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MANCUSO, PIETRO, Antonio Giordano, Lionel Larue, and Alfonso Bellacosa. "Thymine DNA Glycosylase (TDG) as a Novel Potential Target for Melanoma Therapy." Doctoral thesis, Università di Siena, 2018. http://hdl.handle.net/11365/1049338.
Full textAbstract:
Starting from the experimental observations of Prof. Bellacosa, Prof. Giordano and Prof. Larue research groups, in the following study we have tried to elucidate the relationship between TDG (Thymine-DNA Glycosylase) and melanoma disease. Originally, we detected variable endogenous levels of TDG protein within the human melanoma cell lines banked in our labs and a correlation between TDG and tumorigenicity was tentatively established, since cell lines with low to undetectable levels of TDG are known to be tumorigenic in xenotransplant experiments. Moreover, TDG knock-out mouse embryos showed a dramatic phenotype that affects neural crest cells -that are precursors of melanocytes- (see Supplementary Material) therefore, according to those scientific evidences above mentioned, we initially hypothesized and eventually demonstrated, that modulation of TDG levels may significantly affect the biology of melanoma.
Melanoma is an aggressive neoplasm with increasing incidence that is classified by the National Cancer Institute (NCI) as a recalcitrant cancer, i.e., a cancer with poor prognosis, lacking progress in diagnosis and treatment. In addition to conventional therapy, melanoma treatment is currently based on targeting the BRAF/MEK/ERK signaling pathway and immune checkpoints. As drug resistance remains a major obstacle to treatment success, advanced therapeutic approaches based on novel targets are still urgently needed. We reasoned that the base excision repair enzyme TDG could be such a target for its dual role in safeguarding the genome and the epigenome, by performing the last of the multiple steps in DNA demethylation. Here, we show that TDG knockdown in melanoma cell lines causes cell cycle arrest, senescence and death by mitotic alterations, and impairs xenograft tumor formation.
Importantly, untransformed melanocytes are not affected by TDG knockdown, and adult mice with conditional knockout of Tdg are viable. Candidate TDG inhibitors, identified through a high-throughput fluorescence-based screen, reduced viability and clonogenic capacity of melanoma cell lines and increased cellular levels of 5-carboxylcytosine, the last intermediate in DNA demethylation, indicating successful on-target activity. These findings suggest that TDG may provide critical functions specific to cancer cells that make it a highly suitable anti-melanoma drug target. By potentially disrupting both DNA repair and the epigenetic state, targeting TDG may therefore represent a completely new approach to melanoma therapy.
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Malindi, Zaria. "Photoimmunotheranostic targeting of CSPG4-positive melanoma cells using SNAP-tag technology." Master's thesis, Faculty of Health Sciences, 2018. http://hdl.handle.net/11427/31064.
Full textAbstract:
Melanoma is one of the most aggressive and inherently resistant cancers and the most dangerous skin cancer. While it accounts for fewer than 5% of skin cancer cases, 80% of skin cancer related deaths are attributed to melanoma. While resection remains the gold standard for melanoma treatment, surgery is only effective in providing local control of the disease if the cancer is detected in the early stages. Once melanoma enters the later stages, and particularly in the metastatic phase, recurrence is probable, and no adequate treatment exists. Previous work in this group has shown that photodynamic therapy (PDT) presents an opportunity to induce cell death in melanoma cells through the production of ROS and singlet oxygen at doses high enough to overwhelm the resistance mechanisms of the cancer. In this study, we investigated the use of recombinant SNAP-tag-based antibody fusion proteins as a means of delivering phototoxic molecules directly to cancer cells expressing the CSPG4 and PD-L1 cell surface receptors. SNAP-tag is an engineered version of the human DNA repair enzyme O6-alkylguanine-DNA alkyltransferase. It reacts autocatalytically and in a strictly 1:1 coupling chemistry with substrates that have been modified with benzylguanine (BG). Through genetic fusion of this self-labelling protein with a tumour targeting antibody, we developed a recombinant immunoconjugate able to carry BG-modified photosensitizers to selectively target and eliminate malignant melanoma cells. Conjugation of the SNAP-tag fusion protein with the fluorescent dye Alex Fluor 488 showed that anti-CSPG4-SNAP binds specifically to melanoma cells expressing the CSPG4 surface antigen. Binding was tested across a range of cell lines presenting melanoma in its radial and vertical growth phases, in the metastatic growth phase, in its chemoresistant form, and in both its pigmented and unpigmented forms. This binding data thus confirms CSPG4 as a suitable targeted for this treatment strategy. Conjugation of the fusion protein with the BGmodified photosensitizer IRDye 700DX (IR700) has produced no phototoxicity as of yet. In light of the convincing binding analysis, it is concluded that inefficient solubilization of the lyophilized product resulted in inadequate conjugation of BG-IR700 with SNAP-tag. Nonetheless, steps have been planned to resolve the problem in future ongoing work on this project, and we remain confident in the applicability of this technology. The results for the PD-L1 fusion protein were inconclusive. In summary, SNAP-tag technology offers a simple and efficient method for immunofluorescent detection of cancerous cells. These fusions proteins are versatile as they 1) can contain any antibody targeting a tumour-associated or tumour-specific antigen of choice and 2) can be endowed with a wide variety of substrates, as long as the latter contains the BG moiety.
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Veronez, Luciana Chain. "Atividade da fosfoetanolamina sintética em melanoma murino experimental." Universidade de São Paulo, 2012. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17147/tde-15122012-123717/.
Full textAbstract:
O desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas ao melanoma é de particular importância devido à sua baixa resposta aos tratamentos tradicionais. No presente trabalho, utilizamos modelo de melanoma murino experimental para estudarmos os efeitos da fosfoetanolamina (PEA) sintética sobre o desenvolvimento deste tumor. Nossos resultados demonstram que o fosfomonoéster apresentou efeito inibidor da proliferação de células da linhagem B16F10 in vitro, induzindo apoptose após estimulação por 24 a 72h. In vivo, o tratamento (via oral) de animais portadores de melanoma com diferentes doses de PEA (10, 20 e 40mg/Kg), durante 10 ou 20 dias consecutivos, resultou em volumes tumorais pelo menos 70% menores que o de animais controle e diferenças macroscópicas consideráveis. PEA induziu, de maneira dose-dependente, aumento da apoptose e diminuição da proliferação de células tumorais. O tratamento resultou em alterações hematológicas como aumento do número de plaquetas, eritrócitos e leucócitos. Dentre os leucócitos, observou-se uma maior proporção de linfócitos e monócitos após 10 e 20 dias de tratamento, respectivamente. Em adição, PEA induziu uma maior produção da citocina pró-inflamatória IL-6 e das citocinas anti-inflamatórias IL-10 e TGF- e menores níveis da citocina pró-inflamatória IFN-. Os níveis de IL-1, IL-12p70 e IL-17 não foram alterados com o tratamento. Nossos resultados demonstram um papel inibidor da PEA sobre a progressão do melanoma, contribuindo para um melhor entendimento de sua atividade anti-tumoral.The low responsiveness of melanoma to traditional treatments together with its increasing incidence makes the development of new therapeutic strategies against this type of cancer extremely important. In this study, we used a murine melanoma model to evaluate the effects of synthetic phosphoethanolamine (PEA) on the development of this tumor. In vitro, PEA had an inhibitory effect on the proliferation of B16F10 cells, inducing apoptosis after 24 to 72h stimulation. In vivo, oral treatment of melanoma-bearing animals with different doses of PEA (10, 20 e 40mg/Kg) during 10 or 20 consecutive days resulted in reduced tumor volumes (at least 70% compared to the control) and in expressive macroscopic differences. PEA also induced a dose-dependent increase of apoptosis and decrease in tumor cell proliferation. The treatment also resulted in hematological changes, such as increased numbers of platelets, erythrocytes and leukocytes. Among leukocytes, we observed a higher proportion of lymphocytes and monocytes after 10 and 20 days of treatment, respectively. In addition, PEA induced higher levels of the pro-inflammatory cytokine IL-6 and of the anti-inflammatory cytokines IL-10 and TGF-, and it also induced a lower production of the pro-inflammatory cytokine IFN-. No differences were observed in the levels of IL-1, TNF-, IL-12p70 and IL-17 upon treatment. Our results demonstrate an inhibitory role of PEA in the development of melanoma, contributing to a better understanding of its antitumoral activity.
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Junior, Nelson Marcos Ferrari. ""Estudo epidemiológico descritivo dos doentes de melanoma cutâneo acompanhados na Unidade de Melanoma da Santa Casa de São Paulo"." Universidade de São Paulo, 2006. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/5/5133/tde-17102006-153219/.
Full textAbstract:
INTRODUÇÃO: O melanoma cutâneo constitui cerca de 3% de todos os tumores da pele. Atinge indivíduos jovens com média de idade de aparecimento entre 50 e 58 anos. Em torno de 20% dos doentes apresentarão doença avançada e morrerão antes de completar cinco anos de sobrevida. CASUÍSTICA E MÉTODOS: Neste estudo retrospectivo de 364 casos acompanhados de maio de 1993 a janeiro de 2006 descreveram-se as variáveis: sexo, idade, cor, localização da lesão primária, tipo de crescimento, espessura de Breslow, nível de Clark, presença de ulceração, estadiamento e suas correlações. RESULTADOS: Predominou o sexo feminino (58,8%) resultando em uma proporção de 1,4 mulheres para cada homem. A média das idades dos pacientes foi de 58,9 anos e a mediana de 61,0 anos. Pacientes não-brancos constituíram 13,7% da amostra. Para homens e mulheres o melanoma cutâneo localizou-se, predominantemente no tronco (24,3-38,0%) e pés (21,4-23,9%). O melanoma acrolentiginoso representou 22,3% de toda amostra. Os padrões melanoma expansivo superficial e melanoma nodular (p < 0,001) e lesões no tronco (52,8%) predominaram nos indivíduos brancos. O melanoma acrolentiginoso (64%) e a localização nos pés (68,2%)prevaleceram nos pacientes não-brancos. Observou-se minoria de casos com lesão primária in situ (14,6%- EC 0) e alto percentual de melanoma cutâneo espesso (39,7% > 4,0 mm). Presença de ulceração foi observada em 13,4% para tumores finos (= 1,0 mm). Homens apresentaram lesões mais espessas (p = 0,011) e ulceradas (p < 0,001) em relação às mulheres, assim como idosos em relação à não idosos (p = 0,021 para a espessura e p = 0,015 para ulceração). A sobrevida média para os pacientes com doença localizada foi de 97,8 meses e a taxa de sobrevida específica para melanoma cutâneo foi de 85,1% em três anos. CONCLUSÕES: Esta amostra constituiu-se de pacientes com tumores espessos e ulcerados denotando diagnóstico tardio do melanoma cutâneo e pior prognóstico. Caracterizou-se por apresentar predomínio de mulheres, de pacientes não-brancos, de lesões nas extremidades e de melanoma acrolentiginoso.INTRODUCTION: Cutaneous melanoma represents around 3% of all skin tumors. Affecting young patients, with mean age between 50 and 58 years old. About 20% of the patients will have advanced disease and will die before five years of survival. CASUISTIC AND METHODS: In this retrospective study of 364 cases recorded from May 1993 to January 2006 at the Melanoma Unit of Santa Casa de São Paulo the following variables were described: sex, age, skin color, tumor site, growth pattern, tumor thickness, Clark level, ulceration, staging and their correlations. RESULTS: Female (58,8%) prevailed resulting in 1,4 women for each man. The mean age of the patients was 58,9 years old and the median, 61,0 years old. Non-white patients were 13,7% of the sample. The anatomic site of cutaneous melanoma on men and women prevailed at trunk (24,3 38,0%) and feet (21,4 23,9%). Acral entiginous melanoma represented 22,3% of the cohort. Superficial expansive melanoma and nodular melanoma patterns (p<0,001) and trunk lesions (52,8%) predominated on white patients. Acral lentiginous melanoma (64%) and feet anatomic site 68,2%) prevailed on non-white patients. In situ primary lesions were observed in few cases (14,6% - EC 0) and there was high percentage of thick cutaneous melanoma (39,7% > 4,0 mm). In thin tumors (=1,0 mm) were found 13,4% of ulceration. Thickener (p = 0,011) and ulcerated lesions (p < 0,001) were found more in male and in elderly patients (p = 0,021 for thickeness and p = 0,015 for ulceration). The mean survival of patients with local disease was 97,8 months and the three-year survival rate for cutaneous melanoma was 85,1%. CONCLUSIONS: The cohort consisted mostly of thick and ulcerated tumors, which meant late diagnosis and bad prognosis. Also distinguished by considerable prevalence of female, non-white patients, limb lesions and acral lentiginous melanoma.
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Perlmann, Eduardo. "Estudo morfológico das neoplasias melanocíticas uveais em cães." Universidade de São Paulo, 2010. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/10/10137/tde-27012012-101434/.
Full textAbstract:
Os tumores de origem melanocítica representam as mais frequentes neoplasias intra-oculares diagnosticadas nos cães. O presente trabalho teve por objetivo realizar estudo retrospectivo das neoplasias melanocíticas da úvea do cão analisando suas características morfológicas e epidemiológicas. Foi estudado um total de 29 casos; destas, 51,7 % foram diagnosticadas como melanocitoma, enquanto que 48,3 % como melanoma. As raças mais acometidas foram SRD (sem raça definida), Cocker Spaniel Inglês e Labrador Retriver, porém não houve predominância racial significativa. A faixa etária foi de 6 a 15 anos, com média de 10,3 anos. Os tumores acometeram igualmente machos e fêmeas. A úvea anterior foi a localização mais comum, representando 96,5 % de todos os tumores, enquanto a úvea posterior representou 3,5 %, sendo o último, um melanoma. Em 5 casos, o tumor ocupava todo espaço intra-ocular, sendo todos melanomas. Os melanocitomas apresentaram predominância de células grandes, redondas ou poliédricas, densamente pigmentadas e núcleo pequeno. Os melanomas apresentaram 2 padrões celulares distintos. Dos 14 melanomas, 8 (57,2 %) eram compostos por células epitelióides, 2 (14,3 %) por células fusiformes, e 4 (28,5%) apresentaram padrão misto. Em 7 melanomas observou-se áreas de melanocitoma, sugerindo transformação maligna.Melanocytic tumors are the most common intraocular neoplasia in dogs. The aim of the present work was to perform a retrospective study of the canine uveal melanocytic neoplasias analyzing the morphologic and epidemiologic features. It was 29 cases in total; 51,7 % was diagnosed as melanocitoma, while 48,3 % was diagnosed as melanoma. The most common breed was mixed breed dogs, English Cocker Spaniel and Labrador, but there was no significant racial predominance. The age range was 6 to 15 years old, with mean of 10,3 years old. The tumors affected equally males and females. The anterior uvea was the most common site, representing 95,5 % of all tumors and the posterior uvea represented 3,5 %, the latter, was a melanoma. In five cases (17,2%), the tumor occupied the entire intraocular space, all of them melanomas. The melanocitomas presented predominance of round or poliedric, plump cells, densely pigmented with small nucleus. The melanomas presented two distinct patterns. Of the 14 melanomas, eight (57,2 %) was composed of epithelioid cells, two (14,3 %) of spindle cells, and four (28,5 %) presented mixed pattern. There were 7 melanomas that presented melanocitoma areas, suggesting malignant transformation.
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Perlmann, Eduardo. "Estudo imunoistoquímico das neoplasias melanocíticas uvais em cães." Universidade de São Paulo, 2015. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/10/10137/tde-03092015-173006/.
Full textAbstract:
Os melanomas possuem diferentes comportamentos entre as espécies, sendo de grande importância a caracterização do mecanismo molecular que influencia tal diversidade comportamental. Objetivou-se neste estudo avaliar as características moleculares das neoplasias melanocíticas uveais em cães, a fim de compreender as diferenças entre o melanoma uveal humano e o canino. Foram utilizados 64 olhos de 64 cães com diagnóstico de neoplasia intraocular primária de origem melanocítica. Com base nos critérios histopatológicos estabelecidos foram diagnosticados 37 melanocitomas e 27 melanomas. Não houve predominância sexual e cães sem raça definida, Labrador Retriever e Cocker Spaniel Inglês foram os mais acometidos. Foram analisadas características morfológicas, taxa de mitose, grau de pigmentação, presença de extensão extraocular, localização, infiltrado inflamatório, loop vascular e necrose. Foi realizada análise imunoistoquímica avaliando os marcadores Melan-A, HMB-45, Ki-67 e COX-2. O Melan-A mostrou ser mais sensível, sendo expresso em 53,1% dos casos, enquanto o HMB-45 foi positivo em apenas 31,2% dos casos. O Melan-A e o HMB-45 foram menos frequentes nos melanocitomas comparado com os melanomas. Em 23 casos, nenhum dos dois marcadores reagiu. Os resultados do marcador de proliferação Ki-67 revelaram maior positividade entre os melanomas, com média do índice Ki-67 de 37,8%, enquanto a média dos melanocitomas foi de 15%. Não houve diferença estatística da marcação do Ki-67 com os tipos celulares dentre os melanomas. A COX-2 reagiu positivamente na maioria dos casos e não foi observada diferença estatística entre melanocitomas e melanomas. Dentre os melanomas não houve diferença estatística entre os tipos celulares para a marcação da COX-2. Os achados aqui discutidos revelam interessantes diferenças e similaridades entre as neoplasias melanocíticas uveais no homem e no cãoMelanomas have different behavior between species and is of great importance to characterize the molecular mechanism influencing this behavioral diversity. The objective of this study was to evaluate the molecular characteristics of uveal melanocytic neoplasias in dogs, in order to understand the differences between uveal melanoma in humans and dogs. Sixty-four eyes of 64 dogs diagnosed with primary intraocular neoplasia of melanocytic origin were studied. Based on the established histopathological criteria 37 melanocytomas and 27 melanomas were diagnosed. There was no sexual predominance and mixed breed dogs, Labrador Retriever and English Cocker Spaniel were the most affected. Morphological features, mitotic rate, degree of pigmentation, presence of extraocular extension, location, inflammatory infiltrate, vascular loop and necrosis were analyzed. Immunohistochemical analysis was performed to evaluate markers such as Melan-A, HMB-45, Ki-67 and COX-2. The Melan-A was more sensitive and expressed in 53.1% of cases, while the HMB-45 was positive in only 31.2%. The Melan-A, and HMB-45 were less frequent in melanocytomas compared to melanomas. In 23 cases, neither markers reacted. The results of the Ki-67 showed higher positivity among melanomas, mean Ki-67 index of 37.8%, while melanocytomas showed mean of 15%. There was no statistical difference in the Ki-67 labeling among melanoma's cell types. COX-2 reacted positively in most cases and found no statistically significant difference between melanocytomas and melanomas. Among the melanomas, there was no statistical difference between the cell types for COX-2. The findings discussed here reveal interesting differences and similarities between the uveal melanocytic neoplasms in humans and dogs
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Clara, Renan Orsati. "Metabolismo de triptofano em melanomas: o que dizem as células do microambiente?" Universidade de São Paulo, 2015. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/9/9136/tde-29042015-101458/.
Full textAbstract:
O melanoma é composto por células malignas e também por um estroma de sustentação que inclui fibroblastos, células imunológicas, endoteliais, matriz extracelular, dentre outros fatores. Assim, os tumores não são entidades independentes, eles interagem ativamente com o microambiente adjacente de forma bidirecional através de sinais moleculares que modulam o fenótipo maligno. Um dos sinais bioquímicos para desenvolvimento desse fenótipo se dá pelo catabolismo de Trp pela via das quinureninas, que gera compostos com diversas atividades biológicas, que no tumor estão envolvidas com tolerância e imunoescape e, logo, com prognóstico ruim para os pacientes. Até o presente momento apenas o consumo de Trp e a formação de um único metabólito, a quinurenina (KYN), tem sido associada a malignidade dos melanomas. A fim de ampliar e elucidar os mecanismos bioquímicos do metabolismo desse aminoácido em melanomas, estudamos mais de quinze compostos de todas as rotas catabólicas de Trp em células da pele, células imunológicas, linhagens tumorais e amostras clínicas de melanoma. De forma inédita pudemos observar que as células da pele tem maior habilidade de sintetizar KYN quando comparadas às linhagens tumorais, demonstrando que o catabolismo de Trp peritumoral pode ser responsável pelos fenômenos de imunotolerância e escape. Além disso, o metabolismo de Trp pode estar envolvido nos mecanismos de homeostasia da pele, já que especificamente essas células produzem compostos com atividade biológica nesse órgão. As células imunológicas possuem um perfil metabólico completamente diferente umas das outras: monócitos, macrófagos e dendríticas possuem maior ativação da via KYN enquanto linfócitos e neutrófilos possuem maior indução da rota que gera serotonina e melatonina. Mesmo nos diferentes fenótipos de macrófagos, M1 e M2a, foram observadas marcações especificas de metabolismo, que podem estar relacionadas às atividades anti- ou pró-tumoral dessas células no microambiente. Em amostras clínicas, apesar da principal diferença entre nevos e melanomas ser a concentração de KYN, diversas outras alterações no metabolismo de tiptofano foram observadas, o que mostra a complexa magnitude deste metabolismo na fisiopatologia da peleMelanoma is composed of malignant cells and also by a stromal support that includes fibroblasts, immune cells, endothelial cells, extracellular matrix, among other factors. Thus, tumors are not separate entities; they actively interact with the surrounding microenvironment bi-directionally through molecular signals that modulate the malignant phenotype. One of biochemical signals for the development of this phenotype occurs by Trp catabolism through kynurenine pathway, that generates compounds with diverse biological activities, which in tumors are involved with tolerance and imunoescape and therefore with poor prognosis for patients. To date only the consumption of Trp and formation of a single metabolite, kynurenine (KYN), has been associated with malignant melanomas. In order to enlarge and clarify the biochemical mechanisms of this amino acid metabolism in melanomas, we have studied more than fifteen compounds of all catabolic routes of Trp in skin cells, immune cells, tumor cell lines and clinical samples of melanoma. In an unique way we could observe that the skin cells has superior ability to synthesize KYN when compared to tumor cell lines, demonstrating that the peritumoral catabolism of Trp may be responsible for the phenomena of immune tolerance and escape. Furthermore, the Trp metabolism may be involved in skin homeostasis mechanisms, since these cells produce specific compounds with biological activity in this organ. The immune cells have a completely different metabolic profile among them: monocytes, macrophages and dendritic cells have greater KYN pathway activation, and lymphocytes and neutrophils possess greater induction of the route that generates serotonin and melatonin. Even in different macrophages phenotypes, M1 and M2a, we observed specific metabolic marks, which may be related to the anti- or pro-tumoral activity of these cells in the tumor microenvironment. In clinical samples, although the main difference between nevi and melanomas is the concentration of KYN, a range of other changes in Trp metabolism were observed, which shows the complex magnitude of this metabolism in the skin pathophysiology
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Civita, Marina. "Avaliação da cimetidina como tratamento de melanomas em equinos tordilhos." Universidade de São Paulo, 2017. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/10/10136/tde-01122017-161847/.
Full textAbstract:
Os objetivos deste trabalho foram os de avaliar a eficácia da cimetidina como única forma de tratamento para reduzir o tamanho de melanomas localizados em região ventral de cauda e períneo em equinos tordilhos, determinar a eficácia da droga no controle do aparecimento de novas formações nas mesmas regiões e avaliar a duração do tratamento com cimetidina após a sua suspensão com relação à manutenção da redução de tamanho e do aparecimento de novas formações. Para o desenvolvimento do trabalho foram utilizados 32 equinos tordilhos, sem restrições de raça ou sexo, com idade entre sete e 30 anos, com melanomas em região de cauda e períneo de até 5,0 cm de diâmetro e sem histórico anterior de tratamento com cimetidina ou procedimento cirúrgico para esta finalidade. Os animais foram divididos em dois grupos: 21 animais no grupo tratamento que receberam 18 mg/kg de cimetidina por via oral, BID durante noventa dias e 11 animais no grupo controle, que não receberam nenhuma medicação ou placebo. Os equinos foram avaliados quinzenalmente durante o período de tratamento e monitorados mensalmente durante 150 dias após o término da administração da droga. A cimetidina, na dose de 18 mg/kg VO BID, apresenta ação sobre os melanomas em equinos tordilhos, mas sua ação mostrou-se bastante variável e individual, além de não apresentar efetividade na manutenção da redução do volume após o término do tratamento.The purpose of this study was to evaluate the efficacy of cimetidine as treatment for melanoma present in the perineal area and ventral tail of Grey horses. Reduction in tumor volume and the capability of the drug to control the appearance of new nodules were evaluated. Thirty two grey horses with ages ranging between sete and 30 years and no predilection of breed or gender were used in this study. All the animals selected had no attempted treatment prior to this study. The animals were divided in two groups: the treatment group, consisting of 21 horses and the control group consisting of 11 animals. Cimetidine was administered at a dosage of 18 mg/kg orally twice a day for a total of ninety days. During the lenght of treatment, the group was evaluated every two weeks, and all the animals were monitored once a month for another 150 days after the end of therapy. The efficacy of the treatment with cimetidine was observed in 11 animals of the treatment group which showed size reduction of the masses during the drug administration period followed by a slight increase and stabilization at lower volumes than the initial measures. In addition, the animals that responded to the treatment presented a very variable and individual response.
