Dissertations / Theses on the topic 'Microscope multiphotonique'

La microscopie multiphotonique est devenue un outil essentiel pour étudier l'activité fonctionnelle de la souris mais son application à des animaux plus grands se heurte à plusieurs obstacles. Il serait particulièrement avantageux de pouvoir l'appliquer aux macaques, car ils représentent un modèle animal de choix pour comprendre les mécanismes neuronaux des fonctions cognitives de haut niveau, telles que l'attention, la mémoire et la conscience. L'un des principaux facteurs limitant à l'imagerie chez les grands animaux est la dure-mère. Cette couche de tissu épaisse et opaque protège le cerveau, mais elle est si épaisse chez les grands animaux qu'elle entrave l'imagerie. Elle est donc couramment enlevée mais cela conduit à une préparation hautement invasive et instable. L'objectif principal de ce travail est d'étudier la possibilité d'enregistrer l'activité fonctionnelle du cortex du macaque rhésus à travers la dure-mère naturelle.Une installation de microscopie multiphotonique a été conçue avec des chemins optiques de microscopie à deux et trois photons pour pouvoir faire des enregistrements sur des primates non humains vigiles. La fréquence de répétition du laser est de 2MHz, ce qui permet une profondeur d'imagerie maximale à l'intérieur du cortex de 520µm à 960nm et 715µm à 1300nm en la présence d'une dure-mère de 120µm d'épaisseur à la surface. Le champ de vision est de 620x630µm² avec une fréquence d'acquisition de 7,8Hz en utilisant un balayage unidirectionnel. En plus de cette installation, des implants chirurgicaux ont été développés pour une imagerie stable sur le long-terme de sujets vigiles.En utilisant une étude ex vivo de la dure-mère d'un macaque rhésus, les aberrations optiques induites par celle-ci ont été étudiées en mesurant la diminution de la résolution spatiale du microscope pour une épaisseur variable de dure-mère. Ceci révèle qu'elle n'a pas d'impact significatif sur la résolution pour une épaisseur allant jusqu'à 150µm à 1300nm. La longueur d'atténuation effective de la dure-mère naturelle est estimée à 56.5±10.1µm à 960nm et 80.7±5.3µm à 1300nm. Ces valeurs sont utilisées pour modéliser la profondeur maximale d'imagerie en fonction de la fréquence de répétition du laser et de l'épaisseur de la dure-mère.Ce modèle est ajusté et validé à l'aide de données in vivo provenant de deux primates non humains. La longueur d'atténuation effective de la dure-mère naturelle et d'une repousse de tissu après une durectomie (appelée "néomembrane") sont étudiées. Des enregistrements fonctionnels ont été réalisés chez la souris et prétraités avec Suite2P. Les paramètres d'injection virale ont été testés chez trois macaques et nous avons enregistré l'activité structurelle et fonctionnelle de neurones pour l'un d'eux au moment de l'étude.Enfin, la comparaison entre l'utilisation de la microscopie à deux ou trois photons pour l'étude du primate non humain est discutée.En conclusion, nous avons mis en place et optimisé un microscope multiphotonique pour l'imagerie vigile et à long-terme du cortex de primates non-humains et montré qu'il était possible d'enregistrer le cortex jusqu'à plus de 700µm de profondeur (ce qui correspond aux couches L2/L3) tout en gardant la dure-mère naturelle en place
Multi-photon microscopy has become a standard technique to study the structural and functional activity in mice but it faces obstacles to be applied in larger animals. It would be particularly advantageous to be able to apply it to macaque monkeys, as they are the animal model of choice to understand the neural mechanisms of high-level cognitive functions such as selective attention, working memory and consciousness. One of the main limiting factors for imaging in larger animals is the dura mater. This tough and opaque layer of tissue protects the brain but is so thick in larger animals that it obstructs imaging. It is therefore commonly removed but this leads to a highly invasive and unstable preparation. The main aim of the current work is to investigate the possibility to record functional activity from the cortex of the rhesus macaque monkey through the natural dura.A multi-photon microscopy setup has been designed with a two-photon and a three-photon microscopy optical paths to record from awake macaque monkeys. The repetition rate of the laser is 2MHz which allows a maximum imaging depth inside the cortex of 520µm at 960nm and 715µm at 1300nm with an additional 120µm-thick layer of dura mater at the surface. Resonance-galvo scanning is used to allow a maximal frame rate of 15.6Hz at a field of view of 620x630µm². In addition to the setup, surgical implants have been developed for long-term and awake imaging.Using an ex vivo study of dura mater from a macaque monkey, the induced optical aberrations are studied by measuring the decrease in spatial resolution of the setup for a varying thickness of dura mater. This reveals that it has no significant impact on the spatial resolution for a thickness up to 150µm at 1300nm. The effective attenuation length of the dura mater is estimated to be 56.5±10.1µm at 960nm and 80.7±5.3µm at 1300nm. These measurements are used to model the maximum imaging depth that can be reached according to the repetition rate of the laser and the thickness of the dura.This model is adjusted and validated using in vivo data from two non-human primates. The effective attenuation length of the natural dura mater and of a regrowth of tissue following a durectomy (called a 'neomembrane') are investigated. Functional recordings have been performed in mice and preprocessed using Suite2P. Viral injection parameters have been tested in three macaque monkeys and we have so far recorded the in vivo structural and functional activity of neurons in one. Finally, the comparison between the use of two- and three-photon microscopy to study non-human primates is discussed. In conclusion, we have set up and optimized a multi-photon microscope for long-term awake imaging of the cortex of non-human primates and shown that it was possible to record down to over 700µm into the cortex (which corresponds to the layers L2/L3) while imaging through the natural dura mater or a neomembrane

Un des plus grands défis de la neuroscience moderne pour parvenir à comprendre et diagnostiquer les maladies du cerveau est de déchiffrer les détails des interactions neuronales dans le cerveau vivant. Pour ce faire, on doit être capable d'observer des populations de cellules vivantes dans leur matrice d'origine avec une bonne résolution spatiale et temporelle. La microscopie à deux photons se prête bien à cet exercice car elle permet d'exciter des fluorophores à de grandes profondeurs dans les tissus biologiques et elle offre une résolution spatiale de l'ordre du micron. Malheureusement, la très bonne résolution tridimensionnelle diminue la résolution temporelle, car l'effet de sectionnement optique causé par la faible profondeur de champ du microscope nous oblige à balayer les échantillons épais une multitude de fois avant de pouvoir compléter l'acquisition d'un grand volume. Dans ce projet de doctorat, nous avons conçu, construit et caractérisé un microscope à deux photons avec une profondeur de champ étendue afin de faciliter l'imagerie fonctionnelle de neurones dans un échantillon épais. Pour augmenter la profondeur de champ du microscope à deux photons, nous avons modifié le faisceau laser entrant dans le système optique afin de générer une aiguille de lumière, orientée axialement, dans l'échantillon au lieu d'un point. Nous modifions le faisceau laser avec un axicon, une lentille en forme de cône qui transforme le faisceau gaussien en un faisceau quasi non-diffractant, de type Bessel-Gauss. Le faisceau d'excitation conserve donc la même résolution transverse à différentes profondeurs dans l'échantillon, éliminant le besoin de balayer l'échantillon à répétition afin de sonder un volume complet. Dans cette thèse, nous démontrons que le microscope à grande profondeur de champ fonctionne effectivement tel que nous l'avons conçu et nous l'utilisons pour faire de l'imagerie calcique dans un réseau tridimensionnel de neurones vivants. Nous présentons aussi les différents avantages de notre système par rapport à la microscopie à deux photons conventionnelle.
One of the greatest challenges of modern neuroscience that will lead to a better understanding and earlier diagnostics of brain sickness is to decipher the details of neuronal interactions in the living brain. To achieve this goal, we must be capable of observing populations of living cells in their original matrix with a good resolution, both spatial and temporal. Two-photon microscopy offers the right tools for this since it presents with a spatial resolution in the order of the micron. Unfortunately, this very good three-dimensional resolution lowers the temporal resolution because the optical sectioning caused by the microscope's small depth of field forces us to scan thick samples repeatedly when acquiring data from a large volume. In this doctoral project, we have designed, built and characterized a two-photon microscope with an extended depth of field with the goal of simplifying the functional imaging of neurons in thick samples. To increase the laser scanning microscope's depth of field, we shaped the laser beam entering the optical system in such a way that a needle of light is generated inside the sample instead of a spot. We modify the laser beam with an axicon, a cone-shaped lens that transforms a gaussian beam into a quasi non-diffractive beam called Bessel-Gauss beam. The excitation beam therefore maintains the same transverse resolution at different depths inside the sample, eliminating the need for many scans in order to probe the entire volume of interest. In this thesis, we demonstrate that the extended depth of field microscope effectively works as we designed it, and we use it to image calcium dynamics in a three-dimensional network of live neurons. We also present the different advantages of our system in comparison with standard two-photon microscopy.

Cette thèse porte sur l'utilisation et le développement de techniques de microscopie multiphotonique pour l'imagerie d'échantillons biologiques humains. Une plateforme d'imagerie multiphotonique utilisant les contrastes non linéaires sans marquage tels que la fluorescence à deux photons, la génération de seconde harmonique, et les mécanismes Raman cohérent (CARS et SRS) a été conçue et développée au cours de cette thèse, et les travaux expérimentaux suivant deux axes de recherche principaux sont présentés.Dans une première partie , l'imagerie tridimensionnelle et sans marquage des muqueuses du système digestif humain est comparée aux images histologiques classiques avec marquages colorimétriques. Nous montrons que les techniques multiphotoniques utilisées permettent de reconstituer la structure et de discerner les différents éléments moléculaires présents dans les tissus dans le but d'obtenir une caractérisation des zones touchées par le développement de tumeurs cancéreuses
This thesis focuses on multiphotonic microscopy techniques development and use in order to image human biological samples. A multiphotonic imaging setup using label-free nonlinear contrasts mechanisms such as two-photons fluorescence, second harmonic generation, or stimulated Raman effect (CARS or SRS) has been designed and developped during this PhD, and I present the experimental work in two main research topics.In a first part, we compare label-free 3D imaging with classic histological imaging using colorimetric labels in human digestive system. We show that multiphotonic technics allow to reconstruct the organization and discern the molecular compounds inside the tissues, in order to get a caratérization of the cancerous tumors developpement.The second part is related to the application of our multimodal setup to the quantitative study of real active molecular compounds real time penetration into in vivo human skin. We show that multiphotonic microscopy make possible to mesure active molecules in depth 3D concentration in the skin in order to understand transcutaneous diffusion mechanisms in cosmetic and pharmacological applications

