Academic literature on the topic 'Méthode SELEX'

Les ribozymes sont des ARN naturels ou artificiels possédant une activité catalytique. Les ribozymes artificiels ont été identifiés in vitro par la méthode SELEX, et plusieurs d'entre eux ont été caractérisés par des études cinétiques. Ces molécules sont impliquées dans des réactions de clivage, de ligation, de modification d'extrémités d'ARN, de polymérisation, de phosphorylation et d'activation de groupements acyl. Parce qu'elle est nécessaire à la traduction, l'aminoacylation des ARN joue un rôle évolutif important dans la transition du monde de l'ARN vers le monde moderne de l'ADN et des protéines, et elle est centrale à l'établissement du code génétique. Plusieurs ribozymes catalysant le transfert d'acides aminés à partir de cofacteurs activants ont pu être isolés et caractérisés depuis une vingtaine d'années, ce qui a documenté la possibilité d'aminoacylation d'ARNt en l'absence des aminoacyl ARNt synthétases. En développant un nouveau protocole SELEX basé sur l'oxydation au périodate, le but de notre travail est de découvrir de nouveau ribozymes d'une taille de l'ordre d'une vingtaine de nucléotides pouvant combiner la catalyse de l'activation des acides aminé et la transestérification. Bien que des molécules catalysant l'une ou l'autre des deux réactions ont été identifiées, aucun ribozyme n'existe à ce jour qui puisse utiliser des acides aminés libres et un cofacteur activant pour réaliser l'aminoacylation en 3' dans un même milieu réactionnel. La sélection de molécules actives dans une approche SELEX exige la présence de régions constantes sur les deux extrémités des séquences pools aléatoires initiaux. Ces régions sont nécessaires pour l'amplification par PCR, mais elles imposent des contraintes importantes pour l'identification de ribozymes car elles peuvent complètement inhiber leur activité par interférence structurelle. Nous présentons un protocole optimisé qui minimise la taille de ces régions constantes. D'autre part, notre nouveau design est très spécifique pour la sélection d'ARN aminoacylés sur l'extrémité 3'. Ce protocole a été utilisé pour réaliser 6 à 7 cycles de sélection avec différents pools, et un enrichissement en séquences spécifiques a pu être mis en évidence. Bien que certains tests avec les pools sélectionnés a révélé une activité possible, des essais avec des séquences spécifiques de ces pools n'ont pour l'instant pas pu confirmer l'activité catalytique recherchée. Un protocole basé sur le même principe de sélection a été utilisé dans une étude parallèle pour identifier les ARN aminoacylés présents dans l'ARN total d'Escherichia coli. Dans ce deuxième travail, note but est d'identifier tous les d'ARN aminoacylés par séquençage massif, avec à la clé la découverte possible de molécules autres que les ARNt et ARNtm. En utilisant les ARNt comme modèle, nous nous sommes aperçus qu'un protocole RNAseq standard n'était pas adapté à cause des bases modifiées présentes sur ces molécules. Nous avons développé et mis au point un nouveau protocole pour l'identification de n'importe quelle séquence aminoacylée en 3'. La nouvelle approche présentée devrait permette l'étude exhaustive de l'aminoacylation de toutes les séquences présentes dans l'ARN total
Ribozymes are natural or in vitro selected RNA molecules possessing a catalytic activity. Artificial ribozymes have been extensively investigated by in vitro SELEX experiments, and characterized by kinetic assays. Ribozymes are involved in RNA cleavage, ligation, capping, polymerization, phosphorylation and acyl activation. Because it is required for translation, RNA aminoacylation plays an important role in the evolution from the late RNA world to the modern DNA and protein world, and is central to the genetic code. Several ribozymes catalyzing amino acid transfer from various activating groups have already been selected and characterized in the past two decades, documenting the possibility of tRNA aminoacylation in the absence of aminoacyl tRNA synthetase. With a newly designed SELEX protocol based on periodate oxydation, the aim of our investigation is to uncover small ribozymes of the order of 20 nucleotides that could catalyze both amino acid activation and transesterification. Although molecules catalyzing either reaction have been identified, no existing ribozyme could use free amino acids and activating cofactor(s) as substrates for 3' esterification in a single reactional context. The selection of active molecules in a SELEX procedure requires the presence of constant tracks on both ends of the sequences constituting the initial random pools. These tracks are required for PCR amplification, but they impose