to its tendency to pair with adenine instead of cytosine during replication. Thus, it needs to be detected and repaired on time to avoid G:C to T:A transversions. 8-oxoG paired with cytosine is recognized and excised by the 8-oxoguanine DNA-glycosylase (OGG1), which initiates the base excision repair pathway. Although OGG1 has been widely studied in vitro and many structural data are available, many questions remain concerning the dynamics of the protein within the cell nucleus. Hence, the goal of my PhD project was to characterize the dynamics of OGG1 searching for 8-oxoG and get new insights about the residues or functions of OGG1 that regulate these dynamics. I was able to show that the interaction between OGG1 and DNA is crucial for the efficient search of 8-oxoG, and that mutating the residues involved in such interaction impairs OGG1 dynamics and its ability to detect and excise 8-oxoG. Similarly, 8-oxoG detection, but also that of the facing cytosine, both play an important role in the function of the DNA-glycosylase and in its ability to accumulate at the sites of damage. Finally, the NNN motif, which is highly conserved but very poorly characterized, seems to be essential to the specific association with 8-oxoG, but not for the nuclear exploration by OGG1

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Octeau, Vivien. "Microscopie de nano-objets individuels : étude de la diffusion des intégrines dans les sites d'adhésion focales de cellules vivantes." Thesis, Bordeaux 1, 2010. http://www.theses.fr/2010BOR14047/document.

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Abstract:

L’effet photothermique permet de détecter efficacement des nanoparticules d’or avec un microscope en champ lointain grâce à leur forte absorption de la lumière. L’absence de problème photophysique fait des nanoparticules d’or une alternative au marquage de biomolécules par des sondes fluorescentes. La méthode PhACS (Photothermal Absorption Correlation Spectroscopy) utilise les fluctuations de signal photothermique dues au passage de nanoparticules dans le volume de détection pour étudier leur diffusion. Cette méthode permet également la mesure précise de diamètres hydrodynamiques de nanoparticules fonctionnalisées. La méthode SNaPT (Single Nano-Particle Tracking) réalise le suivi bidimensionnel de nanoparticules individuelles grâce à une localisation effectuée par triangulation. Nous avons appliqué cette méthode pour étudier la diffusion des intégrines alphaV-beta3 marquées par des nanoparticules d’or de 5 nm dans les adhérences focales, points d’ancrage entre le cytosquelette de la cellule et la matrice extracellulaire. Nous observons que ces intégrines ont tendance à former des agrégats qui alternent entre un mouvement diffusif et un mouvement confiné. Ce résultat appelle maintenant à un nouveau modèle où nous aurions une redistribution continue des intégrines au sein des adhérences focales
Gold nanoparticles may be detected with optical far-field microscopy by use of the photothermal effect due to their strong light absorbance. With no photophysic issues, gold nanoparticles are an alternative to fluorescent probes for use in biological systems. The PhACS method (Photothermal Absorption Correlation Spectroscopy) is used to study diffusion by measuring the autocorrelation of photothermal signal fluctuations due to nanoparticles passing through the detection volume. This method is sensitive enough to mesure the precise hydrodynamic diameter of functionalised nanoparticles. The SnaPT method (Single Nano-Particle Tracking) can track 2-dimensional motion of individual nanoparticles by pinpointing the localization with a triangulation method. The SNaPT method was used to study motion of alphaV-beta3 integrins that were bound to a 5 nm gold nanoparticle inside focal adhesion, where the cell cytoskeleton is linked to the extracullular matrix. The integrin was found to organize into clusters oscillating between the bound and diffuse states. These observations require new working models where integrins would be constantly redistributed

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Ziegler, Cornelia. "Imagerie quantitative de l'assemblage de la NADPH oxydase des phagocytes en cellules vivantes par des approches FRET-FLIM." Thesis, Université Paris-Saclay (ComUE), 2016. http://www.theses.fr/2016SACLS048/document.

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Abstract:

La NADPH oxydase des phagocytes (NOX2) est responsable de la production d’anions superoxydes qui sont les précurseurs des autres formes réactives de l’oxygène. NOX2 est une enzyme majeure de la réponse immunitaire. Les dysfonctionnements de NOX2 sont associés à de nombreuses pathologies et donc il convient d’en comprendre les détails de la régulation. Cette oxydase est composée de cinq sous-unités : deux protéines membranaires, gp91phox et p22phox et 3 protéines cytosoliques p47phox, p67phox et p40phox. D’après les études in vitro avec des protéines purifiées, les protéines cytosoliques sont supposées former un complexe ternaire qui se déplace à la membrane avec une petite protéine G, Rac, au moment l’activation.L’objectif de ce projet est de caractériser les interactions spécifiques entre les sous-unités cytosoliques de NOX2 en cellules vivantes en utilisant le phénomène de transfert résonant d’énergie de type Förster (FRET) entre deux fluorophores, un donneur et un accepteur. Ici les fluorophores seront des protéines fluorescentes de la famille de la GFP. Elles sont fusionnées à deux sous-unités. L’efficacité du FRET dépend de la distance entre les fluorophores et permet ainsi de caractériser les interactions entre les protéines d’intérêt. Une méthode rapide d’identification des situations où le FRET est positif a été mise au point par cytométrie en flux. Des études détaillées et quantitatives ont ensuite été réalisées en utilisant l’imagerie de durée de fluorescence (FLIM) du donneur. Le FLIM, combiné à l’utilisation de donneurs présentant une durée de vie mono-exponentielle, permet de déterminer directement des efficacités de FRET apparentes et moléculaires, qui contiennent, toutes les deux, des informations qualitatives et quantitatives sur l’interaction et la structure des protéines impliquées. De ces données, il est possible d’extraire la fraction des donneurs interagissant avec un accepteur. Les informations obtenues à partir des données de FRET-FLIM permettent une meilleure compréhension de l’organisation et de la régulation de NOX2 tout en permettant une estimation des constantes de dissociation (Kd). Afin de confirmer ces résultats, des expériences de spectroscopie de corrélation de fluorescence à deux couleurs (FCCS) ont été réalisées. Cette méthode complétement indépendante n’est pas basée sur la distance entre fluorophores comme le FRET mais sur leur co-diffusion à travers un petit volume d’observation dans le cytoplasme cellulaire.L’approche FRET-FLIM nous a tout d’abord permis d’observer les interactions entre hétéro-dimères formés de deux sous-unites différentes en cellules vivantes et d’exclure la formation d’homo-dimères entre deux sous-unités identiques. Etant donné la bonne précision des mesures de FLIM, nous avons pu comparer les informations structurales obtenues en cellules avec les données structurales issues d’études sur les protéines purifiées in vitro et nous avons constaté qu’elles sont en bon accord. Nous avons ensuite aligné les structures disponibles pour proposer un premier modèle 3D du complexe cytosolique de la NADPH oxydase au repos dans le cytosol cellulaire.Les fractions de protéines en interaction sont pour tous les hétéro-dimères autour de 20% ce qui n’est pas en accord avec l’hypothèse courante qui propose que toutes les sous-unités cytosoliques soient sous forme de complexe. Toutefois nos premiers résultats de FCCS confirment ce résultat extrait des données de FRET-FLIM. Nous proposons donc que la complexation des sous-unités cytosolique pourrait être impliquée dans la régulation de la NADPH oxydase. Des études complémentaires seront nécessaires pour valider cette nouvelle hypothèse. Les constantes de dissociation Kd estimées à partir de nos résultats sont micromolaires et donc un ordre de grandeur plus élevé que les valeurs nanomolaires déterminées in vitro. Des mesures plus détaillées de FCCS pourront compléter et valider ces résultats
The phagocyte NADPH oxidase (NOX2) is a key enzyme of the immune system generating superoxide anions, which are precursors for other reactive oxygen species. Any dysfunctions of NOX2 are associated with a plethora of diseases and thus detailed knowledge about its regulation is needed. This oxidase is composed of five subunits, the membrane-bound gp91phox and p22phox and the cytosolic p47phox, p67phox, and p40phox. The latter are assumed to be in a ternary complex that translocates together with the small GTPase Rac to the membranous subunits during activation.Our aim was to discover and to characterize specific interactions of the cytosolic subunits of NOX2 in live cells using a Förster Resonance Energy Transfer (FRET) based approach: Since FRET depends on the distance between two fluorophores, it can be used to reveal protein-protein interactions non-invasively by studying fluorescent protein tagged subunits. To have a rapid method on hand to reveal specific interactions, a flow cytometer based FRET approach was developed. For more detailed studies, FRET was measured by fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM), because it allows a direct determination of the apparent and molecular FRET efficiency, which contains both qualitative and quantitative information about the interaction and the structure of the interacting proteins. Furthermore, the FRET-FLIM approach enables an estimation of the fraction of bound donor. This information itself is important for a better understanding of the organisation and regulation of the NOX2, but it is also necessary for the calculation of the dissociation constant Kd from the FRET-FLIM data. To confirm the findings obtained by FRET-FLIM fluorescence cross correlation spectroscopy (FCCS) experiments were performed. This completely independent method is not based on distances like FRET but on the observation of the co diffusion of the fluorescently labelled samples when they move across a small observation volume inside the cells.The FRET-FLIM approach allowed us in a first step to discover heterodimeric interactions between all cytosolic subunits in live cells. Due to the good precision of the results, we were able to extract structural information about the interactions and to compare them with available structural data obtained from in vitro studies. The information from FRET-FLIM was coherent with in vitro data. We then aligned the available structures leading to the first 3D model of the cytosolic complex of the NADPH oxidase in the resting state in live cells.Additionally, the bound fraction for all heterodimeric interactions derived by FRET-FLIM is around 20 %, which is in contrast to the general belief that all cytosolic subunits are bound in complex. The first FCCS results support our findings. Therefore, we believe that the complexation of the cytosolic subunits could be involved in the regulation of the NADPH oxidase and should be investigated further. The estimated Kd derived from the FRET-FLIM approach is in the low micomolar range, which is an order of a magnitude higher than the nanomolar range of in vitro studies.In conclusion, we showed that our quantitative FRET-FLIM approach is not only able to distinguish between specific and unspecific protein-protein interactions, but gives also information about the structural organisation of the interacting proteins. The high precision of the FRET-FLIM data allow the determination of the bound fraction and an estimation of the Kd in live cells. FCCS is a complementary method, which can verify these quantitative findings. However, it cannot replace FRET-FLIM completely as it does not give any structural information.With respect to the biological outcome of this project, we can propose for the first time a 3D-model of the cytosolic complex of the NADPH oxidase covering the in vitro as well as the live cell situation. Additionally, the small bound fraction found here may raise new ideas on the regulation of this vital enzyme

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MOISAN, GAUTIER ISABELLE. "Suivi des interactions virus herpes simplex type-1 / cellules hotes par microscopies de fluorescence en cellules vivantes." Paris 6, 2001. http://www.theses.fr/2001PA066170.

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Abstract:

Le but de notre travail est de mieux comprendre les interactions entre cellule hote de type neuronal et virus herpes simplex type-1 (hsv-1) en cellules vivantes. Nos etudes ont ete effectuees par microscopie de fluorescence au niveau unicellulaire. La thymidine kinase (tk) virale a ete impliquee dans l'etablissement de la latence et la reactivation. Grace a des etudes de durees de vie de fluorescence au niveau unicellulaire, nous avons determine, par des mesures de transfert d'energie (fret et homo-fret) entre des variants spectraux de la green fluorescent protein (gfp) fusionnes aux extremites n- ou c-terminales de la proteine tk, que celle-ci est sous forme de dimeres actifs en cellules vivantes. De plus, la disparition des 10 acides amines c-terminaux de cette proteine provoque une diminution de 90% de son activite enzymatique. Nous avons construit deux virus recombines exprimant des portions de tk fusionnees a la gfp, l'un deficient en tk, l'autre deficient a la fois en tk et en ul24, et nous les avons caracterises par des techniques de biologie moleculaire et biochimiques. Le virus deficient en ul24 ne montre pas de defaut majeur de replication en cellules cyclantes par rapport aux virus de phenotype ul24 sauvage. L'infection de cellules de type neuronal, les nd7, par le virus kos sauvage ou par l'un des deux virus recombines declenche les evenements precoces de l'apoptose (diminution partielle du potentiel de membrane mitochondriale, exposition de la phosphatidyl serine), mais n'induit pas ses evenements tardifs (condensation de la chromatine, activation des caspases). Ceci suggere que l'apoptose serait bloquee des la premiere heure apres l'infection des cellules, probablement par l'expression d'une ou de plusieurs proteines virales tres precoces. De plus, ni la proteine tk, ni la proteine ul24 ne semblent impliquees dans l'induction ou le blocage de l'apoptose induits par les virus. Les proteines virales tardives n'etant pas exprimees dans les nd7, vraisemblablement aucun virion mature n'est forme. Ceci suggere que ces cellules constituent un bon modele pour des etudes de la latence du hsv-1.

