Dissertations / Theses on the topic 'Mesenchimali'

Bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) account for a small population of cells of the non-hematopoietic component of bone marrow. MSCs are multipotent stem cells endowed with neurotrophic potential combined to immunological properties, making them a promising therapeutic tool for neurodegenerative disorders. Although the mechanisms by which they act are still largely unknown, trans-differentiation, paracrine and autocrine actions have been hypothesized. Here we focus on the study of the effects exerted by rat MSCs on CNS neurons and oligodendrocytes by using a simplified in vitro co-culture system that precludes any direct contact between different cell types. The analysis of hippocampal synaptogenesis, synaptic vesicle recycling and electrical activity show that MSCs by themselves, efficiently support morphological and functional neuronal differentiation. Our observations demonstrate that MSCs selectively and directly increased hippocampal GABAergic presynapses and inhibitory transmission. In fact, this increment correlated to a higher expression of the potassium/chloride KCC2 cotransporter and to an enhancement of both the frequency and the amplitude of mIPSC and sIPSC. The decreased of GABA synapses following the treatment with a widely used Trk-neurotrophin receptor blocker, K252a, and the more specific TrkB receptor bodies prompt for the involvement of the brain derived neurotrophic factor (BDNF) in mediating such effects. The involvement of this neurotrophin is also strengthened by test ELISA on the culture medium collected from MSC-neuron co-cultures in which an higher BDNF concentration was detected, when compared to astrocyte-neuron co-cultures. The results obtained indicate that MSC-secreted factors induce glial-dependent neuronal survival and directly trigger an augmented GABAergic transmission in hippocampal cultures, highlighting a new effect by which MSCs could cooperate in CNS repair. Additionally, MSCs have been described to improve the clinical course of some demyelinating pathologies and to promote tissue repair through immunological mechanisms and neuroprotective effects. Following these evidences we performed in vitro and in vivo experiments to assess whether MSCs exert their actions through the support of oligodendrocytes (OLs), the myelinating CNS cells, and participate in the regulation of their proliferation and maturation. Through the analysis of specific proteins typically used as markers of the different stages of proliferation, maturation and differentiation (specifically, the membrane glycoprotein O4, the proteoglycan NG2 and myelin basic protein MBP, respectively), it has been noticed that MSCs are capable to prolong the proliferation phase of OPCs and also to anticipate OL differentiation, with respect to standard astrocyte/OL co-cultures. Moreover we investigated a possible molecular mechanism underlying these phenomena focusing on neurotrophin pathways. Trk receptors activation was analyzed in order to find out a possible role of neurotrophins in MSC-mediated effects on OLs, as it happens in neuronal cultures. We focused on the changes in the phosphorylation level of ERK (Extracellular signaling-regulated kinases), one of the activated effectors by TrK receptors. Our observations show that, in OLs co-cultured with MSCs, ERK is highly phosphorylated with respect to astrocyte/OL co-cultures, suggesting a MSC-induced activation of the pathways regulated by this protein. These data, although preliminary, suggest that MSCs positively act on the regulation of proliferation and maturation of OLs and, due to the observed effects on the regulation of synaptogenesis (see above), make these cells an interesting model for the identification of molecules involved in MSC neuroprotective processes. This may open new therapeutic approaches in the treatment of neurodegenerative diseases involving not only a synaptic imbalance, as it happens in various forms of epilepsy, but also in demyelinating diseases. Thus, in this research project, we aimed at characterising the molecular mechanisms underlying MSC actions that could participate in the recovery of neurological disorders or demyelinating pathologies.

Le cellule staminali mesenchimali (Mesenchymal Stem Cells, MSCs) sono una popolazione con elevata capacità proliferativa e con potenziale di differenziazione multilineare; rappresentano, quindi, delle buone candidate per la terapia cellulare e la medicina rigenerativa. In questo studio sono state valutate MSCs fetali isolate da villi coriali (Chorionic Villi, CV) e da liquido amniotico (Amniotic Fluid, AF), confrontandole con le MSCs ottenute da midollo osseo (Bone Marrow, BM), per la capacità di crescita in presenza di siero umano allogenico (human serum, HS) o di lisato piastrinico (platelet lysate, PL), per le caratteristiche immunofenotipiche, il profilo di espressione citochinico e l’attività immunoregolatoria su linfociti allogenici stimolati e sottopopolazioni immunoselezionate. Data l’elevata potenzialità di espansione delle MSCs fetali, le cellule studiate sono state valutate per la loro stabilità replicativa tramite lo studio della lunghezza dei telomeri, l’attività dell’enzima telomerasi, l’espressione dei geni hTERT, c-myc e p53 e l’analisi del cariotipo. Una popolazione omogenea di cellule fibroblastoidi positiva ai tipici marcatori di superficie mesenchimali è stata isolata da tutti i campioni di CV ed AF analizzati. Le cellule di CV espandono rapidamente in HS (20 raddoppiamenti di popolazione, PDs, in 59 giorni e 6 passaggi di coltura), mentre in siero animale (fetal bovine serum, FBS) raggiungono 27 PDs in 65 giorni e 7 passaggi. Il PL determina un’espansione nel 60% dei campioni CV, comunque minore rispetto a quella in HS. I campioni di AF espandono, invece, 40 PDs in 90 giorni, ma solo nel 20% dei campioni analizzati, non proliferano in PL, mentre in FBS espandono 28.5 PDs in 66 giorni. Le cellule fetali studiate inibiscono la proliferazione di linfociti allogenici stimolati e regolano la crescita anche di popolazioni linfocitarie selezionate CD4+ e CD8+. Nonostante il loro elevato potenziale di espansione, le MSCs fetali studiate hanno mostrato una lunghezza stabile dei telomeri durante la cultura a lungo termine, assenza dell’attività telomerasica, nessuna espressione di hTERT, livelli costanti di espressione di c-myc e p53 e nessuna anomalia cromosomica. In conclusione, i risultati mostrano che i CV rappresentano un’ottima fonte di MSCs con proprietà immunoregolatorie, capace di espandere in un sistema di proliferazione umanizzato a lungo termine senza alterazioni genetiche. In più del 90% dei campioni di CV analizzati si ottiene un’espansione su larga scala in presenza di siero umano, incoraggiante per potenziali applicazioni cliniche.
Mesenchymal stem cells (MSCs) are promising candidates for cell therapy and tissue engineering. In previous studies, the most important source of MSCs was adult bone marrow (BM). Recently, MSCs with similar cell surface markers and differentiation capacity have also been found in developmentally younger tissues. This study showed data from fetal MSCs obtained from first-trimester chorionic villi (CV) and second trimester amniotic fluid (AF), comparing them with BM. The work reports on growth in human allogeneic serum (HS) and platelet lysate (PL), immunophenotype, cytokine expression profile and immunoregulatory activity of fetal MSCs on stimulated peripheral blood mononuclear lymphocyte subpopulations. The cells studied was analyzed also for telomere length, telomerase activity, hTERT, p53 and cmyc transcriptions, to evaluate their replicative stability. Spontaneous chromosomal alterations were excluded by cytogenetic analysis. CV cells grow rapidly in HS, with 20 populations doublings (PDs) after 59 days (6 passages), and also in animal serum, with 27 PDs after 65 days (7 passages). PL allowed an expansion in 60% of the samples tested, though it was lower than HS. HS supported an average of 40 PDs of expansion in 20% of AF cells after 90 days, whereas animal serum supported 28.5 PDs in 66 days. CV and AF cells inhibited the proliferation of stimulated T lymphocytes, suppressing the growth of both CD4+ and CD8+ T subpopulations and, sometimes, CD19+ cells. Despite their high proliferation capacity, fetal MSCs showed no telomerase activity, no hTERT transcriptions and maintained long, stable telomeres. A constant expression level of p53 and c-myc and a normal karyotype were preserved throughout long-term expansion, suggesting the safety of fetal MSCs. In conclusion, these results indicate that CV would be an optimal and safety source of MSCs with high expansion potential in a HS propagation system, immunoregulatory capacity of T and B lymphocytes. More than 90% of CV samples achieved a large-scale expansion in HS, that is encouraging for potential clinical applications of these cells.

SOMMARIO I prodotti di ingegneria tissutale sono medicinali che contengono o consistono in cellule o tessuti sottoposti ad una rilevante manipolazione così da ottenere caratteristiche biologiche, funzioni fisiologiche e proprietà strutturali pertinenti alla finalità di rigenerazione, riparazione o sostituzione. Nel caso di cellule e tessuti manipolati in vitro, l'obiettivo da raggiungere nel controllo dei processi di produzione e della qualità del prodotto finale è garantire la sicurezza e l'efficacia dei prodotti da immettere nell'uso clinico. Ne consegue la necessità di operare nel rispetto di norme proprie dei processi produttivi dei farmaci sia dal punto di vista della qualità che della sicurezza del prodotto. Lo scopo del lavoro svolto durante il dottorato è stato lo studio e messa a punto di sistemi di produzione per la generazione di un prodotto innovativo per terapie avanzate. Si tratta di un prodotto costituito da cellule staminali mesenchimali, ottime candidate per applicazioni cliniche in medicina rigenerativa. Per la produzione di un prodotto di terapia avanzata, l’intero processo, a partire dal campione iniziale fino al prodotto finito, deve essere svolto in un’officina farmaceutica autorizzata che operi nel rispetto delle Good Manufacturing Practices (GMP). Si tratta di linee guida il cui scopo è assicurare che un farmaco sia prodotto, analizzato e rilasciato in un regime di Qualità controllata e certificata in modo da minimizzare il pericolo che vi siano rischi non previsti per il paziente. Nella fase preliminare del processo è stata valutata la fattibilità del metodo e sono stati definiti i protocolli da impiegare. La fase di fattibilità ha permesso di mettere a punto la procedura di isolamento, espansione, differenziamento delle cellule staminali. E’ stato possibile valutare la stabilità genomica e le caratteristiche immunofenotipiche delle cellule a vari passaggi cellulari. Tutti i dati ottenuti durante lo studio di fattibilità sono stati fondamentali per definire i test di controllo di qualità, le specifiche di prodotto e i criteri di accettabilità richiesti per la successiva convalida del processo. I risultati presentati durante lo studio di fattibilità evidenziano come sia possibile trasferire protocolli di ricerca in processi potenzialmente applicabili in sperimentazione clinica. Alla fine del processo di convalida che prevede la produzione di tre lotti di cellule, le specifiche previste per i controlli in ingresso, durante il processo di produzione e sul prodotto finito devono risultare conformi a tutte le richieste. I passi futuri sono la validazione del processo asettico, mediante l’esecuzione di tre mediafill e la valutazione del rischio relativa alla produzione di lotti destinati alla clinica, in modo da completare la serie di studi necessari per la presentazione di una domanda di autorizzazione allo studio clinico.
ABSTRACT Tissue Engineered products may carry cells or tissues either of human or animal origin. The cells and tissues shall be subjected to substantial manipulation in order to obtain biological characteristics, physiological functions or structural properties relevant for the intended regeneration, repair or replacement. For cells and tissues manipulated in vitro, the objective to be achieved in terms of control of production processes and quality of the final product is to ensure the safety and effectiveness of the products that would be placed in clinical use. Hence the need to act in accordance with the rules which define production processes used for drugs, in order to guarantee the quality and safery of the product.. The purpose of the work done during the PhD was the study and the development of production protocol for the generation of an innovative product for advanced therapies. It is a cellular product made of mesenchymal stem cells, good candidates for clinical applications in regenerative medicine. For this production, all stages, starting from the initial sample and up to the final product, must be carried out in an authorized pharmaceutical facility which operates in compliance with Good Manufacturing Practices (GMP). The purpose of these guidelines is to ensure that drugs are produced, analysed and released in a regime of controlled and certified quality minimizing the danger of unexpected risks for the patient. In the preliminary phase of the process the feasibility of the method was evaluated and the protocols to be used were defined. The feasibility phase allowed the development of procedures for the isolation, expansion and differentiation of stem cells. It was possible to evaluate the genomic stability and immunophenotypic features of the cells at different steps. All data obtained during the feasibility study have been fundamental to define the tests of quality control, product specifications and criteria of acceptability required for the subsequent validation of the process. The results presented in the feasibility study show that it is possible to transfer research protocols to a GMP framework which is potentially applicable in clinical trials. At the end of the validation process, which involves the production of three batches of cells, the specifications required for the incoming controls, during the production’s process and on the final product must comply with all the requirements. The future steps will be the validation of the aseptic process, through the execution of three mediafill and the risk assessment related to the production of batches intended for clinical use, in order to complete the series of documents required for the submission of an application for a clinical study.

Le cellule staminali mesemchimali (MSC) sono una popolazione eterogenea di cellule stromali multipotenti, possono essere isolate da diversi tessuti adulti e possono dare origine a diversi tipi cellulari(21). Nel midollo osseo (BM) differenziano principalmente in osteoblasti e adipociti, e l’ interazione con questo microambiente influenza da vicino il loro programma differenziativo. FasL è una citochina molto conosciuta per il suo ruolo pro-apoptotico, in associazione con il suo recettore specifico Fas, tuttavia diversi studi propongono che sia coinvolta anche in altri processi biologici. Questo lavoro dimostra per la prima volta che FasL può essere coinvolto nella proliferazione e nella differenziazione delle BM-MSC. Le BM-MSC trattate con una bassa dose di FasL (0.5 ng/ml) proliferano più rapidamente delle cellule non trattate, senza andare incontro ad apoptosi o a processi differenziativi, mentre dosi più alte (25 ng/ml) inducono il processo apoptotico nel 20% delle cellule, selezionando una popolazione con un fenotipo ancora staminale. A livello molecolare il trattamento con FasL 0.5 ng/ml induce la fosforilazione di ERK 1/2 e l’aumento dell’espressione della survivina mentre FasL 25 ng/ml determina l’attivazione delle caspasi 8 e 3. Inoltre FasL 25 ng/ml attraverso la modulazione di PPARγ e FABP4/aP2 inibisce reversibilmente la differenziazione delle BM-MSC in adipociti. I dati di inibizione dell’adipogenesi in vitro sono stati confermati su topi Fas lpr, mutati per Fas, che hanno mostrato una maggiore espressione dell’mRNA e delle proteine PPARγ e FABP4/aP2 rispetto ai controlli. I nostri dati suggeriscono che il sistema FasL/Fas è coivolto nella biologia delle BM-MSC, e può regolarne sia la proliferazione che il differenziamento adipogenico. Questi risultati possono avere una rilevanza clinica, chiarendo i meccanismi che determinano l’aumento dell’adipogenesi nel midollo durante l’invecchiamento o in alcune condizioni patologiche come l’osteoporosi.
Mesenchymal stem cells (MSCs) are multipotent progenitor cells that can differentiate into several cell types. Bone marrow (BM)-MSCs mainly differentiate into osteoblasts or adipocytes. MSC interactions with their microenvironment directly affect their self-renewal/differentiation program. Here we show for the first time that FasL, a well-explored pro-apoptotic cytokine, can promote proliferation of BM-derived MSCs in vitro and inhibits their differentiation into adipocytes. BMMSCs treated with a low FasL dose (0.5 ng/ml) proliferated more rapidly than untreated cells without undergoing spontaneous differentiation or apoptosis, whereas higher doses (25 ng/ml) induced significant though not massive BM-MSC death, with surviving cells maintaining a stem cell phenotype. At the molecular level, 0.5 ng/ml FasL induced ERK1/2 phosphorylation and surviving up-regulation, whereas 25 ng/ml FasL induced caspase activation. Importantly, 25 ng/ml FasL reversibly prevented BM-MSC differentiation into adipocytes by modulating PPARγ and FABP4/aP2 expression induced by adipogenic medium. All such effects were inhibited by anti-Fas neutralizing antibody. The in vitro data regarding adipogenesis were confirmed using Faslpr mutant mice, where higher PPARγ and FABP4/aP2 mRNA and protein levels were documented in whole tibia. These data show that the FasL/Fas system plays a role in BM-MSC biology via regulation of both proliferation and adipogenesis. These findings may have clinical relevance because circulating Fas/FasL levels decline with age and several age-related conditions, including osteoporosis, are characterized by adipocyte accumulation in BM.

L'ingegneria tissutale è un campo multidisciplinare in rapida crescita che si avvale delle scienze fisiche, ingegneristiche e della vita per sviluppare ed ottenere cellule funzionali, tessuti ed organi per riparare, sostituire o migliorare le funzioni biologiche perse a causa di anomalie congenite, traumi, malattie o invecchiamento. Nell’ambito della ricostruzione della cartilagine articolare sono stati fatti notevoli passi in avanti ma la soluzione per il ripristino completo del tessuto sembra ancora essere lontana. Nella prima parte di questo lavoro è stata valutata la capacità di uno scaffold a base di gelatina di indirizzare le ADSCs verso un differenziamento in senso condrogenico. Successivamente, con lo scopo di migliorare il grado differenziamento e diminuire i costi associati all’utilizzo di fattori differenziativi, l’attenzione è stata posta sullo sviluppo di un biomateriale a base di alginato e ioni cobalto in modo da mimare e sfruttare le caratteristiche fisiche della cartilagine piuttosto che il suo intorno chimico. In ultimo, è stato sviluppato un sistema low cost per la produzione di chip microfluidici sfruttabili per la realizzazione di sistemi micrometrici per incapsulazione cellulare.
Tissue engineering is an interdisciplinary and multidisciplinary field that aims at the developmentof biological substitutes that restore, mantain, or improve tissue function. Concerning the articular cartilage many improvments were made, but the complete tissue restoration approach still lacking. In the first part of this work, it was evaluated the ability of a gelatin scaffold to promote the condrogenic differentiation of ADSCs. Successively, in order to obtain a low cost sistem, a based alginate/Cobalt scaffold was designed with the aim to take advantage of the physical features of the cartilage tissue. Finally, it was developted a cost effective method to produce microfluidic chips with the aim to obtain micro-systems for cell encapsulation.

L'ingegneria tissutale è un campo multidisciplinare in rapida crescita che si avvale delle scienze fisiche, ingegneristiche e della vita per sviluppare ed ottenere cellule funzionali, tessuti ed organi per riparare, sostituire o migliorare le funzioni biologiche perse a causa di anomalie congenite, traumi, malattie o invecchiamento. Nell’ambito della ricostruzione della cartilagine articolare sono stati fatti notevoli passi in avanti ma la soluzione per il ripristino completo del tessuto sembra ancora essere lontana. Nella prima parte di questo lavoro è stata valutata la capacità di uno scaffold a base di gelatina di indirizzare le ADSCs verso un differenziamento in senso condrogenico. Successivamente, con lo scopo di migliorare il grado differenziamento e diminuire i costi associati all’utilizzo di fattori differenziativi, l’attenzione è stata posta sullo sviluppo di un biomateriale a base di alginato e ioni cobalto in modo da mimare e sfruttare le caratteristiche fisiche della cartilagine piuttosto che il suo intorno chimico. In ultimo, è stato sviluppato un sistema low cost per la produzione di chip microfluidici sfruttabili per la realizzazione di sistemi micrometrici per incapsulazione cellulare.
Tissue engineering is an interdisciplinary and multidisciplinary field that aims at the developmentof biological substitutes that restore, mantain, or improve tissue function. Concerning the articular cartilage many improvments were made, but the complete tissue restoration approach still lacking. In the first part of this work, it was evaluated the ability of a gelatin scaffold to promote the condrogenic differentiation of ADSCs. Successively, in order to obtain a low cost sistem, a based alginate/Cobalt scaffold was designed with the aim to take advantage of the physical features of the cartilage tissue. Finally, it was developted a cost effective method to produce microfluidic chips with the aim to obtain micro-systems for cell encapsulation.