significant burden to the identification of ribozymes because they can prevent any activity through structural inhibition. We present an optimized protocol that significantly minimizes the size of these constant tracks. At the same time, our newly design protocol is very specific for the selection of 3'-end aminoacylated RNA. Working with this protocol, we performed 6 to 7 cycles of selection with different pools, and observed an enrichement with specific sequences. Although some experiments performed with entire pools did reveal a possible activity, no activity could be so far confirmed with specific sequences. A similar protocol was also applied in a parallel study to identify aminoacylated RNA from total RNA in Escherichia coli. In this other approach, our goal is to possibly identify new classes of aminoacylated RNA while using the deep sequencing technology. Using tRNA to validate our protocol, we realized that a standard RNAseq procedure could not work due to the presence of modified bases. We established a new method for bank preparation to identify any sequence aminoacylated at the 3' end. Ultimately, this new approach will allow us to study the level of aminoacylation of any sequence present in total RNA

Le virus de l'hépatite delta humaine (VHD) est un pathogène infectieux qui est associé à une hépatite fulminante chez l'humain. Ce virus possède un génome circulaire d'ARN simple brin comportant deux régions auto-catalytiques (ribozymes). Ce présent travail a pour but d'étudier le mécanisme moléculaire ainsi que le sentier de repliement tridimensionnel subit par ce ribozyme au cours de l'événement de coupure. Afin d'atteindre ce but, nous allons identifier toutes les interactions incluant les bases des ribonucléotides composant le coeur catalytique de ce ribozyme. Pour ce faire, nous utiliserons l'approche de sélection in vitro (SELEX). Malgré son utilisation commune pour l'étude du ribozyme delta , l'approche de SELEX n'a jamais donné de résultats concluants au sujet de la tectonique de ce ribozyme pendant l'événement de coupure. Ceci est dû au fait que dans toutes les analyses précédentes, le site catalytique de ce ribozyme n'a jamais été totalement dégénéré. Par conséquent, nous avons développé une stratégie de SELEX unique qui nous permettra éventuellement de dégénérer tous les nucléotides du site catalytique et de sélectionner tous les ribozymes actifs existant dans une banque combinatoire."--Résumé abrégé par UMI.

Les flagelles ont été décrits comme un facteur de virulence important pour l'attachement initial à l'hôte ou à la surface des équipements hospitaliers. Cependant, la question de savoir comment les bactéries utilisent leurs flagelles pour passer d'un état flottant (planctonique) à un état d'attachement immédiat (sessile) reste ouverte. Cette transition implique la mécanodétection flagellaire. Il a été démontré que les méthylations des lysines dans les flagelles de S. Typhimurium facilitent l'adhésion de la bactérie à la surface ou au récepteur par le biais de l'hydrophobicité. Cependant, l'étude de l'ensemble du méthylome, et plus particulièrement la méthylation des protéines autres que des histones, reste un défi majeur en raison de l'absence de techniques efficaces d’enrichissement des protéines/peptides méthylés. Ici, pour étudier la méthylation des protéines et ses mécanismes chez S. Typhimurium et ses mutants, nous avons appliqué deux stratégies complémentaires pour l'enrichissement des protéines méthylées : l’enrichissement sélectif grâce à la sélection d’aptamères spécifiques, et la séparation de protéines/peptides méthylés par la technologie SCXtips à pH élevé. Des aptamères d'ADN spécifiques ont été obtenus après plusieurs cycles de sélection positive et un cycle de sélection négative à partir d'une bibliothèque d'oligonucléotides aléatoires par le biais de la procédure FluMag-SELEX. Plusieurs oligonucléotides issus du dernier tour de sélection ont été séquencés et des redondances de séquence de 10 %, 11 % et 33 % respectivement contre la MML, DML et TML, ont pu être observées. Une caractérisation plus fine de l’interaction entre l'aptamère sélectionné contre le TML et sa cible a été menée par différentes méthodes (ITC, PCR, liaison sur billes suivie d’une quantification par spectrométrie de masse). La spécificité a été confirmée tandis que l'affinité a été déterminée avec un KD=2,48±0,14 mM. Par la suite, nous avons exploité l’aptamère sélectionné en l’immobilisant à la surface de billes magnétiques afin de disposer d’un outil d’enrichissement des protéines/peptides méthylés sur différents modèles cellulaires. Après avoir validé la démarche sur un contrôle positif (cellules humaines HEK293), nous