Dissertations / Theses: 'Microscopie de molécules uniques'

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Dukhno, Oleksii. "Microscopie de molécules uniques avec des nanoparticules à conversion ascendante." Thesis, Strasbourg, 2018. http://www.theses.fr/2018STRAJ104.

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Abstract:

La microscopie de molécule unique (single-molecule microscopy, SMM) regroupe un ensemble de techniques pour la biologie moléculaire et cellulaire permettant de visualiser le mouvement de molécules biologiques individuelles. Néanmoins, les techniques SMM imposent de fortes contraintes en ce qui concerne les luminophores utilisés. Récemment, un nouveau luminophore appelé «particule à conversion ascendante» (upconverting nanoparticles, UCNP) a attiré l'attention de la communauté scientifique en raison de son émission efficace de lumière visible après une excitation par de la lumière infrarouge. Cette propriété fait des UCNPs un luminophore très intéressant pour les applications biologiques : l'excitation infrarouge permet d'éliminer l’autofluorescence, généralement associé à une excitation dans la gamme du visible. De plus, la photostabilité extrême des UCNP et l’absence de photoclignotement sont également de précieux atouts pour les expériences SMM. L’objectif de cette thèse était d’adapter les UCNPs aux applications SMM, avec le but ultime d’exploiter leurs propriétés uniques pour améliorer les performances des expériences SMM. Au cours du projet, les protocoles de dispersion des UCNPs dans des tampons aqueux ont été optimisées pour conserver une bonne monodispersité des particules; l'efficacité des UCNPs dans les expériences de transfert résonant d'énergie en particule unique a été estimée; des protocoles pour l'imagerie d'UCNPs uniques ont été développés; et la preuve de concept de l'utilisation des UCNPs dans des expériences de suivi de molécules uniques à la surface de cellules vivantes a été réalisée. Finalement, ces résultats forment une base solide pour de futures expériences SMM utilisant les UCNPs
Single-molecule microscopy (SMM) is a powerful set of techniques for molecular and cell biology that allows visualizing the movement of individual biological molecules, but has strict requirements towards the utilized luminophores. Recently, a new luminophore called upconverting particles (UCNPs) gained attention of the research community due to their efficient emission of visible light upon excitation with infrared light. This property makes UCNPs a valuable luminophore for biological applications due to the elimination of autofluorescence background, commonly associated with regular visible light excitation. Extreme photostability of UCNPs and absence of sporadic photoswitching are also valuable for SMM experiments. The objective of this thesis was to adapt UCNPs to SMM applications, with the ultimate goal of exploiting their unique properties towards superior performance of SMM experiments. During the project, protocols for dispersing UCNPs in aqueous buffers were streamlined to provide superior particle monodispersity; the efficiency of UCNPs in single-molecule resonance energy transfer experiments was estimated; protocols for single-molecule imaging with UCNPs were developed; and a proof-of-concept system for targeted single-molecule tracking with UCNPs in live cells was demonstrated. Overall, these findings will serve as a foundation towards robust SMM assays based on UCNPs

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Jouchet, Pierre. "Microscopie super-résolue tridimensionnelle par modulation du signal de fluorescence de molécules uniques." Thesis, université Paris-Saclay, 2020. http://www.theses.fr/2020UPASP005.

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Abstract:

L’imagerie tridimensionnelle par localisation de molécules uniques (SMLM) permet d’obtenir des résolutions de quelques dizaines de nanomètres mais présentent encore certaines limitations liées notamment à une précision axiale non uniforme et une profondeur d’observation souvent limitée au premier micron de l’échantillon. Nous proposons ici une nouvelle approche de localisation de molécules uniques, appelée ModLoc, qui repose sur la modulation et la démodulation du signal de fluorescence des molécules uniques via l’utilisation d’une excitation structurée et modulée temporellement. Dans un premier temps, nous exposons les fondamentaux de l’imagerie SMLM et les limites actuelles de ce domaine. Les subtilités de ce nouveau principe de localisation sont ensuite détaillées et montrent un gain de précision théorique d’un facteur 3. Des études du caractère temporel aléatoire de l’émission des sondes fluorescentes en imagerie SMLM révèlent la nécessité d’intégrer des solutions optiques rapides (proche du kHz). La validation expérimentale du gain en précision accessible est démontrée grâce à la mise en place de deux dispositifs optiques. Nous choisissons d’appliquer ce principe afin d’améliorer la précision de localisation axiale des molécules fluorescentes. Les résultats obtenus mettent en évidence une précision de localisation uniforme de 7.5 nm et jusqu’à 7 microns en profondeur sur des échantillons de calibrations et des échantillons biologiques. La robustesse de la méthode pour l’imagerie SMLM en profondeur est également démontrée grâce notamment à des acquisitions effectuées à 30 µm de profondeur dans des milieux aberrants. Différentes pistes d’amélioration du dispositif actuel ainsi que l’extension de cette approche de localisation modulée à l’observation d’autres grandeurs telle que le temps de vie et l’orientation des molécules fluorescentes sont proposées
Three-dimensional imaging by localization of single molecules (SMLM) makes it possible to obtain resolutions of a few tens of nanometers, but still has certain limitations related in particular to non-uniform axial precision and a depth of observation often limited to the first micron of the sample. We propose here a new approach to single molecule localization, called ModLoc, which is based on the modulation and demodulation of the fluorescence signal of single molecules through the use of structured and time-modulated excitation. First, we present the fundamentals of SMLM imaging and the current limitations of this field. The subtleties of this new localization principle are then detailed and show a theoretical gain in precision by a factor of 3. Temporal emission studies of fluorescent probes in SMLM imaging reveal the need to integrate fast optical solutions (close to kHz). Experimental validation of the precision gain is demonstrated by the implementation of two optical devices. We choose to apply this principle in order to improve the accuracy of axial localization of fluorescent molecules. The results obtained show a uniform localization precision of 7.5 nm and up to 7 microns in depth on calibration samples and biological samples. The robustness of the method for in-depth MMS imaging is also demonstrated thanks in particular to acquisitions carried out at a depth of 30 µm in aberrant media. Various ways of improving the current device as well as the extension of this modulated localization approach to the observation of other quantities such as the life time and orientation of fluorescent molecules are proposed

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Thédié, Daniel. "Caractérisation de protéines fluorescentes photoconvertibles pour la microscopie super-résolution par localisation de molécules uniques." Thesis, Université Grenoble Alpes (ComUE), 2019. http://www.theses.fr/2019GREAV041.

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Abstract:

La microscopie de fluorescence est une puissante technique pour l'observation d'échantillons biologiques et la compréhension de processus moléculaires. Les deux dernières décennies ont été témoins de grandes avancées dans ce domaine, notamment avec le développement des techniques de "super-résolution", qui permettent l'observation de structures plus fines que la limite de diffraction de la lumière visible (~200 nm). Une de ces techniques les plus populaires est le PALM (Photoactivated Localisation Microscopy, microscopie par localisation photoactivée), qui utilise des protéines fluorescentes phototransformables (PTFPs) pour observer des molécules uniques, et les localiser avec une précision de 10-20 nm. Les PTFPs sont des protéines de la même famille que la GFP (Green Fluorescent Protein, protéine fluorescente verte), qui non-seulement produisent de la fluorescence, mais peuvent aussi subir des réactions photo-induites, comme l'activation de fluorescence ou le changement de couleur d'émission. Ces propriétés sont à la base du PALM, puisqu'elle permettent la séparation temporelle stochastique des émissions de fluorescence, et l'imagerie de molécules uniques. Le fait que le PALM détecte des molécules uniques a conduit au développement d'un grand nombre d'applications, dont le sptPALM (single-particle tracking PALM, suivi de molécules uniques en PALM) et le PALM quantitatif (qPALM). Ces applications avancées permettent déjà d'acquérir des informations précieuses sur le fonctionnement des systèmes biologiques, mais leur utilisation reste difficile. Une des raisons en est le comportement photophysique complexe des PTFPs, qui va au-delà des transformations utiles pour l'imagerie PALM.L'objet de cette thèse était donc de caractériser les réactions photo-induites subies par les protéines fluorescentes photoconvertibles (PCFPs, qui sont parmi les marqueurs les plus populaires en PALM), dans le but d'améliorer les approches de suivi de molécules uniques et quantitatives en PALM. En particulier, ce travail cherchait à comprendre les pertes transitoires de fluorescence, connues sous le terme de scintillement (blinking en anglais), qui sont détrimentales aux expériences PALM. Une caractérisation poussée des réactions photo-induites ayant lieu dans les formes verte et rouge de la PCFP étudiée nous a suggéré une stratégie pour réduire l'influence du scintillement, et des artéfacts qu'il produit. Enfin, cette stratégie a été appliquée à une expérience de qPALM.Ce travail constitue un pas en avant vers une meilleure compréhension de la photophysique des PCFPs, et une meilleure extraction d'informations quantitatives des données PALM
Fluorescence microscopy is a powerful tool for the observation of biological specimens and the understanding of molecular processes. The last two decades have seen tremendous advances in the field, notably with the development of “super-resolution” techniques, which allow the observation of structures smaller than the diffraction limit of visible light (~200 nm). One of the most popular of these techniques is Photoactivated Localisation Microscopy (PALM), which uses Phototransformable Fluorescent Proteins (PTFPs) to image single molecules and localise them with 10-20 nm precision. PTFPs are proteins from the Green Fluorescent Protein (GFP) family, which not only produce fluorescence, but can also undergo light-induced reactions such as fluorescence activation or change in emission color. These specific properties are at the base of PALM, since they allow stochastic temporal separation of the fluorescence events and imaging of sparse single-molecules. The fact that PALM deals with single molecules prompted the development of a variety of applications, among which single-particle tracking PALM (sptPALM) and quantitative PALM (qPALM). These advanced applications already provide amazing insights into biological phenomena, but their use remains challenging. One of the reasons for this is the complex photophysical behaviour of PTFPs, beyond the transormations that are useful for PALM imaging.Therefore, this thesis focused on characterising the light-induced reactions occurring in Photoconvertible Fluorescent Proteins (PCFPs, some of the most popular PALM markers) with the aim of improving single-particle tracking and quantitative approaches in PALM. In particular, the work was directed to the understanding of transient losses of fluorescence, known as blinking, that are detrimental to PALM experiments. After a thorough characterisation of light-induced reactions in both the green and the red form of the investigated PCFPs, a strategy was proposed to alleviate blinking and the artefacts it produces. Finally, insights were given into the application of this strategy to improve a qPALM experiment.This work constitutes an further step towards a better understanding of PCFPs photophysics, and improved extraction of quantitative information from PALM datasets

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Harlepp, Sébastien. "Etude des structures secondaires de molécules uniques d'ARN post et en cours de transcription." Université Louis Pasteur (Strasbourg) (1971-2008), 2003. http://www.theses.fr/2003STR13062.

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Abstract:

Dans les années 80, de nombreuses études sur certains ARN ont montré qu'ils possédaient des propriétés biologiques qui jusqu'alors n'étaient attribuées aux seules protéines. Dès lors de nombreux ARN de ce type ont été découvert et la corrélation entre la structure tertiaire et les propriétés biologiques est très forte. Dans ce travail nous avons développé de nouveaux outils permettant de définir les structures de ces ARN. La première technique est une dénaturation mécanique par les pinces optiques : la signature de cette dénaturation est directement lié aux structures en présence. La deuxième technique est de suivre le repliement et donc la structure des ARN en cours de transcription par microscopie en onde évanescente. Ces deux techniques ont été complétées par des simulations numériques
In the 80th, people working on RNA discovered that some of them had some biological properties. This properties were at that time only attributed to proteins. Since that many other RNA with properties has been discovered, and the correlation between function and structure has been shown. In that work we built some new techniques to define the structures. The first tool built was based on mechanical denaturation. This denaturation were obtained by optical tweezers, the signature of such denaturation is directly related to structure. The second setup build was to follow the folding during transcription by using evanescent wave microscopy. This two techniques were completed by some numerical simulations

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Cabillic, Marine. "Caractérisation de l'organisation et du trafic de paires récepteur/anticorps thérapeutiques par microscopie de localisation de molécules uniques couplée au criblage à haut débit." Thesis, Bordeaux, 2021. http://www.theses.fr/2021BORD0026.

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Abstract:

L'immuno-oncologie est un domaine en pleine expansion, à la frontière de la thérapie du cancer. Les immunothérapies du cancer visent à stimuler le système immunitaire de l'organisme pour qu'il cible et attaque la tumeur, grâce à des anticorps thérapeutiques. Ces anticorps se lient spécifiquement aux récepteurs membranaires des cellules T, lymphocytes jouant un rôle central dans la réponse immunitaire, modifiant leur signalisation intracellulaire. Comprendre comment l'organisation spatiale des récepteurs et des protéines de signalisation est régulée, et comment elle détermine l'activation des lymphocytes, est devenu le "Saint Graal" de l'immunologie cellulaire. Dans cette optique, une meilleure compréhension des fonctions des anticorps et du trafic intracellulaire associé, permettrait d’expliciter les différences d’efficacité des candidats thérapeutiques ciblant les récepteurs d'intérêt. La microscopie de super-résolution permet l’accès à l'organisation et la dynamique des récepteurs membranaires avec des résolutions nanométrique. Elle offre la capacité de révéler des informations sur les évènements précoces déclenchés par la liaison d’un anticorps à son récepteur, permettant à terme l’optimisation de leur efficacité fonctionnelle. Associée aux techniques de criblage à haut débit, elle a le potentiel de jouer un rôle prépondérant dans les phases précoces des projets où il est nécessaire de sélectionner les meilleurs anticorps issus de banques pouvant en compter plusieurs centaines.L'objectif de cette thèse CIFRE a été de caractériser fonctionnellement l'organisation et le trafic de paires récepteur/anticorps par l’association de méthodes de microscopie super-résolution par localisation de molécules individuelles (SMLM) et de criblage à haut débit (HCS). Dans ce contexte, nous avons mis au point et utilisé une plateforme permettant de caractériser différents anticorps thérapeutiques ciblant des récepteurs de cellules T, dans le but de recueillir des informations quantitatives sur les candidats thérapeutiques potentiels. Nous avons également optimisé la technique d'imagerie à feuille de lumière simple objectif (soSPIM) dans le but de pouvoir réaliser une cartographie 3D des récepteurs membranaires sur d'une cellule T entière avec une résolution nanométrique. Cette nouvelle approche permet l'imagerie de cellules T dans des conditions plus physiologiques, fournissant des informations complémentaires par rapport aux expériences de criblage à grande échelle. Ces deux techniques nous ont permis d’améliorer notre compréhension du mode d'action des anticorps sur les récepteurs au niveau de la cellule unique. Les expériences à grande échelle réalisées dans le cadre de ce travail ont nécessité plusieurs développements logiciels pour l'automatisation de l'acquisition et l'analyse statistique des Téraoctets de données de molécules individuelles générées. Ce projet de thèse s'est concentré sur la cible PD-1, un point de contrôle crucial du système immunitaire impliqué dans la modulation de l'activation des lymphocytes. La première partie de la thèse a été principalement consacrée à la mise en place de nouveaux protocoles pour l'imagerie de super-résolution des récepteurs PD-1 sur cellules Jurkat activées. La seconde partie concerne l’étude de l'impact d’anticorps thérapeutiques anti-PD-1 utilisés en routine en clinique, sur l'organisation spatiale et la dynamique des récepteurs PD-1 sur cellules vivantes, à l’échelle nanométrique. Ce travail est la preuve concept de l’utilité de ces outils d’imagerie de pointe pour la caractérisation quantitative d’anticorps monoclonaux thérapeutiques ciblant PD-1 à la membrane des cellules T
Immuno-oncology is a young and growing field at the frontier of cancer therapy. Immuno-oncology therapies aim to stimulate the body's immune system to target and attack the tumor through therapeutic antibodies, by binding and modifying the intracellular signaling of T-cells (lymphocytes playing a central role in the immune response) surface receptors. Understanding how the spatial organization of receptors and signaling proteins is regulated and how it determines lymphocyte activation and cell fate decisions has become a ‘holy grail’ for cellular immunology. To achieve this goal, a better comprehension of antibodies functions and subcellular trafficking is requested to explain the differential efficacies of therapeutic candidates targeting receptors of interest. Quantitative super-resolution microscopy provides access to the nanoscale organization of membrane receptors playing a physiological role. It offers a new investigation tool for antibody optimization as well as maximizing their functional efficacy. In combination with high throughput screening techniques, it has the potential to play a crucial role in the early phases of projects in which it is necessary to select the best antibodies from banks that may contain several hundred of them. The goal of this PhD thesis was to functionally characterize receptor/antibodies pairs organization and trafficking by quantitative single-molecule localization microscopy (SMLM) combined with high content screening (HCS). In this context, we have developed and used an HCS-SMLM platform to characterize multiple antibodies targeting T-cell membrane receptors, allowing gathering unprecedented quantitative insight of potential therapeutic candidates. We also optimized the single objective light-sheet microscope (soSPIM) to permit 3D mapping of membrane receptors across an entire T-cell, with single molecule resolution. It allows 3D nanoscale imaging of T-cells in more physiological conditions, and provide complementary information compared to large scale single molecule screening experiments. Altogether, these developments improved our comprehension of antibody mode of action on receptors at the single cell level. Large-scale experiments performed during this work required the development of several software for the automation of the acquisition and the statistical analysis of the Terabytes of single molecule data generated.This project is focused on targeting PD-1, a control point of the immune system involved in the modulation of immune cells activation. The first part of the thesis was mainly devoted to the implementation of new protocols for PD-1 receptors super-resolution imaging on activated Jurkat cells. In the second part, we further investigated the impact of known anti-PD-1 therapeutic antibodies used in clinics, on the nanoscale spatial organization and dynamics of PD-1 receptors in living cells using our HCS-SMLM platform. This work provides the proof of concept of the capacity of these cutting-edge imaging techniques to characterize quantitatively different therapeutic monoclonal antibodies targeting PD-1 on T-cell membrane

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Jaffiol, Rodolphe. "Spectroscopie optique de nano-objets individuels." Paris 11, 2003. http://www.theses.fr/2003PA112223.