Le développement de nouveaux outils et de nouvelles techniques pour la biologie et la médecine a toujours été un moteur pour la recherche en microscopie. Les premiers microscopes permirent à Antoine Von Leeuwenhoek en 1677 de découvrir les bactéries, les spermatozoïdes et les globules rouges et aujourd'hui nous cherchons à visualiser les processus intracellulaires, l'interaction des protéines, l'interaction des cellules dans les tissus... Chaque année de nouvelles techniques apparaissent pour voir plus petit, plus spécifique, plus physiologique. Le laboratoire d'optique et biosciences dans lequel j'ai effectué ma thèse s'intéresse plus particulièrement aux techniques de microscopie multiphoton. Ce type de microscopie, qui re- pose sur les interactions non linéaires entre la matière et la lumière, est principalement utilisé aujourd'hui pour suivre des marqueurs fluorescents dans les tissus grâce au processus de fluo- rescence sous excitation à deux photons. En cela, elle sert à suppléer la microscopie confocale pour visualiser des phénomènes à des profondeurs de pénétration qui lui sont inaccessibles, et permet ainsi de travailler sur l'ensemble d'un tissu. Toutefois, la microscopie multiphoton ne se borne pas à la fluorescence sous excitation à 2 photons ; elle donne aussi accès à des processus non linéaires comme la génération d'harmoniques ou l'émission Raman anti-Stockes stimulée. Ces interactions non linéaires sont encore peu utilisées en biologie et font l'objet de recherches dans notre laboratoire. L'un des processus non linéaires étudiés au laboratoire est la génération de second harmo- nique (SHG). Celle-ci a été mise en évidence en 1961 par P. A. Franken[1] dans des cristaux non linéaires et s'utilise couramment pour doubler la fréquence des lasers. En 1979, ce proces- sus a été appliqué en biologie par Samuel Roth et Isaac Freund[2] sur des tendons de rat où l'organisation du collagène permet d'obtenir l'effet non linéaire. Presque trente années se sont écoulées depuis cette expérience, mais la génération de second harmonique par le collagène reste mal comprise. De plus, même si de nombreuses études ont montré le potentiel de cette technique, elle reste peu utilisée par les biologistes. Cette thèse, sous la direction de Marie-Claire Schanne-Klein, veut répondre à plusieur questions : - Quel est le rôle de l'organisation submicrométrique du collagène dans la génération du signal de second harmonique ? - Que peut apporter cette technique dans la visualisation du collagène par rapport aux autres techniques déjà existantes ? - Quelle est la pertinence de cette technique pour répondre à des problématiques biolo gique ? Nous nous sommes focalisés sur la fibrose qui est une accumulation anormale de collagèn dans les tissus. Une thèse précédente réalisée dans notre laboratoire par Ana-Maria Pena avai déjà montré le potentiel de la génération de second harmonique pour évaluer la gravité d fibroses pulmonaires induites par la bléomycine. Toutefois, ces études réalisées en collabora tion avec le service de pneumologie de l'hôpital Bichat sont restées à l'état de démonstration de principe. Nous avons alors engagé une collaboration étroite avec une équipe de néphro logues composée de Pierre Louis Tharaux, Monica Hernest et Cécile Fligny (Cardiovascula Research Center Inserm Lariboisière INSERM U689, France) qui travaillent sur les phéno mènes de fibroses dans le rein, et nous avons appliqué la microscopie par génération de second harmonique à cette problématique biomédicale. Dans ce manuscrit, le premier chapitre introduit les notions biologiques sur le collagèn et la fibrose nécessaires à la compréhension de la suite. Le deuxième chapitre présente le diverses techniques de visualisation du collagène, insiste sur les principes et le dispositif d microscopie multiphoton et enfin développe une modélisation du signal de génération de se cond harmonique par le collagène observé en microscopie. Nous proposons ensuite dans l troisième chapitre une méthodologie pour quantifier la fibrose rénale, que nous validons su un modèle murin de fibrose rénale. Enfin, le dernier chapitre est consacré à l'application d notre méthodologie à diverses problématiques biologiques liées à la fibrose rénale.

Les techniques de microscopie multiphotonique s'imposent de plus en plus en biologie. Ces techniques permettent d'accéder à une profondeur d'imagerie inégalée dans les tissus vivants tout en les préservant des effets de photo-toxicité. Cette profondeur d'imagerie dépend en outre à la fois de la sensibilité des marqueurs (à l'origine de la fluorescence ou de la génération de seconde harmonique) et des performances optiques du microscope. Le travail présenté dans ce mémoire s'articule autour de ces deux problématiques. Dans une première partie, nous caractérisons de nouveaux marqueurs membranaires du point de vue de leurs propriétés optiques non linéaires et de leur organisation au sein de phospholipides. Nous présentons ensuite le développement d'un microscope multiphotonique prototype dont les performances en terme de profondeur d'imagerie notamment sont étudiées expérimentalement et à partir de simulations Monte Carlo.

Les propriétés photoniques des tissus durs dentaires nous ont permis d’étudier l’email et la dentine a un niveau moléculaire (in vitro) en utilisant des techniques de microscopie optique non linéaires. La microscopie confocale Raman est technique d’imagine de haute résolution permettant d’analyse d’échantillon sans préparation spécifique ni marquage. Cette méthode nous a permis de reconstituer une cartographie de la réticulation du collagène et de la cristallinité au niveau de la jonction émail-dentine et cela avec une résolution spatiale non atteinte jusque-là. Cette analyse chimique de la jonction émail-dentine a permis de redéfinir la largeur de cette zone de transition. Cette largeur est nettement supérieure à celles proposées par les études précédentes. Par ailleurs, l’étude portant sur les changements de fluorescence intrinsèque entre les tissues dentaires sains et cariés suggèrent l’implication de la protoporphyrin IX et de la pentosidine dans l’expression de la fluorescence rouge des tissus cariés. La microscopie multiphotonique quant à elle nous a permis de détecter la lésion carieuse et de suivre son développement en utilisant la génération de seconde harmonique (SHG) et la fluorescence par excitation à deux photons (2PEF). Nos études ont démontré la validité du ratio SHG/2PEF comme paramètre fiable pour la détection de la lésion carieuse. Les études proposées par cette thèse montrent le potentiel des propriétés photoniques de l’émail et de la dentine en utilisant les microscopies Raman et multiphotoniques dans l’étude de ces tissus au niveau moléculaire. Cela offre de nouvelles perspectives en recherche et en applications cliniques
Photonic properties of dental hard tissues allowed us to proceed to in vitro analysis of enamel and dentin on a molecular level. Confocal Raman microscopy has been used to produce a mapping of collagen cross-link and crystallinity of human dentin–enamel junction (DEJ) with a spatial resolution not achieved up to now. The method is a non-invasive, label-free and a high spatial resolution imaging technique. This chemical analysis of DEJ led us to redefine a wider width of this transition zone and advance our understanding of dental histology. A study on the intrinsic fluorescence changes of sound and carious tissues using conventional fluorescence microscopy suggests the involvement of protoporphyrin IX and pentosidine in the fluorescence red-shift observed in carious tissues. Multiphoton microscopy allowed to detect nonlinear optical signal changes during caries process using second harmonic generation (SHG) and two-photon excitation fluorescence (2PEF). Our studies led us to propose the ratio SHG/2PEF as valuable parameter to monitor caries lesion. Collectively, advances described in this thesis show the potential of photonic properties of enamel and dentin using Raman and multiphoton microcopies for molecular investigations on sound as much as on carious tissues. It opens new perspective in dental research and clinical applications

Les techniques d'imagerie optique basées sur des effets non linéaires sont de plus en plus appliquées en biologie. La microscopie multiphotonique fournit une information micrométrique avec une profondeur d'imagerie inégalée dans les tissus vivants, tout en les préservant des effets phototoxiques. Les différentes sources de contrastes endogènes des tissus biologiques permettent de visualiser sans marquage l'émission de fluorescence excitée à deux photons (TPEF), et la génération de seconde harmonique (SHG) de molécules non centrosymétriques dans un milieu non centrosymétrique, en particulier certaines protéines fibrillaires. Ces contrastes permettent des applications dans des domaines comme l'embryologie, les neurosciences ou encore la cancérologie. La microscopie multiphotonique apparaît donc comme un outil bien adapté à l'étude des protéines fibrillaires. Nous présentons dans un premier temps la technique de microscopie multiphotonique, les deux contrastes mis en jeu, ainsi qu'un outil reposant sur la modulation de polarisation de la lumière excitatrice pour la caractérisation du collagène et de la myosine. Nous présentons également une étude préliminaire sur l’imagerie du muscle squelettique bovin. Dans un second temps, nous utilisons la spécificité de la SHG pour le collagène pour développer une méthode de "quantification" du collagène impliqué dans la fibrose du foie. Après une analyse détaillée de notre méthode de scoring SHG, elle est évaluée et comparée aux méthodes usuelles de caractérisation de la fibrose. Cette méthode basée sur l'utilisation d'objectifs à faible NA, pourrait être utilisée en endoscopie SHG, quand les biopsies virtuelles seront possibles
Optical imaging techniques based on nonlinear effects of photon-matter interactions, are increasingly applied in biology. Multiphoton microscopy provides an in-depth information at a micrometric scale in tissues, with low photo-toxicity. Moreover, the various sources of endogenous contrast in biological tissues allow to visualize, without any staining, the two photon excited fluorescence emission (TPEF), and second harmonic generation (SHG) of non-centrosymmetric molecules in non-centrosymmetric media, such as fibrillar proteins like collagen and myosin. These two endogenous contrasts enable a wide range of applications along with embryology, neuroscience or oncology. In this context, multiphoton microscopy appears as a promising tool for the study of fibrillar proteins present in biological tissues. In this document we first present the basis of multiphoton microscopy, the two contrasts involved in this imaging technique, and a tool based on the modulation of polarization of the exciting laser for the characterization of two fibrillar proteins, collagen and myosin. We also present a preliminary study of cattle skeletal muscle by multiphoton microscopy. In a second step, we use the specificity of SHG for imaging collagen to develop a method of scoring of fibrillar collagen deposits in human liver fibrosis. After an in-depth study of our collagen SHG scoring method, it is evaluated and compared to usual technics used to characterise fibrosis. This method which uses low NA lenses, could be extended to SHG endoscopes, when virtual biopsies will be possible