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Dujardin, Antoine. "Atomic force microscopy usage in a context of multi-mode and multi-sample correlative measures on live cells." Thesis, Lille 1, 2018. http://www.theses.fr/2018LIL1I078/document.

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Abstract:

Assez rapidement après son apparition à la fin des années 1980, la Microscopie à Force Atomique (AFM) a démontré des perspectives prometteuses d’applications biomédicales. À l’heure actuelle, elle permet l’étude d’échantillons biologiques allant de la molécule unique à la cellule vivante proche des conditions physiologiques. Bien qu’étant applicable aux cellules eucaryotes et procaryotes, elle est entravée par son faible débit. Alors qu’elle peut être fortement automatisée sur certains échantillons bien caractérisés en air, l’automatisation de l’AFM en liquide reste rare, en particulier en multi-échantillon. Lors de ce projet doctoral, une approche automatisée a été développée pour l’étude des cellules en milieu liquide. Après une introduction du système et des développements nécessaires, nous démontrons l’approche sur des bactéries fixées et vivantes, ainsi que sur des cellules épithéliales. L’utilisation d’automatisation multi-échantillon permet d’augmenter le nombre d’échantillons rassemblés tout en limitant les interactions avec l’utilisateur. Enfin, les développements ultérieurs sont discutés pour aller vers un système automatisé à plus grande échelle sur échantillons vivants
Soon after its development in the late 1980s, atomic force microscopy (AFM) has shown promising applications in the biomedical field. It now allows investigating biological samples from single molecules to living cells under conditions close to physiological. Despite its applicability to both eukaryotic and prokaryotic cells, it is hampered by its low throughput. While heavily automated on some well-characterized samples in air, AFM automation in fluid is very scarce, especially at the multi-sample level. During this doctoral project, an automated approach was developed in fluid, on cells. After introducing the system and the developments required, we demonstrate the approach on fixed and living bacteria as well as on epithelial cells. The usage of multi-sample automation allows gathering a greater number of samples with limited user interaction. Finally, further developments are discussed to lead the path toward higher-scale AFM automation of live samples

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Tramier, Marc. "Imagerie des déclins de fluorescence pour l'étude de la dynamique et des interactions de macromolécules en cellules vivantes." Phd thesis, Université Pierre et Marie Curie - Paris VI, 2001. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00003477.

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Abstract:

Le but de notre travail est de développer une imagerie des déclins de fluorescence et d'en démontrer les potentialités pour l'étude de la dynamique macromoléculaire et des interactions entre macromolécules en cellules vivantes. Notre approche repose sur la mesure de la corrélation temporelle de photons uniques de fluorescence (TCSPC) simultanément à la détermination de la localisation spatiale (le long d'une ligne) de la région d'émission. Des images monodirectionnelles de déclins de fluorescence ont ainsi été obtenues représentant la cinétique de fluorescence en différentes régions subcellulaires. Nous avons également mis au point la mesure de déclins d'anisotropie de fluorescence provenant d'un petit volume subcellulaire (1 µm3) sous microscope en mode confocal. Les résultats présentés dans ce mémoire démontrent l'intérêt de cette approche technologique pour des problématiques de biologie cellulaire. Le marquage fluorescent endogène de protéines a été réalisé en les fusionant à la GFP ou un de ses variants spectraux. Les interactions protéine-protéine ont été étudiées soit par hétéroFRET en mesurant la diminution de la durée de vie de fluorescence du chromophore donneur, soit par homoFRET en mesurant la cinétique de dépolarisation de la fluorescence. Nous avons mis en évidence (i) la formation d'hétérodimères de p45 du facteur de transcription NF-E2 avec deux partenaires dans différents compartiments subcellulaires par hétéroFRET, et (ii) l'homodimérisation de la thymidine kinase du virus de l'herpès simplex type 1 de façon plus concluante par homoFRET que par hétéroFRET. Par ailleurs, la mesure des déclins d'anisotropie de fluorescence de l'éthidium comme sonde de la dynamique torsionnelle de l'ADN a révélé l'existence d'une très forte restriction de cette dynamique dans la chromatine non perturbée. Les développements supplémentaires de notre système pour une imagerie bi-dimensionnelle puis tri-dimensionnelle sont prometteurs.

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Bai, Jiachuan. "Deep learning augmented single molecule localization microscopy reconstruction : enhancing robustness and moving towards live cells." Electronic Thesis or Diss., Sorbonne université, 2023. https://accesdistant.sorbonne-universite.fr/login?url=https://theses-intra.sorbonne-universite.fr/2023SORUS337.pdf.

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Abstract:

La microscopie optique est une technique centrale en biologie cellulaire, mais la diffraction limite sa résolution à environ 200-300 nm. Par conséquent, de nombreuses structures moléculaires telles que les virus, les pores nucléaires ou les microtubules, ne peuvent pas être résolues. La microscopie de localisation à molécule unique (SMLM) offre une résolution spatiale élevée (20 nm ou mieux), permettant de résoudre les structures biologiques à l'échelle moléculaire. Cependant, la SMLM nécessite l'acquisition de plusieurs milliers d’images à base résolution, ce qui limite ses applications aux cellules fixes ou aux structures à dynamique lente. Pour surmonter cette limitation, Ouyang et al. (2018) ont développé une approche d'apprentissage profond appelée ANNA-PALM, capable de reconstruire des images super-résolutives à partir d'un nombre beaucoup plus réduit d'images à basse résolution. Cependant, la méthode ANNA-PALM originale présente plusieurs contraintes. Tout d'abord, cette méthode présente des artefacts lorsqu'elle est appliquée à des images obtenues avec des protocoles ou dans des conditions expérimentales différents des données d'entraînement. Par ailleurs, ANNA-PALMn'a été démontrée que sur des cellules fixes. Ma thèse vise à résoudre ces limitations : 1) en améliorant la robustesse d’ANNA-PALM pour des données issues de laboratoires ou de conditions expérimentales différents et 2) en l’étendant à la visualisation super-résolutive de structures biologiques dynamiques dans les cellules vivantes. 1. Amélioration de la robustesse d'ANNA PALM : notre laboratoire a développé ShareLoc, une plateforme en ligne (shareloc.xyz) qui permet la collecte, la visualisation et la réutilisation des données SMLM acquises par la communauté de microscopie. Dans un premier temps, j’ai validé les fonctionnalités de la plateforme, effectué la curation des données SMLM, implémenté l'ontologie ShareLoc et rédigé la documentation. Ensuite, j'ai ré-entraîné ANNA-PALM sur des images en plus grande quantité et plus variées partagées sur ShareLoc. J’ai évalué quantitativement la qualité des images reconstruites par rapport au modèle original. J'ai démontré une amélioration significative de la robustesse et de la qualité des reconstructions par ANNA-PALM, en particulier pour des images de microtubules prises dans des conditions biologiques différentes de celles des images d'entraînement. 2. Extension d'ANNA-PALM à la reconstruction de films super-résolutifs de la dynamique structurelle en cellules vivantes : pour éviter le floutage dû à la dynamique des structures, chaque image super-résolutive du film reconstruit est basée sur un faible nombre d'images consécutives à basse résolution, ce qui conduit à un sous-échantillonnage important de la structure, qui restreint la résolution. Bien qu'ANNA-PALM puisse reconstruire des images super-résolutives à partir de images sous-échantillonnées, pour les cellules vivantes l’entraînement du modèle et l'évaluation de la qualité des reconstructions sont plus difficiles en raison de l'absence de vérité terrain. Pour relever ces défis, j'ai développé une méthode pour créer des vérités terrain super-résolutives dynamiques à partir d’images SMLM statiques. J'ai appliqué cette stratégie à des données simulées ainsi qu’à des données expérimentales de microtubules. Ensuite, j'ai étendu l’architecture d’ANNA-PALM à des données 3D dont la troisième dimension est le temps, afin d’exploiter l'information temporelle. J'ai utilisé des simulations de microtubules en mouvement pour évaluer quantitativement la qualité des reconstructions par cette approche, en comparaison avec la méthode ANNA-PALM 2D originale, et en fonction de la vitesse des structures et des taux de localisation. Les résultats montrent que l'incorporation d'informations temporelles améliore considérablement la qualité des reconstructions [...]
While microscopy has been a central technique for cell biology since centuries, it has long been limited by diffraction to a resolution of ~200-300 nm. As a consequence, many molecular structures, such as viruses, nuclear pores, or microtubules were left unresolved. Single-molecule localization microscopy (SMLM) offers a high spatial resolution (e.g., 20 nm or better), allowing to resolve biological structures at or near the molecular scale. However, SMLM acquisition necessitates acquiring many thousands of low-resolution frames, mostly limiting its applications to fixed cells or to structures undergoing slow dynamics. To overcome this limitation, Ouyang et al. (2018) developed a deep learning-based approach called ANNA-PALM that can reconstruct a super-resolution image from much fewer low-resolution frames. However, the original ANNA-PALM method faced several limitations. First, ANNA-PALM had only been trained and tested on images from our laboratory. Second, the method exhibits artifacts when applied to images obtained using different protocols or experimental conditions than the training data. Third, ANNA-PALM had only been demonstrated on fixed cells. The objectives of my Ph.D. thesis are to address these limitations by 1) improving the robustness of ANNA-PALM reconstructions when applied to data obtained from distinct laboratories and 2) extending ANNA-PALM to reconstruct super-resolved time-lapse image sequences for dynamic biologicalstructures in live cells. 1. Improving the robustness of ANNA PALM: an obvious approach to improve robustness is to retrain the model using a larger and more varied data set. However, SMLM datasets are not usually publicly accessible. To address this, our lab developed ShareLoc, an online platform (shareloc.xyz) that allows the gathering and reuse of SMLM datasets acquired by the microscopy community. I first validated the platform's functionalities, curated SMLM data, implemented a ShareLoc ontology, and wrote relevant documentation. Next, I took advantage of ShareLoc data to retrain ANNA-PALM on larger and more diverse images and quantitatively evaluated the image reconstruction quality compared to the original model. I demonstrated that the robustness and reconstruction quality of ANNA-PALM significantly improved, notably when applied to images of microtubules taken under biological perturbation conditions never seen by the model during training. 2. Extending ANNA-PALM to reconstruct super-resolution movies of moving structures in live cells: achieving high-quality super-resolution reconstructions of structural dynamics is challenging. To avoid motion blur, each frame of the reconstructed movie is defined from localizations in only a small number of consecutive low-resolution frames. This leads to a strong under-sampling of the structures by single molecule localization events and does not enable super-resolution. Although ANNA-PALM can reconstruct high-quality super-resolved images from under-sampled localization data, training ANNA-PALM for live cells is more difficult, because a clear ground truth is lacking. The absence of ground truth also makes it difficult to assess reconstruction quality. To address these challenges, I first developed a method to generate ground truth super-resolution movies from static SMLM images obtained from long acquisition sequences. I implemented and tested this strategy using both simulated and experimental SMLM images. Second, I extended the ANNA-PALM architecture to 3D data, where the third dimension is time, in order to incorporate temporal information. I used simulations of microtubule dynamics to quantitatively evaluate the reconstruction quality of this approach in comparison with the original 2D ANNA-PALM, and as function of structure velocity and localization rates. [...]

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Carin, Muriel. "Etude microscopique et macroscopique des transferts de chaleur et de masse dans un procédé de congélation des cellules vivantes." Aix-Marseille 1, 2000. http://www.theses.fr/2000AIX11006.