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Abstract:

L'imagerie optique hyper-spectrale, qui combine la microscopie confocale et la spectroscopie optique, a été utilisée pour étudier des objets individuels de taille nanométrique (nano-objets). Les techniques spectroscopiques retenues ont été la spectroscopie Raman et la spectroscopie de fluorescence. Cette approche s'est montré bien adaptée pour l'étude à température ambiante de deux types de nano-objets, les molécules uniques et les nanotubes de carbone. Notre outil d'imagerie Raman s'est avéré efficace pour localiser les différentes espèces chimiques présentes sur nos échantillons. Entre autre, il a permis d'enregistrer les premiers spectres Raman de nouvelles espèces carbonées, comme des nanotubes remplis de molécules de pérylène ou de métallo-fullerènes (peapods). Les spectres Raman des peapods ainsi obtenus, ont révélé l'existence de processus de transfert de charge entre le tube et les métallo-fullerènes, ainsi que la polymérisation des métallofullerènes à l'intérieur des tubes. L'utilisation de surfaces nano-structurées métalliques est un point clé de ces études. D'une part, elles permettent d'exalter fortement le signal de diffusion Raman, rendant ainsi possible la détection de nano-objets en quelques secondes. D'autre part, elles accroissent la sélection spatiale du microscope, ce qui permet d'isoler le signal d'une entité unique. Ainsi, il a été possible d'étudier le signal Raman de molécules uniques ou de nanotubes uniques. J'ai alors mis en évidence certaines des caractéristiques du phénomène d'exaltation locale, son confinement au voisinage des nano-structures et le rôle joué par les irrégularités de surface, telles que les interstices et les protubérances
Single nanoobjects were studied by hyperspectral optical imaging, which associates a scanning confocal microscope with an optical spectroscopy unit. We choose to perform fluorescence spectroscopy and Raman spectroscopy. At room temperature, such spectroscopic approach has proven to be well adapted to study two different nanoobjects, as single molecules and carbon nanotubes. Our Raman imaging set-up is an efficient tool to localize different chemical species in a sample. Thus, we recorded the first Raman spectra of new carbon species, single wall carbon nanotubes which encapsulated several perylene molecules or dimetallofullernes (peapods). For peapods, we demonstrate from Raman spectre a charge transfer process between the nanotubes and the metallofullerenes, and in many cases their polymerization inside the tubes. Metallic nanostructured surfaces are usually required in this kind of experiments. In fact, we observed an enhancement of the Raman scattering with these surfaces, high enough to record the Raman scattering from a single nanoobject in few seconds. Also, they improve the spatial selection of the confocal microscope, that permit the selection of single nanoobjects. In this way, we studied single molecules and single carbone nanotubes. Then, I bring out some characteristics of the enhancement process. In particular, this enhancement is only efficient at the vicinity of the nanostructure. The surface morphology of the nanostructure must also exhibit some protrusions, or interstices

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Linarès-Loyez, Jeanne. "Développement de la microscopie par auto-interférences pour l'imagerie super-résolue tridimensionnelle au sein de tissus biologiques épais." Thesis, Bordeaux, 2019. http://www.theses.fr/2019BORD0167/document.

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Abstract:

Le travail de cette thèse a été consacré au développement d’un nouvelle technique SELFI (pour self-interferences, auto-interférences en anglais). Cette méthode permet d’obtenir une localisation tridimensionnelle d’émetteurs fluorescents individuels. Nous avons démontré que cela permet l'imagerie super-résolue en 3D et le suivie 3D de molécules uniques en profondeur dans des échantillons biologiques denses et complexes. La technique SELFI se base sur l'utilisation des interférences auto-référencées (également appelées « auto-interférences ») pour remonter à la localisation 3D d’un émetteur en une seule mesure. Ces interférences sont générées via l’utilisation d'un réseau de diffraction placé en sortie du microscope de fluorescence : le signal de fluorescence diffracte sur le réseau et les ordres interfèrent, après une courte propagation, sur le détecteur. Les interférences ainsi formées sont décodées numériquement pour remonter à la localisation 3D d'une molécule fluorescente au sein de l'échantillon. Une molécule unique peut ainsi être localisée avec une précision d'une dizaine de nanomètre, et cela jusqu'à une profondeur d'au moins 50µm au sein d'un échantillon biologique vivant épais (par exemple un tissu biologique).En combinant la méthode SELFI à différentes techniques de super-résolution (PALM, dSTORM et uPAINT), nous montrons que cette méthode de localisation tridimensionnelle permet de retrouver la hiérarchie et l'organisation de protéines dans des objets biologiques. En effectuant du SELFI-PALM, nous avons pu observer différentes protéines des points focaux d’adhésion (talin-C terminale et paxiline) et retrouver les différences de hauteur attendues, et ceux sur des échantillons de cellules vivantes. Ces résultats confirment la résolution accessible avec la technique SELFI (environ 25nm) même pour un faible nombre de photons collectés (environ 500 photons par molécule).Nous mettons en évidence la robustesse de la technique SELFI en reconstruisant des images de super-résolution 3D de structures denses en profondeur dans des échantillons tissulaires complexes. En effectuant du SELFI-dSTORM, nous avons observé le réseau d’actine sur des cellules cultivées en surface de la lamelle dans un premier temps, et à différentes profondeurs (25 et 50 microns) au sein de tissus artificiels dans un second temps.Du suivi 3D de particule unique a aussi été effectué sein de tissus biologiques vivants. Nous avons observé la diffusion libre de quantum dots à différentes profondeurs (jusqu’à 50 microns, limité par l’objectif utilisé) dans des tranches vivantes de cerveau.Nous avons appliqué la technique SELFI à la détection de récepteurs postsynaptiques NMDA. Cela nous a permis d'observer, sur des échantillons de neurones en culture primaire mais aussi au sein de tranches de cerveaux de rats, une différence d'organisation entre les deux sous-unités GluN2A et GluN2B de ce récepteur au glutamate.Enfin, nous avons démontré l'importance de suivre l'évolution de l'environnement des échantillons biologiques vivants lors des acquisitions permettant la détection de molécules individuelles. Grâce à l'utilisation additionnelle et simultanée de l'imagerie de phase quantitative, nous avons pu étudier la dynamique de la membrane cellulaire durant l’activation par un facteur de croissance. L'analyse corrélative entre les images de phase quantitative en lumière blanche et les détections de molécules fluorescentes uniques permet d'obtenir de nouvelles informations pertinentes sur l'échantillon étudié
The work of this thesis was devoted to the development of a new technique SELFI (for self-interferences). This method unlocks the three-dimensional localization of individual fluorescent emitters. We have demonstrated that this allows 3D super-resolved imaging and 3D tracking of single molecules deep into dense and complex biological samples. The SELFI technique is based on the use of self-referenced interference to go back to the 3D location of a emitter in a single measurement. These interferences are generated using a diffraction grating placed at the exit of the fluorescence microscope: the fluorescence signal diffracts on the grating and, after a short propagation, the orders interfere on the detector. The formed interferences are digitally decoded to extract the 3D location of a fluorescent molecule within the sample. A single molecule can thus be localized with a precision of approximatively ten nanometers up to a depth of at least 50 µm in a thick living biological sample (for example a biological tissue).By combining the SELFI method with different super-resolution techniques (PALM, dSTORM and uPAINT), we show that this three-dimensional localization method grants the access to the hierarchy and organization of proteins in biological objects. By performing SELFI-PALM, we observed different proteins of the adhesion focal points (talin C-terminal and paxilin) and found the expected elevation differences, and those within living cell samples. These results confirm the resolution capability of the SELFI technique (about 25 nm) even for a small number of photons collected (about 500photons per molecule).We highlight the robustness of the SELFI technique by reconstructing 3D super-resolution images of dense structures at depth in complex tissue samples. By performing SELFI-dSTORM, we observed the actin network in cells grown on the surface of the coverslip at first, and at different depths (25 and 50 microns) within artificial tissues in a second time.3D single particle tracking has also been performed in living biological tissues. We observed the free diffusion of quantum dots at different depths (up to 50 microns) in living brain slices.We applied the SELFI technique to the detection of NMDA postsynaptic receptors. We observed, in primary culture of neurons but also within slices of rat brains, a difference in organization between the two subunits GluN2A and GluN2B of this glutamate receptor.Finally, we show the importance of following the evolution of the living biological sample environment during the acquisition of images leading to detections of single molecules. Thanks to the additional and simultaneous use of quantitative phase imaging, we were able to study cell membrane dynamics during the activation by a growth factor. The correlative analysis between white light quantitative phase images and single fluorescent molecule detections provides new relevant information on the sample under study

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Milhiet, Elodie. "Nanospectroscopie de molécules d’intérêt biologique." Paris 11, 2007. http://www.theses.fr/2007PA112150.

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Abstract:

La spectroscopie de molécule unique joue aujourd’hui un rôle majeur dans de nombreux domaines allant de la physique fondamentale à la biologie. Dans ce contexte, mes travaux ont conduit au développement théorique et instrumental de deux méthodes d’investigation orientées vers la biologie. La première visait à caractériser la dynamique de complexation du calcium par la sonde calcique fluorescente Oregon Green Bapta5N communément employée pour l’analyse des signaux intracellulaires. Pour y parvenir, nous avons développé un dispositif expérimental de spectroscopie de corrélation de fluorescence à un et deux photons présentant une sensibilité proche de la molécule unique. Grace à ce dernier, nous avons pu étudier plusieurs aspects de la photophysique de la sonde et avons évalué ses limites ainsi que l’intérêt de l’appliquer in vivo. La seconde a consisté à développer une technique d’Hybridation In-Situ de Fluorescence (FISH) semi-quantitative afin de cartographier l’expression de gènes dans le cerveau de drosophiles adultes. Nous avons surmonté deux difficultés majeures, en obtenant, pour la première fois, des résultats reproductibles et semi-quantitatifs chez la drosophile adulte. Je présente ici une nouvelle approche où l’amplification enzymatique a été remplacée par une détection optimisée et un protocole réduisant l’impact de l’autofluorescence. Des résultats sur divers gènes exprimés dans le cerveau des drosophiles adultes y sont exposés au même titre qu’une étude visant à mieux comprendre une pathologie de retard mental. Pour conclure, j’ai mis en évidence la capacité de notre technique à résoudre des sondes uniques ce qui ouvre la voie vers de nouvelles applications
Single-molecule-like spectroscopy plays a major role in many domains, from fundamental physics to biology. In this framework, my dissertation focuses on instrumental and theoretical developments of two biological-related applications. The first experiment aims at characterizing the dynamics of calcium binding by the fluorescent calcium probe Oregon-green Bapta5N commonly employed in cell signaling analysis. To achieve it, I have developed an experimental set-up of fluorescence correlation spectroscopy that exhibits sensitivity close to that of single-molecule detection. Either monophotonic or biphotonic excitations can be used. I have investigated the several aspects of the photophysics of the probe and evaluated the interest and limitations of such an approach for future in-vivo measurements. The second one is devoted to the development of a semi-quantitative Fluorescent In-Situ Hybridization (FISH) technique for mapping gene expression in the adult drosophila brain. Two difficulties have to be solved. First, we succeeded in obtaining reproducible results with drosophila adult brain. Secondly, while most of the FISH protocols are not quantitative since they need a strong enzymatic, we achieved semi-quantitative detection of RNA probes. I will present results on a new approach for which enzymatic detection is replaced by a sensitive detection and a protocol which reduces autofluorescence contribution. Results will be presented for several genes in adult drosophila brain to validate the methods as well as an interesting application on a mental retardation disease. To conclude, I show that the method exhibits a single RNA sensitivity which opens the way to new applications

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El, Beheiry Mohamed Hossam. "Towards whole-cell mapping of single-molecule dynamics." Thesis, Paris 6, 2015. http://www.theses.fr/2015PA066618/document.

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Abstract:

La compréhension fondamentale de fonctions biologiques est accordée par l’imagerie de molécules uniques dans les cellules vivantes. Cet environnement nanoscopique est compliqué et largement mal compris. La microscopie de localisation permet cet environnement d’être sondé avec le suivi de molécules uniques. Depuis longtemps, l’obstacle principal qui empêcher la compréhension de processus physiques à cette échelle était la pénurie d’information accessible; de fortes hypothèses ne peuvent pas être établies à partir de quelques dizaines de trajectoires de molécules uniques. L’introduction des techniques de suivi de molécules à haute densité a recadré les possibilités. Dans cette thèse, les outils d’inférence Bayesienne ont été développé pour élucider le comportement de molécules uniques à partir la cartographie de leurs paramètres physiques de mouvement. Ces cartes décrivent, entre autre, les hétérogénéités aux échelles locales mais aussi à l’échelle de la cellule entière. Notamment elles dévoilent les détails quantitatifs sur les processus cellulaires de base. En utilisant cette approche cartographique, les interactions entre récepteurs et protéines d’échafaudage chez les neurones et les cellules non-neuronales sont étudiés. Une étude sur les interactions imprimées dans la cellule est également effectuée grace à un système prometteur d’impression de protéine. Les différents types d’interactions entre constructions chimériques du récepteur de glycine et de protéines d’échafaudage de géphyrine sont décrits et distingué in situ. Enfin, les perspectives vis-à-vis l’obtention de cartes tridimensionnelles de dynamiques de molécules uniques sont également commentées
Imaging of single molecules inside living cells confers insight to biological function at its most granular level. Single molecules experience a nanoscopic environment that is complicated, and in general, poorly understood. The modality of choice for probing this environment is live-cell localisation microscopy, where trajectories of single molecules can be captured. For many years, the great stumbling block in comprehension of physical processes at this scale was the lack of information accessible; statistical significance and robust assertions are hardly possible from a few dozen trajectories. It is the onset of high-density single-particle tracking that has dramatically reframed the possibilities of such studies. Importantly, the consequential amounts of data it provides invites the use of powerful statistical tools that assign probabilistic descriptions to experimental observations. In this thesis, Bayesian inference tools have been developed to elucidate the behaviour of single molecules via the mapping of motion parameters. As a readout, maps describe heterogeneities at local and whole-cell scales. Importantly, they grant quantitative details into basic cellular processes. This thesis uses the mapping approach to study receptor-scaffold interactions inside neurons and non-neuronal cells. A promising system in which interactions are patterned is also examined. It is shown that interactions of different types of chimeric glycine receptors to the gephyrin scaffold protein may be described and distinguished in situ. Finally, the prospects of whole-cell mapping in three-dimensions are evaluated based on a discussion of state-of-the-art volumetric microscopy techniques

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Soule, Pierre. "Etude des mécanismes de translocation des peptides pénétrateurs de cellules (cpp) à l'aide de techniques biophysiques." Thesis, Paris 6, 2015. http://www.theses.fr/2015PA066563/document.

