Academic literature on the topic 'Micobatteri'

L’infezione da micobatteri non tubercolari costituisce una<br />severa complicanza nei pazienti affetti da AIDS. L’efficacia<br />del trattamento è complicata dalla difficoltà di una precisa<br />diagnosi microbiologica e da problematiche farmacologiche<br />(compliance alla terapia, interazioni farmacologiche e malassorbimento).<br />Descriviamo il caso di un giovane uomo affetto<br />da infezione da HIV, AIDS presenter per micobatteriosi<br />atipica disseminata e sindrome infiammatoria da immunoricostituzione,<br />il quale non ha risposto alla terapia antimicobatterica<br />e antiretrovirale per os a causa di malassorbimento<br />intestinale. La somministrazione endovenosa della<br />terapia antimicobatterica e l’adeguamento della terapia antiretrovirale<br />alle resistenze emerse hanno permesso un miglioramento<br />del quadro clinico. È necessario considerare il<br />malassorbimento dei farmaci come una possibile una causa<br />di fallimento terapeutico in corso di infezione micobatterica.

Inducible gene expression systems are powerful tools for studying gene function and for the validation of drug targets in bacteria. We report the development of a novel gene regulation system that allows negative-controlled gene expression. The system is based on two repressors: Pip and TetR. The gene of interest is placed under the transcriptional control of a Pip-dependant promoter (ptr); the Pip encoding gene, however, is placed under TetR transcriptional regulation. Both pip and tetR were integrated into the chromosome using an integrative plasmid. In the absence of ATc, TetR represses pip and the gene of interest can be transcribed. However, upon addiction of anhydrotetracycline (ATc), TetR allows pip expression, resulting in the stringent repression of the gene of interest. Using lacZ as a reporter gene, we showed that supplementation with subinhibitory concentrations of ATc allows stringent repression of its transcription in M. smegmatis and M. tuberculosis both in liquid and in solid media. Time-course and dose-response experiments showed that repression could be modulated in response to ATc concentration. One of the most useful applications of a reverse-inducible system is the possibility to construct conditional mutants of essential genes, allowing their characterization and validation as drug targets. At this purpose we constructed a M. smegmatis mutant where the ftsZ promoter was replaced with a Pip regulated promoter. Upon integration of the integrative plasmid carrying pip and tetR, the recombinant strain was unable to growth in sub- inhibitory ATc concentration, confirming ftsZ repression. The same technique was used in M. tuberculosis where fadD32 operon (essential in M. tuberculosis) and rv3213c (not essential in M. tuberculosis) were placed under Pptr transcriptional control. In the presence of ATc (in the concentration of 200ng/ml) only the conditional mutant of rv3213c was able to grow demonstrating that fadD32 operon is essential in M. tuberculosis. A different strategy to construct conditional mutant of Rv3790 was elaborated; this gene belongs to a large operon in M. tuberculosis so it was elaborated a technique that allows to have an dependant ATc- regulation only in Rv3790 while the other genes continue to be transcribed by their wild- type promoter. The development of a novel reverse-inducible system based on ATc will represent an invaluable tool to study essential genes and virulence-associated genes in mycobacteria.