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Pires, Layla. "Optical strategies for diagnosis and treatment of melanoma." Universidade de São Paulo, 2017. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/76/76132/tde-01122017-154608/.
Full textAbstract:
Melanoma is a pigmented tumor that originates from the melanocytes; pigmented cells present throughout the body, including skin and iris. The cutaneous form is the most common type, and it represents about 5% of the skin tumors diagnosed in Brazil. Although it does not have a high incidence, it represents about 80% to 85% of all skin tumor deaths. The second most frequent type of melanoma is ocular. It represents 5% of all melanoma cases and is a potentially lethal disease, especially when it causes metastasis. The main therapeutic approach for melanomas, in general, is surgery, with resection of the cutaneous lesion or enucleation in the case of ocular melanoma. Other techniques such as adjuvant immunotherapy, palliative chemotherapy, and radiotherapy are also used. However, they have low efficacy and several side effects. Photodynamic therapy is a therapeutic modality based on the interaction of light at specific wavelength and photosensitizer, in the presence of molecular oxygen, leading the cell to death. As melanoma is a pigmented cancer, it usually does not respond well to photodynamic therapy due to the high absorption of light on the surface of the tumor, making volumetric eradication impossible. This project investigated optical strategies for the diagnosis and treatment of melanoma. For the diagnosis, it was evaluated the fluorescence lifetime technique to differentiate melanoma and normal skin. A sensitivity of 99.4%, specificity of 97.4% and accuracy of 98.4% were achieved using linear discrimination analysis. For the cutaneous melanoma treatment, PDT combined to optical clearing agents (OCAs) was investigated. Vascular and cell-target photosensitizers were evaluated combined or not to OCAs. OCA improved PDT response in all pigmented tumors treated, but the best results were achieved when a dual-photosensitizer treatment combined to OCA was performed. The treatment of conjunctival melanoma was conducted using 2-photon excitation photodynamic therapy. The advantage of this technique is the use of infrared light, in a wavelength that melanin has a low absorption, improving the light penetration into the tumor. The tumor histology shows that apoptosis was induced only at the treatment site, with no damage to the surrounding tissue. Additionally, a single TPE-PDT session could treat the entire tumor.O melanoma é um tumor pigmentado que surge dos melanócitos, células pigmentadas presentes em todo o corpo, incluindo a pele e a íris. A forma cutânea é a mais comum e representa cerca de 5% dos tumores cutâneos diagnosticados no Brasil. Embora não tenha uma alta incidência, representa cerca de 80% a 85% de todas as mortes por tumor de pele. O segundo tipo de melanoma mais frequente é o ocular. Representa 5% de todos os casos de melanoma e é uma doença potencialmente letal, especialmente em casos de metástase. A principal abordagem terapêutica para melanomas, em geral, é a cirurgia, com ressecção da lesão cutânea ou enucleação no caso do melanoma ocular. Outras técnicas, como imunoterapia adjuvante, quimioterapia paliativa e radioterapia também são usadas, porém, apresentam baixa eficiência e muitos efeitos colaterais. A terapia fotodinâmica é uma modalidade terapêutica baseada na interação da luz em um comprimento de onda específico e um fotossensibilizador, na presença de oxigênio molecular, levando a célula à morte. Como o melanoma é um câncer pigmentado, geralmente não responde bem à terapia fotodinâmica devido à alta absorção de luz na superfície do tumor, impossibilitando a erradicação volumétrica. Este projeto investigou estratégias ópticas para o diagnóstico e tratamento do melanoma. Para o diagnóstico, foi avaliada a técnica de tempo de vida de fluorescência para distinguir melanoma de pele normal. Utilizando análise de discriminação linear, obteve-se uma sensibilidade de 99,4%, especificidade de 97,4% e precisão de 98,4%. Para o tratamento de melanoma cutâneo, a PDT combinada com clareadores ópticos (OCAs) foi investigada. Um fotossensibilizador que tem como alvo vaso sanguíneo e um fotossensibilizador de alvo celular foram avaliados combinados ou não com OCAs. OCAs são soluções hiperosmóticas que desidratam o tecido, diminuindo o espalhamento da luz e melhorando a penetração de luz em profundidade. OCA melhorou a resposta de PDT em todos os tumores melanóticos tratados, mas os melhores resultados foram obtidos quando a PDT foi realizada com a combinação dos fotossensibilizadores e clareador óptico em uma única sessão. O tratamento do melanoma conjuntival foi realizado utilizando a terapia fotodinâmica por excitação de 2 fótons (TPE-PDT). A vantagem desta técnica é o uso de luz na região do infravermelho, em um comprimento de onda que melanina tem baixa absorção, melhorando a penetração de luz no tumor. A histologia do tumor mostrou que a apoptose foi induzida apenas no local do tratamento, sem danos no tecido adjacente. Além disso, uma única sessão de TPE-PDT foi capaz de tratar todo o tumor.
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Biondi, Luiz Roberto. "Influência do hipotireoidismo na progressão do melanoma experimental." Universidade de São Paulo, 2006. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/10/10133/tde-05012007-103648/.
Full textAbstract:
Este trabalho teve por objetivo avaliar os efeitos do hipotireoidismo experimental induzido mediante utilização da droga propiltiouracil ou por tireoidectomia actínica, utilizando-se Iodo131, sobre o crescimento tumoral local e potencial metastático do melanoma murino, cepa B16F10 em camundongos C57BL6. O trabalho constituiu-se de dois experimentos distintos: 1. Influência do hipotireoidismo sobre o crescimento local e sobrevida, mediante indução do hipotireoidismo com propiltiouracil (PTU) a 0,05% na água de bebida e inoculação de células B16F10 por via subcutânea. 2. Influência do hipotireoidismo sobre o potencial metastático, onde os animais foram submetidos aos seguintes tratamentos: água (CTRL_M); indução do hipotireoidismo com propiltiouracil a 0,05% na água de bebida (PTU_M); indução do hipotireoidismo com iodo131 (I131_M) e do hipertireoidismo com L-tiroxina a 0,00005% na água de bebida (T4_M) e posterior inoculação de células B16F10, por via intravenosa. No experimento 1, os parâmetros avaliados consistiram na medida do volume tumoral e taxa de sobrevida. Os volumes tumorais variaram de 1,8 mm³ a 10.673,1 mm³. Na média diária dos volumes tumorais, o menor valor foi de 1,6 mm³ enquanto o maior volume obtido foi de 8140,9 mm³. A análise estatística das médias dos volumes, mediante teste de T não pareado, não indicou diferença significativa entre os grupos CTRL_L (controle) e PTU_L (tratado), com p = 0,795 para o teste de T e p = 0,5759 para o teste de F, para um intervalo de confiança de 95%. A média da sobrevida foi de 22 dias para o grupo CTRL_L e 21 dias para o grupo PTU_L. A analise estatística dos dados de sobrevida seguiu o Teste de Mantel-Haensze, não havendo diferença significativa na evolução da sobrevida entre os grupos, com p = 0,752 para um intervalo de confiança de 95%. No experimento 2, o parâmetro avaliado consistiu no número de nódulos metastáticos mediante contagem dos nódulos na superfície dos pulmões dos animais, após eutanásia. A distribuição de nódulos tumorais pulmonares apresentou média de 32 nódulos para o grupo CTRL_M; 91 nódulos para o grupo PTU_M; 23 nódulos para o grupo T4_M e 77 nódulos para o grupo I131_M. Houve diferença estatisticamente significativa (p < 0,01) entre os grupos CTRL_M versus PTU_M e I131_M e entre os grupos T4_M versus PTU_M e I131_M. Não houve diferença significativa (p > 0,05) entre os grupos CTRL_M versus T4_M e entre os grupos PTU_M versus I131_M. Os estudos estatísticos foram realizados mediante Teste de Analise de Variância simples (ANOVA) e aplicação de pós-teste de Dunnett, de múltipla comparação. Concluiu-se que o hipotireoidismo não interferiu no crescimento local da cepa B16F10 do melanoma murino em camundongos C57BL6 e significativamente alterou o comportamento metastático da referida cepa nesta linhagem isogênica, favorecendo a formação de nódulos metastáticos nos animais em que este estado patológico foi induzido, quer pela utilização de droga antitireoidiana PTU, quer pela tireoidectomia actínica com I131, no entanto, a administração de L-tiroxina não acarretou o efeito contrárioThe aim of this study was to evaluate the effects of hypothyroidism induced by propylthiouracil or by actinic thyroidectomy, using I131, on focal and methastatic tumor growth of murine melanoma, B16F10, in mice C57BL6. The study was consisted of two different assays: 1. the influence of hypothyroidism on the focal growth and survival rate, by hypothyroidism induction with propylthiouracil (PTU) 0.05% in drinking water and subcutaneous inoculation of B16F10 and 2. the influence of hypothyroidism on the methastatic potential, were the animals underwent the followed treatments: drinking water (CTRL_L), hypothyroidism induction by propylthiouracil on 0.05% in drinking water (PTU_M group), hypothyroidism induction by I131 (I131_M group) and hypothyroidism induction by L-tiroxine on 0.00005% in drinking water (T4_M group). B16F10 cells were intravenously inoculated in all groups. On the first assay, the tumor volume was measured and the survival rate was evaluated. The tumor volumes ranged from 1.8 mm³ to 10673.1 mm³. Regarding the daily mean of tumor volumes, the lowest volume was 1.6 mm³ while the highest one was 8140.9 mm³. A statistical analysis of the tumor volumes was performed using unpaired T test and it showed no significant difference between group CTRL_L (control) and group PTU_L (treated one) (with p=0.795 on T test and p= 0.5759 on F test, using a confidence interval of 95%). The survival rate mean was 22 days on group CTRL_L and 21 days on group PTU_L. The Mantel-Haenszel (logrank) test was used for statistical analysis of these data, and there was no significant difference on the survival rate between groups CTRL_L and PTU_L (with p=0.752 and confidence interval of 95%). On the second assay, the number of methastatic nodules on the lung surface after euthanasia was evaluated. Regarding the lung nodules distribution, 32 nodules were found on group CTRL_M, 91 nodules were found on group CTRL_M, 23 on group T4_M and 77 on group I131_M. There was a statistically significant difference (p<0.01) between groups CTRL_M and PTU_M / I131_M and between groups T4_M and PTU_M / I131_M. No significant difference was observed (p>0.05) between groups CTRL_M and T4_M and between groups PTU_M and I131_M. ANOVA test was used for statistical analysis, followed by multiple comparison Dunnett?s post test. It was concluded that hypothyroidism did not have any influence on the focal growth of the murine melanoma B16F10 in mice C57BL6 and significantly did alter the methastatic behavior of that clone in this isogenic lineage, enhancing the methastatic nodules formation in the animals who were induced to this pathological condition, either by PTU or by actinic thyroidectomy, using I131; however, the administration of L-tiroxine did not show the opposite effect
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Souza, Fernanda França de. "Efeito anti-proliferativo de curcumina associada á nanopartículas magnéticas funcionalizadas com bicamada de ácido láurico sobre células de melanoma humano skmel 37." Universidade Federal de Goiás, 2011. http://repositorio.bc.ufg.br/tede/handle/tde/2894.
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Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES
Fundação de Apoio à Pesquisa - FUNAPE
Curcumin has emerged as a great promise for cancer treatment and chemoprophylaxis with curcumin, but its low solubility in water is minimal systemic bioavailability. Attempts were made to improve its solubility in aqueous solutions by incorporating curcumin in liposomes or micelles, but these systems have low stability. In addition, magnetic nanoparticles have been used as promising drug delivery systems because they can be functionalized to become water soluble and biocompatible. Studies with curcumin incorporated into the magnetic nanoparticles are still scarce. This study aims to evaluate the antiproliferative effect of curcumin combined with magnetic nanoparticles functionalized bilayer of lauric acid in human melanoma cell line SKMEL 37. Human melanoma cells were treated at different concentrations and cytotoxicity was evaluated by MTT assay. The cell morphology was evaluated by light microscopy and fluorescence. Our studies have shown that curcumin has incorporated into nanoparticles cytotoxic effect at concentrations above 40,8 μg/ml or 111 μM. Since free curcumin caused significant death at concentrations above 11.5 μM. We also observed morphological changes typical of apoptosis such as chromatin condensation, nuclear fragmentation and bleb formation. These findings show us that both their cytotoxic activity, as both the magnetic properties and its solubility in water make this new formulation with a curcumin compound interest for therapeutic use.
A curcumina surgiu como uma grande promessa para tratamento do câncer e de quimioprofilaxia com a curcumina, porém sua baixa solubilidade em água e sua biodisponibilidade sistêmica é mínima. Tentativas foram feitas para melhorar a sua solubilidade em soluções aquosas através da incorporação de curcumina em lipossomas ou micelas, mas esses sistemas têm estabilidade baixa. Além disso, as nanopartículas magnéticas têm sido usados como promissores sistemas de entrega de drogas, pois podem ser funcionalizadas para se tornarem solúveis em água e biocompatíveis. Estudos com curcumina incorporada á nanopartículas magnéticas ainda são escassos. Esse estudo tem por objetivo avaliar o efeito anti-proliferativo de curcumina associada a nanopartículas magnéticas funcionalizadas com bicamada de ácido láurico em células de melanoma humano da linhagem SKMEL 37. Células de melanoma humano foram tratadas em diferentes concentrações e a citotoxicidade foi avaliada por ensaio de MTT. A morfologia das células foi avaliada através de microscopia óptica e de fluorescência. Nossos estudos mostraram que a curcumina incorporada em nanopartículas possui efeito citotóxico em concentrações acima de 40,8 μg/ml ou 111 μM. Já a curcumina livre provocou morte significativa em concentrações acima de 11,5 μM. Observamos também alterações morfológicas típicas do processo de apoptose, como condensação de cromatina, fragmentação nuclear e formação de Blebs. Estes achados nos mostram que, tanto sua atividade citotóxica, como ambas as propriedades magnéticas e sua solubilidade em água fazem desta nova formulação com curcumina um composto interessante para uso terapêutico.
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Siena, Ádamo Davi Diógenes. "Análise da expressão de RNAs longos não-codificadores em linhagens celulares de melanoma em diferentes estágios de progressão tumoral." Universidade de São Paulo, 2016. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17135/tde-04012017-084739/.
Full textAbstract:
Evidências sugerem que somente cerca de 2% do genoma codifica proteínas, mas que a maior parte dos 80% restante possui atividade transcricional. Por não ser codificadora de proteínas, essa fração do genoma foi considerada como \'DNA lixo\'. Entretanto, estudos mais recentes e análises pós-ENCODE vem demonstrando que parte significativa destes RNAs não-codificantes desempenham papéis importantes em processos biológicos essenciais e também em doenças. Os RNAs longos não codificadores (lncRNAs) embora tradicionalmente conhecidos pelo imprintinggenômico, vem demonstrando diversos mecanismos de regulação da expressão gênica, principalmente emnível pós transcricional. Um destes lncRNAs que está envolvido principalmente com a metastase em câncer é o HOTAIR. O melanoma tem sido utilizado como modelo de progressao do câncer por suas etapas bem definidas e por isso já tem apresentado alguns lncRNAs envolvidos na melanomagenese e progressão do melanoma, tal como o HOTAIR. Assim, neste trabalho foi analisado a expressão de lncRNAs de amostras de melanócito e melanoma, sendo que as amostras malignas representam as principais fases de progressão deste tipo de câncer. Foram analisados os níveis de expressão relativa. Além disso, foi realizado a expressão diferencial dos grupos representativos do melanoma. Foram encontrados lncRNAs com valores de expressão e significância (p-ajustado <0,01 e fold change >1) que podem ser indicativos de expressão associada a progressão do melanoma. Os lncRNAs mais diferencialmente expressos foram avaliados quanto a sua capacidade de interação proteína-RNA e literatura científica disponível e então foram selecionados para posteriores ensaios funcionais.Evidence suggests that only about 2% of the genome encodes protein, but most remaining 80% has transcriptional activity. Since they do not coding for proteins, this fraction of the genome was considered \'junk DNA\', However, recent studies and post-ENCODE analisys has shown that significant part of these non-coding RNAs play important roles in essential biological processes and in disease. Long noncoding RNAs (lncRNAs) although traditionally known for genomic imprinting, has demonstrated several mechanisms of regulation of gene expression, especially at the post transcriptional level. One of these lncRNAs that is involved primarily with metastasis in câncer is HOTAIR. Melanoma has been used as a model of câncer progression by its well-defined steps, and so it has been presented some lncRNAs involved in melanoma progression and melanomagenese, as HOTAIR was demonstrated. In this work it was analyzed the expression of lncRNAs of melanocyte and melanoma samples, and malignant samples represent the main stages of progression of this type of câncer. Relative expression levels were analyzed. Furthermore, it was performed differential expression of representative melanoma groups. lncRNAs found with expression values and significance (p-adjusted <0.01 and fold change> 1) may be indicative of expression associated with melanoma progression. The lncRNAs more differentially expressed were evaluated for their ability to interact protein-RNA and available scientific literature and then were selected for further functional assays.
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Santos, Manoela Tiago dos. "Prospecção de novos fármacos para melanoma em equivalente dérmico." Universidade de São Paulo, 2011. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/9/9136/tde-05082011-170530/.
Full textAbstract:
Os modelos de reconstrução do microambiente são úteis para investigar as propriedades biológicas dos melanócitos humanos com a matriz e como plataforma para testes de novos fármacos. Existe uma demanda crescente para a utilização de pele e derme reconstruídas em laboratório, em ensaios in vitro de citotoxicidade, viabilidade celular, crescimento celular, irritabilidade e avaliação dos constituintes da matriz extracelular. Caracterizamos, em equivalente dérmico, alguns mecanismos de viabilidade e invasão de melanoma metastático humano quando na presença da matriz, a fim de ampliar o conhecimento a respeito de novas terapias contra o melanoma e entender os mecanismos que favorecem seu potencial invasivo, mimetizando com mais fidelidade o que ocorre in vivo. Através da validação deste modelo, constatamos que ele é essencial para resgatar a fisiopatologia do tumor, pois o melanoma, na presença de equivalente dérmico, torna-se capaz de evadir mecanismos de morte e aumentar a secreção de metaproteinases e citocinas que favorecerão a evolução tumoral. Avaliamos também as propriedades antineoplásicas do ácido clorogênico, que já foram relatadas em um grande número de tumores, porém os mecanismos que levam à sua ação antitumoral ainda não foram bem elucidados. Diante dos trabalhos enfatizando o efeito quimioprotetor dos polifenóis, referentes à sua ação antioxidante em células neoplásicas e com potencial metastático, não há na literatura estudos que comprovem a eficácia do ácido clorogênico sobre células de melanoma metastático humano. Portanto, este estudo visou recriar a estrutura dérmica in vitro e, a partir disso, comparar a resposta de fármacos em células de melanoma cultivada em equivalente dérmico, a fim de avaliar se há modulação diferencial nesse substrato, sugerindo, portanto, um protocolo mais eficaz para a prospecção de fármacos antimelanoma.The microenvironment reconstruction models are useful for investigating the biological properties of human melanocytes onto the matrix and as platform for testing new drugs. There is a growing demand for the use of reconstructed skin and dermis in the laboratory for in vitro assays of cytotoxicity, viability, cell growth, irritability, and evaluation of the extracellular matrix. We characterize in dermal equivalent some mechanisms for cell viability and invasion of human metastatic melanoma in the presence of matrix, the order to increase knowledge about new therapies against melanoma and to understand the mechanisms that favor its invasive potential, to more closely mimic what occurs in vivo. By means of this model, we find that it is essential to rescue the tumor physiopathology as melanoma, in the presence of dermal equivalent, it is able to evade death mechanisms and increase the expression of metalloproteinases and cytokines which favor the tumor evolution. We also evaluated the antineoplastic properties of chlorogenic acid, that have been reported in a large number of tumors, but the mechanisms that lead to its antitumor action has not been well elucidated. Before the work emphasizing the chemoprotective effect of polyphenols related to its antioxidant action in neoplastic cells and with metastatic potential, there is no literature studies confirming the effectiveness of chlorogenic acid on human metastatic melanoma cells. Therefore, this study aims to rebuild the dermal structure in vitro, and from this, to compare the response to drugs in melanoma cells dermal equivalent cultured in order to evaluate whether modulation differential on the substrate, thus suggesting a protocol more effective for prospecting antimelanoma drugs.
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Anger, Moris. "Expressão de proteínas da apoptose em melanoma cutâneo primário." Universidade de São Paulo, 2009. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/5/5158/tde-15042009-162410/.
Full textAbstract:
Melanoma cutâneo ainda constitui a principal causa de morte por câncer de pele nos países desenvolvidos. A variabilidade do comportamento clínico dessa neoplasia tem sido apenas parcialmente explicada pelos aspectos clínicos e histológicos, e a identificação de variáveis biológicas pode vir a ser importante na determinação de grupos de risco específicos. Foram estudados 69 pacientes com melanoma cutâneo primário de diversos graus de gravidade, tratados entre 1990 e 2007, com o intuito de verificar aspectos clínicos e epidemiológicos, preparar Tissue microarray (TMA) para estudo dos melanomas cutâneos primários com espessura maior que 1,0 mm, avaliar por análise imuno-histoquímica a expressão das proteínas da apoptose celular Bcl2, Bax, Bak, Apaf-1, Caspase 3, Caspase 9, Caspase 8, FasL e Fas em nevos-controle e em melanomas primários com espessuras menores e maiores que 1mm, e correlacionar a expressão dessas proteínas da apoptose com a evolução de melanomas cutâneos primários. Os resultados ratificaram tanto dados epidemiológicos já publicados em relação a sexo, idade e local da lesão, quanto a correlação entre a evolução da doença e os índices de Breslow. A análise dos escores compostos relativos à expressão das proteínas da apoptose revelou que o perfil imuno-histoquímico dessas proteínas parece não ter significado prognóstico, uma vez que não houve diferenças de expressão entre pacientes com e sem doença disseminada. Não foram encontradas alterações na expressão das proteínas da apoptose estudadas que pudessem sugerir o seu envolvimento tanto na gênese quanto na progressão de melanoma primário. O perfil imuno-histoquímico com tendência pró-apoptótica parece indicar que outros fatores seriam responsáveis pelo crescimento e disseminação da neoplasiaCutaneous melanoma still constitutes the main cause of skin cancer death in developed world. Clinical behavior variability of this neoplasia has been only partially explained by clinical and histological aspects, and identification of biological variables can be important for determining specific risk groups. Sixty nine (69) patients with mild to severe primary cutaneous melanoma treated in 1990-2007 were studied aiming at (a) verifying clinical epidemiological aspects, (b) generating a Tissue microarray (TMA) for characterizing proteins expression of cutaneous melanoma > 1.0 mm, (c) analyzing the immunohistochemical expression of the apoptosis proteins Bcl2, Bax, Bak, Apaf-1, Caspase 3, Caspase 9, Caspase 8, FasL e Fas in 10 control nevi and in primary melanomas with thickness 1mm, (d) and correlating these proteins expression with the disease prognosis. Results have ratified known epidemiological date on gender, age and lesion localization as well as the correlation between the disease prognosis and the Breslow\'s indexes. Analysis of the composite scores relating to apoptosis proteins has revealed that their immunohistochemical profile seems to be not significant for determining the disease prognosis, since no differences in proteins expression were found when compared patients with and without disease dissemination. Alterations in proteins expression suggesting their role in the genesis as well as in the prognosis of primary melanoma were not evidenced. Immunohistochemical profile with pro-apoptosis trend seems to indicate other factor as responsible for the neoplasia growth and dissemination
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Andrade, Luciana Nogueira de Sousa. "Evidência da dualidade funcional de galectina-3 no crescimento de melanoma murino." Universidade de São Paulo, 2007. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/5/5155/tde-21062007-095821/.