Introduzione. Un’infiltrazione infiammatoria e un’eccessiva proteolisi della matrice extracellulare(ECM), mediata da metallo-proteinasi(MMPs), sono alterazioni dell’aneurisma dell’addominale(AAA). Le cellule staminali mesenchimali(MSC) sono state isolate dalla parete vascolare e rappresentano potenziali candidati target per la medicina rigenerativa in virtù di differenziazione mesodermica e immuno-modulatoria. Scopo dello studio è stato valutare la presenza di un potenziale ruolo delle MSCs nello sviluppo di AAA. Metodi. Sono stati prelevati segmenti di parete aortica aneurismatica da AAA sottoposti a trattamento chirurgico open e segmenti di tessuti aortici da donatori sani. È stata effettuata valutazione istologica della parete di AAA. Le MSCs sono state isolate dal tessuto di AAA(AAA-MSC) e caratterizzate. Le AAA-MSCs sono poi state testate per caratteristiche di immuno-modulazione mediante co-colture di cellule mononucleate attivate(PBMC)da sangue periferico e di MSCs da donatore sano. Risultati. Le cellule AAA-MSCs hanno mostrato proprietà feno/genotipiche mesenchimali: forma fibroblastica, presenza di antigeni MSC e geni staminali. Le MMP-9 sono risultate significativamente aumentate in AAA-MSCs rispetto MSCs. Le AAA-MSCs hanno dimostrato una debole attività immunosoppressiva. I livelli di MMP-9 sono modulate a livello trascrizione attraverso 'azione paracrina di MSCs sane. Conclusioni. L’AAA non ha influenzato il fenotipo delle MSC, ma ne ha alterato la funzione, aumentando l’attività di MMP-9 e mostrando un’inefficace attività di immuno-modulazione. Questi dati suggeriscono che le MSCs della nicchia vascolare contribuiscono alla formazione diAAA. Lo studio dei processi per ripristinare l’immunomodulazione delle MSsC potrebbe essere utile per trovare un approccio medico per il monitoraggio/progressionee degli AAA.
Background. inflammatory infiltrate and excessive extracellular matrix proteolysis (ECM), by Metalloproteinasis (MMPs), are typical characteristics of abdominal aortic aneurysm (AAA). Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) have been detected in the vascular wall and represent attractive target for regenerative medicine, due to the mesodermal lineage differentiation and immunomodulatory activity. Previous papers underlined an impaired MSC behaviour under pathological conditions. Aim of the study was to define the potential role of vascular MSCs to AAA development. Methods. Aortic tissues were collected from patients with AAA and healthy donors. The analysis was organized in three steps: 1) histology of AAA wall; 2) detection of MSCs and evaluation of MMP-9 expression in AAA; 3) MSC isolation from AAA and characterization for mesenchymal/stemness markers, MMP-2, MMP-9, TIMP-1, TIMP-2 and EMMPRIN. AAA-MSCs were tested for immunomodulation, when cultured with activated peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). Co-culture of both healthy and AAA MSCs was performed and afterwards MMP-2/9 mRNA levels were analyzed. Results. AAA-MSCs showed mesenchymal features: fibroblastic aspect, MSC antigens, stemness genes. MMP-9 mRNA, protein and enzymatic activity were increased in AAA-MSCs. Moreover, AAA-MSCs showed a weak immunosuppressive activity, as shown by PBMC ongoing along cell cycle. MMP-9 was shown to be modulated at the transcriptional level through the contact as well as the paracrine action of healthy MSCs. Discussion. Vascular injury did not affect the MSC phenotype, but altered their function, as increased MMP-9 expression and ineffective immunomodulation. These data suggest that vascular MSCs can contribute to aortic disease. The study of key processes to restore MSC immunomodulation could be relevant to find a pharmacological approach for the aneurysm progression

Background. Mesenchymal stem cells (MSC) may be of value in regeneration of renal tissue after damage, however lack of biological knowledge and variability of results in animal models limit their utilization. Methods. We studied the effects of MSC on podocytes ‘in vitro’ and ‘in vivo’ utilizing adriamycin (ADR) as a model of renal toxicity. The ‘in vivo’ experimental approach was carried out in male Sprague Dawley rats (overall 60 animals) treated with different ADR schemes to induce acute and chronic nephrosis. MSC were given a) concomitantly to ADR in tail vein or b) in aorta and c) in tail vein 60 days after ADR. Homing was assessed with PKH26-MSC. Results. MSC rescued podocytes from apoptosis induced by ADR ‘in vitro’. The maximal effect (80% rescue) was obtained with MSC/Podocytes co-culture ratio of 1:1 for 72 hours. All rats treated with ADR developed nephrosis. In no case MSC modified the clinical parameters (i.e. proteinuria, serum creatinine, lipids) but protected the kidney from severe glomerulosclerosis when given concomitantly to ADR. Rats given MSC 60 days after ADR developed the same severe renal damage. Only few MSC were found in renal tubule-interstitial areas after 1-24 hours from injection and no MSC was detected in glomeruli. Conclusions. MSC reduced apoptosis of podocytes treated with ADR ‘in vitro’. Early and repeated MSC infusion blunted glomerular damage in chronic ADR nephropathy. MSC did not modify proteinuria and progression to renal failure, that implies lack of regenerative potential in this model.

Background. Mesenchymal stem cells (MSC) may be of value in regeneration of renal tissue after damage, however lack of biological knowledge and variability of results in animal models limit their utilization. Methods. We studied the effects of MSC on podocytes ‘in vitro’ and ‘in vivo’ utilizing adriamycin (ADR) as a model of renal toxicity. The ‘in vivo’ experimental approach was carried out in male Sprague Dawley rats (overall 60 animals) treated with different ADR schemes to induce acute and chronic nephrosis. MSC were given a) concomitantly to ADR in tail vein or b) in aorta and c) in tail vein 60 days after ADR. Homing was assessed with PKH26-MSC. Results. MSC rescued podocytes from apoptosis induced by ADR ‘in vitro’. The maximal effect (80% rescue) was obtained with MSC/Podocytes co-culture ratio of 1:1 for 72 hours. All rats treated with ADR developed nephrosis. In no case MSC modified the clinical parameters (i.e. proteinuria, serum creatinine, lipids) but protected the kidney from severe glomerulosclerosis when given concomitantly to ADR. Rats given MSC 60 days after ADR developed the same severe renal damage. Only few MSC were found in renal tubule-interstitial areas after 1-24 hours from injection and no MSC was detected in glomeruli. Conclusions. MSC reduced apoptosis of podocytes treated with ADR ‘in vitro’. Early and repeated MSC infusion blunted glomerular damage in chronic ADR nephropathy. MSC did not modify proteinuria and progression to renal failure, that implies lack of regenerative potential in this model.

La fibrosi cistica (FC) è una malattia genetica letale, autosomica recessiva, causata dalla mutazione del gene Cystic Fibrosis Trasmembrane Conductance Regulator (CFTR) che codifica per una proteina canale che regola la conduzione transmembrana di cloro, cAMP- dipendente, espressa sul lato apicale delle cellule epiteliali. Il difetto di base dell’epitelio respiratorio nei pazienti è duplice ossia riguarda la secrezione di cloro e l’assorbimento di sodio. Ne deriva un alterato flusso di fluidi attraverso l’epitelio, con alterata clearance mucociliare respiratoria, cicli di infezioni batteriche e infiammazione ed infine grave danno polmonare. Principale causa di morbilità e mortalità è l’infiammazione cronica che colpisce il polmone. Sono stati scoperti farmaci agenti direttamente sulla CFTR ma non riescono a risolvere il difetto associato a tutte le mutazioni responsabili della FC. La terapia cellulare, invece, essendo agnostica per la mutazione, ha la possibilità di poter curare ogni paziente. Oltre al midollo osseo, nuova promettente fonte di cellule staminali è la membrana amniotica, da cui derivano cellule stromali mesenchimali amniotiche umane (hAMSC) che esprimono marcatori di staminalità e possono differenziare in cellule epiteliali respiratorie quando co-coltivate con cellule epiteliali bronchiali umane immortalizzate (CFBE14o-), omozigoti per l’allele F508del, mutazione più frequente nella FC. Le co-colture mostrano un’aumentata espressione e funzionalità della CFTR e una parziale correzione di altri difetti di base associati alla FC. Poiché tali risultati vengono ottenuti solo nelle co-colture, è stato supposto che un contatto diretto tra hAMSC e CFBE14o- sia necessario per il recupero di tali difetti. Uno degli obiettivi di questa tesi è stato comprendere il ruolo della comunicazione intercellulare, mediata dalle gap junctions (GJ), nelle co-colture studiate per l’espressione e la funzionalità della proteina Cx43, una delle principali componenti delle GJ, silenziando o meno le stesse con un siRNA diretto contro l’mRNA di interesse. I risultati evidenziano il ruolo fondamentale delle GJ nella correzione dei difetti di base associati alla FC da parte delle hAMSC. Si è, quindi, indagato quale messaggero molecolare potesse essere trasmesso attraverso le GJ e, eventualmente, mediare l’effetto terapeutico delle hAMSC. Anche i microRNA (miRNA) vengono trasferiti attraverso le GJ ed è stato dimostrato il loro coinvolgimento nei livelli di espressione della CFTR. In particolare, miRNA-138 aumenta l’espressione della CFTR interagendo con la proteina SIN3A. Sono stati quindi studiati i livelli di miRNA-138 mediante droplet digital PCR. I dati preliminari mostrano come le cellule wild-type abbiano dei livelli più alti di miRNA-138 rispetto alle CFBE14o- con un trend all’aumento nelle co-colture. Ulteriore obiettivo è stato studiare se le hAMSC possano velocizzare la rigenerazione dell’epitelio respiratorio bronchiale e la chiusura delle lesioni che continuamente si formano sotto lo stimolo infiammatorio cronico nei polmoni dei pazienti con FC. I risultati dimostrano che le hAMSC aggiunte ad una ferita indotta su un monostrato di CFBE14o-, sono in grado di riparare il danno con la stessa tempistica richiesta ad una ferita simulata su monostrato di cellule epiteliali bronchiali wild type. Questi studi indicano la possibile utilità terapeutica delle cellule hAMSC nella malattia polmonare associata alla FC, sebbene ulteriori studi sul loro meccanismo d’azione e in modelli più vicini alla patologia umana siano necessari.
Cystic fibrosis (CF) is a lethal, autosomal recessive inherited genetic disease caused by mutation on the Cystic Fibrosis Trasmembrane Conductance Regulator (CFTR) gene encoding a cAMP-dependent channel protein that regulates transmembrane conduction of chloride, which is expressed on the apical membrane of epithelial cells. The basic defect of the airway epithelium in CF patients is due to a double defect in chloride secretion and sodium absorption that lead to an altered flow of fluids through the epithelium of the airways, resulting in an alteration of the airway’s mucociliary clearance, opportunistic bacterial infections, inflammation and severe lung damage. The main cause of morbidity and mortality is chronic inflammation affecting the lung. New drugs have been developed recently to act directly on the CFTR protein, in order to rescue the mutated CFTR processing and function. However, there are still mutations that still failed to be rescued by CFTR modulators. Cell therapy, on the other hand, being agnostic for mutation, has the possibility of being able to cure every patient. Recently have been investigated stem cells as potential therapeutic sources for CF. In addition to the bone marrow, stem cells derived from the amniotic membrane, human amniotic mesenchymal stem cells (hAMSC) are very promising as they express stem cells markers and can differentiate into respiratory epithelial cells when they are co-cultured with immortalized human bronchial epithelial cells (CFBE14o-), homozygous for the F508del allele, the most frequent mutation in CF. The co-cultures also show an increased processing and conductance of the CFTR protein and a partial correction of other basic defects associated with the disease. Since these results are obtained only in co-cultures, it has been assumed that direct contact between hAMSC and CFBE14o- is necessary for the recovery of these defects. One of the objectives of this thesis was to understand the role of intercellular communication, mediated by gap junctions (GJ), in co-cultures that were studied for the expression and functionality of the Cx43 protein, one of the main components of GJ, before and after their silencing, obtained using a siRNA directed against the mRNA of interest. The results highlighted the fundamental role of GJ in the correction of the basic defects associated with CF by hAMSC. It was further investigated which molecular messenger could be transmitted through the GJ and, possibly, mediate the therapeutic effect of hAMSC. MicroRNAs (miRNAs) are also transferred across GJ and their involvement in the expression levels of the CFTR protein has been demonstrated. In particular, miRNA-138 increases the expression of the CFTR protein by interacting with the SIN3A protein. The levels of miRNA-138 were then investigated by droplet digital PCR. Preliminary data show that wild-type CFTR cells have higher levels of miRNA-138 than cells with F508del mutation and that there is an upward trend in co-cultures. A further objective of the study was to investigate whether hAMSC can speed up the regeneration of the airway bronchial epithelium and the closure of the injury that continuously form under the chronic inflammatory stimulus in the lungs of CF patients. The results demonstrate that hAMSC added to a wound induced on a monolayer of CFBE14o-, are able to repair the damage with the same timing required for a simulated wound on a monolayer of wild type CFTR bronchial epithelial cells. Taking to account the data generated in the current study, it indicates the possible therapeutic utility of hAMSC in lung disease associated with CF. However, further studies on their mechanism of action conducted in models with closer resemblance to human CF pathology are required.

RIASSUNTO E SCOPO DEL LAVORO Esiste una stretta correlazione tra obesità e osteoporosi: nell'obesità si riscontra una maggiore fragilità ossea ed un ridotto assorbimento di calcio a livello intestinale, mentre l'osteoporosi è spesso accompagnata da un aumento dell'adipogenesi midollare. In questi ultimi anni un'area della ricerca scientifica si è concentrata sullo studio di nuovi farmaci/sostanze in grado di agire sull'adipogenesi o sull'osteoblastogenesi in quanto è fondamentale trovare nuove terapie che prevengano tali patologie. Conoscendo la stretta relazione tra il differenziamento adipogenico e osteogenico, un farmaco contro l'obesità non dovrebbe avere effetti sul metabolismo osseo, mentre contro l'osteoporosi non dovrebbe avere effetti sull'adipogenesi. A tale proposito gli studi in vitro rappresentano un punto importante sia per valutare l’effetto di tali sostanze che per comprendere i meccanismi alla base delle loro azioni. La maggior parte degli studi condotti sul differenziamento adipocitico, e sulla sua inibizione, sono stati condotti su linee di preadipociti murini (3T3-L1) o umani, mentre sono state utilizzate linee murine MC3T3-E1 e C3H10T1/2 per il differenziamento osteogenico. Nonostante la rilevanza dei dati ottenuti grazie a questi modelli cellulari, i risultati sono spesso controversi, anche in considerazione del fatto che i processi differenziativi nell’uomo e nei roditori possono essere regolati a livello molecolare in modo significativamente diverso. Inoltre questi modelli sono basati su cellule già indirizzate verso il differenziamento adipocitico o osteogenico, e quindi non prendono in considerazione il processo di determinazione che porta la cellula progenitrice ed indifferenziata verso un lineage mesengenico. Le cellule staminali mesenchimali (MSC) in questo contesto rappresentano un modello cellulare particolarmente utile in quanto possono essere efficacemente indotte da uno stato indifferenziato allo stato di adipociti o osteoblasti, di cui peraltro rappresentano fisiologicamente i precursori biologici. Lo scopo di questa tesi è stato quello di valutare l'effetto di Acido Valproico (AVP), Valpromide (VPM), Berberina (BRB), Hibiscus Sabdariffa (HIB) e Resveratrolo (RESV) sul differenziamento adipogenico e osteogenico di cellule staminali mesenchimali umane (hMSC). Le hMSC utilizzate in questo studio sono state caratterizzate e corrispondono ai criteri minimi stabiliti dalla letteratura (Dominici et al., 2006) per poterle definire MSC. Tre le condizioni necessarie: capacità di aderire alla plastica assumendo una morfologia simil-fibroblastica; negatività per i marker ematopoietici CD34 e CD45 e positività per i marker CD29, CD90, CD105 e CD73; capacità, sotto opportune condizioni di coltura, di differenziare nei lineage mesengenici ovvero in osteoblasti, condroblasti ed adipociti. Questo lavoro si è articolato in 5 fasi: 1) Valutazione della tossicità delle diverse sostanze. Per valutare la tossicità delle sostanze precedentemente elencate, le hMSC indifferenziate e le MSC differenziate in senso adipogenico e osteogenico sono state trattate con ciascuna delle diverse sostanze a differenti concentrazioni e sono stati effettuati saggi di vitalità. Sono stati condotti due tipi di test: MTT assay, che valuta l'attività mitocondriale come indicatore della vitalità cellulare e SRB assay, che valuta il contenuto proteico per stimare il numero delle cellule vitali. Sulla base dei risultati ottenuti sono state individuate le concentrazioni non tossiche dei diversi composti da utilizzare negli esperimenti successivi. 2) Effetto delle diverse sostanze sul differenziamento adipogenico e osteogenico. A partire da hMSC indifferenziate è possibile studiare l’intero processo adipogenico trattando le cellule con un terreno (DMEM high glucose) di induzione contenente fattori adipogenici (desametasone 1μM, indometacina/isobutilmetilxantina 100μM/500μM, insulina 10μg/ml) per i primi 10 giorni e successivamente, fino al 28° giorno, con un terreno di mantenimento (contenente insulina 10μg/ml) per la maturazione in senso adipogenico. Le diverse sostanze sono state somministrate alle hMSC sin dal momento dell'induzione e portate fino al 28° giorno di differenziamento adipogenico. L'effetto anti-adipogenico è stato valutato mediante colorazioni istologiche specifiche per i trigliceridi presenti nei depositi lipidici degli adipociti: la colorazione con Oil Red O per osservare la morfologia cellulare mentre la colorazione Nile Red, esaminata mediante citofluorimetro a flusso, per determinare il numero di cellule differenziate. I risultati dimostrano che AVP, BRB, HIB e RESV presentano un effetto anti-adipogenico, mentre VPM non ha dimostrato avere effetto sul differenziamento adipogenico. Successivamente è stato valutato l'effetto di AVP, VPM e HIB aggiunte dopo 3, 7, 10, 14 e 21 giorni dall'induzione adipogenica e analizzate tutte al 28°giorno. Con questi dati abbiamo dimostrato che solo AVP ha un effetto anti-adipogenico, anche quando viene aggiunto dopo 3 o 7 giorni dall'induzione. L'aggiunta di VPM e HIB a tempi diversi dall'induzione non ha portato a delle variazioni significative rispetto alle hMSC indotte con solo il terreno adipogenico. Per il differenziamento osteogenico le hMSC sono state trattate con uno specifico terreno (DMEM low glucose) contenente fattori osteogenici (desametasone 100nM, acido ascorbico 2-fosfato 50μM e βglicerolo 2-fosfato10mM) fino al 28° giorno. La valutazione del differenziamento osteogenico è stata effettuata mediante la colorazione istologica Alizarin red S, che evidenzia la deposizione di calcio mineralizzato. Le diverse sostanze, alle dosi precedentemente scelte, sono state aggiunte inizialmente al terreno osteogenico delle hMSC e portate fino al 28°giorno di trattamento. Da questi esperimenti abbiamo ottenuto risultati differenti per le diverse sostanze valutate. AVP e VPM determinano un precoce differenziamento osteogenico delle hMSC rispetto alle cellule trattate con solo il terreno di differenziamento. Infatti in presenza di AVP e VPM il differenziamento si osserva già dopo 10gg rispetto alle cellule trattate con solo terreno osteogenico. BRB e HIB presentano invece un effetto anti-osteogenico, poichè con l’aggiunta di queste sostanze nel terreno non si osserva deposito di matrice mineralizzata e la colorazione istologica risulta negativa. Le cellule trattate con RESV non mostrano differenze significative rispetto alle cellule trattate con solo terreno osteogenico. Successivamente per AVP, VPM e HIB è stato valutato l'effetto della sostanza aggiunta dopo 3, 7, 10, 14 e 21 giorni dall'induzione osteogenica e analizzate tutte al 28°giorno. Da questi dati abbiamo dimostrato che HIB ha un effetto anti-osteogenico anche quando aggiunta dopo 3, 7, 10 e 14 giorni dall'induzione. L'aggiunta di AVP e VPM a tempi diversi dall'induzione non ha portato variazioni significative rispetto alle hMSC indotte con solo il terreno osteogenico. 3) Valutazione dell'effetto delle sostanze sulla fosforilazione di ERK1/2 durante il differenziamento adipogenico e osteogenico. Mediante esperimenti di immunoblotting abbiamo studiato la fosforilazione (forma attiva) di ERK1/2 per poter capire i meccanismi molecolari alla base delle azioni di tali sostanze nei due diversi differenziamenti. Nelle hMSC, trattate per il differenziamento adipogenico con l'aggiunta di AVP, VPM, BRB, HIB e RESV non si sono osservate variazioni significative nella fosforilazione di ERK1/2 rispetto alle hMSC indotte con solo il terreno adipogenico. Nel differenziamento osteogenico abbiamo osservato a 10giorni una riduzione significativa della forma fosforilata di ERK1 nelle cellule trattate con VPM o BRB rispetto alle cellule trattate con solo terreno osteogenico; la forma fosforilata di ERK2 non varia. A 14giorni solo le cellule trattate con terreno osteogenico e BRB presentano una riduzione significativa di entrambe le forme pERK1/2 rispetto alle cellule trattate con solo terreno osteogenico. 4) Valutazione dell'effetto di Acido Valproico, Valpromide e Hibiscus Sabdariffa sui livelli di fosforilazione di GSK3β e di espressione di βcatenina. Per comprendere meglio il meccanismo d'azione di AVP, VPM e HIB abbiamo studiato, mediante esperimenti di immunoblotting, i livelli di fosforilazione (forma inattiva) di GSK3β e i livelli di espressione di βcatenina nelle hMSC trattate per il differenziamento adipogenico e osteogenico con l'aggiunta delle tre sostanze. Per quanto riguarda il differenziamento adipogenico solo a 3giorni di induzione abbiamo osservato nelle hMSC indotte al differenziamento con l'aggiunta di AVP un aumento significativo di pGSK3β, rispetto alle hMSC trattate con solo il terreno adipogenico. Analizzando i livelli di βcatenina a 12ore, 1, 3giorni non abbiamo rilevato variazioni significative tra le hMSC indotte al differenziamento adipogenico sia in presenza che in assenza delle sostanze. Analizzando i dati relativi al confronto tra le hMSC indotte al differenziamento osteogenico, in presenza o assenza delle sostanze, non abbiamo riscontrato differenze significative nei livelli di pGSK3β per tutti i tempi analizzati. Abbiamo osservato una riduzione significativa nei livelli di βcatenina a 3, 10 e 14giorni in hMSC trattate per il differenziamento osteogenico con l'aggiunta di AVP, mentre solo a 10giorni si osserva una riduzione significativa di βcatenina anche per le hMSC trattate con VPM rispetto alle hMSC indotte con solo terreno osteogenico. 5) Valutazione dell'effetto di Acido Valproico, Valpromide e Hibiscus Sabdariffa sull'espressione genica di C/EBPβ, PPARγ, RUNX2 e OSTERIX. Infine è stato valutato, mediante qPCR, l’effetto di AVP, VPM e HIB sull'espressione genica di C/EBPβ, PPARγ, RUNX2 e OSTERIX (importanti fattori trascrizionali adipogenici e osteogenici) durante il differenziamento adipogenico e osteogenico di hMSC. Dai risultati ottenuti si osserva che le hMSC indotte al differenziamento adipogenico con l'aggiunta di AVP hanno dei livelli di espressione significativamente maggiori per C/EBPβ e significativamente minori per PPARγ rispetto alle hMSC indotte con solo terreno adipogenico. Durante il differenziamento osteogenico si osserva un aumento significativo di Runx2 nelle hMSC trattate con AVP rispetto alle hMSC indotte con solo terreno osteogenico. L'analisi dei nostri risultati ha evidenziato che la sostanza più promettente per un eventuale uso terapeutico sembra essere l’Acido Valproico perché, oltre ad inibire il differenziamento adipogenico, sembra avere un effetto pro-osteogenico sulle hMSC indotte al differenziamento osteogenico anche se saranno necessari ulteriori studi per comprendere a pieno il meccanismo d'azione di tale sostanza.