I sistemi d'espressione inducibili rappresentano ad oggi un potente mezzo con il quale studiare la funzione dei geni essenziali e nell'individuazione di bersagli farmacologici. Essi infatti si dimostrano fondamentali nello studio della funzione di geni quando questa è sconosciuta in quanto permettono di dosarne l'attività in risposta ad un semplice stimolo come l'aggiunta al terreno di un metabolita. Questo sarà un importante strumento per facilitare sia lo studio di nuovi regolatori che lo studio di geni essenziali o importanti per la virulenza. Durante questo triennio di dottorato la mia attività di ricerca si è occupata dello sviluppo e della caratterizzazione di un sistema di regolazione genica per micobatterio che permettesse un controllo negativo basato sull'attività di due repressori: Pip e TetR. In questo sistema il gene d'interesse è posto sotto il controllo trascrizionale di un promotore dipendente da Pip (ptr); Pip a sua volta è posto sotto la regolazione di TetR attraverso l'inserimento nel suo promotore, di due operatori (tetO) riconosciuti specificamente da TetR. L'induttore utilizzato per questo sistema è l'antibiotico anidrotetraciclina (ATc), prodotto di degradazione della tetraciclina, meno tossico ma ancora in grado di interagire con il regolatore TetR. In assenza di ATc, TetR reprime pip e il gene d'interesse puಠessere trascritto; con l'aggiunta di ATc invece si ottiene come effetto l'espressione di pip e di conseguenza lo spegnimento trascrizionale del gene di interesse. Un'applicazione molto utile per un sistema d'espressione inducibile è la costruzione di mutanti condizionali per lo studio di geni essenziali con lo scopo di valutare la possibilità di validare il loro impiego come bersagli farmacologici. A tal fine è stato costruito un mutante condizionale in M. smegmatis, dove il promotore del gene ftsZ, è stato sostituito dal promotore regolato dal repressore pip. Tale mutante in seguito, è stato trasformato con il plasmide integrativo avente entrambi i repressori ed il ricombinante ottenuto è risultato incapace di crescere già a concentrazioni sub-inibitorie di ATc, confermando cosଠla repressione trascrizionale di ftsZ. Lo stesso metodo è stato impiegato per ottenere due mutanti condizionali in M. tuberculosis H37Rv dove l'operone di fadD32 (essenziale in M. smegmatis), o il gene rv3213c (non essenziale; utilizzato come controllo) sono stati posti sotto il controllo trascrizionale di Pptr. In presenza di ATc (in concentrazione pari a 200ng/ml) solo il mutante condizionale di rv3213c è stato in grado di crescere dimostrando come l'operone di fadD32 sia essenziale anche in M. tuberculosis. Una tecnica alternativa per l'ottenimento di un mutante condizionale è stata applicata con il gene Rv3790 di M. tuberculosis; poiché esso appartiene ad un operone costituito da 12 geni, non è stato possibile utilizzare la strategia prevista per ftsZ e fadD32 in quanto un silenziamento di Rv3790 si sarebbe trasmesso anche all'intero operone. Per poter analizzare gli effetti dovuti unicamente alla presenza/ assenza di Rv3790 nella cellula batterica, è stato sviluppato un sistema dove la regolazione ATc- dipendente è stata vincolata solamente al gene suddetto mentre i geni appartenenti al medesimo operone continuavano ad essere regolati a livello trascrizionale dal loro promotore wild- type. Lo sviluppo di un innovativo sistema d'espressione inducibile che utilizza l'anidro- tetraciclina come induttore, rappresenta uno strumento prezioso per lo studio di geni che sono essenziali ed associati alla virulenza nel micobatterio.

Abstract Mycobacterium tuberculosis (MTB) is the causative of tuberculosis, a disease, which causes 2 millions of death every year, with a dramatic incidence especially in developing countries. To find new drug and vaccine strategies against MTB, it is of fundamental importance to study the mechanisms, that allow its survival to environmental stresses, to which it is subjected during the period of infection and latency in the host macrophages. The fine transcriptional regulation of specific genes in response to stress conditions and the peculiar structure of its wall play a key role on this. In the first part of the PhD project two mycobacterial sigma factors, SigE and SigF, which regulate the transcription of specific genes in response to various environmental stresses such as surface stress, oxidative stress, alkaline pH and thermal shock, have been characterized. First the