La microscopie à balayage laser est limitée en résolution par la limite de diffraction de la lumière. Plusieurs méthodes de superrésolution ont été développées depuis les années 90 pour franchir cette limite. Cependant, la superrésolution est souvent obtenue au prix d'une grande complexité (laser de haute puissance pulsé, temps d'acquisition long, fluorophores spécifiques) ainsi que des limitations dans le type d'échantillon observé (observation en surface uniquement). Dans certains cas, comme pour l'illumination structurée et la microscopie SLAM, une amélioration en résolution plus modeste est obtenue, mais avec une complexité et des limites d'utilisation fortement réduites par rapport aux autres méthodes de superrésolution. Les mé- thodes que nous proposons ici sont des méthodes d'augmentation de résolution qui visent à minimiser les contraintes expérimentales et à garder un maximum des avantages des techniques d'imagerie conventionnelles. Dans les cas que nous avons étudiés, les méthodes proposées sont basées sur la microscopie confocale. Nous allons montrer dans un premier temps qu'il est possible d'augmenter de 20% la résolution d'un microscope confocal en changeant le faisceau laser utilisé pour l'excitation par un faisceau Bessel-Gauss tout en ayant un sténopé de la bonne taille (soit 1 Airy Unit). Les avantages de la méthode proposée résident dans sa simplicité d'installation et d'utilisation et sa compatibilité avec d'autres méthodes d'augmentation de résolution. Nous avons démontré les capacités d'augmentation de résolution des faisceaux Bessel-Gauss théoriquement puis exp érimentalement sur des échantillons de nano-sphères et de tissus biologiques obtenant ainsi une résolution de 0.39. Nous avons également montré que l'amélioration en résolution des faisceaux Bessel-Gauss donne une analyse statistique de la colocalisation avec un taux plus faible de faux positifs. Nous avons utilisé des faisceaux Bessel-Gauss de différents ordres pour améliorer la méthode de la microscopie SLAM et ainsi obtenir une résolution descendant à 0.17 (90 nm avec une longueur d'onde de 532 nm). La méthode proposée est entièrement basée sur la microscopie confocale et seul un module permettant de changer le faisceau laser doit être ajouté au montage. Dans un second temps, nous proposons une méthode permettant de bénéficier au maximum des propriétés de la déconvolution pour augmenter la résolution de la microscopie confocale. Pour cela, nous avons utilisé différents modes laser pour l'acquisition d'images et ces images sont utilisées comme données d'entrée pour la déconvolution (avec des mesures des PSF respectives). Les faisceaux laser utilisés apportent ainsi des informations complémentaires à l'algorithme de déconvolution permettant ainsi d'obtenir des images avec une résolution encore meilleure que si une simple déconvolution (utilisant le même algorithme) était utilisée sur l'image confocale. Par la suite, nous avons changé les faisceaux laser par des faisceaux Bessel-Gauss pour augmenter davantage l'ecacité de la déconvolution. Encore une fois, la méthode proposée est entièrement basée sur la microscopie confocale et seul un module permettant de changer le faisceau laser doit être ajouté au montage. Enfin, nous proposons d'aborder une méthode de reconstruction en trois dimensions par tomographie basée sur des projections obtenues en microscopie à deux photons utilisant les faisceaux Bessel-Gauss. En focalisant des faisceaux Bessel-Gauss à angle en microscopie deux photons, on obtient une série de projections utilisables pour une reconstruction tomographique. Le but est de tester la faisabilité de la méthode qui permettrait de reconstruire un volume, en nécessitant moins d'images que dans le cas d'une acquisition plan par plan, en microscopie deux photons classique.
Laser scanning microscopy is limited in lateral resolution by the diffraction of light. Superresolution methods have been developed since the 90s to overcome this limitation. However, superresolution is generally achieved at the cost of a greater complexity (high power lasers, very long acquisition times, specic uorophores) and limitations on the observable samples. In some cases, such as Structured Illumination Microscopy (SIM) and Switching Laser Modes (SLAM), a more modest improvement in resolution is obtained with a reduced complexity and fewer limitations. We propose here methods which improve the resolution while minimizing the experimental constraints and keeping most of the advantages of classical microscopy. First, we show that we can improve by twenty percent the resolution of confocal microscopy by using Bessel-Gauss beams, and by having the right pinhole size (1 Airy Unit), compared to conventional Gaussian beam based confocal microscopy. The advantages of this strategy include simplicity of installation and use, linear polarization compatibility, possibility to combine it with other resolution enhancement and superresolution strategies. We demonstrate the resolution enhancement capabilities of Bessel-Gauss beams both theoretically and experimentally on nano-spheres and biological tissue samples with a resolution of 0.39. We achieved these resolutions without any residual artifacts coming from the Bessel-Gauss beam side lobes. We also show that the resolution enhancement of Bessel-Gauss beams leads to a better statistical colocalization analysis with fewer false positive results than when using Gaussian beams. We have also used Bessel-Gauss beams of different orders to further improve the resolution by combining them in SLAM microscopy achieving a resolution of 0.17 (90 nm with a wavelength of 532 nm). In a second step, we propose a method to improve the resolution of confocal microscopy by combining different laser modes and deconvolution. Two images of the same eld are acquired with the confocal microscope using different laser modes and are used as inputs to a deconvolution algorithm. The two laser modes have different Point Spread Functions and thus provide complementary information leading to an image with enhanced resolution compared to using a single confocal image as input to the same deconvolution algorithm. By changing the laser modes to Bessel-Gauss beams, we were able to improve the effciency of the deconvolution algorithm and to obtain images with a residual Point Spread Function having a width smaller than 100 nm. The proposed method requires only a few add-ons to the classic confocal or two photon microscopes. Finally, we propose a three dimensional tomography reconstruction method using Bessel-Gauss beams as projection tools in two-photon microscopy. While focussing Bessel-Gauss beams at an angle in two photon microscopy, we can obtain a series of projections that can be used for tomography reconstruction. The aim is to test the practicality of the methods allowing to reconstruct a volume while using fewer images than plane by plane acquisitions as in classic two-photon microscopy.

-------------------------------Abstract--------------------------------Since the prediction by Maria Göppert-Mayer in the thirties of the possibility for a fluorescent molecule to be simultaneously excited by multiple photons and, more recently, the development of pulsed lasers, multiphoton microscopy has gradually evolved to finally become one of the most used fluorescent imaging techniques for the studies of thick scattering tissues or for in vivo observations of animals. Either for neurological, physiological or morphological studies, the non invasiveness and the limitation of the excited volume to the focal volume have made this fluorescence microscopy technique an essential tool for biologists.However, in a world where the biological studies always require better microscopes and where there is always a need for the spatial resolution to be improved, it is essential to offer techniques allowing to obtain a better resolution in the three dimensions and to access resolution beyond the diffraction limit defined by Ernst Abbe more than a century ago. In this thesis, the saturated excitation of fluorescence technique is adapted to multiphoton microscopy. This method achieves super-resolved images by temporally modulating the excitation laser-intensity and by demodulating the higher harmonics from the saturated fluorescence signal. As a proof of principle, the improvement of the lateral and axial resolution has been measured on a sample of fluorescent microspheres. While the third harmonic already provides an enhanced resolution, we show in this work that a further improvement can be obtained with an appropriate linear combination of the demodulated harmonics.In the end, a near twofold improvement of the resolution has been obtained in the lateral but also in the axial directions. This improvement is in agreement with the estimated resolution improvement predicted in the theoretical and the mathematical analysis of the technique carried out in this work.We also present in vitro imaging of fluorescent microspheres incorporated in HeLa cells. Enhancements of lateral and axial resolution has been observed, showing that this super-resolution technique performs well in biological samples.Finally, the strengths and weaknesses of the technique have also been analysed and detailed to see in which niche in the world of biological imaging this method can find its place. To this end, its characteristics are compared to other super-resolution and super-localisation techniques that have been previously studied in this thesis.It points out that the imaging depth, the non invasiveness and the relatively low illumination power on the samples but also the limitation of the excited volume in multiphoton microscope coupled with the simple and cost-effective implementation as well as the relatively low illumination power on the sample used in the saturated excitation technique make this method an excellent candidate for deep in vivo studies trough scattering tissue like the skin.
-----------------------Résumé-----------------------Depuis la prédiction de Maria Göppert-Mayer dans les années 30 de la possibilité pour une molécule fluorescente d'être excitée simultanément par plusieurs photons et, plus récemment, depuis le développement des lasers pulsés, la microscopie multiphotonique s'est peu à peu développée pour finalement s'imposer aujourd'hui comme un des outils d'observation par fluorescence les plus performants pour les études de tissus épais diffusants, ou encore pour l'observation in vivo d'animaux. Que ce soit pour des études neurologiques, physiologiques ou morphologiques, l'aspect non invasif et la limitation du volume excité au volume focal ont rendu cet outil de microscopie indispensable aux biologistes.Cependant, dans un monde où les études biologiques nécessitent toujours de meilleurs microscopes et où la résolution spatiale en particulier doit toujours être améliorée, il convient de proposer des techniques permettant d'obtenir une meilleure résolution dans les trois dimensions et d'aller au-delà de la limite de diffraction définie par Ernst Abbe il y a plus d'un siècle.Dans cette thèse, la technique de saturation de l'excitation de la fluorescence est adaptée à la microscopie multiphotonique. Cette méthode permet d'obtenir des images de superrésolution en modulant temporellement l'intensité laser d'excitation et en démodulant les harmoniques supérieures présentes dans le signal saturé de fluorescence. La démonstration de principe sur des microsphères fluorescentes a été réalisée montrant une amélioration de la résolution latérale et axiale. Alors que l'utilisation de la troisième harmonique produit déjà une meilleure résolution, ce travail de thèse montre qu'une amélioration supplémentaire peut être obtenue en utilisant une combinaison linéaire particulière des harmoniques démodulées.Au final, un quasi doublement de la résolution a pu être observé tant dans les directions latérales que dans la direction axiale. Cette amélioration correspond à l'amélioration prédite dans l'analyse théorique et mathématique réalisée également dans ce travail.De plus, le passage aux études in vitro a été réalisé avec succès en observant des microsphères fluorescentes incorporées dans des cellules HeLa. Des améliorations de la résolution latérale et axiale ont également été observées montrant que cette technique de superrésolution peut être appliquée à l'étude d'échantillons biologiques. Les forces et les faiblesses de cette méthode sont également analysées et détaillées afin de voir dans quel créneau d'études biologiques la technique de saturation de l'excitation de fluorescence pourrait se faire une place. A cette fin, ses caractéristiques sont comparées aux autres méthodes de superrésolution et de superlocalisation détaillées dans la première partie de ce travail.Il en resort que l'importante profondeur d'imagerie, l'aspect non invasif et la limitation du volume excité de la microscopie multiphotonique couplés à la simplicité d'implémentation et les relativement faibles puissances utilisées pour saturer l'excitation font de cette technique un excellent candidat pour des études in vivo dans des zones en profondeur dans des milieux diffusants comme la peau.
Doctorat en Sciences de l'ingénieur et technologie
info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les avancées technologiques concernant la microscopie ont permis la création d'une grande variété de systèmes optiques dédiés à l'investigation du comportement dynamique des cellules in vivo. En neuroscience, le dé réside dans l'observation des interactions entre des neurones marqués d'un fluorophore qui sont situés à différentes profondeurs dans le tissu. Afin d'y arriver, il est nécessaire de balayer l'échantillon sur plusieurs plans transverses pour couvrir entièrement son volume. Puisque cette procédure diminue la résolution temporelle, il a été proposé d'utiliser un axicon pour augmenter la profondeur de champ du microscope et réduire le nombre de balayages à effectuer. Cependant, l'axicon est di cile à fabriquer et possède généralement des défauts sur la pointe du cône, dégradant ainsi la qualité de la composante. En vue de remplacer l'axicon par une autre composante optique dont la fabrication n'entraîne pas de défaut, il a été envisagé d'utiliser une lentille à gradient d'indice couplée à une lentille simple (GRIN-axicon). Des simulations ont montré que le GRIN-axicon a le potentiel de produire un faisceau Bessel de bonne qualité. Toutefois, les tests expérimentaux ont été très brefs et il est nécessaire d'investiguer davantage le comportement de cette nouvelle composante en laboratoire. L'objectif de ce projet de maîtrise est donc de concevoir, fabriquer et caractériser un GRIN-axicon pour une application en microscopie multiphotonique. Comme objectif secondaire, on souhaite approfondir la théorie reliée à cette nouvelle composante.
Technological advances in microscopy have led to the creation of a wide variety of optical systems dedicated to the investigation of the dynamic behavior of cells in vivo. In neuroscience, the challenge lies in the observation of interactions between labeled neurons located at different depths in the tissue. In order to achieve this, it is necessary to scan the sample on several transverse planes to fully cover its volume. Since this procedure decreases the temporal resolution, it has been proposed to use an axicon to increase the depth of field of the microscope and reduce the number of scans to be performed. However, the axicon is di cult to manufacture and usually has defects on the tip of the cone, thus degrading the quality of the component. In order to replace the axicon by another optical component easier to manufacture, the use of a graded index lens coupled to a single lens (GRIN-axicon) was considered. Simulations have shown that the GRIN-axicon has the potential to produce a good quality Bessel beam. However, experimental tests have been very limited and it is necessary to further investigate the behaviour of this new component in the laboratory. The objective of this master's project is therefore to design, manufacture and characterize a GRIN-axicon for application in multiphoton microscopy. As a secondary objective, we wish to deepen the theory related to this new component.