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Abstract:

La nécessité de délivrer des médicaments directement dans les cellules est grandissante avec le développement des thérapies géniques. Les peptides pénétrants (Cell Penetrating Peptides : CPP) représentent une possibilité pour administrer ces médicaments dans les cellules sans effet délétère sur la membrane. Ce sont des peptides d’une dizaine d’acides aminés, généralement cationiques. Ils sont capables de traverser la membrane cellulaire, et conservent cette propriété lorsqu’une cargaison leur est attachée. Cependant, leurs mécanismes d’entrée ne sont toujours pas tous connus. Nous avons caractérisé quelques aspects des mécanismes permettant aux CPP de traverser directement la membrane plasmique à l’aide de trois techniques biophysiques. i) Nous avons ainsi pu mettre en évidence le rôle des sulfates d’héparane comme partenaire d’adhésion forte du CPP pénétratine, à l’aide d’un outil de mesure de force : le Biomembrane Force Probe. ii) Nous avons montré la possibilité pour la pénétratine de franchir la bicouche lipidique (sans mécanisme cellulaire actif) si celle-ci est suffisamment riche en lipides chargés négativement. Ce passage a été étudié sur bicouches modèles, formées à l’interface entre gouttelettes obtenues par émulsion inverse dans de l’huile en présence de lipides. iii) Pour visualiser la translocation de CPP à l’échelle de la molécule unique nous avons développé un montage original de microscopie à onde évanescente sur bicouche suspendue
Gene therapy relies on an efficient and specific delivery of drugs into targeted cells. For this purpose, the use of carriers that will help the drugs to cross the membrane, without introducing deleterious effect due to the membrane disruption, are promising. A family of such carriers is known as Cell Penetrating Peptides (CPPs). These peptides are short, about ten amino acids, and often cationic. They are able to translocate through the membrane with different cargos and deliver them into the cytosol. However the mechanisms are still, to a great extent, unknown. We used three biophysical techniques to gain insights into the mechanisms leading to the translocation of a CPP. i) We found the heparan sulfates to be the strongest partner of the CPP penetratin at the cell surface. This adhesion has been pointed out using the Biomembrane Force Probe, a force measuring tool. ii) We evidenced the translocation of penetratin through the lipid bilayer (without any cell mechanism) as long as it contains enough negatively charged lipids. This has been carried out using model bilayers formed at the interface between droplets generated by an inverted emulsion: water in an oil and lipid mixture. iii) To view the translocation of CPPs at the single molecule level we developed a total internal reflection fluorescence microscope (TIRFM) on a suspended bilayer

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Julien, Carine. "Fluorescence et Diffusion Raman exaltée de surface (SERS) de molécules individuelles." Phd thesis, Université Paris Sud - Paris XI, 2004. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00011564.

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Abstract:

Deux études distinctes mettant en oeuvre la détection et l'analyse de signaux spectroscopiques optiques de molécules individuelles- colorants ou molécules organiques- ont été menées.
Par microscopie grand champ de fluorescence, l'émission de molécules uniques de pérylène orange insérées dans un film solgel mince, par enregistrement de films d'une large zone de l'échantillon sur laquelle plus d'une centaine d'émetteurs individuels sont détectés, fournit des informations sur cette espèce et la matrice sondée. Pour exploiter les films, un outil logiciel a été développé. Les processus de photoblanchiment, la mobilité moléculaire, la nucléation des molécules excitées sont mis en évidence et discutés. On note une grande richesse des dynamiques temporelles d'émission, mais aussi des spectres qui reflètent notamment la reconformation proposée du pérylène orange excité. Il s'ensuit l'existence de nombreux nanoenvironnements différents dans la matrice poreuse.
Par microscopie confocale à balayage, le signal de diffusion Raman exaltée de surface de molécules uniques organique adsorbées sur des agrégats d'argent de morphologie complexe est exploité. Certains objets présentent une exaltation géante, estimée être de plus de 14 ordres de grandeur, ce qui permet l'enregistrement de spectres résolus en seulement une seconde. L'analyse chimique offerte permet de distinguer différentes espèces, et la présence nécessaire sur ces points chauds d'Ag+ est démontrée. Une caractérisation corrélée par microscopie électronique des agrégats actifs repérés met aussi en avant l'existence d'une morphologie privilégiée, avec de nombreuses protubérances de dimension nanométrique et interstices.

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Chahid, Makhlad. "Echantillonnage compressif appliqué à la microscopie de fluorescence et à la microscopie de super résolution." Thesis, Bordeaux, 2014. http://www.theses.fr/2014BORD0426/document.

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Abstract:

Mes travaux de thèse portent sur l’application de la théorie de l’échantillonnagecompressif (Compressed Sensing ou Compressive Sampling, CS) à la microscopie defluorescence, domaine en constante évolution et outil privilégié de la recherche fondamentaleen biologie. La récente théorie du CS a démontré que pour des signauxparticuliers, dits parcimonieux, il est possible de réduire la fréquence d’échantillonnagede l’information à une valeur bien plus faible que ne le prédit la théorie classiquede l’échantillonnage. La théorie du CS stipule qu’il est possible de reconstruireun signal, sans perte d’information, à partir de mesures aléatoires fortement incomplèteset/ou corrompues de ce signal à la seule condition que celui-ci présente unestructure parcimonieuse.Nous avons développé une approche expérimentale inédite de la théorie du CSà la microscopie de fluorescence, domaine où les signaux sont naturellement parcimonieux.La méthode est basée sur l’association d’une illumination dynamiquestructurée à champs large et d’une détection rapide à point unique. Cette modalitépermet d’inclure l’étape de compression pendant l’acquisition. En outre, nous avonsmontré que l’introduction de dimensions supplémentaires (2D+couleur) augmentela redondance du signal, qui peut être pleinement exploitée par le CS afin d’atteindredes taux de compression très importants.Dans la continuité de ces travaux, nous nous sommes intéressés à une autre applicationdu CS à la microscopie de super résolution, par localisation de moléculesindividuelles (PALM/STORM). Ces nouvelles techniques de microscopie de fluorescenceont permis de s’affranchir de la limite de diffraction pour atteindre des résolutionsnanométriques. Nous avons exploré la possibilité d’exploiter le CS pour réduiredrastiquement les temps d’acquisition et de traitement.Mots clefs : échantillonnage compressif, microscopie de fluorescence, parcimonie,microscopie de super résolution, redondance, traitement du signal, localisation demolécules uniques, bio-imagerie
My PhD work deals with the application of Compressed Sensing (or CompressiveSampling, CS) in fluorescence microscopy as a powerful toolkit for fundamental biologicalresearch. The recent mathematical theory of CS has demonstrated that, for aparticular type of signal, called sparse, it is possible to reduce the sampling frequencyto rates well below that which the sampling theorem classically requires. Its centralresult states it is possible to losslessly reconstruct a signal from highly incompleteand/or inaccurate measurements if the original signal possesses a sparse representation.We developed a unique experimental approach of a CS implementation in fluorescencemicroscopy, where most signals are naturally sparse. Our CS microscopecombines dynamic structured wide-field illumination with fast and sensitive singlepointfluorescence detection. In this scheme, the compression is directly integratedin the measurement process. Additionally, we showed that introducing extra dimensions(2D+color) results in extreme redundancy that is fully exploited by CS to greatlyincrease compression ratios.The second purpose of this thesis is another appealing application of CS forsuper-resolution microscopy using single molecule localization techniques (e.g.PALM/STORM). This new powerful tool has allowed to break the diffraction barrierdown to nanometric resolutions. We explored the possibility of using CS to drasticallyreduce acquisition and processing times

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Turkcan, Silvan. "Interaction toxine-cellule étudiée par imagerie de nanoémetteurs individuels." Phd thesis, Ecole Polytechnique X, 2010. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00608124.

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Abstract:

La membrane cellulaire est une partie vitale de la cellule dont l'architecture joue un rˆole crucial dans de nombreux processus cellulaires, comme la signalisation et le trafic, et dans diverses pathologies. Cette th'ese vise 'a sonder l'architecture membranaire via le mouvement de deux r'ecepteurs membranaires qui sont exploit'es par des toxines bact'eriennes. Les progr'es r'ecents des techniques de microscopie optique ont montr'e que certains r'ecepteurs membranaires ne diffusent pas librement dans la membrane, mais sont confin'es ou diffusent de fa¸con anomale. Actuellement, plusieurs mod'eles con- courent pour expliquer le confinement des r'ecepteurs, tel que le mod'e le Picket-Fence, les radeaux lipidiques et les agr'egats de prot'eines. Pour sonder la membrane, des nanoparticules (Y0.6Eu0.4VO4) dop'ees avec des lan- thanides sont coupl'ees 'a deux toxines peptidiques diff'erentes formant des pores dans la membrane, la toxine α de C. septicum et la toxine ǫ de C. perfingens. Le suivi de r'ecepteurs individuels sur lesquels sont fix'ees des toxines marqu'ees dans la mem- brane apicale de cellules MDCK avec un microscope 'a champ large permet de d'etecter le mouvement du r'ecepteur avec une r'esolution meilleure que la limite de diffrac- tion. Les r'ecepteurs de la toxine α et ǫ montrent une diffusion confin'ee avec des coefficients de diffusion similaires de 0.16 ± 0.14 µm2/s dans des domaines stables de 0.5 µm2. Pour analyser les trajectoires des r'ecepteurs, nous avons mis en oeuvre une nouvelle technique bas'ee sur une m'ethode d'inf'erence. Notre seule hypoth'ese est que le r'ecepteur se d'eplace selon l''equation de Langevin. Cette m'ethode exploite l'ensemble de l'information stock'ee dans la trajectoire et la qualit'e des valeurs extraites est v'erifi'ee par des simulations. Les deux r'ecepteurs sont confin'es dans un potentiel de type ressort avec une raideur de 0.45 pN/µm. Des exp'eriences apr'es d'epl'etion du cholest'erol par la cholest'erol oxydase et apr'es la d'epolym'erisation du cytosquelette par latrunculin B montrent que le confinement des r'ecepteurs individuels d'epend du taux de cholest'erol et que la d'epolym'erisation de l'actine n'influence pas le confinement. En utilisant la nanoparticule coupl'ee aux toxines comme un amplificateur de la force hydrodynamique applique'e par un flux liquide, nous avons mesur'e la r'eponse du r'ecepteur 'a une force ext'erieure. Les r'esultats indiquent une fixation des domaines de confinement sur le cy- tosquelette. Enfin, un mod'ele pour le confinement du r'ecepteur est propos'e, bas'e sur le couplage hydrophobe entre le r'ecepteur et la bicouche lipidique qui l'entoure. Ce mod'ele permet d'expliquer le potentiel de type ressort 'a l'int'erieur du domaine de confinement.

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Butler, Corey. "Quantitative single molecule imaging deep in biological samples using adaptive optics." Thesis, Bordeaux, 2017. http://www.theses.fr/2017BORD0632/document.

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Abstract:

La microscopie optique est un outil indispensable pour la recherche de la neurobiologie et médecine qui permet l’étude des cellules dans leur environnement natif. Les processus sous-cellulaires restent néanmoins cachés derrière les limites de la résolution optique, ce qui rend la résolution des structures plus petites que ~300nm impossible. Récemment, les techniques de la localisation des molécules individuelles (SML) ont permis le suivi des protéines de l’échelle nanométrique grâce à l’ajustement des molécules uniques à la réponse impulsionnelle du système optique. Ce processus dépend de la quantité de lumière recueilli et rend ces techniques très sensibles aux imperfections de la voie d’imagerie, nommé des aberrations, qui limitent l’application de SML aux cultures cellulaires sur les lamelles de verre. Un système commercial d’optiques adaptatives est implémenté pour compenser les aberrations du microscope, et un flux de travail est défini pour corriger les aberrations dépendant de la profondeur qui rend la 3D SML possible dans les milieux biologiques complexes. Une nouvelle méthode de SML est présentée qui utilise deux objectifs pour détecter le spectre d’émission des molécules individuelles pour des applications du suivi des particules uniques dans 5 dimensions (x,y,z,t,λ) sans compromis ni de la résolution spatiotemporelle ni du champ de vue. Pour faciliter les analyses de manière quantitative des Go de données générés, le développement des outils biochimiques, numériques et optiques est présenté. Ensemble, ces approches ont le but d’amener l’imagerie quantitative des molécules uniques dans les échantillons biologiques complexes
Optical microscopy is an indispensable tool for research in neurobiology and medicine, enabling studies of cells in their native environment. However, subcellular processes remain hidden behind the resolution limits of diffraction-limited optics which makes structures smaller than ~300nm impossible to resolve. Recently, single molecule localization (SML) and tracking has revolutionized the field, giving nanometer-scale insight into protein organization and dynamics by fitting individual fluorescent molecules to the known point spread function of the optical imaging system. This fitting process depends critically on the amount of collected light and renders SML techniques extremely sensitive to imperfections in the imaging path, called aberrations, that have limited SML to cell cultures on glass coverslips. A commercially available adaptive optics system is implemented to compensate for aberrations inherent to the microscope, and a workflow is defined for depth-dependent aberration correction that enables 3D SML in complex biological environments. A new SML technique is presented that employs a dual-objective approach to detect the emission spectrum of single molecules, enabling 5-dimensional single particle imaging and tracking (x,y,z,t,λ) without compromising spatiotemporal resolution or field of view. These acquisitions generate ~GBs of data, containing a wealth of information about the localization and environment of individual proteins. To facilitate quantitative acquisition and data analysis, the development of biochemical, software and hardware tools are presented. Together, these approaches aim to enable quantitative SML in complex biological samples

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Parutto, Pierre. "Statistical analysis of single particle trajectories reveals sub-cellular nanodomain organisation and function." Thesis, Paris Sciences et Lettres (ComUE), 2019. http://www.theses.fr/2019PSLEE055.

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Abstract:

Les trajectoires de molécules individuelles obtenues par microscopie super-résolution permettent de suivre des protéines avec une précision nanométrique dans des cellules vivantes. Dans cette thèse, j’ai étudié les régions de hautes densités présentes dans ces trajectoires, dont un modèle possible est celui des puits de potentiel. Pour les caractériser à partir de trajectoires, j’ai développé une nouvelle méthode hybride basée sur la densité de points et le champ de force local puis je l’ai comparé aux méthodes d’état de l’art. Ensuite, j’ai utilisé celle-ci pour caractériser les puits maintenant les canaux calciques Cav au niveau des zones actives des terminaux présynaptiques ce qui a permis de mieux comprendre le rôle des variantes d’épissage de ces canaux dans la transmission synaptique. Dans une autre étude, j’ai analysé des trajectoires de protéines résidant dans le lumen du Réticulum Endoplasmique (RE). J’ai créé une méthode pour reconstruire le réseau du RE à partir des trajectoires que j’ai utilisé pour caractériser le mouvement de ces molécules par un modèle de saut-diffusion qui a pour conséquence une meilleure redistribution du contenu luminal par rapport à un mouvement diffusif. Enfin, je discute d’autres analyses de trajectoires pour les intéractions lysosome-ER, les canaux Cav à la jonction neuro-musculaire de la drosophile et les protéines composant le complexe NuRD
Single-Particle Trajectories (SPTs) obtained from super-resolution microscopy allow to track proteins with nanometer precision in living cells and are used in neuroscience and cellular biology. In this thesis, I was interested in the high-density nanodomains found in these trajectories that can be modeled as potential wells. To characterize them, I developed a new hybrid method based on the point density and local drift field and compared it to the other state-of-the-art methods. Then, I used it to identify transient potential wells in SPTs of voltage-gated calcium channels (CaV) contributing to a better understanding of the role of the different CaV splice variants in synaptic transmission. In another study, I looked at SPTs from Endoplasmic Reticulum (ER) luminal resident proteins where I developed a method to reconstruct the network from trajectories and used it to characterize the luminal motion as a jump-diffusion process, which allows for a better redistribution of the luminal content than the previously assumed diffusive model. Finally, I discuss other analyses of motions for lysosome-ER interactions, CaV2.1 channels at drosophila’s neuromuscular junctions and the description of the motion of the constituent proteins of the NuRD chromatin remodeling complex

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Jacq, Maxime. "Etude de la morphogénèse et de la division chez Streptococcus pneumoniae." Thesis, Université Grenoble Alpes (ComUE), 2016. http://www.theses.fr/2016GREAV008/document.

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Abstract:

La division bactérienne résulte de la constriction de la membrane, menée par la protéine du cytosquelette FtsZ, et de l’expansion et du remodelage de la paroi, réalisés par des synthétases et des hydrolases de la paroi. La coordination de ces processus au sein d’un macrocomplexe protéique, le divisome, est nécessaire au maintien de la forme et de l’intégrité bactérienne. J’ai étudié deux aspects importants de ce mécanisme de coordination chez le pathogène humain Streptococcus pneumoniae. J’ai déterminé in vivo la nanostructure de la protéine FtsZ en développant l’utilisation du PALM (PhotoActivated Localization Microscopy)chez le pneumocoque. Cette technique, basée sur la détection de molécules uniques et permettant une résolution de 20-40 nm, a révélé des aspects inattendus (dimensions, amas, sous-structures) de l’architecture de l’anneau de FtsZ au cours du cycle cellulaire. En parallèle, j’ai étudié le rôle de l’hydrolase Pmp23 par génétique, biochimie et microscopie à fluorescence. Mon travail a montré que Pmp23 est requise pour la stabilité des macrostructures du divisome du pneumocoque, révélant une nouvelle connexion entre le métabolisme de la paroi et la division cellulaire
Bacterial division results from the combination of membrane constriction, driven by the cytoskeletal protein FtsZ, with cell wall expansion and remodeling, performed by cell wall synthases and hydrolases. Coordination of these processes within a large protein complex known as the divisome ensures cell integrity and maintenance of cell shape. I have investigated two important aspects of this coordination mechanism in the human pathogen Streptococcus pneumoniae. I determined the in vivo nanostructure of the divisome scaffolding protein FtsZ by developing the use of PhotoActivated Localization Microscopy (PALM) in the pneumococcus. PALM, which is based on the detection of single fluorescent labels and allows 20-40 nm resolution, has revealed unexpected features (dimensions, clusters, new substructures) of the FtsZ-ring architecture along the cell cycle. In parallel, I studied the role of the cell wall hydrolase Pmp23 using genetics, biochemistry and fluorescence microscopy. My work has shown that Pmp23 is required for the stability of divisome macrostructures in the pneumococcal cell, revealing a new connection between cell wall metabolism and cell division

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Chong, Michael. "Electrically driven fluorescence of single molecule junctions." Thesis, Strasbourg, 2016. http://www.theses.fr/2016STRAE022/document.