avons identifié 19 sites de méthylation de la lysine sur 5 protéines de Salmonella. Les résultats préliminaires de l'analyse protéomique ont confirmé que l'aptamère sélectionné était effectivement capable de distinguer et d'enrichir les protéines contenant de la méthyllysine provenant de souches de S. Typhimurium.Parallèlement, la technologie SCXtips à pH élevé a été utilisée comme stratégie de séparation à partir culture de souches bactériennes dans le milieu hM-SILAC. Cette méthode a permis d'identifier 23 sites de méthylation uniques chez la souche ΔmetE, 51 sites de méthylation uniques chez la souche ΔmetEΔmotAB, et enfin 18 sites uniques chez la souche ΔmetEΔfliB sur 19 protéines méthylées. En comparant les différences de méthylation des protéines, nos résultats suggèrent que lorsque les bactéries manquent de motilité, les méthylations de lysine dans les protéines bactériennes semblent être régulées à la hausse. Outre la méthylation par la méthylase FliB, un grand nombre d’événements de méthylation pourraient être régulés par d’autres méthylases
Flagella have been described as an important virulence factor for initial attachment to the host or to the surface of hospital equipment. However, how bacteria use their flagella to switch from a floating (planktonic) state to an immediately attached (sessile) state remains an open question. This transition involves flagellar mechanosensing or surface-sensing. It has been illustrated that lysine methylations in S. Typhimurium flagella facilitate bacterial adhesion to the surface or receptor via hydrophobicity. However, the study of the entire methylome, including non-histone methylation, remains a major challenge because of the lack of efficient methyl protein/peptide enrichment techniques. Here, to investigate protein methylation and its mechanisms in S. Typhimurium and its mutants, we applied two complementary strategies for methyl protein enrichment: aptamer-based enrichment technology and high pH SCXtips separation strategy. The specific DNA aptamers were obtained after performing several rounds of positive selection and one round of negative selection from a random oligonucleotide library through the FluMag-SELEX procedure. The selected ssDNA pools were sequenced and 10%, 11%, and 33% of redundant sequences for MML, DML, and TML, respectively have been observed. The highest redundancy was observed with oligonucleotides directed against TML. The interaction study of this aptamer with its target was then performed by the methods like ITC, PCR, and bead-based binding assays followed by mass spectrometry titration. The specificity was confirmed while the affinity was determined to be KD=2.48±0.14 mM. Then, the selected aptamer has been used as an enrichment tool based on the aptamer-bound beads method, in order to isolate methylated proteins or peptides on various cell lines. After the validation of our approach using a positive control (HEK293 cells), we identified 19 lysine methylation sites on 5 proteins from Salmonella Preliminary results from proteomic analysis confirmed that the selected aptamer was indeed able to distinguish and enrich methyllysine-containing proteins from S. Typhimurium strains and human cell lines. In parallel with this, the high pH SCXtips technology was performed as a complementary separation strategy when cultivating the strains in the hM-SILAC medium. Using this method, 23 unique methylation sites in ΔmetE, 51 unique methylation sites in ΔmetEΔmotAB, and 18 unique sites in ΔmetEΔfliB on 19 methylated proteins were identified. By comparing the differences in protein methylation, our results suggest that when bacteria lack motility, lysine methylations in bacterial proteins seem to be upregulated. Besides being methylated by the methylase FliB, a large number of methylation events could be regulated by other methylases

Le projet de thèse consiste à concevoir une nouvelle méthode d'évolution moléculaire d'acides nucléiques. Le couplage de la méthode SELEX avec la chimie bioorthogonale permettra d'identifier des ligands présentant des modifications chimiques. En augmentant ainsi la diversité chimique des oligonucléotides, il sera possible d'obtenir des ligands de haute affinité pouvant servir au diagnostic et à la thérapie.La preuve de concept de cette technique à l'interface entre la biologie et la chimie a tout d'abord nécessité la synthèse de composés augmentant la diversité moléculaire des oligonucléotides et donc potentiellement l'affinité de ceux-ci pour la cible. Les acides nucléiques sont ensuite fonctionnalisés par ces composés grâce à la chimie click. Une optimisation des étapes de synthèse et d'amplification enzymatique d'oligonucléotides modifiés a été réalisée par séquençage à haut-débit. Une validation de la méthode contre la Streptavidine a pu être réalisée et a abouti à l'identification de ligands dont l'interaction dépend de la modification chimique. L'affinité des ligands pour la cible a été évaluée, par différente méthodes (fluorescence et interférométrie de bio-couche)
