Academic literature on the topic 'Microscopie de fluorescence à feuille de lumière'

Introduction. La gestion optimale de la fertilisation azotée des cultures nécessite l’utilisation de méthodes qui permettent d’évaluer rapidement et avec précision le statut azoté de la biomasse aérienne en cours de saison. C’est le cas des mesures optiques sur le végétal et parmi celles-ci, les approches basées sur la mesure de la fluorescence chlorophyllienne (ChlF) des feuilles occupent une place intéressante. Les potentialités de la ChlF sont étudiées depuis plusieurs années pour détecter et quantifier différents stress biotiques et abiotiques des plantes et la ChlF peut s’envisager pour l’évaluation du statut azoté. Ces approches permettent a priori de pallier certaines limitations des méthodes souvent utilisées pour l’évaluation du statut azoté basées sur la transmission ou la réflexion de la lumière et reliées à la teneur en chlorophylle des feuilles. Littérature. Dans cette revue, deux approches basées sur la ChlF sont examinées. La première étudie la ChlF variable, ou cinétique de Kautsky, qui représente l’approche classiquement abordée par la majorité des auteurs. La seconde approche repose sur l’estimation par la ChlF de la concentration en composés foliaires métabolites de la plante, plus spécifiquement la chlorophylle et les composés phénoliques (en particulier les flavonoïdes). Pour chaque approche, les caractéristiques de la ChlF sont examinées, expliquant leurs liens et leurs applications dans l’évaluation du statut azoté des cultures. Conclusions. Parmi les deux approches analysées, l’utilisation du rapport de ChlF qui combine l’estimation de la concentration en chlorophylle et en flavonoïdes au niveau de la feuille apparait comme une approche potentiellement pertinente pour évaluer le statut azoté des cultures, ces deux concentrations étant en relation étroite avec la teneur en azote des feuilles.

La matrice extracellulaire (MEC), le sécrétome tumoraux et l‘angiogenèse tumorale sont perturbés du fait de mutations de gènes et de l’environnement hypoxique, participant à la progression tumorale. Mon travail de thèse a consisté en l’analyse de l’impact du microenvironnement sur l’agressivité de tumeurs de ccRCC et des conséquences sur la morphogenèse vasculaire, grâce au développement simultané d’un microscope de fluorescence à feuille de lumière (DSLM) et d’un modèle de culture 3-D de microtumeurs vascularisées présentant une couverture périvasculaire et dont les propriétés mécaniques sont contrôlées.J’ai d’abord caractérisé un modèle de culture 3-D de recrutement périvasculaire de cellules souches mésenchymateuses, fournissant un outil pour l’analyse des interactions cellulaires périvasculaires et tumorales avec les cellules endothéliales.J’ai ensuite caractérisé le remodelage de la MEC au cours de l’angiogenèse, et développé une approche de réticulation par la lysyl oxydase like-2 (LOXL2) d’hydrogel de collagène afin de moduler les propriétés physiques de la MEC et d’optimiser la formation de capillaires. Ayant développé ces deux outils, je me suis intéressé au rôle de l’EMT dont j’ai montré son impact synergique avec les facteurs paracrines sécrétés et mécaniques de la MEC sur l’invasion tumorale. La vascularisation des sphéroïdes a permis d’observer des interactions directes entre cellules endothéliales et tumorales, selon un mécanisme s’apparentant à la co-option vasculaire.L’ensemble de ces résultats permettra d’approfondir la compréhension du rôle du microenvironnement sur la modulation de l’angiogenèse et l’invasion tumorale induite par la mutation de VHL
The extracellular matrix (ECM), tumor secretome and tumor angiogenesis are highly dysregulated as a result of gene mutations and of the hypoxic microenvironment, promoting tumor progression. My PhD work aimed to investigate the impact of microenvironment on ccRCC tumor aggressiveness and its consequences on vascular morphogenesis, thanks to the simultaneous development of a digitally scanned laser fluorescent light-sheet microscope (DSLM) built in-house and of a 3-D vascularized microtumor model displaying perivascular coverage and controlled ECM physical properties.I first characterized a 3-D in vitro model of perivascular recruitment of mesemchymal stem cells, providing an essential tool for elucidating interactions of perivascular and tumor cells with endothelial cells.I then analyzed the ECM remodeling associated with angiogenesis, and developed a biomimetic strategy with LOXL2 for cross-linking collagen I hydrogels in order to modulate ECM physical properties and to enhance capillary formation. Once development of these tools achieved, I demonstrated the synergistic impact of EMT, paracrine factors and physical properties of the microenvironment on tumor invasion of ccRCC cell line. Vascularized tumor spheroids allowed observation of direct interactions between tumor cells and endothelial cells through a process reminiscent of vascular co-option by tumor cells.Altogether these data further understanding on the role of the microenvironment in modulation of angiogenesis and in tumor invasiveness driven by VHL mutation