La Sindrome di Shwachman (SDS) è una rara malattia genetica, autosomica recessiva, caratterizzata da insufficienza pancreatica, disfunzioni ematologiche, displasie scheletriche e disordini cognitivi. Nel 90% dei pazienti vengono riscontrate mutazioni a carico del gene SBDS. Similarmente ad altre sindromi midollari, i pazienti affetti da SDS hanno un aumentato rischio di insorgenza di mielodisplasie e leucemia, ma i meccanismi responsabili di questa predisposizione non sono ancora stati indagati in modo approfondito. Le cellule mesenchimali stromali (MSCs) vengono considerate fattori con un ruolo fondamentale nel mantenere e sostenere la plasticità e la sopravvivenza delle cellule staminali all’interno della nicchia midollare. Studi recenti hanno dimostrato inoltre come mutazioni specifiche a livello delle MSCs possono essere fattori sufficienti per disregolare i sottili equilibri omeostatici all’interno della nicchia e dare inizio ad un processo di trasformazione neoplastica. Il nostro gruppo ha dimostrato che MSCs derivate da pazienti affetti da SDS erano comparabili a quelli di donatori sani per quanto riguarda le loro caratteristiche in vitro (marcatori di superficie, capacità di differenziare in diversi lineages, abilità nel sostenere la vitalità di cellule CD34). La gene expression analysis condotta su 16 SDS-MSCs in realtà mostra come queste cellule avessero un pattern di espressione genica differente da quello delle mesenchimali di donatori sani, suggerendo come le mesenchimali SDS potessero avere un ruolo nei disordini ematologici riscontrati nella malattia. In questo studio abbiamo aumentato la corte di pazienti e, avvalendoci di un modello in vivo, abbiamo studiato il possibile coinvolgimento delle MSCs nei disordini ematopoietici. Il nostro modello prevedeva l’impianto sottocutaneo in topi immunocompromessi di pellet cartilaginei derivanti da MSCs da donatori sani e pazienti stimolate per 21 giorni con un particolare medium di differenziamento. Dopo 60 giorni, gli animali sono stati sacrificati e gli ossicoli recuperati per l’analisi istologica. Dai nostri dati emerge come, al termine del periodo sperimentale, solo i pellet derivati da MSCs di donatore sano siano stati in grado di formare una nicchia midollare completa, con presenza di trabecole ossee, adipociti e cellule ematopoietiche murine. Di contro, nessuno dei pellet derivati da paziente è stato ritrovato vascolarizzato o colonizzato da cellule ematopoietiche. L’analisi a time point precoci ci ha permesso di individuare dei difetti nel processo differenziativo dei pellet derivati da pazienti, che non mostravano riassorbimento cartilagineo, né deposizione di matrice ossea o processi di vascolarizzazione. Questo dato ci suggerisce come nel nostro modello le mesenchimali da paziente mostrino difetti nel loro processo differenziativo e di conseguenza possano essere coinvolte anche nei disordini ematologici a carico del midollo. Nella seconda parte del nostro studio abbiamo testato un farmaco su cellule ematologiche e non ematologiche di paziente. Questo farmaco agisce sulle nonsense stop codon mutation, una delle mutazioni più diffuse nei pazienti SDS a carico del gene SBDS, consentendo il read-through della mutazione non senso e quindi la produzione di una proteina completa. I nostri risultati hanno mostrato l’azione positiva di questo farmaco in diverse linee cellulari (linfoblastoidi, mesenchimali e mononucleate da midollo), restorando la produzione della proteina. Inoltre, il trattamento con questo farmaco ha anche prodotto miglioramenti a livello funzionale nelle cellule mononucleate. In particolare queste cellule, in seguito al trattamento, hanno mostrato un significativo aumento nella capacità di dare colonie CFU-GM. Questo risultato ha forti conseguenze a livello clinico poiché, non avendo mostrato effetti tossici, questo farmaco potrebbe essere proposto per la cura dei disordini ematologici in questi pazienti.
Shwachman-Diamond Syndrome (SDS) is a rare autosomal recessive disease, characterized by exocrine pancreatic disorder, hematological aberrancies, bone marrow failure and cognitive impairment. In 90% of patients the SBDS gene is found mutated. Similar to other marrow failure syndromes, SDS patients have an increased risk for developing myelodysplastic syndrome and AML. To date, the mechanisms underlying the bone marrow failure in SDS patients are not fully understood. Microenvironment constituents and in particular mesenchymal stromal cells (MSCs) are considered the pivotal organizers for the generation, maintenance and plasticity of the hematopoietic stem cell niche. Recent studies show that specific changes in MSCs may be sufficient to initiate a complex phenotype of disordered homeostasis with similarities to myelodysplasia. We have demonstrated that MSCs obtained from SDS patients were comparable in vitro to HD but gene expression analysis of 16 SDS-MSCs showed that these cells had a specific gene expression signature compared to HD. These results suggest that it is possible that MSCs could be involved in the pathogenesis of the SDS marrow disorders. We increased our patients cohort and investigated whether SDS-MSCs were able to sustain malignant evolution using an innovative scaffold-free in vivo system based on the ex vivo generation of semi-cartilaginous pellets (SCPs) from human MSCs. We obtained SCPs stimulating MSCs for 21 days with a specific differentiating medium and a complete and correct formation of cartilaginous tissues both in HD and SDS samples. These SCPs were transplanted heterotopically into subcutaneous tissue of immunocompromised mice. After 60 days, we sacrificed mice and collected ossicles. We found that in 90% of cases, HD were able to recreate the hematopoietic microenvironment, with the establishment of a complete marrow niche, while none of the transplanted SDS-SCPs was able to recreate the hematopoietic microenvironment, revealing a defect in these differentiating process. The second part of our study was focused on testing a specific drug able to act on nonsense stop codon mutation, one of the most diffuse alterations in SDS patients, linked to risk of developing myelodysplastic syndrome. We successfully obtained restoration of SBDS protein in different cell lineages deriving from patients (Lymphoblastoids, MSCs, mononuclear cells from bone marrow). Protein restoration was also accompanied in some cases with an improvement of functionality. In particular, mononuclear cells from bone marrow treated with drug showed an increase in their ability to form colonies when cultured in a specific assay. This represents a powerful result, due to the potential clinical consequences related to possible therapeutic strategy. Indeed, SDS patients in future could take advantage of this drug to ameliorate their hematological defects and abolish other symptoms.

L’attività di ricerca ha riguardato lo studio di popolazioni di cellule staminali mesenchimali umane (MSC) ottenute da molteplici tessuti adulti. Sono state investigate sorgenti di MSC alternative al midollo osseo, libere da conflitti etici, dotate di vantaggi per l’applicabilità clinica che vanno dalla elevata resa nel recupero cellulare alla tessuto-specificità. Le cellule ottenute dalle diverse sorgenti sono state caratterizzate immunofenotipicamente, commissionate mediante protocolli di induzione specifici per i diversi tipi cellulari ed analizzate con opportuni saggi istologici, immunoistochimici, di espressione genica e proteica. Esperimenti di cocoltura hanno permesso la descrizione di capacità immunomodulatorie e trofiche. - La placenta a termine risulta essere una ricca sorgente di cellule staminali mesenchimali (MSC). Dalla membrana amniotica, dal corion e dalla gelatina di Wharton del cordone ombelicale sono state ottenute MSC con potenzialità differenziative verso commissionamenti mesenchimali, con capacità immunomodulatorie e trofiche. Tali tessuti sono ampiamente disponibili, garantiscono una elevata resa nel recupero cellulare e sono liberi da conflitti etici. - Due popolazioni di cellule con caratteristiche di MSC sono state individuate nella mucosa e nella sottomucosa intestinale. Queste cellule possiedono caratteristiche di tessuto-specificità, sono dotate di attività trofiche ed immunomodulatorie che potrebbero essere vantaggiose per approcci di terapia cellulare in patologie quali le Malattie Infiammatorie Croniche Intestinali (IBD). - Popolazioni di cellule staminali con caratteristiche simili alle MSC sono state ottenute da isole pancreatiche. Tali popolazioni possiedono vantaggi di tessuto-specificità per approcci di terapia cellulare per il Diabete. - Sono stati investigati ed individuati marcatori molecolari (molecole HLA-G) correlati con il livello di attività immunomodulatoria delle MSC. La valutazione di tali marcatori potrebbere permettere di determinare l’attività immunosoppressiva a priori del trapianto, con l’obiettivo di scegliere le popolazioni di MSC più adatte per l’applicazione e di definirne il dosaggio. - E’ stato messa a punto una metodica e una strumentazione per il frazionamento di cellule staminali in Campo Flusso in assenza di marcatura (NEEGA-DF). Questa metodica permette di discriminare sottopopolazioni cellulari in base a caratteristiche biofisiche.

L’attività di ricerca ha riguardato lo studio di popolazioni di cellule staminali mesenchimali umane (MSC) ottenute da molteplici tessuti adulti. Sono state investigate sorgenti di MSC alternative al midollo osseo, libere da conflitti etici, dotate di vantaggi per l’applicabilità clinica che vanno dalla elevata resa nel recupero cellulare alla tessuto-specificità. Le cellule ottenute dalle diverse sorgenti sono state caratterizzate immunofenotipicamente, commissionate mediante protocolli di induzione specifici per i diversi tipi cellulari ed analizzate con opportuni saggi istologici, immunoistochimici, di espressione genica e proteica. Esperimenti di cocoltura hanno permesso la descrizione di capacità immunomodulatorie e trofiche. - La placenta a termine risulta essere una ricca sorgente di cellule staminali mesenchimali (MSC). Dalla membrana amniotica, dal corion e dalla gelatina di Wharton del cordone ombelicale sono state ottenute MSC con potenzialità differenziative verso commissionamenti mesenchimali, con capacità immunomodulatorie e trofiche. Tali tessuti sono ampiamente disponibili, garantiscono una elevata resa nel recupero cellulare e sono liberi da conflitti etici. - Due popolazioni di cellule con caratteristiche di MSC sono state individuate nella mucosa e nella sottomucosa intestinale. Queste cellule possiedono caratteristiche di tessuto-specificità, sono dotate di attività trofiche ed immunomodulatorie che potrebbero essere vantaggiose per approcci di terapia cellulare in patologie quali le Malattie Infiammatorie Croniche Intestinali (IBD). - Popolazioni di cellule staminali con caratteristiche simili alle MSC sono state ottenute da isole pancreatiche. Tali popolazioni possiedono vantaggi di tessuto-specificità per approcci di terapia cellulare per il Diabete. - Sono stati investigati ed individuati marcatori molecolari (molecole HLA-G) correlati con il livello di attività immunomodulatoria delle MSC. La valutazione di tali marcatori potrebbere permettere di determinare l’attività immunosoppressiva a priori del trapianto, con l’obiettivo di scegliere le popolazioni di MSC più adatte per l’applicazione e di definirne il dosaggio. - E’ stato messa a punto una metodica e una strumentazione per il frazionamento di cellule staminali in Campo Flusso in assenza di marcatura (NEEGA-DF). Questa metodica permette di discriminare sottopopolazioni cellulari in base a caratteristiche biofisiche.

Lo scheletro è un tessuto dinamico, capace di adattarsi alle richieste funzionali grazie a fenomeni di rimodellamento ed alla peculiare proprietà rigenerativa. Tali processi avvengono attraverso l’azione coordinata di osteoclasti ed osteoblasti. Queste popolazioni cellulari cooperano allo scopo di mantenere l’ equilibrio indispensabile per garantire l’omeostasi dello scheletro. La perdita di tale equilibrio può portare ad una diminuzione della massa ossea e, ad una maggiore suscettibilità alle fratture, come avviene nel caso dell’osteoporosi. E’ noto che, nella fisiopatologia dell’osso, un ruolo cruciale è svolto da fattori endocrini e paracrini. Dati recenti suggeriscono che il rimodellamento osseo potrebbe essere influenzato dal sistema nervoso. L’ipotesi è supportata dalla presenza, nelle vicinanze dell’osso, di fibre nervose sensoriali responsabili del rilascio di alcuni neuro peptidi, tra i quali ricordiamo la sostanza P. Inoltre in modelli animali è stato dimostrato il diretto coinvolgimento del sistema nervoso nel mantenimento dell’omeostasi ossea, infatti ratti sottoposti a denervazione hanno mostrato una perdita dell’equilibrio esistente tra osteoblasti ed osteoclasti. Per tali ragioni negli ultimi anni si è andata intensificando la ricerca in questo campo cercando di comprendere il ruolo dei neuropeptidi nel processo di differenziamento dei precursori mesenchimali in senso osteogenico. Le cellule stromali mesenchimali adulte sono indifferenziate multipotenti che risiedono in maniera predominante nel midollo osseo, ma che possono anche essere isolate da tessuto adiposo, cordone ombelicale e polpa dentale. In questi distretti le MSC sono in uno stato non proliferativo fino a quando non sono richieste per processi locali di riparo e rigenerazione tessutale. MSC, opportunamente stimolate, possono differenziare in diversi tipi di tessuto connettivo quali, tessuto osseo, cartilagineo ed adiposo. L’attività di ricerca è stata finalizzata all’ottimizzazione di un protocollo di espansione ex vivo ed alla valutazione dell’influenza della sostanza P, neuropeptide presente a livello delle terminazioni sensoriali nelle vicinanze dell’osso, nel processo di commissionamento osteogenico.
Bone is a dynamic tissue, with the ability to adapt to its functional demands and repair itself by bone remodelling. The major effector cells of bone remodelling are osteoclast and osteoblast, they cooperate in order to maintain the balance between bone formation and bone resorption, essential for bone homeostasis. Disruption of this balance can diminish bone mass and micro-architectural integrity of the bone resulting in an increase in bone fragility and susceptibility to fractures, as evident in osteoporosis. It is known that, in the pathophysiology of the bone, a crucial role is played by endocrine and paracrine factors. Recent data suggest that bone remodeling may be influenced by the nervous system. The hypothesis is supported by the presence, in proximity of the bone, of sensory nerve fibers responsible for the release of some neuro peptides, like substance P. Iin capsaicin-treated animal has been shown the direct involvement of the nervous system in the maintenance of bone, this animal showed bone loss and increased bone fragility. For these reasons in recent years has intensified research in this field trying to understand the role of neuropeptides in the process of differentiation of mesenchymal precursors into osteogenic lineage. The mesenchymal stromal cells are undifferentiated multipotent cells present in the bone marrow, adipose tissue, umbilical cord and dental pulp. In these districts, MSC are in a quiescent state until they are required to local repair or tissue regeneration. MSC, suitably stimulated, can differentiate into different types of connective tissue such as, bone, cartilage and adipose. The research was designed to optimize a protocol for ex vivo expansion and to evaluate the effect of substance P, neuropeptide in the sensory endings in the vicinity of the bone, in the process of picking osteogenic.

Lo scheletro è un tessuto dinamico, capace di adattarsi alle richieste funzionali grazie a fenomeni di rimodellamento ed alla peculiare proprietà rigenerativa. Tali processi avvengono attraverso l’azione coordinata di osteoclasti ed osteoblasti. Queste popolazioni cellulari cooperano allo scopo di mantenere l’ equilibrio indispensabile per garantire l’omeostasi dello scheletro. La perdita di tale equilibrio può portare ad una diminuzione della massa ossea e, ad una maggiore suscettibilità alle fratture, come avviene nel caso dell’osteoporosi. E’ noto che, nella fisiopatologia dell’osso, un ruolo cruciale è svolto da fattori endocrini e paracrini. Dati recenti suggeriscono che il rimodellamento osseo potrebbe essere influenzato dal sistema nervoso. L’ipotesi è supportata dalla presenza, nelle vicinanze dell’osso, di fibre nervose sensoriali responsabili del rilascio di alcuni neuro peptidi, tra i quali ricordiamo la sostanza P. Inoltre in modelli animali è stato dimostrato il diretto coinvolgimento del sistema nervoso nel mantenimento dell’omeostasi ossea, infatti ratti sottoposti a denervazione hanno mostrato una perdita dell’equilibrio esistente tra osteoblasti ed osteoclasti. Per tali ragioni negli ultimi anni si è andata intensificando la ricerca in questo campo cercando di comprendere il ruolo dei neuropeptidi nel processo di differenziamento dei precursori mesenchimali in senso osteogenico. Le cellule stromali mesenchimali adulte sono indifferenziate multipotenti che risiedono in maniera predominante nel midollo osseo, ma che possono anche essere isolate da tessuto adiposo, cordone ombelicale e polpa dentale. In questi distretti le MSC sono in uno stato non proliferativo fino a quando non sono richieste per processi locali di riparo e rigenerazione tessutale. MSC, opportunamente stimolate, possono differenziare in diversi tipi di tessuto connettivo quali, tessuto osseo, cartilagineo ed adiposo. L’attività di ricerca è stata finalizzata all’ottimizzazione di un protocollo di espansione ex vivo ed alla valutazione dell’influenza della sostanza P, neuropeptide presente a livello delle terminazioni sensoriali nelle vicinanze dell’osso, nel processo di commissionamento osteogenico.
Bone is a dynamic tissue, with the ability to adapt to its functional demands and repair itself by bone remodelling. The major effector cells of bone remodelling are osteoclast and osteoblast, they cooperate in order to maintain the balance between bone formation and bone resorption, essential for bone homeostasis. Disruption of this balance can diminish bone mass and micro-architectural integrity of the bone resulting in an increase in bone fragility and susceptibility to fractures, as evident in osteoporosis. It is known that, in the pathophysiology of the bone, a crucial role is played by endocrine and paracrine factors. Recent data suggest that bone remodeling may be influenced by the nervous system. The hypothesis is supported by the presence, in proximity of the bone, of sensory nerve fibers responsible for the release of some neuro peptides, like substance P. Iin capsaicin-treated animal has been shown the direct involvement of the nervous system in the maintenance of bone, this animal showed bone loss and increased bone fragility. For these reasons in recent years has intensified research in this field trying to understand the role of neuropeptides in the process of differentiation of mesenchymal precursors into osteogenic lineage. The mesenchymal stromal cells are undifferentiated multipotent cells present in the bone marrow, adipose tissue, umbilical cord and dental pulp. In these districts, MSC are in a quiescent state until they are required to local repair or tissue regeneration. MSC, suitably stimulated, can differentiate into different types of connective tissue such as, bone, cartilage and adipose. The research was designed to optimize a protocol for ex vivo expansion and to evaluate the effect of substance P, neuropeptide in the sensory endings in the vicinity of the bone, in the process of picking osteogenic.