The thesis project involves designing a new method for the molecular evolution of nucleic acids. Coupling the SELEX method with bioorthogonal chemistry will make it possible to identify ligands with chemical modifications. Increasing the chemical diversity of nucleic acids in this way will provide the opportunity to obtain high-affinity ligands that can be used for diagnosis and therapy.Proof of concept for this technique at the interface between biology and chemistry first required the synthesis of compounds that increase the molecular diversity of oligonucleotides and therefore potentially their affinity for the target. Nucleic acids are then functionalized by these compounds using click chemistry. The enzymatic synthesis and amplification steps using chemically modified oligonucleotides were optimized by high-throughput sequencing analysis. Our method was validated by selecting ligands against Streptavidin, whose interaction require chemical modifications. The affinity of the ligands was measured using different technics (Fluorescence and Bio-Layer Interferometry)

Les cancers, qu’il s’agisse de leucémies ou de tumeurs solides, sont le résultat de proliférations cellulaires anormales et non contrôlées au sein des tissus. Ces proliférations anarchiques sont le reflet d’une surexpression et/ou sur-activation de protéines intracellulaires engendrées par un événement oncogénique. Aujourd’hui encore il est donc nécessaire de trouver de nouvelles molécules à usage thérapeutique ciblant spécifiquement ces protéines. C’est dans ce contexte que les facteurs de transcription STAT5 constituent de véritables cibles de choix puisque ces protéines participent activement à la leucogénèse. L’implication directe des protéines STAT5 dans la génèse des leucémies a été démontrée par l’utilisation de formes mutées constitutivement active de STAT5. Les facteurs de transcription STAT5 jouent un rôle essentiel dans la voie de signalisation JAK/STAT. Cette voie aboutit à la régulation de grandes fonctions biologiques telles que la prolifération cellulaire, la différenciation cellulaire ou encore l’apoptose. L’objectif de ce projet consiste donc à cibler spécifiquement les protéines STAT5 dans le but de rétablir le processus de mort cellulaire et empêcher la prolifération des cellules cancéreuses. Les inhibiteurs spécifiques des protéines STAT5 sont sélectionnés selon la méthode SELEX qui permet d’isoler des ligands structurés de forte affinité pour la protéine. L’affinité et la spécificité de ces inhibiteurs, appelés aptamères, sont caractérisées à partir de modèles cellulaires de leucémies dépendant de l’activité des facteurs de transcription STAT5. Les aptamères sont aujourd’hui de véritables outils thérapeutiques en pleine évolution
Leukemias are due to abnormal cell proliferation, which is the result of intracellular over-expression or excessive activation of protein due to oncogenic event. Still today, it is necessary to find new therapeutic molecules, which specifically target these proteins. STAT5, via the JAK/STAT signaling pathway, controls fundamental cellular processes, including .cell survival, proliferation and differentiation. To struggle against tumorigenesis, JAK/STAT signaling pathway has to be inhibited. The aim of this project is to target specifically STAT5 factors to restore healthy signal transduction. We generated aptamers by an iterative in vitro selection. Aptamers are short-structured single strand DNAs or RNAs that bind with high affinity and specificity to their target. Once STAT5B recombinant proteins are produced, they are subjected to SELEX process. The number of rounds depends on various parameters. After seven rounds, two sequences are retrieved. The specificity and affinity of these aptamers are assessed by fluorescent immunoassays. Binding affinity and kinetics of interaction are characterized by SPR. Aptamer anti proliferative effects are determined by evaluation of the growth of cells depending on STAT5. Finally, we developed several .assays aiming at understanding the mechanism of an aptamer action on STAT5B such as phosphorylation measurement and EMSA. Aptamers are now emerging therapeutic tools; they exhibit significant advantages relative to protein therapeutics