L’imagerie biologique par microscopie à deux photons (MDP)est de plus en plus utilisée actuellement pour explorer les structures des cellules, ainsi que leur mode de fonctionnement. Récemment cette technique a trouvé de nombreuses applications dans le domaine biomédical (imagerie cellulaire et du petit animal. La MDP tire avantage du phénomène d’absorption à deux photons (ADP), caractérisé par la dépendance quadratique de la probabilité d’absorption simultanée de deux photons en fonction de l’intensité lumineuse du laser, ce qui fait que l’émission ne se produit qu’au point focal du système optique. Pour l’amélioration de cette technique, la contribution du chimiste consiste en l’élaboration de nouveaux colorants ayant une section efficace d’ADP (2) élevée. La compatibilité biologique et la non-toxicité de ces colorants sont deux caractéristiques importantes. L’objectif de ce travail est donc l’élaboration et la caractérisation de nouveaux chromophores absorbants multiphotoniques, solubles dans l’eau pour l’imagerie biologique. La MDP peut être combinée à un autre type d’imagerie comme l’Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) ou avec un thérapie particulière comme par exemple la Thérapie par Capture de Neutron par le Bore (BNCT). Pour ce faire, des chromophores contenant des hétéroatomes spécifiques des propriétés s’ajoutant à l’ADP (gadolinium et bore) ont été conçus, synthétisés et caractérisés
Cellular imaging is more and more used for the investigation of cells structures, functions and communications. For that purpose, fluorescence confocal microscopy has become a routine technique since it permits to investigate the details of a variety of physiological behaviors in the cell. More recently two-photon excited microscopy (TPEM) has emerged in biomedical research, for example in cellular and small animal imaging. This method takes advantages of the nonlinear optical (NLO) properties of chromophores: the emission occurs only at the focal point of the laser (quadratic dependence upon intensity) and the laser used induces a low bleaching out of focus (use of IR light instead of the more energetic UV light). Wide efforts are therefore being undertaken in order to develop chromophores with high two-photon absorption cross-section (σ2), good fluorescence efficiency, and low bleaching. The aim of our research is the elaboration and characterization of new water-soluble chromophores, optimized for two-photon induced fluorescence in biological systems for bio-imaging. This technique (TPEM) can be combined to other type of imaging like the Magnetic Resonance Imaging (MRI) or some kind of therapy like Boron Neutron Capture Therapy (BNCT). For these aims, chromophores containing paramagnetic atom (gadolinium in our case) and boron atoms were designed, synthesized an characterized

Cette thèse présente l'utilisation d'impulsions ultracourtes pour des expériences de microscopie non-linéaire et d'optique quantique. Dans un premier temps, nous exposerons plusieurs techniques de façonnage d'impulsions et nous détaillerons en particulier le fonctionnement et la caractérisation de notre dispositif de façonnage. Nous étudierons l'utilisation d'un masque de phase 2D diffractif adressé optiquement qui permet un façonnage à la fois en phase et en amplitude spectrale. Par la suite, nous verrons comment le façonnage d'impulsions ultra-courtes peut être un outil efficace pour sélectionner les fluorophores excités en microscopie à deux photons. Pour cela, nous présenterons une expérience de contrôle cohérent de l'absorption à deux photons dans un embryon de drosophile vivant avec notre système de façonnage programmable. Ensuite nous décrirons un schéma de façonnage simplifié à base de prismes, qui, conjointement avec une approche de multiplexage temporel des impulsions, permet d'imager simultanément plusieurs fluorophores. Enfin, nous discuterons l'utilisation d'impulsions ultracourtes pour des expériences de mesures de temps et de dispersion à la limite quantique. Nous détaillerons en particulier une étude théorique et expérimentale d'un système de façonnage original à base de matériaux biréfringents pour produire la dérivée temporelle d'un champ électrique ou bien la dérivée temporelle de son enveloppe.

Cette thèse décrit l’élaboration de nouvelles nanosondes disposant de propriétés permettant leur utilisation pour la microscopie multiphotonique ainsi que la thérapie ciblée du cancer. Dans un premier temps, ce travail s’est concentré sur la synthèse de nanoparticules actives en optique non linéaire et pour la photothérapie. Différents types de nanoparticules ont ainsi été élaborées et caractérisées comme des nanobâtonnets d’or, des nanoparticules de carbure de silicium ou de niobate de potassium, et des nanohybrides couplant ces différentes briques de base. Les nanoparticules ont ensuite été fonctionnalisées par des biomolécules comme l’acide folique afin de leur conférer des propriétés de ciblage spécifique vis-à-vis des cellules cancéreuses. La fonctionnalisation de surface des nanoparticules a été caractérisée de manière approfondie par des techniques avancées telles que la spectroscopie infrarouge, XPS et ToF-SIMS. Dans un second temps, les propriétés optiques non linéaires et thérapeutiques de ces nanoparticules ont été étudiées. Ainsi, ces nanosondes ont été utilisées avec succès pour réaliser le marquage de cellules saines et le ciblage spécifique de cellules cancéreuses pour la microscopie multiphotonique. Enfin, les propriétés photothérapeutiques de ces nanoparticules ont également été étudiées pour réaliser la destruction photoinduite de cellules cancéreuses
This thesis describes the synthesis of new nanoprobes with properties allowing their use for cancer-targeted multiphotonic microscopy and cancer phototherapy. On the one hand, this work was focused on the synthesis of nanoparticles with non-linear optical and phototherapeutic properties. Different nanoparticles were synthesized and used like gold nanorods, silicon carbide or potassium niobate nanoparticles, and nanohybrids coupling these previous nano-building blocks. These nanoparticles were functionalized with biomolecules like folic acid to provide specific cancer-targeting properties. The surface chemistry of these nanoparticles was carefully evaluated through advanced characterization techniques such as infrared spectroscopy, XPS and ToF-SIMS. On the other hand, optical and therapeutic properties of these nanoparticles were studied. These nanoprobes were successfully used to perform healthy cells labelling and cancer cells targeting for multiphotonic microscopy. Phototherapeutic properties of our nanoparticles were also used to induce light-triggered cancer therapy

Un des enjeux majeurs de la biochimie et de la biologie cellulaire actuelle est de pouvoir suivre de manière dynamique les événements moléculaires à l’intérieur de la cellule vivante dans son contexte fonctionnel, c'est-à-dire in situ (dans son tissu d’origine). Il ne suffit plus, par exemple, d’identifier une réaction biochimique in vitro pour pouvoir savoir si un enzyme ou un autre rencontrera son substrat à l’intérieur de la cellule. Il apparaît de plus en plus évident que des facteurs spatio-temporels très fins à l’intérieur de la cellule vivante déterminent en grande partie la spécificité des signaux cellulaires. Il suffit de penser aux fluctuations calciques intracellulaires, par exemple, qui participent à une multitude de cascades de signalisation; sans spécificité spatiale et temporelle, la cellule ne pourrait utiliser les signaux calciques de manière utile et efficace. A cette fin, on propose un système de microscopie laser qui incorpore un axicon, lequel a la propriété de focaliser la lumière en un faisceau quasi-Bessel. Le contrôle du profil du faisceau incident sur l’axicon procure une ligne focale sur l’axe longitudinal ayant une intensité constante dans le milieu absorbant ainsi qu’une grande résolution transverse. Conséquemment, nous devons balayer notre échantillon en deux dimensions seulement pour obtenir une image complète de tout le volume, réduisant ainsi considérablement le temps d’acquisition. Nous présenterons les résultats théoriques de la génération d’un faisceau quasi-Bessel dans un échantillon absorbant, les caractéristiques du laser Ti:saphir utilisé ainsi que le schéma proposé pour la microscopie laser avec un axicon. Nous verrons qu’il est possible d’imager des échantillons fluorescents allant jusqu’à 1 mm d’épaisseur avec un seul balayage. Dans cette thèse, nous passerons en revue quelques principes qui sont à la base des avantages de la microscopie par excitation à deux photons afin de mettre en relief certains des défis (résolution spatiale, résolution temporelle, sensibilité, profondeur de pénétration dans le tissu et phototoxicité) pour améliorer l’utilisation de cette approche pour l’imagerie cellulaire fonctionnelle. Les propriétés des faisceaux de Bessel formés par l’axicon seront étudiées en profondeur. Nous décrirons ensuite notre microscope à deux photons avec un axicon et nous présenterons plusieurs résultats obtenus avec ce dernier.