Full textAbstract:
Tumores são definidos como microambientes compostos não só pelas células malignas, mas também por células endoteliais, fibroblastos e leucócitos, que promovem o crescimento tumoral e a angiogênese. Galectina-3, uma proteína que se liga a b- galactosídeos, é abundantemente expressa por monócitos/macrófagos, dentre outros leucócitos. Inúmeras evidências sugerem que galectina-3 atua como uma molécula reguladora da resposta inflamatória. Tendo em vista que o infiltrado inflamatório pode promover a progressão de tumores, o objetivo do presente trabalho foi avaliar se galectina-3, expressa tanto pela célula tumoral como pelas células estromais, modula o crescimento de melanoma. Para tal, células de melanoma murino Tm1 foram transfectadas com o gene de galectina-3. Ambos clones celulares (galectina-3 positivos e negativos) foram injetados na intrafáscia ou no subcutâneo de camundongos (fêmeas) C57BL/6 selvagens e/ou nocautes para o gene de galectina-3 para análise da implantabilidade e crescimento tumoral. Com relação à implantabilidade, não foi observado diferenças no estabelecimento de uma massa tumoral proliferativa em animais selvagens inoculados com células Tm1 transfectadas ou não com o gene de galectina-3 em animais selvagens. Em relação a taxa de crescimento dos tumores, nenhum animal nocaute inoculado com células Tm1 galectina-3 positivas apresentou tumores de dimensões mensuráveis até o 11º dia pós-inóculo. Independente do nível de expressão de galectina- 3 pela célula tumoral, os tumores originados nos animais nocautes apresentavam menor massa em gramas comparados ao grupo selvagem, sugerindo que galectina-3 expressa pelas células estromais promove o crescimento tumoral. Ainda, os tumores originados nos animais nocautes e no grupo selvagem inoculado com células Tm1 galectina-3 positivas apresentavam menor extensão de área necrótica do que os animais selvagens inoculados com células Tm1 galectina-3 negativas. Interessantemente, os animais selvagens e nocautes inoculados com células Tm1 galectina-3 positivas apresentaram tumores com menor área vascular e menor número de estruturas vasculares funcionais quando comparados aos animais selvagens inoculados com células Tm1 galectina-3 negativas. A análise de expressão gênica nos tumores mostrou que os níveis relativos de RNAm de VEFG (fator de crescimento de endotélio vascular) foram menores nos animais inoculados com células Tm1 galectina-3 positivas em relação aos inoculados com células Tm1 galectina-3 negativas, indicando que galectina-3 expressa pelas células tumorais atua como uma molécula anti-angiogênica. Finalizando, o presente trabalho sugere que galectina-3 pode atuar como uma molécula pró- ou anti-tumoral, dependendo do tipo celular que a expressa no microambiente tumoral.Tumors have been described as microenvironments composed not only by malignant cells, but also by endothelial cells, fibroblasts and leukocytes, which can promote tumor growth and angiogenesis. Galectin-3, a b-galactoside binding protein, is expressed by monocytes/macrophages and others leukocytes. In fact, several lines of evidence suggest that galectin-3 act as master regulators of the inflammatory response. Based on the fact that the inflammatory infiltrate can promote tumor progression, the proposal of this study was to evaluate if galectin-3, either from tumor or stromal cells could modulate melanoma growth. Tm1 murine melanoma cell line was transfected with the galectin-3 gene. Both clones (galectin-3 negative and positive) were injected in the foot pad or subcutaneous in female C57BL/6 wild-type (WT) and galectin-3 knock-out (KO) mice to tumor engraftment and growth analysis. There was no difference in the tumor engraftment between animas injected with Tm1 galectin-3 positive or negative cells. In addition, any knock-out mice injected with galectin-3 positive cells had measurable tumors up to day 11 post inoculation. Regardless the galectin-3 expression level in the melanoma cell, tumors from galectin-3 KO mice were smaller than those from WT animals, suggesting that galectin-3 expressed by stromal cells promotes tumor growth. Moreover, tumor necrotic area was smaller in KO mice and in wild-type animals injected with Tm1 galectin-3 positive cells compared to wild type animals injected with Tm1 galectin-3 negative cells. Interestingly, both vascular area and the number of functional vessels in animals injected with galectin-3 positive Tm1 cells were smaller in WT as well as in KO mice compared to the same animals injected with galectin-3 negative Tm1 cells. Gene expression analysis showed that VEGF (vascular endothelial growth factor) mRNA levels were smaller in wild type animals injected with Tm1 galectin-3 positive cells compared to those injected with Tm1 galectin-3 negative cells, indicating that galectin-3 expressed by tumor cells can act as an anti-angiogenic molecule. The present study suggests that galectin-3 can act either as a pro or antitumoral molecule, depending on which type of cell (tumoral or stromal) this lectin is expressed within tumor microenvironment.
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Rangel, Marcelo Monte Mor. "Interferência da eletroporação sobre a expressão de conexinas." Universidade de São Paulo, 2011. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/10/10133/tde-25062012-153446/.
Full textAbstract:
A eletroporação é um fenômeno que promove a formação de poros na membrana citoplasmática quando esta é submetida à exposição de um campo elétrico específico. Dentre as principais aplicações da eletroporação podemos citar a eletroquimioterapia, uma nova terapia contra o câncer, e a terapia gênica, ainda em desenvolvimento. As conexinas são unidades formadoras das junções gap, canais transmembrana responsáveis pela comunicação intercelular e que participam de uma serie de eventos fisiológicos como o crescimento e diferenciação celular. A importância desta família de genes na oncologia está cada vez mais clara dadas às evidencias de seu comportamento de supressor de tumor ou como facilitador da disseminação e metástases de acordo com a fase de em que o câncer se apresenta. A eletroporação como um fenômeno que promove perturbação em membrana poderia interferir de alguma forma na expressão das conexinas. O objetivo deste trabalho foi avaliar os possíveis efeitos de interferência na expressão gênica das células promovidos pela eletroporação em especial na família de genes das conexinas. Para tanto as células foram expostas a um campo semelhante a o utilizado para eletroquimioterapia e avaliadas em diferentes tempos após a exposição. Três linhagens, duas neoplásicas (melanoma B16/BL6 e E9) e uma linhagem não neoplásica (E10) foram utilizadas como modelo experimental para que pudesse ser feita uma analise comparativa e a avaliação dos possíveis diferentes comportamentos das mesmas frente à eletroporação. O estudo da expressão gênica foi realizado pelas técnicas de imunofluorescência, western blot e PCR em tempo real. A Cx 26 foi avaliada na linhagem B16/BL6 e a Cx 43 nas linhagens E9 e E10. Os resultados da imunofluorescência apontaram uma marcação no citoplasma em B16/BL6, predominantemente em núcleo para a linhagem E9 e em núcleo e citoplasma em E10. Somente a linhagem E9 apresentou diferentes marcações entre os grupos, com uma marcação em citoplasma no grupo t1/2 (30 minutos apos a eletroporacao) O western blot mostrou diminuição transiente para as Cxs apenas nas linhagens neoplásicas nos grupos t1/2 e t1 (1 hora apos a eletroporacao). A linhagem E10 apresentou aumento de expressão nos mesmos grupos. O PCR em tempo real apresentou diferenças significativas nos tempos t1/2 e t1 para as linhagens B16/BL6 e E10. A linhagem B16/BL6 teve diminuição de RNAm enquanto a linhagem E10 apresentou aumento de transcrição de RNAm. A linhagem E9 apresentou padrão de expressão bastante heterogêneo. Frente aos resultados apresentados podemos concluir que a eletroporação interferiu de maneira transiente na expressão de conexinas.Electroporation is a phenomenon that promotes the formation of pores in the cytoplasmic membrane when it is exposed to a specific electric field. The main applications of electroporation include the electrochemotherapy, a new cancer therapy, and gene therapy, still in development. Connexins are forming units of gap junctions, transmembrane channels responsible for intercellular communication and participating in a series of physiological events such as cell growth and differentiation. The importance of this gene family in oncology is increasing. The evidence of its behavior as a tumor suppressor or facilitator of dissemination and metastases according to the stage where the cancer presents itself. Electroporation as a phenomenon that promotes membrane disruption could interfere somehow in the expression of connexins. The aim of this study was to evaluate the possible effects of interference in gene expression. of cells promoted by electroporation in particular gene family of connexins. For this purpose cells were exposed to a electric field similar to that used for Electrochemotherapy and evaluated at different times after exposure. Three cell lines, two neoplastic (melanoma B16/BL6 and E9) and one line non-neoplastic (E10) were used as experimental models that could provide a comparative analysis between the lines and an assessment of the possible different behaviors due to electroporation. Its expression was assessed by immunofluorescence, western blot and real-time PCR. Cx 26 was evaluated in the melanoma cell line B16/BL6 and Cx 43 in the cell lines E9 and E10. The results showed a cytoplasm immunofluorescence staining pattern in the in B16/BL6, predominantly in the nucleus in line E9 and in the nucleus and cytoplasm for cell line E10. Only the cell line E9 had different immunoflurescence stainings between the groups, with a positivity in the cytoplasm in the group t1/2. The western blot showed transient decrease of Cxs only in cell lines neoplastic in the times t1/2 and t1. The lung cell line E10 showed increased expression in the same time points. The real-time PCR showed significant differences in t1/2 and t1 for the cell lines B16/BL6 and E10. The melanoma cell line B16/BL6 had mRNA decreased while the cell line E10 showed increased transcription of mRNA. The cell line E9 showed a very heterogeneous expression pattern. According to our results, we can conclude that electroporation interfered transiently in the expression of connexins.
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Schul, Vitor Basso. "Partículas de fosfato de ferro e fosfato de ferro-cálcio como dispositivos visando o tratamento de melanoma." Universidade de São Paulo, 2010. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/82/82131/tde-29032016-114821/.
Full textAbstract:
O câncer tem múltiplas origens e suas causas incluem estilo de vida, fatores ambientais e suscetibilidade genética hereditária. Por isso, a busca por tratamentos mais eficazes e por um diagnóstico precoce das neoplasias malignas cresce cada vez mais. Apesar de o câncer, geralmente, derivar de um único clone de células transformadas, o processo de progressão tumoral promove considerável diversidade genética entre as células neoplásicas em crescimento. O melanoma cutâneo maligno origina-se dos melanócitos presentes predominantemente na pele ou de células precursoras multipotentes, como os nevus, e é o câncer cutâneo com maior grau de malignidade. Várias são as linhas de tratamento utilizadas atualmente para o câncer, porém muitas ainda não são tão eficazes, e a descoberta precoce ainda é uma das principais ferramentas para o combate ao problema. O presente projeto teve como objetivo verificar a resposta de células de fibroblastos e Hep2 in vitro tratadas com partículas de óxido de ferro e ferro-cálcio, assim como, a caracterização dessas partículas. A caracterização das partículas foi realizada por meio da análise granulométrica, de Microscopia eletrônica de varredura (MEV), teste de absorbância dos vidros e a medida da capacidade de aquecimento das partículas quando em solução nas concentrações de 50, 250 e 500 mg/ml. Os testes de toxicidade dos vidros foram realizados por meio de ensaios in vitro de difusão de extratos em solução e método de difusão em Agar utilizando-se linhagem celular de fibroblasto e células tumorais de laringe humana Hep2. E, testes in vivo com a administração das partículas obtidas pela via subcutânea. Os resultados da caracterização das partículas demonstraram que o diâmetro médio das partículas de fosfato de ferro foi de 830,2 nm e 745,3 nm para as partículas de fosfato de ferro-cálcio, o que foi confirmado pela MEV. O teste de absorbância mostrou que os vidros absorvem em ampla faixa do espectro eletromagnético, incluindo a faixa de 660 nm. O teste de aquecimento demonstrou a capacidade das partículas em variar em média 14 graus Celsius a temperatura da solução, independentemente da concentração utilizada. Os testes in vitro e in vivo mostraram que as partículas não foram citotóxicas e não causaram danos ao tecido subcutâneo, mesmo após o tempo de 1 semana da administração. Estes resultados mostram que a utilização de partículas de vidros de fosfato para o tratamento de câncer pode ser viável, assim com seu potencial para utilização no tratamento de melanoma.Cancer has many origins and their causes include lifestyle, environmental factors and hereditary susceptibility. Therefore, the search for better treatments and early diagnosis of malignant neoplasms grows more and more. Although the cancer usually derives from a single clone of transformed cells, the process of tumor progression promotes genetic diversity between the neoplastic cells in growth. Cutaneous malignant melanoma arises from melanocytes predominantly present in the skin or multipotent progenitor cells, such as nevi, and is the skin cancer with the highest degree of malignancy. Several lines of treatment are currently used to treat the cancer, but many still not effective and early detection stills one of the main tools to combat the problem. This project aimed to verify the response of fibroblasts and Hep2 cells treated in vitro with particles of iron oxide and iron-calcium, as well as the characterization of these particles. Characterization of particles was performed by means of textural analysis, scanning electron microscopy (SEM), absorbance test of the glasses and measurement of the heating capability in particle solutions at concentrations of 50, 250 and 500 mg/ml. Toxicity tests of glasses were performed using in vitro tests of extracts of diffusion in solution and Agar diffusion method using a fibroblast cell line and tumor cells in Hep2 human larynx. And, in vivo tests with subcutaneous injection of the particles. The characterization results showed that the particle average diameter of particles of iron phosphate was 830.2 nm and 745.3 nm for the particles of iron-calcium phosphate, which was confirmed by SEM. The absorbance test showed that the glasses absorb in a wide range of the electromagnetic spectrum, including the band of 660 nm. The heating test demonstrated the capability of the particles to promote a 14ºC average temperature variation in the solution, regardless of the concentration. In vitro and in vivo tests showed that the particles were not cytotoxic and did not cause damage to the subcutaneous tissue, even after 1 week of administration. These results shows that the utilization of phosphate glasses particles can be feasible, as well as its potential for use in the treatment of melanoma.
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Camacho, Lizeth Carolina Cordoba. "Caracterização funcional do SNP rs6917 na 3\'UTR do gene Proibitina: associação com quimiorresistência em linhagens de melanoma humano e melanoma de crescimento vertical." Universidade de São Paulo, 2018. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/5/5155/tde-05062018-122246/.
Full textAbstract:
O melanoma cutâneo é um tipo de tumor formado a partir dos melanócitos, células de origem neuroectodérmica que habitam a epiderme, sendo responsáveis por sua pigmentação. Embora este tumor seja o tipo menos frequente de câncer de pele, ele está associado com altas taxas de mortalidade, principalmente devido a seu comportamento agressivo (alta capacidade metastática) e quimiorresistência aos tratamentos (quimioterapia e radioterapia). Os processos da quimiorresistência em melanoma ainda não são totalmente conhecidos. Estudos prévios de nosso grupo evidenciaram que a expressão da proteína Proibitina (PHB) encontra-se aumentada em células de melanoma frente à exposição a certos quimioterápicos, executando sua função de molécula anti-apoptótica, quando localizada no citoplasma, e/ou supressora tumoral quando no núcleo. Adicionalmente, foi visto que a repressão de PHB sensibiliza as células de melanoma, enquanto a sua superexpressão protege da morte celular induzida por cisplatina. Além disso, estudos de associação genótipo-fenótipo revelaram que o alelo menos frequente/raro do SNP rs6917 (C1703T) na região 3\'UTR do gene da PHB foi associado com o risco aumentado de desenvolvimento do melanoma. O objetivo do nosso trabalho foi avaliar o envolvimento do SNP rs6917 da 3\'UTR do gene PHB em linhagens de melanoma humano e sua resposta celular frente ao tratamento com agentes quimioterápicos indutores de estresse celular como temozolomida, cisplatina e vemurafenib. Para avaliar a contribuição do polimorfismo rs6917 no desenvolvimento de melanoma, foi desenvolvido um estudo tipo caso-controle numa população brasileira. O estudo analisou 198 pacientes com melanoma e 200 controles. Em ensaios in vitro as linhagens celulares de melanoma humano SK-Mel 05 e UACC-62 (BRAFV600E mutadas) foram transfectadas com as variantes polimórficas UTR/C e UTR/T clonadas no plasmideo pmirGLO Dual-Luciferase nos sítios de restição NheI/XhoI. A Geneticina (G418) foi utilizada para seleção estável das células, ensaios de western Blot, qRT-PCR e luminiscencia confirmaram a expresão do transgene. As diferentes doses de cisplatina, temozolomida e vemurafenib foram definidas para o tratamento das células. Para avaliar a morte celular foi realizada a técnica de citometria de fluxo após incorporação com iodeto de propidio. Após os tratamentos, foram realizados ensaios clonogênicos e de imunofluorescencia para determinar sobrevivencia celular e localização subcelular da proibitina, respectivamente. Nossos resultados revelaram que variáveis clinicas como a presença de cabelos claros (loiros ou ruivos), mais de 20 pintas, exposição solar intermitente, queimaduras solares na infância e adolescência são fatores de risco para o aparecimento de melanoma. Nos casos, os portadores do alelo T mostraram um risco aumentado em 5,6 vezes para o desenvolvimento de melanoma de crescimento vertical em comparação com os pacientes com genótipo CC. Ensaios in vitro, mostraram que células de melanoma humano superexpressando o alelo raro 3\'UTR/T após tratamento com cisplatina, temozolomida e vemurafenib apresentavam um fenotipo mais proliferativo e clonogênico com menor morte celular quando comparadas com as células 3\'UTR/C e vetor vazio. Ensaios de Western blot e bioluminescência mostraram, respectivamente, um aumento na expressão e atividade do gene da luciferase nas células 3\'UTR/T. Estes resultados mostram que o SNP rs6917 modula a expressão de PHB e que o alelo raro T representa um polimorfismo funcional promovendo a quimiorresistência em melanomaMelanoma is a type of skin tumor formed from melanocytes, cells of neuroectodermal origin that inhabit the epidermis, being responsible for its pigmentation. Although its low incidence, melanoma is associated with high rates of mortality due to its resistance to chemotherapy. The mechanisms involved in melanoma chemoresistance are not well fully understood yet, therefore, the comprehension of this phenomenon may be useful for the development of new treatment strategies. Previous results from our laboratory showed that Prohibitin (PHB), a protein with diverse functions including regulation of cell cycle progression and apoptosis, was overexpressed in human melanoma cells lines when exposed to high-doses of the chemotherapy drug, cisplatin. PHB knockdown sensitized melanoma cells, meanwhile PHB recombinant overexpression protected melanoma cells to cisplatin-induced cell death. Studies of genotype-phenotype association revealed that the Single Nucleotide Polymorphism rs6917 at the portion 3\'UTR of the PHB gene showed an association with some risk factors for the development of melanoma. The aim of this study was to investigate if the SNP rs6917 affects PHB protein function by modulating cell proliferation and chemoresistance in human melanoma cell lines when exposed to stress inductors agents such as cisplatin, temozolomide and vemurafenib. A hospital-based case-control study was carried out in a Brazilian sample to evaluate the contribution of rs6917 polymorphism in melanoma development. The study comprised 198 melanoma patients and 200 controls. For invitro assays SK-Mel 05 and UACC-62 human melanoma cell lines (both BRAFV600E mutated) were used. The 852bp of PHB-3\'UTR harboring wild-type (3\'UTR/C) or the rare allele (3\'UTR/T) were cloned at pmirGLO Dual-Luciferase plasmid at NheI/XhoI restriction sites and stable cell lines were generated. Geneticin (G418) was used for stable selection, qRT-PCR, Western Blot and luciferase assays confirmed the transgene expression. Different doses of cisplatin, temozolomide and vemurafenib were defined to treat the cells. Cell death was evaluated using flow cytometry after propidium iodide incorporation. Cell survival was assessed by clonogenic assay after cells undergone treatment. Our results revealed that clinical variables like presence of light hair, more than 20 moles, intermintent sun expossure and sunburns at childhood are risk factors for melanoma development. We also showed that T allele carriers have a 5,6 times increased risk to develop vertical growth melanoma in comparison with the CC genotype patients. In vitro assays with transfected melanoma cells, SK-Mel 05 and UACC-62, overexpressing the rare allele 3\'UTR/T showed a more proliferative and clonogenical phenotype and less induced cell death after cisplatin, temozolomide and vemurafenib treatment when compared to cells overexpressing the wild-type allele 3\'UTR/C and empty vector. Westernblot and bioluminiscence assays showed respectively an increase in the expresion and activity of the luciferase gene of the 3\'UTR/T cells in comparison with the 3\'UTR/C and empty vector cells. All together these results showed that the SNP rs6917 modulates the expression of PHB and that the rare allele T represents a functional polymorphism by promoting a chemoresistance phenotype in melanoma
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Coimbra, Janine Baptista. "Ação de metabólitos da via das triptaminas em linhagens de melanomas." Universidade de São Paulo, 2015. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/9/9136/tde-26102015-093528/.
Full textAbstract:
O triptofano (Trp) é essencial para muitos processos fisiológicos e seu metabolismo apresenta-se alterado em doenças como no câncer. O Trp é degradado por três vias: via das quinureninas; via serotonérgica e via das triptaminas. A primeira está envolvida com a tolerância e o imune escape de células tumorais, já a segunda leva a produção de serotonina e melatonina, com uma diversidade de funções biológicas e que possuem atividades antitumorais reconhecidas. A terceira rota é a menos estudada e a função dos compostos sintetizados ainda é desconhecida. Trabalhos do grupo mostram que a via das triptaminas é ativa em melanomas e que triptamina (TRY) e dimetiltriptamina (DMT), metabólitos produzidos por esta via, também possuem atividade antitumoral. Nosso objetivo é avançar sobre a compreensão de como esta via afeta o metabolismo e crescimento tumoral. Para tanto, estudamos mais detalhadamente a via em linhagens de melanoma. A adição de TRY e DMT nas culturas modificou a produção de compostos das outras rotas de metabolização do Trp. Além disso, TRY e DMT afetaram a invasividade das células tumorais e TRY aumentou a atividade citotóxica de células mononucleares frente a melanomas. Observamos que apesar dos efeitos biológicos da via das quinureninas estar amplamente relacionado a ligação dos metabólitos no receptor de aril hidrocarbonetos, para a via das triptaminas o receptor parece não estar associado com a atividade antitumoral descrita. Nossos resultados apontam para a importância da via das triptaminas na dinâmica tumoral e a necessidade de estudos mais amplos relacionados ao metabolismo do Trp.Tryptophan (Trp) is essential for many physiological processes and its metabolism is modified in several diseases such as in cancer. TRP is broken down into three pathways: kynurenine path, serotonergic path and tryptamine path. The first is involved in tolerance and immune escape of cancer cells, while the second leads to the production of serotonin and melatonin, which have a variety of biological functions and recognized antitumor activity. The third route is the least studied and the biological function of the synthesized compounds is still unknown. Our group shows that tryptamine path is active in melanomas and tryptamine (TRY) and dimethyltryptamine (DMT), metabolites produced by this route, also have antitumor activity. Our goal is make progress on understanding how tryptamine route affects metabolism and tumor growth. Therefore, we studied in detail this pathway in melanoma cell lines. The addition of TRY and DMT into the cultures leds the production of metabolites of other Trp routes. Moreover, TRY and DMT affect the invasiveness of tumor cells and TRY increased antitumor activity of the immune system against melanomas. We observed that despite biological effects of kynurenine path be largely related to metabolites binding aryl hydrocarbon receptor, for tryptamine pathway the receptor seems not to be associated with the described antitumor activity. Our results point the importance of tryptamine pathway in tumor dynamics and the need for broader studies related to Trp metabolism.
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Junior, Abdo Salomão. "Infusão transdérmica de fármaco no tratamento do melanoma murino B16F10." Universidade de São Paulo, 2017. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/5/5167/tde-03012018-111449/.