L’ochratoxine A ou OTA, mycotoxine de structure isocoumarinique chlorée, produite par les genres Aspergillus et Penicillium, est un contaminant de plusieurs produits alimentaires. Même à l’état de traces, l’OTA possède des effets néfastes sur la santé humaine et animale: effets néphrotoxiques, tératogènes, immunosuppressives, neurotoxiques et cancérogènes du groupe 2B (l’OTA a été considérée par l’IARC comme un cancérogène possible pour l’homme). Pour éviter ces problèmes de santé publique, plusieurs directives préconisent de limiter la présence de l’OTA dans divers aliments. Dans le but d’assurer la sécurité alimentaire et par respect des normes européennes, plusieurs méthodes analytiques, principalement basées sur des techniques chromatographiques, ont vu le jour. Malgré leur efficacité, ces méthodes demeurent très coûteuses et nécessitent un personnel qualifié, d’où l’intérêt de développer de nouvelles technologies basées sur les méthodes biochimiques. Le principe de ces techniques est basé sur une interaction molécule cible-élément de reconnaissance. On utilise dans ce travail de thèse une nouvelle classe de molécules appelées : les aptamères. Ce sont des séquences oligonucléotidiques ADN ou ARN simple ou double brins, sélectionnés selon leur aptitude à reconnaitre une cible par une méthode combinatoire de sélection in vitro appelée SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponantial enrichment). L’objectif du présent travail est de développer de nouvelles méthodes à base d’aptamères pour la détermination de l’OTA dans les denrées alimentaires. Nous allons mettre au point deux méthodes: une méthode d’extraction et une méthode de détection. La première consiste en un oligoadsorbant ou colonnes d’affinité à base d’aptamères. La performance de cet outil d’extraction est évaluée en termes de rétention, spécificité, sélectivité et régénération. La seconde méthode est basée sur un aptacapteur développé dans un système entièrement automatisé en flux où toutes les manipulations et les optimisations sont effectuées par des séquences automatiques. Après optimisation, ces méthodes sont appliquées sur des échantillons réels de bière. Les limites de détection obtenues sont beaucoup inférieures aux normes fixées par la Commission Européenne. Les limites de détection et les rendements obtenus ont pu démontrer la faisabilité ainsi que l’intérêt potentiel de telles techniques analytiques pour des échantillons réels sans effets de matrice
Ochratoxin A (OTA), an isoucoumarinic mycotoxin produced by the genra Aspergillus and Penicillium, is a common contaminant of several foodstuffs. Even in trace amounts, OTA has adverse affects on human and animal health: nephrotoxic, teratogenic, neurotoxic, immunosuppressive and it was considered by the international Agency of Research on Cancer (IARC) as a potential carcinogenic agent (group 2B). In order to meet food safety concerns and official legislated regulations, analytical methods, mainly based on chromatographic techniques, have been reported for OTA detection. Despite their effectiveness, these techniques remain expensive and require qualified skilled personnel, alternatives strategies are emerging and novel technologies based on biochemical methods. These techniques are based on the interaction target-recognition element. We use in this work, a new class of biomolecules called aptamers. They are single or double stranded DNA or RNA, selected by their ability to recognise a target, by a combinatorial method of selection in vitro called SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponantial enrichment). The aim of this work is the development of new methods based on aptamers for OTA determination in foodstuffs. We will develop two methods, one method for extraction and another one for detection. The first one consists in an aptamer-based affinity column or oligosorbent. This device of extraction was evaluated in term of retention, specificity, selectivity and regeneration. While the second is based on an aptasensor developed in a fully automated system. All the optimizations and manipulations were performed using automated sequences. After optimizations, these two methods are applied for OTA determination in real beer samples. The obtained limits of detection are much lower than the maximum tolerated levels of OTA in set by the European commission. Also, the high recovery yields obtained show the good applicability of the developed oligosorbent and aptasensor in real sample without matrices effect