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Abstract:

Ce travail est consacre a l'etude des transferts de chaleur et de masse dans un procede de congelation de cellules en suspension. Une approche macroscopique est utilisee pour la validation d'une methode simplifiee de congelation des cellules souches hematopoietiques. L'etude experimentale et numerique est entreprise afin d'identifier les parametres influencant la descente en temperature des poches de cellules placees dans un congelateur a 80\c. A partir des conclusions de cette etude, un protocole est propose. La deuxieme partie de ce travail porte sur le developpement d'un modele elements finis permettant d'etudier la reponse osmotique d'une ou plusieurs cellules lors de la propagation d'un front de solidification. A cette fin, les equations de la chaleur et de la diffusion sont resolues dans un domaine bidimensionnel avec une technique de suivi de front pour suivre les deplacements du front de solidification et de la membrane. L'interaction entre un front de glace et des cellules est etudiee en fonction des vitesses de refroidissement et de la position initiale des cellules.

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Silve, Aude. "Nouveaux dispositifs pour l'application contrôlée d'impulsions électriques nanosecondes et pour la détection de leurs effets sur les cellules : Nouveaux résultats et hypothèses sur les paramètres contrôlant l'électroperméabilisation des cellules biologiques." Phd thesis, Université Paris Sud - Paris XI, 2011. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00684394.

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Abstract:

La manipulation des membranes des cellules en suspension ou dans des tissus au moyen d'impulsions électriques constitue un sujet de recherche majeur au cœur du bio-électromagnétisme. A ce jour les impulsions de quelques microsecondes voire millisecondes ont été principalement étudiées. Elles n'affectent que la membrane plasmique des cellules. Les impulsions nanosecondes de fort niveau de champ (de l'ordre de quelques MV/m) ouvrent la voie vers la manipulation des organelles intra-cellulaires. En outre, elles constituent un nouvel outil pour l'étude des mécanismes de la perméabilisation. Les travaux de cette thèse ont été principalement consacrés aux effets des impulsions de 10 ns sur la membrane plasmique. Des protocoles expérimentaux permettant d'appliquer de façon reproductible et contrôlée les impulsions sur des objets vivants ont été définis. Des moyens de mesure (D-dot et B-dot) adaptés aux hautes tensions et hautes fréquences ont été développés et mis en œuvre, permettant un contrôle en temps réel des impulsions délivrées.Différentes approches ont permis de mettre en évidence la perméabilisation des cellules par des impulsions de 10 ns. Ces techniques regroupent notamment le suivi de bio-impédance dans les tissus et l'internalisation de molécules cytotoxiques non perméantes dans des cellules en suspension et in vivo sur des tumeurs. Les expériences conduites ont permis de mettre en évidence la plus grande efficacité des basses fréquences de répétition dans la perméabilisation d'un tissu végétal (la pomme de terre). De plus l'influence de la conductivité du milieu extracellulaire sur le niveau de perméabilisation a été investiguée. Ces expériences ont permis de mettre en évidence l'importance de la dynamique d'établissement et de relaxation de la différence de potentiel transmembranaire dans l'efficacité de la perméabilisation.Enfin un microscope CARS (Coherent Anti-stokes Raman Scattering) plein-champ a été développé. Sa conception a été pensée en vue de l'étude des effets des impulsions ultra-courtes sur le vivant à l'échelle moléculaire. A ce jour il permet d'obtenir des images de cellules en CARS en 3 ns.

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Woringer, Maxime. "Tools to analyze single-particle tracking data in mammalian cells." Electronic Thesis or Diss., Sorbonne université, 2019. http://www.theses.fr/2019SORUS419.

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Abstract:

Ce travail présente des outils pour analyser la régulation de la transcription dans les cellules eucaryotes, en particulier pour le suivi de facteurs de transcription (TF) individuels dans les cellules de mammifères. Un noyau de cellule eucaryote est complexe et contient de nombreuses molécules (ADN, ARN, protéines, ATP, etc). Ces molécules interagissent avec des TF et influencent la transcription. Certaines de ces interactions peuvent être étudiées par des techniques de biochimie. La plupart, en particulier les interactions faibles, non covalentes, sont invisibles par ces méthodes. La microscopie de cellules vivantes et le suivi de molécules uniques (SPT en anglais) sont de plus en plus utilisées pour étudier ces phénomènes. L'inférence des paramètres biophysiques d'un facteur de transcription, par exemple son coefficient de diffusion, son nombre de sous-populations ou son temps de résidence sur l'ADN sont cruciaux pour comprendre sa dynamique et son influence sur la transcription. Des outils validés et précis sont donc nécessaires pour analyser les données de SPT. Pour être utile, un outil de SPT doit être non seulement validé, mais aussi accessible à des non-programmeurs. Ils doivent aussi tenir compte des biais expérimentaux présents dans les données. Nous proposons un outil d'analyse de SPT, qui se fonde sur l'estimation du propagateur de la diffusion. Ce outil a été validé et est accessible par une interface web. Nous avons montré qu'il donne des résultats proches de l'état de l'art. Il a été testé dans deux cadres : (1) l'étude de la diffusion augmentée par la catalyse enzymatique in vitro et (2) l'analyse de la dynamique du TF c-Myc dans des cellules de mammifères
This work aims at providing tools to dissect the regulation of transcription in eukaryotic cells, with a focus on single-particle tracking of transcription factors in mammalian cells. The nucleus of an eukeryotic cell is an extremely complex medium, that contains a high concentration of macromolecules (DNA, RNA, proteins) and other small molecules (ATP, etc). How these molecules interact with transcription factors, and thus influence transcription rates is an area of intense investigations. Although some of these interactions can be captured by regular biochemistry, many of them, including weak, non-covalent interactions remain undetected by these methods. Live-cell imaging and single-particle tracking (SPT) techniques are increasingly used to characterize such effects. The inference of biophysical parameters of a given transcription factor (TF), such as its diffusion constant, the number of subpopulations or its residence time on DNA, are crucial to understanding how TF dynamics and transcription intertwine. Accurate and validated SPT analysis tools are needed. To be used by the community, SPT tools should not only be carefully validated, but also be easily accessible to non-programmers. They should also be designed to take into account known biases of the imaging techniques. In this work, we first propose a tool, accessible through a web interface, based on the modeling of the diffusion propagator. We validate it extensively and show that it exhibits state-of-the art performance. We apply this tool to two experimental settings: (1) the study of catalysis-enhanced diffusion in-vitro and (2) the analysis of the dynamics of the c-Myc transcription factor in mammalian cells

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Chouinard, Julie. "Effets des LDL natives et oxydées sur l'évolution des propriétés biomécaniques des cellules endothéliales et imagerie des LDL par microscope à force atomique." Mémoire, Université de Sherbrooke, 2007. http://savoirs.usherbrooke.ca/handle/11143/1351.

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Abstract:

Cette étude vise à définir l'effet des lipoprotéines de basses densité natives (LDL) et oxydées (ox-LDL) sur les fonctions des cellules endothéliales en relation avec les processus physiopathologiques de l'athérosclérose. Le microscope à force atomique (AFM) fut utilisé en combinaison avec les méthodes biochimiques traditionnelles afin d'acquérir de l'information sur les propriétés biomécaniques des cellules endothéliales. L'AFM est un outil permettant l'acquisition d'images et de mesures de forces quantitatives concernant les propriétés viscoélastiques des cellules vivantes selon leur exposition aux LDL ou ox-LDL. L'AFM rassemble localement des informations sur la membrane cellulaire et le cytosquelette des cellules et ce, de manière non invasive. Il est ensuite possible de corréler les résultats obtenus avec les marquages immunohistochimiques afin d'évaluer la réponse cellulaire suite à une exposition à des LDL ou ox-LDL. Ces données recueillies, les protocoles étant au point, il ne restera plus qu'à effectuer les tests avec les antioxydants afin de déterminer les agents et les dosages appropriés permettant une protection salutaire de l'endothélium. Ce travail amène donc de nouvelles connaissances sur les mécanismes moléculaires fondamentaux de la dysfonction endothéliale en vue éventuellement de développer de nouvelles thérapies cytoprotectrices efficaces. Une méthode d'imagerie des LDL a également été mise au point en utilisant l'AFM. Il est maintenant possible d'obtenir des images de bonne qualité permettant aussi de mesurer les dimensions de LDL individuelles. Cette technique pourrait entre autre servir à évaluer des pathologies touchant les LDL comme le diabète.

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Ewald, Maxime. "High speed bio atomic force microscopy : application à l'étude de la structure et dynamique d'assemblage supramoléculaires : étude des interactions au niveau de la cellule." Thesis, Dijon, 2011. http://www.theses.fr/2011DIJOS043.

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Abstract:

Le microscope à force atomique (AFM) fait partie des microscopies de champ proche dites à sonde locale. De par sa versatilité, un grand nombre de domaines des nanosciences tant en physique, que chimie ou biologie utilisent cette technique. Cependant, le champ d’investigation de la microscopie AFM classique est restreint temporellement et spatialement. En effet, en raison de sa limite de vitesse d’acquisition d’image et sa limite de caractérisation des interactions en surface, des études de dynamique moléculaire ou d’éléments sub-surface ne sont pas envisageables. Nous montrons donc que la caractérisation en volume est permise en utilisant une méthode d’imagerie non destructive, la microscopie de champ proche holographique ultrasonore (SNFUH). Cette méthode développée pour étudier à l.air et en liquide, a fourni des informations localisées en profondeur avec une haute résolution spatiale, en utilisant des fréquences de résonance dans la gamme du MHz. Une calibration a été effectuée sur des échantillons de structures enterrées ou non, réalisés par lithographie e-beam. Ces échantillons ont été utilisés pour ajuster les fréquences de résonance et comprendre la formation des images en mode acoustique (profondeur investiguée et inversion de contraste). Cet outil non invasif et innovant de caractérisation a donc été développé. Il présente un énorme potentiel pour des échantillons biologiques en termes de résolution et d’information. Les microscopes AFMclassique et acoustique SNFUH sont soumis à des contraintes de temps. Pour s’en affranchir, un prototype, le microscope à force atomique haute-vitesse (HS-AFM) a été développé par l’équipe du Professeur T. Ando à l’Université de Kanazawa (Japon). Il autorise ainsi le balayage à vitesse vidéo, i.e. 25 images/s, en milieu liquide. Nous avons amélioré le prototype avec une nouvelle génération de boucle d’asservissement et augmenté la zone de caractérisation. La résolution dépend fortement du levier utilisé. De plus une qualité d’image supérieure est obtenue grâce à l’utilisation de surpointes en carbone sur ces mêmes leviers. Finalement, nous montrons des résultats obtenus avec ces deux techniques de microscopies sur différents édi.ces biologiques en milieu liquide. Ainsi, avec le microscope AFM haute-vitesse, des dynamiques biomoléculaires ont pu être visualisées (ex : structures protéine-ADN) avec une résolution nanométrique. Puis une étude des changements conformationnels intracellulaires de kératinocytes vivantes dans leur milieu physiologique a été réalisée par microscopie acoustique SNFUH et montre la dégradation du matériel biologique. L’ensemble de ces résultats ouvre un nouveau champ d’investigation dans le domaine de la biologie
The atomic force microscope (AFM) made part of scanning near-field probe microscopy. Thanks to its versatility, many fields as physics, chemistry or biology use this technique. However, the field of investigation of the classical AFM microscope is limited temporally and spatially. Indeed, due to his scan speed limitation and surface interaction caracterisation limitation, studies of molecular dynamics and sub-surface elements are not possible. We show that the volume caracterisation is permitted using a non-destructive imaging method, called Scanning Near-Field by Ultrasound Holography (SNFUH). This tool developed for study in air and liquid has provided depth information as well as spatial resolution at the nanometer scale using resonant frequencies of about range of MHz. Calibration has been performed on samples of buried or not structures made by e-beam lithography and have been used to adjust the resonant frequency and understand the acoustic image formation (depth investigation and contrast in-version). We have developed a non-invasive and innovative tool of characterization for biology : he presents a huge potential for biological samples in terms of resolution and information. Classical AFM and acoustic SNFUH microscopes are time resolution limited. To overcome this time constraint, a prototype, High Speed Atomic Force Microscope (HS-AFM), has been developed by the team of Prof. T. Ando, Kanazawa University (Japan). It allows a scan rate at video speed, i.e. 25 frames/s, in liquid medium. We have improved the prototype, through a new generation of feedback control and increased the scan area. The resolution depends strongly of the probe used. Moreover a better image quality is obtained through the use of carbon tips on these cantilevers. Finally, we show our results obtained with these two microscopy techniques about biological buildings in liquid environment. Thereby, with the HS-AFM microscope, biomolecular dynamics have been visualized (e.g. protein-DNA structures) with nanometric resolution. Then a study about intracellular conformational changes of keratinocytes living cells in their physiological medium has been realized by acoustic microscopy SNFUH and show deterioration of biological components. All of these results provide new insights in biology field

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Bélanger, Erik. "Développement et utilisation d'une plateforme d'imagerie optique quantitative, multimodale et non linéaire de la moelle épinière chez les animaux vivants." Doctoral thesis, Université Laval, 2013. http://hdl.handle.net/20.500.11794/24192.