Le mouvement animal, présent lors d’expériences in vivo effectuées à l’aide de microscopie à effet deux photons, nuit à l’observation de phénomènes biologiques et à l’analyse subséquente des flux vidéos acquis. Ceci s’explique entre autres par le fait que, dû au sectionnement optique, tout déplacement dans l’axe z (perpendiculaire au plan d’imagerie) modifie drastiquement l’image et ne permet qu’une observation instable de l’échantillon examiné. En appliquant une fonction de hachage aux images acquises, nous produisons des vecteurs décrivant les qualités perceptuelles de ces images ; ces vecteurs peuvent alors servir à comparer les images une à une, en temps réel. Ces comparaisons nous permettent de réunir les images en groupes correspondant à des plans z distincts. Ainsi, du processus de hachage, de comparaison et de groupage d’images résulte une méthode logicielle de compensation de mouvement en temps réel qui peut être utilisée dans le cadre d’expériences biologiques en laboratoire.
Animal movement during in vivo two-photon microscopy experiments hinders efforts at observing biological phenomena and the subsequent analysis of the acquired video streams. One of the reasons for this is that, due to optical sectioning, any displacement in the z-axis (perpendicular to the plane of imaging) dramatically changes the collected image and thus provides the experimenter with an unstable view of the imaged sample. By applying a hashing function on the acquired video frames, we produce vectors embodying the images’ perceptual qualities; these vectors can then be used to compare the frames one to another, in real-time. These comparisons allow us to group similar images in clusters corresponding to distinct z-planes. In effect, the process of perceptually hashing, comparing and grouping video frames provides us with software-based, real-time movement compensation which can be used in a biological laboratory setting.

Les oscillateurs biologiques régissent le monde vivant à toutes les échelles. En biologie du développement, le cœur battant et les cils motiles en sont deux représentations dont les dimensions temporelles et spatiales sont analogues. Leur observation dynamique est un enjeu majeur pour permettre la compréhension de leur fonctionnement et des processus biologiques dans lesquels ils sont impliqués. Dans ce manuscrit, nous nous proposons de résoudre leur mouvement tridimensionnel in vivo chez un organisme-modèle de vertébré : le poisson-zèbre. Pour contourner les limites actuelles de vitesse d’imagerie, nous utiliserons la propriété de périodicité de ces oscillateurs biologiques, afin de développer des stratégies innovantes d'imagerie rapide en microscopie multiphoton.D’abord, le cil cellulaire est une extension cytoplasmique que l’on retrouve dans presque toutes les cellules eucaryotes dont le rôle est de générer un flux biologique lorsqu'il est motile. Au cours des dernières années, leurs dysfonctionnements ont été identifiés dans un nombre croissant de pathologies, regroupées sous le terme de ciliopathies. En particulier, ils sont présents en nombre dans l’organisateur gauche-droite du poisson-zèbre, la vésicule de Kupffer. Le flux directionnel qu’ils génèrent est responsable de la brisure de symétrie gauche-droite aux stades précoces, le dernier axe biologique à se spécifier chez les vertébrés. Dans ce manuscrit, nous détaillons une approche systématique d’analyse des cils cellulaires, exploitant les artefacts de balayage observés en microscopie multiphoton, issus du battement périodique de ceux-ci. Cette approche nous a notamment permis de découvrir une nouvelle forme d’asymétrie, ou de chiralité, apparaissant au sein de la vésicule de Kupffer.Par ailleurs, l’étude du cœur battant se heurte également à l’impossibilité de résoudre son mouvement rapide et en trois dimensions, par les techniques actuelles de microscopie. Dans ces travaux, nous proposons une méthode d’imagerie rapide à balayage point par point tirant profit de la propriété périodique du cœur, consistant en la synchronisation a posteriori de séquences de lignes balayées rapidement. Nous montrons que cette approche nous permet d’atteindre des résolutions temporelles sans précédent (de l’ordre de 1000 volumes par seconde), sans marquage, et sans compromettre d’autres paramètres d’acquisition (RSB, résolution spatiale, phototoxicité). En particulier, nous appliquons la méthode au suivi de la contraction des sarcomères cardiaques in vivo par génération de seconde harmonique (SHG), ainsi qu’à l’observation des valves cardiaques, les structures les plus dynamiques du cœur
Oscillations are abundant at every scale of the living world. In development biology, the beating heart and the motile cilium are two oscillators operating at temporally and spatially analogous scales. Their dynamic visualization is a major experimental challenge, which would shed new lights on the biological processes they are involved in. In this manuscript, we will extract their biophysical features or image their three-dimensional beating pattern in vivo, in a vertebrate model organism: the zebrafish. To circumvent current limitation in imaging speed, we will use the common periodic property of their motion to develop innovative strategies for fast multiphoton imaging.First, the cellular cilium is a cytoplasmic extension found in almost all eukaryotic cells whose role is to generate a biological flow when motile. In recent years, their dysfunctions have been identified to be involved in a growing number of pathologies, known as ciliopathies. In particular, they are present in large numbers in the zebrafish left-right organizer, the Kupffer vesicle: the directional flow they generate is responsible, at early stages, for the breaking of the left-right symmetry, the last biological axis to specify in vertebrates. In this manuscript, we will describe a systematic approach to extract cilia biophysical features, using the scanning artifacts observed in point scanning multiphoton microscopy when imaging their periodic beating. The systematic worfkflow we developed has enabled us to unveil the establishment of a novel form of asymmetry in the Kupffer's vesicle.Similarly, the study of the beating heart and the visualization of its rapid and three-dimensional periodic motion remains a challenge, even using state-of-the-art fluorescence microscopy techniques. In this work, we will propose a fast point-scanning imaging method that takes advantage of the periodic property of the beating heart. It relies on the retrospective synchronization of fast scanned line sequences. We will show how this approach can reach unprecedented temporal resolutions (in the order of 1000 volumes per second), with label-free contrast, and without compromising any other acquisition parameters, such as SNR or spatial resolution. In particular, we applied the method to the tracking of contracting cardiac sarcomeres in vivo, using second harmonic generation (SHG), and achieved reconstruction the 3D motion of the cardiac valves, the fastest-moving structure of the heart

La fibrose pulmonaire idiopathique (FPI) est une maladie associant des lésions fibreuses et inflammatoires. La fibrose pulmonaire induite par la bléomycine chez la souris est acceptée comme le modèle expérimental de fibrose pulmonaire et permet l'utilisation d'agents potentiellement thérapeutiques et l'application de nouvelles techniques de microscopie et d'imagerie tissulaire. Nous avons étudié dans ce modèle deux peptides endogènes, la sérotonine (5-HT) et la somatostatine possédant respectivement des propriétés fibrosantes et anti-fibrosantes, par l'intermédiaire d'antagonistes ou d'analogues à des récepteurs cellulaires spécifiques. Nous avons montré que le blocage des récepteurs 5-HT2A et 5-HT2B, exprimés préférentiellement dans le poumon, par des antagonistes spécifiques (kétanserine et SB215505 respectivement), réduit la fibrose pulmonaire (collagènes totaux solubles et ARNm des procollagènes I et III) et la sécrétion de médiateurs classiquement impliqués dans ce processus (TGF-B1,CTGF, PAI-1). La voie de la somatostatine semble également impliquée, et ses récepteurs sstl, sst2, sst3; ssst4 et sst5 exprimés dans le poumon normal, avec une augmentation du sst-2 après instillation de bléomycine. Le traitement des souris avec une fibrose pulmonaire induite par la bléomycine par une dose quotidienne sous cutanée de SOM230, un analogue de la somatostatine, améliore la survie, diminue la concentration pulmonaire en collagène et l'expression du procollagène I, l'expression des facteurs profibrosants TGF-lil et CTGF, et augmente l'expression des facteurs anti-fibrosants HGF et KGF. Enfin, l'application de la microscopie multiphoton dans ce modèle permet une analyse tridimensionnelle qualitative et quantitative du dépôt de collagène sur du poumon non coloré et fraîchement disséqué, et ouvre de nouvelles perspectives d'évaluation de la maladie à la fois in vivo et ex vivo
Idiopathic pulmonary fibrosis is characterised by inflammation and fibrosis within the pulmonary interstitium. The bleomycin induced lung fibrosis animal model allows the study of potentially therapeutic molecules, and the application of new techniques of tissue microscopy. In this model, we have studied two endogenous peptides, serotonin (5-HT) and somatostatin which display pro fibrotic and ant anti-fibrotic properties respectively, using specific antagonists or analogues to cellular receptors. Blockage of 5-HT2A and 5-HT2B receptors - which are preferentially expressed in the lung, - with specific antagonists (ketanserin and SB215505 respectively), reduced lung fibrosis (total soluble collagen and procollagen I and III mRNA) and the expression of profibrotic mediators known to be involved in the pathophysiology of lung fibrosis (TGF-B1, CTGF, PAI-1). The somatostatin pathway appears also involved, and its receptors sstl, sst2, sst3, ssst4 and sst5 are expressed in the normal lung, with and an increase of sst-2 receptor following bleomycin instillation. Daily subcutaneous single dose injection of SOM230, a new somatostatin analogue, in bleomycin mice, improves mice survival, decreases the pulmonary concentration in collagen and the expression of procollagen I, as well as the expression of pro fibrotic factors TGF-IÎ1 and CTGF, and increases the expression of the protective factors HGF and KGF. Finally, the application of multiphoton microscopy in this model describes for the first time the tridimensional features on the normal and fibrotic lung, and allows volumetric quantitative and qualitative analysis of collagen deposition of unstained fresh lung, opening new perspectives in tissue assessment of this disease both in vive and ex vivo