B-cell Chronic Lymphocytic Leukemia (B-CLL) is the most common leukemia in adults and is characterized by the accumulation of mature clonal CD5+ B lymphocytes in peripheral blood, bone marrow and lymphoid tissues. The defect in programmed cell death favours the disease progression through a prolonged survival of malignant cells and the induction of the drug-resistance. The defective apoptosis of B-CLL cells is not only due to intrisic defects of the leukemic clone, but also to extrinsic factors that influence its behavior in the tissue microenvironment. Since the accumulation of monoclonal B cells is also supported by their interaction with surrounding cells, we focused our attention on mesenchymal stem cells (MSCs) in order to evaluate their role in survival and localization of neoplastic clone. MSCs can be isolated, expanded with high efficiency and induced to differentiate into multiple mesenchymal lineages under appropriated colture conditions. In addition, they show crucial immunoregulatory properties suppressing several T-, B- and NK-cell functions and affecting dendritic cell activities. In the present study MSCs isolated from the bone marrow of 47 B-CLL patients were expanded ex vivo and characterized through fluocytometric analysis and differentiation coltures (adipocytes and osteocytes). While MSCs from B-CLL patients exhibited normal phenotype and differentiation capacities, when co-coltured with neoplastic B cells they exherted an anti-apoptotic effect reducing lymphocyte apoptosis. After 7 days of colture in presence of CLL-MSC, we observed a relevant extended survival of leukemic cells, but not of normal B lymphocytes. The same effect was observed on B-CLL cells isolated from 3 patients treated with pro-apoptotic compounds, suggesting an involvement of MSCs in drug-resistance. Finally, chemotaxis tests showed the ability of MSCs to produce molecules promoting migration and localization of neoplastic B cells in bone marrow. Taken together, these findings suggest that MSCs derived from patients with B-CLL, despite an apparent normal phenotype and normal differentiation ability, provide survival signals to neoplastic cells extending their lifespan and producing chemotattic factors favouring their accumulation in the bone marrow.
La leucemia linfatica cronica di tipo B (LLC-B) è la forma più comune di leucemia nell’adulto ed è caratterizzata dall'accumulo clonale di piccoli linfociti B CD5+ nel sangue periferico, nel midollo osseo e negli organi linfatici, dovuto sia ad un aumento della proliferazione che ad un difetto dei meccanismi di morte cellulare programmata. La resistenza all’apoptosi in questi linfociti favorisce la progressione della malattia attraverso un’aumentata sopravvivenza del clone neoplastico e l’induzione della resistenza ai farmaci citostatici. Tali alterazioni sono imputabili sia a fattori intrinseci che a fattori estrinseci derivanti dal microambiente. Poiché l’aumentata sopravvivenza ed il progressivo accumulo del clone linfocitario risultano selettivamente favoriti dall'interazione con cellule accessorie non tumorali presenti nel microambiente in cui esso risiede, in questa tesi abbiamo focalizzato l’attenzione sulle cellule mesenchimali staminali (MSC), allo scopo di valutare il loro ruolo nella sopravvivenza e nella compartimentalizzazione del clone B leucemico. Le MSC costituiscono una frazione esigua (inferiore allo 0,01%) della popolazione di cellule midollari, sono cellule staminali multipotenti in grado di differenziare in diversi tessuti di origine mesenchimale; sono inoltre dotate di proprietà immunomodulatorie verso linfociti B, T, Natural Killer e cellule dendritiche. In questa tesi le MSC sono state isolate dal sangue midollare di 47 pazienti affetti da LLC-B e sono state caratterizzate fenotipicamente e funzionalmente mediante analisi citofluorimetrica (positività per CD73, CD90 e CD105, negatività per CD31, CD34 e CD45) e colture differenziative (adipociti ed osteociti) confrontandole con MSC di donatori sani. Successivamente si sono allestite co-colture di linfociti B di pazienti affetti da LLC e MSC allo scopo di valutare l’effetto delle MSC sul clone neoplastico di LLC. Le MSC ottenute dai pazienti non hanno presentato alterazioni dal punto di vista fenotipico né funzionale rispetto alle MSC di donatori sani, tuttavia esse hanno sviluppato interazioni capaci di favorire la sopravvivenza del clone leucemico. Gli esperimenti di co-coltura hanno dimostrato infatti che le MSC esercitano un effetto anti-apoptotico sui linfociti B neoplastici, documentato da un aumento significativo della sopravvivenza delle cellule B di LLC dopo 7 giorni di coltura, effetto verificatosi anche con MSC di donatori sani e invece molto meno marcato nei linfociti B normali. Tale attività anti-apoptotica si è osservata, seppur di minore intensità, anche nei linfociti B di pazienti sottoposti a trattamento chemioterapico in vivo con Fludabarina e Ciclofosfamide, suggerendo che le MSC possano essere implicate anche nei meccanismi di chemio resistenza del clone di LLC. Infine l’analisi della migrazione cellulare dei linfociti B patologici in presenza di terreno condizionato derivante dalle colture di MSC ha dimostrato la capacità delle MSC di produrre stimoli chemiotattici in grado di richiamare in sede midollare il clone maligno, ma non i linfociti B normali. I dati riportati suggeriscono che le MSC nei pazienti affetti da LLC-B, sebbene non mostrino alterazioni dal punto di vista fenotipico e funzionale, svolgono un ruolo attivo nel favorire la sopravvivenza e la compartimentalizzazione delle cellule B neoplastiche a livello midollare.

One of the most important challenges in modern medicine is the identification of cell therapy protocols, enabling identification of personalized treatment strategies. WIthin this context, adult stem cells (ASC) have a large applicative potential. Contrary to ESCs (embryonic stem cells) and IPSCs (induced pluripotent stem cells), ASCs can be easily extracted from different tissues (bone marrow, skin, adipose tissue, muscle) without raising ethical issues . Moreover, they can be used for autologous transplantation, eliminating the complications associated with autoimmune reactions. Mesenchymal stem cells (MSC,), are an ASC population present in the bone marrow, adipose tissue and other tissues. MSCs are readily available and are able to self-replicate and differentiate, supported by the presence of appropriate stimuli, into cell lines derived from mesodermal lineage (osteoblasts, chondrocytes, adipocytes, and muscle cells). In the last decade it has also been observed that MSCs are able to trans-differentiate into cell types of ectodermal and endodermal origin (transdifferentiation).. The purpose of my work was to develop and define the conditions which can induce trans-differentiation of MSCs extracted from rat adipose tissue toward the neuronal phenotype. The study is part of a major project of regenerative medicine focused on identifying new strategies aimed at restoring functionality in degenerated brain tissue. Initially, MSCs have been characterized by the induction of osteoblastic differentiation, one of their physiological differentiations, and their interaction with biocompatible materials ( titanium dioxide) was analyzed, in order to assess their possible application in medicine for the creation, for example, of prothesic solutions. Subsequently, we sought to devise a GMP compliant cell culturing medium for MSC proliferation, crucial in order to obtain a clinically relevant cell number to differentiate following isolation from adipose tissue. For that reason we tried to induce the differentiation of MSCs into a neural phenotype; a first approach has been to apply protocols already known in literature for the differentiation of different types of stem cells toward the neuronal phenotype.. We considered both the direct differentiation protocols, as well as those that encompassed intermediate stages (sphere-forming). The protocols of differentiation by sphere formation resulted in differentiated MSC expressing glial markers (GFAP), but the protocol was too long(30 days) and a number of differentiated cells very low.. A second approach has been to develop a proprietary differentiation medium (NZ4) using the knowledge and expertise gained from the literature and from the negative results previously obtained The cells maintained in NZ4 differentiation medium , showed a clear morphological change and a high vitality; moreover they expressed both markers of specific neurons in the early stages of development (nestin, doublecortin) as well as markers expressed by mature neurons (βIIItubulin, VAMP2, Sinaptotagmin). Furthermore, the efficiency of the differentiation protocol has been functionally characterized by means of qualitative analysis of the dynamics of intracellular calcium and with quantitative analysis of the resting membrane potential The functional characterization clearly showed that MSC exposed to NZ4 differentiation medium have comparable behavior as primary neurons undergoing in vitro maturation. Given the future direction of the project will be to inject in an animal model the cell undergoing differentiation in order to attempt a partial recovery of the damaged neuronal tissue (i.e. ischemia) we characterized the behavior of MSC encapsulated in a biocompatible bioresorbable hydrogel matrix. The cells were encapsulated for different time periods, recovered, and heir survival as well as maintenance of stemness potential following retrieval was assessed . There are still other issues to be clarified n in particular, it will be necessary to verify in an in vivo setting the the efficacv of the differentiation protocol as well as to characterize the process of MSCs homing and to perform more detailed studies on behavioral changes of the same animal model. However, preliminary data obtained during this thesis allows to deepen the knowledge concerning the differentiation process of MSC from adipose tissue toward a neuronal phenotype.

Nel mondo ogni anno circa 2,2 milioni di pazienti si sottopongono a innesti ossei. Esiste inoltre un ramo dell’ingegneria dei tessuti che sviluppa e sperimenta biomateriali e bioreattori con la capacità di indurre un commissionamento osteogenico di cellule staminali in coltura, per realizzare in vitro tessuto osseo biomimetico. Tuttavia, al momento non esiste una tecnica accreditata come standard di coltura per stimolare le cellule nello stesso modo nel quale sono sollecitate nel tessuto in vivo. I meccanismi di generazione e riparazione del tessuto osseo sono, in gran parte, regolati da segnali meccanici che agiscono attraverso una deformazione che nell’osso si manifesta come non-uniforme, a frequenza variabile e a bassa intensità. Attualmente i dispositivi in grado di stimolare meccanicamente i sistemi cellulari producono una deformazione con una frequenza costante e con un’ampiezza che non rispecchia quella fisiologica. Tuttavia è stato recentemente progettato un con spettro analogo a quello di un segnale musicale (NUMS non uniform micro stretching) . I risultati del lavoro descritto in questo elaborato confermano che le cellule stimolate con NUMS presentano un miglior differenziamento osteogenico rispetto a cellule stimolate con un segnale uniforme (US uniform stretching). Questo dispositivo innovativo getta le basi per uno sviluppo di una tecnologia che promuova la sintesi in vitro di tessuto osseo bioibrido.

Le cellule staminali mesenchimali sono cellule pleiotropiche che si differenziano in adipociti o osteoblasti attraverso un signaling pathway che prevede il coinvolgimento dell'espressione di HO-1 ed HO-2. Abbiamo esaminato gli effetti di un induttore dell'espressione di HO-1 e di un inibitore dell'attivita' enzimatica di HO-1 sul differenziamento osteoblastico delle MSC in presenza ed in assenza di un'alta concentrazione di glucosio. Le MSC sono state coltivate in un medium osteogenico aumentando l'espressione dell'osteonectina, RUNX-2, osteocalcina e la fosfatasi alcalina. L'espressione di HO-1 durante il differenziamento e' stata inizialmente downregolata per poi tornare a valori simili alle cellule indifferenziate dopo 15 giorni di differenziamento. Inoltre, l'effetto di HO-1 sugli osteoblasti appare differente da quello visto nel differenziamento in adipociti. L'induzione di HO-1 attraverso una cobalto protoporfirina (CoPP) decrementa l'adipogenesi. In piu' come evidenziato dalla diminuzione dei livelli di BMP-2, osteocalcina , osteoprotegerina l'aggiunta di glucosio al medium osteogenico inibisce il differenziamento in osteoblasti. Tuttavia il differenziamento di MSC in adipociti e' incrementato dal glucosio. L'induzione di HO-1 attraverso il CoPP e' stato in grado di aumentare l'espressione dei markers osteoblastici gia citati. Lo studio suggerisce che l'induzione dell'eme ossigenasi e' in grado di attenuare l'effetto dell'iperglicemia durante il differenziamento in osteoblasti.
Human bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs) are pleiotrophic cells that differentiate to either adipocytes or osteoblasts as a result of crosstalk by specific signaling pathways including heme oxygenase (HO)-1/-2 expression. We examined the effect of inducers of HO-1 expression and inhibitors of HO activity on MSC differentiation to the osteoblast and following high glucose exposure. MSC cultured in osteogenic medium increased expression of osteonectin, Runt-related transcription factor 2 (RUNX-2), osteocalcin, and alkaline phosphatase. HO-1 expression during differentiation was initially decreased and then followed by a rebound increase after 15 days of culture. Additionally, the effect of HO-1 on osteoblasts appears different to that seen in adipocyte stem cells. On addition of a cobalt compound, the resultant induction of HO-1 decreases adipogenesis. Moreover, glucose (30 mM) inhibited osteoblast differentiation, as evidenced by decreased bone morphogenetic protein (BMP)-2, osteonectin, osteocalcin, and osteoprotegerin (OPG). In contrast, MSC-derived adipocytes were increased by glucose. Increased HO-1 expression increased the levels of osteonectin, OPG, and BMP-2. Inhibition of HO activity prevented the increase in osteonectin and potentiated the decrease of osteocalcin and OPG in cells exposed to high glucose levels. Furthermore, targeting HO-1 expression increased pAMPK and endothelial nitric oxide synthase (eNOS) and restored osteoblastic markers. Our findings suggest that targeting HO-1 gene expression attenuates the hyperglycemia-mediated decrease in MSC-derived osteoblast differentiation. Finally, the mechanism underlying the HO-1-specific cell effect on osteoblasts and adipocytes is yet to be explored. Thus, the targeting of HO-1 gene expression presents a portal to increase osteoblast function and differentiation and attenuate osteoporosis by promoting bone formation

The aim of our study was to evaluate the properties of the laser-modified titanium surface, that are its skills of promoting a faster differentiation of human Mesenchymal Stem Cells (hMSCs) into osteoblasts and a more stable connection between differentiated cells and titanium comparing to the machined and the sand-blasted surfaces. Furthermore, we wanted to evaluate if titanium alone was a sufficient factor able to induce the differentiation towards the osteogenic lineage. Materials and methods: we harvested stem cells from an individual (after his consensus) and cultivated them into dishes with titanium disks presenting three different surfaces: machined (M), sand-blasted (S) and laser-modified (L). In the test group cells were cultivated in an osteogenic medium, while in the control group cells were seeded in a standard DMEM. Evaluations of the degree of differentiation were made with Alizarin coloration after 28, 38, 42, 49, 56 and 63 days of induction. Results: no signs of differentiation were evident in the control group, while in the test group there was a statistically significant differentiation evident since the fourth week. Laser-modified and sand-blasted surfaces showed similar values, greater than the machined surface. Discussion: the differentiation reached its peak on the sixth week for the laser-modified surface, and on the seventh week for the other two surfaces. After the peak, the differentiation had a slow decrease for the laser-modified surface and a rapid decrease for the other two. Conclusions: titanium alone can’t be considered a sufficient factor able to induce differentiation of human Mesenchymal Stem Cells into osteoblasts. Moreover, laser-modified induces a faster differentiation of stem cells and a more stable connection between osteoblasts and titanium.

Le cellule staminali/stromali mesenchimali umane (hMSC) sono attualmente applicate in diversi studi clinici e la loro efficacia è spesso legata alla loro capacità di raggiungere il sito d’interesse. Poco si sa sul loro comportamento migratorio e i meccanismi che ne sono alla base. Perciò, questo studio è stato progettato per comprendere il comportamento migratorio delle hMSC e il coinvolgimento di Akt, nota anche come proteina chinasi B. L’espressione e la fosforilazione della proteinchinasi Akt è stata studiata mediante Western blotting. Oltre al time-lapse in vivo imaging, il movimento cellulare è stato monitorato sia mediante saggi tridimensionali, con l’uso di transwell, che mediante saggi bidimensionali, attraverso la tecnica del wound healing. Le prove effettuate hanno rivelato che le hMSC hanno una buona capacità migratoria. E’ stato osservato che la proteinchinasi B/Akt ha elevati livelli basali di fosforilazione in queste cellule. Inoltre, la caratterizzazione delle principali proteine di regolazione ed effettrici, a monte e a valle di Akt, ha permesso di concludere che la cascata di reazioni della via di segnale anche nelle hMSC segue un andamento canonico. Specifici inibitori farmacologici sono stati utilizzati per determinare il potenziale meccanismo coinvolto nella migrazione cellulare e nell'invasione. L’inibizione della via PI3K/Akt determina una significativa riduzione della migrazione. L’utilizzo di inibitori farmacologici specifici per le singole isoforme di Akt ha permesso di discriminare il ruolo diverso di Akt1 e Akt2 nella migrazione delle hMSC. E’ stato infatti dimostrato che l'inattivazione di Akt2, ma non quella di Akt1, diminuisce significativamente la migrazione cellulare. Nel complesso i risultati ottenuti indicano che l'attivazione di Akt2 svolge un ruolo critico nella migrazione della hMSC; ulteriori studi sono necessari per approfondire la comprensione del fenomeno. La dimostrazione che l’isoforma Akt2 è necessaria per la chemiotassi diretta delle hMSC, rende questa chinasi un potenziale bersaglio farmacologico per modulare la loro migrazione.
Human Mesenchymal Stromal Cells (hMSC) are currently tested in several clinical trials. In spite of hMSC efficacy is frequently linked to their ability to reach the affected site, little is known on their migratory behavior and the underlying mechanism. This study was designed to investigate the migratory behavior of hMSC and to test the involvement of Akt, also known as protein kinase B. Akt protein expression and phosphorylation was investigated in hMSC western blotting analysis. Cell migration was assessed by transwell, wound healing and time lapse in vivo motility assays. MSC results fairly migratory and Akt was strongly activated at basal level. Furthermore, the characterization of the major regulatory proteins and effectors, upstream and downstream of Akt, has led to the conclusion that the cascade of reactions of this signaling pathway in hMSC follows a canonical pathway. Pharmacological inhibitors were used to determine the potential mechanism responsible for cell migration and invasion. Blocking PI3K/Akt pathway resulted in decreased hMSC migration. The use of pharmacological inhibitors specific for individual Akt isoforms allowed us to discriminate the different role of Akt1 and Akt2 in the migration of the hMSC. Through our analysis, we demonstrated that pharmacological inactivation of Akt2, but not that of Akt1, significantly decreased cell migration and invasion. Although these results are not fully comprehensive for the understanding of the phenomenon, in the complex indicate that the activation of Akt2 plays a critical role in allowing the migration of the hMSC. The demonstration that the Akt2 isoform is required for the chemotaxis of direct hMSC, makes this kinase a potential pharmacological target to modulate the migration of such cells.