L'utilisation de la microscopie de fluorescence à feuille de lumière (LSFM) est une technique de choix pour l’imagerie 3D à hautes résolutions spatiales et temporelle d'échantillons vivants. Néanmoins, en profondeur dans les échantillons biologiques, les aberrations optiques induites par l'inhomogénéité de l'indice de réfraction des tissus entraînent une perte significative de contraste et de résolution spatiale. Pour compenser ces aberrations et ainsi retrouver une image limitée uniquement par la diffraction, nous avons combiné un microscope LSFM avec de l'optique adaptative (OA) basée sur la mesure directe du front d'onde avec un analyseur de front d'onde Shack-Hartmann en source étendue (ESSH). Cette approche originale conduit à une correction efficace et rapide du front d'onde puisqu'elle ne nécessite pas d'algorithmes itératifs utilisés dans les configurations d'OA sans capteur, et à une mise en œuvre plus facile et compatible avec l'étude d'échantillons vivants, car elle ne requiert pas l'insertion invasive de billes fluorescentes ni l'utilisation complexe et coûteuse d'un laser impulsionnel pour générer une étoile guide. Cependant, les performances dans un tel instrument sont assujetties à la géométrie de l'excitation : le capteur ESSH réalise une mesure de front d’onde moyenne sur le volume fluorescent imagé par les microlentilles qui le composent et fixé par l'épaisseur de la feuille de lumière. Afin d'optimiser la mesure et la correction du front d’onde, et par conséquent le gain apporté par l’OA, il est nécessaire de minimiser l'épaisseur de la feuille de lumière à l'illumination sur tout le champ de vision du capteur ESSH, idéalement de la rendre égale à la profondeur de champ de l'objectif de collection. Ceci est possible grâce à une configuration de LSFM développée récemment, la microscopie à feuille de lumière balayée axialement, qui permet d'obtenir une feuille de lumière d'une épaisseur inférieure à 1 micromètre tout en conservant un champ de vue de 500 x 500 µm². Je présente la mise en œuvre de ce microscope à feuille de lumière à haute résolution spatiale, combiné à une boucle d'optique adaptative basée sur une mesure de front d'onde en source étendue, sa caractérisation et ses performances, ainsi que des résultats d'imagerie en profondeur sur des larves de poissons-zèbres vivantes
The use of light-sheet fluorescence microscopy (LSFM) is a technique of choice for high spatial and temporal resolution 3D imaging of living samples. However, at depth in biological samples, optical aberrations induced by tissue refractive index inhomogeneity result in a significant loss of contrast and spatial resolution. To compensate for these aberrations and thus recover an image limited only by diffraction, we have combined an LSFM microscope with adaptive optics (AO) based on direct wavefront measurement with an extended-source Shack-Hartmann wavefront sensor(ESSH). This original approach leads to efficient and rapid wavefront correction, as it does not require the iterative algorithms used in sensorless AO configurations, and to easier implementation compatible with the study of living samples, as it does not require the invasive insertion of fluorescent beads or the complex and costly use of a pulsed laser to generate a guide star. However, performance in such an instrument is subject to the geometry of the excitation: the ESSH sensor performs a wavefront measurement averaged over the fluorescent volume imaged by the microlenses of which it is composed, and fixed by the thickness of the light-sheet. To optimize wavefront measurement and correction, and consequently the gain provided by the AO, it is necessary to minimize the thickness of the light sheet at illumination over the entire field of view of the ESSH sensor, ideally to make it equal to the depth of field of the collection objective. This is made possible by a recently developed LSFM configuration, axially swept light-sheet microscopy, which achieves a light-sheet thickness of less than 1 micrometer while maintaining a field of view of 500 x 500 µm². I present the implementation of this high-spatial-resolution light-sheet microscope, combined with an adaptive optics loop based on extended-source wavefront measurement, its characterization and performance, as well as in-depth imaging results on live zebrafish larvae