Ce travail etudie deux aspects du photodetachement des ions negatifs d'halogenes. L'etude experimentale du detachement multiphotonique d'ions negatifs d'halogenes dans le cas general de la polarisation elliptique a ete completee par la mesure des distributions angulaires de l'iode negatif detache par trois photons, et du chlore et fluor negatifs detaches par 4 photons (1064 nm chaque fois). La conservation de la symetrie par rapport au sens de parcours de l'ellipse dans ces distributions, contrairement a ce qu'on attendait, constitue le resultat experimental le plus marquant. Pour analyser ces mesures, une extension du theoreme de yang a ete etablie. Elle donne la forme mathematique des distributions angulaires de photoelectrons detaches par n photons issus d'un systeme atomique ayant un moment cinetique total nul et dont le cur est laisse dans un etat impair, dans le cas general de la polarisation elliptique. Une etude numerique du signal de detachement du fluor negatif detache par 3, 4 et 5 photons a ete realisee. Elle prend en compte le phenomene de competition de voies de photodetachement et l'effet ponderomoteur. Le second aspect de ce travail concerne la construction d'une experience dite de microscopie de photodetachement. Son principe, jusqu'alors jamais mis en pratique, est le suivant: un electron detache dans un champ electrique peut atteindre le detecteur par deux chemins possibles, on peut donc observer des interferences electroniques. On peut interpreter ces interferences comme une coupe radiale de fonction d'onde de photodetachement. L'etude de la faisabilite, la description de l'experience, ainsi que les premieres images obtenues avec le brome negatif sont presentees. On verifie que les resultats experimentaux sont en accord avec la theorie semi-classique

La microscopie multiphotonique est une modalité d’imagerie de pointe offrant des opportunités d’avancées remarquables en biologie mais aussi dans le domaine médical. Afin d’en exploiter pleinement le formidable potentiel au cœur même de la pratique clinique, le développement de nombreuses sondes miniaturisées à fibre optique pour l’endomicroscopie multiphotonique (EMMP) a eu lieu depuis de nombreuses années et dans de nombreux laboratoires français et étrangers. Il s’est pour l'instant confronté à des limitations majeures comme l’impossibilité de recueillir les signaux d’auto-fluorescence des tissus qui sont intrinsèquement faibles comme ceux venant des co-enzymes métaboliques NADH et FAD. Cette limitation compromet l'utilité de l’EMMP en la restreignant à une imagerie morphologique requérant un marquage exogène des tissus. Ce manuscrit présente une architecture d’EMMP permettant de dépasser cette limitation, capable de proposer une imagerie fonctionnelle du métabolisme cellulaire en temps réel, in vivo, in situ, sans marquage. Le prototype d’EMMP proposé est une amélioration du précédent, où les Grisms en réflexions sont remplacés par des Grisms en transmission, permettant d’élargir la bande spectrale d’utilisation et la transmission du système. Ce prototype voit aussi l’adjonction d’un second laser excitateur afin d’accéder aux fluorescences du NADH et du FAD. Les résultats démontrent capable que nous sommes à même d’imager les fluorescences cellulaires intrinsèques au travers de 5 mètres de fibre optique avec une résolution subcellulaire. Parmi celles-ci nous sommes capables d’exciter et de collecter spécifiquement les fluorescences du NADH et du FAD. Enfin nous détectons assez de photons pour disposer d‘informations quantitatives et donc de proposer une image du rapport d’oxydo-réduction optique en endomicroscopie
Nonlinear microscopy is a cutting edge imaging modality leading to remarkable step forward in biology but also in the clinical field. To use it at its full potential and at the very heart of clinical practice, there has been several development of fiber-based micro-endoscope. The application for those probes is now limited by few major restrictions, such as the impossibility to collect auto-fluorescence signal from tissues theses being inherently weak such as the fluorescence from NADH or FAD. This limitation reduces the usefulness of the micro-endoscope effectively restraining it to morphological imaging modality requiring staining of the tissue. Our aim is to go beyond this limitation, showing cellular metabolism monitoring, in real time, without any staining. The experimental setup is an upgrade of our precedent one where the reflection- based Grism stretcher is replace with a new generation transmission-based Grism stretcher. Another Laser was also added in order to tune the first laser at 860nm to allow FAD imaging and the second one to 760nm for NADH. The results prove that we assess and image the level of NADH and FAD at subcellular resolution through a five-meter-long fiber. Thus we demonstrate that we are capable of measuring the optical redox ratio in a micro-endoscopic configuration

Le marquage fluorescent de biomolécules, en particulier de l’ADN, est devenu un outil incontournable en biologie. La microscopie biphotonique a par ailleurs apporté des avancées substantielles en imagerie biologique Dans ce contexte, nous avons conçu de nouveaux marqueurs d’ADN pour la microscopie de fluorescence excitée à deux photons. Une série de triphénylamines vinylpyridinium (TP-Py) développée en amont de ce travail avait montré une section efficace d’absorption à deux photons élevée et un marquage spécifique de l’ADN nucléaire dans le rouge en microscopie confocale et biphotonique. Dans le cadre de la présente thèse, plusieurs séries d’analogues ont été développés afin d’optimiser les propriétés des TP-Py ; d’étudier les relations structure-propriétés optiques de cette famille et de mettre ainsi en évidence de nouveaux marqueurs performants. Lors de cette étude, une nouvelle famille de fluorophores, les trinaphtylamines, a été développée. Par ailleurs, des conjugués de TP-Py ont été préparés pour le marquage covalent d’ADN pour la détection d’hybridation par fluorescence excitée à deux photons et le marquage in vivo. La vectorisation de ces marqueurs par des polyamines a également été effectuée. Des dérivés de TP-Py pour le greffage sur des nanoparticules d’or ont enfin été développés dans le but d’étudier les interactions fluorophore-surface métallique et exalter leur fluorescence
Fluorescent labelling of biomolecules, in particular DNA, has become increasingly important for biological studies. Multiphoton microscopy is additionally a powerful technique for biological imaging. In this context, we have designed new fluorescent DNA probes for two-photon excited fluorescence microscopy. Prior to this work, a series of red emitting vinylpyridinium triphenylamines (TP-Py) had shown high two-photon absorption properties and nuclear DNA staining in confocal and two-photon excitation microscopy. In this regard, we developed several new series of analogues to optimize the properties of TP-Py and to study the relationships between structure and optical properties. In addition, a completely new family, trinaphthylamines, was developed. Furthermore, TP-Py conjugates were developed for covalent DNA labelling for hybridization studies and in vivo optical tracking of plasmids. Polyamine conjugates targeting cancerous cells were also prepared. A number of TP-Py derivatives for grafting to gold nanoparticles were synthesized in order to study the gold surface-fluorophore interactions and to enhance their fluorescence

La sérotonine (5-HT) est un neurotransmetteur régulant plusieurs fonctions fondamentales du corps : la thermorégulation, le comportement sexuel et alimentaire, le cycle éveil-sommeil, la perception de la douleur, l'anxiété, le contrôle moteur, mais elle est surtout connue pour le contrôle de l'humeur. Le manque de sérotonine dans le système nerveux central est associé aux maladies mentales. Ces maladies sont la dépression, le trouble bipolaire, l’anxiété, le trouble de panique, les phobies, les troubles obsessionnel-compulsifs et la schizophrénie. Un outil pour la détection de la sérotonine et de ses précurseurs nous permettrait d'étudier les mécanismes des diverses maladies impliquant un débalancement de la sérotonine. Dans le système nerveux central, la biosynthèse de la sérotonine se fait dans certains neurones du tronc cérébral. La sérotonine, tout comme son précurseur le tryptophane (Trp), est fortement fluorescente en comparaison à d'autres molécules endogènes. L’imagerie multiphotonique a été exploitée dans le cadre de ce projet pour détecter la sérotonine. Cette technique d’imagerie permet d’obtenir une bonne spécificité et d’offrir un sectionnement optique pour l’imagerie dans les cellules et les tissus. Différents processus d’excitation (à 2- et 3- photons) dans différentes conditions (cellules fixées ou non) ont été explorés afin d’optimiser la détection de l’autofluorescence de la sérotonine. Nous avons donc d’abord développé un système d’imagerie capable de détecter la fluorescence des molécules de la biosynthèse de la sérotonine, excluant le tryptophane. Nous sommes capables de détecter ces espèces isolées à des concentrations avoisinant le milli molaire en solutions. La méthode a été testée dans deux modèles contenant de la sérotonine (cellules et tranches). Les mesures ont démontré un manque de spécificité et sensibilité lorsqu’utilisées dans des systèmes plus complexes que les simples solutions. Ce manque de spécificité et de sensibilité est discuté avec des pistes d’amélioration pour les projets futurs, incluant l’utilisation d’autres modèles mieux contrôlés et d’autres techniques optiques plus avancées.
Serotonin (5-HT) is a neurotransmitter regulating several basic functions of the body: thermoregulation, sexual and food behavior, the sleep-wake cycle, perception of pain, anxiety, motor control, but is best known for control of mood. The lack of serotonin in the central nervous system is associated with mental illness. These diseases are depression, bipolar disorder, anxiety, panic disorder, phobias, obsessive-compulsive disorder and schizophrenia. A detection tool of serotonin and its precursors would allow us to study the mechanism of various diseases involving an imbalance of this neurotransmitter. In the central nervous system, the biosynthesis of serotonin occurs in specific neurons of the brainstem. Serotonin, like its precursor tryptophan (Trp), is highly fluorescent in comparison to other endogenous molecules. Multiphoton fluorescence excitation has been used in this project to detect serotonin without exogenous labels. This fluorescence imaging technique provides a good specificity as well as optical sectioning for imaging in cells and tissues. Different excitation processes (two- and three-photon) under different conditions (fixed cells or not) were explored to optimize the detection of autofluorescence of serotonin. We therefore first developed an imaging system capable of detecting the fluorescence of molecules involved in the biosynthesis of serotonin, excluding tryptophan. We are able to detect these isolated species in solution at concentrations near a millimolar. The method was tested in two models containing serotonin (cells and slices). The measurements have shown a lack of specificity and sensitivity when used in systems more complex than simple solutions. This lack of specificity and sensitivity is discussed with possible improvements for future project including the use of other models with better control of serotonin concentrations, of other more advanced optical techniques such as fluorescence lifetime imaging.