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Abstract:

La microscopie optique chez les animaux vivants est un outil de recherche prometteur pour l’avancement de la neurobiologie. L’imagerie intravitale offre un aperçu en direct de la réponse des cellules individuelles aux dommages affectant le système nerveux. Combinée à la vaste gamme de souris transgéniques disponibles commercialement et compatibles avec différents modèles animaux de maladies neurodégénératives, la microscopie in vivo favorise la compréhension du déroulement des pathologies et du fonctionnement des thérapies. Il est capital de travailler à l’émergence de cet outil, qui se présente comme une stratégie dotée d’un énorme potentiel. Le projet de doctorat décrit dans cette thèse porte donc sur le développement et l’utilisation d’une plateforme de microscopie quantitative, multimodale et non linéaire pour l’imagerie de la moelle épinière chez les animaux vivants. Premièrement, nous avons enrayé la dépendance en polarisation de l’intensité du signal de diffusion Raman cohérente (CARS, « coherent anti-Stokes Raman scattering »), de façon à adapter les images à l’interprétation histologique. Nous avons appliqué cette technique afin d’étudier l’histologie de la myéline de la moelle épinière du rat. En second lieu, nous avons proposé une nouvelle procédure d’analyse d’images compatible avec l’imagerie d’animaux vivants, dans le but de faire de l’histologie des axones myélinisés. Nous avons alors quantifié, dans un modèle de blessure par écrasement d’un nerf, la démyélinisation proximale et la remyélinisation distale au site de lésion ex vivo et in vivo respectivement. Troisièmement, nous montrons que l’imagerie de CARS de la moelle épinière de souris vivantes peut être réalisée avec un microendoscope, et ce tout en conservant sa compatibilité avec le signal de fluorescence par excitation à deux photons. Finalement, nous discutons d’une stratégie de traitement numérique d’images pour réduire les artefacts reliés au mouvement de l’animal. Cette technique permet l’étude histologique de la myéline et la quantification de la motilité des cellules microgliales dans leur environnement natif. En définitive, cette thèse démontre que la microscopie de CARS in vivo progresse peu à peu vers un outil grand public en neurobiologie.
Optical microscopy in living animals is a promising research tool for the evolution of neurobiology. Intravital imaging offers a live preview of how individual cells respond to the nervous system damages. Applying in vivo microscopy to a panoply of transgenic mice used with different animal models of neurodegenerative diseases promotes the understanding of the progress of pathologies and the comprehension of how therapies work. It is thus essential to promote the emergence of optical microscopy technologies in living animals because it is a strategy with great potential. Therefore, the project described in this doctoral thesis focuses on the development and use of a microscopy platform for quantitative, multimodal and nonlinear imaging of the spinal cord in living animals. First, we alleviated the polarization dependence of the coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) signal intensity. This strategy makes images more amenable to histological interpretation. With this technique, we studied the histology of myelin in the rat spinal cord. Secondly, we proposed a new image analysis procedure compatible with live animals imaging in order to achieve the histology of myelinated axons. We quantified the demyelination proximal, and remyelination distal to the crush site ex vivo and in vivo respectively. Third, we showed that CARS imaging of the spinal cord in living mice can be achieved with a microendoscope, and this while maintaining compatibility with the two-photon excitation fluorescence signal. Finally, we discuss a digital image processing strategy that reduces imaging artifacts related to movement of the animal. This technique allows the histological study of myelin and the quantification of the motility of microglial cells in their native environment. Ultimately, this thesis demonstrates that in vivo CARS microscopy progresses gradually towards a robust tool for research in neurobiology.

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Förster, Matthias. "Évaluation de la pénétration cutanée des ingrédients de systèmes dispersés : utilisation combinée des cellules de diffusion et de la microscopie confocale Raman." Phd thesis, Université Claude Bernard - Lyon I, 2010. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00865818.

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Abstract:

L'objet de cette thèse est l'étude de la pénétration des actifs cosmétiques dans la peau. Les axes d'investigation principaux ont concerné l'influence des propriétés physicochimiques des actifs et des ingrédients de la formule sur les mécanismes de pénétration. Les actifs cosmétiques choisis sont le rétinol, actif lipophile, et la caféine, actif hydrophile. Les formulations investiguées sont des émulsions de type huile dans eau, comparées aux solutions de tensioactifs correspondantes. Trois huiles cosmétiques ont été utilisées: Butylène glycol de cocoate, Octyldodecyl myristate et la Paraffine liquide, stabilisées en émulsion avec des tensioactifs ester de polyéthylène glycol (PEG20 et PEG6) possédant des longueurs de chaîne carbonées variables (C8, C12, C18 et C18:1). La pénétration percutanée a été mesurée quantitativement en utilisant la méthode des cellules de diffusion de Franz en fonctionnement statique et dynamique et qualitativement par la microscopie confocale Raman. Avec cette combinaison de techniques analytiques, il est possible, de mesurer la pénétration et d'évaluer l'impact de chaque composant de la formulation sur la pénétration cutanée d'un actif. Une corrélation a pu être établie entre l'effet fluidifiant d'une huile et l'augmentation de la pénétration du rétinol. Par ailleurs les tensioactifs, même s'ils ont montré un effet moindre en terme de fluidification conduisent également à une augmentation de la pénétration en raison d'une variation du coefficient de partage de l'actif entre la formule et la peau. Concernant la caféine, l'influence de la structure des tensioactifs et en particulier de la longueur de chaîne carbonée a été mise en évidence

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Blaising, Julie Élisabeth Françoise. "Étude des mécanismes moléculaires des inhibiteurs de l'entrée du virus de l'hépatite C (HCV) Silibinine et Arbidol : microenvironnement hépatique et infection par le HCV." Thesis, Lyon 1, 2013. http://www.theses.fr/2013LYO10235.

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Abstract:

Le virus de l'hépatite C (HCV) infecte environ 180 millions de personnes à travers le monde. De nouveaux antiviraux ont récemment été mis sur le marché mais ils présentent des effets indésirables. La recherche de nouvelles cibles thérapeutiques reste donc d'actualité. Mes principaux travaux ont consisté à développer des approches de biochimie et d'imagerie sur cellules vivantes pour étudier les mécanismes moléculaires d'action des antiviraux silibinine (SbN) et arbidol (ARB) sur HCV. Nous avons montré que SbN et ARB inhibent des vésicules entourées de clathrine et ne sont pas délivrés aux endosomes précoces. SbN et ARB inhibent également l'infection d'autres virus entrant par endocytose clathrine-dépendante, ce qui expliquerait leur activité à large spectre. J'ai également contribué à un projet initié depuis quelques mois au sein de l'équipe. L'hypothèse était qu'un élément présent dans le microenvironnement hépatique (MEH) jouerait un rôle essentiel dans l'infection par HCV. Nous nous sommes intéressés au syndécan-1 (SDC1) car il est fortement exprimé à la surface des hépatocytes. Nos travaux montrent que la déplétion de SDC1 diminue fortement l'infection. SDC1 colocalise à la surface des hépatocytes non infectés avec CD81, un récepteur connu de HCV. Dans les jours suivant l'infection, cette colocalisation est perturbée. Ces données suggèrent que SDC1 serait un co-facteur d'entrée de HCV, agissant en combinaison avec CD81, et que l'infection réorganiserait les molécules du MEH, ce qui pourrait à long terme contribuer à la persistance de l'infection
Hepatitis C virus (HCV) is a global health concern infecting 170 million people worldwide. New antivirals recently received the approval for the treatment against HCV infection but they display many side effects. Research for new therapeutic targets therefore remains an important topic. My main work was to develop approaches in biochemistry and live cell imaging to study the molecular mechanisms of action of antivirals silibinin (SbN) and arbidol (ARB) on HCV infection. We show that SbN and ARB alter clathrin-mediated endocytosis. Viral particles are trapped in clathrin-positive structures and cannot be delivered to the early endosomal compartment, thereby preventing infection. SbN and ARB also prevent cell infection by viruses that enter through clathrin-mediated endocytosis, which could explain their broad spectrum activity. I also contribute to a project initiated for a few months in the lab. We hypothsized that a molecule present in the immediate surrouding of the hepatocyte microenvironment could play a role in HCV infection. We focused on the syndecan-1 (SDC1) because it is essentially anchored on the surface of hepatocytes. We show that SDC1 depletion leads to a drastic decrease of the viral infectivity. SDC1 colocalizes on the unfected hepatocyte surface with the already identified HCV recptor CD81. This colocalization vanished within days in infected cells. These data suggest that SDC1 could act as a cellular co-factor for HCV entry, in combination with CD81; thus infection could reorganized molecules of the hepatocyte microenvironment and contribute to HCV hepatotropism and the peristence of infection

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Kirsz, Michel. "Etude comparative des dents humaines fossiles et vivantes." Bordeaux 2, 1992. http://www.theses.fr/1992BOR2OND2.

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Georget, Virginie. "Dynamique intracellulaire du récepteur des androgènes dans une cellule vivante." Montpellier 1, 1998. http://www.theses.fr/1998MON1T025.

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Matheoud, Diana. "Présentation croisée par les cellules dendritiques à partir de cellules vivantes." Paris 6, 2009. http://www.theses.fr/2009PA066745.

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Abstract:

Les cellules apoptotiques représentent une source d’antigènes induisant une présentation croisée efficace. Notre travail a consisté à évaluer le potentiel des cellules vivantes en tant que source d’antigènes pour la présentation croisée. Nous avons montré que des DC internalisent du matériel cellulaire à partir de cellules vivantes et que ce mécanisme est actif et implique les PI3 Kinases, les récepteurs scavenger et des lectines. La capture d’antigènes à partir de fibroblastes exprimant l’ovalbumine (L-OVA), induit une activation des lymphocytes T CD8+ naïfs OT-I. In vivo, la capture de matériel cellulaire à partir de cellules vivantes par les DC a été démontré dans la rate par microscopie confocale en 3D. Les DC cultivées avec des cellules L-OVA vivantes induisent une activation de lymphocytes T OT-I naïfs, même en absence de DC endogènes capables de présenter l’épitope. Finalement, des DC cultivées avec des cellules vivantes portant des antigènes naturels induisent des réponses T naturelles plus fortes qu’à partir de cellules apoptotiques. La présentation croisée à partir de cellules vivantes doit être pris en compte dans le cadre de l’immunothérapie ou de l’autoimmunité

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Markova, Olga. "Les biosenseurs fluorescents pour l'analyse de cellules vivantes." Aix-Marseille 2, 2008. http://theses.univ-amu.fr.lama.univ-amu.fr/2008AIX22103.pdf.

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Abstract:

Flurorescent sensors become a powerful tool for non invasive monitoring of intracellular ion concentrations and intracellular protein localisation. In our work we study properties of genetically encoded C1 sensors 'C1-sensor", that is a CFP-YFP based construct, "Biosensor-GlyR" that is a GlyR channel with C1-Sensor incorporated into intracellular domain, proposed method for application of this proteins to measurements of intracellular C1 in different cell types, identify sensitivity to C1 and estimate chloride concentration in cell lines and primary hippocampal cultures. In the second part of our work we reveal intracellular dynamics of hippocalcin, a member of neuronal calcium sensors protein family, tagged with yellow fluorescent protein. We identify spatial temporal characteristics of Ca2+ dependent hippocalcin translocations in process of hippocampal neurons that support the idea of hippocalcin role in a decoding of short place specific calcium signals in neurons
Les senseurs fluorescents deviennent un instrument puissant pour la mesure non-invasive de la concentration des ions intracellulaires et pour la localisation des protéines intracellulaires. Notre travail consiste à étudier les propriétés d'un senseurs C1- codés génétiquements, le 'C1-Sensor', qui est une construction CFP-YFP, et celles du 'Biosensor-GlyR', qui est un canal GlyR fusionné avec le C1-Sensor. Nous avons caractérisé les propriétés spectrales de ces senseurs, mesuré leurs sensibilité au C1- et évalué la [C1-]i dans des cellules CHO et des cultures hippocampales primaires. Dans la deuxième partie de notre travail, nous avons trouvé et décrit les caractéristiques temporelles et spatiales de la translocation de l'hippocalcin marqué par EYFP. Ce résultat laisse à penser que cette protéine permet de faire le décodage rapide des signaux calciques à des endroits spécifiques dans les neurones

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David, Ariane. "Chorégraphie de ségrégation des deux chromosomes de Vibrio cholerae." Phd thesis, Université Paris Sud - Paris XI, 2013. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00921394.