Full textAbstract:
A incidência de casos de melanoma tem aumentado em todo o mundo sendo que, apesar do diagnóstico precoce e do advento das terapias moleculares, o número de pacientes que morrem com a doença em estágio avançado continua em elevação. Deste modo as pesquisas atuais têm focado no desenvolvimento de diferentes estratégias para a disponibilização de terapias eficazes e acessíveis. Nesse contexto, a via de administração transdérmica constitui uma alternativa promissora para aumentar a eficácia local e sistêmica de fármacos, incluindo agentes antitumorais. Diversos métodos têm sido desenvolvidos para maximizar a permeação cutânea de fármacos, destacando-se, entre esses, a ablação térmica por radiofrequência (RF). Esse processo resulta na criação de vários microcanais entre a epiderme e a derme, pelos quais diversas moléculas podem passar em direção às camadas mais profundas da pele. Nesse estudo, a eficácia da infusão transdérmica de etoposídeo por dispositivo de radiofrequência fracionada foi avaliada em modelo de melanoma murino. Camundongos da linhagem C56BL/6 foram divididos nos seguintes grupos experimentais: 1) controle; 2) tratados com radiofrequência; 3) tratados com a aplicação tópica de etoposídeo; e 4) tratados com radiofrequência e posterior aplicação tópica de etoposídeo. Os tratamentos foram realizados durante o período de 28 dias. O peso corpóreo, o volume tumoral e o perfil hematológico foram avaliados semanalmente. Ao término do tratamento os animais foram eutanasiados e procedeu-se a coleta da massa tumoral e dos órgãos (pulmão, baço, rins, linfonodos e fígado) para análise histopatológica. As células tumorais obtidas das massas tumorais foram analisadas quanto às alterações do ciclo celular e do potencial transmembrânico mitocondrial. Os resultados demonstraram que o tratamento com etoposídeo isolado reduziu a sobrevida dos animais e ocasionou alterações histológicas indicativas de toxicidade. Em contrapartida, a infusão transdérmica do etoposídeo por dispositivo de radiofrequência promoveu redução significativa do volume tumoral, em comparação com todos os grupos experimentais, sem ocasionar mortalidade. Esse tratamento também diminuiu a plaquetocitose e elevou o número de eritrócitos em comparação com os outros grupos. A análise histopatológica dos órgãos dos animais tratados com RF + etoposídeo evidenciou que não houveram alterações significativas na arquitetura tecidual. Ainda, o grupo tratado com RF + etoposídeo foi o que apresentou o maior percentual de células estacionadas na fase S/G2M e com mitocôndrias inativas, evidenciando o aumento da eficácia demonstrada no estudo in vivo. O conjunto de resultados sugere que o tratamento com a radiofrequência seguida do etoposídeo resulta em melhor resposta antitumoral do quimioterápico, com baixos índices de toxicidade sistêmicaThe incidence of melanoma cases has increased worldwide and, despite early diagnosis and targeted molecular therapy, the number of patients dying from metastatic disease continues to rise. Thus, current research has focused on the development of different treatment strategies to provide efficient and accessible solutions. In this sense, transdermal delivery is a promising alternative enhancing the local and systemic efficacy of drugs, including antitumor agents. Several methods have been developed to improve the skin permeation of drugs, highlighting, among those, the radiofrequency thermal ablation (RFA). This process results in the creation of many microchannels between the epidermis and the dermis through which several molecules can pass towards the deeper layers of the skin. In this study, the efficacy of the transdermal delivery of etoposide by a fractional radiofrequency device was evaluated in a murine melanoma model. C56BL/6 lineage mice were divided into the following experimental groups: 1) control; 2) treated with radiofrequency; 3) treated with topical applications of etoposide; and 4) treated with radiofrequency followed by topical applications of etoposide. The animals were treated for 28 days and the body weight, tumor volume and hematological profile were analyzed weekly. At the end of the treatments, the animals were euthanized and the tumor mass and organs (lung, spleen, kidneys, lymph nodes and liver) were collected for histopathological analysis. Tumor cells obtained from the tumor masses were analyzed for changes in the cell cycle and mitochondrial transmembrane potential. The results showed that the treatment with etoposide alone reduced the survival of the animals and caused histological changes indicating toxicity. On the other hand, the transdermal delivery of etoposide by a radiofrequency device resulted in a significant reduction of the tumor volume, in comparison with all the experimental groups, not causing mortality. This treatment also decreased thrombocytosis and increased the number of red blood cells compared to the other groups. The histopathological analysis of the organs from animals treated with RFA + etoposide demonstrated that there was no significant change in tissue architecture. Furthermore, the group treated with RFA + etoposide presented the highest percentage of cells with inactive mitochondria and interruption at the S/G2M stage, corroborating the increased efficacy of the in vivo study. The set of results indicates that the treatment with radiofrequency followed by etoposide results in better antitumor responses of chemotherapy, with low toxicity rates
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Meneguelo, Renato. "Efeitos antiproliferativos e apoptóticos da fosfoetanolamina sintética no melanoma B16F10." Universidade de São Paulo, 2007. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/82/82131/tde-12022008-135651/.
Full textAbstract:
A fosfoetanolamina sintética é uma molécula fosforilada artificialmente, com síntese inédita realizada pela primeira vez pelo nosso grupo, diferindo-se das moléculas atuais pelo seu nível de absorção de aproximadamente 90%, com diversas propriedades antiinflamatórias e apoptóticas. O objetivo principal desse estudo e avaliar os efeitos antitumorais \"in vitro\" e \"in vivo\" da fosfoetanolamina sintética em células de melanoma B16F10 implantados em camundongos Balb-c. Foram utilizados grupos de 60 camundongos Balb-c, fêmeas com aproximadamente 20 g, tratados com água e ração \"ad libidum\". A atividade citotóxica do composto foi testada em linhagens tumorais pelo método colorimétrico MTT, e determinada à concentração inibitória (IC50%), sua toxicidade foi também testada em linfócitos T normais, em ensaios de proliferação celular, estimulados por mitógeno. Os animais portadores de tumores foram tratados após o 14º dia do implante tumoral com solução aquosa (i.p) de fosfoetanolamina sintética e o grupo controle recebeu solução salina, e foram avaliados os seguintes parâmetros: volume tumoral, área e número de metástases em órgãos internos. Foi também realizada a comparação da fosfoetanolamina sintética em relação aos quimioterápicos comerciais Taxol e Etoposideo separados nas diferentes fases do ciclo celular. Os resultados do tratamento com a fosfoetanolamina sintética \"in vitro\" mostraram que o composto induz citotoxicidade seletiva para as células tumorais com IC50% de 1.69 ug/ml sem afetar a capacidade proliferativa de células normais. Os animais portadores de tumores dorsais de melanoma B16F10 apresentaram significativa redução carga tumoral, mostrando inibição da capacidade de crescimento e a metastatização. A avaliação hematológica não demonstrou alterações relevantes após a administração da fosfoetanolamina sintética pela via intraperitoneal nos animais portadores de melanoma. Conclui-se que a fosfoetanolamina sintética diminuiu significativamente o tamanho de tumores de forma seletiva, sem alterações em células normais, com vantagem em relação aos quimioterápicos comerciais, pois a mesma não apresentou os terríveis efeitos colaterias dos mesmos. Neste trabalho ficou evidente a capacidade inibitória da fosfoetanolamina sintética na inibição da progressão e disseminação das células tumorais.The synthetic phosphoethanolamine is a phosphorilad artificially molecule, with unknown synthesis carried through for the first time for our group, differing itself from current molecules for its level of absorption of approximately 90%, with diverse anti-inflammatory and apoptotic as properties. The main objective of this study and to evaluate the anti tumor effect \"in vitro\" and \"in vivo\" of the synthetic phosphoethanolamine in cells of melanoma B16F10 implanted in mice Balb-c. Groups of 60 Balb-c mice had been used, females with approximately 20 g, treated with water and ration \"ad libidum\". The cytotoxic activity of the composition was tested in lives tumor or normal cells for colorimetric method MTT, and determined to the inhibitory concentration (IC50%) its toxicid also it was tested in normal linphocytes T, in assays of cellular proliferation, stimulated for mitogen. The bearing animals of tumors had been dealt with after 14º day the tumor inoculation with watery solution (i.p) of synthetic phosphoethanolamine and the group control received solution saline, and had been evaluated the following parameters: tumor volume, area and number of metastases in internal agencies. Also the comparison of the synthetic phosphoethanolamine in relation to the convencionaly treatment with quimioterapics separate Taxol and Etoposideo in the different phases of the cellular cycle was carried through. The results of the treatment with the synthetic phosphoethanolamine \"in vitro\" had shows that the composition induces selective citotoxicity for the tumor cells with IC50% of 1.69 ug/ml without affecting the proliferative capacity of normal cells. The bearing animals of dorsal tumors of melanoma B16F10 had presented significant reduction tumor load, showing to inhibition of the capacity of growth and the metastatization. The hematological evaluation did not show alterations the administration of the synthetic phosphoethanolamine by the intraperitoneal way in the bearing animals of melanoma. The synthetic phosphoethanolamine significantly reduced the size of tumors of selective form, without alterations in normal cells; with advantage in relation to the commercial quimioterapics therefore the same one did not present the terrible collaterals effect of the same ones. In this work it was evident the inhibitory capacity of the synthetic phosphoethanolamine in the inhibition of the progression and dissemination of the tumor cells.
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Oliveira, Érica Aparecida de. "Estudo comparativo de radiofármacos para angiogênese na detecção de melanoma." Universidade de São Paulo, 2011. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/85/85131/tde-31102011-092818/.
Full textAbstract:
Diagnóstico precoce e tratamento de melanoma, um tumor cutâneo com o pior prognóstico, é extremamente importante para um resultado clínico favorável. A biblioteca de peptídeos phage display é um recurso útil de triagem para identificar peptídeos bioativos que interagem com alvos em cânceres. O objetivo desse estudo foi a avaliação de dois traçadores de tecnécio-99m com sequências peptídicas RGD e NGR, conjugados com o quelante bifuncional MAG3. Os conjugados peptídicos (10 μL de uma solução μg/μL) foram marcados com tecnécio-99m usando tampão de tartarato de sódio. A avaliação radioquímica foi feita por ITLC e confirmada por CLAE. O coeficiente de partição foi determinado e ensaios de internalização foram realizados em duas linhagens celulares de melanoma (B16F10 e SKMEL28). A avaliação da biodistribuição dos traçadores foi realizada em animais sadios em diferentes tempos e também em camundongos portadores de células tumorais aos 120 min após a sua administração. Estudos de bloqueamento também foram conduzidos pela co-injeção de peptídeo frio. O desempenho dos conjugados peptídicos mostraram-se bastante parecidos em diversas avaliações. Eles foram radiomarcados com alta pureza radioquímica (>97%). Ambos são hidrofílicos, com excreção renal preferencial. A captação tumoral foi maior para células SKMEL28 do que para as células B16F10, especialmente para o 99mTc-MAG3-PEG8-c(RGDyK) (7,85±2,34 %DI/g) aos 120 min pós-injeção. O desempenho do 99mTc-MAG3-PEG8-c(RGDyk) foi superior que o do traçador com NGR, quanto à captação no melanoma humano podendo ser considerado como um promissor radiofármaco para diagnóstico de melanoma.Early diagnosis and treatment of melanoma, a cutaneous tumor with a serious prognosis, is extremely important for optimal clinical outcome. Phage display peptide libraries are a useful screening resource for identifying bioactive peptides that interact with cancer targets. The aim of this study was the evaluation of two technetium-99m tracers for angiogenesis detection in melanoma model, using cyclic peguilated pentapeptide with RGD and NGR motifs conjugated with bifunctional chelator MAG3. The conjugated peptides (10 μL of a μg/μL solution) were labeled with technetium-99m using a sodium tartrate buffer. Radiochemical evaluation was done by ITLC and confirmed by HPLC. Partition coefficient was determined and internalization assays were performed in two melanoma cells (B16F10 and SKMEL28). Biodistribution evaluation of the tracers was done in healthy animals at different times and also in mice bearing the tumor cells at 120 min post injection. Blocking studies were also conducted by co-injection of cold peptides. The conjugated showed the same profile in many evaluations. They were radiolabeled with high radiochemical purity (>97%). Both were hydrophilic, with preferential renal excretion. Tumor uptake was higher for human melanoma cells than for murinic melanoma cells, specially for 99mTc-MAG3-PEG8-c(RGDyK) (7.85±2.34 %ID/g) at 120 min post injection. The performance of 99mTc-MAG3-PEG8-c(RGDyk) was much better than NGR tracer concerning human melanoma uptake and might be considered in future investigations focusing radiotracers for melanoma diagnosis.
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Pereira, Alexandre. "Toxicidade seletiva da crotamina do veneno de Crotalus durissus terrificus sobre as células indutoras de tumores." Universidade de São Paulo, 2011. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/87/87131/tde-22052012-155446/.
Full textAbstract:
Crotamina é um peptídeo de baixo peso molecular composto de 42 resíduos de aminoácidos. A presença de nove resíduos de lisina e três pontes dissulfeto confere a crotamina compactibilidade elevada, estabilidade, carga positiva líquida, apresentando similaridade estrutural com defensina, um peptídeo antimicrobiano do epitélio humano. Crotamina até 10,0 mM é inócua para células normais (e.g., fibroblastos humanos e células-tronco embrionárias de murinos), mas letal para células tumorigênicas CHO-K1. Aqui, nós demonstramos que 1 mg crotamina (0,2 mM) foi citotóxica para céluas B16-F10, Mia Paca-2 e SK-Mel-28 células in vitro, como se provou pelos ensaios de MTT, coloração com Hoechst 33342 e Iodeto de Propídio. Adicionalmente, nós avaliamos o efeito citotóxico da crotamina sobre a invasão do melanoma cutâneo primário produzido pela implantação de células B16-F10 em camundongos C57BL/6J. O efeito da crotamina em melanoma cutâneo foi estudado em dois grupos de camundongos (tratados com crotamina e não tratados), sendo cada grupo composto por 35 camundongos. Cada animal do grupo, tratado com crotamina, recebeu diariamente 1,0 mg/100 mL de crotamina (2 mM) , enquanto aqueles não tratados receberam apenas placebo. O tratamento com crotamina durou 21 dias. O atraso da implantação do tumor e redução da mortalidade foi observado para o grupo tratado com crotamina quando comparados ao grupo controle não-tratados. O peso médio d o tumor no grupo não tratado foi 4,60 g, enquanto nos tratados com crotamina foi de apenas de 0,27 g, quando detectados. O cálculo de sobrevida estimado de Kaplan Meier indicou que o grupo tratado com crotamina apresentou diferenças significativas, número de sobreviventes (n = 28/35), em comparação ao grupo não tratado (n = 7/35). Os dados de nossa pesquisa demonstram que a crotamina possui in vitro e in vivo uma atividade citotóxica específica e seletiva contra tipos de tumores de crescimento rápido e agressivo.Crotamine is a low molecular weight peptide composed of 42 amino acid residues. The presence of nine lysine residues and three disulfide bonds confers to crotamine high compactness, stability, net positive charge, and overall structural similarity to b-defensin 2, an antimicrobial peptide from the human epithelia. Crotamine, up to 10.0 mM, is innocuous to normal cells (e.g., human fibroblasts and murine embryonic stem cells), but lethal for tumorigenic CHO-K1 cells. Herein, we demonstrated that 1 mg of crotamine (0,2 mM) was cytotoxic for B16-F10, Mic PaCa-2 and SK-Mel-28 cells in vitro, as proved by MTT assay, Hoechst 33342 and Propidium iodide staining. Additionally, we evaluate the cytotoxic effect of crotamine on primary invasion of cutaneous melanoma produced by injection of B16-F10 cells into C57Bl/6J mice. The effect of crotamine on cutaneous melanoma was studied on two groups of mice (crotamine-treated and non-treated), each composed by 35 mice. Each animal in crotamine-treated group received daily 1 mg/100 mL of crotamine (2 mM), while those non-treated received placebo. Crotamine treatment lasted for 21 days. The delay of tumor implantation and reduction of death was observed for crotamine-treated group when compared to control non-treated group. Average weight of tumor in non-treated group was 4.60 g, while in crotamine-treated, was only about 0.27 g, if detectable. The Kaplan Meier estimator indicated that crotamine-treated group present significant survival number (n=28/35) in comparison with non-treated group (n=7/35). Data from our research demonstrate that crotamine possesses in vitro and in vivo specific and selective cytotoxic activity against aggressive and fast growing types of tumor.
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Vargas, Thiago Henrique Moroni. "Caracterização imuno-histoquímica da Galectina-3 como ferramenta prognóstica em melanomas orais caninos." Universidade de São Paulo, 2018. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/74/74135/tde-14022019-132753/.
Full textAbstract:
Os melanomas correspondem a 7% de todas as neoplasias malignas em cães e são principalmente encontrados em cavidade oral e lábios, correspondendo a 33% dos tumores de boca, possuem um prognóstico ruim devido ao fato de serem diagnosticados tardiamente, por sua grande capacidade de invasão local e formação de metástases, além de altas taxas de recidiva após o tratamento cirúrgico. A Galectina-3 (Gal-3) é uma proteína responsável por diversas funções fisiológicas como adesão, apoptose, angiogênese, proliferação e diferenciação. Em medicina veterinária existem poucos estudos relacionando à expressão da Gal-3 com prognóstico e a progressão da neoplasia. Realizamos imuno-histoquímica para Gal-3 em 27 melanomas orais caninos que foram avaliados de maneira semiquantitativa e quantitativa, e comparamos os resultados obtidos com a sobrevida, outros marcadores prognósticos (Ki67, índice mitótico e atipia nuclear), expressão de proteínas relacionadas à apoptose (BCL2 e CASP3) e parâmetros histopatológicos (grau de pigmentação e tipo histológico). Detectamos alta expressão de Gal-3 em melanomas com maior sobrevida pós-cirúrgica e uma alta expressão nuclear de Gal-3 em melanomas com menor sobrevida pós-cirúrgica. Além disso, houve correlação entre as expressões de Gal-3 e BCL2, assim como entre atipia nuclear e sobrevida pós-cirúrgica. É sabido que a Gal-3 é capaz de formar heterodímeros com a BCL2 no citoplasma para atuar na evasão da morte por apoptose, impedindo a liberação da citocromo C. Já no núcleo, a Gal-3 induz à parada do ciclo celular, reduzindo a taxa da proliferação. Apesar do reduzido número amostral devido à dificuldade nos acompanhamentos clínicos nossos dados permitem sugerir que a Gal-3 é possui potencial para ser um marcador prognóstico de sobrevida em casos de melanomas orais caninos. Novos estudos devem ser realizados afim de confirmar nossas observações e elucidar o papel da Gal-3 nesta neoplasia.Melanomas are almost 7% of all malignant neoplasms in dogs. They are mainly found in the oral cavity and lips, corresponding to 33% of tumors of the oral cavity. They carry a poor prognosis because of late diagnoses, local invasiveness, high metastatic and recurrence rates after surgical treatment. Galectin-3 (Gal-3) is a protein with a variety of biological roles such as in adhesion, apoptosis, angiogenesis, proliferation and differentiation. In veterinary medicine, there are few studies comparing the expression of Gal-3 with prognosis and tumor progression. We performed immunohistochemistry for Gal-3 in 27 canine oral melanomas and evaluated the immunolabelling both semi-quantitatively and quantitatively. The results were compared with survival, other prognostic markers (Ki67, mitotic index and nuclear atypia), expression of proteins related to apoptosis (BCL2 and CASP3) and histopathological parameters (degree of pigmentation and histological type). We detected higher expression of Gal-3 in cases of melanoma that presented longer post-surgical survival and a higher nuclear expression of Gal-3 in dogs with melanoma that had shorter post-surgical survival. In addition, there was correlation between the Gal-3 and BCL2 expressions, as well as between nuclear atypia and post-surgical survival. It is known that Gal-3 is able to form heterodimers with BCL2 in the cytoplasm leading to evasion of apoptosis, through preventing mitochondrial cytochrome C release. Nuclear Gal-3 induces the cell cycle arrest, reducing the proliferation rate. Despite the small sample size due to the difficulty in clinical follow-up, our data suggest that Gal-3 has the potential to be a prognostic marker for survival in cases of canine oral melanomas. Further studies should be performed to confirm our observations and elucidate the role of Gal-3 in this neoplasm.
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Paioli, Fernanda Somma. "Efeito citotóxico da crotoxina em células de melanoma murino e fibroblastos." Universidade de São Paulo, 2011. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/87/87131/tde-17032011-105046/.
Full textAbstract:
A crotoxina é a toxina mais abundante e ativa do veneno da cascavel brasileira Crotalus durissus terrificus. É composta por duas sub-unidades ligadas não covalentemente. A sub-unidade ácida é enzimaticamente inativa e não possui toxicidade, é também conhecida como crotapotina e potencializa a ação da fosfolipase A2 (sub-unidade básica). Alguns autores atribuem à crotoxina um efeito citotóxico e sugerem seu uso como um agente terapêutico contra tumores. Neste trabalho, foi investigada a citotoxidade da crotoxina e suas subunidades em células de melanoma murino e fibroblastos. Os ensaios de indicam que a crotoxina é tóxica para as células de melanoma promovendo a morte até em concentrações mais baixas enquanto os fibroblastos foram afetados somente em concentrações mais altas. Ensaios com as subunidades mostraram que a fosfolipase A2 foi mais tóxica para as células de melanoma que para os fibroblastos.Crotoxin is the most abundant and active toxin from the venom of the Brazilian rattlesnake Crotalus durissus terrificus. It is composed of two subunits non covalently linked. One acidic with no enzymatic or toxic activity, known as crotapotin, which enhances the phospholipase A2 (basic subunit) action. Some authors have also attributed to this toxin a direct cytotoxic effect, and have suggested its use as a therapeutical agent against tumoral cells. In the present work, we investigated the cytotoxic effect of crotoxin and its subunitis on murine melanoma cells and fibroblasts. Our results indicate that crotoxin is highly toxic to the melanoma cells inducing cell death even at the lowest concentration while the fibroblast were only affected with the higher concentrations. The subunits assays showed that the phospholipase A2 had a higher toxicity on melanoma cells than on fibroblasts.
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Silva, Emanoel Pedro de Oliveira. "Estudos fotofísicos e fotobiológicos de sistemas de liberação contendo o fármaco fotossensível cloro-ftalocianina de alumínio para aplicação em terapia fotodinâmica." Universidade de São Paulo, 2016. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/60/60137/tde-21102016-112503/.
Full textAbstract:
A terapia fotodinâmica (TFD) tem se apresentado nos últimos anos como uma alternativa para o tratamento de tumores cutâneos, viscerais e sistêmicos, demonstrando resultados promissores, tanto em estudos in vitro como in vivo. Trata-se de uma técnica simples e não invasiva. A terapia consiste na excitação de um fármaco fotossensibilizante por uma fonte de luz visível que depois de absorvida pela molécula, leva a produção espécies reativas de oxigênio (EROs) em presença do oxigênio molecular por uma sequencia de reações fotoquímicas. Nesse trabalho propõe-se a preparação, caracterização e detreminação da atividade fotodinâmica de uma nanoemulsão rica em colesterol e de lipossomas ultradeformáveis como novos sistemas de liberação para o fármaco fotossensibilizante cloro alumínio ftalocianina (PcAlCl), comparando com um sistema clássico de lipossoma convencional. Como modelo celular foram utilizadas células de glioblastoma (U87MG) e de melanoma (B16F10). As formulações apresentaram características desejáveis como reprodutibilidade, tamanho de partícula, estabilidade curto e em longo prazo e deformidade adequados para a utilização como meio de veiculação da PcAlCl. Pela análise dos estudos fotofísicos de rendimento quântico de fluorescência (?F), tempo de vida de fluorescência (?) e rendimento quântico de oxigênio singleto (??) da PcAlCl em etanol e incorporada nas formulações, pode-se observar que a incorporação a um veículo de liberação melhorou as características da PcAlCl. Nos estudos em células nenhum dos sistemas apresentou citotoxicidade na ausência de luz, mas apresentaram um aumento da atividade fotodinâmica da PcAlCl de até 80% quando comparadas à PcAlCl livre quando irradiadas. Todas as formulações apresentaram características que corrobora com o emprego como sistemas de liberação para o aumento da atividade fotodinâmica da PcAlCl podendo serem empregados no tratamento de glioblastoma e de melanomaThe Photodynamic therapy (PDT) has been an alternative for the treatment of skin, and brain tumors, and has shown promising results, both in vitro and in vivo, is a simple and non-evasive technique. The therapy consists into a light-sensitive drug excitation by a light visible source that once absorbed by the molecule lead to produce reactive oxygen species (ROS) in the molecular oxygen presence by a sequence of photochemical reactions. This work proposes the preparation and characterization of a cholesterol-rich nanoemulsion and ultradeformable liposomes as new delivery systems for the drug photosensitizer chloro aluminum phthalocyanine (PcAlCl) compared to a classical system as the conventional liposome and their photodynamic activity in glioblastoma cells line (U87MG) and melanoma cells line (B16F10). The formulations showed suitable characteristics such as reproducibility, particle size, short and long-term stability and deformity for their use as drug delivery for PcAlCl. For the photophysical studies: absorption, fluorescence, fluorescence quantum yield (?F), fluorescence lifetime (?) and quantum yield of singlet oxygen (??) of PcAlCl in ethanol and incorporated in the formulations demonstrated that the incorporation was able to improve its photophysical characteristics. In in vitro studies, the drug delivery systems showed no cytotoxicity in the absence of light, but demonstrated increased in PcAlCl photodynamic activity up to 80% over the PcAlCl free when irradiated. All formulations showed characteristics, which cooperates with the use of these drug delivery systems for, increased the PcAlCl photodynamic activity for glioblastoma and melanoma treatment
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Cardoso, Ana Carolina Ferreira. "Modulação da expressão de galectina-3 frente às pressões seletivas de pH e oxigenação: um mecanismo para a heterogeneidade intratumoral?" Universidade de São Paulo, 2014. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/5/5155/tde-25112014-124037/.
