Academic literature on the topic 'MED/20 CHIRURGIA PEDIATRICA E INFANTILE'

2015 - 2016
BACKGROUND. Lo sviluppo di sistemi medicali sempre più avanzati per l’acquisizione delle immagini finalizzati all’estrazione di informazioni tridimensionali sugli organi del corpo umano tramite metodi non invasivi, hanno portato all’affermazione di una nuova disciplina scientifica nota come medical imaging. L’innovazione degli ultimi anni, dalla quale nasce il mio progetto di ricerca, è lo sviluppo di programmi informatici che creano immagini con risoluzione 3D, avendo come substrato le immagini 2D generate con gli esami TC (Tomografia Computerizzata) e RM (Risonanza Magnetica) in pazienti con patologia tumorale o malformativa. Le ricostruzioni 3D trovano la loro applicazione principale nel supporto della diagnosi, considerando che le immagini possono essere trasmesse ad esperti in tutto il mondo per consultazioni in tempo reale (tele-medicina), e nella pianificazione del trattamento chirurgico in termini di tipo di approccio, scelta del materiale, scelta della tecnica più idonea, salvaguardia di strutture vicine. CASISTICA. Durante i 3 anni di dottorato, sono stati inclusi nello studio 40 pazienti, 13 femmine e 27 maschi, con un’età compresa tra 6 mesi e 17 anni. Sono stati suddivisi in 3 gruppi sulla base della patologia: malformativa (29/40), tumorale (7/40) e altro (4/40). Tutti i pazienti hanno eseguito TC o RM dalle cui immagini è stata eseguita la ricostruzione 3D con il programma Vr Render 0.81. Tutti i 40 bambini sono stati sottoposti ad intervento chirurgico. Per ognuno di loro le immagini ricostruite sono state discusse tra il chirurgo pediatrico e il radiologo-per pianificare al meglio la strategia chirurgica. Non riportiamo complicanze intraoperatorie né discrepanze tra la ricostruzione 3D e la reale anatomia del paziente. CONCLUSIONI. Dall’analisi retrospettiva del nostro studio è emerso che la ricostruzione 3D permette una buona e migliore pianificazione chirurgica delle patologie tumorali e malformative. L’immagine sviluppata dal programma Vr Render garantisce una definizione corretta della dimensione della patologia, della sua localizzazione e i suoi rapporti con le strutture circostanti. Importante e necessaria è stata la collaborazione tra il Chirurgo Pediatra e il Radiologo, emblema della multidisciplinarietà, ormai tipica, del management di patologie complesse. Il futuro della renderizzazione 3D è certamente una sempre maggiore applicazione nella pianificazione chirurgica e nel training e formazione dei giovani chirurghi. [a cura dell'autore]
BACKGROUND. The development of advanced medical imaging systems led to a new scientific discipline known as medical imaging. the main gol of this branch is to obtain three-dimensional information on human body organs through non-invasive methods. In tha last 10 years, many programs, that create images with 3D resolution following 2D images obtained by TC (Computer Tomography) and MRI (Magnetic Resonance) in patients with cancer or congenital malformation, have been developed. The 3D reconstructions find their main application in diagnose and plan surgical treatment in terms of approach type, choice of material, choice of the most suitable technique, safeguarding nearby structures. MATERIALS and METHODS. During the 3-year of study, 40 patients, 13 females and 27 males, aged 6 months to 17, were included in the study. They were subdivided into 3 groups based on the pathology: malformative (29/40), tumor (7/40) and others (4/40). All patients underwent TC or MRI. Based on CT or MRI images, 3D reconstruction was carried out with the Vr Render 0.81 program. All 40 children underwent surgery. All imaging have been discussed between pediatric surgeon and radiologist to plan surgical strategy. We do not report intraoperative complications or discrepancies between the 3D reconstruction and the real anatomy of the patient. CONCLUSION. After retrospective analysis of our study, we can conclude that 3D reconstruction allows to better plan surgery of tumor and malformative pathologies. The Vr Render program guarantees to have a correct definition of the size of the pathology, its location and its relationships with nearby structures. The multidisciplinary team (Pediatric Surgeon and the Radiologist) has been Important for the management of complex pathologies. The future of 3D rendering is certainly a major application in surgical planning and training of young surgeons. [edited by author]
XXIX n.s.