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Abstract:

L'objectif de cette thèse est de définir la chorégraphie de ségrégation des deux chromosomes circulaires de Vibrio cholerae, c'est à dire le positionnement de l'information génétique au cours de la croissance de la cellule, ainsi que les mécanismes dirigeant ces ségrégations. Il a longtemps été supposé que les bactéries étaient trop petites pour avoir une organisation intra-cellulaire, et le manque de techniques appropriées ne permettait pas d'infirmer cette hypothèse. Or la taille des chromosomes comparée à celle de la bactérie impose une compaction et aujourd'hui, de nouvelles techniques de microscopie et d'analyse génétique permettent d'affirmer que les chromosomes bactériens étudiés jusqu'à maintenant ont tous une organisation et une chorégraphie de ségrégation précises et différentes selon les espèces. Toutes les espèces étudiées à ce jour ont un chromosome circulaire unique : la réplication du chromosome commence à une origine unique bidirectionnelle, les deux fourches de réplication se déplacent le long des deux bras de réplication (ou réplichores) et finissent la réplication au terminus, diamétralement à l'opposée de l'origine de réplication sur la carte du chromosome. Peu d'espèces ont été étudiées, et Vibrio cholerae émerge progressivement comme un nouveau modèle : son génome est réparti sur deux chromosomes, et la chorégraphie de plusieurs chromosomes dans une cellule n'a jamais été décrite. De plus, cette espèce semble être au croisement évolutif entre Caulobacter crescentus et Escherichia coli : Vibrio cholerae a d'une part une morphologie en croissant, des systèmes de partition aux origines et un positionnement de l'origine du chromosome I, semblables à C. crescentus, et d'autre part un système de compaction du terminus et un set de gènes impliqués dans la maintenance du chromosome ayant co-évolué, qu'on ne retrouve que dans peu d'espèces proches d'E. coli. Une autre caractéristique intéressante de V. cholerae est que le chromosome II semble avoir été acquis récemment et n'est donc peut être pas gouverné par les mêmes mécanismes que le chromosome I, comme en témoignent le positionnement de son origine et son terminus, inédits pour des chromosomes bactériens. Parmi les Vibrios (environ 60 espèces principalement retrouvées dans les environnements aquatiques), certaines espèces sont des pathogènes dévastateurs pour les poissons, le corail, les crustacés ou les fruits de mer. Mais la plus documentée est Vibrio cholerae, car elle provoque chez l'Humain une maladie provoquée par l'ingestion d'eau contaminée qui peut être mortelle si le patient n'est pas réhydraté à temps. Bien que facilement traitable, le choléra fait encore de nombreuses victimes dans les pays en développement où les structures de santé et les règles d'hygiène font parfois défaut. Ainsi l'étude de Vibrio cholerae présente un intérêt médical, mais également par extension aux autres Vibrios, un intérêt environnemental non négligeable.

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Rémy, Ingrid. "Visualisation des voies de signalisation intracellulaires dans les cellules vivantes." Thesis, National Library of Canada = Bibliothèque nationale du Canada, 2000. http://www.collectionscanada.ca/obj/s4/f2/dsk1/tape2/PQDD_0032/NQ62104.pdf.

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Canetta, Elisabetta. "Micromanipulation de cellules vivantes par spectrométrie AFM : application au cancer." Université Joseph Fourier (Grenoble), 2004. http://www.theses.fr/2004GRE10003.

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Batisse, Claire. "Caractérisation biochimique et structurale des RNases P et MRP chez la levure Saccharomyces cerevisiae." Phd thesis, Université de Strasbourg, 2013. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00804257.

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Abstract:

La RNase P est une endoribonucléase responsable de la maturation de l'extrémité 5' des ARNt prématures. Holoenzyme très conservée, elle est constituée d'une composante ARN formant le noyau catalytique et d'une composante protéique dont le nombre de sous-unités est variable : une protéine chez les bactéries, 5 chez les archées et d'au moins 9 chez les eucaryotes. Les eucaryotes possèdent également une autre endoribonucléase, la RNase MRP dont la composition est proche de la RNase P tant au niveau ribonucléique que protéique mais avec une spécificité de substrat propre. Dans cette étude, nous proposons une méthode originale et spécifique pour purifier la RNase P et la RNase MRP de S. cerevisiae. Grâce à la microscopie électronique et au traitement d'images, nous avons déterminé la première structure de ces deux holoenzymes à une résolution d'environ 1.5 nm. Ces structures révèlent une architecture modulaire commune où les protéines stabilisent la composante ARN et contribuent à l'édification de cavités et de conduits. Les spécificités structurales sont localisées en des positions stratégiques pour l'identification et la coordination du substrat.

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Barroca, Thomas. "Microscopie supercritique plein champ pour l’observation des membranes cellulaires." Paris 6, 2013. http://www.theses.fr/2013PA066457.

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Abstract:

Les processus membranaires sont impliqués dans de nombreux mécanismes cellulaires. La compréhension de ces phénomènes est cruciale en biologie, entraînant le développement de techniques de fluorescence spécifiques à l’imagerie de surface comme le TIRF. Nous avons développé une technique alternative d’imagerie plein champ utilisant le principe de l’émission supercritique (SAF). Quand les émetteurs fluorescents sont très proches de l’interface de verre, leurs composantes de champ proche deviennent propagatives à des angles supercritiques. Cette émission supercritique, encore appelée lumière interdite, décroît très rapidement avec la distance fluorophore/surface avec une longueur caractéristique de décroissance de 100 nm. Ainsi sélectionner l’émission supercritique permet un filtrage axial efficace au-delà de la limite de diffraction mais conduit malheureusement à une dégradation de la résolution latérale. Pour s’affranchir de cette difficulté, nous proposons d’utiliser la cohérence spatiale de chaque fluorophore pour générer des interférences en fluorescence à l’aide d’une soustraction entre deux images. Nous montrons qu’appliquer ces auto- interférences sur les composantes SAF permet un confinement axial de 100 nm sans aucune dégradation de la résolution latérale dans une configuration plein champ. De plus, notre technique permet de suivre simultanément la membrane et les parties internes de la cellule. Enfin, sa facilité d’implémentation permet d’ajouter une nouvelle fonctionnalité d’imagerie de surface sur n’importe quel microscope sans modification de celui-ci
Numerous cell mechanisms involve membrane processes. The understanding of such processes is thus of crucial importance in biomedical applications. It explains the spectacular development of specific fluorescence imaging techniques like TIRF. We have developed an alternative full field imaging technique based on Supercritical Angle Fluorescence (SAF). When fluorescent emitters are placed in the vicinity of the glass slide, their near-field components become propagative at supercritical angles. This supercritical emission sharply decays with the fluorophore/surface distance with a characteristic decay length of about 100 nm. Selecting the supercritical emission thus provides an efficient way to realize spatial filtering but unfortunately also lead to a significant loss of lateral resolution. To overcome this drawback, we propose to use the spatial coherence of each single fluorescent emitter to generate interferences in fluorescence using a subtraction between two images. We show that apply this method on SAF components allows us to obtain an axial confinement of 100 nm without any degradation of the lateral resolution in a full-field configuration. Moreover, this technique allows us to simultaneously follow dynamic events both at the surface and more in-depth. Finally, this method easily provides an additional surface imaging capability to any microscope without major modifications

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Daigle, André. "Production d'un fromage à pâte ferme contenant des cellules vivantes de Bifidobacterium infantis." Thesis, National Library of Canada = Bibliothèque nationale du Canada, 1997. http://www.collectionscanada.ca/obj/s4/f2/dsk3/ftp05/mq25545.pdf.

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Delbarre, Erwan. "Etude comparative de l' assemblage en cellules vivantes des lamines sauvages et mutées." Paris 6, 2005. http://www.theses.fr/2005PA066398.

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Louvet, Emilie. "Dynamique et compartimentation de la machinerie de maturation des ARN ribosomiques en cellules vivantes." Paris 5, 2005. http://www.theses.fr/2005PA05S025.

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Abstract:

L'organisation fonctionnelle du noyau dépend de machineries nucléaires distribuées dans des domaines appelés corps nucléaires. Pour comprendre comment cette distribution est régulée,nous avons choisi le nucléole comme modèle d'étude. Nous nous sommes intéressés au trafic et à la compartimentation de la machinerie de maturation des ARNr pendant l'interphase et la mitose. Cette étude a nécessité l'utilisation de techniques de microscopie permettant le suivi de protéines en cellules vivantes telles que : le FRAP, la vidéomicoscopie et le tdFLIMFRET. Grâce à un système permettant de séparer réversiblement les machineries de transcription et de maturation des ARNr en interphase, nous avons montré que la machinerie de maturation est déconnecté des sites de transcription et se concentre dans des masses nucléaires issues du composant granulaire nucléolaire. Nous les avons nommées masses granulaires. Ce processus réversible, nous a permis d'étudier la reformation nucléolaire. Dans des cellules contrôles et grâce à un système de cellules perméabilisées, mis au point dans le laboratoire, nous avons montré que la reformation nucléolaire dépend de l'hydrolyse de l'ATP et que CK2 intervient dans la régulation de la compartimentation du nucléole. En sortie de mitose, nous avons montré que le recrutement des machineries de maturation précoce et tardive passe par les même PNB. La convergence des machineries dans un même site pourrait être l'origine de la formation des PNB. De plus, nous avons mis en évidence l'interaction des protéines B23 et Nop52 dans les PNB. Aussi, nous proposons, pour les PNB, un rôle de plateformes d'assemblage des complexes de maturation des ARNr
The functional organisation of the nucleus depends on machineries that are distributed in domains named nuclear bodies. To understand how this distribution is regulated we have chosen the nucleolus as example. We have focused our attention on traffic and compartmentation of the rRNA processing machinery during interphase and mitosis. To follow proteins in living cells we have used microscopy technologies such as: FRAP, videomicroscopy and tdFLIM-FRET. A reversible system capable of disconnecting the processing from the transcription machineries during interphase permitted us to show that the processing machinery can be disconnected from the transcription sites and accumulates in nuclear masses originating from the nucleolar granular component. We named these granular masses. This reversible process permitted us to study reformation of the nucleolus. In control cells and in an assay using permeabilized cells set up in the laboratory, we have shown that nucleolar reformation depends on ATP hydrolysis and that CK2 is involved in nucleolar compartmentation. At the exit of mitosis, we have shown that early and late processing machineries pass through the same PNB. The convergence of the machineries in a single site could be at the origin of PNB formation. Furthermore, we have demonstrated that Nop52 and B23 interact in the same PNB. For this reason, we propose that PNB are preassembly platforms for rRNA processing complexes

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Grégoire, Antoine. "Design et étude d'un dispositif holographique monolithique, compact et portatif pour l'imagerie de cellules vivantes." Master's thesis, Université Laval, 2019. http://hdl.handle.net/20.500.11794/37883.