Full textAbstract:
A heterogeneidade intratumoral é um fenômeno extremamente importante para entender a progressão tumoral e a resposta à intervenção terapêutica. A galectina-3 pertence à família das lectinas, possuem a função de reconhecimento e ligação à ?-galactosídeos ramificados de glicolipídeos e glicoproteínas, e está envolvida em processos fisiológicos e patológicos como o câncer. Nesse trabalho, a heterogeneidade intratumoral em relação à expressão de galectina-3 foi observada em amostras de diferentes lesões melanocíticas de pacientes. Além disso, o inóculo de células de melanoma murino negativas para galectina-3 em animais gal3-/- gerou tumores constituídos por uma fração de células tumorais que passaram a expressar de novo galectina-3, sugerindo que pressões do microambiente tumoral modulam a expressão dessa lectina em melanomas. A acidose extracelular atuou como regulador negativo de galectina-3 in vitro, diminuindo a expressão dessa lectina tanto em células de melanoma murino e humano quanto em melanócito murino. Entretanto, a hipóxia, seja pela exposição aguda ou intermitente, não alterou a expressão in vitro de galectina-3 em células de melanoma humano. Por fim, tumores originados pelo inóculo de células tumorais positivas e negativas para galectina-3 (mimetizando tumores heterogêneos) obtiveram a maior taxa de crescimento tumoral comparados aos tumores constituídos por uma única população de células, seja positiva ou negativa para galectina-3. Portanto, foram apresentadas evidências de que a heterogeneidade intratumoral em relação à galectina-3 parece estar envolvida com o sucesso evolutivo do melanoma e que a acidose é indicada como uma das pressões microambientais que contribuem para o estabelecimento e manutenção da fração de células tumorais negativas para galectina-3 dentro da massa tumoralThe intratumoral heterogeneity observed in human tumors is extremely important to understand tumor progression and its therapeutic response. Galectin-3 belongs to animal lectin family and it is a ?-galactosidase binding protein which is involved in physiological and pathological processes, including cancer. In this work, an intratumor heterogeneous galectin-3 expression was observed in tissue sessions containing different human melanocytic lesions. Moreover, negative galectin-3 murine cells injected into gal3-/- mice were able to generate tumors composed of a positive galectin-3 cell fraction, suggesting that selective forces in tumor microenvironment modulate galectin-3 expression in melanoma. Extracellular acidosis acts as a negative regulator to galectin-3 in vitro, decreasing its expression in murine and human melanoma cells and even in murine melanocytes. However, intermittent or acute hypoxia exposure did not alter galectin-3 expression in human melanoma cells in vitro. In addition, tumors originated from a mixture of positive and negative galectin-3 cells (mimicking heterogeneous tumors) showed higher growth rate compared to those derived from only galectin-3 positive or negative cells. Therefore, we showed evidences that galectin-3 intratumoral heterogeneity seems to be involved with the evolutionary success of melanoma and that acidosis may be the microenvironmental pressure responsible for the establishment and maintenance of galectin-3 negative cell fraction into the tumor bulk
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Teixeira, Tarso Felipe. "Melanomas melânicos e amelânicos da cavidade bucal de cães: aspectos epidemiológicos, morfológicos e moleculares." Universidade de São Paulo, 2011. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/10/10133/tde-19102012-082041/.
Full textAbstract:
Melanoma é uma neoplasia maligna com comportamento agressivo considerado o câncer mais comum da cavidade bucal de cães. Ele pode ser classificado quanto a morfologia celular em epitelióide, fusiforme e misto ou quanto ao fenótipo: melânico ou amelânico. Estudos têm sugerido que os melanomas amelânicos são mais agressivos. O objetivo deste estudo foi avaliar o comportamento dos melanomas da cavidade bucal dos cães, quantificando a expressão das Cx26 e 43, caderina-E, MMPs 2 e 9 e proliferação celular. Para tanto foram coletados 25 melanomas provenientes de cães atendidos no HOVET FMVZ-USP (16 melânicos e 9 amelânicos). Após a cirurgia os animais foram acompanhados até a morte, sendo que 5 animais foram eutanasiados (2 antes da cirurgia e 3 após o procedimento cirúrgico, devido ao sofrimento físico). Os tumores eram diagnosticados através do histopatológico e classificados de acordo com OMS (1998). Para confirmação dos melanomas amelânicos foi utilizado à técnica de imuno-histoquímica com o perfil de anticorpos pré-estabelecidos. A proliferação celular foi quantificada através do uso de PCNA, índice apoptótico e caspase-3. O comportamento tumoral foi avaliado através da técnica de imuno-histoquímica para caderina-E e MMPs 2 e 9. E a expressão das Cxs foram avaliadas através da imunofluorescência e western blot. Cães com melanma amelânico apresentaram menor sobrevida, com aumento do número de metástase, fraca marcação para caderina-E e alta intensidade para as MMPs 2 e 9, aumento de células positivas para PCNA e índice mitótico, e diminuição da caspase-3, não havendo diferença significante quanto aos tipos histotógicos. Houve diminuição de expressão das Cxs entre os amelânicos, no entanto, aumento da síntese do gene de CX 26 entre o mesmo grupo, o que se verificou através do PCR em Tempo Real. Nossos achados sugerem que os melanomas da cavidade bucal de cães apresentam um comportamento mais agressivoMelanoma is a malignant neoplasm with aggressive behavior considered the most common cancer of the buccal cavity in dogs. It can be classified as cell morphology in epithelioid, spindle and mixed or on the phenotype, in melanotic or amelanotic. Studies have suggested that amelanotic melanomas are more aggressive. The aim of this study was to evaluate the behavior of melanoma of the buccal cavity of dogs, quantifying the expression of Connexins 26 and 43, E-cadherin, MMPs 2 and 9 and cell proliferation. For both melanomas were collected from 25 dogs attended at HOVET FMVZ (USP) (16 melanotic and 9 amelanotic melanomas). After the surgery, the animals were followed until death, so 5 animals were euthanized (2 before surgery and 3 after surgery, due to physical suffering). The tumors were diagnosed by histopathology and classified according to WHO (1998). For confirmation of amelanotic melanomas it was used the technique of immune-histochemistry with the antibody profile pre-established. Cell proliferation was quantified by using PCNA, apoptotic index and caspase-3. The tumor behavior was evaluated using the technique of immune-histochemistry for E-cadherin and MMPs 2 and 9. And the expression of Cxs was evaluated by immune-fluorescence and western blot. Dogs with amelanotic melanoma had lower survival with increasing number of metastatic, weak immunoreactivity for E-cadherin and high intensity for MMP 2 and 9, an increase of cells positive for PCNA and mitotic index, and decreased caspase-3, no significant difference in the morphologic subtypes. There was a decrease of expression of Cxs between amelanotic, however, increased synthesis of CX 26 gene among the same group, which was verified by real time PCR. Our findings suggest that melanomas of the buccal cavity of dogs exhibited more aggressive behavior.
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Silva, Rodrigo Ribeiro da. "O gene KIAA0090 é ativado em lesão pré-neoplásica e seu silenciamento por siRNA causa morte celular em linhagem de melanoma." Universidade de São Paulo, 2010. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17136/tde-19072010-111704/.
Full textAbstract:
O gene KIAA0090, encontrado em todos os genomas eucariotos, está localizado em uma região cromossômica (1p36.13) com alta freqüência de aberrações em tumores humanos. Além disso, os perfis de expressão disponíveis em bancos de dados públicos sugerem expressão alterada deste gene em muitos tumores e em resposta a diferentes tratamentos. Os objetivos deste trabalho foram investigar a possível ocorrência de múltiplos transcritos do gene KIAA0090 em linhagens celulares de melanoma humano; avaliar o padrão de expressão do gene em diferentes linhagens celulares e amostras de tumores, por RT-PCR tempo-real; e analisar o efeito do knockdown deste gene sobre a viabilidade de células de melanoma. O transcrito que observamos estar expresso em linhagem de células de melanoma parece corresponder à RefSeq completa. Observamos aumento da expressão do gene KIAA0090 em todas as linhagens celulares de melanoma humano em comparação com melanócitos. Curiosamente, entretanto, observou-se expressão significativamente maior em amostras de nevos (média = 11,02) em relação a melanoma primário (média = 2,87) ou metastático (média = 2,72) (p <0,01). Não houve diferença significativa entre melanoma primário e metastático. O tratamento de células de melanoma, com um inibidor da metilação do DNA (5-Aza-2\'-desoxicitidina) e/ou desacetilação de histonas (tricostatina A) levou a um aumento da expressão KIAA0090, sugerindo que eventos epigenéticos possam estar envolvidos na modulação da expressão do gene KIAA0090. Não houve diferenças significativas nos níveis de expressão do mRNA KIAA0090 entre substância branca e glioblastoma, embora tenhamos observado uma discreta redução na taxa de sobrevida associada com maiores níveis de mRNA KIAA0090 em glioblastomas, em estudo envolvendo amostras de 28 pacientes. Interessante que esta observação é compatível com dados de estudos de expressão gênica em larga escala onde se constata uma correlação direta entre superexpressão de KIAA0090 e menor probabilidade de sobrevida em pacientes com glioblastoma (dados de 216 pacientes analisados - https://cma.nci.nih.gov/cma-tcga/). Em 31 amostras de pacientes com leucemia linfóide aguda não conseguimos encontrar qualquer relação entre a expressão do gene KIAA0090 e idade do paciente, sexo, contagem de leucócitos, risco, imunofenótipo e resposta clínica do paciente. Knockdown do gene KIAA0090 induziu morte celular em linhagem de melanoma metastático, e esta parece ser uma morte celular por apoptose, já que as células inviáveis são positivas para Anexina V. Os dados obtidos, assim como os dados depositados em bancos de dados, confirmam alteração na expressão do gene KIAA0090 durante a progressão tumoral. Lesões pré-neoplásicas como nevos já apresentam alteração na expressão do gene em estudo, comparável com o que ocorre para oncogenes como BRAF. Assim como para outras moléculas envolvidas nas vias UPR e ERAD, knockdown do gene induz morte celular do tipo apoptótica. Portanto o gene KIAA0090 parece ser muito importante em ajudar a manter a capacidade tumorigênica das células em ambientes não favoráveis.The KIAA0090 gene, which has been found in all eukaryotic genomes and is predicted to encode a highly conserved transmembrane protein, maps to a chromosomal region (1p36.13) with frequent aberrations in some human tumors. In addition, publicly available expression data suggest altered expression of this gene associated with many tumors and treatments. The goals of this work were to search for the occurrence of multiple KIAA0090 transcripts in melanoma cell lines; determine the gene expression pattern in different cell lines and tumor types by real time RT-PCR; and analyze the gene knockdown effect on melanoma cell viability. The transcript that we found to be expressed in melanoma cell line seems to correspond to RefSeq transcript. In melanoma, increased KIAA0090 expression was found in all human melanoma cell lines in comparison to melanocytes. Interestingly, however, we observed significantly higher expression of KIAA0090 in nevi samples (mean value = 11,02) as compared to primary (mean value = 2,87) or metastatic (mean value = 2,72) melanoma groups (p<0,01), although there was no significant difference between primary and metastatic melanoma. Treatment of melanoma cells with an inhibitor of DNA methylation (5-Aza-2\'- deoxycytidine) and /or deacetylation of histones (Trichostatin A) leads to an enhancement of KIAA0090 expression, supporting the hypothesis that epigenetic events may be involved in modulating KIAA0090 gene expression. On the other hand, no significant differences in the KIAA0090 mRNA expression levels were observed between white matter and glioblastoma samples, although we found slightly lower survival rates associated with high levels of KIAA0090 mRNA in glioblastomas in a study involving 28 patient samples. Interestingly, this was compatible with database of large scale gene expression studies, which have shown a direct correlation between KIAA0090 up-regulation and low survival rates in patients with glioblastoma (216 patients data analized - https://cma.nci.nih.gov/cma-tcga/). In 31 samples from Acute Lymphocytic Leukemia patients, we could not find any relationship between the KIAA0090 gene expression and patient age, sex, white blood cell count, risk, immunophenotype, response and patient\'s current situation. KIAA0090 knockdown led to an increase of cell death rate in a melanoma cell line, and since unviable cells are Annexin V positive, we postulate that they undergo apoptotic death. The data obtained, and the ones deposited in databases, confirms changes in expression of KIAA0090 during tumor progression. Pre-neoplasic lesions such as nevi already have changes in KIAA0090 expression, comparable to oncogene BRAF. As for other molecules involved in the UPR and ERAD pathways, KIAA0090 knockdown induces apoptotic cell death. Therefore, KIAA0090 gene seems to be very important in helping maintain the tumorigenic ability of cells in not suitable environments.
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Sá, Daniel Coelho de. "Análise da expressão do inflamassoma em melanoma cutâneo e nevo melanocítico." Universidade de São Paulo, 2018. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/5/5133/tde-24102018-125931/.
Full textAbstract:
A resposta inflamatória está envolvida em muitos aspectos da biologia do câncer. O inflamassoma é um complexo multiprotéico intracelular compostos por três elementos: um receptor de reconhecimento de padrões moleculares (PRR), uma proteína ligadora ASC (proteína speck-like associada à apoptose com domínio de recrutamento de caspase) e o zimogênio pró-caspase-1. A ativação da caspase-1 é responsável pela síntese de IL-18 e, principalmente, de IL-1?. A ativação da caspase-1 é ainda capaz de induzir a piroptose, um tipo de morte celular inflamatória. O papel dos inflamassomas no câncer ainda é mal definido, devido às suas funções contrastantes na oncogênese, variando a depender do tipo de tecido e do estágio da tumorigênese em que são ativados. Estudos recentes mostraram uma ativação do inflamassoma à medida que o melanoma progride. Avaliamos a expressão de componentes do inflamassoma, incluindo dois tipos de PRR (NLRP1 e NLRP3), da enzima caspase-1, e da IL-1beta em neoplasias melanocíticas benignas e malignas, por meio de técnica de imunohistoquímica. Foram analisadas amostras de tecidos embebidos em parafina de 25 pacientes com melanoma (16 melanomas finos e 9 melanomas intermediários-espessos) e 22 pacientes com nevo melanocítico (12 nevos intradérmicos e 10 nevos displásicos). Todas as amostras de pele foram recuperadas dos arquivos do Departamento de Dermatologia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo. Evidenciamos uma maior expressão de NLRP1, NLRP3 e caspase-1 nos melanomas quando comparados aos nevos. Não houve diferença estatisticamente significativa quanto a expressão de IL-1beta entre os grupos. De forma inesperada, a descoberta mais interessante foi uma maior expressão de NLRP1 em melanomas finos do que nos tumores mais espessos. Esses achados sugerem que um aumento de NLRP1 poderia representar um evento promotor na transformação de melanócitos, mas que não estaria envolvido na progressão tumoral. Estudos adicionais são necessários para esclarecer esta complexa relação entre as proliferações melanocíticas e o inflamassomaInflammatory response is involved in many aspects of cancer biology. Inflammasomes are a group of cytosolic multiprotein complexes, classically consisting of an upstream sensor protein of the NOD-like receptor (NLR) family, the adaptor protein ASC, and the downstream effector caspase-1. Its activation leads to the production of biologically active IL-1beta and IL-18, and consequently contributing to the inflammatory process. Caspase-1 activation can also induce pyroptotic cell death, that is accompanied by the release of cytosolic contents to the extracellular space eliciting local inflammation. The roles of the inflammasomes in cancer are still ill defined, due to their contrasting roles in oncogenesis. Recent studies have shown an activation of the inflammosome as melanoma progresses. We evaluated the expression of inflamassome components (NLRP1, NLRP3, caspase-1) and of IL-1beta in melanocytic neoplasms, by immunohistochemistry. Formalin-fixed, paraffin-embedded tissue samples from 25 patients with melanoma (16 thin melanomas and 9 intermediate-thick melanomas), and 22 patients with melanocytic nevus (12 intradermal nevi and 10 dysplastic nevi) were analyzed. All skin samples were retrieved from the files of the Department of Dermatology at Clinics Hospital of Faculty of Medicine, University of São Paulo. Comparing all nevi with all melanomas, we found a higher expression of NLRP1, NLRP3 and caspase-1 in melanomas. There was no difference of IL-1beta expression between the groups. For the first time, to our knowledge, we reported an increasing expression of NLRP1 in melanoma compared to melanocytic nevus. Unexpectantly, NLRP1 expression resulted augmented NLRP1 in thin melanomas compared with intermediate-thick melanomas. These data may suggest a role of NLRP1 in oncogenesis, but that its expression decreases as disease progresses. We can hypothesize that an increase of NLRP1 could represent a promoter event in melanocyte transformation, but it does not be involved in tumour progression. The association between nevus, melanoma and inflammasomes seems to be complex and further studies are necessary to clarify this
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Maria, Andrea Gutierrez. "Papel do receptor B1 de cininas no desenvolvimento de melanoma murino." Universidade de São Paulo, 2011. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17131/tde-06012016-162046/.
Full textAbstract:
O melanoma malígno está entre os cânceres que mais têm aumentado nas últimas décadas representando um grande desafio terapêutico. Quando diagnosticado precocemente, as chances de cura por excisão cirúrgica com margens de segurança adequadas são altas. Entretanto, casos avançados de melanoma são resistentes às formas atuais de terapia; assim, um dos maiores desafios para a pesquisa em melanoma é a identificação de alvos moleculares para o desenvolvimento de novas estratégias de tratamento. A capacidade de impedir o desenvolvimento de um tumor depende do melhor entendimento das vias celulares e moleculares que operam no microambiente tumoral. Uma inflamação crônica e persistente contribui para o desenvolvimento do câncer, e mesmo tumores que não são epidemiologicamente ligados a patógenos, são caracterizados pela presença de componentes inflamatórios em seu microambiente. O Sistema Calicreínas-Cininas (SCC) é responsável por uma série de efeitos biológicos, como vasodilatação, modulação da dor e inflamação, contração/relaxamento da musculatura lisa e efeitos sobre a proliferação celular. A participação do receptor B1 de cininas é bem relacionada a processos inflamatórios; contudo, a relação entre o SCC e câncer ainda é pouco descrita na literatura. Com relação ao melanoma, não existem na literatura, estudos que relacionam a participação do SCC e essa patologia. Portanto, a identificação de mecanismos genéticos e de vias de sinalização que levam à formação e progressão tumoral é de extrema importância para um desenho racional de terapias. Assim, o objetivo desse trabalho foi estudar a participação do receptor B1 de cininas no desenvolvimento de melanoma. Primeiramente realizou-se ensaios in vitro com células de melanoma murino, B16F10, verificando-se a presença dos componentes do SCC nesta linhagem celular, bem como a capacidade de migração das células quando estimuladas com o agonista e antagonista do receptor B1. Posteriormente, induziu-se melanoma em animais selvagens e knockout para o receptor B1 e verificou-se expressão de citocinas, vias de proliferação e apoptose e vascularização nesses tumores a partir técnicas de PCR, western blotting e análise histológica. Observou-se que células B16F10 estimuladas com o agonista do receptor B1, diminuem a capacidade de migração. Tumores desenvolvidos em animais knockout para o receptor B1, possuem uma menor expressão gênica desse receptor quando comparados com tumores desenvolvidos em animais selvagens e apresentam vias de proliferação celular mais ativadas, além de uma vascularização irregular. Considerando esses resultados, sugerimos que o receptor B1 de cininas contribui para o impedimento da progressão tumoral, podendo, futuramente, ser um alvo terapêutico para o tratamento de melanoma.Malignant melanoma is between the cancer types that most have been increased in the last decades, representing a therapeutic challenge. When it is early detected, chances of cure through surgical excisions with secure margins are high. However, advanced cases of melanoma are resistant to all types of therapies; thus, one of the most challenges for research in melanoma is the identification of molecular targets to further develop new strategies of treatment. The ability to blockade the development of a tumor depends on a better understanding of cellular and molecular pathways that operate in the tumor microenvironment. A chronic and persistent inflammation contributes to cancer development, and, even tumors that are not epidemiologically linked to pathogens present inflammatory components in their microenvironment. The Kallicrein-Kinin System (KKS) is responsible for several biological effects, like, vasodilatation, modulation of pain and inflammation, contraction/relaxation of smooth muscles and cell proliferation. The kinin B1 receptor is well related to inflammatory processes, however, the involvement of the KKS in cancer development is, yet, not well described in the literature. Regarding to melanoma, studies relating the involvement of the KKS in melanoma development is still not available. This way, identification of genetic mechanisms and signaling pathways that drive melanoma formation and progression is extremely important for designing rational therapies in the future. Thus, the aim of this study was evaluate the participation of the kinin B1 receptor in melanoma progression. First, in vitro assays with murine melanoma cells, B16F10, were performed to verify the presence of the KKS components in this cell lineage, as well as the capacity of migration when these cells are stimulated with the B1 receptor agonist and antagonist. Then, melanoma was induced in wild type and B1 receptor knockout mice and the expression of cytokines, proliferation and apoptosis pathways and vascularization were studied by PCR, western blotting and histological analyses. We observed that B16F10 cells stimulated with the B1 receptor agonist had their capacity of migration decreased. Tumors developed in B1 receptor knockout mice showed a lower expression of this gene comparing to the tumors developed in wild type animals, also presenting higher activation of proliferation pathways and abnormal vessels. Considering these results, we suggest that the kinin B1 receptor contributes to blockade, at least in part, the tumor progression which can, in the future, become a therapeutic target for melanoma treatment.
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Ribeiro, Aline Hunger. "Transferência gênica de p19Arf e interferon-b em células de melanoma." Universidade de São Paulo, 2011. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/87/87131/tde-10022012-143841/.
Full textAbstract:
O melanoma maligno é uma forma de câncer com alto índice de morte devido, em parte, à falta de tratamentos eficazes e à sua tendência de formar metástases. Nosso grupo tem desenvolvido vetores virais para a transferência gênica de fatores anti-tumorais e, inicialmente, foi construído um vetor adenoviral, AdPG, no qual a expressão do transgene é controlada por p53, um supressor de tumor e fator de transcrição. Sendo que aproximadamente 90% dos casos de melanoma retêm p53 selvagem, foi proposto que isto pudesse ser utilizado como uma ferramenta para dirigir a expressão do transgene codificado pelo vetor AdPG, um mecanismo apoiado por resultados anteriores de nosso grupo. Por exemplo, a transdução de células B16 (melanoma de camundongo, p53-selvagem, deleção de p19Arf) com vetores AdPG portadores de p19Arf ou interferon-b (IFNb) resultou em morte celular maciça enquanto a transferência de apenas um destes fatores isolados não causou o mesmo efeito. O trabalho descrito aqui inclui dois avanços tecnológicos críticos em comparação com trabalhos anteriores do grupo. Primeiramente, os transgenes de interesse (eGFP, p19Arf e IFNb) foram inseridos num vetor adenoviral que apresenta o tripetídeo RGD na sua proteína fibra. Essa modificação no vetor permite a eficiente transdução de um amplo espectro de células alvos sem a dependência do receptor viral do adenovírus selvagem, CAR. Além disso, foi construído um vetor bicistrônico, que contém a combinação de ambos os genes terapêuticos, como forma de garantir a transferência dos dois fatores ao mesmo tempo para as células-alvo. A inclusão de p19Arf, um supressor de tumor e inibidor de MDM2, como um gene terapêutico deve complementar as atividades do p53 celular endógeno e, como consequência, atuar na promoção da expressão a partir do vetor e também na inibição da proliferação das células tumorais. Porém, a transferência de p19Arf sozinho acarretaria efeito somente nas células que foram transduzidas e, então, seu efeito seria limitado. Por este motivo, descreve-se, além do p19Arf, a utilização de IFNb, uma proteína secretada com funções anti-tumorais, incluindo inibição de angiogênese, indução de apoptose e ativação da resposta imunológica. A estratégia do projeto contemplou vários níveis relacionados ao mecanismo do processo de transferência, incluindo a eficiência da transdução, o mecanismo de controle da expressão dos transgenes e as atividades dos transgenes. Assim, foi proposto que a combinação de p19Arf e IFNb pudesse ser uma estratégia interessante para induzir morte no tumor primário e uma resposta imunológica contra as células metastáticas. Com este projeto, foi iniciada a construção destes novos vetores aprimorados para transferência gênica nas células de melanoma.Malignant melanoma is a type of cancer with high death rates, in part, because of a lack of efficient treatments and its tendency to generate metastases. Our group has developed viral vectors for the gene transfer of anticancer factors and, initially, we constructed an adenoviral vector, AdPG, in which transgene expression is controlled by p53, a tumor suppressor and transcription factor. As 90% of melanoma cases maintain wild-type p53, it was proposed that this could be used as a tool to drive transgene expression encoded by the AdPG vector, as evidenced by previous studies from our group. For example, transduction of B16 cells (mouse melanoma, wild-type p53, p19Arf-null) with vectors encoding p19Arf or interferon-b (IFNb) resulted in massive death cell, while transfer of just one of these factors alone did not cause the same effect. The work described here includes two critical technologic advances in comparison with our previous work. First, transgenes of interest (eGFP, p19Arf and IFNb) were inserted into an adenoviral vector which presents the RGD tripeptide in its fiber. This vector modification allows efficient transduction in a wide range of target cells without dependence on the wild type adenovirus receptor, CAR. In addition, a bicistronic vector was constructed which contains the combination of both therapeutic genes, ensuring the transfer of both factors to the target cells at the same time. Use of p19Arf, a tumor suppressor and MDM2 inhibitor, as a therapeutic gene should complement endogenous p53 activities and, as a consequence, promote expression from the AdPG vector and inhibit tumor cell proliferation. However, p19Arf gene transfer alone should have an effect only in transduced cells and, therefore, its effect would be limited. For this reason, we describe, in addition to p19Arf, the application IFNb, a secreted protein with antitumor functions, including inhibition of angiogenesis, induction of apoptosis and activation of immunologic response. This strategy involves several mechanistic levels related with the gene transfer process, including transduction efficiency, control over transgene expression and transgene activity. Therefore, it was proposed that the combination of p19Arf and IFNb could be an interesting strategy to induce primary tumor death and an immunologic response against metastatic cells. In this project, the construction of new vectors optimized for gene transfer in melanoma cells was initiated.