Obiettivi Il COVID-19 è una malattia principalmente respiratoria nell’età adulta; nei bambini, al contrario, i sintomi gastrointestinali sono più frequenti. Inoltre, non si conoscono i meccanismi di infezione in epoca fetale, epoca in cui i pazienti sono raramente colpiti da COVID-19. Gli organoidi sono uno strumento relativamente nuovo per stabilire in vitro colture di lunga durata che assomigliano tridimensionalmente al tessuto di origine e possono sia mantenere la staminalità che differenziarsi completamente in tutti i tipi di cellule. Abbiamo quindi mirato a sviluppare un sistema di coltura per organoidi gastrointestinali (GIO) per studiare l'infezione da SARS-CoV-2 nell'epitelio gastrico lungo tutta la durata della vita. Metodi I GIO sono stati derivati da feti di 8-21 settimane e da tessuti pediatrici e adulti. Sono stati coltivati utilizzando un terreno chimicamente definito, per testare la loro capacità di mantenere la forma e di differenziarsi completamente. GIO sono stati analizzati in correlazione all'ECM circostante. Gli organoidi sono stati quindi indotti a differenziarsi nella forma a polarità cellulare inversa (RP-GO) e quindi incubati con SARS-CoV-2. Tutti gli esperimenti sono stati analizzati mediante qPCR, immunofluorescenza e analisi qualitativa a seconda dei casi. Risultati Gli organoidi gastrointestinali possono essere isolati da tutte le età gestazionali, dimostrando la normale morfologia dell'epitelio gastrico ed esprimendo tipi di cellule mature, comprese le cellule della nicchia, del villo/ghiandola e di tipo enteroendocrino. Queste colture possono essere mantenute indefinitamente in vitro e coltivate in condizioni conformi alle indicazioni GMP. Gli RP-GO mostrano polarità apicale, esponendo ACE2 sulla superficie esterna, ottimizzando le condizioni per l'infezione virale. La nucleoproteina virale è stata dimostrata nelle cellule in fase di apoptosi, con gli RP-GO pediatrici più suscettibili ed infettati in modo efficiente rispetto agli organoidi fetali e adulti. Conclusioni Abbiamo stabilito con successo un efficiente sistema di coltura di organoidi gastrointestinali per tutte le età, dalla vita fetale all'età adulta. La tecnologia basata sugli organoidi può essere utilizzata per modelli di malattie in vitro, test sui farmaci o terapia cellulare. L'applicazione di regole conformi alle GMP rende la traduzione clinica più vicina.
Aims Adult COVID-19 is mainly respiratory illness, but in children GI symptoms are more frequent. Furthermore, fetuses are rarely affected by COVID-19. Organoids are a relatively new tool to in vitro establish long-living culture that three-dimensionally resemble the tissue of origin and may both maintain the stemness and fully differentiate in all cell types. As a proof of concept, we aimed to develop a culture system for gastrointestinal organoids (GIOs) to investigate SARS-CoV-2 infection in gastric epithelium across the lifespan. Methods GIO were derived from 8-21 week fetuses and from pediatric and adult tissues. They were cultured using chemically-defined medium, to test their ability to maintain stemness and to fully differentiate. GIO were analyzed in correlation to the surrounding ECM. Reverse cellular polarity Organoids (RP-GOs) were induced and incubated with SARS-CoV-2. All experiments were analyzed by qPCR, immunofluorescence and qualitative analysis as appropriate. Results Gastrointestinal organoids can be isolated from all gestational ages, demonstrating normal gastric epithelial morphology and expressing mature gastric cell types including, the niche, secretive, and enteroendocrine cells. These cultures may be maintained indefinitely in vitro and cultured in GMP-compliant conditions. RP-GOs exhibit apical-out polarity, exposing ACE2 on the external surface, optimizing conditions for viral infection. Viral nucleoprotein was demonstrated in cells undergoing apoptosis, with pediatric RP-GOs most susceptible and efficiently infected compared to fetal and adult organoids. Conclusions We have successfully established an efficient gastrointestinal organoid culture systems for all ages, from fetal life to adulthood. Organoid-based technology can be used for in vitro disease modelling, drug testing or cell therapy. The application of GMP compliant rules makes the clinical translation closer.