La microscopie multiphoton est une technique d'imagerie optique non-invasive permettant une imagerie 3D de la structure de la peau à l'échelle submicrométrique. L'imagerie par microscopie multiphoton a généré des informations qualitatives nouvelles en dermatologie, mais les analyses quantitatives publiées restent peu nombreuses. L'objectif de cette thèse est de contribuer au développement de l'analyse des images multiphoton par une rationalisation de l'approche visuelle et par une validation de paramètres quantitatifs originaux. Deux démarches cliniques ont été mises en œuvre. La première est constituée par l'évaluation et le monitoring des effets secondaires de la corticothérapie topique. Une étude pilote préliminaire a permis d'appréhender la capacité à objectiver de façon non invasive des modifications morphologiques et pigmentaires dans l'épiderme. Une seconde étude plus complète sur deux classes d'âge a montré que la microscopie multiphoton rend possible l'objectivation de modifications cutanées liées au vieillissement. Les différences d'effets induits par les corticoïdes et leur cinétique entre sujets jeunes et âgés ont aussi été caractérisées. Des paramètres quantitatifs ont été validés sur la base de critères histologiques connus. La seconde démarche clinique dédiée à une situation physiologique a abordé l'analyse des différentes typologies de couleur de peau. Cette étude a conforté la pertinence des paramètres quantitatifs relatifs à la quantité de mélanine. Il a été en effet possible de discriminer différents groupes typologiques d'intensité de couleur de peau croissante, grâce aux méthodes quantitatives basées sur l'utilisation des forts signaux de fluorescence ou de la durée de vie de fluorescence de la mélanine
Investigation of the 3D structure of human skin with a sub-cellular resolution. Multiphoton microscopy imaging has generated new qualitative information in dermatology. However, only very few published data deal with quantitative analysis from multiphoton images. The aim of this thesis was to contribute to the developpement of multiphoton images analysis, by a rationalization of the visual approach and the validation of new quantitative parameters. Two clinical approaches were performed. The first one addressed the assessment and the monitoring of cutaneous side effects induced by topical corticotherapy. A preliminary pilot study allowed demonstration that multiphoton microscopy was able to objectivate morphological and pigmentary modifications in epidermis in a non invasive way. A more comprehensive second study focusing on two age groups showed that multiphoton microscopy could objectivate age-related cutaneous modifications. Differences in the effect induced by the corticoids were characterized between young and old volunteers. Quantitative parameters were validated by comparison to already known histological features. The second clinical approach dealt with a physiological situation: analysis of different skin color typologies. This study comforted the pertinence of quantitative parameters related to pigmentation assessment. Discrimination of various skin color typologies was performed thanks to quantitative methods based on use of the specific fluorescence lifetime of the melanin or its high fluorescence signal

Cette thèse a porté sur le développement pour la biologie de la microscopie par génération de troisième harmonique (THG), qui permet la visualisation sans marquage de cellules et de tissus avec une résolution sub-micrométrique. Son application en biologie était jusqu'à présent limitée par le manque d'études du mode de création du signal dans l'échantillon, des sources de contrastes biologiques endogènes ainsi que de la phototoxicité induite. Le travail présenté ici a essentiellement porté sur ces trois questions. Nous avons d'abord étudié théoriquement et expérimentalement l'influence de la structure de l'échantillon et de la focalisation du faisceau excitateur sur le signal THG. Nous avons montré que l'imagerie THG agit sur l'échantillon comme un filtre passe! -bande pour les fréquences spatiales et qu'ajuster la focalisation de l'excitation permet de moduler la visibilité de structures au sein d'un système complexe selon leur forme. Par ailleurs, nous avons caractérisé les propriétés optiques de différents liquides biologiques, qui prédisent qu'un corps lipidique dans un environnement aqueux doit constituer une source efficace de signal intracellulaire. Nous avons démontré que de telles structures peuvent effectivement être suivies et quantifiées par microscopie THG dans de nombreux types de tissus biologiques non marqués, ouvrant la voie à des applications en physiopathologie. Finalement, nous avons appliqué la microscopie THG à la visualisation in vivo et sans marquage du développement embryonnaire précoce chez la drosophile. Sur ce modèle, nous avons étudié les mécanismes de phototoxicité liés à l'imagerie THG et démontré la possibilité de visualiser les embryons en 3D sans perturbation du développement et de quantifier les mouvements morphogénétiques à partir des séquences obtenues.

Le travail effectué au cours de cette thèse a porté sur le développement et la mise en œuvre de nouvelles stratégies en microscopie non linéaire permettant d'augmenter le nombre de signaux non linéaires simultanément observables d'une part, et la vitesse d'acquisition d'autre part. Dans un premier temps, nous avons exploré la possibilité de produire des signaux multiples au moyen de deux trains d'impulsions synchronisés de longueur d'onde centrale distincte. Nous avons montré que cette approche permet d'exciter de façon optimale et simultanée trois protéines fluorescentes respectivement bleue, jaune, et rouge. Une application de cette méthode consiste à imager de grands volumes de tissus marqués avec des transgènes Brainbow dans le but d'étudier la connectivité ou le lignage cellulaire. Plus généralement, nous avons montré que cette approche permet de combiner plusieurs signaux non linéaires tels que la fluorescence, la génération de seconde (SHG) et de troisième (THG) harmoniques, ainsi que le mélange à quatre ondes (FWM). Dans un deuxième temps, nous avons étudié la possibilité d'augmenter la vitesse d'imagerie. Pour cela, nous avons mis en œuvre plusieurs manières de produire des faisceaux de Bessel focalisés afin d'augmenter la profondeur de champ d'un microscope à balayage. Enfin, en vue d'augmenter la vitesse d'acquisition tout en préservant le sectionnement optique, nous avons construit un microscope biphotonique à nappe de lumière de profil spatial programmable. Dans cette géométrie nous avons comparé les propriétés d'imagerie de profils d'excitation de type gaussien et de Bessel pour des applications en biologie du développement.

Le transport moléculaire dans les neurones joue un rôle essentiel dans leur développement et la maintenance de leurs fonctions, en raison notamment de leurs longues arborescences. Les conséquences d’anomalies du transport axonal ont été associées de longue date à la maladie d’Alzheimer telle que le gonflement des axones consécutif à l’accumulation des organelles transportés, mais il y a peu d’outils permettant l’étude fine sur le long terme de ce transport en culture et encore moins in vivo.L’équipe dans laquelle cette thèse a été réalisée a développé une méthode de mesure du transport intraneuronal en culture de neurone de souris reposant sur le suivi d’endosomes ayant internalisé spontanément des nanodiamants fluorescents. Elle a également démontré la grande sensibilité de cette méthode à détecter des facteurs de risques génétiques de maladies neuropsychiatriques.L’objectif de ma thèse a été d’étendre cette méthode de mesure au circuit neuronal intègre du cerveau de larves de poisson zèbre. Pour ce faire j’ai utilisé des nanocristaux (NCs) à réponse optique non-linéaires, pouvant être excité dans une fenêtre de transparence des tissus, à une longueur d’onde ≈1 µm, et générant un signal de second harmonique (SHG). Nous avons utilisé le microscope multiphoton de la plateforme Emerg’In (INRAE, Jouy-en-Josas) qui est installée au sein d’une pisciculture et dispose de scanners galvanométriques résonants et de détecteurs hybrides, ce qui nous a permis de maintenir une cadence de 20 champs par seconde malgré la nécessité de balayer le faisceau laser, contrairement aux études en culture, menées en champ large.Nous avons mis au point un nouveau protocole de mesure, depuis l’injection des NC jusqu’à l’extraction des paramètres de transport à partir des données vidéos. Pour cela, j’ai optimisé et automatisé les analyses des données en développant deux programmes écrits en Python : l’un permettant de reconstruire automatiquement les trajectoires des NCs de manière la plus fidèle possible et l’autre permettant de segmenter les trajectoires en phases de mouvement et de pauses afin d’en extraire des paramètres de transport.J’ai appliqué ces nouveaux outils à l’étude, sur un modèle transgénique de poisson zèbre, de l’impact fonctionnel d’une mutation présente dans des neuropathies dont une paraplégie spastique héréditaire et la maladie de Charcot-Marie-Tooth périphérique. Chez des patients atteints par l’une de ces maladies, plusieurs mutations ont été identifiées sur le gène KIF5A codant pour la chaine lourde du moteur moléculaire kinésine 1 qui assure des déplacements antérogrades (du corps cellulaire vers la périphérie). Nous avons mesuré le transport d’endosomes dans les axones de neurones du cerveau de larve de poissons zèbres transgéniques portant une mutation sur kif5a, et avons observé des modifications subtiles de ce transport. Pour cela, plus de 500 trajectoires d’endosomes (acquises à une profondeur de ≈100 µm sous la surface de la tête) ont été analysées, issues de 40 larves.En guise de contrôle, nous avons également étudié le transport endosomal dans des mutants privés des moteurs dynéines, les seuls à assurer le transport rétrograde, et avons observé que le transport bidirectionnel était totalement arrêté dans les mutants.La méthodologie mise en place peut servir à cribler des anomalies fonctionnelles résultant de facteurs génétiques de troubles neurologiques ou neurodégénératifs
Molecular transport in neurons plays an essential role in their development and the maintenance of their functions, due in particular to their long branches. The consequences of axonal transport abnormalities have long been associated with Alzheimer's disease, such as the swelling of axons caused by the accumulation of transported organelles. However, there are few tools allowing the detailed long-term study of this transport in culture and even less in vivo.The team in which this work was conducted has developed a method for measuring intraneuronal transport in mouse cultured neurons based on the tracking of endosomes having spontaneously internalized fluorescent nanodiamonds. This technique was able to detect genetic risk factors of neuropsychiatric diseases, proving its high sensitivity.The objective of my thesis was to extend this measurement method to the neuronal circuit of the zebrafish larvae’s brain. For this purpose, I have used nanocrystals (NCs) with non-linear optical response, which can be excited in a tissue transparency window at a wavelength ≈1 µm, and generate a second harmonic signal. We have used the multiphoton microscope of the Emerg'In facility (INRAE, Jouy-en-Josas), which is installed next to a fish farming and has resonant galvanometric scanners and hybrid detectors, which allowed us to maintain a frame rate of 20 fps despite the need to scan the laser beam, unlike in culture studies conducted in wide field.We have developed a new measurement protocol, from the injection of the NC to the extraction of transport parameters from the videos data. To do this, I have optimized and automated the data analysis by developing two programs written in Python: one that automatically reconstructs the trajectories of the NCs as faithfully as possible and the other that segments the trajectories into motion and pause phases in order to extract transport parameters.I have applied these new tools to study, in a transgenic zebrafish model, the functional impact of a mutation present in neuropathies including hereditary spastic paraplegia and peripheral Charcot-Marie-Tooth disease. In patients suffering from one of these diseases, several mutations have been identified in the KIF5A gene coding for the heavy chain of the kinesin 1 molecular motor which ensures anterograde movements (from the cell body to the periphery). We have measured endosome transport in axons of neurons in the brain of transgenic zebrafish larvae bearing a mutation on kif5a, and we observed subtle changes in this transport. More than 500 endosome trajectories (acquired at a depth of ≈100 µm below the surface of the head) were analyzed from 40 larvae.As a control, we also studied endosomal transport in mutants deprived of dynein motors, the only ones to ensure retrograde transport, and observed that bi-directional transport was totally stopped in the mutants.This methodology can be used to screen for functional abnormalities resulting from genetic factors of neurological or neurodegenerative disorders