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Sekimoto, Larissa Satiko Alcantara. "Avaliação da terapia fotodinâmica em cultivo celular tridimensional de melanoma humano." Universidade de São Paulo, 2016. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/76/76132/tde-02052016-104216/.
Full textAbstract:
O melanoma representa 4% dos tipos de neoplasias cutâneas e causa 79% de morte por doenças de pele no mundo. Um dos grandes problemas relacionados ao tratamento de melanoma advém da sua resistência às terapias convencionais e, assim, a terapia fotodinâmica surgiu como uma alternativa terapêutica promissora, devido ao seu papel no tratamento de diversos tipos de câncer, além de outras doenças de pele. Ela é baseada no acúmulo seletivo de uma molécula fotoativa no tecido alvo, seguida da iluminação por uma fonte de luz, cujo comprimento de onda é específico para a excitação dessa molécula, ocasionando no dano celular. Neste estudo, foram realizados experimentos in vitro investigando a resposta fotodinâmica em melanoma humano, através de um modelo de tumor tridimensional por levitação magnética. Inicialmente, um protocolo de obtenção dos tumores de melanoma foi desenvolvido para avaliação da terapia em diferentes doses de luz e concentrações de fotossensibilizador. Em seguida, ensaios de cinética e quantificação intracelular com dois fotossensibilizadores, Photogem® e Photodithazine®, também foram feitos com o intuito de averiguar a sua distribuição, bem como tempo de internalização nos tumores. Tendo estabelecido que a incubação por 16 horas com Photodithazine® foi o parâmetro experimental mais adequado, a terapia fotodinâmica foi realizada, em sessão única, com irradiação em 660 nm em tumores de duas diferentes espessuras. Logo, testes de citotoxicidade foram utilizados para comparar os resultados de ambas as condições, onde se notou que o aumento na espessura atenuou o dano oxidativo decorrente da terapia. Além disso, foi observado que o acréscimo na dose de luz não acarretou em mudanças muito significativas na morte celular. No entanto, o maior dano celular, de aproximadamente 90% de morte, foi obtido com 100 μg/mL de Photodithazine® e iluminação com 60 J/cm², resultando na desagregação dos tumores, efeitos promissores da terapia no melanoma. Uma possível alternativa sugerida para aprimorar a eficiência fotodinâmica, seria a aplicação de mais sessões de terapia fotodinâmica, uma vez que os experimentos realizados nesse trabalho foram com uma sessão e, esse procedimento, poderia ocasionar em maior morte celular.Melanoma accounts for 4% of skin cancers and causes 79% of death from skin diseases worldwide. A major problem associated with melanoma treatment is due to its increasingly resistance to conventional therapies. Thus, photodynamic therapy has emerged as a promising alternative modality to several types of cancer and other skin disorders. It generally involves the selective accumulation of a photoactive molecule in target tissue, followed by illumination with light source of an appropriate wavelength, to excite this molecule, resulting in cell damage. This study sought to investigate the photodynamic response in human melanoma, through a three dimensional tumor model by magnetic levitation. Initially, a protocol to obtain melanoma tumors was developed, to evaluate the therapy at different doses of light and photosensitizer concentrations. Posteriorly, kinetic assays and intracellular quantification with two photosensitizers, Photogem® and Photodithazine®, were also carried out in order to ascertain its distribution, as well as time internalization in tumors. Having established that incubation for 16 hours with Photodithazine® was the most suitable experimental parameter, photodynamic therapy was performed in a single session, with irradiation of 660 nm in two tumors, different in thicknesses. Therefore, cytotoxicity tests were used to compare the results of both conditions, where it was noted that the increased tumor depth may attenuate oxidative damage, induced by the therapy. Furthermore, it was observed that the increase in light dose did not result in significant changes in cell death. Nevertheless, the greater cell damage, approximately 90% kill was obtained with 100 ug/mL Photodithazine® and illumination with 60 J / cm², causing tumor breakdown, which is a promising effect in melanoma therapy. An alternative suggested to enhance the photodynamic efficiency, would be to apply more sessions of photodynamic therapy, so this procedure could result in increased cell death.
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Ono, Bruno Andrade. "Avaliação da resposta fotodinâmica em células de melanoma murino utilizando Photodithazine." Universidade de São Paulo, 2016. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/76/76132/tde-02052016-104501/.
Full textAbstract:
A terapia fotodinâmica é uma técnica que vem sendo aprimorada para o tratamento de cânceres e infecções e seu efeito terapêutico consiste na geração de espécies reativas de oxigênio que causam danos irreversíveis às células, levando-as a morte. Ela é considerada menos invasiva que outros tratamentos, podendo ser repetida diversas vezes e utilizada em conjunto com outros tratamentos sem o comprometimento do paciente. Um dos focos da terapia fotodinâmica é o tratamento de cânceres de pele melanoma devido a localização superficial das lesões e a elevada taxa de letalidade que a doença ocasiona, esta alta taxa esta relacionada a formação de tumores secundários em outras regiões do corpo que dificulta a cura. Neste trabalho buscou-se entender a interação do fotossensibilizador de segunda geração, Photodithazine, com as células de melanoma murino de linhagem B16F10. Foram analisadas a captação celular e a co-localização intracelular deste fotossensibilizador através da marcação de componentes celulares em microscopia confocal. Ensaios de viabilidade celular foram realizados para obtenção das concentrações menos citotóxicas sem e com luz, utilizando o teste de MTT. Foi realizada a caracterização do tempo de vida médio fluorescência do fotossensibilzador durante a terapia fotodinâmica em microscópio FLIM (fluorescence lifetime imaging microscopy). Os resultados indicaram que um maior tempo de incubação no escuro causa maior citotoxicidade para as concentrações acima de 0,1 mg/mL de Photodithazine. Os ensaios de terapia fotodinâmica apresentaram redução de mais de 90% de viabilidade celular para baixas concentrações de Photodithazine®, utilizando fluências acima de 2J/cm2. O tempo de vida médio de fluorescência do Photodithazine livre em solução apresentou tempo de 3,75 ns e quando ligado às células de 4,63 ns, durante a terapia fotodinâmica o tempo de vida médio de fluorescência apresentou alteração de aproximadamente 0,2 ns. Através do cálculo de coeficientes de correlação, foi observado a alta co-localização em mitocôndrias.Photodynamic therapy is a technique manly applied in the treatment of cancers and infections. The principal compound of this therapy is the reactive oxygen species generated that react and damage various cellular components, causing cell death. Photodynamic therapy is considered minimally invasive and can be repeated several times without compromising the patient. One of the main focuses of photodynamic therapy is threatment of melanoma skin cancer due to it is superficial location of the lesions and also because the disease has a high rate of mortality, caused by the formation of secondary tumors elsewhere in the body that makes it difficult to cure. In this study, murine melanoma cells were studied in monolayer model using Photodithazine, a photosensitizer of second generation. Cellular uptake and intracellular co-localization of the photosensitizer was observed by labeling cellular components that were analyzed by confocal microscopy. Cell viability assays were performed to obtain the cytotoxic concentrations in the dark, using the MTT test. Using the less cytotoxic concentrations, photodynamic therapy trials was performed to obtain the cytotoxic fluences. Finally, the average lifetime fluorescence of photosensitizer was measured to characterize the photodynamic therapy in FLIM (fluorescence lifetime imaging microscopy). The results indicated that longer dark incubation cause greater cytotoxicity at the concentrations above 0.1 mg/mL of Photodithazine. Thereby the results of photodynamic therapy experiments observed the decreasing from over 90% cell viability at low concentrations of Photodithazine using fluences above 2 J/cm2. The average fluorescence lifetime of the free Photodithazine solution was 3.75 ns and cell-bound 4.63 ns, during the photodynamic therapy the average lifetime fluorescence changed approximately 0.2 ns. By calculating correlation coefficients, the high colocalization was observed in mitochondria.
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Giavina-Bianchi, Mara Huffenbaecher. "Análise da expressão da proteína NY-ESO-1 no melanoma cutâneo." Universidade de São Paulo, 2016. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/5/5133/tde-20062016-111434/.
Full textAbstract:
INTRODUÇÃO: o câncer é a doença que mais mata pessoas com idade abaixo de 85 anos e é um problema de saúde pública. Os tumores podem expressar em determinada fase de seu desenvolvimento proteínas anômalas que podem ser alvo de métodos diagnósticos e de intervenções terapêuticas. A expressão de NY-ESO-1 é detectada em 20 a 40% dos melanomas. Há evidências que esta expressão é mais freqüente em tumores de estágios mais avançados e está associada a um pior prognóstico. OBJETIVOS: determinar a frequência de expressão da proteína NY-ESO-1 no melanoma cutâneo e tentar correlacioná-la com o índice de Breslow, aspectos histopatológicos do melanoma, incluindo o infiltrado linfocítico tumoral, e a morbi-mortalidade dos pacientes. MÉTODOS: o presente estudo é longitudinal de coorte retrospectiva e foi realizado de agosto de 2009 a outubro de 2015. Foram selecionados 89 melanomas de 87 pacientes do Ambulatório de Tumores do Departamento de Dermatologia da FMUSP, divididos em 3 grupos, sendo: grupo 1: 34 melanomas com índice de Breslow <= 1,0 mm; grupo 2: 29 melanomas com índice de Breslow entre 1,1 - 4,0 mm e grupo 3: 26 melanomas com índice de Breslow >= 4,0 mm. As lâminas dos exames anátomo-patológicos destes pacientes foram revisadas quanto ao diagnóstico de melanoma, seu índice de Breslow e a presença de infiltrado linfocítico tumoral. A seguir, realizou-se exame de imunohistoquímica para a determinação da presença do antígeno NY-ESO-1 em todos os 89 tumores coletados e em mais 20 nevos (11 displásicos e 9 intradérmicos) escolhidos ao acaso. Através da revisão dos dados do prontuário, foram obtidos os dados clínicos de: idade, sexo, raça, fototipo da pele, local de aparecimento do melanoma, status do linfonodo sentinela quando realizado, desenvolvimento de metástases e sobrevida dos pacientes. Os dados anátomo-patológicos do tumor analisados foram: tipo histológico, presença de ulceração, e tipo de infiltrado linfocítico tumoral. Nos melanomas que apresentavam infiltrado linfocítico tumoral, foram realizados testes imunohistoquímicos para pesquisa de células CD3+, CD8+, FoxP3+ e CD8+FoxP3+ (duplamente positivas). RESULTADOS: O antígeno NY-ESO-1 esteve presente em 19% dos melanomas cutâneos primários e não foi detectado em nenhum dos 20 nevos pesquisados. A expressão do antígeno NY-ESO-1 esteve estatisticamente relacionada a tumores com espessuras maiores. Apresentou também uma associação inversa com o tipo extensivo superficial em relação aos outros tipos histológicos. O infiltrado linfocítico tumoral dos melanomas NY-ESO-1 positivos continha menor número de células CD3+, que se encontravam isoladas ou arranjadas em pequenos grupos de até 5 células, o que contrastava significantemente com os tumores NY-ESO-1 negativos, com maior densidade de células CD3+, dispostas em grandes grupos, com 6 ou mais células. A expressão da proteína NY-ESO-1 não esteve associada à idade, ao sexo, ao fototipo, ao sítio primário do tumor, à presença de ulceração, ao status do linfonodo sentinela, ao desenvolvimento de metástases ou à sobrevida. CONCLUSÕES: Há expressão de NY-ESO-1 em uma porcentagem considerável dos melanomas, principalmente nos mais espessos. O menor número de células CD3+ no infiltrado linfocítico tumoral, acrescido ao fato destas células estarem isoladas ou em pequenos grupos, sugere que embora imunogênico, a expressão do antígeno NY-ESO-1 não resulta num estímulo eficaz do sistema imune no combate ao tumor. O desenvolvimento de uma vacina para estes pacientes poderá, no futuro, aumentar as possibilidades terapêuticas do melanomaINTRODUCTION: cancer is the disease that leads to the greatest number of deaths in people over 85 years old and it has become a major public health problem. Tumors may express aberrantly proteins during certain phases of their development, which can be target for diagnostic or treatment purposes. NY-ESO-1 is detected in 20 to 40% of melanomas. There is evidence that it is more frequent in advanced stages and that is associated with a worse prognosis. OBJECTIVES: to determine the frequency of NY-ESO-1 protein expression in cutaneous melanoma and to try to correlate it to Breslow index, melanoma histopathological aspects, including the tumor infiltrating lymphocytes, and patients morbi-mortality. METHODS: the present study is longitudinal of retrospective cohort. The research was carried on from August 2009 to October 2015. Eighty nine melanomas were selected from 87 patients in Oncology Outpatient Clinic, Dermatology Division, University of São Paulo and divided in 3 groups, such as: group 1: 34 melanomas with Breslow index <= 1,0 mm; group 2: 29 melanomas with Breslow index between 1,1 - 4,0 mm e group 3: 26 melanomas with Breslow index >= 4,0 mm. All specimens were reviewed for diagnostic, Breslow index and tumor infiltrating lymphocytes. After that, immunohistoquimical test for the presence of NY-ESO-1 antigen was performed in all 89 melanomas collected and in 20 nevi (11 dysplastic nevi and 9 dermal nevi) that were randomly chosen. By reviewing clinical charts, the following data was obtained: age, sex, skin phototype, site of the tumor, lymph node sentinel status, development of metastases and survival of the patients. The histological data analyzed was: histological melanoma type, presence of ulceration, grade of tumor infiltrating lymphocytes. In those melanomas that had tumor infiltrating lymphocytes, we performed immunohistoquimical tests for the presence of CD3+, CD8+, FoxP3+ and CD8+FoxP3+ (double positive) cells. RESULTS: antigen NY-ESO-1 was present in 19% of primary cutaneous melanomas and none of the 20 nevi. The expression of antigen NY-ESO-1 was statistically related to thicker melanomas. It presented also an inverse association with superficial spreading melanoma type compared to other subtypes. Tumor infiltrating lymphocytes of NY-ESO-1 positive melanomas had fewer CD3+ cells, that were isolated or arranged in small groups up to 5 cells, which was significantly different from tumors NY-ESO-1 negatives, with higher density of CD3+ cells, displayed in large groups of 6 or more cells. The expression of NY-ESO-1 protein was not associated to age, sex, phototype, site, ulceration, lymph node sentinel status, development of metastases and survival. CONCLUSIONS: A considerable amount of melanomas express NY-ESO-1, mainly thicker tumors. The fewer number of CD3+ cells in the tumor infiltrating lymphocytes, added to the fact of those cells being isolated or in small groups suggest that, although immunogenic, the expression of NY-ESO-1 antigen does not result in a efficient stimulus of the immune system to fight the tumor. The development of a vaccine to those patients may, in the future, enhance the roll of therapeutic possibilities for melanoma
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Biteghe, Fleury Augustin Nsole. "Comparison of the therapeutic efficacy of SNAP-tag fusion protein and the synergistic actions of chemotherapy and photodynamic therapy in killing resistant melanoma." Doctoral thesis, Faculty of Health Sciences, 2019. http://hdl.handle.net/11427/30430.
Full textAbstract:
Cutaneous melanoma is the deadliest form of skin cancer, which arises from epidermal pigment-producing cells called melanocytes. In melanoma, surgical excision of primary nonmetastatic tumor remains the gold standard of therapy worldwide. Upon metastases, melanoma becomes highly resistant to conventional radio-and chemotherapy. Chemotherapy, using dacarbazine (DTIC), remains the standard treatment option. In melanoma, chemotherapy failure has partly been attributed to a resistant population which is endowed with higher clonogenic potential, and aberrant expression of membrane proteins known as ABC transporters (ABCB5 and ABCG2), which mediate cellular resistance by extruding cytotoxic molecules from cells. To palliate these adverse effects, this study primarily aimed to investigate the efficacy of the synergistic actions of chemotherapy (Dacarbazine:DTIC) and hypericin-activated photodynamic therapy (HYP-PDT) in reducing chemoresistance in DTIC resistant (UCT Mel1DTICR2) and non-resistant melanoma cells (UCT Mel-1). To achieve these goals, the therapeutic efficacy of conventional therapies (DTIC, HYP-PDT and DTIC+HYP-PDT) was evaluated based on their ability to reduce cell viability; therapeutic resistant subpopulations; clonogenicity and ABC transporters (ABCB5 and ABCG2) in both melanoma cells. Additionally, the ability of the therapeutic treatments to efficiently halt cell division and activating cell death mechanisms, was assessed using cell cycle analysis and an Annexin-V assay. The results obtained showed that combination therapy was the most efficient therapy which was associated with a reduction in main populations (therapeutic resistant sub-population not expressing ABC transporters: MP), and clonogenic capacity in both melanoma cell types. Similarly, DTIC displayed a therapeutic efficacy which significantly reduced side populations (therapeutic resistant sub-population which were expressing ABC transporters: SP), and clonogenicity in UCT Mel-1 only. Interestingly, both ABCG2 and ABCB5 expressions were significantly increased in both melanoma cells, post combination therapy. Lastly, combination therapy and PDT were equally shown to induce a G1 cell cycle arrest, as opposed to DTIC which induced an S phase arrest. These cell cycle arrests were associated with efficient activation of apoptosis and necrosis, depending on the melanoma cell type, post HYP-PDT and combination therapy. Nevertheless, the efficacy of DTIC and HYP-PDT might respectively be limited by off target effects harming normal cells and low dosage in tumour cells which limiting their clinical utility. To address these challenges, this study aimed to develop a targeted tumor therapy, using the self-labelling activity of SNAP-tag fusion protein to conjugate synthetic small molecule lead substance toxin such as monomethyl Auristatin F (MMAF or AURIF). This cytotoxic payload was delivered to targeted cells, through genetic fusion of SNAP-tag to three different single chain fragments of an antibody (scFv1711, LsFv49 and scFv#34), which specifically treated tumor cells expressing epidermal growth factor (EGFR), melanotransferrin (p97) orfibroblast activation protein alpha (FAP-α) receptors, respectively. Achievement of this targeted therapy was performed through construction of three scFv-SNAP fusion proteins, which were expressed in HEK 293T cells. Thereafter, the purified scFv-SNAP fusion proteins were conjugated to BG-substrates to investigate their efficacy in specifically killing tumor cells. Binding and cytotoxic activities of the scFv-SNAP fusion proteins were performed using flow cytometry, and the XTT cell viability assay. All scFv-SNAP-fusion proteins were specifically bound to their target cells, indicating that AURIF conjugation did not compromise the binding activity of scFv-SNAP fusions. Finally, the cytotoxic assay confirmed that all scFv-SNAPAURIF conjugates induced a 50 percent reduction in cell viability at nanomolar concentrations in targeted cells which expressed their cognate antigens. To conclude, combination therapy was shown to be more efficient than monotherapies in killing chemoresistant melanoma cells, while SNAP-tag technology provided a superior, targeted therapeutic efficacy by sparing normal cells from unwanted toxic effects, and reducing the therapeutic requirement for high concentration of cytotoxic payloads.
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Bellé, Luziane Potrich. "Ação da proteína amiloide sérica A em melanomas." Universidade de São Paulo, 2015. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/9/9136/tde-01072015-104739/.
Full textAbstract:
Concentrações séricas basais da proteína amiloide sérica A (SAA) estão significativamente aumentadas em pacientes com câncer e alguns autores sugerem uma relação causal. Trabalho anterior do grupo mostrou que a SAA induz a proliferação de duas linhagens de glioblastoma humano e afeta os processos de invasividade in vitro, sustentando um papel pró-tumoral para esta proteína. Com base nesse trabalho, investigamos a abrangência dos efeitos de SAA para outro tipo de célula tumoral e para isso escolhemos um painel de linhagens de melanoma humano e uma linhagem primária obtida a partir de aspirado de linfonodo de paciente com melanoma, por nós isolada. Observamos que apesar da célula precursora de melanomas, isto é, melanócito, não produzir SAA, todas as linhagens de melanoma produziram a proteína e expressaram alguns dos seus receptores. Além disso, quando estas células foram estimuladas com SAA houve uma inibição da proliferação em tempos curtos de exposição (48 horas) e efeitos citotóxicos após um tempo maior (7 dias). A SAA também afetou processos de invasividade e a produção das citocinas IL-6, IL-8 e TNF-α. Aos avaliarmos o efeito da SAA na interação das células de melanoma com células do sistema imune, vimos que a SAA ativou uma resposta imune anti-tumoral aumentando a expressão de moléculas co-estumolatórias, como CD69 e HLA-DR, e sua função citotóxica. Ainda, vimos que a produção de TNF-α, IFN-γ, IL-10, IL-1β e IL-8 estimuladas por SAA podem contribuir com os efeitos desta. De forma geral estes resultados nos levam a crer que a SAA tem atividade anti-tumoral em melanomas. Finalizando, com base na importância do desenvolvimento da resistência às terapias atuais para o melanoma, observamos que em células resistentes ao PLX4032, um inibidor de BRAF, os efeitos imunomodulatórios induzidos pela SAA estão abolidos, possivelmente identificando um novo componente da resistência.Basal serum concentrations of the protein serum amyloid A are significantly increased in cancer patients and some authors suggest a causal relationship. Previous work of our research group showed that SAA induces proliferation of two cell lines of human glioblastoma and affects invasiveness processes in vitro, supporting a pro-tumor role for this protein. Based on this work, we investigated the extent of SAA effects to another type of tumor cell and we chose a panel of human melanoma cell lines and primary line obtained from a patient with melanoma by lymph node aspirate. Melanoma cells were isolated by us. We observed that while the precursor cells of melanoma, melanocytes, do not produce SAA, all melanoma cell lines expressed the protein and produced some of their receptors. Moreover, when these cells were stimulated with SAA there was an inhibition of proliferation in short exposure times (48 hours) and cytotoxic effects after a longer period (7 days). SAA also affected invasive procedures and the production of the cytokines IL-6, IL-8 and TNF-α. To evaluate the SAA effect in the interaction of melanoma cells with immune system cells, we found that SAA activated an anti-tumor immune response by increasing the expression of co-estimulatory molecules such as CD69 and HLA-DR, and their cytotoxic function. Furthermore, we found that the production of TNF-α, IFN-γ, IL-10, IL-1β and IL-8 stimulated by SAA can contribute to this effect. In general these results lead us to believe that the SAA has anti-tumor activity in melanomas. Finally, based on the importance of the resistance development to current therapies for melanoma we observed that in cells resistant to PLX4032, a BRAF inhibitor, the immunomodulatory effects induced by SAA are abolished, possibly identifying a new resistance component.
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Brohem, Carla Abdo. "Mecanismo de ação do 4-nerolidilcatecol na indução da morte celular e contenção da invasão em linhagens de melanoma humano e modelo de pele artificial." Universidade de São Paulo, 2010. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/9/9136/tde-03092010-151856/.