Background and Purpose: Pediatric arterial ischemic stroke (AIS) may underlie an as yet undiagnosed syndrome often characterized by simple Mendelian inheritance. We aimed to establish and validate a targeted gene panel for AIS associated with monogenic disorders, and to determine its diagnostic yield and clinical utility. Methods: Clinical and neuro-radiological data were collected for every patient enrolled in the study. DNA samples were tested by means of a customized gene panel including 15 genes associated with known genetic diseases related with AIS. Results: Thirty-eight patients (23 males, mean age 6.5 years) were selected with heterogeneous AIS phenotypes, mostly multiple and asynchronous and secondary to vasculopathy. Ten out of 38 resulted to carry rare potentially causative mutations in at least one of the 15 genes analyzed. In 4 cases the analyses led to a definite genetic diagnosis while results were either controversial or null in the remaining patients. Conclusions: While the complexity of the different clinical phenotypes associated with AIS is not fully accounted for by the genes tested in the present study, the achieved diagnoses had a great beneficial impact on patient management. A wider gene panel or an unbiased genome wide approach would be better suited to explain a greater proportion of pediatric stroke events.

Background The aetiology and the prognostic factors of biliary atresia (BA), a progressive obstructive cholangiopathy of infants, are still not well known. Four different subtypes of BA have been described in relation to the age of the developmental failure during gestational age (i.e. Biliary Atresia Splenic Malformation (BASM), Cystic BA, CMV IgM +ve BA and Isolated BA). We aimed to investigate the relation between the bile duct damage in the porta hepatis and liver and cells with an intestinal phenotype (expressing Cytokeratin 20 (CK-20)) in order to establish if this could be considered a prognostic marker of BA. Methods Samples were orientated intra-operatively then immunostained with anti-cytokeratin 20 (CK20). Sections were then digitised and analysed. Clinical and immunohistochemical data were compared. Data are quoted as median (range). Non-parametric statistical comparisons were made as appropriate. P < 0.05 was regarded as significant. Results 48 consecutive infants were treated with Kasai Portoenterostomy (KPE) or primary liver transplantation in a single-centre between 1999 and 2017. CK20 expression in the liver was not associated with a successful KPE (P = 0.69) or native liver survival (P = 0.91). By contrast, remnant porta hepatis CK20 expression was associated with a successful KPE (P=0.04, HR: 0.49). Diffuse expression (distribution > 50% of slide) was associated with a longer period of native live survival (P=0.01; HR: 0.29). Conclusions CK20 diffuse expression in the porta hepatis is associated with a successful KPE and it is a predictor of native liver survival.