Les interactions lumière-matière dans les mileux moléculaires et bio-moléculaires peuvent mener à des processus complexes où les polarisations des champs optiques se couplent aux assemblages de dipoles de transitions moléculaires. La manipulation des polarisations des champs optiques en microscopie de fluorescence peut en particulier donner accès à des modifications fines d'arrangements moléculaires. Dans ce travail de thèse nous introduisons une méthode basée sur la variation continue d'un état de polarisation d'excitation complémentée par une analyse polarisée, appliquée à la microscopie de fluorescence multi-photons. La fluorescence à deux photons polarimétrique permet d'accéder à une information statique quantitative sur la forme et l'orientation de la distribution orientationnelle moléculaire dans des membranes lipidiques artificielles, dans des cellules ou sur des composés molécluaires co-cristallins qui peuvent être fortement hétérogènes. La fluorescence à trois photons polarimétrique apporte de plus un diagnostique de cristallinité dans des cristaux de protéines, avec une forte sensibilité à leur structure et symétrie. L'implémentation expérimentale de cette technique requiert de quantifier les distortions de polarisation provenant du montage expérimental et de l'échantillon lui-même, qui sont finement analysés
Light-matter interaction in molecular and bio-molecular media can lead to complex processes where optical fields polarizations couple to an assembly of molecular transition dipoles. The manipulation of the optical fields polarization in fluorescence microscopy can in particular give access to fine changes occurring in molecular arrangements. In this PhD thesis we report a method based on a tuneable excitation polarization state complemented by a polarized read-out, applied to polarization-resolved multiphoton fluorescence microscopy. Two-photon fluorescence polarimetry allows to retrieve a quantitative information on the static molecular distribution shape and orientation in different environments such as model lipid membranes, cell membranes, and molecular inclusion compounds that can be strongly heterogeneous. Three-photon fluorescence polarimetry has been furthermore applied in bio-molecular media in order to provide a diagnostics for crystallinity in protein crystals with high sensitivity to their structure and symmetry. The experimental implementation of polarimetric multi-photon microscopy requires to quantify possible polarization distortions originating from the experimental set-up or sample itself, which are thoroughly analyzed

L'objectif de ce travail de thèse a été d'améliorer la qualité des images de sphéroïdes de cellules cancéreuses, en travaillant à la fois sur la voie de détection et sur la voie d'illumination d'un microscope à feuille de lumière. Nos travaux ont permis de montrer d'une part qu'il était possible d'améliorer la qualité des images en profondeur en utilisant une boucle d'optique adaptative, composé d'une miroir déformable et d'un analyseur de front d'onde de type Shack-Hartmann. Pour faire fonctionner cette boucle, il est nécessaire d'utiliser des objets ponctuels fluorescents classiquement nommés " étoiles guides ", sur lesquelles notre travail s'est également porté. D'autre part, nous avons comparé différentes modalités d'illumination en feuillet de lumière (excitation 1 photon versus 2 photons, faisceau Gaussien ou faisceau de Bessel. . . ). Nous avons également développé une méthode objective permettant une standardisation des résultats obtenus
The aim of our thesis work was to improve spheroid imaging quality focusing on the study and development of both illumination and detection path of the SPIM. This work shows the possibility to improve deep image quality by using an adaptive optics loop consisting of a deformable mirror and a Shack Hartmann wavefront sensor. In order to work, the loop needs fluorescent source points known as "guide stars", which was also a part of our study. Furthermore, we have also compared different light sheet illumination modalities (1 photon versus 2 photons, Gaussian beam or Bessel beam. . . ) as well as developing an automated and standardized image analysis procedure