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Abstract:

Les propriétés optoélectroniques de jonctions moléculaires sont étudiées par microscopie à effet tunnel (STM). Premièrement, les structures moléculaires sont synthétisées sur une surface Au(111). Puis, par manipulation, nous soulevons et suspendons une molécule entre la pointe du STM et la surface d’or pour obtenir une jonction moléculaire. En appliquant une tension entre la pointe et l'échantillon, un courant est généré, ce qui conduit à l'excitation de la molécule. Ce processus est médié par des modes de plasmons de surface localisé de la pointe. Finalement, la molécule se désexcite de manière radiative et génère un signal de fluorescence. On utilise cette technique pour étudier deux systèmes moléculaires. Dans le premier, un émetteur (porphyrin) est suspendu dans la jonction grâce à des fils organiques (oligothiophène). Ce type de jonction génère une émission de lumière étroite dont la couleur est contrôlée en sélectionnant la structure chimique de l'émetteur. Le contrôle de la largeur du pic d’émission est obtenu en détachant progressivement l'unité émettrice de la surface. On observe aussi des pics vibroniques décalés vers le rouge qui fournissent une empreinte chimique de l’émetteur, et des pics décalés vers le bleu, signe d’une deséxcitation d’un exciton non-thermalisé. Le deuxième type de jonction est composé de nano-rubans de graphène (GNRs) dont la largeur et la structure de l’arrête sont définis avec une précision atomique. Une fois suspendu dans la jonction, les GNRs qui présentent une terminaison spécifique (terminaison C) montrent un spectre d’émission de lumière avec un pic principal et deux pics vibroniques décalés vers le rouge. Le pic principale est associé à une transition intra-ruban entre un état Tamm localisé et un état delocalisé
This thesis presents a study of the optoelectronic properties of molecular junctions performed by scanning tunneling microscopy (STM). First, the molecular structures are synthesized on a Au(111) surface. Then, by manipulation we lift and suspend a molecule between the tip of the STM and the gold surface, creating a single molecule junction. By applying a voltage bias between the tip and the sample, a current is generated, which leads to the excitation of the molecule. This process is mediated by the localized surface plasmon modes of the tip. Eventually, the molecule de-excites in a radiative way, generating a fluorescence signal. We use this technique to study two different molecular junctions. First, an emitting unit (fused-porphyrin) is suspended in the junction by means of organic linkers (oligothiophene). This type of junction generates a narrow-line emission of light whose color is controlled by selecting the chemical structure of the emitting unit. Moreover, control over the linewidth is obtained by progressively detaching the emitting unit from the surface. Also, we observe red-shifted vibronic features that provide a chemical fingerprint of the emitter, and blue- shifted vibronic features that are a sign of hot-luminescence. For the second type of junctions we use graphene nanoribbons (GNRs) of atomically precise width and edge structure. When lifted in the junction, GNRs with a specific type of termination (C-terminated) exhibit a light emission spectrum with a main peak and two red-shifted vibrational features. The main peak is associated to an intra-ribbon transition between a localized state (Tamm) and a delocalized state

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Ardhuin, Thibault. "Étude par STM et NC-AFM des mécanismes de charge de molécules individuelles sur substrats isolants." Thesis, Toulouse 3, 2018. http://www.theses.fr/2018TOU30315.

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Abstract:

Ces dernières années sont apparues de nouvelles techniques permettant le contrôle de la charge de nano-objets individuels (atome, molécule, agrégat métallique ou semi-conducteur, ...) déposés sur substrats isolants. Cet aboutissement a été rendu possible par le perfectionnement des méthodes de microscopie à effet tunnel (STM) et à force atomique (AFM). En combinant ces outils, les précurseurs ont réussi à maîtriser l'état de charge d'un atome d'or déposé sur une bicouche de NaCl(001) sur substrat Cu(111). Par la suite, ce type de manipulation a été étendu à des systèmes moléculaires notamment au CEMES avec Cu(dbm)2. Ce sujet s'inscrit dans la continuité de ces études. L'objectif était d'analyser l'impact de l'augmentation de l'épaisseur du film isolant sur les mécanismes de charge. Cette problématique requière une quantification de l'état de charge du système ainsi qu'une mesure de l'épaisseur d'isolant. Dans ce travail, nous avons pu étudier des films de KBr et NaCl déposés sur des surfaces de Cu(111) et Ag(111). Pour ces études, que ce soit en courant tunnel (STM) ou en gradient de force (NC-AFM), le contrôle de l'état de pointe est essentiel. Lorsque l'on travaille sur substrat isolant, la pointe a tendance à collecter des contaminants qui en changent les propriétés électroniques. Or, pour charger un système de manière reproductible, il nous faut impérativement contrôler la métallicité de l'apex. Cette maîtrise passe par une re-préparation fréquente de la pointe sur une surface métallique, difficile à trouver dans le cas d'un film épais. Pour pallier à cette rareté, nous avons mis en place un masque de dépôt permettant un contrôle du gradient de l'épaisseur du film isolant tout en préservant des zones de métal libre. Cela nous a permis de réaliser nos mesures avec un état de pointe mieux contrôlé. L'instabilité de l'état de pointe nous a également conduit à effectuer des spectroscopies à courant régulé de type Z(V). En contrôlant ce courant, il est alors possible de minimiser l'interaction entre la pointe et le film isolant, préservant ainsi plus longtemps la pointe. Ces spectroscopies Z(V) permettent également d'augmenter la tension de mesure jusqu'à atteindre le régime d'émission de champ. Nous avons observé par cette méthode une variation de la modulation de l'amplitude des résonances d'émission de champ (FER) en fonction de l'épaisseur du film isolant. Une modélisation numérique par différences finies a été développée afin de comprendre ce phénomène. [..]
In recent years, new techniques have emerged to control the charge of individual nano-objects (atom, molecule, metal aggregate or semiconductor, etc.) deposited on insulating substrates. This achievement has been made possible by the refinement of Tunneling Microscopy (STM) and Atomic Force (AFM) methods. By combining these tools, the precursors succeeded in controlling the state of charge of a gold atom deposited on a NaCl (001) bilayer on a Cu (111) substrate. Subsequently, this type of manipulation has been extended to molecular systems, in particular at the CEMES with Cu(dbm)2. This subject is part of the continuity of these studies. The objective was to analyze the impact of the increase of the thickness of the insulating film on the charge mechanisms. This problem requires a quantification of the state of the system charge as well as a measurement of the insulation thickness. In this work, we have been able to study KBr and NaCl films deposited on Cu(111) and Ag(111) surfaces. For these studies, whether in tunnel current (STM) or force gradient (NC-AFM), the control of the tip state is essential. When working on an insulating substrate, the tip tends to collect contaminants that change their electronic properties. However, to charge a system in a reproducible way, we must imperatively control the metallicity of the apex. This control requires a frequent re-preparation of the tip on a metal surface, difficult to find in the case of a thick film. To overcome this scarcity, we have implemented a deposition mask allowing a control of the gradient of the thickness of the insulating film while preserving clean metal zones. This allowed us to carry out our measurements with a better controlled state of the tip. The instability of the tip state has also led us to perform Z (V) regulated current spectroscopies. By controlling this current, it is then possible to minimize the interaction between the tip and the insulating film, thus making the tip last longer. These Z (V) spectroscopies also make it possible to increase the measurement voltage until reaching the field emission regime. We have observed a variation of the modulation of the field emission resonances (FER) amplitude as a function of the thickness of the insulating film. [...]

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Bachellier, Nicolas. "On surface spin detection and doping of metallocenes." Thesis, Strasbourg, 2016. http://www.theses.fr/2016STRAE030/document.

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Abstract:

Le sujet principal de cette thèse est l'étude de métallocènes déposés sur une surface de cuivre. Leurs adsorptions et propriétés électroniques sont expérimentalement étudiées par microscopie à effet tunnel (STM) et spectroscopie par effet tunnel (STS). Nos résultats ont été validés par des calculs se basant sur la théorie de la fonctionnelle de la densité (DFT). Plus précisément, nous avons étudié la façon dont le ferrocène FeC10H10 et le nickelocène NiC10H10s'adsorbent sur le cuivre. Nous avons découvert que ces métallocènes forment spontanément des réseaux alternant molécules horizontales et verticales. Nous avons ensuite modifié la structure du ferrocène par l'ajout d'un atome de cobalt et caractérisé les propriétés magnétiques de la nouvelle molécule ainsi créée, notamment l'apparition d'un effet Kondo témoignant de l'apparition de propriétés magnétiques au sein de la molécule. L'étude spectroscopique du nickelocène a révélé une excitation de la molécule à basse énergie.Cette excitation se traduit par une réorientation du moment de spin de la molécule, passant d'une orientation perpendiculaire à l'axe principal de la molécule à une orientation parallèle à cet axe.Nous avons finalement transféré un nickelocène sur la pointe STM et utilisé cette pointe moléculaire pour sonder les états d'une seconde molécule. Nous avons alors obtenu une double excitation de spin dans notre jonction tunnel, avec une augmentation significative de la conductance due aux excitations
The main subject of this PhD thesis is the study of metallocenes deposited on copper surfaces. Their adsorptions and electronic properties are experimentally studied by scanning tunnelling microscopy(STM) and scanning tunnelling spectroscopy (STS). Our results were confirmed by density functional theory (DFT) computations. More precisely, we studied how ferrocene FeC10H10 and nickelocene NiC10H10 are adsorbed on copper. We found that these metallocenes spontaneously create networks alternating horizontal and vertical molecules. We added a cobalt atom to the ferrocene in order to modify its structure and we characterized the magnetic properties of the new molecule we created, in particular the appearance of a Kondo effect showing that magnetic properties appeared in the molecule. The spectroscopic study of nickelocene revealed an excitation of the molecule at low bias. This excitation consist in a change in the spin orientation of the molecule, going from an orientation perpendicular to the main molecule axis to an orientation parallel to this axis. We finally transferred a nickelocene to the STM tip and used this molecular tip to probe the states of a second molecule. We consequently obtained a double spin excitation in our tunnel junction, with a significant increase of the conductance due to excitations

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Woringer, Maxime. "Tools to analyze single-particle tracking data in mammalian cells." Electronic Thesis or Diss., Sorbonne université, 2019. http://www.theses.fr/2019SORUS419.

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Abstract:

Ce travail présente des outils pour analyser la régulation de la transcription dans les cellules eucaryotes, en particulier pour le suivi de facteurs de transcription (TF) individuels dans les cellules de mammifères. Un noyau de cellule eucaryote est complexe et contient de nombreuses molécules (ADN, ARN, protéines, ATP, etc). Ces molécules interagissent avec des TF et influencent la transcription. Certaines de ces interactions peuvent être étudiées par des techniques de biochimie. La plupart, en particulier les interactions faibles, non covalentes, sont invisibles par ces méthodes. La microscopie de cellules vivantes et le suivi de molécules uniques (SPT en anglais) sont de plus en plus utilisées pour étudier ces phénomènes. L'inférence des paramètres biophysiques d'un facteur de transcription, par exemple son coefficient de diffusion, son nombre de sous-populations ou son temps de résidence sur l'ADN sont cruciaux pour comprendre sa dynamique et son influence sur la transcription. Des outils validés et précis sont donc nécessaires pour analyser les données de SPT. Pour être utile, un outil de SPT doit être non seulement validé, mais aussi accessible à des non-programmeurs. Ils doivent aussi tenir compte des biais expérimentaux présents dans les données. Nous proposons un outil d'analyse de SPT, qui se fonde sur l'estimation du propagateur de la diffusion. Ce outil a été validé et est accessible par une interface web. Nous avons montré qu'il donne des résultats proches de l'état de l'art. Il a été testé dans deux cadres : (1) l'étude de la diffusion augmentée par la catalyse enzymatique in vitro et (2) l'analyse de la dynamique du TF c-Myc dans des cellules de mammifères
This work aims at providing tools to dissect the regulation of transcription in eukaryotic cells, with a focus on single-particle tracking of transcription factors in mammalian cells. The nucleus of an eukeryotic cell is an extremely complex medium, that contains a high concentration of macromolecules (DNA, RNA, proteins) and other small molecules (ATP, etc). How these molecules interact with transcription factors, and thus influence transcription rates is an area of intense investigations. Although some of these interactions can be captured by regular biochemistry, many of them, including weak, non-covalent interactions remain undetected by these methods. Live-cell imaging and single-particle tracking (SPT) techniques are increasingly used to characterize such effects. The inference of biophysical parameters of a given transcription factor (TF), such as its diffusion constant, the number of subpopulations or its residence time on DNA, are crucial to understanding how TF dynamics and transcription intertwine. Accurate and validated SPT analysis tools are needed. To be used by the community, SPT tools should not only be carefully validated, but also be easily accessible to non-programmers. They should also be designed to take into account known biases of the imaging techniques. In this work, we first propose a tool, accessible through a web interface, based on the modeling of the diffusion propagator. We validate it extensively and show that it exhibits state-of-the art performance. We apply this tool to two experimental settings: (1) the study of catalysis-enhanced diffusion in-vitro and (2) the analysis of the dynamics of the c-Myc transcription factor in mammalian cells

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Yang, Bin. "New approaches in super-resolution microscopy." Thesis, Bordeaux, 2015. http://www.theses.fr/2015BORD0075/document.

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Abstract:

La première méthode vise à améliorer la vitesse d’imagerie de la microscopie super-résolue àtempérature ambiante pour des applications biologiques. En tant qu’une technique de scan, lamicroscopie STED a besoins d’être parallélisé pour faire de l’imagerie rapide en champ large. Nousavons obtenu une parallélisation massive de la microscopie STED en utilisant les réseaux d’optiqueavec une excitation en en champ large et une caméra rapide pour détection. Les images super-résoluesd’un champ de 3 μm par 3 μm sont acquises en scannant une maille élémentaire du réseau optique, quipeut être aussi petite que 290 nm * 290 nm. La microscopie Lattice-STED est démontrée avec unerésolution allant jusqu'à 70 nm à une cadence de 12,5 images par seconde.La deuxième méthode étend la microscopie super-résolue à la température de l’hélium liquide pourdes applications aux technologies quantiques. Des résolutions optiques à l'échelle nanométrique desémetteurs quantique est une étape cruciale vers le contrôle des états délocalisés formés par lesinteractions fortes et cohérentes entre des émetteurs. Dans ce contexte, nous avons développé unetechnique de microscopie à des températures cryogéniques, dénommée la microscopie Essat. Cettetechnique est basée sur la saturation optique de l'état excité des molécules fluorescentes uniques parl’excitation d’un faisceau en forme d’anneau. Une résolution moins de 10 nm est obtenue avec debasses intensités d'excitation, plus de millions de fois plus faibles que celles utilisées dans lamicroscopie STED à la température ambiante. Par rapport aux approches basées sur la superlocalisation,notre technique offre une occasion unique de résoudre sous la limite de diffraction lesmolécules uniques ayant des fréquences de résonance optiques qui se chevauchent. Ceci ouvre la voieà l'étude des interactions cohérentes entre émetteurs uniques et à la manipulation de leur degréd'intrication
The first technique aims at improving the imaging speed of super-resolution microscopy at roomtemperature for biological applications. As a scanning technique, STED (Stimulated EmissionDepletion) microscopy needs parallelization for fast wide-field imaging. Using well-designed opticallattices for depletion together with wide-field excitation and a fast camera for detection, we achievelarge parallelization of STED microscopy. Wide field of view super-resolved images are acquired byscanning over a single unit cell of the optical lattice, which can be as small as 290 nm * 290 nm.Lattice-STED imaging is demonstrated with a resolution down to 70 nm at 12.5 frames per second.The second one extends super-resolution microscopy to liquid helium temperature for applications inquantum technologies. Optical resolution of solid-state single quantum emitters at the nanometer scaleis a challenging step towards the control of delocalized states formed by strongly and coherentlyinteracting emitters. ESSat (Excited State Saturation) microscopy operating at cryogenic temperaturesis based on optical saturation of the excited state of single fluorescent molecules with a doughnutshapedbeam. Sub-10 nm resolution is achieved with extremely low excitation intensities, more thanmillion times lower than those used in room temperature STED microscopy. Compared to superlocalisationapproaches, our technique offers a unique opportunity to super-resolve single moleculeshaving overlapping optical resonance frequencies, paving the way to the study of coherent interactionsbetween single emitters and to the manipulation of their degree of entanglement

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Fernandez, Laurent. "Influence of gangliosides in the dynamics and partitioning of CD82 and its partners." Thesis, Montpellier, 2017. http://www.theses.fr/2017MONTT038.