Short Bowel Syndrome (SBS) in children is a condition of intestinal malabsorption and dysmotility, caused by rare congenital malformations or acquired diseases, requiring extensive bowel surgical resection which in severe cases can lead to irreversible intestinal failure. Nowadays, the management of pediatric patients affected by SBS is multidisciplinary, involving different possible strategies of treatment: total parenteral nutrition, surgical intestinal lengthening up to intestinal transplantation. The main aim of all these approaches is to promote bowel absorption, but none of them is free from complications that may impair children quality of life. Based on these considerations, this Research Project aims to identify new options to manage and treat SBS. Hence, two aspects were considered: a clinical and an experimental one. As known, the management of SBS patients requires a careful follow-up by a multispecialistic team, able to survey their possible short- and long-term complications and their progressive weaning from parenteral support. Considered this, the clinical part of this Research Project focused on the evaluation of citrulline as a reliable serum marker of residual bowel function. The goal was to verify the possibility of suggesting it for routine dosage in case of intestinal failure, similarly to creatinine in renal impairment and for transaminases in hepatic failure. Briefly, we identified a sample population consisting of 10 SBS patients, age ≤ 5 years and residual bowel length (after surgery) ≤ 100 cm. Patients followed-up with parenteral and enteral nutrition programs and were subjected to citrulline dosages at least 6 weeks after surgery. At the end of the clinical evaluation, we highlighted that serum values of citrulline are strongly related with both the residual intestinal length and the duration of their dependence on parenteral support (p < 0.01). Likewise, the experimental research turned its attention to Tissue Engineering that is a new medical science which aims to achieve functionally active tissue substitutes by scaffolds, cells and growth factors. The second part of the Research Project focused on the possibility to develop a bio-synthetic scaffold for tissue engineering applications in SBS. We manufactured, according to a protocol we patented, new hydrogels based on polyvinyl alcohol with a degree of oxidation of 1% and 2% respectively. The purpose of the chemical oxidation was to confer to the derived biomaterial a certain biodegradation rate. Hence, oxidized hydrogels obtained via physical cross-linking (freezing-thawing) were compared to native PVA hydrogels for their morpho-mechanical and biological properties by means of ultrastructural analysis with scanning electron microscopy, tensile tests, swelling index analysis, and in vivo biodegradation studies. These investigations showed that the strength and the stiffness of the polymer are significantly related to the chemical modification as they decrease along with the oxidation degree; conversely, the swelling and the biodegradation rate increase along with it. The obtained results led us to identify in scaffolds prepared by using 1% Oxidized PVA the supports with the most adequate morpho-mechanical and biodegradation properties to our purposes. Hereafter, it was set up a composite scaffold in 1% Oxidized PVA cross-linked with decellularized intestinal extracellular matrix (ECM). The combination of the polymer with the bioactive matrix allowed us to obtain a support with good mechanical properties and able to promote cell growth and proliferation. Briefly, the small intestine of adult rats was removed and decellularized according to the detergent-enzymatic protocol by Meezan. After having assessed the effectiveness of the procedure (DAPI staining) the acellular matrix was characterized by histological staining (hemotoxylin/eosin). Thereafter, the extracellular matrix (intact and homogenized) was crosslinked with 1% Oxidized PVA and the ability of the composite scaffold to support cell adhesion and proliferation was investigated using a primary culture of adipose mesenchymal stem cells. After 7 days from seeding, a significant cell growth on the composite scaffolds was observed in comparison with the nude polymeric support. Finally, based on of the TESI (Small Intestine Tissue Engineering) model, the scaffold was implanted in the omentum of adult rats; after 4-weeks, composite scaffolds demonstrated their ability to induce the formation of a composite pseudoepithelial tissue with intestinal-like features.