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Abstract:

Le design d’un dispositif optique sans lentille et portatif est basé sur la microscopie holographique numérique pour des applications de terrain ou de point-of-care. L’appareil développé repose sur cette technique de microscopie car elle permet de reconstruire le front d’onde diffracté (phase et intensité) par un échantillon biologique observé. Le dimensionnement de cet appareil dépend de l’illumination utilisée ainsi que des contraintes physiques associées à la détection. Afin de maximiser l’information pertinente et enregistrable d’échantillons faiblement diffusants, des simulations FDTD sont utilisées. La propagation des champs diffractés à l’aide d’outils fidèles permet de générer des hologrammes échantillonnés à la façon d’un détecteur et de reconstruire les spécimens avec un grossissement. Par exemple, la reconstruction numérique de l’hologramme associé à la diffraction d’une bille de diamètre de 5 mm simulée via la méthode FDTD, et grossie selon un grandissement Gy = 20, est de 107.22 mm pour la méthode de propagation du spectre angulaire DFFT. La procédure proposée ouvre donc la voie à l’étude du champ diffracté utilisable dans un contexte d’holographie numérique, et ce pour des échantillons numériques pouvant modéliser des spécimens biologiques. D’ailleurs, le dispositif sans lentille mis sur pied à partir d’un coupleur de fibre optique offre une visibilité atteignant V = 0:8435 pour une configuration hors axe et cette dernière est limitée par le bruit cohérent de la source laser utilisée. L’étude du grossissement et de la résolution du dispositif montrent que le microscope holographique portatif est limité par l’échantillonnage du capteur utilisé, et ce, bien que la méthode d’indexation de zéros permette d’interpoler et de résoudre des détails plus fins que la taille d’un pixel pour la propagation DFFT. Finalement, l’appareil conçu est capable d’effectuer de l’imagerie de phase quantitative. L’épaisseur reconstruite d’une cible de verre (n = 1:52) est de 149±23 nm et concorde avec la valeur attendue de 150 nm.
ompact off-axis holographic lensless microscope capable of non-invasively imaging weakly scattering biological samples for on the field applications is designed. The technique allows to reconstruct both the phase and intensity of a sample-diffracted wavefront. The dimensioning of the proposed device depends on both the illumination shining the sample and the physical constraint associated with acquisition device. Hence, FDTD simulations are used in order to ascertain the smallest usable scattered field. Using proper propagation methods, the diffracted field is used to generate a numerical hologram emulating the sensor’s sampling rate. Such hologram is then numerically reconstructed in order to retrieve the object and compare it with the former. For instance, a 5 mm diameter bead diffraction field is obtained via FDTD simulation. As it is magnified by a factor Gy = 20, its reconstruction retrieves a magnified bead of 107.22 mm in diameter. The proposed pipeline thus paves the way for the study of modelled biological sample usable scattered field for holographic applications. Moreover, the proposed compact lensless device using an optical fiber coupler attains an off-axis visibility of V = 0:8435 as this last is limited by coherent noise. The study of the microscope attainable magnification and resolution shows that it is limited by the sampling rate of the used acquistion device, and that is, albeit zero-padding interpolation could provide smaller than a pixel size detail resolution for DFFT propagation. Lastly, the designed device is capable of quantitative phase imaging. The reconstructed thickness of a glass phase target (n = 1:52) is of d = 149±23 nm which is in good agreement with the expected value of 150 nm.

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Boutin, Céline. "Spectroscopie de corrélation de fluorescence pour l'étude de la diffusion membranaire dans les cellules vivantes." Troyes, 2008. http://www.theses.fr/2008TROY0019.

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Abstract:

La spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS) permet d’étudier la dynamique d’objets fluorescents. En particulier, elle est parfaitement adaptée à l’étude de la diffusion moléculaire. Ainsi, elle s’est avérée efficace pour étudier la diffusion de la Rhodamine-6G au voisinage d’une interface dont l’hydrophobicité est contrôlée. L’utilisation de surface possédant des degrés d’hydrophobicité croissants nous a permis de montrer que la rhodamine-6G est fortement attirée par les surfaces hydrophobes. Une étude de la fluidité de la membrane plasmique de cellules vivantes a également été menée. Elle a porté sur le phénomène de résistance multiple des traitements anticancéreux. La fluidité membranaire d’une lignée cellulaire résistante apparaît plus hétérogène que celle de la lignée sensible. L’effet d’un fluidifiant ainsi que de deux révertants nous ont permis de révéler l’existence de « domaine » membranaire corrélé à la présence d’une protéine à l’origine de la résistance. Enfin, un développement instrumental basé sur le FRET a été proposé afin de réduire fortement l’élongation axiale du volume d’observation. Grâce à une fonctionnalisation de la surface et un marquage membranaire spécifique, les points d’adhésion cellulaire ont été mis en évidence par imagerie, nous permettant de réaliser des premières mesures locales de FCS
Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is used to probe the dynamic of molecular dyes. In particular, FCS is well adapted to investigate diffusion processes. Thus, such spectroscopic approach was suitable to study the diffusion of rhodamine-6G near a controlled interface in term of hydrophobicity degree. Finally, we have shown that rhodamin-6G is strongly attracted by hydrophobic surfaces. A study of membrane fluidity in living cells has also been conducted. It related to the multidrugs resistance (MDR) phenomena in cancer research. So, we clearly reveal the higher heterogeneity of plasma membrane in MDR cells in comparison with the sensitive ones. The effect of specific and non specific membrane agents allowed us to display the presence of distinct membrane “domain” linked to the resistance. Finally, an instrumental development based on FRET was proposed in order to strongly reduce the axial elongation of the confocal volume. Through a surface functionalization and an appropiate plasma membrane labelling, we have highlighted cell adhesion on surfaces, which enabled us to perform first local FCS measurements on cells

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Lombard, Alain. "QuanTI-FRET, un outil d'imagerie pour l'analyse de la mécanotransduction dans les cellules vivantes uniques." Thesis, Université Grenoble Alpes, 2020. http://www.theses.fr/2020GRALY055.

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Abstract:

De nombreux processus cellulaires élémentaires (migration, différentiation, mort) sont contrôlés par des ensembles d'acteurs reliés entre eux par des réactions en cascade. Certains de ces réseaux de signalisation convertissent des signaux mécaniques extérieurs à la cellule en signaux biochimiques internes, processus appelé mécanotransduction. Nous cherchons à étudier ces réseaux dans une approche de traitement du signal, pour déterminer expérimentalement un analogue de la fonction de transfert en espace et temps pour la mécanotransduction.Le contrôle de la variable d'entrée mécanique est assuré par différents types de substrats 2D que nous avons mis en place, comme la simple surface de verre, des motifs géométriques d'adhérence, et des substrats magnéto-actifs (composés de micro-piliers insérés dans un élastomère) pouvant stimuler localement et dynamiquement les cellules.La mesure de la variable de sortie biochimique est assurée par des biosenseurs FRET. La fluorescence qu'ils émettent est collectée à travers un microscope de fluorescence en champ large inversé. Nous avons mis en place le calcul de l'efficacité de FRET quantitative à partir de cette fluorescence sans l'utilisation de standards de FRET. Elle donne accès à l'activité en espace et en temps de certaines molécules des réseaux de signalisation.Quelques outils sont enfin présentés comme potentiels candidats pour réaliser la fonction de transfert, parmi lesquels des combinaisons de méthodes de corrélations, et la décomposition en valeurs singulières utilisée en acousto-optique. La combinaison de ces outils et méthodes reste complexe, notamment pour mettre en évidence un comportement biologique à partir d'une grandeur quantitative. Les premiers usages de ces outils ne présentent pas de résultat biologique majeur, mais sont prometteurs pour étudier la mécanotransduction
Many elementary cellular processes (migration, differentiation, death) are controled by a set of agents linked together by cascade reactions. Some of these signaling networks convert mechanical signals external to the cell into internal biochemical signals, a process called mechanotransduction. We seek to study these networks through a signal processing approach, in order to experimentally determine an analogous of the transfer function in time and space for mechanotransduction.Controlling the input variable is done by different type of 2D substrates which have been developped, from the simple glass surface, the adherent geometrical patterns, to the magneto-active substrates (composed of micro-pillars inserted into an elastomer) capable of stimulating locally and dynamically the cells.Measuring the biochemical output variable is done by FRET biosensors. The fluorescence emitted is collected through an inverted widefield fluorescence microscope. We set up the quantitative FRET efficiency calculus from this fluorescence without using FRET standards. It gives access to the activity in space and time of some molecules of network signalisation.Some tools are finally presented as potential candidates to perform the transfer function, among them are combination of correlation methods, and singular value decomposition used in acousto-optics. Combiantion of these tools and methods remains complex, particularly to highlight a biological behaviour from a quantitative quantity. The first use of these tools do not give any biological result, but are promising to study mechanotransduction

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Kurzawa, Laetitia. "Développement de biosenseurs peptidiques fluorescents pour la détection des Cdk-cyclines dans les cellules vivantes." Thesis, Montpellier 2, 2011. http://www.theses.fr/2011MON20086.

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Abstract:

Chez les eucaryotes supérieurs, la progression ordonnée du cycle cellulaire est régie par une dizaine de kinases Cdk-cyclines. Les altérations génétiques ou épigénétiques impliquant des oncogènes ou des gènes codant pour des suppresseurs de tumeurs sont souvent associées à l'expression ou l'activation aberrante des Cdks, favorisant ainsi la prolifération cellulaire incontrôlée et notamment le développement de cancers. Malgré la pertinence oncogénique et thérapeutique de ces protéines, leur détection est restée jusqu'à présent limitée à des méthodes indirectes et invasives. Dans ce contexte, mes travaux de thèse ont permis de développer un biosenseur peptidique fluorescent permettant de reconnaître spécifiquement les Cdk-cyclines. Associé à une stratégie de vectorisation non invasive basée sur l'utilisation de peptides vecteurs pénétrants, le biosenseur a été délivré efficacement dans les cellules. La mise au point d'une quantification ratiométrique du signal a par ailleurs permis d'évaluer l'abondance relative des Cdk-cyclines endogènes. Deux variants plus spécifiques de certains complexes ont pu être développés. Enfin, d'autres versions du biosenseur ont quant à elles permis d'évaluer sa biodistribution in vivo et de mettre au point un essai cellulaire en vue d'un criblage de petites molécules ayant un effet sur l'abondance relative des Cdk-cyclines
Cdk-cyclins represent key regulators of cell cycle progression among superior eukaryotes. Genetic and epigenetic alterations involving oncogenes or tumor suppressor genes are often associated with aberrant expression or activation of Cdks, leading to the sustained proliferation of cells and by the way to the development of cancers. Despite the oncogenic and therapeutic relevance of these proteins, their detection has so far remained limited to indirect and invasive methods. My Ph.D. thesis work aimed in this context at developing peptidic fluorescent biosensors that specifically recognize Cdk-cyclins. Combined to cell-penetrating peptides, the biosensor was efficiently delivered into cells. Following the development of the signal ratiometric quantification, the relative abundance of endogenous Cdk-cyclins was directly evaluated in living cells. Two other variants, that are more specific towards specific Cdk-cyclin complexes, were also designed. Finally, the development of novel versions of the biosensor allowed us to evaluate its biodistribution in vivo and to set up a cell-based assay to screen small molecules having an effect on Cdk-cyclin relative abundance

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Safi, Malak. "Nanoparticules inorganiques et nanofils magnétiques : toxicité et étude physique des interactions avec les cellules vivantes." Paris 7, 2012. http://www.theses.fr/2012PA077029.