transcriptional regulation, translational and post-translational regulation of the extracytoplasmic function (ECF) transcription factor SigE were studied. Regarding the study of the transcriptional regulation, it was possible to confirm by 5'RACE PCR and RT-PCR experiments the presence of three promoters of sigE, and to determine the contribution of each promoter in the transcription of this gene, depending on the environmental conditions of bacterial growth. The fact, that the transcriptional start codon of one of these promoters is located 63 base pairs downstream of the start codon annotated in MTB genome opened the possibility of the existence of two isoforms of Sige. By translational fusions between specific sequences of sigE with lacZ, deprived of its own translational initiation codon, and subsequent site-specific mutagenesis, it was possible to confirm, based on further beta-galactosidase activity detection, the existence of two alternative start codons, an ATC and a TTG, coding for an isoform of respectively 218 and 215 of amino acids, in addition to the ATG already annotated in MTB genome, which encodes for an isoform of 257 amino acids. Finally, it was possible to confirm, that the gene downstream sigE encodes for the anti-sigma factor of SigE, called RseA, capable of binding both isoforms of SigE. In a second project also the role of the factor SigF M. smegmatis in the biosynthesis of carotenoid pigments, resistance to hydrogen peroxide and in the efficiency of bacterial transformation was studied. By RT-PCR it has been shown, that SigF controls the transcription of genes involved in the biosynthesis of carotenoid pigments, and, assuming that they serve as protection against free radicals, it was verified that the sigF mutant strain is actually more sensitive compared to the wild type strain to treatment with hydrogen peroxide. Finally, we also demonstrated, that the mutant strain has a higher transformation efficiency than the wild type strain, indicating that SigF regulates the transcription of genes possibly involved in the permeability of the cell wall. In the second part of the project, the localization of the protein on the surface PPE17 mycobacteria was characterized. Like other members of the PPE family, the PPE17 has a highly conserved N-terminal domain, which, based on different evidences in literature, is assumed to play an important role in their translocation to the mycobacterial surface. Moreover, it was investigated the possible influence of the presence of PE11 in the translocation process or in the stability of PPE17, as the PE11 coding sequence is in tandem and co-transcribed with that encoding the PPE17, and there is a specific interaction between these two proteins. The data obtained by proteinase K sensitivity assays performed on M. smegmatis strains, expressing the entire PPE17 or only its domain PPE (dPPE17) fused with the HA epitope, confirm, that the entire PPE17 is exposed on the surface, both in the presence and absence of PE11. According to data obtained, the possibility to translocate the MTB model antigen (Mpt64) on the surface of the vaccine strain M. bovis BCG, by fusing them with the dPPE17 was tested. Proteinase K and whole cell ELISA assays performed on cultures of M. bovis BCG expressing this chimeric protein indicate, that it is indeed localized at the mycobacterial surface. Similarly, another two fusions with dPPE17 were constructed to express on the mycobacterial surface the multimeric MTB antigen AG85-ESAT6 of MTB and the Csp C3 antigen of Plasmodium bergii. According to the proteinase K sensitivity assays carried out on strains of M. smegmatis expressing the two chimeric proteins indicate that also in this case both are localized at the surface. The strains of M. bovis BCG expressing these antigens on their surface will be tested in future in the mouse model to measure any increase in protection compared to the wild type strain.