En raison de leur capacité à former des spores extrêmement résistantes à la chaleur, certaines bactéries thermophiles non pathogènes sont responsables de nombreuses détériorations parmi les aliments en conserve, engendrant de lourdes pertes économiques et du gaspillage alimentaire. Deux espèces, Geobacillus stearothermophilus et Moorella thermoacetica, sont majoritairement à l’origine de ces contaminations et représentent plus de 65 % des cas de non stabilité détectés. Les méthodes culturales et moléculaires existantes à ce jour présentent des inconvénients en termes de durée d’analyse et d’applicabilité sur le terrain, limitant leur utilisation pour la détection des spores de ces bactéries.Le projet Spores-Quantum, dans lequel s’inscrit cette thèse, vise donc au développement de systèmes d'analyse en temps réel permettant de détecter et de quantifier directement les spores de Geobacillus stearothermophilus et Moorella thermoacetica au sein d’une flore microbienne complexe. Soutenu par le programme Carnot Qualiment, il est le fruit d’une collaboration entre le Centre Technique de la Conservation des Produits Agricoles (CTCPA), centre technique industriel de référence pour les professionnels de la conserve français, et le laboratoire Biocapteurs, Analyses, Environnement (BAE-LBBM, UAR 3579) de l’Université de Perpignan Via Domitia. Plus précisément, cette thèse s’est focalisée sur le développement d’aptamères comme éléments de reconnaissance spécifique des spores des deux espèces cibles. Un protocole Spore-SELEX couplé à une PCR en émulsion et un séquençage à haut débit a été réalisé avec succès uniquement pour la sélection de candidats à la reconnaissance des spores de G. stearothermophilus. Ainsi, 18 cycles SELEX successifs ont été mis en oeuvre comprenant 4 cycles de contre-sélection envers 12 espèces bactériennes couramment retrouvées le long des lignes de fabrication. Le séquençage des aptamères du cycle 18 a révélé 70 séquences surreprésentées dont le nombre de copies dépasse 0,15 % du total des séquences obtenues. Dans ce groupe, l'aptamère G001 a présenté un enrichissement très élevé avec une abondance relative de plus de 18 %. L'affinité et la spécificité pour les spores de G. stearothermophilus des 13 candidats les plus abondants au cycle 18 ont été confirmées par un test PCR basé sur la formation d'un complexe aptamère-spore et une étape de filtration. D’autres méthodes de détermination de l’affinité aptamère/spore ont également été explorées et sont présentées dans ce manuscrit. L'obtention de ces aptamères est le point de départ pour le futur développement de biocapteurs dédiés à la détection des spores de G. stearothermophilus
Due to their ability to form extremely heat-resistant spores, some non-pathogenic thermophilic bacteria are responsible for many spoilages of canned food products, resulting in high economic losses and food waste. Two species, Geobacillus stearothermophilus and Moorella thermoacetica, are mainly responsible for these contaminations and represent more than 65% of the cases of non-stability detected. The existing cultural and molecular methods have drawbacks in terms of analysis time and applicability in the field, which limits their use for the detection of the spores of these bacteria.This thesis work forms part of the Spores-Quantum project, which aims developing real-time analysis systems for the direct detection and quantification of G. stearothermophilus and M. thermoacetica spores in complex microbial environments. Supported by the Carnot Qualiment programme, it is the result of a collaboration between the Centre Technique de la Conservation des Produits Agricoles (CTCPA), an industrial technical reference center for French canning professionals, and the Biosensors, Analyses, Environment laboratory (BAE-LBBM, UAR 3579) of the University of Perpignan Via Domitia. More precisely, this thesis focused on the development of aptamers as specific recognition elements of the two target species. A Spore-SELEX protocol associated with emulsion PCR and high-throughput sequencing was successfully performed only for the selection of G. stearothermophilus spore specific aptamers. Then, 18 successive SELEX cycles, including 4 counter-selections cycles against 12 bacterial species commonly found along the production lines. Candidate sequences from cycle 18 revealed 70 over-represented sequences with copy numbers exceeding 0.15% of the total sequences obtained. In this group, the G001 aptamer showed a very high enrichment with a relative abundance higher than 18 %. The affinity and specificity for G. stearothermophilus spores of the 13 most abundant candidates at cycle 18 were confirmed by a PCR assay based on aptamer-spore complex formation and a filtration step. Other methods for determining aptamer/spore affinity were also explored and are presented in this manuscript. The obtained aptamers will be used in the near future for developing biosensors dedicated to the detection of G. stearothermophilus spores