Le cellule staminali/stromali mesenchimali umane (hMSC) sono attualmente applicate in diversi studi clinici e la loro efficacia è spesso legata alla loro capacità di raggiungere il sito d’interesse. Poco si sa sul loro comportamento migratorio e i meccanismi che ne sono alla base. Perciò, questo studio è stato progettato per comprendere il comportamento migratorio delle hMSC e il coinvolgimento di Akt, nota anche come proteina chinasi B. L’espressione e la fosforilazione della proteinchinasi Akt è stata studiata mediante Western blotting. Oltre al time-lapse in vivo imaging, il movimento cellulare è stato monitorato sia mediante saggi tridimensionali, con l’uso di transwell, che mediante saggi bidimensionali, attraverso la tecnica del wound healing. Le prove effettuate hanno rivelato che le hMSC hanno una buona capacità migratoria. E’ stato osservato che la proteinchinasi B/Akt ha elevati livelli basali di fosforilazione in queste cellule. Inoltre, la caratterizzazione delle principali proteine di regolazione ed effettrici, a monte e a valle di Akt, ha permesso di concludere che la cascata di reazioni della via di segnale anche nelle hMSC segue un andamento canonico. Specifici inibitori farmacologici sono stati utilizzati per determinare il potenziale meccanismo coinvolto nella migrazione cellulare e nell'invasione. L’inibizione della via PI3K/Akt determina una significativa riduzione della migrazione. L’utilizzo di inibitori farmacologici specifici per le singole isoforme di Akt ha permesso di discriminare il ruolo diverso di Akt1 e Akt2 nella migrazione delle hMSC. E’ stato infatti dimostrato che l'inattivazione di Akt2, ma non quella di Akt1, diminuisce significativamente la migrazione cellulare. Nel complesso i risultati ottenuti indicano che l'attivazione di Akt2 svolge un ruolo critico nella migrazione della hMSC; ulteriori studi sono necessari per approfondire la comprensione del fenomeno. La dimostrazione che l’isoforma Akt2 è necessaria per la chemiotassi diretta delle hMSC, rende questa chinasi un potenziale bersaglio farmacologico per modulare la loro migrazione.
Human Mesenchymal Stromal Cells (hMSC) are currently tested in several clinical trials. In spite of hMSC efficacy is frequently linked to their ability to reach the affected site, little is known on their migratory behavior and the underlying mechanism. This study was designed to investigate the migratory behavior of hMSC and to test the involvement of Akt, also known as protein kinase B. Akt protein expression and phosphorylation was investigated in hMSC western blotting analysis. Cell migration was assessed by transwell, wound healing and time lapse in vivo motility assays. MSC results fairly migratory and Akt was strongly activated at basal level. Furthermore, the characterization of the major regulatory proteins and effectors, upstream and downstream of Akt, has led to the conclusion that the cascade of reactions of this signaling pathway in hMSC follows a canonical pathway. Pharmacological inhibitors were used to determine the potential mechanism responsible for cell migration and invasion. Blocking PI3K/Akt pathway resulted in decreased hMSC migration. The use of pharmacological inhibitors specific for individual Akt isoforms allowed us to discriminate the different role of Akt1 and Akt2 in the migration of the hMSC. Through our analysis, we demonstrated that pharmacological inactivation of Akt2, but not that of Akt1, significantly decreased cell migration and invasion. Although these results are not fully comprehensive for the understanding of the phenomenon, in the complex indicate that the activation of Akt2 plays a critical role in allowing the migration of the hMSC. The demonstration that the Akt2 isoform is required for the chemotaxis of direct hMSC, makes this kinase a potential pharmacological target to modulate the migration of such cells.

Il mantenimento del fenotipo cellulare è di fondamentale importanza in qualsiasi applicazione di ingegneria tissutale. La possibilità di valutare in vitro le risposte cellulari a condizioni che mimano l'ambiente in vivo, può fornire una più completa conoscenza del comportamento dei biomateriali impiantati. La realizzazione di multistrati di polielettroliti (PEMs) su materiali impiantabili è un'ottima strategia per realizzare condizioni che possano promuovere o prevenire l'adesione cellulare, o ancora più importante dirigerne e mantenerne il fenotipo. La versatilità dei PEMs fornisce la straordinaria possibilità di mimare il complesso ambiente extracellulare in vitro; variando le caratteristiche chimiche, meccaniche e topografiche è possibile promuovere l'adesione, la proliferazione, il differenziamento, la migrazione e l'espressione genica di praticamente tutti i tipi di cellule. La grande varietà dei tessuti biologici e i fenotipi cellulari ad essi associati, impone che la scelta delle caratteristiche dei PEMs sia la più idonea possibile al tipo cellulare utilizzato per la rigenerazione di uno specifico tessuto. Lo strato terminale di un multilayer di polielettroliti è un fattore determinante nella biocompatibilità di un materiale e deve essere attentamente considerato sulla base delle interazioni cellulari desiderate per una particolare applicazione. Lo studio si basa sulle interazioni tra cellule staminali mesenchimali umane e PEMs terminanti rispettivamente con Polistirensolfonato (PSS) e Polietilenimmina (PEI). I PEMs PSS-ended sembrano avere le caratteristiche migliori per dirigere l'adesione ed il mantenimento del fenotipo delle hMSCs, mostrando una buona biocompatibilià. Il PEMs PEI-ended induce significative modificazioni morfologiche ed un abbassamento dell'attività metabolica cellulare; tuttavia la forza di adesione cellulare a questa superficie è superiore rispetto a quella che si riscontra negli altri campioni. Nello sviluppo di nuovi biomateriali per applicazioni in ingegneria tissutale, il PSS si comporta come un buon substrato di crescita per le cellule mesenchimali, a differenza del PEI che ne compromette alcune funzioni biologiche; tuttavia potrebbe essere interessante modulare alcuni parametri nella struttura del PEMs PEI-ended o funzionalizzarlo con opportuni fattori che ne riducano l'effetto negativo sulle hMSCs, al fine di poter sfruttare il forte ancoraggio cellulare indotto da questa superficie.

Le cellule mesenchimali stromali / staminali (MSC) rappresentano una promessa terapeutica nelle terapie cellulari e geniche. Nonostante decenni di ricerca preclinica, la mancanza di modelli farmacocinetici (PK) e farmacodinamici (PD) consolidati sta ostacolando una solida traslazione clinica di MSC nei pazienti. Il modello farmacocinetico-farmacodinamico (PK-PD) basato sul meccanismo è un approccio matematico adottato di routine dai farmacocinetisti preclinici per simulare il profilo PK / PD di un candidato composto allo sviluppo clinico e per prevedere il regime di dosaggio clinico. I modelli PK / PD standardizzati combinati con una comprensione approfondita della PK e PD delle MSC, potrebbero essere utili per migliorare il successo terapeutico di questo tipo di cellule promettenti. Pertanto, partendo da un modello PK / PD presentato da Parekkadan e Milwid nel 2010, ci occupiamo dell'ottimizzazione di un modello PK / PD teorico per la biodistribuzione dell'MSC con l'obiettivo di raggiungere un approccio quantitativo da applicare nello sviluppo di farmaci MSC. Il piano di studi è così sintetizzato: A. La farmacocinetica delle MSC può essere rappresentata da un modello a due compartimenti. Infatti, come rappresentato da Parekkadan e Milwid, la concentrazione di MSC era caratterizzata da una cinetica esponenziale in decadenza della vitalità cellulare, che a sua volta influenza il tempo per raggiungere la massima secrezione di un mediatore molecolare, con una breve finestra terapeutica associata alla terapia MSC. Questo modello rappresenta un modo per affrontare il modello PK / PD per le MSC, tuttavia non considera molti aspetti come l'elevata connessione delle MSC con l'ambiente circostante e l'importanza dei fattori circolanti (rilasciati dalle MSC stesse e da altre cellule) nell’esercitare un effetto PD. B. Il modello basale è un modello diretto in cui il farmaco (MSC) influenza direttamente la risposta farmacologica (IL-10). Tuttavia, sulla base delle prove dell'iniezione di MSC in un modello di sepsi indotto da LPS (Németh et al. 2010), a cui si riferiva P&M, abbiamo iniziato a considerare un nuovo modello PK / PD. Dopo la somministrazione per via endovenosa, le MSC possono rilasciare prostaglandina-E2 (PGE2) che a sua volta agisce sui recettori PGE2 dei macrofagi attivati inducendo il rilascio di interleuchina-10 (IL-10) la cui funzione è quindi quella di ridurre l'infiammazione che agisce sulle cellule immunitarie. Pertanto, le MSC influenzano la concentrazione di PGE2 che a sua volta regola la concentrazione di IL-10. Mentre confermiamo il modello a due compartimenti per descrivere la PK delle MSC, ora affermiamo che la farmacocinetica dei fattori rilasciati (PGE2 e IL-10) può essere sintetizzata da un modello indiretto inesplorato in cui la risposta farmacologica non è solo correlata alla concentrazione plasmatica di MSC ma dipende anche da altri fattori (PGE2 e IL-10). C. Sulla base della letteratura attuale, valutiamo diversi tipi di modelli PK / PD indiretti o di turnover, cercando di semplificare l'intricato processo di infiammazione che caratterizza un modello di sepsi indotto da LPS. D. I dati di raccolta in vivo derivanti da un modello di sepsi murino sono applicati per convalidare nuovi modelli PK / PD indiretti
Mesenchymal stromal/stem cells (MSC) represent a therapeutic promise in cell and gene therapies. In spite decades of preclinical research, the lack of established pharmacokinetic (PK) and pharmacodynamic (PD) models are hindering a solid clinical translation of MSC towards patients. Mechanism-based pharmacokinetic-pharmacodynamic (PK-PD) model is a mathematical approach adopted routinely by preclinical pharmacokineticists to simulate the PK/PD profile of a compound candidate to the clinical development and for predicting the clinical dosing regimen. Standardized PK/PD models combined with deepened understanding of MSCs PK and PD could be helpful to improve the therapeutic success of this still promising cell type. Therefore, starting from a PK/PD model presented by Parekkadan and Milwid in 2010, we address the optimization of a theoretical PK/PD model for MSC biodistribution with the aim to achieve a quantitative approach to be applied in MSC drug development. The study plan is so summarized: A. MSCs pharmacokinetics can be represented by a two-compartment model. Indeed, as represented by Parekkadan and Milwid, MSC concentration was characterized by a decaying exponential kinetic of cellular viability, that on turn affects the time to reach maximal secretion of a molecular mediator, with a short therapeutic window associated with MSC therapy. This model represents a way to address PK/PD model for MSCs, however it does not consider many aspects like the high connection of MSCs with the neighboring environment and the importance of the circulating factors (released by MSCs themselves and other cells) into exerting the PD effect. B. The basal model is a direct model in which the drug (MSCs) affect simultaneously the pharmacological response (IL-10). However, basing on the evidences of MSC injection in a sepsis model LPS-induced (Németh et al. 2010), to which P&M referred, we began to consider a new PK/PD model. After i.v administration MSCs can release prostaglandin-E2 (PGE2) that on turn acts on PGE2 receptors of activated macrophages inducing the release of interleukin-10 (IL-10) whose function is then to reduce inflammation acting on immune cells. Therefore, MSCs influences PGE2 concentration that on turn rules IL-10 concentration. While we confirm the two-compartment model to describe the PK of MSCs, we now assert that the pharmacokinetic of released factors (PGE2 and IL-10) can be summarized by an unexplored indirect model in which the pharmacological response is not only related to the plasma concentration of MSCs but is dependent also to other factors (PGE2 and IL-10). C. Basing on the current literature, we evaluate different kind of indirect or turnover PK/PD models, trying to simplify the intricate inflammation process that characterize a sepsis model LPS-induced. D. In vivo collecting data arise from a sepsis mice model are applied to validate the novel indirect PK/PD models

ABSTRACT Introduction: Mesenchymal stem cells (MSCs) are defined as a heterogeneous population of stromal stem cells and can be isolated from many adult tissues like bone marrow or adipose tissue. Many studies have shown that MSCs play a key role in tumour progression. MSCs recruited in tumour sites can stimulate tumour cell progression and mobilization, especially in breast cancer. However it is still unclear the molecular mechanism used by MSCs to promote angiogenesis, metastasis and tumour progression. Recently, studies demonstrated that P2X7 purinergic receptor plays a key role in stimulating tumour cell mobilization and metastatization. In fact, they have proposed that TGF-β stimulation promotes ATP release from cancer cells that stimulates P2X7 receptor activation. This activation stimulates neoplastic cells migration and then promoting tumour metastatization. Moreover, tumour cells that over-express P2X7 receptor grow faster than other cells and in vivo generate larger tumours. In these animals, the use of oATP (a P2X7 inhibitor) reduces tumour dimensions. The aim of this study is to confirm MSCs role in tumour progression and to clarify the involvement of P2X7 receptor as a key mediator of MSC-mediated induction of tumor growth. Mat & met: We used in vitro and in vivo optical imaging to study the influence of MSCs in tumour progression. Murine (EMT-6 and MET-1 cell lines) and human (SUM159) mammary carcinoma cells were infected with a lentiviral construct expressing mCherry or Luciferase as a constitutive reporter gene. These cells were used for in vitro and in vivo studies. Tumour cells were cultured in the presence or absence of MSCs for 48h with or without an inhibitor: oATP (100 µM). In in vitro studies cell viability was monitored by Trypan blue exclusion test, and by reporter gene activity. To perform in vivo studies, tumor cells (EMT-6, MET-1 and SUM159) were injected into mammary fat pad of nude mice. mCherry or Luciferase activity was used to assess tumour growth over time by whole body optical imaging. MSC injection and the treatment with the inhibitors started after tumour establishment, and the longitudinal imaging was further performed twice a week. At the endpoint, tumors were explanted and tumour weight and volume were evaluated for each experimental group. Results: In vitro studies showed that MSC migration ability significantly increases after treatment with tumour conditioned culture medium. Moreover, tumor cells proliferation was increased by MSCs co-culture as demonstrated by cell count and by reporter photon emission observed by optical imaging and biochemical analysis in cell lysates. This effect was prevented by treatment with the inhibitor oATP. In vivo data confirmed in vitro observations, in fact, a significant increase of tumour dimension at the endpoint was detected in animals injected with MSCs. The evaluation of tumour growth by optical imaging of reporter activity over time, demonstrated that the presence of MSCs significantly stimulated the proliferation of mammary carcinoma cells whereas the treatment with oATP prevented this phenomenon. These results were validated by ex vivo analysis. In comparison to control group, tumour weight and volume were higher in the MSC treated group, while they were similar to controls for the inhibitor treated ones. The inhibitory effect of oATP underlines a key role of P2X7 receptor in tumor growth and a correlation between MSCs tumour stimulation and P2X7 activity. Conclusions: These data demonstrated the capability of stem cells to stimulate the rate of breast cancer growth. These preliminary studies pave the way for the understanding of the molecular mechanism of MSC-mediated induction of tumor cell proliferation, proposing the involvement of the purinergic receptor pathway. In the TME, mesenchymal cells release a large amount of TGF-β that could support tumour progression and metastatizzation by indirectly activating P2X7 receptors. In this scenario, the recruitment of endogenous MSCs to tumour sites acquires important implications. In fact, it could be useful to understand the rate of endogenous MSC migration to tumour sites to evaluate if an inhibition of MSC-tumor cross talk or MSC-mediated immunomodulation could help in increasing anti-neoplastic treatment efficacy.

Nell’ambito dell’ingegneria dei tessuti, la possibilità di rigenerazione del miocardio post-infartuale è un argomento “caldo”, che suscita grandi speranze ma solleva altrettanto grandi interrogativi - sostenuti dal sussistere di dubbi di base sulle scelte operative praticabili. Esiste tuttavia concordanza nel considerare fondamentale l’utilizzo di un “supporto” che possa mantenere nella sede peri-infartuale le cellule competenti. Infatti, la semplice iniezione di cellule staminali per via endovenosa o direttamente nell’area infartuata non si è dimostrata particolarmente efficace, soprattutto a causa della cospicua perdita cellulare che si verifica rapidamente dopo il trapianto. Ci si orienta quindi verso la strategia di seminare cellule in grado di transdifferenziare in senso muscolare cardiaco su un materiale biocompatibile in vitro e di impiantare successivamente il costrutto ottenuto in vivo dove ci si attende il riassorbimento del biomateriale e l’integrazione delle cellule. Tuttavia, mentre in altri settori della medicina - quali ortopedia e dermatologia - l’impiego di pseudotessuti ingegnerizzati ha già permesso di conseguire ottimi risultati nella rigenerazione di tessuti danneggiati, allo stato attuale, i progressi ottenuti nell’ambito della rigenerazione del miocardio infartuato appaiono ancora aneddotici e distanti dall’ottenere protocolli condivisi per l’impiego in clinica. Il lavoro presentato in questa ricerca, condotto grazie alla sinergia di competenze interdisciplinari negli ambiti chimico, biologico e dell’ingegneria biomedica meccanica ed elettronica, è uno studio di fattibilità di una metodica standardizzata in grado di indirizzare cellule staminali mesenchimali (MSCs) indifferenziate verso l’acquisizione in vitro di caratteri fenotipici confrontabili con quelli delle cellule muscolari cardiache attraverso il paradigma della coltura dinamica in bioreattore. Il prototipo di bioreattore impiegato, in quanto sviluppato originalmente nel corso di questa attività di ricerca, presenta rispetto ad altri strumenti descritti l’innovazione e il vantaggio di non richiedere l’utilizzo di un incubatore, in quanto esso stesso permette di coltivare cellule al suo interno in condizioni controllate di temperatura, pH e concentrazione di CO2. La sua flessibilità operativa consente di impostare e controllare da personal computer leggi di moto di qualsiasi forma anche con cicliche molto veloci. Infine, la presenza di estensimetri in grado di misurare finemente la variazione di tensione esercitata sulla matrice polimerica utilizzata, posta in trazione tra due afferraggi, permette di applicare nel tempo una forza di stiramento costante, ottenendo deformazioni controllate e risultati riproducibili in termini di modificazioni cellulari. Il superamento delle problematiche sorte durante la fase di messa a punto del sistema, che deve essere ritenuto parte integrante del lavoro di sviluppo condotto, ha permesso di studiare l’adattamento di MSCs allo stiramento ciclico, mostrando che questo effettivamente determina alcune differenze fenotipiche rispetto al controllo statico. Inoltre le cellule hanno acquistato una disposizione orientata lungo l’asse longitudinale delle fibre, dato questo particolarmente importante se si considera la disposizione ordinata delle cellule del miocardio, le quali costituiscono un vero e proprio sincizio, indispensabile per una diffusione sincrona dell’impulso elettrico di contrazione. La creazione di uno pseudotessuto cardiaco ottimale richiederà ovviamente ulteriore lavoro, ma la metodica qui presentata si propone al tempo stesso come uno strumento di studio e come una strategia operativa per un approccio innovativo e standardizzabile alla medicina rigenerativa del miocardio.

Nell’ambito dell’ingegneria dei tessuti, la possibilità di rigenerazione del miocardio post-infartuale è un argomento “caldo”, che suscita grandi speranze ma solleva altrettanto grandi interrogativi - sostenuti dal sussistere di dubbi di base sulle scelte operative praticabili. Esiste tuttavia concordanza nel considerare fondamentale l’utilizzo di un “supporto” che possa mantenere nella sede peri-infartuale le cellule competenti. Infatti, la semplice iniezione di cellule staminali per via endovenosa o direttamente nell’area infartuata non si è dimostrata particolarmente efficace, soprattutto a causa della cospicua perdita cellulare che si verifica rapidamente dopo il trapianto. Ci si orienta quindi verso la strategia di seminare cellule in grado di transdifferenziare in senso muscolare cardiaco su un materiale biocompatibile in vitro e di impiantare successivamente il costrutto ottenuto in vivo dove ci si attende il riassorbimento del biomateriale e l’integrazione delle cellule. Tuttavia, mentre in altri settori della medicina - quali ortopedia e dermatologia - l’impiego di pseudotessuti ingegnerizzati ha già permesso di conseguire ottimi risultati nella rigenerazione di tessuti danneggiati, allo stato attuale, i progressi ottenuti nell’ambito della rigenerazione del miocardio infartuato appaiono ancora aneddotici e distanti dall’ottenere protocolli condivisi per l’impiego in clinica. Il lavoro presentato in questa ricerca, condotto grazie alla sinergia di competenze interdisciplinari negli ambiti chimico, biologico e dell’ingegneria biomedica meccanica ed elettronica, è uno studio di fattibilità di una metodica standardizzata in grado di indirizzare cellule staminali mesenchimali (MSCs) indifferenziate verso l’acquisizione in vitro di caratteri fenotipici confrontabili con quelli delle cellule muscolari cardiache attraverso il paradigma della coltura dinamica in bioreattore. Il prototipo di bioreattore impiegato, in quanto sviluppato originalmente nel corso di questa attività di ricerca, presenta rispetto ad altri strumenti descritti l’innovazione e il vantaggio di non richiedere l’utilizzo di un incubatore, in quanto esso stesso permette di coltivare cellule al suo interno in condizioni controllate di temperatura, pH e concentrazione di CO2. La sua flessibilità operativa consente di impostare e controllare da personal computer leggi di moto di qualsiasi forma anche con cicliche molto veloci. Infine, la presenza di estensimetri in grado di misurare finemente la variazione di tensione esercitata sulla matrice polimerica utilizzata, posta in trazione tra due afferraggi, permette di applicare nel tempo una forza di stiramento costante, ottenendo deformazioni controllate e risultati riproducibili in termini di modificazioni cellulari. Il superamento delle problematiche sorte durante la fase di messa a punto del sistema, che deve essere ritenuto parte integrante del lavoro di sviluppo condotto, ha permesso di studiare l’adattamento di MSCs allo stiramento ciclico, mostrando che questo effettivamente determina alcune differenze fenotipiche rispetto al controllo statico. Inoltre le cellule hanno acquistato una disposizione orientata lungo l’asse longitudinale delle fibre, dato questo particolarmente importante se si considera la disposizione ordinata delle cellule del miocardio, le quali costituiscono un vero e proprio sincizio, indispensabile per una diffusione sincrona dell’impulso elettrico di contrazione. La creazione di uno pseudotessuto cardiaco ottimale richiederà ovviamente ulteriore lavoro, ma la metodica qui presentata si propone al tempo stesso come uno strumento di studio e come una strategia operativa per un approccio innovativo e standardizzabile alla medicina rigenerativa del miocardio.