Riassunto Mycobacterium tuberculosis (MTB) è l’agente eziologico della tubercolosi, patologia che nel mondo causa ogni anno due milioni di morti, con un’incidenza drammatica specie nei Paesi in via di sviluppo. Per poter trovare nuove strategie farmacologiche e vaccinali contro MTB è di fondamentale importanza lo studio dei meccanismi, che permettono la sua sopravvivenza ai vari stress ambientali, ai quali è sottoposto durante il periodo di infezione e latenza nei macrofagi dell’ospite. La fine regolazione della trascrizione di geni specifici in risposta a condizioni di stress e la peculiare struttura della sua parete giocano in merito un ruolo fondamentale. Nella prima parte del progetto di dottorato sono stati caratterizzati due fattori di trascrizione sigma micobatterici, SigE e SigF, che regolano la trascrizione di geni specifici in risposta a vari tipi di stress ambientali, come lo stress di superficie, lo stress ossidativo, il pH alcalino e lo shock termico. Anzitutto è stata studiata la regolazione trascrizionale, traduzionale e posttraduzionale del fattore di trascrizione con funzione extracitoplasmatica (ECF) SigE. Per quanto riguarda lo studio della regolazione trascrizionale, è stato possibile confermare tramite esperimenti di 5’RACE PCR e RT-PCR la presenza di tre promotori di sigE, e a dosare, a seconda delle condizioni ambientali di crescita batterica, il contributo di ciascun promotore nella trascrizione di questo gene. Dato che l’inizio della trascrizione di uno di questi promotori è sito 63 paia di basi a valle del codone di start annotato nel genoma, si è aperta l’ipotesi dell’esistenza di due isoforme di SigE. Mediante fusioni traduzionali tra specifiche sequenze di sigE con lacZ, private del proprio codone di inizio della traduzione, e successive mutagenesi sito-specifiche, è stato possibile confermare, in base all’attività beta-galattosidasica rilevata, l’esistenza di due codoni di start alternativi, un ATC ed un TTG, che codificano per un’isoforma di rispettivamente 218 e 215 di amminoacidi, oltre all’ATG già annotato nel genoma di MTB, che codifica per un’isoforma di 257 amminoacidi. Infine è stato possibile confermare, che il gene a valle di sigE codifica per il fattore anti-sigma di SigE, denominato RseA, in grado di legare entrambe le isoforme di SigE. In un secondo progetto è stato studiato anche il ruolo del fattore SigF di M. smegmatis nella biosintesi di pigmenti carotenoidi, nella resistenza a perossido d’idrogeno e nell’efficienza di trasformazione batterica. Tramite RT-PCR è stato dimostrato che SigF controlla la trascrizione di geni coinvolti nella biosintesi dei pigmenti carotenoidi, e, partendo dal presupposto che essi fungono da protezione contro i radicali liberi, è stato verificato che il mutante per il gene sigF è effettivamente più sensibile rispetto al ceppo selvatico al trattamento con perossido d’idrogeno. Infine è stato dimostrato anche, che il ceppo mutante possiede una maggiore efficienza di trasformazione rispetto al ceppo selvatico, indicando che SigF regola probabilmente la trascrizione di geni coinvolti nella permeabilità della parete. Nella seconda parte del progetto è stata caratterizzata la localizzazione della proteina PPE17 sulla superficie micobatterica. Come altri membri della famiglia PPE, la PPE17 presenta un dominio N-terminale altamente conservato, il quale, in base a diverse evidenze in letteratura, si suppone svolgere un ruolo importante per la loro traslocazione in superficie. Inoltre, si è voluto verificare un’eventuale influenza della presenza della proteina PE11 nel processo di traslocazione in o nella stabilità della PPE17, in quanto la sequenza codificante la PE11 è in tandem e co-trascritta con quella codificante la PPE17, e vi è un’interazione specifica tra queste due proteine. I dati ottenuti mediante saggi di sensibilità alla proteinasi K su ceppi di M. smegmatis, esprimenti la PPE17 intera o solo il suo dominio PPE (dPPE17) fuse all’epitopo HA, confermano che la PPE17 intera sia esposta in superficie, sia in presenza che in assenza di PE11. In base ai dati ottenuti si è infine tentato di veicolare un antigene modello (Mpt64) di MTB sulla superficie del ceppo vaccinale M. bovis BCG fondendolo con il dPPE17. Saggi di sensibilità alla proteinasi K e ELISA su cellule intere effettuati su culture di M. bovis BCG esprimenti questa proteina chimerica indicano, che essa sia effettivamente localizzata a livello superficiale. Allo stesso modo sono state costruite due ulteriori fusioni con il dPPE17 per esprimere sulla superficie micobatterica l’antigene multimerico Ag85-ESAT6 di MTB e l’antigene Csp C3 di Plasmodium berghii. In base a saggi di sensibilità alla proteinasi K svolti su ceppi di M. smegmatis esprimenti le due fusioni anche in questo caso entrambe localizzano in superficie. I ceppi di M. bovis BCG esprimenti questi antigeni sulla loro superficie saranno testati in futuro nel modello del topo per misurare un eventuale aumento della protezione rispetto al ceppo selvatico.