Full textAbstract:
O melanoma é a forma mais mortal de câncer de pele, origina-se de células produtoras de pigmentos, os melanócitos. Esses podem ser cutâneos ou não-cutâneos (encontrados no revestimento da membrana coróide do olho, nas meninges, e nos tratos gastrintestinal e geniturinário). O aumento da incidência de melanomas malignos nas últimas décadas, e sua alta taxa de mortalidade e grande resistência a maior parte das terapias, tem sido um enorme desafio para a comunidade científica. Particularmente, a falta de habilidade de indução à morte por apoptose em resposta à quimioterapia e outros estímulos externos permitem uma vantagem seletiva para progressão tumoral, formação de metástase e resistência à terapia em melanomas. O estresse oxidativo e espécies reativas de oxigênio (EROs) vêm sendo, há muito tempo, reconhecidos como importantes desencadeadores e moduladores da apoptose. Porém o exato papel do estresse oxidativo no processo apoptótico ainda é uma questão de debate. Antioxidantes tendem a possuir propriedades regulatórias de tradução de sinais que devem ou não estar ligadas as suas capacidades de inativar oxidantes. Porém em certas condições, um forte ambiente oxidante onde há falta de suporte para regenerar (reduzir) antioxidantes oxidados, permite que alguns antioxidantes assumam características de um pró-oxidante. Foi demonstrada a capacidade citotóxica de um potente antioxidante, 4-nerolidilcatecol (4-NC), extraído da planta Pothomorphe umbellata L. Miq, sobre linhagens tumorais de melanoma e sobre fibroblastos humanos normais. Esse composto foi capaz de induzir a parada do ciclo celular em G1, bem como diminuir a atividade de MMPs e em outras linhagens de melanoma foi capaz de induzir a morte celular por apoptose. Estudos subseqüentes mostraram que o mecanismo de ação deste composto inicia-se com a formação e acúmulo de EROs, além da inibição da enzima catalase. O 4-NC foi capaz de induzir a morte por apoptose via mitocondrial, aumentando os níveis das proteínas p53, Noxa, Mcl-1, clivando Bax e Bid e induzindo a clivagem das caspases 3 e 9. Além disso, em modelo de pele artificial contendo melanoma, o 4-NC foi capaz de conter a invasão do melanoma para a estrutura dérmica da pele reconstituída. Foram utilizadas como controle de diferenciação as proteínas Queratina 10 e 14, Involucrina e, como marcador do melanoma, a proteína S100. Parte desta invasão é contida devido à inibição da ativação das MMP-2 e -9 e ativação de TIMP-2 pelo 4-NC. Sendo assim, esse composto se mostra como um potencial quimioterápico no tratamento do melanoma humano.Melanoma is the most agressive form of skin cancer, it arises from the pigment-producing cells, melanocytes. These may be cutaneous or non-cutaneous (found in the lining membrane of the eye choroid, the meninges, and gastrointestinal and genitourinary tracts). The increased incidence of malignant melanomas in recent decades, its high mortality rate and high resistance to most therapies has been a major challenge to the scientific community. It\'s particularly difficult to induce cell death by apoptosis in response to chemotherapy and other external stimuli, which may provide a selective advantage for tumor progression, metastasis formation and resistance to therapy in melanoma. Oxidative stress and reactive oxygen species (ROS) have been recognized for a long time as important triggers and modulators of apoptosis, but the exact role of oxidative stress in the apoptotic process is still a matter of discussion. Antioxidants tend to possess properties to regulate transduction signals that may not be related to their ability to inactivate oxidants. Under certain conditions, in a strong oxidizing environment where there is lack of support to regenerate (reduce) oxidized antioxidants, some antioxidants can assume characteristics of pro-oxidant. The 4-nerolidylcatechol (4-NC) is a potent antioxidant that is extracted from the plant Pothomorphe umbellata L. Miq. Its citotoxic potential has been demonstrated on melanoma tumor cell lines and on normal human fibroblasts. This compound was able to induce cell cycle arrest in G1, decrease the activity of MMPs and cell death by apoptosis. Subsequent studies showed that the mechanism of action of this compound starts with the formation and accumulation of ROS, and inhibition of the enzyme catalase. The 4-NC was able to induce apoptosis via mitochondria, increasing the levels of p53, Noxa, Mcl1, cleaving Bax and Bid and inducing cleavage of caspases 3 and 9. Furthermore, in a model of artificial skin containing melanoma 4-NC was able to contain the invasion of melanoma to the dermal part of the skin. Proteins keratin 10 and 14, involucrin and S100 were used as control of differentiation. Part of this invasion is restrained due to TIMP-2 activation and the inhibition of MMP-2 and -9 activation by 4-NC. Concluding, this compound can be used as a potential chemotherapeutic agent in the treatment of human melanoma.
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Almeida, Andreia de Araujo. "Estudo comparativo da fotoxicidade das protoporfirinas IX endógena e sintética e seus fotoprodutos contra células malígnas." Universidade de São Paulo, 2011. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/59/59135/tde-01052011-153055/.
Full textAbstract:
A protoporfirina IX (PpIX) ocupa um lugar especial entre a família das porfirinas devido ao seu importante papel na natureza e diversas aplicações, inclusive em terapia fotodinâmica. Sob ação da luz visível, a PpIX transforma-se em fotoprodutos que podem ser citotóxicos ou fotocitotóxicos, e isto pode, de um lado, aumentar a eficiência do tratamento e, por outro lado, apresentar toxicidade no escuro, prejudicando o paciente. Como as características da sua fototransformação dependem do ambiente onde elas se encontram, tornam-se importantes os estudos dos efeitos do ambiente nas características da sua fototransformação. As propriedades espectroscópicas da PpIX sintética e endógena, extraída das glândulas harderianas de ratos da espécie Rattus novergicus albinus, e seus fotoprodutos e a atividade citotóxica foram estudadas no escuro e sob ação da luz visível em uma cultura de células malignas, em comparação com Photogem® e a porfirina TPPS4. A localização das protoporfirinas e seus fotoprodutos dentro da estrutura celular também foram observadas. Foi notado que existe uma diferença entre os espectros de absorção e fluorescência das PpIX endógena e sintética e também de seus fotoprodutos, e do grau de sua fototransformação. Associou-se estes efeitos à diferença do ambiente onde as porfirinas se encontravam, devido a interação da PpIX endógena e de seu fotoproduto com compostos celulares que poderiam estar presentes depois da purificação da PpIX obtida da glândula. A fotocitotoxicidade das PpIX sintética e endógena foram comparáveis. Os fotoprodutos, tanto da PpIX sintética quanto endógena não apresentaram fotocitotoxicidade ou mostraram fotocitotoxicidade menor do que a das porfirinas, resultado contrário ao encontrado na literatura. Em relação ao padrão Photogem®, as protoporfirinas apresentaram uma fotocitotoxicidade comparável a ele, mas uma citotoxicidade no escuro maior. A TPPS4 demonstrou tanto uma fototoxicidade, como uma citotoxicidade no escuro menor que o Photogem®. Da análise da distribuição intracelular das porfirinas PpIX e seus fotoprodutos com a de marcadores padrões de estruturas celulares, pode ser concluído que eles não penetraram no núcleo da célula, e sua distribuição nas demais partes do citoplasma foi difusa, sem nenhuma localização preferencial.The protoporphyrin IX (PpIX) occupies a special place among the porphyrins family due their important role in nature and several applications, including Photodynamic Therapy. Under the action of visible light, PpIX becomes photoproducts that can be cytotoxic or photocytotoxic and these effects can, on one hand, increase the treatment efficiency and, on the other hand, be toxic in the dark, harming the patient. Since the characteristics of its phototransformation depend on the environment where they are finding, studies of the effects of environment on the characteristics of its phototransformation are important. The spectroscopic properties and cytotoxic activity were studied in the dark and under visible light action of synthetic and endogenous PpIX, extracted from mice harderian gland of the Rattus novergicus albinus species and its photoproducts, in a culture of malignant cells, compared with Photogem® and TPPS4 porphyrin. The cellular localization of protoporphyrin and its photoproducts inside cellular structure also were observed. It was observed that there is a difference between the fluorescence and absorption spectra of synthetic and endogenous PpIX and between its photoproducts and also the degree of its phototransformation. These effects can be linked to the difference of the environment where the porphyrins were, due the interaction of endogenous PpIX and its photoproducts with cellular components that could be present after purification of PpIX obtained from the gland. The photocytotoxic of synthetic and endogenous PpIX were comparable. The photoproducts of both synthetic and endogenous PpIX showed no photocytotoxic or were smaller than of porphyrins, a contrary result to that it was found in the literature. In relation to pattern composite Photogem®, the protoporphyrin showed a photocytotoxic comparable to it, but protoporphyrin a higher cytotoxicity in the dark. The TPPS4 demonstrated both a lower phototoxicity as a cytotoxicity in the dark than Photogem®. From analysis of intracellular distribution of the porphyrin PpIX and its photoproducts with markers patterns of cellular structures, may be concluded that they did not penetrate into the cell nucleus and its distribution in other parts of the cytoplasm was diffuse, without preferential location.
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Reis, Eduardo Guidi Francisco dos. "Protocolos de implementação e avaliação dos tratamentos de braquiterapia oftálmica com rutênio-106 em um hospital geral." Universidade de São Paulo, 2017. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17159/tde-10042018-120404/.
Full textAbstract:
A Braquiterapia oftálmica utiliza radionuclídeos, como o Rutênio-106 no tratamento de melanomas uveais e outras neoplasias oculares. Para realização desse procedimento é necessária uma interação da equipe multidisciplinar principalmente entre a Oftalmologia, Oncologia, Radioterapia, Física Médica e Enfermagem, envolvendo estrutura física e profissionais qualificados para garantir os processos e resultados do procedimento. Este estudo tem o objetivo de avaliar os primeiros tratamentos de braquiterapia oftálmica com Rutênio-106 e também estabelecer protocolos e processos para implementação da técnica em um Hospital Geral. Os resultados obtidos para os primeiros 11 casos tratados entre 2015 e 2017, sendo 10 melanomas e 1 hemangioma, evidenciaram baixa toxicidade aguda. Foram analisados 5 pacientes com seguimento de 5 a 13 meses. Houve regressão da lesão em todos os pacientes, com média de 28% no ápice e 12% na base no período de até 12 meses, sendo observado uma regressão progressiva durante o período de avaliação. Os protocolos foram utilizados e validados durante todas as etapas do tratamento. O uso do Ru-106 mostra-se alternativa viável no tratamento de lesões oculares, sendo primordial a capacitação e integração da equipe e seguimento de protocolos para o êxito do tratamento.Ophthalmic Brachytherapy uses radionuclides, such as Ruthenium-106 in the treatment of uveal melanomas and other ocular tumors. For this procedure is necessary a multidisciplinary interaction between Ophthalmology, Oncology, Radiotherapy, Medical Physics and Nursing, involving physical structure and qualified professionals to guarantee the processes and results of the procedure. This study aims to evaluate the first ophthalmic brachytherapy treatments with ruthenium- 106 and also to establish protocols and processes for the implementation of this service in a General Hospital. The results obtained for the first 11 cases treated between 2015 and 2017, being 10 melanomas and 1 hemangioma, showed low acute toxicity. Five patients were followed up for 5 to 13 months. There was regression of the lesion in all of these patients, with a mean of 28% at the apex and 12% at the base in the period close to 1 year, with a progressive regression during the evaluation period. The protocols were used and validated during all stages of treatment. The use of 106-Ru is a viable alternative in the treatment of ocular tumors, being the team qualification and the correct follow-up of the protocols crucial for the treatment success.
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Fernandes, Débora Kristina Alves. "Avaliação do potencial de superação da quimioresistência do melanoma aos inibidores de BRAFV600E (Vemurafenibe) e de MEK (Trametinibe) utilizando terapia combinatória com 4-nerolidilcatecol (4-NC)." Universidade de São Paulo, 2018. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/9/9142/tde-04072018-125441/.
Full textAbstract:
Embora o melanoma represente apenas 4% das neoplasias malignas da pele, é considerado a mais grave por ser altamente etal. Em virtude da via MAPK (Mitogen activated protein kinase) estar intimamente ligada ao descontrole da proliferação celular, especialmente em melanoma, esta via se tornou um alvo para o desenvolvimento de terapias direcionadas a oncogenes, como os potentes quimioterápicos Vemurafenibe (inibidor da mutação V600E em BRAF - BRAFV600E) e Trametinibe (inibidor de MEK). Cada vez mais, melhores taxas de respostas vêm sendo alcançadas com os novos medicamentos, porém a maioria dos pacientes está sujeita a recidivas após 7 meses de tratamento devido ao desenvolvimento de quimioresistência, justificando a constante busca por novos compostos terapêuticos. Dados de nosso laboratório indicam que 4-nerolidilcatecol (4-NC) induz aumento na expressão de p53, produção de ROS e dano ao DNA, culminando em apoptose dependente de caspase-3 em células de melanoma por ser um inibidor proteassomal. Além disto, o 4-nerolidilcatecol (4- NC) demonstrou efeito inibitório na proliferação de células de melanoma em modelo de cultura organotípica de pele. Desta forma, este projeto visa avaliar a possibilidade de superação da quimioresistência aos inibidores de BRAF e de MEK, utilizando terapias combinatórias com 4-NC em células de melanoma humano resistentes a estes inibidores. Primeiramente, linhagens celulares de melanoma resistentes aos inibidores de BRAF (R) e BRAF/MEK (DR) foram geradas a partir de células parentais BRAF mutadas (P) e caracterizadas por MTT, microscopia de fluorescência e western blotting. Estas células foram submetidas ao tratamento com 4-NC que apresentou citotoxicidade na concentração de 30µM, inibição de formação de colônias e diminuição na invasão em modelos in vitro de culturas 2D e 3D em todas as linhagens estudadas (P, R e DR). O 4-NC foi ainda capaz de induzir estresse de retículo endoplasmático com indução de apoptose. Visando a explorar o efeito terapêutico in vivo do 4-NC, outro estudo foi conduzido em animais submetidos a enxerto xenográfico com células parentais de melanoma NRAS mutadas. Após desenvolvimento do tumor, os animais foram tratados 3 vezes por semana durante 3 semanas com 4-NC (10 mg/kg) por via i.p. O 4-NC foi capaz de inibir em até 4 vezes o crescimento dos tumores xenográficos (4/10) quando comparado com os controles, com remissão completa do tumor em um animal. A expressão de p53 e PARP clivada foi aumentada nos tumores dos animais tratados, sugerindo apoptose. A expressão gênica de MMP2 e MMP14 estava diminuída nas mesmas amostras, demonstrando o papel do 4-NC na inibição da invasão do melanoma in vivo. Finalmente, a toxicidade sistêmica do 4-NC foi avaliada nas mesmas doses empregadas no ensaio in vivo de tumorigênese. A baixa toxicidade observada nos ensaios toxicológicos com tratamentos sub-crônicos com 4-NC e a citotoxicidade demonstrada em modelos xenográficos nos leva a considerar este composto como promissor para estudos futuros e sua aplicação no tratamento do melanoma cutâneo humano, incluindo pacientes resistentes aos inibidores de BRAF e MEK.Melanoma accounts for only 4% of malignant neoplasms of the skin, but is considered the most serious because it is highly deadly. Because the MAPK (Mitogen activated protein kinase) pathway is closely linked to the lack of control of cell proliferation, especially in melanoma, this pathway has become a target for the development of oncogene-targeted therapies, such as the potent chemotherapeutic agents Vemurafenib (V600E mutation inhibitor in BRAF - BRAFV600E) and Trametinib (MEK inhibitor). Increasingly, better response rates have been achieved with the new drugs, but most patients are subject to relapses after 7 months of treatment due to several mechanisms, which justify the constant search for new therapeutic compounds. Data from our laboratory indicate that 4-nerolidylcatechol (4-NC) induces increased p53 expression, ROS production and DNA damage, culminating in caspase-3 dependent apoptosis in melanoma cells. The 4-NC compound demonstrated an inhibitory effect on melanoma cell proliferation in an organotypic skin culture model. Thus, this project aims to evaluate the possibility of overcoming the existing chemoresistance to BRAF and MEK inhibitors, using 4-NC combinatory therapies in human melanoma cells resistant to these inhibitors. Firstly, melanoma cell lines resistant to BRAF (R) and BRAF / MEK (DR) inhibitors were generated from naive cells mutated BRAF (N) and characterized by MTT, fluorescence microscopy and western blotting. These cells were submitted to 4-NC treatment that showed cytotoxicity with 30 µM, inhibition of colony formation and decrease in invasion in 2D and 3D in vitro models in all cell line studied (N, R and DR). Furthermore, 4-NC was able to induce endoplasmic reticulum stress with apoptosis induction. In order to explore the in vivo therapeutic effect of 4-NC, an additional study was conducted using xenograft model with NRAS-mutated melanoma cell line. After tumor development, the animals were treated 3 times per week for 3 weeks with 4-NC (10 mg / kg) by i.p. injection. 4-NC was able to inhibit up to 4- fold the growth of xenograft tumors (4/10) when compared to controls, with complete tumor remission in one animal. Cleaved PARP and p53 expression were increased in the tumors of treated animals, suggesting apoptosis. MMP2 and MMP14 gene expression were decreased in the same samples, demonstrating the role of 4-NC in inhibiting melanoma invasion in vivo. Finally, the systemic toxicity of 4-NC was evaluated at the same doses employed in the in vivo tumorigenesis assay. The low toxicity observed in the toxicological assays with sub-chronic 4- NC treatments and the demonstrated cytotoxicity in xenograft models leads us to consider this compound as promising for future studies and its application in the treatment of cutaneous human melanoma, including patients resistants to BRAF and MEK inhibitors.
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Teixeira, Veronica Rodrigues. "Mecanismos associados à perda de expressão do gene de galectina-3 em um modelo de progressão de melanoma murino." Universidade de São Paulo, 2007. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/5/5155/tde-20062007-145547/.
Full textAbstract:
Galectina-3 é uma lectina animal que apresenta afinidade por b- galactosídeos e que tem sido associada à progressão tumoral e metástase. A expressão de galectina-3 encontra-se alterada durante a progressão tumoral de diferentes neoplasias. Em tumores como carcinoma de tiróide e bexiga a expressão de galectina-3 encontra-se aumentada, enquanto que em tumores como carcinoma de mama e ovário a expressão desta lectina encontra-se diminuída. Neste trabalho nós utilizamos um modelo de progressão tumoral de melanoma murino para investigar os mecanismos envolvidos na perda de expressão de galectina-3. Este modelo é composto por uma linhagem de melanócitos imortalizados (melan-a) e duas linhagens de melanoma de crescimento vertical (Tm1 e Tm5) estabelecidas após submeter a linhagem melan-a a inúmeros ciclos de de-adesão. Enquanto melan-a acumula grandes quantidades de galectina-3, as linhagens Tm1 e Tm5 deixaram de expressar o gene de galectina-3. Análise da região 5\' do gene de galectina-3 demonstrou que esta região apresentava grande conteúdo de dinucleotídeos CpG e vários sítios SP1. O seqüenciamento desta região após tratamento do DNA com bissulfito de sódio mostrou que esta região estava totalmente metilada nas linhagens Tm1 e Tm5 e desmetilada na linhagem melan-a. O tratamento da linhagem Tm1 com 5-Aza-2\'-deoxicitidina (5-Aza-CdR), um inibidor da DNA metiltransferase, provocou um decréscimo significativo nos níveis de metilação da região 5\' do gene de galectina-3 que por sua vez levou a re-expressão do RNAm e da proteína. O tratamento de Tm1 com os inibidores de histono deacetilases tricostatina A e 4-ácido-fenilbutírico em combinação com 5-Aza-CdR não aumentou os níveis de expressão do gene de galectina-3 e curiosamente, reverteu o efeito induzido por 5-Aza-CdR. Em adição, a expressão da enzima DNMT1 apresentou um discreto aumento nas linhagens Tm1 e Tm5 em relação a melan-a. Em conjunto esses resultados sugerem que mecanismos epigenéticos como a metilação estão envolvidos no controle de expressão do gene de galectina- 3 ao longo da progressão tumoral de melanoma murino.Galectin-3 is a b-galactoside-binding animal lectin, shown to be involved in tumor progression and metastasis. Galectin-3 expression has been found altered along tumor progression of different tumors. In some types of cancers such as thyroid carcinoma and bladder carcinoma, galectin-3 expression has been found increased, whereas in tumors such as breast carcinoma and ovary carcinoma the expression of this lectin has been found decreased along tumor progression. In this study, we have used a murine melanoma model to investigate the mechanisms responsible for the loss of galectin-3 gene expression. This model consists of a cell line of immortalized melanocytes (melan-a) and two cell lines of vertical growth phase melanoma (Tm1 and Tm5) established after submitting melan-a cells to several deadhesion cycles. While melan-a expressed high amounts of galectin-3, both Tm1 and Tm5 cells lost galectin-3 gene expression. Analysis of the 5\' upstream region of the galectin-3 gene demonstrated the presence of a high CpG content and several SP1 binding sites. Bisulfite sequencing of this region showed that it was fully methylated in Tm1 and Tm5 cells and unmethylated in melan-a cells. Treatment of Tm1 cells with 5-aza-2\'-deoxycytidine (5-Aza-CdR), a DNA methyltransferase inhibitor, led to a marked decrease in the methylation levels of the 5\' upstream region of the galectin-3 gene, which led to transcription of the galectin-3 gene. Treatment of Tm1 cells with the histone-deacetylase inhibitors trichostatin A and 4- acid-phenilbutyrate in combination with 5-Aza-CdR did not increase the levels of galectin-3 gene expression and intriguingly, reverted the effect of 5-Aza-CdR alone. In addition, the expression of DNMT1 showed a modest, but significant increase in Tm1 and Tm5 cells as compared with melan-a cells. Altogether these results indicate that epigenetic mechanisms such as methylation play a role in the regulation of the galectin-3 gene expression along murine melanoma progression.
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Araujo, Luiza Ferreira de. "Estudo do metabolismo energético com base na instabilidade do genoma mitocondrial no melanoma." Universidade de São Paulo, 2017. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17135/tde-23042018-153436/.
Full textAbstract:
Estudos recentes relataram oncogenes induzindo a reprogramação metabólica no câncer. Essa reprogramação é fundamental para que as células cancerosas tenham nutrientes e biomoléculas suficiente para manter sua alta taxa proliferativa. A mitocôndria tem um papel central no metabolismo energético da célula e alterações no seu genoma, tanto em relação a mutações como em número de cópias, já foram bastante observados em vários tipos tumorais. Além disso, deficiência no fator de transcrição mitocondrial A (TFAM), fundamental para a transcrição e estabilidade do mtDNA, já foi associada com o crescimento tumoral. Diante disso, nosso estudo teve como objetivo avaliar o papel da instabilidade do genoma mitocondrial no metabolismo energético e crescimento do melanoma. Para isso, nós medimos a instabilidade do mtDNA utilizando como parâmetros: o acúmulo de mutações no mtDNA, alterações no mtDNAcn e a expressão do TFAM. O impacto da instabilidade do mtDNA foi avaliado em três modelos diferentes de melanoma: um modelo in vitro de linhagens celulares, dados de expressão gênica de tumores de melanoma metastático proveniente do TCGA e um modelo murino induzível de melanoma (BrafV600E/Ptennull), adicionado a um background alternativo de deficiência para o TFAM/mtDNAcn. Esse modelo murino também nos permitiu avaliar a deficiência do TFAM limitada a células tumorais (Tfamflox) e tanto em células tumorais, como no seu microambiente (Tfam+/-). Nas análises in vitro, nós observamos correlações positivas entre o mtDNAcn e a expressão do TFAM com a taxa de consumo de glicose e produção de ATP, indicando um impacto desses parâmetros na bioenergética celular. Análises de expressão gênica, utilizando tanto as linhagens de melanoma como tumores de melanoma metastático, nos sugeriram que o TFAM regula genes indutores de angiogênese, a resposta imunológica humoral e vias metabólicas de aminoácidos. Nas análises in vivo, nós observamos um aumento dos tumores em camundongos Tfam+/-, indicando que a deficiência de TFAM/mtDNAcn em células tumorais e no seu microambiente induz a tumorigênese, o que confirma os dados de expressão gênica encontrados com linhagens e tecido de melanoma. Além disso, análises de metabolômica e transcriptômica combinadas nos sugeriram que as células de melanoma com deficiência no TFAM/mtDNAcn são mais dependentes do metabolismo de glutamina. Diante disso, nós concluímos que a deficiência do TFAM/mtDNAcn tem um papel importante no crescimento do melanoma, induzindo a expressão de genes pro-tumorigênicos e aumentando o consumo da glutamina para suprir as necessidades proliferativas das células cancerosas. Esses dados são relevantes e podem nos ajudar a entender melhor o papel da mitocondrial na progressão do melanoma.Recent studies have shown many oncogenes triggering metabolic reprogramming in cancer. The metabolic switch in cancer cells is necessary to supply the high demand for nutrients and biomolecules for proliferative cells. In this context, mitochondria play a central role in the energetic metabolism of the cell and changes in its genome, such as an increased load of mutations and alterations in mtDNA content, have been reported in several cancers. In addition, deficiency in the Mitochondrial Transcription Factor A (TFAM), responsible for transcription and maintenance of mtDNA stability, was previously associated with tumor growth. Based on that, our goal was to evaluate the impact of the mitochondrial genome instability in the energetic metabolism and melanoma growth. mtDNA instability was inferred measuring mtDNA mutations load and content, as well as TFAM expression. Its impact was evaluated in three different melanoma models: an in vitro model using melanoma cell lines, gene expression data from metastatic melanoma tumors, publicly available at TCGA, and an inducible murine model of melanoma (BRAFV600E/PTENnull), crossed onto different TFAMdeficient backgrounds. The murine model also provides us a tractable model to examine the consequences of mtDNA instability limited to cancer cells (Tfamflox) and in both cancer cells and tumor microenvironment (Tfam+/-). In vitro analysis showed us a positive correlation between mtDNA copy number (mtDNAcn) and TFAM expression with glucose consumption and ATP production, pointing an impact of these parameters in cellular bioenergetics. Further gene expression analysis, using both cell lines and metastatic melanoma data, suggested that TFAM could regulate the expression of angiogenesis genes, humoral immunity and amino acid metabolism. In vivo analysis confirmed the gene expression data, and revealed a higher melanoma growth in Tfam+/-. Also, combined metabolomics and transcriptomics data suggested that TFAM/mtDNAcn deficient melanoma cells rely mostly on glutamine metabolism to supply their energetic requirements. In conclusion, these data indicate that TFAM/mtDNAcn influences melanoma growth by triggering pro-tumorigenic signals and inducing metabolic reprogramming towards glutamine metabolism. These results are relevant and might help us understand how mitochondria affect melanoma progression.