La microscopie optique chez les animaux vivants est un outil de recherche prometteur pour l’avancement de la neurobiologie. L’imagerie intravitale offre un aperçu en direct de la réponse des cellules individuelles aux dommages affectant le système nerveux. Combinée à la vaste gamme de souris transgéniques disponibles commercialement et compatibles avec différents modèles animaux de maladies neurodégénératives, la microscopie in vivo favorise la compréhension du déroulement des pathologies et du fonctionnement des thérapies. Il est capital de travailler à l’émergence de cet outil, qui se présente comme une stratégie dotée d’un énorme potentiel. Le projet de doctorat décrit dans cette thèse porte donc sur le développement et l’utilisation d’une plateforme de microscopie quantitative, multimodale et non linéaire pour l’imagerie de la moelle épinière chez les animaux vivants. Premièrement, nous avons enrayé la dépendance en polarisation de l’intensité du signal de diffusion Raman cohérente (CARS, « coherent anti-Stokes Raman scattering »), de façon à adapter les images à l’interprétation histologique. Nous avons appliqué cette technique afin d’étudier l’histologie de la myéline de la moelle épinière du rat. En second lieu, nous avons proposé une nouvelle procédure d’analyse d’images compatible avec l’imagerie d’animaux vivants, dans le but de faire de l’histologie des axones myélinisés. Nous avons alors quantifié, dans un modèle de blessure par écrasement d’un nerf, la démyélinisation proximale et la remyélinisation distale au site de lésion ex vivo et in vivo respectivement. Troisièmement, nous montrons que l’imagerie de CARS de la moelle épinière de souris vivantes peut être réalisée avec un microendoscope, et ce tout en conservant sa compatibilité avec le signal de fluorescence par excitation à deux photons. Finalement, nous discutons d’une stratégie de traitement numérique d’images pour réduire les artefacts reliés au mouvement de l’animal. Cette technique permet l’étude histologique de la myéline et la quantification de la motilité des cellules microgliales dans leur environnement natif. En définitive, cette thèse démontre que la microscopie de CARS in vivo progresse peu à peu vers un outil grand public en neurobiologie.
Optical microscopy in living animals is a promising research tool for the evolution of neurobiology. Intravital imaging offers a live preview of how individual cells respond to the nervous system damages. Applying in vivo microscopy to a panoply of transgenic mice used with different animal models of neurodegenerative diseases promotes the understanding of the progress of pathologies and the comprehension of how therapies work. It is thus essential to promote the emergence of optical microscopy technologies in living animals because it is a strategy with great potential. Therefore, the project described in this doctoral thesis focuses on the development and use of a microscopy platform for quantitative, multimodal and nonlinear imaging of the spinal cord in living animals. First, we alleviated the polarization dependence of the coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) signal intensity. This strategy makes images more amenable to histological interpretation. With this technique, we studied the histology of myelin in the rat spinal cord. Secondly, we proposed a new image analysis procedure compatible with live animals imaging in order to achieve the histology of myelinated axons. We quantified the demyelination proximal, and remyelination distal to the crush site ex vivo and in vivo respectively. Third, we showed that CARS imaging of the spinal cord in living mice can be achieved with a microendoscope, and this while maintaining compatibility with the two-photon excitation fluorescence signal. Finally, we discuss a digital image processing strategy that reduces imaging artifacts related to movement of the animal. This technique allows the histological study of myelin and the quantification of the motility of microglial cells in their native environment. Ultimately, this thesis demonstrates that in vivo CARS microscopy progresses gradually towards a robust tool for research in neurobiology.

La sclérose en plaques est une maladie chronique, auto-immune et neurodégénérative qui se traduit par l’apparition de plaques inflammatoires démyélinisantes dans le système nerveux central. Pour caractériser la réponse immunitaire innée, j’ai développé des outils d’imagerie optique non linéaire multispectrale intravitale, et des solutions semi automatisées d’analyse d’images. J’ai participé à la mise au point d’un protocole d’identification des phénotypes immunitaires en cytométrie. Ces outils appliqués à l’étude de l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale, un modèle murin de SEP, ont permis d’analyser la cascade immunitaire par immunomarquages et marquages fluorescents transgéniques, de décrire les distributions des populations cellulaires dans le SNC, et de les associer à la dégradation axonale sur des échelles de temps de la seconde à la semaine. Sur une lignée de souris transgénique, Thy1-CFP/Cd11c-EYFP/LysM-EGFP, j’ai suivi en microscopie biphotonique l’évolution des densités de cellules fluorescentes dans la moelle épinière pendant plusieurs semaines. J’ai conclu que la dégénération axonale et les déficits moteurs sont corrélés avec l’infiltration par les méninges de neutrophiles et monocytes. Les monocytes se différencient in situ en cellules dendritiques d’origine monocytaire (moDCs) parallèlement à l'activation de la microglie. Ces événements cellulaires, dont la maturation des moDCs sont corrélés avec la résorption de l’inflammation. La méthodologie est en place pour poursuivre ces investigations sur d’autres modèles. L’optimisation du microscope m’a aussi permis d’accéder simultanément au contraste endogène CARS pour visualiser la gaine de myéline
Multiple sclerosis is a chronic auto-immune neurodegenerative disease characterized by the appearance of inflammatory plaques in the central nervous system. To characterize the innate immune response I have developed nonlinear optical tools for intravital multispectral imaging as well as semi-automated image processing solutions. I also contributed to the development of a flow cytometry protocol allowing the identification of immune cell phenotypes. Applied to study of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis, a mouse model of MS, these tools have allowed to analyze the immune cascade thanks to immunolabelings and transgenic expression of fluorescence, describe the distributions of cell populations in the CNS with regard to neuron degeneration on time scales ranging from seconds to weeks. On a transgenic mouse line Thy1-CFP/Cd11c-EYFP/LysM-EGFP, I have followed by two-photon microscopy the evolution of fluorescent cells densities in the same area of the spinal cord for several weeks. I conclude that axonal degeneration and motor deficits are correlated with neutrophils and monocytes infiltration from the meninges. The monocytes differentiate in situ in monocyte-derived dendritic cells (moDCs) along with the recruitment of activated microglia. These cellular events correlated with a stabilization/remission phase of the disease. MoDCS maturation thus seems involved in the dampening of inflammation. Methodology and tools are now set for further investigations with other models. The microscope optimization for multicolor excitation allowed me to access simultaneously to the endogenous CARS contrast to visualize the myelin sheath

L’utilisation de chromophores absorbant à deux photons (ADP) pour des applications en photothérapie dynamique (PDT) et en imagerie de fluorescence présente de nombreux avantages. Les propriétés non-linéaires de ces chromophores permettent notamment d’améliorer la longueur de pénétration dans les organismes vivants ainsi que la résolution. Pour des applications in-vivo la biocompatibilité de ces chromophores lipophiles doit aussi se poser. Une étude d’ingénierie pour le développement de chromophores pour la PDT-ADP en utilisant des atomes de brome comme groupe générateur d’oxygène singulet est décrite. Différents paramètres dont le nombre et la position des atomes de brome sur la chaîne carbonée, la longueur de conjugaison, la géométrie des chromophores ont été étudiés. Cette étude permet de mettre en évidence l’importance de la position des substituants bromes et de la symétrie sur le rendement de croisement inter-système.Les observations spectroscopiques faites lors de l’étude d’ingénierie ont permis de développer des chromophores pour la microscopie de fluorescence à deux photons. La biocompatibilité est apportée grâce à un polymère d’(hydroxyethyl)acrylate. Ce polymère permet de créer une coquille hydrosolubilisante covalente. Ces chromophores ont été utilisés pour faire de l’imagerie de vascularisation cérébrale de haute résolution. Une observation particulière sur un chromophore, marquage des cellules endothéliales des parois des vaisseaux sanguins intravitaux ainsi que les applications en résultant sont présentées. Des stratégies visant l’amélioration de la sélectivité des systèmes polymères/chromophores pour des applications intravitales, comme le traitement des tumeurs cancéreuses sont décrites. Une stratégie de modification des fonctions hydroxy des chaînes polymères par des groupements imidazoliums est présentée. L’étude de complexation des polymères avec l’ADN et les études spectroscopiques in-cellulo ont été réalisées
The use of two-photon absorbing (TPA) chromophore for applications in photodynamic therapy (PDT) and fluorescence imaging provides many advantages. The non-linear properties make it possible to increase both observation depth in animals and 3D resolution. Nevertheless, for in-vivo applications, improving bio-compatibility of these inherently lipophilic chromophore is a challenge. The development of new chromophores for PDT-TPA using a molecular engineering approach using bromide substituents as singlet oxygen generators is described. Parameters like position and number of bromide, the conjugated length and chromophore symmetry are studied. The study shows the importance of bromide atom position and of the symmetry on the inter system crossing efficiency. During the engineering study, spectroscopic observation and rationalization permit to envision the design of new chromophores for two photon laser scanning fluorescent microscopy. Bio-compatibility of these chromophores is provided by (hydroxyethyl)acrylate polymer, which provides a covalent water-soluble shell. These chromophores are used to make high resolution image of cerebral vascularization. One of these chromophores shows intravital specific interaction with endothelial cells in blood vessels. Some applications of the chromophore are described. Strategies to increase the intravital selectivity of polymer/chromophores units towards cancer cells and tumor are presented. A modification of hydroxyl function by imidazolium group is described. This new chromophore is evaluated towards its complexation properties with DNA and in cellulo spectroscopic studies