Le cellule staminali mesenchimali (MSC) impiegate nelle strategie di medicina rigenerativa sono state isolate da vari tessuti, quali midollo osseo, tessuto adiposo e polpa dentale. Le MSC sono elementi peculiari che contribuiscono al processo di guarigione ossea, sia direttamente poichè precurcosi degli osteoblasti o indirettamente, producendo citochine, fattori di crescita e modulando la vascolarizzazione e l’infiammazione. Pertanto, l’infusione di MSC rappresenta un potenziale approccio terapeutico per favorire la guarigione ossea. Tuttavia, il successo delle strategie rigenerative può essere influenzato da un microambiente sfavorevole. Lo scopo di questo studio è stato studiare come le caratteristiche fisico-chimiche del microambiente extracellulare, in particolare la tensione di ossigeno e l’acidosi extracellulare, possono modulare la staminalità e il potenziale osteogenico delle MSC. Abbiamo esaminato se l’ipossia prolungata influenzava il differenziamento osteogencio delle cellule staminali mesenchimali derivate dal tessuto adiposo (ASC). L’effetto della tensione di ossigeno è stato valutato sulla proliferazione cellulare, sugli antigeni di superficie, sull’espressione dei geni di staminalità e dell’osteogenesi, sulla deposizione di matrice minerale e sul rilascio dei fattori di crescita. Abbiamo dimostrato che l’ipossia aveva un duplice ruolo, promuoveva la proliferazione delle ASC in assenza di stimoli osteogenici, ma favoriva il differenziamento in presenza di fattori pro-osteogenici. Successivamente abbiamo valutato l’effetto di differenti livelli di pH extracellulare (6.5, 6.6, 7.1 e 7.4) sulla staminalità e il differenziamento osteogenico delle cellule staminali derivate dalla polpa dentale (DPSC). Abbiamo evidenziato che il microambiente acido promuoveva il fenotipo staminale delle DPSC. Inoltre, l’acidosi extracellulare riduceva significativamente la crescita cellulare favorendo lo stato quiescente G0 del ciclo cellulare. Infine, abbiamo dimostrato l’effetto inibitorio del pH acido sul potenziale osteogenico delle DPSC. Pertanto la modulazione delle variazioni della tensione di ossigeno e del pH extracellulare devono essere considerate quando le MSC rappresentano uno strumento terapeutico in campo ortopedico.
Mesenchymal stem cells (MSC) have been isolated from various tissues, including bone marrow, adipose tissue, and dental pulp for regenerative strategies in orthopaedics and dentistry. MSC are critical elements that may contribute to bone healing, either directly as osteoblast precursors or indirectly by producing cytokines and growth factors, and by modulating vascularization and inflammation. The infusion of MSC therefore represents a valuable therapeutic approach to enhance bone healing. However, the success of regenerative strategy may be hampered by an unfavourable microenvironment. The aim of this study was to investigate how physicochemical characteristics of extracellular microenvironment, including oxygen tension and extracellular acidity, can modulate the stemness and the osteogenic potential of MSC. We first examined whether a prolonged exposure to hypoxia affects the osteogenic differentiation of adipose derived mesenchymal stem cells (ASC). The effect of oxygen tension was evaluated on cell proliferation, surface antigens, stemness gene and bone-related genes expression, alkaline phosphatase activity, mineral matrix deposition, and growth factor release. We demonstrated that hypoxia acts dually, promoting ASC proliferation and stemness in the absence of osteogenic stimuli, but also inducing their differentiation in a bone-like milieu. We subsequently investigated the effect of different levels of extracellular pH (6.5, 6.8, 7.1 and 7.4) on stemness and osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells from dental pulp (DPSC). We were able to provide consistent evidence that an acidic microenvironment promotes the stemness state of DPSC. Moreover, extracellular acidosis significantly reduces cells growth, and push cells to reside in the quiescent G0 phase of the cell cycle. Finally, we demonstrated the inhibitory effect of acidic pH on the osteogenic potential of DPSC. Modulation of oxygen tension and extracellular pH variations must be considered when MSC are included as a therapeutic tool in bone-related applications.

Le cellule staminali mesenchimali (MSC) impiegate nelle strategie di medicina rigenerativa sono state isolate da vari tessuti, quali midollo osseo, tessuto adiposo e polpa dentale. Le MSC sono elementi peculiari che contribuiscono al processo di guarigione ossea, sia direttamente poichè precurcosi degli osteoblasti o indirettamente, producendo citochine, fattori di crescita e modulando la vascolarizzazione e l’infiammazione. Pertanto, l’infusione di MSC rappresenta un potenziale approccio terapeutico per favorire la guarigione ossea. Tuttavia, il successo delle strategie rigenerative può essere influenzato da un microambiente sfavorevole. Lo scopo di questo studio è stato studiare come le caratteristiche fisico-chimiche del microambiente extracellulare, in particolare la tensione di ossigeno e l’acidosi extracellulare, possono modulare la staminalità e il potenziale osteogenico delle MSC. Abbiamo esaminato se l’ipossia prolungata influenzava il differenziamento osteogencio delle cellule staminali mesenchimali derivate dal tessuto adiposo (ASC). L’effetto della tensione di ossigeno è stato valutato sulla proliferazione cellulare, sugli antigeni di superficie, sull’espressione dei geni di staminalità e dell’osteogenesi, sulla deposizione di matrice minerale e sul rilascio dei fattori di crescita. Abbiamo dimostrato che l’ipossia aveva un duplice ruolo, promuoveva la proliferazione delle ASC in assenza di stimoli osteogenici, ma favoriva il differenziamento in presenza di fattori pro-osteogenici. Successivamente abbiamo valutato l’effetto di differenti livelli di pH extracellulare (6.5, 6.6, 7.1 e 7.4) sulla staminalità e il differenziamento osteogenico delle cellule staminali derivate dalla polpa dentale (DPSC). Abbiamo evidenziato che il microambiente acido promuoveva il fenotipo staminale delle DPSC. Inoltre, l’acidosi extracellulare riduceva significativamente la crescita cellulare favorendo lo stato quiescente G0 del ciclo cellulare. Infine, abbiamo dimostrato l’effetto inibitorio del pH acido sul potenziale osteogenico delle DPSC. Pertanto la modulazione delle variazioni della tensione di ossigeno e del pH extracellulare devono essere considerate quando le MSC rappresentano uno strumento terapeutico in campo ortopedico.
Mesenchymal stem cells (MSC) have been isolated from various tissues, including bone marrow, adipose tissue, and dental pulp for regenerative strategies in orthopaedics and dentistry. MSC are critical elements that may contribute to bone healing, either directly as osteoblast precursors or indirectly by producing cytokines and growth factors, and by modulating vascularization and inflammation. The infusion of MSC therefore represents a valuable therapeutic approach to enhance bone healing. However, the success of regenerative strategy may be hampered by an unfavourable microenvironment. The aim of this study was to investigate how physicochemical characteristics of extracellular microenvironment, including oxygen tension and extracellular acidity, can modulate the stemness and the osteogenic potential of MSC. We first examined whether a prolonged exposure to hypoxia affects the osteogenic differentiation of adipose derived mesenchymal stem cells (ASC). The effect of oxygen tension was evaluated on cell proliferation, surface antigens, stemness gene and bone-related genes expression, alkaline phosphatase activity, mineral matrix deposition, and growth factor release. We demonstrated that hypoxia acts dually, promoting ASC proliferation and stemness in the absence of osteogenic stimuli, but also inducing their differentiation in a bone-like milieu. We subsequently investigated the effect of different levels of extracellular pH (6.5, 6.8, 7.1 and 7.4) on stemness and osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells from dental pulp (DPSC). We were able to provide consistent evidence that an acidic microenvironment promotes the stemness state of DPSC. Moreover, extracellular acidosis significantly reduces cells growth, and push cells to reside in the quiescent G0 phase of the cell cycle. Finally, we demonstrated the inhibitory effect of acidic pH on the osteogenic potential of DPSC. Modulation of oxygen tension and extracellular pH variations must be considered when MSC are included as a therapeutic tool in bone-related applications.

Il trapianto di fegato e' il trattamento di scelta per pazienti con patologia epatica cronica, cirrotica e/o neoplastica. Il limitato numero di donatori, nonche' il rigetto e l'uso prolungato di immunosoppressori, ne limitano l'applicazione clinica. Inoltre, la possibilita' di ottenere epatociti trapiantabili e' ostacolato dal basso potenziale replicativo delle cellule epatiche, dalla loro concomitante perdita di funzionalita' in coltura e dal ridotto numero di cellule vitali e funzionali che si ottengono dopo criopreservazione. Le cellule dello stroma midollare hanno la capacita' di differenziare in epatociti. In particolare, le cellule staminali mesenchimali (BM-MSCs) possiedono self-renewal e, coltivate in vitro e sotto opportuno condizionamento, possono differenziare in osteoblasti, adipociti, condrociti, miociti, rappresentando un potenziale trapiantologico. Scopo del nostro studio e' valutare le differenze in vitro delle hBM-MSCs in epatociti ed il loro stato funzionale.
Liver transplantation is the treatment of choice for patients with chronic liver disease, cirrhosis and / or cancer. The limited number of donors and rejection prolonged use of immunosuppressants, thus limiting their clinical application. In addition, the possibility of obtaining transplantable hepatocytes is hampered by the low replicative potential of liver cells, their concomitant loss of function in culture and the reduced number of viable cells and functional are obtained after cryopreservation. The bone marrow stromal cells have the ability to differentiate into hepatocytes. In particular, mesenchymal stem cells (BM-MSCs) possess self-renewal, and cultured in vitro and under appropriate conditions, can differentiate into osteoblasts, adipocytes, chondrocytes, myocytes, representing a potential transplant. The aim of our study was to evaluate the differences of the HBM-MSCs in vitro in hepatocytes and their functional status.

Bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) have been investigated as marker of liver regeneration in an experimental model of acute liver failure (ALF). This model was created in Wistar rats through an intraperitoneal injection of carbon tetrachloride (CCl4). MSCs (3 million) were collected by long bones of 10 Wistar rats and then intravenously infused 24 hours after induction of ALF in 16 rats, Group A. In control Group B, 16 rats received a peritoneal injection of CCl4, and an intravenous infusion of normal saline. All rats were sacrificed at 2, 3, 4 and 7 days post-CCl4-injection. To assess the efficacy of the induction of the ALF, 4 rats Group (C) were sacrified 1 day after poisoning. Biochemical markers (BM) of liver function as platelets counts and pathology examination of the procured livers were staged on post-infusion-days 2, 3, 4 and 7. In Group A platelets count was higher than in the untreated control Group on post-CCl4-infusion day 2nd (p = 0.02) and 3rd (p=0.001). Also The trend of BM as transaminases was higher in the non-treated Group B, GOT (p=0.002), GPT (p<0.0001). Pathology examination showed greater grade of hepatocellular necrosis, and neutrophilic infiltration in Group B (p=0.02). MSCs infusion determined a less aggressive picture of hepatic damage.

L’infiammazione cronica è un fattore di rischio di insorgenza del cancro, e la citochina infiammatoria IL-6 gioca un ruolo importante nella tumorigenesi. In questo studio abbiamo dimostrato che L’IL-6 down-regola l'espressione e l'attività di p53. In linee cellulari umane, IL-6 stimola la trascrizione dell’rRNA mediante espressione della proteina c-myc a livello post-trascrizionale in un meccanismo p38MAPK-dipendente. L'up-regolazione della biogenesi ribosomiale riduce l'espressione di p53 attraverso l'attivazione della via della proteina ribosomale-MDM2. La down-regolazione di p53 produce l’acquisizione di modifiche fenotipiche e funzionali caratteristiche della epitelio mesenchimale di transizione, un processo associato a trasformazione maligna e progressione tumorale. I nostri dati mostrano che questi cambiamenti avvengono anche nelle cellule epiteliali del colon di pazienti affetti da colite ulcerosa, un esempio rappresentativo di una infiammazione cronica soggetta a trasformazione neoplastica, che scompaiono dopo trattamento con farmaci antinfiammatori. Questi risultati svelano un nuovo effetto oncogenico indotto dall’IL-6 che può contribuire notevolmente ad aumentare il rischio di sviluppare il cancro non solo in pazienti con infiammazioni croniche, ma anche in quei pazienti con condizioni patologiche caratterizzate da elevato livello di IL-6 nel plasma, quali l'obesità e e il diabete mellito di tipo 2.
Chronic inflammation is an established risk factor of the onset of cancer, and the inflammatory cytokine IL-6 has been proved to play a role in tumorigenesis. Here we showed that IL-6 down-regulates the expression and activity of the tumor suppressor p53. In human cell lines, IL-6 enhanced rRNA transcription by stimulating c-myc protein expression at post-transcriptional level in a p38MAPK-dependent manner. The up-regulated ribosome biogenesis reduced the p53 expression through the activation of the ribosomal protein-MDM2 degradation pathway of p53. The p53 down-regulation induced cells to acquire phenotypic and functional changes characteristic of the epithelial-mesenchymal transition, a process associated with malignant transformation and tumor progression. We found that these changes also occurred in the colon epithelial cells of patients with ulcerative colitis, a very representative example of a chronic inflammation prone to neoplastic transformation, and disappeared after treatment with anti-inflammatory drugs. These findings unraveled a new IL-6 induced oncogenic effect which can greatly contribute to increase the risk to develop cancer not only in patients with chronic inflammations, but also in patients with those pathological conditions which are characterized by high IL-6 plasma level, such as obesity and type-2 diabetes mellitus.

L’infiammazione cronica è un fattore di rischio di insorgenza del cancro, e la citochina infiammatoria IL-6 gioca un ruolo importante nella tumorigenesi. In questo studio abbiamo dimostrato che L’IL-6 down-regola l'espressione e l'attività di p53. In linee cellulari umane, IL-6 stimola la trascrizione dell’rRNA mediante espressione della proteina c-myc a livello post-trascrizionale in un meccanismo p38MAPK-dipendente. L'up-regolazione della biogenesi ribosomiale riduce l'espressione di p53 attraverso l'attivazione della via della proteina ribosomale-MDM2. La down-regolazione di p53 produce l’acquisizione di modifiche fenotipiche e funzionali caratteristiche della epitelio mesenchimale di transizione, un processo associato a trasformazione maligna e progressione tumorale. I nostri dati mostrano che questi cambiamenti avvengono anche nelle cellule epiteliali del colon di pazienti affetti da colite ulcerosa, un esempio rappresentativo di una infiammazione cronica soggetta a trasformazione neoplastica, che scompaiono dopo trattamento con farmaci antinfiammatori. Questi risultati svelano un nuovo effetto oncogenico indotto dall’IL-6 che può contribuire notevolmente ad aumentare il rischio di sviluppare il cancro non solo in pazienti con infiammazioni croniche, ma anche in quei pazienti con condizioni patologiche caratterizzate da elevato livello di IL-6 nel plasma, quali l'obesità e e il diabete mellito di tipo 2.
Chronic inflammation is an established risk factor of the onset of cancer, and the inflammatory cytokine IL-6 has been proved to play a role in tumorigenesis. Here we showed that IL-6 down-regulates the expression and activity of the tumor suppressor p53. In human cell lines, IL-6 enhanced rRNA transcription by stimulating c-myc protein expression at post-transcriptional level in a p38MAPK-dependent manner. The up-regulated ribosome biogenesis reduced the p53 expression through the activation of the ribosomal protein-MDM2 degradation pathway of p53. The p53 down-regulation induced cells to acquire phenotypic and functional changes characteristic of the epithelial-mesenchymal transition, a process associated with malignant transformation and tumor progression. We found that these changes also occurred in the colon epithelial cells of patients with ulcerative colitis, a very representative example of a chronic inflammation prone to neoplastic transformation, and disappeared after treatment with anti-inflammatory drugs. These findings unraveled a new IL-6 induced oncogenic effect which can greatly contribute to increase the risk to develop cancer not only in patients with chronic inflammations, but also in patients with those pathological conditions which are characterized by high IL-6 plasma level, such as obesity and type-2 diabetes mellitus.

In adult tissues, somatic stem cells represent a cell reservoir involved in physiological or pathological cell replacement within healthy or damaged tissue. Thanks to specific molecular or physical signals of the microenvironment, homeostasis process is guaranteed inside stem cell niches. Factors deriving from pathological events induce a shift in stem cell behaviour to cell differentiation, in order to reconstitute cell populations lost in the damaged tissue. In several myopathies, chronic inflammation is a part of pathological process that causes fibrotic infiltrations and adipose deposition within degenerating tissue, leading even to muscle substitution. Mechanisms underlying these events are not clear yet and represents a focus in etiopathogenetic studies on muscular research. The aim of this work was to develop an experimental model for mimicking in vitro the effects of a damaged muscle on a specific stem cell population; the methodological improvement is represented by the simultaneous culture of both the component in a microenvironment divided by a porous membrane. Parameters setting and standardization make the method reproducible and applicable to different culture conditions. First experimental session, performed on a population of human circulating myogenic progenitors expressing CD133 antigen, has shown how the presence of a murine muscle tissue section in culture can induce an higher cell proliferation and expression of an early marker of muscle differentiation, as Myf5. Nevertheless, because of their hematopoietic origin, these cells cannot complete their myogenic differentiation, that is usually achieved in a direct coculture with myotubes or myofibers. The same experimental design, applied for the culture of mesenchymal stem cells with myogenic potential, has shown how the biological factors, released by the murine muscle section, can induce an adipose differentiation in that stem cell population. Lipid drops in cell cytoplasm and expression of specific markers of adipose differentiation, such as perilipin A and FABP4, confirmed that the experimental model proposed can reproduce in vitro a culture condition similar to the one observed in degenerating muscle in several myopathies. This methodological approach represents a new model for in vitro study of adipose deposition in muscle, whose molecular mechanisms are not well characterized yet; using a whole tissue section in culture allows to reproduce in vitro a microenvironment similar to the once observed in vivo. For this reason the experimental model developed for this work can be seen as new perspective in the study of molecular process underlying adipose tissue formation in degenerating muscle.

Le cellule mesenchimali stromali (MSC) sono cellule multipotenti e numerosi studi hanno mostrato i loro effetti benefici nel danno renale acuto ma non sono ancora stati dimostrati potenziali effetti nella malattia renale cronica. L'ostruzione ureterale unilaterale (UUO) è un modello di fibrosi interstiziale nel quale l'attivazione di molecole vasoattive, citochine profibrotiche e infiammatorie gioca un ruolo patogenetico nello sviluppo dell'apoptosi e atrofia tubulare. Il sistema renina-angiotensina (RAS) gioca un ruolo chiave nello sviluppo della fibrosi renale e i farmaci che hanno come target l'angiotensina II, principale mediatore del RAS, sono attualmente la terapia più efficace nel ridurre la progressione della malattia renale cronica. E' noto che gli ACE-inibitori (ACEi) inducono un aumento compensatorio della renina plasmatica per la mancaza del feedback negativo sulla sua produzione. Tuttavia, la renina (R) promuove il danno renale non solo stimolando la produzione di ANGII, ma anche up-regolando geni profibrotici attraverso l'attivazione del recettore renina/prorenina. Lo scopo dello studio è stato indagare se l'infusione di MSC riduceva il danno renalein un modello animale di UUO e comparare gli eventuali effetti protettivi di ACEi e MSC in UUO. Abbiamo studiato 5 gruppi di ratti. A: sham operati. B: ratti sottoposti a UUO che ricevevano soluzione salina. C: ratti sottoposti a UUO che ricevavano MSC 3X106 nella vena della coda al giorno 0. D:ratti sottoposti a UUO che ricevevano lisinopril dal g 1 al g 21. E: ratti sottoposti a UUO che ricevevano MSC 3X106 nella vena della coda al giorno 0 e lisinopril dal g 1 al g 21. I ratti sono stati sacrificati al giorno 7 e 21. I risultati dello studio mostrano che MSC in UUO prevengono l'aumento della renina, riducono la generazione di ANGII e che in terapia combinata con ACEi riducono ulteriormente l'ANGII, determinando una sinergia nel miglioramento della fibrosi renale.
Mesenchymal stromal cells (MSC) are multipotent cells with immunomodulant and anti-inflammatory effect. Several studies have shown MSC beneficial effect in acute kidney injury but are not yet known MSC effects in chronic kidney disease. Unilateral ureteral obstruction (UUO) is a model of renal interstitial fibrosis, the final common pathway for progressive renal diseases where the activation of vasoactive molecules, inflammatory and profibrotic cytokines plays a pathogenetic role in the development of cell apoptosis and tubular atrophy. Renin-angiotensin system (RAS) plays a pivotal role in renal fibrosis and agents that target angiotensin II, principal mediator of RAS, are the most effective therapy to reduce progression of chronic kidney disease. Its known that angiotensin-converting enzyme inhibitors (ACEi) induce a compensatory increase in plasma renin levels because of the disruption of the negative feedback of its production. However renin (R) promotes renal injury not only by stimulating angiotensin II (ANG II) generation, but also up-regulating pro-fibrotic genes through renin/prorenin receptor activation. The aim of the study was to investigate whether MSC infusion attenuate renal injury in a rat model of UUO and to compare the protective effects of ACEi and MSC in UUO. We studied 5 groups of rats. A: rats sham operated. B: rats UUO received saline solution on day 0 (vehicle control). C: rats UUO received MSC 3X106 on day 0 via tail vein. D: rats UUO received lisinopril from d 1 to 21. E: rats UUO received MSC on d 0, and lisinopril from d 1 to 21. Rats were sacrified on d 7 and 21. Our results show that MSC in UUO rat model prevent renin increase, reduce angiotensin II generation and in combination therapy with ACEi suppress further angiotensin II block, thereby lead to a synergy in ameliorating renal fibrosis.