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Silva, Mariane Borges da. "Efeitos dos fatores tumorais derivados do melanoma canino na geração e maturação de células dendríticas caninas: estudo in vitro." Universidade de São Paulo, 2015. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/10/10133/tde-04092015-160659/.
Full textAbstract:
Os cães são afetados por doenças inflamatórias e neoplásicas que compartilham diversas similaridades com as desordens em humanos, assim seu estudo representa um importante modelo animal para as condições humanas. As células dendríticas (DCs) representam a população mais potente de células apresentadoras de antígenos. As DCs representam também um novo alvo promissor de imunoterapia em cães; no entanto o uso terapêutico de DC caninas é restrito, dentre outros fatores, devido a falta de padronização nas técnicas de isolamento e limitado numero de informações específicas da espécie a esse respeito. Este projeto tem por finalidade avaliar a geração de células dendríticas caninas geradas in vitro e ativadas por diferentes estímulos biológicos na presença e ausência de extrato tumoral de melanoma canino. Os resultados demonstraram que as DCs caninas geradas na presença de extrato tumoral em grandes concentrações apresentavam atividade funcional semelhante as DCs madurasDogs are affected by inflammatory and neoplastic diseases that share many similarities with the disorders in humans, so their study is an important animal model for the human condition. Dendritic cells (DCs) are the most potent population of antigen presenting cells. DCs also represent a promising new target for immunotherapy in dogs; However, the therapeutic use of canine DC is restricted among others factors due to lack of standardization in isolation techniques and limited number of species-specific information in this regard. This project aims to assess the generation of canine dendritic cells generated in vitro and activated by different biological stimuli in the presence and absence of tumor extract of canine melanoma. The results showed that the canine DCs generated in the presence of high concentrations tumor extract showed similar functional activity of mature DCs
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Neyra, Jennifer Eliana Montoya. "Modulação dos efeitos citotóxicos dos vemurafenibe pela cloroquina em células de melanoma maligno G-361: papel da dermicidina." Universidade de São Paulo, 2017. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/42/42136/tde-30012018-101101/.
Full textAbstract:
Neste estudo foram avaliados os efeitos farmacológicos do vemurafenibe (inibidor BRAFV600E) e da cloroquina (inibidor de autofagia) na viabilidade celular e crescimento tumoral das sublinhagens de melanoma:G361 pLKO que expressa dermicidina e G361 IBC I com silenciamento da expressão. As células G-361 responderam a vemurafenibe (2 μM) e cloroquina (100 μM), isoladamente ou combinadas, com aumento apoptose, e redução das taxas de senescência. Vemurafenibe (50 mg/kg / 21 dias) inibiu o crescimento tumoral em camundongos imunodeficientes independente da expressão da DCD. A combinação com Cloroquina (30 mg/kg) a cada 24 horas, acelerou, enquanto a cada 72 horas, reduziu o crescimento tumoral. Os tumores apresentaram alterações morfológicas e núcleos atípicos; e não expressaram os marcadores S100, HMB-45, Mela-A ou citoqueratinas. Este trabalho confirmar a eficácia do vemurafenibe e sugere o potencial adjuvante da cloroquina no tratamento de melanomas. O estudo também confirma o papel da dermcidina como oncogne e fator de crescimento de células de melanoma maligno.In this study we evaluated the pharmacological effects of vemurafenib ( inhibitor BRAFV600E) and chloroquine (autophagy inhibitor) in cell viability and tumor growth of two melanoma cell lines identified as G-361 pLKO, which expresses dermcidin, and G361 IBC I which silenced DCD expression. G-361 melanoma cells responded to vemurafenib (1-2 μM) and chloroquine (50-100 μM) alone or combined, with increased apoptosis rates, while decreasing senescent cells. Vemurafenib (50 mg/kg / 21 days) inhibited melanoma growth in immunodeficient mice independent of dermicidin. Chloroquine (30 mg/kg) in combination with vemurafenib, accelerated (at 24 hour interval), and reduced (at 72 hours interval), melanoma growth. Tumor tissues showed atypical cell morphology and nuclear histological patterns and melanocytic differentiation biomarkers S100, HMB-45, Melan-A or pancytokeratins were not. This work confirms the efficacy of vemurafenib and suggests potential adjuvant effect of chloroquine. It also confirms the role of dermcidin as growth factor and oncogene for melanoma cells.
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Drewes, Carine Cristiane. "Efeitos das nanocápsulas de núcleo lipídico contendo acetileugenol em melanomas: estudos in vivo e in vitro." Universidade de São Paulo, 2015. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/9/9141/tde-27082015-101459/.
Full textAbstract:
O melanoma é uma neoplasia de pele invasivo, com maior taxa de morte, sem tratamento efetivo. Nanocápsulas poliméricas de núcleo lipídico (LNC) tem sido empregadas com sucesso como carreadores de fármacos hidrofóbicos. Como o eugenol é um composto hidrofóbico com atividades antiproliferativas e pró-apoptóticas em células cancerosas, visamos avaliar os efeitos dos tratamentos com acetileugenol (AC), LNC ou LNC contendo acetileugenol (LNC-AC) em modelo de melanoma in vivo em camundongos C57B6, e a citotoxicidade dos mesmos em células endoteliais (HUVEC) e de melanoma (SK-Mel-28) in vitro. Os resultados obtidos mostraram que: 1) tratamentos i.p. com as LNC ou com LNC-AC (50 mg/kg, 3-10 dia de indução do tumor) induziram toxicidade sistêmica e, somente o tratamento com LNC inibiu o desenvolvimento do melanoma. O tratamento com LNC, mas não com a mistura de triglicerídeos de cadeia média, por via oral, inibiu o desenvolvimento tumoral, sem toxicidade. Adicionalmente, os tratamentos com AC, LNC ou LNC-AC não foram eficazes quando administrados em fase tardia de evolução tumoral (50 mg/kg, 7-17 dia de indução do tumor, via oral); 2) os tratamentos agudos com AC, LNC ou LNC-AC (20 mg/kg, 200 µL, e.v.) não alteraram o número de leucócitos circulantes, mas os tratamentos com LNC ou com LNC-AC reduziram o comportamento de rolling dos leucócitos em vênulas póscapilares do músculo cremaster e causaram hemólise, sendo que este último efeito também foi observado após tratamento in vitro em hemácias murinas; 3) Os estudos in vitro mostraram que as LNC e LNC-AC foram captadas pelas células HUVEC e SK-Mel-28 após 1 hora de incubação; que a incubação com LNC-AC induziu apoptose tardia e necrose com maior eficácia em SK-Mel-28 do que em HUVEC; que as incubações com LNC ou LNC-AC exerceram efeitos antiproliferativos, induzindo parada na fase G2/M do ciclo celular das duas linhagens de células avaliadas; que somente a incubação com AC ou LNC-AC inibiu a adesão ao Matrigel® com maior eficácia na linhagem SK-Mel-28 do que HUVEC; que somente a incubação com as LNC reduziram a expressão de VCAM-1 em HUVEC e que as incubações com LNC ou LNC-AC reduziram a expressão de β3 integrina em SK-Mel- 28; que nenhum dos tratamentos alterou a migração celular das HUVEC ou SK-Mel- 28; que somente a incubação com LNC-AC reduziu os níveis de espécies reativas de oxigênio em HUVEC e SK-Mel-28; que a incubação com LNC ou LNC-AC aumentou a produção de óxido nítrico (NO) pelas duas linhagens de células avaliadas; que o tratamento com L-NAME reverteu os níveis de NO e a inibição sobre a proliferação celular induzida pela incubação com LNC ou LNC-AC e; que o tratamento de células de melanoma murino com LNC ou LNC-AC parece alterar a polarizar os neutrófilos para o fenótipo N1. Associados, os resultados obtidos mostram o tratamento oral com LNC inibe o crescimento do melanoma sem induzir efeitos tóxicos, e que este efeito benéfico pode ser dependente, pelo menos em parte, da nanoencapsulação dos triglicerídios de cadeia média e da supraestrutura da formulação, com toxicidade direta sobre as células de melanoma e possível modulação do microambiente tumoral.Melanoma is the most invasive skin cancer, with high rates of death without effective treatment. Polymeric lipid-core nanocapsules (LNC) has been successfully used as carriers of hydrophobic drugs. As eugenol is an hydrophobic compound with antiproliferative and pro-apoptotic activity in cancer cells, here we aimed to evaluate the effects of treatments with acetyleugenol (AC), LNC or LNC containing acetyleugenol (LNC-AC) in an in vivo melanoma model in C57BL6 mice and the cytotoxicity of the treatments in vitro, using endothelial (HUVEC) and melanoma (SK-Mel- 28) cells. The results obtained showed that: 1) i.p. treatments with LNC or LNCAC (50 mg/kg, 3-10 days of tumor injection) induced systemic toxicity and, only the treatment with LNC inhibited the melanoma development. Treatment with LNC, but not with mix of triglycerides of medium chain, by oral route, inhibited the tumor development, without toxicity. In addition, the treatments with AC, LNC or LNC-AC were not effective when administered in the late stage of tumor evolution (50 mg/kg, 10-20 days of tumor induction, oral route); 2) the acute treatments with AC, LNC or LNC-AC (20 mg/kg, 200 µL, intravenous route) did not altered the number of circulating leukocytes, but the treatments with LNC or LNC-AC reduced the rolling behavior of leukocytes in postcapillary venules of the cremaster muscle and induced hemolysis. The latter effect was also observed after in vitro treatment using murine erythrocytes; 3) In vitro studies showed that the LNC and LNC-AC suffered uptake by HUVEC and SK-Mel-28 cells after 1 hour of incubation; that the incubation with LNC-AC induced late apoptosis and necrosis more effectively in SK-Mel-28 than in HUVEC cells; that the incubation with LNC or LNC-AC presented antiproliferative effects, by inducing G2M arrest in cell cycle in both cells lines evaluated; that only the incubation with AC or LNC-AC inhibited the adhesion in Matrigel® with more efficaccy in SK-Mel-28 than in HUVEC cells; that only incubtion with LNC reduced the VCAM-1 expression in HUVEC and the incubation with LNC or LNC-AC reduced the β3 integrin expression in SK-Mel-28 cells; that any treatment affected the HUVEC or SK-Mel- 28 migration; that only the incubation with LNC-AC reduced the levels of reactive species of oxygen in HUVEC and SK-Mel-28 cells; that the incubation with LNC or LNC-AC increased the nitric oxide (NO) production by both cell lines used; that the treatment with L-NAME reversed the NO levels and the inhibition on cell proliferation induced by incubation with LNC or LNC-AC and; that the in vitro treatment of murine with LNC or LNC-AC altered the neutrophil polarization to N1 phenotype. Together, results obtained show that the oral treatment with LNC inhibit the melanoma growth without any toxic effect, and that the beneficial effect could be dependent, at least in part, of nanoencapsulation of medium chain triglycerides and the supraestrucuture of the formulation, with direct toxicity on melanoma cells and possible modulation of tumor microenvironment.
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Ferrucio, Bianca. "Avaliação de melanócitos humanos expostos ao inseticida carbaril e à radiação solar em cultura." Universidade de São Paulo, 2015. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/9/9141/tde-28052015-085252/.
Full textAbstract:
O carbaril (metilcarbamato de naftila), um inseticida de amplo espectro, foi recentemente associado ao desenvolvimento de melanoma cutâneo em estudo epidemiológico de coorte com trabalhadores agrícolas norte-americanos, expostos também à radiação solar, o principal fator etiológico para o desenvolvimento de tumores cutâneos. Apesar de abrangente e bem planejado, aquele estudo epidemiológico não é suficiente para caracterizar a contribuição direta do inseticida e da radiação solar na melanomagênese. Diversos estudos têm explorado o efeito sinérgico de determinadas substâncias químicas à radiação UV, potencializando seus efeitos deletérios sobre a pele, e possivelmente contribuindo para o desenvolvimento de tumores. A hipótese deste trabalho é de que a exposição ao carbaril associada à radiação solar possa estimular a transformação de melanócitos. Esse estudo visou caracterizar melanócitos humanos após exposição individual ou combinada ao carbaril (100uM) e à radiação solar (375 mJ/ cm2). Em ensaio de microarray, o carbaril, mas não a radiação solar, induziu uma importante resposta a estresse oxidativo, evidenciada pelo aumento da expressão de genes antioxidantes, como o Hemeoxigenase-1 (HMOX1), e pela diminuição da expressão do gene MiTF, regulador da atividade melanocítica; os resultados foram confirmados por qRT-PCR. Além disso, tanto o carbaril quanto a radiação solar induziram respostas que sugerem dano ao DNA e alteração de ciclo celular. A expressão dos genes nestas categorias, como p21 e BRCA1/2, foi notavelmente mais intensa no grupo de tratamento combinado e de fato, ensaios por citometria de fluxo demonstraram parada de ciclo celular na fase S, redução do número de células em apoptose e indução mais rápida de lesões do tipo CPD neste grupo experimental. Nossos dados sugerem que o carbaril é genotóxico para melanócitos humanos, especialmente quando associado à radiação solarCarbaryl (1-naphthyl-methylcarbamate), a broad spectrum insecticide, has recently been associated with the development of cutaneous melanoma in an epidemiological cohort study with U.S. farm workers also exposed to ultraviolet radiation, which is known to be the main etiologic factor for skin carcinogenesis. Although comprehensive and well designed, the epidemiological study is not sufficient to characterize the direct contribution of the insecticide and solar radiation in melanomagenesis. Several studies have explored the synergistic effect of certain chemicals with UV radiation, increasing its deleterious effects on the skin, possibly contributing to tumor development. We hypothesized that Carbaryl exposure associated with UV solar radiation may induce melanocyte transformation. This study aims to characterize human melanocytes after individual or combined exposure to Carbaryl (100uM) and solar radiation (375 mJ/ cm2). In a microarray analysis, Carbaryl, but not solar radiation, induced an important oxidative stress response, evidenced by the upregulation of antioxidant genes, such as Hemeoxygenase-1 (HMOX1), and downregulation of MiTF, the main regulator of melanocytic activity; results were confirmed by qRT-PCR. Moreover, both Carbaryl and solar UV induced a gene response that suggests DNA damage and cell cycle alteration. The expression of genes in these categories, such as p21 and BRCA1/2, was notably more intense in the combined treatment group in an additive manner and in fact, flow cytometry assays demonstrated cell cycle arrest in S phase, reduced apoptosis induction and faster induction of CPD lesions in this experimental group. Our data suggests that carbaryl is genotoxic to human melanocytes, especially when associated with solar radiation
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Santos, Suene Bernardes dos. "Viabilidade da medida de elementos-traço em soro sanguíneo para diagnóstico de melanoma." Universidade de São Paulo, 2012. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/43/43134/tde-06112014-110043/.
Full textAbstract:
A medida e o controle de elementos químicos, majoritários ou traço, em tecidos e fluídos biológicos, vem sendo utilizada há muito tempo para diagnósticos médicos, em avaliações de saúde, estado nutricional e para prevenção e acompanhamento de doenças. Em muitos casos tal relação já foi solidamente estabelecida, mas no estudo de neoplasias, ainda se busca relação entre teores químicos elementares e vários tipos (ou estágios) de câncer. Nesse tipo de estudo utilizam-se métodos espectroscópicos multi-elementares de altíssima sensibilidade ainda não disponíveis rotineiramente em laboratórios clínicos. Neste trabalho, buscaram-se alterações na concentração de elementos químicos majoritários e traço em soro sanguíneo de pacientes com melanoma, por meio de análises pelos métodos PIXE e HR-ICPMS como auxiliar de diagnóstico desta neoplasia, uma vez que sua detecção em estágios iniciais aumenta a probabilidade de recuperação. A técnica PIXE (Proton Induced X-ray Emission) de análise multi-elementar baseia-se na detecção de raios X característicos, enquanto o HR-ICPMS (High Resolution Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry) é um espectrômetro de massa de alta resolução. As amostras de sangue de 30 pacientes e 116 doadores sadios foram coletadas no Hospital São Paulo (protocolos CEP 1036/08 UNIFESP) em tubos de vidro sem aditivos, sendo o soro separado por meio de centrifugação a 4500 rpm durante 15 minutos. Foram identificados e quantificados um total de 10 elementos: 4 por HR-ICPMS (Mg, Se, Cu e Zn) e 8 por PIXE (P, S, Cl, K, Ca, Br, Cu e Zn). Os métodos analíticos foram aferidos com os materiais de referência QMEQAS06S-06, QMEQAS08S-06 e NIST 1577b. A precisão analítica variou de 3 % a 9 % para ambas as técnicas. As informações clínicas relevantes dos pacientes foram incluídas na análise (tipo histológico do tumor; nível de melanoma; escala de Breslow em profundidade; número de linfonodos; presença ou ausência de mitose e/ou ulceração). A avaliação do grupo controle mostrou diferentes concentrações de P e Mg para indivíduos com idade acima ou abaixo de 40 anos. Os teores de P, S, Ca, Cu e Zn em indivíduos saudáveis apresentaram diferenças com o gênero, evidenciando a necessidade de inserir estas variáveis na análise caso-controle. As concentrações de K, S, Ca e Se apresentaram diferença entre os grupos controle e melanoma, quando consideradas as variáveis clínicas dos pacientes (p<0,05). A necessidade de estratificação por idade, gênero e estágio da neoplasia, reduziu criticamente o já limitado espaço amostral, comprometendo a interpretação das pequenas diferenças nas concentrações elementares encontradas. Os resultados encontrados para a população sadia concordaram com os valores publicados na literatura e colaboraram para o fortalecimento do banco de dados de concentrações elementares em soro da população brasileira.Recording chemical elements, either as major or trace quantities, in tissues and biological fluids is regularly being used for medical diagnosis, health assessments, nutritional status, and for the monitoring and prevention of diseases. In many cases, such relationship is firmly established, but for cancer, there is still a search for a relationship between chemical elements and various types (or stages) of cancer. In this kind of study, highly sensitive multielemental spectroscopic methods are used which are not yet routinely available in clinical laboratories. In this study, changes in the concentration of chemical elements in serum of melanoma patients were sought by means of PIXE and HR-ICPMS analysis as an aid to early diagnosis, and to help increasing the likelihood of pacients recovery. The multi-elemental PIXE method (Proton Induced X-ray Emission) relies on the detection of characteristic X-rays of the sample, while the HR-ICPMS (High Resolution Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry) is a high resolution mass spectrometer. Blood samples from 30 patients and 116 healthy donors were collected at the Hospital (protocols CEP 1036/08 UNIFESP) in glass tubes without additives, and the serum separated after centrifugation for 15 minutes at 4500 rpm. A total of 10 elements were measured: 4 by HR-ICPMS (Mg, Se, Cu and Zn), 8 by PIXE (P, S, Cl, K, Ca, Br, Cu and Zn). The analytical methods were assessed analyzing reference materials QMEQAS06S-06, QMEQAS08S-06 and NIST 1577b. The analytical precision ranged from 3 % to 9 %. Relevant clinical information of patients has also been included in the statistical analysis (histological type of tumor, level of melanoma, Breslow depth scale, number of lymph nodes, presence or absence of mitosis and/or ulceration). The evaluation of the control group showed different concentrations of P and Mg for individuals aged above and below 40 years. The P, S, Ca, Cu and Zn in healthy individuals differed according to the gender, highlighting the need of inserting the variables age and gender in the case-control analysis. The concentrations of K, S, Ca and Se showed differences between the control group and the melanoma, when considering the clinical variables of the patients (p <0.05). The need for stratification by age, gender and stage of cancer, critically reduced the already limited number of samples, compromising the interpretation of the small differences in elemental concentrations found. The results for the healthy population agreed with the values reported in the literature and contributed to strengthen the database of elemental concentrations in serum of the Brazilian population.
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Queiroz, Rodrigo Guimaraes. "Componentes derivados de venenos de serpentes com ação antitumoral em células de melanoma Murino." Universidade de São Paulo, 2012. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/85/85131/tde-24082012-133252/.
Full textAbstract:
Apesar dos constantes avanços no tratamento de câncer, essa doença continua sendo umas das principais causas de mortalidade no mundo todo, portanto, é imperativo que novas modalidades de tratamento sejam desenvolvidas. Venenos de serpentes causam uma variedade de efeitos biológicos, pois constituem uma mistura complexa de substâncias como disintegrinas, proteases (serino e metalo), fosfolipases A2, L-aminoácido oxidases entre outras. No presente trabalho pesquisou-se em alguns venenos de serpentes frações com atividade antitumoral, pois há relatos de compostos ofídicos que apresentam esta atividade. Após fracionamento de venenos de serpentes das famílias Viperidae e Elapidae foram feitas incubações das frações obtidas com células normais de fibroblasto L929 e de melanoma B16-F10. Os resultados mostraram que as frações do veneno da serpente Notechis ater niger apresentaram a maior especificidade e potencial antitumoral em células de melanoma murino B16-F10 que os demais venenos utilizados. Este achado, aliado ao fato de ser um veneno pouco explorado foram determinantes para que este veneno fosse selecionado para dar continuidade aos estudos. As frações citotóxicas deste veneno foram submetidas a análises para identificar e caracterizar os componentes que apresentaram esta atividade atitumoral. Ensaios de western-blot e zimografia sugerem que estas proteínas não pertencem à classe das metalo e serinoproteinases.Despite the constant advances in the treatment of cancer, this disease remains one of the main causes of mortality worldwide. So, the development of new treatment modalities is imperative. Snake venom causes a variety of biological effects because they constitute a complex mixture of substances as disintegrins, proteases (serine and metalo), phospholipases A2, L-amino acid oxidases and others. The goal of the present work is to evaluate a anti-tumor activity of some snake venoms fractions. There are several studies of components derived from snake venoms with this kind of activity. After fractionation of snake venoms of the families Viperidae and Elapidae, the fractions were assayed towards murine melanoma cell line B16-F10 and fibroblasts L929. The results showed that the fractions of venom of the snake Notechis ater niger had higher specificity and potential antitumor activity on B16-F10 cell line than the other studied venoms. Since the components of this venom are not explored yet coupled with the potential activity showed in this work, we decided to choose this venom to develop further studies. The cytotoxic fractions were evaluated to identify and characterize the components that showed antitumoral activity. Western blot assays and zymography suggests that these proteins do not belong to the class of metallo and serine proteinases.
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Santos, Antonio José da Silva. "Efeitos da terapia com laser baixa potência em melanoma: ensaios in vitro." Universidade de São Paulo, 2012. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/85/85134/tde-31052013-101630/.
Full textAbstract:
Embora a terapia com uso de laser de baixa potência (TLBP) seja uma modalidade terapêutica amplamente estudada no meio científico, sua aplicação na clínica médica ainda gera controvérsias, já que a literatura reporta que a TLBP é capaz de promover a proliferação e diferenciação de células tumorais. O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos da TLBP no crescimento celular usando como modelo a linhagem B16F10 de melanoma murino em estado de homeostase e estado redox, além de verificar o comportamento quimiotáxico da linhagem B16F10 por meio do ensaio de migração transwell em resposta à TLBP em diferentes densidades de energia. Foram montados cinco grupos experimentais utilizando um laser de emissão vermelha em λ = 660 nm: Grupo controle (GC) onde nenhuma irradiação foi realizada; G30 (30J/cm2); G60 (60J/cm2); G90 (90J/cm2); G120 (120J/cm2); G150 (150J/cm2), com as respectivas doses utilizadas. Todos os experimentos foram realizados em triplicata e os resultados obtidos foram submetidos à análise estatística. Sob as condições experimentais deste estudo, nossos resultados mostram que a TLBP neste comprimento de onda não promoveu mudanças no metabolismo celular nos tempos de 48 h e 72 h, independente do estado nutricional. Foi possível observar mudança no padrão de comportamento quimiotáxico da linhagem celular B16F10 irradiadas com laser de emissão vermelha.The low power lasers (TLBP) is a therapeutic modality widely studied in scientific field, its application in clinical medicine still generates many conflicts since literature reports proliferation in cancer cells. The objective of this study was to evaluate the effects of TLBP on cell growth using as model the line B16F10 in state of homeostasis and redox state and investigate the chemotactic behavior of B16F10 lineage through transwell migration assay in response to TLBP in different energy densities. For this purpose five experimental groups were assembled using a laser emission at λ = 660 nm: control group (G0) where no irradiation was performed; G30 (30J/cm2), G60 (60J/cm2), G90 (90J/cm2); G120 (120J/cm2); G150 (150J/cm2) with the respective doses used. All experiments were performed in triplicate and the results were statistically analyzed. Under the experimental conditions of this study, our results show that TLBP did not induced changes in cellular metabolism that influence proliferation at 48 h and 72 h, independent nutritional status. It was possible to observe changes in behavior pattern chemotactic of cell line B16F10 with TLBP at red emission.