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Abstract:

Un membre de la famille des tétraspanines, CD82, est une protéine transmembranaire et l'un des rares suppresseurs de métastase identifié jusqu'à présent. Cependant, le mécanisme de suppression de métastase induite par CD82 reste mal compris. Les tétraspanines, y compris CD82, ont la propriété unique de créer un réseau d'interactions protéines-protéines à la membrane plasmique, appelé « tetraspanin web ». Dans ce réseau, CD82 est connu pour interagir avec d’autres tétraspanines, y compris CD9, CD81 et CD151, en plus d’autres protéines membranaires telles que les intégrines, les récepteurs de facteurs de croissance et les protéines de type immunoglobuline. De plus, des travaux antérieurs ont identifié que l'interaction de CD82 avec l’EGFR, d'autres tétraspanines et les intégrines dépend de l'expression des gangliosides au sein de la membrane plasmique.À ce jour, les études dans ce domaine ont utilisé des techniques d'ensemble qui ne peuvent pas tenir compte de la dynamique et de la stochasticité de la membrane, alors qu'il est maintenant bien établi que l'organisation spatio-temporelle de ses composants est cruciale pour certaines fonctions cellulaires.Ainsi, lors de ma thèse de doctorat, j'ai cherché à étudier à la fois la dynamique et la compartimentation de CD82 et de ses partenaires à la membrane plasmique des cellules épithéliales mammaires HB2. Pour ce faire, la technique de pistage en molécule unique basée sur l’utilisation d’un microscope TIRF a été utilisée afin d’obtenir des informations directes à l'échelle nanométrique sur la dynamique de protéines individuelles dans les cellules vivantes. Nos expériences en pistage de molécule unique ont démontré que l'expression de CD82 augmentait la dynamique CD81 à la membrane plasmique des cellules HB2 et modifiait ses interactions au sein du tetraspanin web. En revanche, les dynamiques de CD9 et de l’intégrine α3 n'ont pas été modifiées par l'expression de CD82. De plus, en modifiant enzymatiquement l'expression des gangliosides, nous avons montré que ces lipides sont impliqués à la fois dans la dynamique et la compartimentation des tétraspanines à la membrane plasmique. En effet, la déplétion en gangliosides entraine une augmentation de la dynamique de CD82, CD81 et de l’intégrine α3 ainsi qu'une redistribution des tétraspanines à la membrane plasmique. Nous avons également étudié la migration en 2D des cellules HB2 et montré que CD82 et les gangliosides modifiaient de façon différentielle la migration des cellules HB2.L’ensemble de nos résultats démontrent que CD82 et les gangliosides modulent de manière différente la dynamique et la compartimentation des tétraspanines et de leurs partenaires à la membrane plasmique des cellules HB2. Enfin, ce travail suggère que l'activité de CD82 en tant que suppresseur de métastase pourrait être en partie liée à sa capacité, en coopération avec les gangliosides, à moduler l'organisation spatio-temporelle de ses partenaires au sein du tetraspanin web
A member of the family of tetraspanins, CD82, is a transmembrane protein and one of the rare metastasis suppressors identified so far. However, the mechanism of CD82-induced metastasis suppression remains not fully revealed. Tetraspanins, including CD82, have the unique property to create a network of protein-protein interactions within the plasma membrane, called tetraspanin web. Within this network, tetraspanins interact with each other (eg. CD82 with CD9, CD81 and CD151) as well as with other proteins, such as: integrins, growth factor receptors and immunoglobulin-like proteins. Additionally previous work has identified that the interaction of CD82 with EGFR, other tetraspanins and integrins depends on the expression of gangliosides at the plasma membrane.To date, studies in this field have employed ensemble-averaging techniques which are unable to account for membrane dynamics and stochasticity. Nevertheless, it is now well established that the spatio-temporal organization of its components is crucial for cellular functions.Thus, during my PhD thesis I aimed to study both the dynamics and partitioning of CD82 and its partners at the plasma membrane of HB2 mammary cells. To achieve this aim, a TIRF-based Single Molecule Tracking (SMT) approach was employed to provide direct nanoscale insights by observing individual proteins in living cells. Our SMT experiments demonstrated that CD82 overexpression increased CD81 dynamics at the plasma membrane of HB2 cells and modified its interaction within the tetraspanin web. In contrast, CD9 and α3 integrin dynamics were not modified by CD82 expression. Moreover, by enzymatically tuning gangliosides expression, we showed that these lipids are involved in both dynamics and partitioning of tetraspanins at the plasma membrane. Indeed, gangliosides depletion resulted in an increase in CD82, CD81 and α3 integrin dynamics as well as a redistribution of tetraspanins at the plasma membrane. We also investigated the 2D migration of HB2 cells showing that CD82 and gangliosides differentially altered the cellular migration of HB2 cells.Taken together, our results demonstrate that both CD82 and gangliosides differentially modulate the dynamics and partitioning of tetraspanins and their partners at the plasma membrane of HB2 cells. Finally, this work suggests that CD82 activity as metastasis suppressor could be in part linked to its ability, in cooperation with gangliosides, to modulate the spatio-temporal organization of its partners within the tetraspanin web

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Kerlin, Maciej. "Gene coregulation in cis within the 3D genome – A single-molecule imaging study." Electronic Thesis or Diss., Sorbonne université, 2021. http://www.theses.fr/2021SORUS124.

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Abstract:

Le génome eucaryote est organisé dans l’espace et le long de sa séquence. Du chromosome aux gènes, son organisation 3D est étroitement liée à son activité transcriptionnelle. A une échelle inférieure à la mégabase, le génome est organisé physiquement en domaines d’auto-interaction (TAD, pour topologically associating domains), que l’on pense influencer l’action de séquences régulatrices des gènes, appelées ‘amplificateurs’. Les TAD sont parfois vus comme des ‘unités de régulation’ permettant de coréguler plusieurs gènes en les exposant aux mêmes amplificateurs. L’expression de gènes d’un même TAD est en effet souvent corrélée entre tissus et types cellulaires. On sait d’autre part que l’expression de gènes fonctionnellement liés est aussi souvent corrélée. Cependant, le rôle que joue l’organisation 3D d’un locus génomique dans la corégulation de gènes fonctionnellement liés reste mal compris. Par des techniques d’imagerie de molécules uniques, j’ai observé, dans des cellules individuelles, la position et la transcription de trois gènes adjacents et fonctionnellement liés, partageant –ou non– les mêmes amplificateurs. J’ai utilisé comme système modèle la réponse à l’œstrogène dans des cellules MCF7. En combinant les techniques de FISH ARN et ADN, j’ai mesuré le couplage transcriptionnel de paires de gènes en cis, mettant en évidence une augmentation de la corrélation entre gènes d’un même TAD en réponse à l’œstrogène. Une perturbation de la frontière entre TAD indique également le rôle des contacts génomiques dans la corégulation de gènes. Ces travaux posent les bases pour comprendre comment les amplificateurs et les gènes communiquent et coordonnent leur activité en 3D
The eukaryotic genome is highly organized in both space and sequence. From entire chromosomes to individual genes the 3D organization of the genome is linked to transcription and many regulatory mechanisms likely coexist at different scales. At the sub-megabase scale, the genome is physically organized into self-interacting topologically associating domains (TADs) that are thought to constrain the range of action of gene regulatory elements called ‘enhancers’. Current data suggest that TADs serve as ‘regulatory units’ to coregulate multiple genes by exposing them to the same enhancers. Genes from the same TAD indeed often display correlated expression across different tissues and cell types. Interestingly, correlated expression is seen between functionally related genes. However, how 3D organization at an individual locus plays a mechanistic role in coregulating functionally related genes is unknown. Using single-molecule imaging, I observed in single cells the spatial positions and transcription of three adjacent functionally related genes regulated by the same/different enhancers. I used estrogen stimulation in MCF7 cells as a model system to study hormone-responsive genes and enhancers. Using combined RNA-DNA FISH, I measured the coupling between genes as the correlation in cis of their transcription. I found, that stimulation with estrogen increases the correlation in cis between genes belonging to the same TAD. Perturbation of the TAD boundary revealed the contribution of contact insulation to gene coregulation. Together, this work lays the ground towards an understanding of how enhancers and genes communicate and coordinate their activity within the 3D genome

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Bechensteen, Arne. "Optimisation L2-L0 contrainte et application à la microscopie à molécule unique." Thesis, Université Côte d'Azur, 2020. http://www.theses.fr/2020COAZ4068.

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Abstract:

L'optimisation parcimonieuse est cruciale dans la société d'aujourd'hui, car elle est utilisée dans de nombreux domaines, tels que le débruitage, la compression, l’apprentissage et la sélection de caractéristiques. Cependant, obtenir une bonne solution parcimonieuse d'un signal est un défi de calcul.Cette thèse se concentre sur l'optimisation d’un terme des moindres carrés en norme L0 sous une contrainte de k-parcimonie sur la solution exprimée avec la pseudo-norme L0 (le problème L2-L0 contraint). Nous étudions également la somme de la fonction de perte des moindres carrés et d'un terme de pénalité L0 (le problème L2-L0 pénalisé). Les deux problèmes sont non convexes, non continus et NP-durs. Nous proposons trois nouvelles approches d'optimisation parcimonieuse. Nous présentons d'abord une relaxation continue du problème contraint et présentons une méthode pour minimiser la relaxation proposée. Deuxièmement, nous reformulons la pseudo-norme L0 comme un problème de minimisation convexe. Ceci est fait en introduisant une variable auxiliaire, et nous présentons une reformulation exacte du problème contraint (CoBic) et pénalisé (PeBic). Enfin, nous présentons une méthode pour minimiser le produit du terme de fidélité des données et du terme de régularisation. Ce dernier est un travail de recherche en cours. Nous appliquons les trois premières méthodes proposées (relaxation, CoBic et PeBic) à la microscopie par molécule unique. Les résultats des algorithmes proposés sont à l'état de l'art des méthodes basées sur la grille. De plus, fixer la constante de contrainte de parcimonie est généralement plus intuitif que fixer le paramètre de pénalité, ce qui rend l’approche contrainte attractive pour les applications
Sparse optimization is crucial in today's society, as this is used in multiple domains, such as denoising, compression, machine learning, and variable selection. Sparse optimization is also vital in single-molecule localization microscopy, a microscopy method widely used in biology. However, obtaining a good sparse solution of a signal is computationally challenging. This thesis focuses on sparse optimization in the form of minimizing the least square loss function under a k-sparse constraint with an L0 pseudo-norm (the constrained L2-L0 problem). We also study the sum of the least square loss function and an L0 penalty term (the penalized L2-L0 problem). Both problems are non-convex, non-continuous, and NP-hard. We propose three new approaches to sparse optimization. We present first a continuous relaxation of the constrained problem and present a method to minimize the proposed relaxation. Secondly, we reformulate the L0 pseudo-norm as a convex minimization problem. This is done by introducing an auxiliary variable, and we present an exact biconvex reformulation of the constrained (CoBic) and penalized (PeBic) problems. Finally, we present a method to minimize the product of the data fidelity term and the regularization term. The latter is still an ongoing research work. We apply the three proposed methods (relaxation, CoBic, and PeBic) to single-molecule localization microscopy and compare them with other commonly used algorithms in sparse optimization. The proposed algorithms' results are as good as the state-of-the-art in grid-based methods. Furthermore, fixing the sparsity constraint constant is usually more intuitive than fixing the penalty parameter, making the constraint approach attractive for applications

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Fiszman, Nicolas. "Etude de cinétique de la traduction eucaryote à l'échelle de la molécule unique." Phd thesis, Palaiseau, Institut d'optique théorique et appliquée, 2013. http://pastel.archives-ouvertes.fr/pastel-00939858.

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Abstract:

La synthèse des protéines est un mécanisme central de la vie cellulaire dont la compréhension est un enjeu du domaine biomédical. Les études en molécule unique permettent d'observer chaque système réactionnel individuellement et donnent accès à des évènements asynchrones difficilement observables en mesure d'ensemble, tels la traduction de protéines.Cette thèse présente les premiers résultats en molécule unique sur la traduction par un ribosome eucaryote (mammifère). Nous observons les systèmes traductionnels grâce à des marqueurs fluorescents liés à des oligonucléotides pouvant s'hybrider sur les séquences d'ARN traduites. L'observation de ces marqueurs est faite par microscopie de fluorescence en onde évanescente (TIRF), les ARN étant fixés sur une lamelle de microscope. En lisant l'ARN, le ribosome détache les marqueurs, et leurs instants de départs donnent des informations sur le passage du ribosome à différentes positions sur l'ARN. Cette méthode permet d'obtenir des données cinétiques sur un grand nombre de systèmes traductionnels en parallèle pouvant alors être interpolées par des lois de probabilité. Nous obtenons par cette méthode des mesures de la cinétique in vitro de l'élongation eucaryote et nous observons un délai dû à une initiation non-canonique. En effet, nous complexons le ribosome sur l'ARN grâce à une structure de type IRES. Dans nos conditions d'expérience, l'incorporation d'un acide aminé prend environ une seconde tandis que cette structure induit un retard à la traduction de plusieurs dizaines de secondes. Ces résultats ouvrent des perspectives d'étude cinétique dans des cas plus complexes tels le franchissement de structures secondaires de l'ARN.

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Douarche, Nicolas. "Modélisation d'expériences permettant la manipulation de molécules biologiques uniques." Phd thesis, Université Pierre et Marie Curie - Paris VI, 2005. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00011190.

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Abstract:

Le manuscrit concerne la modélisation de mécanismes de régulation de l'expression génétique. Il se divise en deux parties.
Une étude statique de la formation de boucles dans la molécule d'ADN par exemple observable lors de la répression, à l'étape de transcription, de l'opéron Lac. Sont pris en compte : les effets liés à la taille des protéines fixant la boucle, des mécanismes entraînant une perte de rigidité du double brin - typiquement l'accrochage d'autres protéines - ainsi que son étirement au moyen d'une force extérieure. Nous avons calculé numériquement les diverses distributions en extension, ainsi que le facteur de cyclisation du modèle de polymère semi-flexible, dit "du ver". Seule la rigidité de courbure de l'ADN a été considérée. Nous avons adapté l'expression analytique obtenue par Shimada et Yamakawa en 1984.
Suit un bilan posant les bases d'une simulation stochastique du mécanisme permettant, à l'étape de réplication, le Contrôle du Nombre de Copie (CNC) du plasmide ColE1. Ce travail numérique devrait compléter une future caractérisation tant théorique qu'expérimentale, de la robustesse au bruit.

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Barbier, Nathalie. "Etude des erreurs programmées du ribosome par microscopie de fluorescence en molécule unique." Thesis, Université Paris-Saclay (ComUE), 2017. http://www.theses.fr/2017SACLO005/document.