Le cellule mesenchimali stromali (MSC) sono cellule multipotenti e numerosi studi hanno mostrato i loro effetti benefici nel danno renale acuto ma non sono ancora stati dimostrati potenziali effetti nella malattia renale cronica. L'ostruzione ureterale unilaterale (UUO) è un modello di fibrosi interstiziale nel quale l'attivazione di molecole vasoattive, citochine profibrotiche e infiammatorie gioca un ruolo patogenetico nello sviluppo dell'apoptosi e atrofia tubulare. Il sistema renina-angiotensina (RAS) gioca un ruolo chiave nello sviluppo della fibrosi renale e i farmaci che hanno come target l'angiotensina II, principale mediatore del RAS, sono attualmente la terapia più efficace nel ridurre la progressione della malattia renale cronica. E' noto che gli ACE-inibitori (ACEi) inducono un aumento compensatorio della renina plasmatica per la mancaza del feedback negativo sulla sua produzione. Tuttavia, la renina (R) promuove il danno renale non solo stimolando la produzione di ANGII, ma anche up-regolando geni profibrotici attraverso l'attivazione del recettore renina/prorenina. Lo scopo dello studio è stato indagare se l'infusione di MSC riduceva il danno renalein un modello animale di UUO e comparare gli eventuali effetti protettivi di ACEi e MSC in UUO. Abbiamo studiato 5 gruppi di ratti. A: sham operati. B: ratti sottoposti a UUO che ricevevano soluzione salina. C: ratti sottoposti a UUO che ricevavano MSC 3X106 nella vena della coda al giorno 0. D:ratti sottoposti a UUO che ricevevano lisinopril dal g 1 al g 21. E: ratti sottoposti a UUO che ricevevano MSC 3X106 nella vena della coda al giorno 0 e lisinopril dal g 1 al g 21. I ratti sono stati sacrificati al giorno 7 e 21. I risultati dello studio mostrano che MSC in UUO prevengono l'aumento della renina, riducono la generazione di ANGII e che in terapia combinata con ACEi riducono ulteriormente l'ANGII, determinando una sinergia nel miglioramento della fibrosi renale.
Mesenchymal stromal cells (MSC) are multipotent cells with immunomodulant and anti-inflammatory effect. Several studies have shown MSC beneficial effect in acute kidney injury but are not yet known MSC effects in chronic kidney disease. Unilateral ureteral obstruction (UUO) is a model of renal interstitial fibrosis, the final common pathway for progressive renal diseases where the activation of vasoactive molecules, inflammatory and profibrotic cytokines plays a pathogenetic role in the development of cell apoptosis and tubular atrophy. Renin-angiotensin system (RAS) plays a pivotal role in renal fibrosis and agents that target angiotensin II, principal mediator of RAS, are the most effective therapy to reduce progression of chronic kidney disease. Its known that angiotensin-converting enzyme inhibitors (ACEi) induce a compensatory increase in plasma renin levels because of the disruption of the negative feedback of its production. However renin (R) promotes renal injury not only by stimulating angiotensin II (ANG II) generation, but also up-regulating pro-fibrotic genes through renin/prorenin receptor activation. The aim of the study was to investigate whether MSC infusion attenuate renal injury in a rat model of UUO and to compare the protective effects of ACEi and MSC in UUO. We studied 5 groups of rats. A: rats sham operated. B: rats UUO received saline solution on day 0 (vehicle control). C: rats UUO received MSC 3X106 on day 0 via tail vein. D: rats UUO received lisinopril from d 1 to 21. E: rats UUO received MSC on d 0, and lisinopril from d 1 to 21. Rats were sacrified on d 7 and 21. Our results show that MSC in UUO rat model prevent renin increase, reduce angiotensin II generation and in combination therapy with ACEi suppress further angiotensin II block, thereby lead to a synergy in ameliorating renal fibrosis.

Introduzione. Le cellule mesenchimali derivate dal tessuto adiposo (hASC) rappresentano un importante strumento per la terapia cellulare, in quanto derivano da un tessuto adulto abbondante e facilmente reperibile. Con il dispositivo medico Lipogems l’isolamento di tali cellule è eseguito esclusivamente mediante sollecitazioni meccaniche. Il prodotto ottenuto è quindi minimamente manipolato e subito utilizzabile. Ad oggi, il condizionamento pro-differenziativo delle staminali è per lo più attuato mediante molecole di sintesi. Tuttavia, altri fattori possono modulare la fisiologia cellulare, come gli stimoli fisici e molecole naturali. Onde elettromagnetiche hanno indotto in modelli cellulari staminali l’espressione di alcuni marcatori di differenziamento e, in cellule adulte, una riprogrammazione, mentre estratti embrionali di Zebrafish sono risultati antiproliferativi sia in vitro che in vivo. Metodi. La ricerca di nuove strategie differenziative sia di natura fisica che molecolare, nel particolare onde acustiche ed estratti embrionali di Zebrafish, è stata condotta utilizzando come modello cellulare le hASC isolate con Lipogems. Onde acustiche sono state somministrate mediante l’utilizzo di due apparati di trasduzione, un generatore di onde meccaniche e il Cell Exciter . I trattamenti con gli estratti embrionali sono stati effettuati utilizzando diverse concentrazioni e diversi tempi sperimentali. Gli effetti sull’espressione dei marcatori di staminalità e differenziamento relativi ai trattamenti sono stati saggiati in RT-PCR quantitativa relativa e/o in qPCR. Per i trattamenti di tipo molecolare è stata valutata anche la proliferazione. Risultati e conclusioni. La meta-analisi dei dati delle colture di controllo mostra la stabilità d’espressione genica del modello. I trattamenti con i suoni inducono variazioni dell’espressione genica, suggerendo un ruolo regolatorio di tali stimoli, in particolare del processo di commitment cardiovascolare. Due degli estratti embrionali di Zebrafish testati inibiscono la proliferazione alle 72 ore dalla somministrazione. L’analisi d’espressione associata ai trattamenti antiproliferativi suggerisce che tale effetto abbia basi molecolari simili ai processi di differenziamento.
Background. Adipose derived mesenchymal stem cells (hASC) represent an interesting tool for cell therapy, due to their tissue derivation that is abundant and easily available. Using Lipogems, a medical device, stem cells isolation is performed only with mild mechanical forces, giving a minimally manipulated and ready to use fat product. To date, the differentiation processes in vitro are mostly obtained using chemical compounds. Anyway, other factors are shown to be modulators in cell physiology, as physical stimuli and some natural molecules. For instance, electromagnetic waves induced the expression of differentiation markers in stem cell models and adult cells were reprogrammed after treatment, while Zebrafish embryo derived extracts were shown to be antiproliferative both in vitro and in vivo. Methods. The search for new differentiation strategies was focused both on physical waves and Zebrafish extracts, using hASC isolated with Lipogems as cell model. Acoustic waves were gave using two types of transducer, the mechanical wave generator and the Cell Exciter. Zebrafish extracts treatments were performed using different doses and experimental times. Gene expression analysis of stemness and differentiation genes was conducted in both the experimental approaches using quantitative relative RT-PCR and/or qPCR. Proliferation assay was also performed for treatments with natural compounds. Results and conclusions. Control cell culture data meta-analysis revealed that hASC has a stable gene expression in basal conditions. Acoustic waves induced gene expression changes in hASC, in particular in cardiovascular commitment genes, suggesting a regulatory role in differentiation processes. Two of the Zebrafish extracts are shown to inhibit hASC proliferation, with statistical significance after 72 hours from the treatment. Gene espression analysis suggested that this effect could share the same molecular mechanism with differentiation events.

Introduzione. Le cellule mesenchimali derivate dal tessuto adiposo (hASC) rappresentano un importante strumento per la terapia cellulare, in quanto derivano da un tessuto adulto abbondante e facilmente reperibile. Con il dispositivo medico Lipogems l’isolamento di tali cellule è eseguito esclusivamente mediante sollecitazioni meccaniche. Il prodotto ottenuto è quindi minimamente manipolato e subito utilizzabile. Ad oggi, il condizionamento pro-differenziativo delle staminali è per lo più attuato mediante molecole di sintesi. Tuttavia, altri fattori possono modulare la fisiologia cellulare, come gli stimoli fisici e molecole naturali. Onde elettromagnetiche hanno indotto in modelli cellulari staminali l’espressione di alcuni marcatori di differenziamento e, in cellule adulte, una riprogrammazione, mentre estratti embrionali di Zebrafish sono risultati antiproliferativi sia in vitro che in vivo. Metodi. La ricerca di nuove strategie differenziative sia di natura fisica che molecolare, nel particolare onde acustiche ed estratti embrionali di Zebrafish, è stata condotta utilizzando come modello cellulare le hASC isolate con Lipogems. Onde acustiche sono state somministrate mediante l’utilizzo di due apparati di trasduzione, un generatore di onde meccaniche e il Cell Exciter . I trattamenti con gli estratti embrionali sono stati effettuati utilizzando diverse concentrazioni e diversi tempi sperimentali. Gli effetti sull’espressione dei marcatori di staminalità e differenziamento relativi ai trattamenti sono stati saggiati in RT-PCR quantitativa relativa e/o in qPCR. Per i trattamenti di tipo molecolare è stata valutata anche la proliferazione. Risultati e conclusioni. La meta-analisi dei dati delle colture di controllo mostra la stabilità d’espressione genica del modello. I trattamenti con i suoni inducono variazioni dell’espressione genica, suggerendo un ruolo regolatorio di tali stimoli, in particolare del processo di commitment cardiovascolare. Due degli estratti embrionali di Zebrafish testati inibiscono la proliferazione alle 72 ore dalla somministrazione. L’analisi d’espressione associata ai trattamenti antiproliferativi suggerisce che tale effetto abbia basi molecolari simili ai processi di differenziamento.
Background. Adipose derived mesenchymal stem cells (hASC) represent an interesting tool for cell therapy, due to their tissue derivation that is abundant and easily available. Using Lipogems, a medical device, stem cells isolation is performed only with mild mechanical forces, giving a minimally manipulated and ready to use fat product. To date, the differentiation processes in vitro are mostly obtained using chemical compounds. Anyway, other factors are shown to be modulators in cell physiology, as physical stimuli and some natural molecules. For instance, electromagnetic waves induced the expression of differentiation markers in stem cell models and adult cells were reprogrammed after treatment, while Zebrafish embryo derived extracts were shown to be antiproliferative both in vitro and in vivo. Methods. The search for new differentiation strategies was focused both on physical waves and Zebrafish extracts, using hASC isolated with Lipogems as cell model. Acoustic waves were gave using two types of transducer, the mechanical wave generator and the Cell Exciter. Zebrafish extracts treatments were performed using different doses and experimental times. Gene expression analysis of stemness and differentiation genes was conducted in both the experimental approaches using quantitative relative RT-PCR and/or qPCR. Proliferation assay was also performed for treatments with natural compounds. Results and conclusions. Control cell culture data meta-analysis revealed that hASC has a stable gene expression in basal conditions. Acoustic waves induced gene expression changes in hASC, in particular in cardiovascular commitment genes, suggesting a regulatory role in differentiation processes. Two of the Zebrafish extracts are shown to inhibit hASC proliferation, with statistical significance after 72 hours from the treatment. Gene espression analysis suggested that this effect could share the same molecular mechanism with differentiation events.

Human mesenchymal stromal cells (hMSCs) are multipotent cells isolated from several tissues that possess self-renewal capacity, long term viability and are capable to differentiate into several cell lineages (osteoblasts, chondrocytes, adipocytes, etc.). They interact with hematopoietic stem cells (HSC) and exert immunoregulatory function. These characteristics make MSCs excellent candidates for regenerative medicine and gene therapy. To date, bone marrow (BM) has been the main source for the isolation of hMSCs,but in the last decade some drawbacks arose: 1) the cells low number that requires an ex vivo expansion; 2) the BM MSCs senescence with increasing of donor age; 3) the invasive procedure. This has led many researchers to investigate alternative MSCs sources and new expansion protocols to bypass FBS/human platelet rich plasma (hPRP) limitations: 1) the risk of prion diseases and immunological reactions associated with the use of FBS; 2) the decreased proliferative effect of hPRP after high g rate centrifugation to purify it, its undefined composition and its full clinical impact that remains to be investigated. In addition, its use is limited by the amount of whole blood necessary to obtain a sufficient quantity of autologous hPRP for cell expansion. In this study we focused on: 1) adipose tissue derived-MSCs (AT MSCs) because of the high number of cells that can be obtained and the easy enzyme-based procedures; 2) umbilical cord derived-MSCs (UC MSCs) which possess greater and faster expansion capability, higher frequency of colony forming unit fibroblast (CFU-F) than BM MSCs. For the first time, we evaluated, measuring bromo-deoxyuridine incorporation in neosynthesized DNA, the effects on AT and UC MSCs expansion of a pool of seven human recombinant growth factors: epidermal growth factor (EGF), basic-fibroblast growth factor (bFGF), granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF), hepatocyte growth factor (HGF), insulin-like growth factor I (IGF I), platelet-derived Growth factor-bb (PDGFbb) and transforming growth factor β1 (TGFβ1). We defined two cytokines cocktails based on EGF-bFGF-PDGFbb for AT MSCs, and EGF-PDGFbb for UC MSCs expansion in a FBS-free medium supplemented with hPPP (3%), which allows a normal MSCs expansion with a minimal apoptosis and supports GFs proliferative effect. These mixtures permitted us, starting from about 100-150 cm3 of AT and 30 cm of UC, to obtain after 21 days of culture a sufficient number of cells for clinical applications, for example in graft versus host disease (GvHD). Furthermore, in our expansion conditions, we required about 80 ml of hPPP obtainable from 150-200 ml of whole blood, as opposed to 350 ml of hPRP which requires 1000-1200 ml of whole blood. The mitogenic response decreases when MEK signaling is inhibited by U0126, a MEK1/2 inhibitor. This result suggests that MEK 1/2 pathway is required to mediate a maximum mitogenic response of cells to GFs. Our cocktails do not influence surface markers expression. AT and UC MSCs highly expressed CD 105, CD 90, and CD 44, whereas cells expressing CD 31, CD 34, CD 117 and CD 45 were lost with progressive passages, in line with the parameters proposed for MSCs by International Society for Cellular Therapy. High levels of the enzyme aldehyde dehydrogenase (ALDH) have proven to be a novel marker for the identification and isolation of hematopoietic stem cells (HSCs). Co-staining experiments revealed that >80% of ALDH+ umbilical cord blood cells were CD 34+. Based on our studies, ALDH combined with other surface markers (CD 45 and CD 105) can not be used exclusively to define MSCs derived from AT and UC in a manner similar to HSCs because of its low level (less than 50%). Differentiation capacity into adipogenic and osteogenic lineage, tested at the end of P2, was confirmed only for AT MSCs. The exposure to EGF-bFGF-PDGFbb increased adipogenic differentiation as well as osteogenic one respect to cultures in FBS and hPPP, likely because these GFs commit MSCs to specific mesodermal differentiation. This could represent a highly promising approach in tissue engineering for breast soft tissue reconstruction after mastectomy, tissue and subdermal defects after trauma or burn injury. AT MSCs were reported to have a slightly inferior potential for osteogenesis, with our GFs cocktail this “problem” could be overcome, a normal osteogenesis could take place and it could guarantee a large amount of osteogenic precursors for scaffold population. UC MSCs, probably due to their ontogenetic age, did not show mineralization and the formation of lipid vacuoles, but they were more immunocompetent than AT ones in the presence of GFs. UC MSCs immunosuppressive effect, on T cells stimulated with phytohemagglutinin, was confirmed in all tested supplements and was significant when MSCs:T cell ratio was 1:10. AT MSCs immunomodulation was detectable at 1:5 ratio in the presence of GFs cocktail and it was less marked than in FBS, likely because GFs, inducing cell maturation, reduce immunomodulatory potential. Whereas, UC MSCs, having relatively primitive nature, seem to be less influenced by cytokines than mature MSCs. We did not measure a significant immunosuppression when AT/UC MSCs and lymphocytes were separated by transwell. This suggests that the suppressive factor(s) are not constitutively secreted by MSCs and probably a pre-activation mediated by cell contact is required. Recently, a number of clinical trials used cytokine induced killer (CIK) cells in an attempt to improve the effectiveness of HSC transplantation. CIK cells are a population of immune-effector cells CD 3+ CD 56+, expanded in vitro by exposure to interferon γ, monoclonal anti CD3 and interleukin 2. They show cytotoxicity against a broad range of malignant cell targets, but not against normal CD 34+ stem cells. In view of relevant role of both MSCs and CIK cells, we explored the interactions between the two cell types. We found that CIK cells lysed UC MSCs in dose dependent manner, while UC cells killed CIK ones and suppressed their cytotoxicity against K562, a tumour target. These effects required cell to cell contact. Our results should be taken into account in evaluating novel protocols of adoptive immunotherapy. They suggest to administer, at first, mesenchymal cells to optimize engraftment and to prevent GvHD, and then CIK cells to mediate graft versus leukemia. In conclusion, our cocktails guarantee the expansion of an extremely homogeneous population of MSCs and a sufficient number of cells for clinical applications: committed AT MSCs in reconstructive medicine, and UC MSCs in hematologic context in combination with CIK cells.
Le cellule stromali mesenchimali umane (hMSC) sono cellule multipotenti, isolate da numerosi tessuti, con capacità di autoreplicarsi e di differenziarsi in più linee cellulari (osteoblasti, condrociti, adipociti, ecc.). Interagiscono con le cellule staminali ematopoietiche (HSC) e hanno proprietà immunomodulanti. Queste caratteristiche hanno reso le MSC eccellenti candidate per la medicina rigenerativa e la terapia genica. Fino ad oggi il midollo osseo (BM) ha rappresentato la fonte principale di MSC, ma nell’ultimo decennio sono state sollevate delle riserve: 1) la bassa frequenza che richiede un’espansione ex vivo; 2) la comparsa di senescenza con il progredire dell’età del donatore; 3) la procedura di prelievo invasiva. Questo ha spinto i ricercatori ad investigare, da una parte, fonti alternative e, dall’altra, nuovi protocolli di espansione per bypassare gli inconvenienti associati all’uso del siero fetale bovino (FBS) e di plasma umano arricchito di piastrine (hPRP). Le principali limitazioni sono legate, per l’FBS, al rischio di trasmissione di malattie prioniche e di reazioni immunitarie causate dalle proteine xenogeniche; per hPRP, alla sua composizione variabile, ad un effetto clinico poco conosciuto e, soprattutto, all’alta quantità di sangue intero richiesto per ottenere un volume di hPRP autologo sufficiente per l’espansione ex vivo delle MSC. In più, la centrifugazione ad alte g, nel tentativo di rimuovere le membrane delle piastrine, decresce l’effetto proliferativo di hPRP. In questo studio sono state prese in esame due fonti alternative: 1) il tessuto adiposo (AT), da dove le MSC sono ottenibili in alto numero e con una facile procedura enzimatica; 2) il cordone ombelicale (UC), dal quale sono isolabili, come riportato in letteratura, MSC caratterizzate da frequenza e capacità replicativa maggiori rispetto alle BM MSC. Per la prima volta è stato valutato, misurando l’incorporazione della bromo-deossiuridina nel DNA neosintetizzato, l’effetto sulla proliferazione di AT e UC MSC di un pool di sette fattori di crescita (GF) umani ricombinanti: epidermal growth factor (EGF), basic-fibroblast growth factor (bFGF), granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF), hepatocyte growth factor (HGF), insulin-like growth factor I (IGF I), platelet-derived growth factor-bb (PDGFbb) e transforming growth factor β1 (TGFβ1). Sono stati così definiti due cocktail a base di EGF-bFG-PDGFbb per le AT MSC e EGF-PDGFbb per espansione delle UC MSC in un mezzo FBS-free supplementato con plasma umano povero di piastrina (hPPP, 3%), che supporta la crescita delle mesenchimali minimizzando l’apoptosi e consente l’azione dei GF. Queste combinazioni di citochine sono state in grado di fornire, dopo 21 giorni di coltura, un numero sufficiente di cellule per un eventuale trattamento, ad esempio, della graft versus host disease (GvHD), partendo da 100-150 cm3 di AT e 20-30 cm di UC. Inoltre, nelle condizioni di coltura definite, sono serviti circa 80 ml di hPPP ottenibili da 150-200 ml di sangue intero, invece dei 350 ml di hPRP ricavabili da 1000-1200 ml di sangue. La risposta mitogenica riscontrata sembra coinvolgere due protein-kinasi specifiche, MEK1 e MEK2, come evidenziato in presenza di un loro inibitore specifico (U0126). Questo suggerisce la priorità di questa via nel mediare la risposta mitogenica massima delle citochine. I cocktail, inoltre, non influenzano l’espressione dei marker di superficie caratteristici delle mesenchimali. CD 105, CD 90 e CD 44 sono risultati altamente espressi sia sulle AT che sulle UC MSC, mentre la percentuale di cellule positive al CD 31, CD 34, CD 117 e CD 45 decresceva con il progredire dei passaggi, in linea con i criteri definiti dall’International Society for Cellular Therapy. Le aldeidi deidrogenasi (ALDH), una classe di enzimi ossidativi, sono state di recente proposte come marker per l’identificazione e l’isolamento delle HSC dove sono espresse ad alti livelli (>80% nelle cellule CD 34+ isolate dal sangue della vena del cordone ombelicale). In questo studio si è indagato se le ALDH potessero svolgere un ruolo analogo per le MSC. I risultati ottenuti hanno evidenziato che le ALDH, combinate con CD 45 e CD 105, non possono essere usate come marker identificativi per le MSC derivate da AT e UC a causa della loro bassa espressione (inferiore al 50%). La capacità differenziativa in senso adipogenico ed osteogenico, testato a fine del secondo passaggio (P2), è stata confermata per la AT MSC. L’esposizione a EGF-bFGF-PDGFbb ha incrementato l’adipogenesi e l’osteogenesi rispetto alla coltura in FBS e hPPP, probabilmente le citochine stimolano l’attivazione dei pathway coinvolti nel differenziamento adipogenico ed osteogenico. L’utilizzo di cellule mesenchimali “indirizzate” al differenziamento adipogenico potrebbe rappresentare una promettente risorsa in chirurgia plastica e ricostruttiva per la ricostruzione del seno dopo mastectomia, per la riparazione di difetti tissutali e subdemici conseguenti a traumi o ustioni. Per le AT MSC è stata riferita una potenzialità osteogenica inferiore alle altre MSC adulte. Con il cocktail definito, che predispone le AT MSC anche all’osteogenesi, questo “problema” potrebbe essere superato, garantendo un numero sufficiente di precursori osteogenici per il popolamento di uno scaffold. Le UC MSC, forse a causa della loro età ontogenia, non hanno evidenziato mineralizzazione e la formazione di vacuoli lipidici, ma si sono dimostrate più immunocompetenti delle AT MSC in presenza dei GF. L’effetto immunomodulante, a carico dei linfociti T attivati con fitoemagglutinina, è stato registrato per le UC MSC ad un rapporto MSC: cellule T pari a 1:10 in tutte le condizioni testate. L’immunomodulazione indotta dalle AT MSC è stata invece riscontrata a 1:5 in presenza del cocktail risultando così più blanda di quella in FBS. Probabilmente i fattori di crescita, inducendo la maturazione e predisponendo le cellule al differenziamento, compromettono le potenzialità immunomodulanti delle mesenchimali isolate da AT. Le UC MSC, essendo invece più immature, sono forse meno suscettibili all’azione dei GF rispetto alle MSC adulte. Quando tra mesenchimali e linfociti si è interposta una “barriera” che ne impediva il contatto “fisico”, non è stato rilevato alcun blocco significativo della proliferazione delle cellule T. Si può concludere che il contatto cellulare rappresenti la condizione necessaria per attivare i meccanismi di immunosoppressione come la produzione di fattori solubili. Recentemente, si sono moltiplicati i trial clinici dove si vanno ad infondere cellule CIK (cytokine induced killer) con lo scopo di aumentare l’efficienza del trapianto di HSC. Le cellule CIK sono una popolazione linfocitaria CD 3+ CD 56+, espanse in vitro con interferone γ, anti CD3 e interleuchina 2, e dotate di azione citotossica verso numerosi target tumorali, ma non sulle staminali CD 34+. Visto il ruolo rilevante in campo ematologico sia delle MSC che delle CIK, è stata indagata l’interazione tra le due popolazioni cellulari. Le CIK hanno mostrato un’azione citotossica sulle UC MSC dose dipendente, mentre le mesenchimali hanno determinato la soppressione delle CIK e la riduzione della loro potenzialità citotossica a carico della K562, un target tumorale. Questi risultati dovrebbero essere tenuti presenti nella definizione di nuovi protocolli clinici di immunoterapia. Essi suggeriscono di somministrare prima le mesenchimali al fine di supportare l’attecchimento delle HSC e prevenire la GvHD, e solo in un secondo tempo le CIK ad azione antitumorale. In conclusione, i cocktail definiti garantiscono l’espansione di una popolazione omogenea di mesenchimali e in numero sufficiente per l’uso clinico delle AT MSC “committed” in medicina ricostruttiva, e delle UC MSC in un contesto ematologico in combinazione con le cellule CIK a patto di una somministrazione in due tempi.