The resolution of a conventional fluorescence microscope image is diffraction limited which achieves a spatial resolution of 200nm lateral and 500nm axial. Recently, many superresolution fluorescence microscopy techniques have been developed which allow the observation of many biological structures beyond the diffraction limit. Structured illumination microscopy (SIM) is one of them. The principle of SIM is based on using a harmonic light grid which down modulates the high spatial frequencies of the sample into the observable region of the microscope. The resolution enhancement is highly dependent on the reconstruction technique, which restores the high spatial frequencies of the sample to their original position. Common SIM reconstructions require the perfect knowledge of the illumination pattern. However, to perfectly control the harmonic illumination patterns on the sample plane is not easy in experimental implementations and this makes the experimental setup very technical. Reconstructing SIM images assuming the perfect knowledge of the illumination intensity patterns may, therefore, introduce artifacts on the estimated sample due to the misalignment of the grid that can occur during experimental acquisitions. To tackle this drawback of SIM, in this these, we have developed blind-SIM reconstruction strategies which are independent of the illumination patterns. Using the 3D blind-SIM reconstruction strategies we extended the harmonic SIM to speckle illumination microscopy which uses random unknown speckle patterns that need no control, unlike the harmonic grid patterns. For harmonic-SIM images, since incorporating some information about illumination patterns is valuable, we have developed a 3D positive filtered blind-SIM reconstruction which confines the iterative estimation of the illuminations in the vicinity of the Fourier peaks (using carefully designed Fourier filter masks) in the Fourier space. Using blind-SIM reconstruction techniques a lateral resolution of about 100nm and axial resolution of about 200nm is obtained in both speckle and harmonic SIM. In addition, to reduce the out-of-focus problem in widefield images, a simple computational technique which is based on reconstructing 2D data with 3D PSF is developed based on blind-SIM reconstruction. Moreover, to combine the functionalities of SIM and light sheet microscopy, as a proof of concept, we have developed a simple microscope setup which produces a structured light sheet illumination pattern.
La microscopie de fluorescence optique est l’un des outils les plus puissants pour étudier les structures cellulaires et moléculaires au niveau subcellulaire. La résolution d’une image de microscope conventionnel à fluorescence est limitée par la diffraction, ce qui permet d’obtenir une résolution spatiale latérale de 200nm et axiale de 500nm. Récemment, de nombreuses techniques de microscopie de fluorescence de super-résolution ont été développées pour permettre d’observer de nombreuses structures biologiques au-delà de la limite de diffraction. La microscopie d’illumination structurée (SIM) est l’une de ces technologies. Le principe de la SIM est basé sur l’utilisation d’une grille de lumière harmonique qui permet de translater les hautes fréquences spatiales de l’échantillon vers la région d’observation du microscope. L’amélioration de la résolution de cette technologie de microscopie dépend fortement de la technique de reconstruction, qui rétablit les hautes fréquences spatiales de l’échantillon dans leur position d’origine. Les méthodes classiques de reconstruction SIM nécessitent une connaissance parfaite de l’illumination de l’échantillon. Cependant, l’implémentation d’un contrôle parfait de l’illumination harmonique sur le plan de l’échantillon n’est pas facile expérimentalement et il présente un grand défi. L’hypothèse de la connaissance parfaite de l’intensité de la lumière illuminant l’échantillon en SIM peut donc introduire des artefacts sur l’image reconstruite de l’échantillon, à cause des erreurs d’alignement de la grille qui peuvent se présenter lors de l’acquisition expérimentale. Afin de surmonter ce défi, nous avons développé dans cette thèse des stratégies de reconstruction «aveugle» qui sont indépendantes de d’illumination. À l’aide de ces stratégies de reconstruction dites «blind-SIM», nous avons étendu la SIM harmonique pour l’appliquer aux cas de «SIM-speckle» qui utilisent des illuminations aléatoires et inconnues qui contrairement à l’illumination harmonique, ne nécessitent pas de controle. Comme il est utile de récupérer des informations sur l’illumination en SIM harmonique, nous avons développé une reconstruction blind-SIM tridimensionnel et filtrée qui confine l’estimation itérative des illuminations au voisinage des pics dans l’espace de Fourier, en utilisant des masques de filtre de Fourier soigneusement conçus. En utilisant des techniques de reconstruction blind-SIM, une résolution latérale d’environ 100 nm et une résolution axiale d’environ 200 nm sont obtenues, à la fois en SIM harmonique et en SIM speckle. En outre, pour réduire le problème de focalisation dans les images de champ large, une technique de calcul simple qui repose sur la reconstruction bidimensionnel de données à partir de PSF tridimensionnel est développée. En outre, afin de combiner à la fois les fonctionnalités de la SIM et de la microscopie á nappe de lumière, en tant que preuve de concept, nous avons développé une configuration de microscope simple qui produit une nappe de lumière structurée