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Abstract:

La synthèse des protéines est un mécanisme central de la vie cellulaire dont la compré-hension est un enjeu pour la recherche biomédicale. Des phénomènes comme les erreurs programméesde la traduction eucaryote ou l’initiation par des structures IRES virales sont impliqués dans les processusde réplication de virus et de bactéries. Mieux appréhender ces processus est une étape essentiellepour aboutir au développement d’approches thérapeutiques innovantes. Les études en molécule uniquepermettent d’observer chaque système réactionnel individuellement et donnent accès à des évènementsasynchrones difficilement observables en mesure d’ensemble, tels la traduction de protéines.Ce manuscrit de thèse présente une approche d’étude de la traduction par un ribosome eucaryote(mammifère) en molécule unique. Nous observons les systèmes traductionnels grâce à des marqueursfluorescents liés à des oligonucléotides pouvant s’hybrider sur les séquences d’ARN messagers traduites.L’observation de ces marqueurs est faite par microscopie de fluorescence en réflexion totale (TIRFM),les ARNm étant accrochés à la surface de l’échantillon. En lisant l’ARNm, le ribosome détache lesmarqueurs, et leurs instants de départ nous permettent de remonter à la dynamique de traductionde ribosomes individuels. Cette méthode permet d’obtenir des données cinétiques statistiques surun grand nombre de systèmes traductionnels en parallèle pouvant alors être ajustées par des lois deprobabilité. Partant de ce principe, mes travaux de thèse ont eu pour objectif d’étendre nos expériencesà une nouvelle problématique biologique : l’étude des évènements non canoniques de la traductioneucaryote. Pour cela nous avons apporté les modifications et les optimisations nécessaires au dispositifet au protocole expérimental pour l’adapter à ces nouveaux enjeux.Nos mesures de la cinétique in vitro de l’élongation eucaryote ont mis à jour un délai dû à uneinitiation non-canonique. En effet, nous réalisons le recrutement du ribosome par l’ARNm grâce àune structure virale de type IRES. Dans nos conditions d’expérience, l’incorporation d’un acide aminéprend environ une seconde tandis que cette structure induit un retard à la traduction de plusieursdizaines de secondes. Nous avons réalisé une étude comparative de plusieurs de ces structures viraleset avons montré que le délai mesuré était une caractérisitique conservée dans le cadre de l’initiation noncanonique. Ce résultat ouvre des perspectives d’études cinétiques tant pour approfondir nos conclusionssur les IRES que pour aborder d’autres évènements non canoniques tel que le décalage de la phase delecture ou le franchissement du codon stop
The synthesis of proteins is a central mechanism of cellular life whose understandingis an issue for biomedical research. Phenomena such as programmed errors of eukaryotic translation orinitiation by viral IRES structures are involved in virus and bacterial replication processes. A Betterunderstanding of these processes is an essential step towards the development of innovative therapeuticapproaches.Single molecule studies allow each reaction system to be observed individually and give accessto asynchronous events, such as protein translation, that are difficult to observe in overall measurements.This phD manuscript presents a single molecule approach to study translation by a eukaryotic(mammalian) ribosome.We observe the translational systems thanks to fluorescent primers linked to oligonucleotides thatare hybridized to the translated mRNA sequences. These markers are observed by Total InternalReflection Fuorescence Microscopy (TIRFM) ; with the mRNAs attached to the sample surface. Whilereading the mRNA, the ribosome detaches the primers, and their instants of departure give us access tothe translation dynamics of individual ribosomes. This method makes it possible to obtain statisticalkinetic data on a large number of parallel translational systems, which can then be fitted by probabilitylaws. On the basis of this principle, my phD work aimed at extending our experiments to a newbiological issue : the study of non-canonical events in eukaryotic translation. To this end, we havemade the modifications and optimizations necessary for the set-up and the experimental protocol toadapt them to these new challenges.Our measurements of the in vitro kinetics of eukaryotic elongation have revealed a delay due tonon-canonical initiation. Indeed, the ribosome are recruited on the mRNA thanks to a viral, IREStype structure. Under our experimental conditions, the incorporation of an amino acid takes aboutone second while this structure induces a translation delay of several tens of seconds. We carried outa comparative study of several of these viral structures and showed that the measured delay was acharacteristic preserved in the framework of the non-canonical initiation. This result opens up prospectsfor kinetic studies both to deepen our conclusions on IRES and to address other non-canonical eventssuch as programmed frameshifting or STOP codon readthrough

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Douarche, Nicolas. "Modélisation d' expériences permettant la manipulation de molécules biologiques uniques." Paris 6, 2005. https://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00011190.

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Géron-Landre, Bénédicte. "Reconnaissance de courtes séquences d'ADN et détection en microscopie de fluorescence." Paris 6, 2005. http://www.theses.fr/2005PA066206.

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Le, Gall Antoine. "Pince optique et microscopie de fluorescence pour l'étude de la synthèse des protéines en molécule unique." Phd thesis, Université Paris Sud - Paris XI, 2011. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00647915.

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Abstract:

Ce mémoire rapporte deux approches de la synthèse des protéines à l'échelle de la molécule unique. Nous utilisons la microscopie de fluorescence en onde évanescente pour sonder l'activité traductionnelle de deux types de ribosomes. Les premiers, issus d'E. Coli (organisme procaryote), sont mutés afin de les marquer d'un nanocristal semiconducteur (QD). La fin de la traduction, qui correspond au décrochage du ribosome de l'ARNm lorsque celui-ci atteint le codon stop, est alors mise en évidence par la disparition du QD de la surface de l'échantillon. Le deuxième type de ribosome étudié est quant à lui extrait de cellules de lapins (organisme eucaryote) et est dit "sauvage", c'est à dire qu'il n'a pas subi de modification, tandis qu'un oligonucléotide marqué d'un fluorophore est hybridé à l'ARNm. L'activité hélicase du ribosome lui permettant de séparer deux brins complémentaires, l'oligonucléotide et donc le fluorophore disparaissent en même temps que le ribosome parcourt l'ARNm, permettant ainsi de sonder l'activité du ribosome. Nous donnons pour ces deux types de ribosomes une vitesse moyenne de la traduction dans des milieux contenant les facteurs de la traduction issus d'extraits cellulaires.La deuxième approche de la synthèse des protéines porte sur les propriétés de l'ARNm, support de l'information génétique codant pour la séquence des protéines. Nous avons développé un montage de pince optique permettant de manipuler et caractériser les propriétés mécaniques d'oligonucléotides, ainsi qu'une méthode originale de calibration de ce piège optique. La cohérence de nos mesures sur l'étirement d'un double brin d'ADN avec la littérature nous permettra de poursuivre notre étude sur la mesure des forces nécessaires pour ouvrir une structure secondaire de l'ARNm.

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Winckler, Pascale. "Spectroscopie de corrélation de fluorescence : fluidité membranaire et détection de molécule unique en solution concentrée." Troyes, 2011. http://www.theses.fr/2011TROY0009.

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Abstract:

La Spectroscopie de Corrélation de Fluorescence (FCS) est une technique de molécules uniques particulièrement bien adaptée aux études en milieu biologique. Elle est ici mise en œuvre pour analyser localement la membrane plasmique de cellules vivantes. Dans un premier temps, la distribution de la microfluidité membranaire de cellules vivantes a été caractérisée grâce à des mesures de temps de diffusion par FCS. Nous avons ainsi pu établir la loi de distribution de la fluidité membranaire à l’échelle de la cellule unique pour différentes lignées cellulaires (LR73, MCF7, KB3. 1, MESSA et MDCKII). Une simulation Monte-Carlo montre qu’un modèle simple de diffusion à deux dimensions dans une matrice contenant des microdomaines visqueux peut rendre compte de l’allure asymétrique typique des distributions obtenues. Ce résultat a été utilisé pour évaluer les modifications membranaires liées à la surexpression de la P-glycoprotéine, protéine responsable d'un phénomène de résistance à la chimiothérapie. Nous avons également comparé la structuration membranaire de diverses lignées cancéreuses, chacune se déclinant en une version sensible et une version résistante à un médicament : la Doxorubicine. Dans un second temps, nous proposons une nouvelle méthode d’illumination locale basée sur un transfert d’énergie non radiatif. Cette méthode permet de réduire la profondeur de champ du microscope à l’échelle nanométrique. Nous en démontrons ici le potentiel pour l'utilisation de la FCS dans des solutions micromolaires ainsi que pour l'imagerie de l'adhésion cellulaire
Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a single molecule technique very well suited for in vivo studies. We have used FCS to explore plasma membrane microfluidity of living cells. Measurements were conducted at the single cell level, which enabled us to get a detailed over-view of the typical plasma membrane microviscosity distribution of each cell line studied (LR73, MCF7, KB3. 1, MESSA and MDCKII). A Monte Carlo simulation based on a 2D diffusion model enables us to link the asymetric fluidity distribution profile with the plasma membrane micro-organization. This result was used to determine the membrane organisation related to the surexpression of the P-glycoprotein (Pgp), a protein implicated in multidrug resistance. We also compare the membrane structuration of various cancer cell lines, each comes in two versions, a sensitive one and a resistant one to a chemotherapeutic drug: the Doxorubicin. Secondly, we propose a new excitation scheme based on a nonradiative energy transfert. This approach allow us to reduce the illumination depth of the microscope at the nanometric scale. We demonstrate its potential through two applications: FCS in micromolar solutions and fluorescence imaging on cells adhesion areas

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Martin, Kévin. "Hélicènes photo-et redox actifs : Molécules uniques et auto-assemblage sur surface." Thesis, Angers, 2018. http://www.theses.fr/2018ANGE0056.

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Abstract:

La conception de nouvelles molécules chirales est depuis plusieurs décennies un enjeu majeur. Ces travaux ont porté sur la synthèse ainsi que la caractérisation de diverses molécules à base d’hélicènes. En effet, les hélicènes sont chiraux et présentent des propriétés chiroptiques exceptionnelles. Ainsi, la combinaison de ces entités chirales associées à divers motifs permet la modulation de ces propriétés. Dans une première partie de ce manuscrit, nous nous sommes intéressés à l’association des hélicènes avec le motif tétrathiafulvalène (TTF) associant ainsi les propriétés redox du TTF à la chiralité des hélicènes. Une seconde partie concerne la préparation d’hélicènes luminescents à base de benzothiadiazole et de BODIPY avec pour objectif l’émission de lumière circulairement polarisée (CPL). Dans une troisième partie, nous avons étudié l’autoassemblage et la réactivité des motifs hélicéniques sur différentes surfaces de cuivre ou d’or. Enfin, nous avons réalisé des jonctions moléculaires à base d’hélicènes comme molécules uniques. En conclusion, nous avons développé différents motifs chiraux redox et photo-actifs ainsi que la formation de domaines auto-assemblés et des jonctions moléculaires à base d’hélicènes
The development of new chiral molecules is a major challenge since few decades. This PhD work focuses on the synthesis and the characterisation of a variety of molecules based on helicenes. Indeed, helicenes are chiral and show exceptional chiroptical properties. Therefore, combining these chiral entities with various motifs allow the modulation of their properties. In a first part of this manuscript, we were interested in the association of helicenes with tetrathiafulvalene (TTF), thus combining the redox properties of TTF with the chirality of helicenes. The second part concerns the preparation of luminescent helicenes based on benzothiadiazole and BODIPY for circularly polarised light luminescence (CPL). In a third part we investigated the self-assembly and the reactivity of helicenes on gold and copper surfaces. Finally, we have prepared single molecule junctions based on helicenes. In Conclusion, we developed different redox and photoactive helicenes with applications towards the self-assembly on surfaces and single molecular junctions

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Morel, Mathieu. "Développement de dispositifs microfluidiques pour l'étude du guidage axonal en molécules uniques." Paris 6, 2010. http://www.theses.fr/2010PA066753.

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Abstract:

Le fonctionnement de notre système nerveux repose sur l’établissement d’un réseau complexe de connexions neuronales au cours de l’embryogenèse et sur le maintien de ces circuits au cours de la vie adulte. C'est la présence de molécules de guidage qui permet aux axones de s'orienter correctement soit par attraction, soit par répulsion, et d'établir ainsi un réseau entre cellules nerveuses. Les recherches effectuées au cours de cette thèse de doctorat ont porté sur la détection des molécules de guidage par le cône de croissance, l’extrémité motile de l’axone, et sur sa capacité à répondre à un signal directif de très faible intensité. Dans un premier temps, nous avons développé des microsystèmes de stimulation utilisant la technologie microfluidique, compatibles avec la culture primaire de neurones et l’imagerie en molécule unique. Ceux-ci permettent de générer rapidement des gradients stables et contrôlés afin d’analyser la dynamique cellulaire en fonction des paramètres d’un signal chimique et de faire des mesures parallélisées sur plusieurs neurones. Nous avons alors utilisé ces « puces » pour étudier la distribution de récepteurs uniques diffusant sur la membrane du cône de croissance. Nous avons ainsi pu caractériser quantitativement les processus d’amplification et de filtrage temporel durant la détection d’un gradient de GABA en fonction des paramètres de ce gradient. Les résultats expérimentaux ont été confrontés à un modèle biophysique basé sur la diffusion libre des récepteurs membranaires et sur leur interaction transitoire avec le cytosquelette.

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Allemand, Jean Francois. "Quelques expériences entre physique, chimie, biologie :formations de boucles dans l'ADN, moteurs moléculaires etségrégation chromosomique, excitation biphotonique,spectroscopie de corrélation de fluorescence." Habilitation à diriger des recherches, Université Pierre et Marie Curie - Paris VI, 2006. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00141893.

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Abstract:

Dans une première partie nous avons utilisé des techniques de
micromanipulations de molécules d'ADN uniques avec des pinces magnétiques
pour étudier la cinétique et thermodynamique de formation de boucles
sur l'ADN par le répresseur GalR. Nous avons également étudié les propriétés
de la translocase à ADN FtsK impliquée dans la ségrégation des chromosomes
chez E. coli. Dans une seconde partie nous avons mis en place différentes
expériences utilisant l'excitation biphotonique. Tout d'abord nous
avons construit un dispositif pour mesurer les sections efficaces d'absorption
à deux photons de molécules synthétisées au laboratoire.Nous avons ensuite
mis en place la technique de corrélation de fluctuations de fluorescence pour
mesurer des coefficients de diffusion et des constantes cinétiques.

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Vienne, Véronique. "Etude de la cinétique de scanning lors de l'initiation de la traduction par microscopie de fluorescence en molécule unique." Electronic Thesis or Diss., université Paris-Saclay, 2023. http://www.theses.fr/2023UPASP161.

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Abstract:

La synthèse des protéines est un processus complexe, multi-étapes impliquant de nombreux facteurs qui doivent interagir de manière coordonnée pour traduire correctement l'ARN messager. Comme les ribosomes en cours de traduction ne peuventpas être synchronisés, des études sur des molécules uniques ont été introduites pour mieux comprendre la dynamique de la traduction. Cette approche a d'abord été appliquée à la traduction chez les procaryotes et, plus récemment, aux systèmes eucaryotes. Dans notre étude, nous nous intéressons à une étape spécifique de l'initiation de la traduction eucaryote appelée "scanning". Au cours de cette étape, le complexe de pré-initiation (PIC), qui contient la petite sous-unité ribosomique et des facteurs d'initiation de la traduction, glisse sur l'ARNm de 5' vers 3' pour localiser le codon START. Pour assembler le PIC à l'extrémité 5' de notre ARNm modèle, nous utilisons un site d'entrée interne du ribosome (IRES) du virus EMCV. Le processus d'initiation commence lorsque le PIC est recruté sur l'ARNm par l'IRES. Ensuite, le PIC parcourt l'ARNm en aval de l'IRES jusqu'à ce qu'il atteigne le codon START. L'objectif de ce travail est de déterminer la vitesse de scanning et d'évaluer l'impact de différentes structures secondaires sur la cinétique de scanning. Pour ce faire, nous utilisons un dispositif de microscopie de fluorescence en réflexion totale en molécule unique. Le principal avantage de travailler à l'échelle de la molécule unique est qu'il n'est pas nécessaire de synchroniser les ribosomes pour mesurer leur vitesse. Nous suivons le passage de ribosomes individuels non modifiés de mammifères via des jalons fluorescents hybridés le long de l'ARNm. Ces jalons sont deux oligonucléotides complémentaires fluorescents (émettant respectivement dans le vert et le rouge) hybridés à des positions distinctes de la région 5'UTR de l'ARNm et excités alternativement. Pendant le scanning, le PIC ouvre la structure secondaire et détache les oligonucléotides. Cela entraîne la perte du signal de fluorescence de chaque oligonucléotide, et l'évaluation précise de la vitesse de scanning. En utilisant des oligonucléotides complémentaires à différentes positions de la région 5'UTR, nous avons accès à la distribution de la vitesse de scanning des ribosomes individuels
Protein synthesis is a complex multistep process involving many factors that need to interact in a coordinated manner to properly translate the messenger RNA. As translating ribosomes cannot be synchronized over many elongation cycles, single-molecule studies have been introduced to bring a deeper understanding of translation dynamics. This approach has been first applied to prokaryotic translation and, recently to eukaryotic systems. In our study, we are interested in a specific step of translation initiation called scanning. During this step, the pre-initiation complex (PIC), which contains the small ribosomal subunit and translation initiation factors, slides on the mRNA 5' toward 3' to localize the start codon. To assemble the PIC on the 5' end of our model mRNA,we use an internal ribosome entry site (IRES) of the EMCV virus. The initiation process starts when the PIC is recruited on the mRNA by the IRES. Than the PIC scans the mRNA downstream the IRES until it reaches the start codon. The objective of this work is to determine the scanning speed and to assess the impact of different secondary structures on the scanning kinetics. To do so, we use a total internal reflexion fluorescent microscopy set-up with single-molecule sensitivity. The major advantage of single-molecule techniques is that there is no need to synchronize the ribosomes to measure their speed. We monitor the passage of individual, unmodified mammalian ribosomes at specific fluorescent milestones along mRNA. These milestones are two fluorescent complementary oligonucleotides (emitting respectively in the green and the red) hybridized at distinct positions of the 5'UTR of the mRNA, and excited alternatively. While scanning, the PIC unwinds the secondary structure and thereby induces the release of the oligonucleotides. This causes the loss of the fluorescence signal from each oligonucleotide. The time lapse between signals due to the release of each oligonucleotide allows a precise assessment of the scanning speed. By using oligonucleotides at complementary to various positions in the 5'UTR we have access to the scanning speed distribution of single ribosomes

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Wagner, Gaudeline. "Etude de la dynamique de la chromatine par des techniques de molécules uniques." Paris 7, 2006. http://www.theses.fr/2006PA077176.