Il Paclitaxel (PTX) è un potente agente chemioterapico approvato per il trattamento di numerosi tumori solidi. Tuttavia, la scarsa solubilità in acqua e l’elevata tossicità causano gravi effetti collaterali che pregiudicano severamente la qualità di vita dei pazienti, già compromessa dalla patologia. Il presente lavoro di tesi ha riguardato la preparazione mediante nano-precipitazione di micelle di un pro-farmaco del PTX (PTX2S), caricate con feoforbide a (PheoA), una molecola fotosensibile che illuminata ad una specifica lunghezza d’onda genera specie reattive all’ossigeno (ROS) e ossigeno di singoletto (1O2) capaci di uccidere le cellule tumorali. Le nanomicelle sono state caratterizzate in termini di stabilità in condizioni fisiologiche, capacità di loading e di rilascio del farmaco e sviluppo di ROS a seguito di irraggiamento con luce bianca. Inoltre, test preliminari in vitro eseguiti su cellule staminali mesenchimali umane (MSC) hanno dimostrato che le nanomicelle sono efficacemente internalizzate dalle cellule senza comprometterne la vitalità e la morfologia. Tali dati preliminari dimostrano che le MSC possono essere quindi utilizzate come vettori selettivi delle nanomicelle qui descritte.

Osteogenic protein-1 (OP-1 or BMP-7) is a member of Bone Morfogenic Proteins’s family (BMPs) and consists of 431 amino acid. BMPs are multi-functional growth factors belonging to the transforming growth factor ? (TGF-?) superfamily. Implicated in a variety of functions as the formation of cartilage and bone, and the development of non-osteogenic tissues (heart, nerve), BMPs are secreted as a precursor approximately four times longer than the mature form, and share a C-terminal distinctive pattern ..C…CXGXC…CC…CXCX.. containing seven cysteines, the active region of the proteins. In this study we prepared a recombinant fusion protein, called TAT-OP1, including TAT sequence, an Arg rich peptide derived from HIV protein usually used to perform the cell transfection, and a portion of OP-1 sequence. The construct TAT-OP1, 162 aminoacids long, starts with an N-terminal 6His-tag followed by TAT sequence (all together 30 AA), a peptidase specific cleavage site (spanning 6 AA) and the C-terminal OP-1 domain (126 AA) containing the cysteines motive. Obtained by recombinant DNA technology, the protein TAT-OP1 has been purified by immobilized metal ion affinity chromatography (IMAC) and RP-HPLC, then characterized by SDS-PAGE, aminoacid analysis, UV, CD, and mass spectrometry. In order to demonstrate the osteogenic potential of recombinant fusion protein TAT-OP1, we treated osteoblastic cell line MC3T3-E1 by using different treatment conditions (pulse- 200 nM and in continous- 5.5, 13.5 and 27 nM treatment). After 7 and 14 days of cellular treatment performed by application of both stimulation methods, the presence of calcium salt deposits, alkaline phosphatase activity and the expression of osteogenic markers (osteopontin, osteocalcin and Cbfa1/Runx2) were detected by colorimetric and immunoflorescence assays. To investigate the possible applications of this protein in bone tissue engineering, we developed a research model using adherent fibroblastic cells isolated from umbilical cord blood (UCBMSCs) and a three-dimensional (3D) synthetic scaffold, named Puramatrix Hydrogel TM to mimic the native micro-environment. Moreover, PLGA micro-beads were employed to allow a controlled release of TAT-OP1 with the aim to maintain a suitable level of protein for prolonged times, enhancing its stimulation efficacy. The primary cultures of UCBMSCs were separated by density-gradient method and were phenotypically characterized in 2D system for the expression of CD105, CD90, CD166, nestin, c-kit, CD31, CD34 and CD38 and for their multi-differentiative potential. As detected on MC3T3-E1 cells, TAT-OP1 demostrated to stimulate nodule calcium formation and the expression of alkaline phosphatase when the cells were treated by both of stimulation methods. After encapsulation into Puramatrix Hydrogel TM, the cellular response to TAT-OP1 stimulation was evaluated by using electron microscopy analysis, to detect the production of bone like ECM. After 27 days of stimulation with TAT-OP1 (200 nM), microfibrils were observed partially aggregated around the cells. Calcification nodules and Hydroxyapatite crystals were detected only in the cultures encapsulated into Puramatrix Hydrogel TM and treated with PLGA microspheres-controlled release system. Further investigations will define the utility of this technical approach to improve the in vitro study of osteogenic differentiation and the biological activity of TAT-OP1 for clinical application in the field of bone tissue engineering.

La versatilità della struttura chimica del glicole polietilenico (PEG) e la sua eccellente biocompatibilità, hanno reso questo biomateriale un’ottima scelta per svariate applicazioni biomediche. Questa tesi compilativa si propone di descrivere questo interessante biomateriale nel campo dell’ingegneria dei tessuti, affrontando nel dettaglio un particolare caso di studio che vede il PEG impiegato come scaffold per la realizzazione di tessuti biologici (osseo e cartilagineo). Dopo avere introdotto e illustrato i principi dell’ingegneria dei tessuti e dei biomateriali più utilizzati in questo ambito, si descriveranno le principali tecniche di manipolazione per la fabbricazione dello scaffold costituito da PEG e alcuni impieghi del PEG come supporto per la drug delivery e la detossinazione. Infine verrà trattato il caso di studio: biostampa 3D di uno scaffold composito PEG-peptide contenente cellule mesenchimali staminali.

Previous works showed that muscle substitutes composed by acellular matrix and myoblasts may represent a promising approach for the treatment of diseases characterized by congenital absence or loss of large areas of skeletal muscle tissue. Here, the regeneration process occurring in vivo within the prosthetic material has been studied verifying the expression, as mRNA and protein, of some skeletal muscle and nerve tissue markers during three month after reconstructive surgery. The experimental evidences indicate that a progressive muscle remodelling within the implants exists and it is not completed after three months. Indeed, the simultaneous presence of markers belonging to both early and late differentiative stages indicates the presence of activated progenitors towards the myogenic line and cellular elements of advanced stages. Moreover, the involving of circulating precursors, probably of marrow origin, in the regeneration process it is suggested by the following observations: i) persistence of poorly differentiated cells at 3 months after surgery, ii) important cell migration from vessels without inflammatory phenomena, and iii) implanted myoblasts, that are cells already committed toward a specific fate, presumably form multinucleated elements in a short time. Finally, there is a rapid appearence of both vascular network and the nervous component. Although these promising results, in view of medical application a problem arise when the function of muscle satellite cells is impaired or their number inside the muscle fibers is low. To overcome this problem, this research has been addressed to the identification of alternative cell sources. For this reason, it has been evaluated both in vitro and in vivo the myogenic potential of mesenchymal cells (MSCs) obtained from umbilical cord blood (UCB). There is the possibility to withdraw the umbilical cord blood at the birth time and to store it in tissue banks, and having an autologous MSC reserve to use for congenital muscular diseases. Evidence for myogenic differentiation was found when MSCs were seeded on Matrigel® coated plates and cultured with myogenic media. After 4 days Myf-5, detected by immunofluorescence, was expressed by 13% of MSCs increasing to 30% at 8 days. We used quantitative PCR for human MyoD and Myogenin mRNAs to further demonstrate myogenic differentiation of MSCs. To evaluate the regenerative capacity of MSCs we used a skeletal muscle chemical injury model (bupivacaine hydrochloride), resulting in necrosis of muscle fibers in Lewis rat Tibialis Anterior. Undifferentiated green fluorescent protein (GFP)-labeled MSCs were injected into the injured muscle, without immunosuppression. The cells engrafted after 1 week and stained positive for Myf-5 and MyoD. After 2 weeks, we noted striations in fibers containing UCB-MSCs suggesting an organization of cytoskeletal proteins into sarcomeres. The skeletal muscle appeared intact by histological analysis, without signs of significant immunologic response, and the presence of MSCs was detected by immunostaining with a monoclonal antibody against human-Nuclei. In addition, these cells also expressed myosin and sarcomeric tropomyosin, a motor-protein and an actin-binding filament protein, respectively. At both time points we observed fibers with centrally located nuclei, indicating regenerated fibers. Finally, the number of GFP-positive fibers/total fibers counted in several fields was 40% for both time points and the area covered by these fibers was 20% of all fibers at 7 days increasing to 26% at 14 days, indicating a maturation of these myofibers. Our in vitro and in vivo data indicate that human MSCs are able to differentiate towards the myogenic lineage and may be efficiently incorporated into injured skeletal muscle, supporting the muscle regenerative process.

Questo progetto di ricerca ha voluto valutare l’efficacia del trattamento combinato con cellule staminali autologhe di origine mesenchimale e concentrato piastrinico per uso non trasfusionale, come innovativo trattamento sphincter-saving, nella cura delle fistole perianali complesse. Il reclutamento iniziale eseguito presso l’ambulatorio di colo-proctologia dell’UOC di Chirurgia generale e d’Urgenza del Policlinico “P. Giaccone” ha compreso 22 pazienti con fistole perianali complesse. I nostri criteri di esclusione sono stati: fistole non complicate curabili con semplice fistulotomia, fistole retto-vaginali, gravidanza, morbo di Crohn e rettocolite ulcerosa, HCV, HBV, HIV, neoplasie, malattie autoimmuni, TBC, malattie psichiatriche, in trattamento con agenti immunosoppressori o citotossici. Questi pazienti sono stati sottoposti, dopo studio morfo-funzionale con RMN con mdc e manometria, a trattamenti di bonifica preliminare che sono consistiti nel posizionamento di un loose seton in 13 pazienti e di una bonifica perianale per la presenza di raccolte ascessuali in 5 pazienti. Durante i controlli intermedi 12 pazienti sono stati esclusi dallo studio, nello specifico in 7 pazienti si è avuta una superficializzazione del tramite, motivo per cui gli stessi sono stati sottoposti a semplice fistulotomia, 2 pazienti sono stati esclusi a causa delle comorbidità, 3 pazienti hanno rifiutato il trattamento proposto. Sono quindi stati trattati con stromal vascular fraction, contenente cellule staminali autologhe di origine mesenchimale, ottenuto mediante lipoaspirazione e centrifugazione, unitamente al concentrato piastrinico per uso non trasfusionale autologo pre-depositato, 9 pazienti, di cui 4 maschi e 5 femmine. L’età media dei pazienti è stata di 41 anni. Le fistole trattate erano tutte transfinteriche, di cui recidive in 5 pazienti che presentavano un numero medio di interventi chirurgici precedenti il nostro trattamento di 5 interventi ed anteriori in 4 pazienti. Durante il follow-up in una paziente data la persistenza di secrezioni è stato posizionato un setone di drenaggio ed eseguito un nuovo trattamento con inoculo di un’ulteriore quota di CPUNT dopo periodo di bonifica, cui è succeduta una nuova recidiva; la paziente ha poi avuto una diagnosi di verosimile M. di Crohn; si segnala che lo studio e l’esclusione di presenza di IBD era stato eseguito nel preoperatorio di tutti i pazienti trattati. Un altro paziente ha mostrato una riduzione delle secrezioni pur con una loro persistenza per cui è stato sottoposto ad un nuovo trattamento con CPUNT senza beneficio. E’ stata eseguita una valutazione della qualità di vita con l’utilizzo dello score SF-36 (versione italiana) ed una dei risultati funzionali con il Wexner score e Vaizey score. Nei pazienti guariti si è avuto un miglioramento nella valutazione generale della salute fisica (PCS) in 5 pazienti, in un paziente il valore è rimasto invariato ed un paziente ha mostrato un peggioramento. Il miglioramento del PCS tra il pre ed il post-operatorio è stato debolmente significativo (P=0.0502). Per quanto riguarda la valutazione generale dello stato di salute mentale (MCS), nei pazienti guariti si è avuto un miglioramento in 5 pazienti ed un peggioramento in due pazienti. La variazione nel MCS tra il pre ed il post-operatorio non è stata statisticamente significativa (P=0.1665). Non vi sono state differenze statisticamente significative nel Wexner score (p=0.3125) e nel Vazey score(p=0.4375). Al follow-up ad un anno il 77.7% dei pazienti è guarito. Il trattamento proposto ha mostrato alti tassi di guarigione, pressocchè nulle complicanze e non ha influito negativamente sulla continenza dei pazienti trattati.

"Human Bone Marrow and Adipose Tissue Mesenchimal Stem cells: isolation, differentiation and growth on polimeric scaffold" Tissue engineering has demonstrated his positive role in the repair of damaged tissues. This study investigated the properties of adult mesenchimal stem cells (MSCs) obteined from adipose tissue and bone marrow. The plastic-adherent (PA) and immunomagnetic by anti-nerve growth factor receptor antibodies (anti-NFGR) isolation tecniques were compared. In vitro MSCs diffusion and differentiation was studied for multiple lineage (chondrogenic, adipogenic, fibroblastic and osteoblastic). Adesive and proliferation cells properties were studied on commercial homologous idrossilapatite and on biomaterials polyurethane polimeric scaffold constructed and developed just for this research. Results suggested that adipose tissue may be a source of pluripotent stem cells and that NGFR+ cells are a population highly primitive and homogeneous. The polyurethane scaffolds aren' t citotossic and permit the diffusion and proliferation of MSCs

Stem cells have become worldwide interesting because they can be potentially employed for the treatment of many different types of deseases; moreover, they can be manipulated representing a promising tool for genetic therapy. Mesenchymal stem cells (MSC) can be obtained from several adult tissues and from fetal-derived tissues, such as umbilical cord, umbilical cord blood and placenta, and they can be induced to differentiate into several cell types. Nevertheless, proliferation and differentiation potential of these cells has not yet been explained; particularly differentiative potential of fetal-derived tissue cells remains to be investigated. In this study, umbilical cord blood (UCB) and umbilical cord (UC) have been evaluated as potential sources of MSC. For this purpose, a subpopulation of cells expressing CD105, a membrane antigen well known as marker of MSC, has been isolated from UCB and UC. The proliferative potential and plasticity of CD105-positive cells have been investigated in vitro by means of synthetic or natural supports and/or using differentiative media containing inductive factors. Finally, in view of clinical applications, the engraftment of these cells in a model of chemical-induced liver injury has been verified. Collectively, our data have demonstrated in vitro the plasticity of UCB and UC CD105-positive cells not only towards mesodermal lineage cells (osteogenic and adipogenic lineage) but also towards endodermal lineage cells (hepatogenic lineage). These results suggest that CD105-positive cells could be usefully employed in regenerative medicine. In fact, due to availability, safety in the collection and lack of ethical issues, UCB and UC may become elective sources of multipotent MSC.