L’objet de cette thèse est le développement méthodologique et logiciel d’outils permettant de traiter les grands volumes de données multimodales et tomographiques produits sur Nanoscopium. La technique de microscopie en rayons X durs par balayage permet l’acquisition simultanée d’information par contraste d’absorption, de phase, de diffusion et de fluorescence X. L’association des techniques de balayage avec l’infrastructure d’acquisition rapide FLYSCAN permet de proposer aux futurs utilisateurs de la ligne Nanoscopium de faire des acquisitions tomographiques multimodales. Un des principaux enjeux de cette approche est le traitement en ligne des grands volumes de données générées durant l’acquisition. Le résultat principal de cette thèse est le logiciel MMXI, dédié au traitement et à la reconstruction des jeux de données multimodales 2D et 3D. Ce logiciel intègre un algorithme dédié à la lecture de gros volumes de données, différentes fonctions de réduction de données, deux algorithmes de reconstruction de phase (intégration dans l’espace de Fourrier et technique itérative) et des algorithmes de reconstruction tomographiques (rétroprojection filtré ou itérative). L’ensemble des méthodes implémentées, des applications permettant de valider ces développements ainsi que les perspectives d’évolution sont présentées dans ce manuscrit
The subject of this thesis is the methodological and software development of tools for processing very large multimodal and tomographic datasets produced on Nanoscopium beamline in the SOLEIL synchrotron. Scanning hard X-ray imaging allows simultaneous acquisition of multimodal information, i.e. of images in which each pixel contains several types of data. Combining these scanning techniques with the FLYSCAN infrastructure, developed for fast data acquisition at Synchrotron SOLEIL, permits to perform multimodal tomographic imaging and tomographic reconstruction during routine user experiments. A main challenge of such imaging techniques is the online processing of the important amount of generated multimodal data. The main outcome of this thesis work is the MMX-I software which is dedicated to processing large 2D/3D multimodal dataset. This software includes an original algorithm for continuous reading of large data volumes, several reduction functions, two phase reconstruction algorithms (integration in Fourier space and iterative technics) and tomographic reconstruction technics (filtered back projection and iterative technics). Every implemented method as well as application allowing to validate the new developments and few evolution perspectives are presented in this thesis manuscript

Les modèles en 3D occupent une place de plus en plus importante en biologie cellulaire car ils offrent de nombreux avantages pour la compréhension des processus physiopathologiques. La microscopie à feuille de lumière et plus particulièrement, le Selective Plane Illumination Microscope (SPIM), un de ses variants, représente un outil de choix pour observer et imager avec une haute résolution spatio-temporelle ces structures assimilées à des tissus (TM). Bien que le SPIM est un outil puissant, il souffre de phénomènes tels que la diffusion, l'absorption et les aberrations optiques qui limitent la profondeur à laquelle une imagerie utile peut être réalisée. L'optique adaptative (AO), de plus en plus utilisée dans le domaine de la microscopie, est une technique capable d'améliorer la qualité d'imagerie en profondeur en corrigeant les aberrations optiques introduites par l'échantillon. Pour ce travail de thèse, j'ai implémenté dans un SPIM un système d'AO capable de corriger les aberrations dans les TMs optiquement épais tels que les sphéroïdes tumoraux multicellulaires (MCTS). Un capteur de front d'onde de type Shack-Hartmann (SHWFS) à haute sensibilité a été développé à façon afin de permettre la reconstruction du front d'onde à partir de la faible quantité de lumière produite par l'étoile guide non linéaire utilisé dans notre système. Au cours de ce travail, j'ai tout d'abord caractérisé les performances de ce SHWFS et évalué la capacité du système à corriger les aberrations dans diverses conditions, y compris à l'intérieur de TMs. J'ai observé des améliorations sans précédent de la qualité d'image en profondeur des MCTS, en termes de détails et de résolution haute-fréquence. Grâce à ces corrections, j'ai pu mettre en évidence des évènements biologiques tels que des mitoses non visibles sans corrections. Les " up converting " nanoparticules (UCNP) sont des particules de terres rares capables d'émettre une lumière d'une longueur d'onde plus courte que celle de l'éclairage lorsqu'elles sont illuminées. Les étoiles guides en UCNP sont particulièrement intéressantes en raison de la possibilité qu'elles soient excitées dans l'infrarouge proche tout en émettant de la lumière visible, ce qui réduit le photodommage produit par l'éclairage. La possibilité d'utiliser des UCNP comme étoiles guides dans des échantillons biologiques a été explorée dans cette thèse