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Abstract:

Nous avons sondé deux aspects de la dynamique des fibres de chromatine individuelles: (i) leur cinétique d'assemblage dans un flux hydrodynamique, et (ii) leur réponse mécanique à des contraintes rotationnelles. L'assemblage de la chromatine a été étudié avec différents systèmes biologiques: des extraits cellulaires et des histones purifiées. Nous avons optimisé le dispositif expérimental pré-existant et établi une méthode d'analyse quantitative des réactions ayant lieu près des surfaces. Cela nous a permis de mettre en évidence les rôles respectifs de différents facteurs dans le processus d'assemblage. Nous avons ensuite utilisé un montage de pinces magnétiques afin d'exercer des contraintes mécaniques contrôlées sur des fibres de chromatine. Cette expérience a montré que, sous l'effet d'une forte contrainte de surenroulement positif, le nucleosome subissait une transition structurale vers un état que nous avons nommé réversome. Les implications biologiques de cette transition ont été examinées. La mécanique des fibres contenant le variant centromérique de l'histone H3, CENP-A, a également été étudiée
We investigated two sides of single chromatin fibers dynamics: (i) chromatin assembly kinetics in a shear flow, and (ii) chromatin mechanical behavior under supercoiling constraints. Chromatin assembly was studied using different assembly Systems, cellular extracts and purified histones. We optimized the existing set-up and developed a method to quantitatively analyze surface reactions. The influence of several factors on the assembly was then underlined. A magnetic tweezers set-up was then used to exert controled mechanical constraints on chromatin fibers. Under high positive supercoiling, the nucleosome was shown to undergo a structural transition towards an altered state we named reversome. The biological relevance of this transition was discussed. The mechanical response of fibers containing the centromeric variant of histone H3, CENP-A, was also investigated

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Labeau, Olivier. "Détection et étude de nano-objets : nanocristaux de CdSe/ZnS et molécules uniques." Bordeaux 1, 2005. http://www.theses.fr/2005BOR13004.

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Abstract:

Ce travail traite de la détection et de l'étude de nano-objets luminescents que sont les nanocristaux de semi-conducteur de CdSe/ZnS et les molécules aromatiques. Le mémoire est organisé en trois parties distinctes. La première décrit différentes méthodes de détection de nano-objets par des méthode optiques de champ lointain. L'accent est mis sur l'utilisation d'un dispositif de microscopie confocale de fluorescence fonctionnant aux très basses temlpératures. La seconde traite plus spécifiquement ed la spectroscopie des nanocristaux de CdSe/ZnS. Une étude complète ainsi qu'un modèle de l'évolution en foction de la température du déclin de la luminescence de ces nanocristaux à l'échelle individuelle sont détaillés. Des résultats concernant la spectroscopie d'excitation résonante et de fluorescence des nanocristaux de CdSe/ZnS sont aussi mentionnés. Enfin, dans une dernière partie, la détection de la charge d'un vortex d'Abrikosov est envisagée par la spectroscopie de molécules individuelles aromatiques fluorescentes aux très basses températures présentant un fort effet Stark linéaire. Ce travail met en évidence un phénomène supplémentaire, un déplacement régulier du spectre d'excitation avec la puissance excitatrice, observable pour des molécules situées au voisinage d'une interface métallique ou supraconductrice.

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Heo, Minyoung. "Dynamique fonctionnelle du moteur flagellaire bactérien entraîné par des stators marqués par des protéines fluorescentes et par des stators étrangers modifiés par évolution." Thesis, Montpellier, 2016. http://www.theses.fr/2016MONTT080/document.

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Abstract:

Le moteur flagellaire bactérien (BFM) est un complexe moléculaire qui permet aux bactéries de nager dans un milieu liquide. La rotation du moteur est générée à l’interface entre deux éléments clés: les protéines formant le stator (MotA and MoB) et l’anneau C “switching complex” à la base du rotor. Les stators sont des modules du moteur structurellement et fonctionnellement différentiables du reste du moteur, et leurs association et dissociation dynamique autour du rotor contrôle la génération du couple. Quand une protéine fluorescente (PF) est fusionnée à MotB, le moteur est en état de marche mais une réduction générale de la mobilité de la cellule a été observée. La raison précise d’une telle réduction de mobilité n’a pas été étudiée.Le but de cette étude est de comprendre comment la fusion PF de la protéine du stator modifie la génération du couple et le sens de rotation du moteur. C’est particulièrement important car le tag FP se trouve à l’interface entre le stator et le rotor, là où le couple et le changement du sens de rotation sont produits. Trois différentes PFs (eGFP, YPet, Dendra2) ont été fusionnées à la protéine MotB. Malgré la haute similarité de leurs structures, notre analyse a montré que les trois stators fusionnés génèrent des couples différents. Les stators marqués avec YPet produisent un couple moyen similaire au WT (stators sans tag PF), alors que les stators marqués avec eGFP et Dendra2 produisent respectivement 70% et 40% du couple moyen du WT. De plus, les moteurs utilisant les stators fusionnés ont montré des capacités de changement de sens de rotation réduites. Lors d’un changement de sens de rotation, la valeur absolue de la vitesse des moteurs WT ne change pas. Cette “symétrie” de vitesse lors du changement n’apparaît pas avec les moteurs à stators fusionnés et le changement peut être accompagné d’une importante diminution (~30%) de la vitesse absolue.En observant par microcopie TIRF avec détection de molécules uniques, des stators marqués dans un moteur en état de marche, les signaux de fluorescence sont détectés à la membrane comme prévu pour ces protéines, montrant une population de stators diffusant dans celle-ci. Les clusters fluorescents étaient visibles au centre des cellules en rotation, attachés au couvre-glace par une seule flagelle, confirmant que le tag de fluorescence peut être visualisé dans des moteurs en état de marche. Dans un second projet développé dans le laboratoire Bertus Beaumont à TU Delft, en prenant le BFM en tant que système modèle d’évolution expérimentale, sa modularité et son « évolubilité » ont été explorés pour apprendre les détails au niveau moléculaire de l’évolution de ce type de machine. Les stators de E.coli ont été échangés par un set de 21 stators étrangers homologues. L’expérience a révélé que les protéines du stator peuvent être échangées entre espèces de bactéries distantes et certains stators non compatibles peuvent être modifiés positivement par un procédé d’évolution pour devenir fonctionnels. Au cours de cette évolution, les bactéries ont accumulé des mutations avantageuses dans leurs gènes MotA et MotB étrangers, tout particulièrement dans leur domaine fonctionnel. Des mutations identiques dans des stators différents ont été observées, indiquant que l’évolution peut se reproduire. L’analyse fonctionnelle au niveau d’un seul moteur a révélé que ces mutations avantageuses amélioraient la génération du couple et/ou la capacité du moteur à changer de sens. Les investigations détaillées du génotype et du phénotype du BFM modifié par évolution apportés par cette étude, pourraient donner une idée sur la façon dont des machines moléculaires comme le BFM ont évolué, et les effets fonctionnels des mutations bénéfiques qui facilitent l'intégration fonctionnelle
The bacterial flagellar motor (BFM) is the macromolecular complex which allows bacteria to swim in liquid media. Located at the base of the flagellum, anchored in the cell membrane, this remarkably small (~45nm) yet powerful rotary motor rotates each flagellum of the cell switching between counterclockwise (CCW) and clockwise (CW) direction. The motor rotation is generated at the interface between the two key components of the motor: the stator protein complexes (each composed of 4 MotA and 2 MotB proteins) and the C- ring protein complex at the base of the rotor. The stator complexes are structurally and functionally discernible modules of the motor, and their dynamical association and dissociation around the rotor controls the generation of torque.The first project of this study aims to investigate how the FP tag on the stator protein modifies the torque generation and switching of the motor. This is particularly important because the fluorescent protein tag lies at the interface between stator and rotor, where torque and switching are produced. Three different FPs (eGFP, YPet, Dendra2) were fused to MotB. Interestingly, despite the high similarity of their structures, our analysis revealed that the three fusion stators generate different torque. Furthermore, in the presence of fusion stators, the motor showed significantly impaired switching abilities. When switching direction of the rotation, the absolute value of the speed of WT motors does not change, whereas this symmetry of speed upon switching is not observed in the fusion stator motors, and switching can be accompanied with a significant (~30%) decrease in absolute speed. Both the impaired torque generation and the switching ability were improved by introducing a rigid linker between the stator and the FP tag. Taken together, this study provides a further insight into the dynamics of the stator and rotor interaction at its interface.When the cells carrying the fluorescently labeled stators were observed in a custom made TIRF-fluorescence microscope with single molecule capability, the fluorescence signals were detected as concentrated clusters in the membrane as expected for these membrane proteins around the motors, together with a population of stators diffusing in the membrane. Fluorescent clusters were visible at the center of rotating cells tethered to the glass slide by a single flagellum, confirming that the fluorescent tags can be visualized in functioning motors.In a second project developed in Bertus Beaumont lab at TU Delft, taking BFM as an experimental evolutionary model system, its modularity and evolvability have been explored to learn the molecular details of the evolution of molecular machines. The stators of E.coli have been exchanged by a set of 21 homologue foreign stators. The experiments revealed that the stator proteins can be exchanged between distant bacteria species, and some of the non-compatible stators can be positively modified by evolution to become functional. Those evolved strains accumulated beneficial mutations in their foreign motA and motB genes, especially on their functional domains. Identical mutations in different stators were common, indicating that evolution is repeatable. The functional investigation at the single motor level revealed that those beneficial mutations improved the torque generation and/or the switching ability of the motor. The detailed genotype and phenotype investigations of the evolutionary modified BFM may bring an insight into how molecular machines such as BFM have evolved as well as the functional effects of the beneficial mutations that facilitate functional integration

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Arthaud, Christopher. "Etude de la morphogénèse et de la division chez Streptococcus pneumoniae par microscopie de localisation de molécule unique." Thesis, Université Grenoble Alpes (ComUE), 2018. http://www.theses.fr/2018GREAV024/document.

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Abstract:

La morphogénèse des ovocoques, dont fait partie le pathogène humain Streptococcus pneumoniae, implique des processus d’élongation et de division associés à la synthèse de la paroi bactérienne. Le composant majeur de cette paroi est le peptidoglycane, un polymère de sucre réticulé par des chaines peptidiques, qui confère la forme de la bactérie et est essentiel à sa survie. La synthèse de peptidoglycane nécessaire à l’élongation et la division bactérienne est effectuée par des complexes protéiques appelés respectivement « élongasome » et « divisome ». Les mécanismes d’assemblage et l’activité de ces complexes dans la cellule bactérienne restent encore non élucidés. Pour imager l’activité des complexes de synthèse du peptidoglycane in vivo à l’échelle du nanomètre, j’ai développé une méthode faisant appel à des dérivés de D-amino acides, à la chimie click et à la microscopie de localisation de molécules uniques (dSTORM ou direct Stochastic reconstruction microscopy). Cette méthode a permis d’obtenir des images à une résolution d’environ 20 nm, révélant des aspects inattendus de la synthèse du peptidoglycane et remettant en question le rôle de certaines protéines dans la morphogenèse du pneumocoque. En combinant ces observations avec les données de la littérature, un modèle simplifié de la morphogénèse des ovocoques est proposé
The morphogenesis of ovovcocci, which include the human pathogen Streptococcus pneumoniae, involves elongation and division processes associated with cell wall synthesis. The main component of the cell wall is the peptidoglycan, a polymer made of glycan chains cross-linked by peptide chains, which confers the bacterial shape and is essential for cell survival. Peptidoglycan synthesis required for cell elongation and division is performed by large protein complexes called “elongasome” and “divisome”, respectively. The assembly mechanisms and activity of these complexes in the bacterial cell remain mysterious. To image the activity of the peptidoglycan synthesis complexes in vivo at the nanoscale, I developed a method combining D-amino acid derivatives, click chemistry and single-molecule localization microscopy (dSTORM or direct Stochastic reconstruction microscopy). This method allowed obtaining images at a resolution of about 20 nm resolution, revealing unexpected features of peptidoglycan synthesis and challenging the role of some proteins in pneumococcus morphogenesis. By combining these observations with data from the literature, a simplified model of ovococci morphogenesis is proposed

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Kawahara, Seiji Léo. "Spectroscopie à effet tunnel d'adatomes Kondo et de molécules uniques sur une surface magnétique." Phd thesis, Université Paris-Diderot - Paris VII, 2012. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00927225.

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Abstract:

Cette thèse s'inscrit dans le contexte de l'électronique de spin. Dans une première partie, nous nous intéressons à l'effet Kondo induit par un atome 3d sur une surface ferromagnétique étudié en spectroscopie à effet tunnel. Nous montrons que la signature spectroscopique observée au-dessus d'atomes uniques de Co adsorbés sur des plots de fer auto-organisés sur une surface d'Au(111) peut se dédoubler sous l'effet du couplage avec les îlots. Un modèle de résonance Fano à deux niveaux en interaction avec un continuum permet d'ajuster les spectres tunnel et d'extraire la température Kondo et le champ magnétique qui induirait le dédoublement s'il s'agissait d'un effet Zeeman. Ce champ de plusieurs dizaines de Teslas est compatible avec la valeur connue du champ d'échange à la surface du fer. Des atomes bistables entre deux sites adjacents ont été observés, montrant de façon réversible un spectre dédoublé ou non. Dans une seconde partie, nous nous intéressons à la polarisation de spin de la densité d'états de molécules uniques de C60 adsorbées sur une surface de Cr(001) observée en microscopie à effet tunnel résolue en spin. Les cartes de conductance différentielle et les spectres tunnel locaux montrent une magnétorésistance tunnel au-dessus des molécules. Des simulations liaisons fortes et ab initio ont permis d'identifier l'état moléculaire impliqué et de montrer que le substrat induit une levée de dégénérescence dépendant du spin. La magnétorésistance mesurée change de signe en fonction de la tension tunnel et atteint plusieurs dizaines de pourcents à des tensions de plusieurs centaines de mV.

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Kawahara, Seiji Leo. "Spectroscopie à effet tunnel d'adatomes Kondo et de molécules uniques sur une surface magnétique." Paris 7, 2012. http://www.theses.fr/2012PA077118.

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Abstract:

Cette thèse s'inscrit dans le contexte de l'électronique de spin. Dans une première partie, nous nous intéressons à l'effet Kondo induit par un atome 3d sur une surface ferromagnétique étudié en spectroscopie à effet tunnel. Nous montrons que la signature spectroscopique observée au-dessus d'atomes uniques de Co adsorbés sur des plots de fer auto-organisés sur une surface d'Au(l 11) peut se dédoubler sous l'effet du couplage avec les îlots. Un modèle de résonance Fano à deux niveaux en interaction avec un continuum permet d'ajuster les spectres tunnel et d'extraire la température Kondo et le champ magnétique qui induirait le dédoublement s'il s'agissait d'un effet Zeeman. Ce champ de plusieurs dizaines de Teslas est compatible avec la valeur connue du champ d'échange à la surface du fer. Des atomes bistables entre deux sites adjacents ont été observés, montrant de façon réversible un spectre dédoublé ou non. Dans une seconde partie, nous nous intéressons à la polarisation de spin de la densité d'états de molécules uniques de C₆₀ adsorbées sur une surface de Cr(OOl) observée en microscopie à effet tunnel résolue en spin. Les cartes de conductance différentielle et les spectres tunnel locaux montrent une magnétorésistance tunnel au-dessus des molécules. Des simulations liaisons fortes et ab initio ont permis d'identifier l'état moléculaire impliqué et de montrer que le substrat induit une levée de dégénérescence dépendant du spin. La magnétorésistance mesurée change de signe en fonction de la tension tunnel et atteint plusieurs dizaines de pourcents à des tensions de plusieurs centaines de mV
This work deals with two spintronics problems. In a first part, the Kondo effect induced by a 3d single atom adsorbed on a ferromagnetic surface is investigated using tunneling spectroscopy. We find that the tunneling spectra measured above Co adatoms on Fe/Au(l 11) islands can be split by the interaction with the substrate. We have successfully fit the tunneling signatures with a two levels Fano resonance, which allows to extract the Kondo temperature and the magnetic field that would induce such a splitting if it was due to a Zeeman effect. This field of several tens of Teslas is in good agreement with the expected Weiss field at thee iron surface. Some atoms were found to switch easily between two adjacent sites and show perfectly reproducible split/non split signatures. In a second part, we investigate the polarization of the local density of states of single C₆₀ molecules adsorbed on a Cr(OOl) surface using spin-polarized scanning tunneling spectroscopy. The spin resolved conductance maps and spectra show a significant tunneling magnetoresistance above the molecules. Tight-binding and ab initio simulations allow the identification of the polarized state, which derives from a lifting of degeneracy of one of the free molecule orbitals. The magnetoresistance is ascribed to a spin-splitting of this state and its spin-dependant hybridization with the Cr(OOl) surface. The Julliere magnetoresistance reaches several tens of percents at tunneling bias of hundreds of mV and its sign changes as a function of the bias

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Bercy, Mathilde. "Les structures secondaires dans l'ARN : une étude par mesure de forces sur molécules uniques." Thesis, Paris 6, 2015. http://www.theses.fr/2015PA066718/document.