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Abstract:

Les nanoparticules inorganiques, grâce à leur taille nanométrique (< 100 nm) sont utilisées dans de nombreuses applications industrielles (cosmétiques, automobiles. . . ) et en biomédecine (traitements anti-cancéreux, vectorisation des médicaments. . . ). Cependant, une des grandes questions à ce jour concerne la toxicité de ces nanoparticules et leur impact sur la santé et l'environnement. L'évaluation de la toxicité s'avère néanmoins une tâche difficile, étant donné le grand nombre de paramètres en jeu dans ce problème dont la nature chimique des particules, leur taille, leur état de surface, leurs morphologies, leur mode d'internalisation et le type de cellules ou d'organes ciblés etc. L'objectif de notre travail est l'étude de la toxicité de ces nanoparticules et leurs interactions avec des cellules vivantes. Nous étudions plus particulièrement les effets de la nature, de l'enrobage et de la forme des nanoparticules d'oxydes de cérium (CeO₂), des oxydes de Fer (y-Fe₂O₃) et des matériaux nanostructurés faits à partir de celles-ci. Les tests de viabilité cellulaire ont montré que l'internalisation dans les cellules de mammifères et la toxicité dépendent de la nature de la particule, mais aussi de son enrobage. En effet, des polymères de faible poids moléculaire, adsorbés en surface des nanoparticules étaient plus stables que les ligands classiques et rendaient les nanomatériaux plus furtifs. De manière étonante, malgré leur forme et leur taille, les nanofils magnétiques synthétisés à partir des γ-Fe₂O₃ sont internalisés par les cellules. Leur biocompatibilité et leur biodégradabilité pourraient ouvrir la voie à des applications en biophysique et en nanomédecine
The inorganic nanoparticles, due to their size (< 100 nm) are being used in a wide range of applications including industries (cosmetics, automotive. . . ) and biomedicine (cancer therapy, drug delivery. . . ). However, the toxicity of these nanoparticles and their impact on the environment and possible health risks have not yet been fully evaluated. The evaluation of the toxicity appears to be difficult, considering the existence of different parameters such as the chemical composition of the nanoparticles, their size, their surface, their morphology, their uptake, and the type of targeted cells. The objective of our work is the study of the toxicity of these nanoparticles, and their interactions with living cells. We especially study the effects of the chemical composition, the coating, and the shape of the cerium oxide (CeO₂), iron oxide (y-Fe₂O₃), and the nanostructured materials synthesized from these particles. The cellular viability assays showed that the uptake inside mammalian cells and the toxicity depend on the nature of the particle, and also on the type of coating. Indeed, the polymers of weak molecular weight, adsorbed on the surface of the nanoparticles are more stable than the classic ligands and make them stealth. Surprisingly, despite their shape and length, the magnetic nanowires synthesized from y-Fe₂O₃), are taken up by the cells. Their biocompatibility and their biodegradability pave the way for applications in biophysics and nanomedicine

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Ouedraogo, Gladys. "Étude des mécanismes et cibles cellulaires de la phototoxicité des fluoroquinolones : l'approche microspectrofluorimétrique sur cellules vivantes." Paris, Muséum national d'histoire naturelle, 2000. http://www.theses.fr/2000MNHN0027.

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Abstract:

Les fluoroquinolones sont des antibiotiques très utilisés mais phototoxiques. Pour élucider les mécanismes de cette phototoxicité, nous avons mené une étude microspectrofluorimétrique de leur localisation intracellulaire dans des fibroblastes humains en culture, afin d'identifier les sites cellulaires de cette photosensibilisation, ainsi que les dommages causés au niveau de ces sites. Les expériences de co-localisation réalisées avec le jaune de Lucifer ou le rouge neutre (des marqueurs lysosomiaux fluorescents), ont permis d'identifier les lysosomes comme site préférentiel de localisation des fluoroquinolones, bien qu'on les retrouve dans tout le cytoplasme. Une altération de la perméabilité de la membrane lysosomiale a été démontrée en suivant la re-localisation du jaune de Lucifer ou du rouge neutre dans des fibroblastes photosensibilisés par ces antibiotiques. Des dommages ont aussi été détectés au niveau des mitochondries en utilisant la rhodamine 123 comme sonde fluorescente, bien que l'on n'observe pas de localisation très importante des fluoroquinolones dans ces organites. La perturbation des mécanismes de l'endocytose dans les fibroblastes traités avec les fluoroquinolones a été démontrée en utilisant les LDL comme ligand modèle. La fixation et l'internalisation plus la dégradation des LDL furent suivies au moyen du phénomène de F. R. E. T. (transfert d'énergie de fluorescence de type Forster), grâce à deux carbocyanines incorporées dans le cœur lipidique des LDL et formant un couple accepteur-donneur. Une dépolymerisation des filaments d'actine marqués au alexa 568< T. M> phalloidine a aussi été révélée par microscopie de fluorescence. La phototoxicité des fluoroquinolones induite par l'UVA, résulte donc de l'altération de cibles biologiques multiples

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Claverie, Léa. "Dynamique d'échange de la dynamine mesurée dans les cellules vivantes pendant la formation de vésicules d'endocytose." Thesis, Bordeaux, 2019. http://www.theses.fr/2019BORD0053.

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Abstract:

L'endocytose dépendante de la clathrine (EDC), c’est-à-dire la formation de vésicules recouvertes de clathrine (VRC) à partir de la membrane plasmique, est un processus essentiel dans les cellules eucaryotes. Au cours de l’EDC, la GTPase dynamine est recrutée au cou de la VRC naissante où elle s'oligomérise en hélice. Les changements de conformation induits par l'hydrolyse du GTP catalysent la scission du cou vésiculaire. Ce processus a été étudié en détail par reconstitution in vitro sur des tubules membranaires, mais il doit être établi dans des cellules vivantes, où les interactions de la dynamine avec d'autres protéines comme l'amphiphysine sont critiques. L'imagerie TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence) avec le protocole pH pulsé (ppH) sur cellules vivantes permet la détection de la formation de VRC avec une résolution spatiale (~100 nm) et temporelle (2 s) élevée. Ce protocole a révélé que la dynamine présente un recrutement biphasique aux puits recouverts de clathrine (PRC) en maturation avec un pic au moment de la scission mais les paramètres de son recrutement dans les cellules vivantes restent peu clairs. Pour déterminer ces paramètres, j’ai utilisé des techniques d’imagerie sur cellules vivantes pour étudier le recrutement de la dynamine à l’échelle globale et à l’échelle de la molécule unique lors de perturbations aiguës de sa fonction. Mes résultats de thèse ont montré que la dynamine est recrutée à la membrane plasmique, diffuse à l'extérieur des PRC et y est transitoirement piégée. De plus, j’ai déterminé avec des dynamines mutées (1) que le domaine PRD de la dynamine est crucial pour son recrutement aux PRC ; (2) que le domaine PH est important pour la scission vésiculaire mais par pour son recrutement aux PRC ou à la membrane plasmique. Enfin, j’ai observé que la dynamine s'échange en permanence avec un pool extra-PRC, ce qui permettrait son recrutement ultérieur par l'ajout de nouveaux sites de liaison et sa capacité à rétrécir le cou des vésicules suite à l’hydrolyse du GTP. En conclusion, ces données suggèrent qu’aux PRC, les molécules de dynamine (1) sont constamment échangées ; (2) diffusent à des taux similaires tout au long du processus de formation, maturation et scission des vésicules; et (3) l'activité GTPase de la dynamine contribue à la maturation et à la scission des VRC
Clathrin-mediated endocytosis (CME), the formation of clathrin-coated vesicles (CCV) from the plasma membrane, is an essential process in eukaryotic cells. During CME, the GTPase dynamin is recruited to the neck of nascent CCV where it oligomerizes into helical filaments. Conformational changes induced by the hydrolysis of GTP catalyze the scission of the vesicle neck. This process has been studied in detail with in vitro reconstitution on membrane tubules but it needs to be established in living cells, where interactions between dynamin and other proteins such as amphiphysin are critical. Live cell total internal reflection fluorescence (TIRF) imaging with the pulsed pH (ppH) assay allows the detection of CCV formation with high spatial (~100 nm) and temporal (2 s) resolutions. It has revealed that dynamin is recruited to maturing clathrin-coated pits (CCP) in two phases with a peak at the time of scission but the parameters of its recruitment in living cells remain unclear. To determine these parameters, we have performed live cell imaging of dynamin recruitment at collective and single molecule levels during acute perturbations of its function. My PhD results showed that dynamin is recruited to the plasma membrane, diffuses outside of CCP and is trapped at CCP. Furthermore, we determined with mutated dynamins that (1) the PRD domain of dynamin is crucial for its recruitment at CCP; (2) the PH domain is important for vesicular scission but not for recruitment to CCP or to the plasma membrane. Finally, I observed that dynamin exchanges with an extra-CCP pool at all times: this would allow for its further recruitment by addition of new binding sites and its ability to narrow the vesicle neck after GTP hydrolysis. Altogether, these data suggest that in CCP dynamin molecules (1) are constantly exchanged; (2) diffuse at similar rates throughout the entire process of vesicle formation, from maturation until scission; and (3) that dynamin’s GTPase activity contributes to CCP maturation and scission

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MORALES, POIREL NATHALIE. "Comportement de la sonde fluorescente tma-dph en interaction avec les cellules vivantes aux fortes concentrations." Strasbourg 1, 1993. http://www.theses.fr/1993STR15061.

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Bilodeau, Philippe. "Mesure par microscopie holographique numérique des propriétés viscoélastiques des cellules entières." Master's thesis, Université Laval, 2019. http://hdl.handle.net/20.500.11794/37528.

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Abstract:

L’étude des propriétés viscoélastiques des cellules entières par microscopie optique permet de soutirer de l’information unique sur les caractéristiques des cellules. Il est d’autant plus pertinent d’analyser ces propriétés tout au long de la maturation des cellules en culture pour en extraire de l’information sur le développement ainsi que sur la santé de celles-ci. Cependant, la grande majorité des techniques d’imagerie nécessite l’ajout d’un agent de marquage, alors que les méthodes permettant de mesurer les propriétés viscoélastiques cellulaires sont d’autant plus invasives. L’emploi de la microscopie holographique numérique est proposé, car cette méthode permet d’imager en temps réel des cellules en culture sans technique de marquage et d’en tirer des données quantitatives. De plus, la microscopie holographique numérique permet d’observer à l’échelle nanoscopique des déformations induites sur ces cellules, sans contact physique entre les cellules et un instrument externe. Le but de ce projet est de développer des tests en écoulement cisaillé permettant d’obtenir les propriétés viscoélastiques des cellules entières de façon précise et non invasive. Les réponses en déformation des cellules, face à la contrainte induite par le fluide en mouvement, sont ensuite interprétées par des modèles viscoélastiques auxquels les propriétés, telles que les constantes de rigidité et de viscosité, sont extraites pour toute la culture simultanément. Les résultats ont montré que les tests en écoulement cisaillé permettent de mesurer les propriétés viscoélastiques des cellules entières de façon non invasive. Une différence significative a été observée entre les propriétés des cellules NIH 3T3, HEK 293T/17 et des neurones. La constante de rigidité E1, ainsi que la constante de viscosité h2 des modèles Standard et Burgers sont des propriétés viscoélastiques des cellules entières permettant la distinction de ces types cellulaires.
The study of viscoelastic properties of whole-cell by optical microscopy allows one to obtain unique information on cell features. It is all the more important to assess those properties all along cultured cell maturation to extract information on its development and health. However, a vast majority of imaging techniques require a marking agent, whilst methods to measure viscoelastic properties are equally invasive. The use of digital holographic microscopy is proposed, since this method allows to image cell culture in real-time without a marking technique and provides quantitative images. Moreover, digital holographic microscopy provides screening deformation at nanoscopic scale induced on cells, without physical contact between the cells and an external instrument. The goal of this project is to develop shear flow assays allowing precise and non-invasive measurements of whole-cell viscoelastic properties. Cell deformation responses caused by the fluid shear stress are interpreted by viscoelastic models where rigidity and viscosity constants are extracted for the whole cell culture simultaneously. Results have shown that shear flow assays allow non-invasive whole-cell measurements of viscoelastic properties. A significant difference between cell properties of NIH 3T3, HEK 293T/17 and neurons have been found. The rigidity constant E1 and the viscosity constant h2 from Standard and Burgers models are viscoelastic properties to be used to discriminate those cell type.

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Mathieu, Julien. "Modélisation et conception d'un système de mesure de comportement électrique de cellules vivantes: Application aux Epitheliums intestinaux." Phd thesis, Université d'Evry-Val d'Essonne, 2008. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00422252.

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Abstract:

A partir de paramètres électriques comme le courant de court-circuit, la tension transépithéliale et la conductance, il est possible d'étudier des phénomènes de transports électrogéniques à travers un tissu biologique. Ces mesures peuvent contribuer à l'étude d'une molécule en fonction de sa traversée et de son action sur les propriétés de l'épithélium, de son mécanisme de transport, de sa relation concentration-passage ou encore de ses effets comparés à des molécules de référence. Le travail réalisé porte sur la conception d'un système automatisé permettant de mesurer ces trois paramètres électriques. Le principe de base utilisé est celui de la chambre d'Ussing. Il consiste à monter un tissu biologique entre deux demi-chambres pour isoler ses cotés muqueux et séreux et à mesurer ses paramètres électriques par l'intermédiaire d'électrodes de courant et de référence. L'étude a abouti à la réalisation d'une chambre d'Ussing modifiée pour optimiser la circulation de la solution physiologique et homogénéiser la densité de courant électrique traversant le tissu biologique. Des électrodes en acier inoxydable ont également été étudiées pour démontrer leur utilisation possible dans la chambre. Le principe de mesure retenu est fondé sur un correcteur défini d'après une fonction de transfert simplifiée du système. Une modélisation plus précise des interfaces et de différents tissus a été réalisée par impédancemétrie et a été utilisée pour la simulation et la calibration du correcteur. Les résultats obtenus ont été confrontés à un système de référence et permettent d'envisager par la méthode proposée une utilisation améliorée des chambres d'Ussing.