In recent years, tissue mimics (TMs) such as microtissues, spheroids, and organoid cultures have become increasingly important in life-science research, as they provide a physiologically relevant environment for cell growth, tissue morphogenesis, and stem cell differentiation. Selective Plane Illumination Microscopy (SPIM) is one of the most prominent microscopy modalities for three-dimensional tissue imaging, and a sine qua non tool to understand cell biology in TMs. However, while SPIM is regarded as a very powerful tool for TM imaging, optical microscopy suffers from certain limitations when imaging 3D samples. Indeed, scattering, absorption and optical aberrations limit the depth at which useful imaging can be done, typically no more than 100 µm. Adaptive Optics (AO) is a technique capable of improving image quality at depth by correcting the optical aberrations introduced by the sample which is seeing increasing use in fluorescence microscopes. For this thesis, I have incorporated a wavefront sensor AO scheme to SPIM, able to correct aberrations in optically thick TMs such as multi-cellular tumor spheroids (MCTS). Due to the low amount of light produced by non-linear guide stars such as the one used in our system, a custom high-sensitivity Shack-Hartmann wavefront sensor (SHWFS) was developed for our needs. In this work, I characterize the performance of this SHWFS and the ability of our system to correct aberration in various conditions, including inside TMs. I show unprecedented image quality improvements for in-depth imaging of MCTS, in regard of high-frequency detail and resolution. This allowed us to identify biologically relevant features at depths inaccessible to conventional SPIM. Up-converting nanoparticles (UCNP) are rare-earth based particles that are able to undergo photon up-conversion when illuminated, emitting light of a shorter wavelength than that of the illumination. Guide stars made from UCNP are especially attractive due to the possibility of them being excited in the near-infrared while emitting visible light, reducing photodamage produced by the illumination light. The viability of using UCNP as guide stars in biological samples in explored in this thesis

Les suspensions concentrées et les verres colloïdaux forment une classe de matériaux intéressante d'un point de vue de la physique mais également des applications. Ces matériaux présentent des comportements rhéologiques remarquables comme la présence d'un seuil d'écoulement, des phénomènes de glissement ou encore des dynamiques de relaxation très lentes et du vieillissement. Les techniques rhéologiques classiques ne permettant pas à elles seules de remonter à l'origine microscopique de ces phénomènes, il est nécessaire de les associer à des techniques permettant de sonder la structure et la dynamique à des échelles très locales. Dans ce travail nous développons et mettons en œuvre une série d'outils complémentaires utilisant la diffusion multiple de la lumière ou la microscopie par fluorescence et nous les appliquons à l'étude de la dynamique de suspensions concentrées de microgels polyélectrolytes au voisinage de l'équilibre, en cours de vieillissement ou en écoulement. Les principaux résultats portent sur la mesure des propriétés viscoélastiques linéaires dans une fenêtre de fréquences comprises entre des temps browniens et plusieurs heures, sur le vieillissement physique, et sur le rôle des parois dans la structuration des écoulements.

Dans ce travail de thèse a été réalisé la synthèse de micro- et nano-particules de polyuréthane en milieux aqueux par les techniques de polyaddition en suspension et de polyaddition en miniemulsion sans catalyseur (procédés de synthèse économiques et respectueux de l'environnement). Le polyuréthane a été synthétisé à partir d'un polyol d'origine naturel et biodégradable. Un principe actif modèle (lévofloxacin) a été encapsulé dans les nano- et micro-particules. L'efficacité d'encapsulation et le profil de libération de ce principe actif ont été déterminés par la spectroscopie de fluorescence. La morphologie des particules a été analysée par MEB et MET et la formation du polyuréthane a été confirmée par FTIR. La technique de diffusion de la lumière a été utilisée pour déterminer la taille, la morphologie des particules et pour suivre la cinétique de la dégradation enzymatique de ces particules dans différents milieux (acides et basiques).