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Abstract:

L'ARN s'est longtemps vu attribuer un simple role de transmission entre l'ADN, garant de l'information genetique, et les proteines, assurant les fonctions et donc la survie cellulaire. Ce n'est qu'avec les decouvertes des ARNs de transfert dans les annees 70, puis des ribozymes dans les annees 80, qu'il a ete realise que l'ARN pouvait assurer ces deux roles : l'information genetique est stockee dans sa sequence lineaire, et l'adoption de structures tridimensionnelles complexes rend possible une activite catalytique. Depuis, de nouvelles fonctions de l'ARN n'ont cesse d'etre decouvertes, a tous les niveaux de regulation de l'expression genique entre autres. La majorite de ces fonctions repose sur la structuration tridimensionnelle d'ARNs simple brin.Dans ce travail, differents aspects de la structuration de l'ARN sont abordes, toujours en utilisant la technique de mesure de forces sur molecules uniques par piegeage optique. Dans un premier temps, une etude comparative d'une structure secondaire modele, le hairpin dans ses formes ARN et ADN, a ete realisee. La question de l'interaction d'une structure secondaire avec une proteine helicase (DbpA) a ensuite ete abordee. Enfin, dans le cadre plus general d'une etude sur l'assemblage du ribosome, nous avons debute le developpement d'une nouvelle methode d'analyse des structures secondaires. Cette methode repose sur le suretirement d'un hybride ARN ribosomique / ADN
Traditionally, RNA has been considered as a mere intermediate between DNA, keeper of the genetic information, and proteins, which assume cells self-sustenance. With the discoveries of the transfert RNA in the 70s, and of the ribozymes in the 80s, RNA took on both roles: it can store information in its linear sequence, and tridimensional structuration enables catalytic functions. Since then, numerous roles devoted to RNA have been discovered, particularly for gene expression regulation. Most of these functions rely on tridimensional structuration of single stranded RNA. In this work, we used an optical tweezers setup to study several aspects of RNA structuration by single molecule force measurement. In a first part, we compared the dynamic behaviour of a model secondary structure made of either RNA or DNA, the hairpin. Then we considered the interaction of a secondary structure with a protein, the RNA helicase DbpA. Finally, within a wider study of ribosome assembly, we worked on the development of a new method to study tridimensional structuration. This method relies on the overstretching of a hybrid ribosomal RNA / DNA molecule

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Tresset, Guillaume. "Compartimentation microscopique: depuis les microchambres femtolitriques jusqu'aux particules pseudo-virales." Habilitation à diriger des recherches, Université Paris Sud - Paris XI, 2013. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00848365.

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Abstract:

Avec l'avènement de la microélectronique et des techniques de miniaturisation, de nouveaux domaines transdisciplinaires sont nés au confluent des sciences de l'ingénieur, de la matière et du vivant. La technologie a désormais investi l'échelle du nanomètre ; elle parvient à sonder, mais aussi surtout à façonner les constituants élémentaires de la matière synthétique et organique, depuis les atomes jusqu'aux complexes macromoléculaires. La nécessité d'isoler des molécules et des assemblages supramoléculaires est motivée par leur découplage du milieu environnant avec lequel ils interagissent. Des stratégies de compartimentation se sont devéloppées pour répondre aux besoins grandissants d'isolement de ces entités, en particulier à travers deux approches classiques en nanotechnologie : top-down et bottom-up. L'approche top-down consiste à "sculpter" la matière pour lui conférer des dimensions compatibles avec les objets à confiner. La lithographie et les techniques de microfabrication en général rentrent typiquement dans cette catégorie. Des stratégies microfluidiques destinées à manipuler spécifiquement des assemblages supramoléculaires ont été ainsi développées soit en vu d'applications pour la microanalyse totale, soit pour des études biophysiques fondamentales. Dans l'approche bottom-up, des molécules de natures différentes sont agencées pour former l'entité qui va confiner les objets d'intérêt. La chimie et le vivant procèdent par cette approche pour synthétiser des assemblages supramoléculaires et des organismes. Dans cette optique, la compaction de polyélectrolytes par des agents lipidiques en particules nanométriques a été étudiée. Cette stratégie permet en particulier de transférer des gènes au sein des cellules. Enfin, toujours dans le cadre d'une approche bottom-up de la compartimentation, nous présentons une méthodologie résolument bio-inspirée qui exploite les propriétés naturelles d'auto-assemblage des virus. Cette autre statégie ouvre la voie à l'encapsulation d'une large variété de molécules et de nano-objets. Elle tire avantage de l'extraordinaire précision moléculaire de l'assemblage d'un virus et vise à tirer profit de ses propriétés circulatoires dans l'organisme. C'est dans cet esprit que se clôt ce mémoire avec une présentation succinte des perspectives à long terme orientées autour de l'assemblage de systèmes viro-inspirés. Les objectifs seront d'élucider les mécanismes moléculaires sur des systèmes de complexité croissante, et en parallèle de maîtriser ces mécanismes via le développement de méthodologies d'auto-assemblage dirigé.

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Houel, Julien. "Polarons de boîtes quantiques InAs/GaAs : microscopie et spectroscopie d’absorption de boîtes uniques et d’ensembles." Paris 11, 2009. http://www.theses.fr/2009PA112290.

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Abstract:

Ce manuscrit porte sur des études relatives aux transitions inter-sous-niveaux des polarons dans les boîtes quantiques auto-assemblées InAs/GaAs. Dans un premier temps, nous avons étudié des ensembles inhomogènes de boîtes quantiques. Nous avons effectué des études de spectroscopie lointain infrarouge (≥20µm). Tout d’abord à basse température, ce qui nous a permis d’identifier les énergies des transitions S-P, ainsi que le dédoublement moyen des niveaux P+ et P-. Nous en avons déduit les dopages (nombre d’électrons moyen par boîte quantique) des échantillons ainsi que leur distribution de taille. Nous avons ensuite effectué ces spectroscopies à 300 K, ce qui nous a permis d’expliquer la forme non-gaussienne de spectres par la distribution non-homogène des porteurs dans les boîtes, en fonction de leur taille. Afin de contrôler le dédoublement des niveaux P+ et P- observés en spectroscopie, nous avons effectué des recuits sur des ensembles inhomogènes de boîtes. Enfin, nous avons réalisé des expériences de spectroscopie moyen infrarouge en géométrie guidée qui nous ont permis de montrer que l’absorption S→ Continuum est modulée par des interférences Fabry-Pérot, dues à l’absorption sur l’épaisseur de la couche active des 80 plans de boîtes épitaxiés (~ 4µm). Dans une deuxième partie, nous avons étudié l’absorption inter-sous-niveaux de boîtes quantiques uniques à 300 K par l’intermédiaire d’une technique de microscopie d’absorption qui couple un microscope à force atomique (AFM) à un laser impulsionnel dans le moyen infrarouge. Grâce à cette technique, nous avons présenté les premières images 2D de l’absorption inter-sous-niveaux de boîtes quantiques uniques à 10 µm de longueur d’onde, avec une résolution sous-longueur d’onde de ~ 60-80 nm, soit ~ λ/150. Cette technique nous a également permis de réaliser la première mesure de la largeur homogène d’une transition inter-sous-niveaux. Nous avons obtenu une résonance Lorentzienne de 10 meV de large à mi-hauteur à 300 K et centrée à 120 meV, correspondant à la largeur homogène de la transition S-D. Dans une troisième partie, nous avons mesuré les temps de relaxation des polarons pour les transitions S-P+, en fonction du dopage des échantillons, par le biais d’expériences pompe/sonde dégénérées en résonance avec les transitions d’un ensemble inhomogène de boites quantiques à basse température (4 K). Nous avons également réalisé le premier spectre pompe/sonde à deux couleurs en résonance avec les transitions S-P et S-P à 26 et 23 µm de longueur d’onde. Enfin, nous avons réalisé des caractérisations de membranes à cristaux photoniques dans le moyen infrarouge en réflectivité ainsi qu’en émissivité, avec lesquelles on observe des modes de Bloch de centre de zone vers 10 µm de longueur d’onde. Nous avons également caractérisé en réflectivité des cavités insérées dans les membranes à cristaux photoniques, dans le moyen/lointain infrarouge. Nous avons ainsi observé des modes de cavité autour de 15-20 µm de longueur d’onde, proche de l’énergie de la transition S-P.

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Marhaba, Salem Pellarin Michel. "Influence de la morphologie sur les propriétés optiques de nano-objets métalliques uniques." [s.l.] : [s.n.], 2008. http://tel.archives-ouvertes.fr/docs/00/35/62/12/PDF/These_de_doctorat_de_Salem_Marhaba.pdf.

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Schäfer, Philip Sudadyo. "Tuning of color and polarization of the fluorescence of nano-ribbons using laser microscopy and controlled self-assembly." Thesis, Bordeaux, 2016. http://www.theses.fr/2016BORD0435/document.

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Abstract:

Des matériaux ayant des propriétés émissives spécifiques peuvent être obtenus par l'organisation contrôlée de fluorophores aux échelles moléculaire, nano- et micro-métrique. Dans ce travail, l'émission de lumière bleue polarisée est obtenue par l'auto-assemblage hautement anisotrope de n-acènes alcoxylés en nano-rubans. Des techniques de microscopie de fluorescence ont été utilisées pour déterminer le mécanisme de leur croissance et ont été combinées à la cristallographie aux rayons X pour déterminer l'empilement moléculaire dans les nano-objets. L'étude a révélé que la formation des nano-rubans est induite non seulement par le mécanisme de maturation d'Ostwald très commun, mais aussi par une croissance par attachement orienté rarement démontré dans des systèmes organiques. En plus des techniques plus courantes, la microscopie en polarisation de fluorescence de molécules uniques a contribué à caraxctériser l'emplilement moléculaire, bien que les nano-objets à haute densité en chromophore constituent des échantillons très difficiles à étudier. Dans ce travail, les propriétés des nano-rubans ont été contrôlées au niveau microscopique par les conditions de croissance, ainsi que par l'addition de dopants. Ainsi, en combinant différentes molécules et une réaction photochimique sous microscopie, des rubans à motifs colorés sub-micrométriques ont été obtenus. Par ailleurs, l'assemblage orthogonal a été exploité pour développer des réseaux interpénétrés. Ces derniers se distinguent par une émission à double couleur, un transfert d'énergie entre objets et une électroluminescence aux jonctions
Materials with specific emissive properties can be obtained by the controlled organization of fluorophores at the molecular, nano- and microscales. In this work, polarized blue light emission is achieved by the highly anisotropic self-assembly of alkoxylated n-acenes into nano-ribbons. Fluorescence microscopy techniques were used to determine the growth mechanism and were combined to X-ray crystallography to determine the molecular packing in the nano-objects. The study revealed that the formation of the nano-ribbons is induced not only by the very common Ostwald ripening mechanism but also by an oriented attachnment growth, rarely observed with such evidence in organic systems. Besides more common techniques, single molecule fluorescence polarization microscopy contributed to characterize the molecular packing, although the nano-objects with high chromophore density represent very challenging samples. In this work, the properties of the nano-ribbons have been controlled at the microscopic level by the growth conditions, as well as by the addition of dopants Thereby, combining different molecules and photochemistry at the sub-micrometer scale under the microscope, colorful patterned ribbons could be obtained. In addition, orthogonal assembly was exploited to grow interpenetrated networks. The latter demonstrated dual color-emission, as well as inter-object energy transfer and electroluminescence at junctions

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Du, Roure Olivia. "Adhésion homophile entre fragments de cadhérines : mesures de forces par microscopie à force atomique à l'échelle de la molécule unique." Paris 6, 2002. http://www.theses.fr/2002PA066504.

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Alwan, Monzer. "Etude experimentale de contacts métalliques et moléculaires ponctuels : de l'objet individuel aux statistiques." Thesis, Aix-Marseille, 2012. http://www.theses.fr/2012AIXM4106/document.

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Abstract:

Nous présentons un travail expérimental contribuant à l'étude de contacts ponctuels métalliques et moléculaires à l'aide de dispositifs de jonctions brisées développés dans notre équipe. Ces techniques de jonctions brisées, utilisables dans les conditions ambiantes, sont particulièrement adaptées à deux champs disciplinaires : l'électronique moléculaire et la nano mécanique.Nous avons étudié la durée de vie de contacts métalliques d'or, qui excède rarement la dizaine de millisecondes à température ambiante. Par le biais d'une analyse statistique de mesures de conductance, nous montrons que leur durée de vie est limitée par la contrainte mécanique appliquée à la jonction. Ces résultats nous ont permis de proposer un mécanisme de rupture, et de définir des conditions optimales pour la formation des contacts à température ambiante.Nous présentons ensuite une étude préliminaire de mesure de conductance d'une molécule unique, utilisant un dispositif à jonction brisée ainsi qu'un microscope à effet tunnel.Les résultats obtenus indiquent que, si la mesure de la conductance d'une molécule unique est possible, la stabilité observée est à considérer avant d'envisager des applications
We present here an experimental work which contributes to the study of metallic and molecular point contacts using broken junctions-based devices developed in our team. Under ambient environmental conditions, these techniques are particularly adapted to two disciplinary fields: molecular electronics and nano-mechanics.We have studied the lifetime of gold contacts, which rarely exceed ten milliseconds at room temperature.Through statistical analyses of conductance measurements, we show that this lifetime is limited by the mechanical strain applied to the junction. These results allowed us to propose a breaking mechanism, and to define optimal conditions for the formation of the contacts at room temperature. We present then a preliminary study of conductance measurements of a single molecule, using a broken junction device as well as a scanning tunneling microscope.The results indicate that, despite the conductance measure of a single molecule is possible the observed stability should be considered before envisaging applications

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Dulin, David. "Observation de l'activité traductionnelle d'un ribosome unique par microscopie de fluorescence couplée à un système microfluidique." Phd thesis, Université Paris Sud - Paris XI, 2009. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00538401.

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Abstract:

Dans ce mémoire sont présentées la conception et la réalisation d'une expérience portant sur l'étude en molécule unique de l'activité traductionnelle du ribosome procaryote. Pour ce faire, nous utilisons un ribosome et des acides aminés lysines marqués spécifiquement avec deux marqueurs fluorescents ayant des spectres d'émissions différents. Ainsi, nous pouvons colocaliser les ribosomes et les acides aminés incorporés en utilisant la microscopie de fluorescence par réflexion totale (TIRFM). Pour pouvoir compter les acides aminés incorporés, nous avons réalisé une étude en molécule unique des propriétés photophysiques du fluorophore organique les marquant, le Bodipy FL. Celui-ci a une faible durée de vie et clignote beaucoup. Afin de remédier à ces problèmes, nous avons développé un système permettant d'augmenter sa durée de vie d'un facteur 25 environ, et qui réduit le taux de clignotement pour de faibles intensités d'excitation. L'étude des ribosomes à proximité de la surface d'une lamelle de microscope nous a amenés à développer une chimie de surface n'autorisant qu'une accroche spécifique des espèces biologiques étudiées et conservant l'activité des ribosome. Ces études ont été réalisées à l'aide de cellules microfluidiques élaborées par nos soins permettant une grande flexibilité lors des expériences. Nous avons élaboré un marquage spécifique original du ribosome à l'aide d'un nanocristal semi-conducteur. Nous avons évalué la spécificité de l'accroche ainsi que l'activité du ribosome marqué en mesure d'ensemble. Nous avons ensuite observé l'activité de ces ribosomes marqués accrochés à une surface en molécule unique. Des expériences préliminaires en molécules uniques ont démontré que des ribosomes non marqués étaient capables d'incorporer les acides aminés marqués Bodipy FL . Enfin, nous présentons les premières étapes de conception d'une pince optique pour mesurer des forces de cohésion sur des structures particulières de l'ARN messager.

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Girod, Stéphanie. "Vers la mesure de nano-objets uniques, réalisation de nanogaps par électromigration." Phd thesis, Université de Lorraine, 2012. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00727574.

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Abstract:

Nous avons étudié la formation de nanogaps par électromigration dans des nanofils d'or. Cette technique consiste à provoquer la rupture d'un nanofil en lui appliquant de fortes densités de courant et peut être utilisée pour la caractérisation électrique de nano-objets. L'étude en temps réel du processus d'électromigration par microscopie à force atomique a permis d'apporter un éclairage nouveau de la dynamique du processus. En effet, il apparaît que la structure globale du dispositif est définie dans les premiers temps de l'électromigration et nous avons montré que cette structure est directement liée à la microstructure du film métallique. Pour la première fois, des nanogaps ont été élaborés par électromigration dans des films monocristallins. Malgré l'absence de joints de grain, il est possible de former des nanogaps dans un matériau épitaxié. L'utilisation de ces matériaux permet d'obtenir des nanogaps avec une morphologie plus reproductible. Les propriétés de transports des nanogaps obtenus à partir de films polycristallins ont été caractérisées. Les caractéristiques obtenues présentent toutes des signatures particulières, attribuées à la présence d'agrégats d'or provenant de la procédure d'électromigration et/ou de polymères issus du procédé de nanofabrication. Ces résultats montrent la difficulté à réaliser des mesures à l'échelle de la molécule unique.

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Dissertations / Theses on the topic 'Microscopie de molécules uniques'

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