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Mathieu, Julien. "Modélisation et conception d'un système de mesure de comportement électrique de cellules vivantes : application aux épithéliums intestinaux." Thesis, Evry-Val d'Essonne, 2008. http://www.theses.fr/2008EVRY0018/document.

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Abstract:

A partir de paramètres électriques comme le courant de court-circuit, la tension transépithéliale et la conductance, il est possible d'étudier des phénomènes de transports électrogéniques à travers un tissu biologique. Ces mesures peuvent contribuer à l’étude d’une molécule en fonction de sa traversée et de son action sur les propriétés de l’épithélium, de son mécanisme de transport, de sa relation concentration-passage ou encore de ses effets comparés à des molécules de référence. Le travail réalisé porte sur la conception d’un système automatisé permettant de mesurer ces trois paramètres électriques. Le principe de base utilisé est celui de la chambre d’Ussing. Il consiste à monter un tissu biologique entre deux demi-chambres pour isoler ses cotés muqueux et séreux et à mesurer ses paramètres électriques par l’intermédiaire d’électrodes de courant et de référence. L’étude a abouti à la réalisation d’une chambre d’Ussing modifiée pour optimiser la circulation de la solution physiologique et homogénéiser la densité de courant électrique traversant le tissu biologique. Des électrodes en acier inoxydable ont également été étudiées pour démontrer leur utilisation possible dans la chambre. Le principe de mesure retenu est fondé sur un correcteur défini d’après une fonction de transfert simplifiée du système. Une modélisation plus précise des interfaces et de différents tissus a été réalisée par impédancemétrie et a été utilisée pour la simulation et la calibration du correcteur. Les résultats obtenus ont été confrontés à un système de référence et permettent d’envisager par la méthode proposée une utilisation améliorée des chambres d’Ussing
With electrical parameters such as the short circuit current, the transepithelial voltage and the conductance it is possible to study electrogenic transport across biological barriers. These measurements can be useful for the study of a molecule on the basis of its crossing behavior and its action on the epithelium properties, its dose effect relationship and its comparison with known molecules. The purpose of this work was to achieve an automated device which can measure these three electrical parameters. The used measurement principle is based on the Ussing’s chamber. This principle consists in mounting a biological tissue between two half chambers in order to isolate its mucosal side from its serous side and to measure its electrical parameters using working electrodes and reference electrodes. The study led to the design of a modified Ussing’s chamber which improves the fluid flow and the electric current density through the biological tissue. Stainless steel electrodes have been also studied in order to demonstrate their potential use in the chamber. The measurement principle is based on a controller synthesized from a simplified transfer function model. A more accurate model of the interfaces with various tissues was carried out by impedance spectroscopy and was used for the controller’s simulation and calibration. The results were checked with a reference system and allow to consider the proposed method as an improvement of the Ussing’s chamber

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Cardot, Philippe. "Separation de cellules vivantes du sang humain par la technique de fractionnement par couplage flux-force gravitationnelle." Paris 6, 1988. http://www.theses.fr/1988PA066119.

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Staub, Martial. ""cellules vivantes" et "fictions administratives" : histoire sociale des paroisses a nuremberg a la fin du moyen age." Paris 10, 1997. http://www.theses.fr/1997PA100168.

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Abstract:

Cette etude porte sur les deux paroisses (saint-sebald et saint-laurent) de nuremberg jusqu'aux debuts de la reforme. Partant du constat selon lequel l'histoire religieuse du moyen age s'est dedoublee entre une histoire des institutions ecclesiastiques et une histoire de la vie religieuse (a. Vauchez), elle plaide pour une approche de type + histoire-problemes ; et apprehende concretement la paroisse sous l'angle du + contrat statutaire ; (m. Weber). Pour ce faire, elle est cependant amenee a redefinir la nature de la juridiction dont la paroisse est le ressort. Apres avoir defini la juridiction paroissiale de la fin du moyen age comme procedant du mode incitatif plus que coercitif, cette etude examine, d'une part, de quelle facon les fideles des deux paroisses nurembergeoises ont pu eventuellement s'assurer les uns les autres d'un lien + statutaire ; et, d'autre part, comment, en l'absence d'institutions propres, la solidarite en question a pu perdurer au fil des generations. Comme une solidarite de ce type ne peut guere passer que par les oeuvres pieuses realisees dans le cadre paroissial, en ce sens que les fideles devaient etre plus genereux que ne l'exigeait le tarif que constituaient les indulgences, il apparut rapidement que l'absence de reactions a la suppression de certaines oeuvres au moment de la reforme posait probleme et permettait ainsi de rendre compte des elements de continuite ayant jusqu'alors rempli leur fonction. L'existence de solidarites paroissiales a saint-sebald et a saint- laurent etablie par ailleurs, il devenait ainsi possible de montrer de quelle facon les multiples solidarites dont nuremberg etait riche avaient, pour ainsi dire par analogie, assure la continuite du contrat statutaire paroissial ; de meme la reforme se trouvait-elle inscrite dans la genese d'une veritable + religion civique ;. Encore fallait-il faire la part du role joue par les institutions de l'administration paroissiale qu'etaient les cures, les fabriques, mais aussi les associations de clercs, ne serait-ce que parce que ce sont ces institutions qui ont transmis les sources. A conclure de la transmission des documents a la maniere dont les institutions de l'administration paroissiale se donnaient a voir, cette etude des paroisses de nuremberg a la fin du moyen age tente d'inaugurer un mode different d'acces aux sources
This study focuses on nuremberg's two parishes, saint sebald and saint lawrence, until the onset of the reformation. It takes as its starting point andre vauchez's observation - the history of medieval religion has bifurcated into a history of ecclesiastical institutions and a history of religious life -, pleads for an "histoire-problemes" style approach, and apprehends concretely the parish through the angle of the "statutory contract" (max weber). To do so, it redefines the nature of the jurisdiction which the late medieval parish underlay. Once it has defined late medieval parish jurisdiction as incitative rather than coercive in nature, the study moves on to examine, first, how the faithfuls in the two parishes of nuremberg could possibly guarantee to one another a "statutory" bond, second, how in the lack of specific institutions, this form of solidarity was able to last generation after generation. Such a solidarity could hardly exist otherwise than in works of piety performed within the parish's framework, with a degree of generosity superogatory vis-a-vis that prescribed (e. G. , by indulgences). The absence of reaction at their supression when the reformation came to nuremberg is surprising, and allows to account for elements which had fulfilled until then to create continuity. Once established the existence of parish solidarities in saint sebald and saint lawrence, it becomes possible to show how nuremberg's various solidarities insured, analogically as it were, the parish statutory contract's continuity. On the basis of the same reasoning the genesis of a true "civic religion" bore in itself the later reformation. Yet one had to evaluate the share which the parish administration's "institutions" - curateships, fabric funds as well as associations of clerics - might have played, if only because these are the institutions which have transmitted our sources. In order to solve this problem, this study of nuremberg's late medieval parishes goes from the documentary transmission to the way in which the parish administration's institutions represented themselves. In so doing, it seeks to suggest a different way of approaching the sources

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EMMANUEL, FLORENCE. "Conception d'une molecule pour l'etude de l'internalisation dans les cellules vivantes. Double marquage fluorescent de la ricine." Paris 7, 1991. http://www.theses.fr/1991PA077164.

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Abstract:

Dans le but de suivre les voies d'endocytose d'une molecule toxique: la ricine, il apparaissait necessaire de concevoir une molecule signal dont les differentes etapes de penetration et de cheminement pourraient etre reperees dans la cellule. Cette these presente la mise au point d'une methode simple et rapide de separation des chaines de la ricine, le marquage de ces chaines par des sondes fluorescentes differentes: dansyl (d) pour la chaine a et fluoresceine (f) pour la chaine b, et leur reassociation conduisant a la formation de trois types de molecule de ricine fluorescente: deux monomarquees (ab#f et a#db) et une doublement marquee (a#db#f). Les chaines marquees libres et les molecules de ricine fluorescente ont ete etudiees par spectroscopie d'absorption et de fluorescence, leurs activites biologiques sont conservees. Une approche de l'etude de l'internalisation de la ricine par les cellules d'hepatome de zajdela a ete realisee par videomicrofluorimetrie en utilisant la molecule ab#f. Cette etude a conduit a la mise en evidence de deux populations cellulaires fixant differemment la ricine

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Cardot, Philippe. "Séparation de cellules vivantes du sang humain par la technique de fractionnement par couplage flux-force gravitationnelle." Grenoble 2 : ANRT, 1988. http://catalogue.bnf.fr/ark:/12148/cb37612390p.

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Mathieu, Julien Mammar Said Eto Bruno. "Modélisation et conception d'un système de mesure de comportement électrique de cellules vivantes application aux épithéliums intestinaux /." S. l. : Evry-Val d'Essonne, 2008. http://www.biblio.univ-evry.fr/theses/2008/2008EVRY0018.pdf.

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Hayek, Ali. "Ingénierie, synthèse et caractérisation de nouveaux chromophores absorbants multiphotoniques : Applications en imagerie biologique." Université Louis Pasteur (Strasbourg) (1971-2008), 2006. https://publication-theses.unistra.fr/public/theses_doctorat/2006/HAYEK_Ali_2006.pdf.

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Abstract:

L’imagerie biologique par microscopie à deux photons (MDP)est de plus en plus utilisée actuellement pour explorer les structures des cellules, ainsi que leur mode de fonctionnement. Récemment cette technique a trouvé de nombreuses applications dans le domaine biomédical (imagerie cellulaire et du petit animal. La MDP tire avantage du phénomène d’absorption à deux photons (ADP), caractérisé par la dépendance quadratique de la probabilité d’absorption simultanée de deux photons en fonction de l’intensité lumineuse du laser, ce qui fait que l’émission ne se produit qu’au point focal du système optique. Pour l’amélioration de cette technique, la contribution du chimiste consiste en l’élaboration de nouveaux colorants ayant une section efficace d’ADP (2) élevée. La compatibilité biologique et la non-toxicité de ces colorants sont deux caractéristiques importantes. L’objectif de ce travail est donc l’élaboration et la caractérisation de nouveaux chromophores absorbants multiphotoniques, solubles dans l’eau pour l’imagerie biologique. La MDP peut être combinée à un autre type d’imagerie comme l’Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) ou avec un thérapie particulière comme par exemple la Thérapie par Capture de Neutron par le Bore (BNCT). Pour ce faire, des chromophores contenant des hétéroatomes spécifiques des propriétés s’ajoutant à l’ADP (gadolinium et bore) ont été conçus, synthétisés et caractérisés
Cellular imaging is more and more used for the investigation of cells structures, functions and communications. For that purpose, fluorescence confocal microscopy has become a routine technique since it permits to investigate the details of a variety of physiological behaviors in the cell. More recently two-photon excited microscopy (TPEM) has emerged in biomedical research, for example in cellular and small animal imaging. This method takes advantages of the nonlinear optical (NLO) properties of chromophores: the emission occurs only at the focal point of the laser (quadratic dependence upon intensity) and the laser used induces a low bleaching out of focus (use of IR light instead of the more energetic UV light). Wide efforts are therefore being undertaken in order to develop chromophores with high two-photon absorption cross-section (σ2), good fluorescence efficiency, and low bleaching. The aim of our research is the elaboration and characterization of new water-soluble chromophores, optimized for two-photon induced fluorescence in biological systems for bio-imaging. This technique (TPEM) can be combined to other type of imaging like the Magnetic Resonance Imaging (MRI) or some kind of therapy like Boron Neutron Capture Therapy (BNCT). For these aims, chromophores containing paramagnetic atom (gadolinium in our case) and boron atoms were designed, synthesized an characterized

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Dissertations / Theses on the topic 'Microscopie des cellules vivantes'

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