I macrofagi giocano un ruolo essenziale nella risposta immune a Mycobacterium tuberculosis (Mtb), ma Mtb ha evoluto una serie di meccanismi per superare le risposte macrofagiche e può sopravvivere a lungo all’interno del macrofago umano. Lo studio della risposta trascrizionale all’infezione sia dell’ospite che del patogeno, potrebbe essere interessante per conoscere meglio questa interazione. Con questo scopo noi abbiamo analizzato, a livello trascrizionale, la relazione tra virulento Mtb e macrofago umano dopo 7 giorni di infezione, usando la tecnica del macroarray. Noi abbiamo settato una procedura sperimentale per arricchire di RNA micobatterico, l’RNA totale estratto dalle cellule infettate. Inoltre abbiamo ottimizzato il processo di retrotrascrizione per la generazione del cDNA di Mtb, usando primers specifici per il batterio. Quindi abbiamo analizzato le alterazione di Mtb intracellulare rispetto a Mtb cresciuto in un terreno di coltura sintetico, usando un macroarray con l’intero genoma di Mtb, e abbiamo studiato il profilo di espressione genica dei macrofagi infettati, rispetto ai non infettati, usando un macroarray contenente 858 geni umani coinvolti in processi immunoregolatori. L'analisi globale del trascrittoma di Mtb descritta in questo studio evidenzia un batterio che sente attivamente l’ambiente che lo circonda e che si adatta alle condizioni ostili intracellulari. Dal punto di vista del macrofago, invece, l’infezione determina un’up-regolazione di geni codificanti principalmente molecole con ruolo chemotattico, indicando che il macrofago umano mantiene, dopo 7 giorni di interazione col patogeno, la propria capacità di reclutare altre cellule al sito di infezione. I dati di alcuni geni ottenuti dall’ array sono stati confermati in real-time polymerase chain reactions (PCR). In questo contesto noi abbiamo sviluppato un saggio SYBR Green real-time PCR più specifico e sensibile per rilevare mRNAs micobatterici, rari e ricchi in GC, da campioni di cellule infettate.
Macrophages play an essential role in the immune response to Mycobacterium tuberculosis (Mtb), but Mtb evolved effective mechanisms to survive most macrophage effector functions and it can persist within macrophage longtime. The study of transcriptional response to infection of both host and pathogen, should be interesting to better understand this interaction. To this aim we analyzed, at transcriptional level, the relationship of virulent Mtb and human macrophages after 7 days of infection by macroarrays technique. We set up the experimental procedure to enrich in mycobacterial RNA the total RNA extracted from Mtb-infected cells. We optimized also, the reverse transcription process for Mtb cDNA generation, using Mtb specific primers. Then, we studied simultaneously the gene expression profile of the host and the pathogen. We analyzed the alterations in intracellular Mtb, respect to Mtb grown in synthetic medium, using a macroarray with the whole Mtb genome and the gene expression profile of infected macrophages, versus uninfected ones, using a macroarray containing 858 human genes involved in immunoregulation. The global Mtb transcriptome described in this study suggests an intracellular Mtb that actively sense and adapt itself to hostile environment. On the other hand, human macrophages up-regulate, mainly, genes encoding for molecules with a chemotactic role, indicating their maintenance of capacity to recruit other cells at the site of infection, after 7 days of interaction with the pathogen. The data for a selected group of the modulated genes were confirmed by real-time polymerase chain reactions (PCR). In this context we developed a more sensitive and more specific SYBR Green real-time PCR assay to detect rare and GC-rich mycobacterial mRNAs from infected samples.

In questo studio è stato valutato il ruolo di tre citochine fondamentali nella risposta immune ai micobatteri, IFN-γ, IL-2 e IL-17, in soggetti con infezione NTM, sani e controlli di malattia, allo scopo di identificare biomarcatori ematici da poter utilizzare a fine diagnostico in test ELISpot. Lo studio è stato condotto sia su una popolazione pediatrica che su una popolazione adulta di soggetti con micobatteriosi, testandovi la produzione da parte dei linfociti T delle tre citochine in esame, in risposta a lisati delle specie più comuni di NTM. Nell’ultima parte dello studio una parte delle PBMC, provenienti dai soggetti adulti, è stata utilizzata per creare linee T antigene-specifiche le quali sono state successivamente nanoingegnerizzate con nanoparticelle (NP) di magnetite fluorescenti al fine di creare un sistema di delivery specifico.