La sindrome dell'intestino corto o Short Bowel Syndrome (SBS) in età pediatrica è una condizione di malassorbimento e dismotilità intestinali, conseguenza di rare malformazioni congenite o patologie acquisite, che comportino resezioni chirurgiche più o meno estese dell'intestino sino, nei casi più gravi, ad insufficienza intestinale. Allo stato attuale, la gestione dei pazienti affetti da SBS è multidisciplinare; varie le possibili strategie terapeutiche: la nutrizione parenterale totale, la chirurgia di "allungamento intestinale" e, nelle fasi più avanzate della patologia, il trapianto di intestino. L'obiettivo primario di tutti questi approcci è quello di promuovere l'assorbimento intestinale, tuttavia nessuno di essi è scevro da complicanze capaci di inficiare la qualità della vita dei pazienti. Sulla base delle precedenti considerazioni, questo Progetto di Ricerca si propone di identificare nuovi approcci per il management ed il trattamento della SBS. A tal fine, la ricerca si è sviluppata su due versanti: uno clinico e l’altro sperimentale. Come noto, la gestione della SBS necessita di un attento follow-up dei pazienti da parte di un'equipe multispecialistica che sia in grado di monitorare, nel breve e nel lungo termine, le possibili complicanze nonché la svezzabilità del paziente dal supporto parenterale. In tale senso, nella parte di ricerca clinica è stata studiata e valutata l'attendibilità della citrullina come marker sierico della funzionalità intestinale residua; l’obiettivo è di proporne un impiego routinario esattamente come avviene per la creatinina nell'insufficienza renale e per le transaminasi nell'insufficienza epatica. A tale scopo, all’interno del nostro campione di pazienti affetti da SBS e seguiti in follow-up, è stata individuata una sottopopolazione campionaria costituita da 10 pazienti inseriti in un programma di nutrizione parenterale ed enterale domiciliare, con età ≤ 5 anni e lunghezza intestinale residua (dopo chirurgia) ≤ 100 cm, che sono stati sottoposti a dosaggio della citrullinemia ad almeno 6 settimane di distanza dalla chirurgia. I valori della citrullinemia sierica sono risultati essere correlati in maniera statisticamente significativa (p < 0,01) sia con la lunghezza intestinale residua di tali pazienti, che con la durata della loro dipendenza dal supporto parenterale. In parallelo, la Ricerca Sperimentale ha rivolto l’attenzione verso una nuova disciplina medica: l’Ingegneria Tissutale. Quest’ultima è una scienza multidisciplinare che si propone di realizzare in laboratorio sostituti tissutali funzionalmente attivi attraverso l’impiego di scaffold, cellule e fattori di crescita. In particolare, in questa seconda parte del progetto di ricerca è stata investigata la possibilità di sviluppare uno scaffold bio-sintetico per applicazioni di ingegneria tissutale intestinale. Brevemente, sono stati realizzati, secondo un protocollo brevettato dal nostro gruppo di ricerca, dei nuovi idrogeli a base di polivinil alcol con un grado di ossidazione dell’1% e del 2%. L'obiettivo dell’ossidazione chimica è stato quello di conferire al biomateriale caratteristiche di biodegradabilità in confronto alla sua forma non ossidata. Dopo cross-linking fisico mediante freezing-thawing, idrogeli in PVA nativo e PVA ossidato sono stati caratterizzati per le loro proprietà morfo-meccaniche e biologiche, tramite analisi ultrastrutturali di microscopia elettronica a scansione, test di trazione, valutazione dell’indice di rigonfiamento e studio di biodegradazione in vivo. Queste indagini hanno dimostrato che la resistenza meccanica e la rigidità del polimero vengono modulate dalla modifica chimica, diminuendo all’aumentare del grado di ossidazione. Diversamente, l’indice di rigonfiamento e il tasso di biodegradazione sono tanto più elevati quanto più aumenta la percentuale dei gruppi carbonilici derivati dall’ossidazione. I risultati ottenuti hanno consentito di identificare nel PVA ossidato all’1% il polimero con caratteristiche morfo-meccaniche e di biodegradazione congeniali ai nostri scopi. Sulla base di questo, è stato allestito uno scaffold composito, costituito da PVA ossidato all’1% cross-linkato con matrice extracellulare intestinale decellularizzata (intera e omogenizzata): la combinazione del polimero (avente proprietà meccaniche e di biocompatibilità/biodegradazione ottimali) con la matrice bioattiva ha consentito di ottenere un supporto capace di favorire la crescita e la proliferazione cellulare. Brevemente, la realizzazione dello scaffold composito ha previsto l'espianto di intestino tenue da ratto adulto e la successiva decellularizzazione del tessuto con metodo detergente-enzimatico secondo Meezan. Dopo aver valutato l'efficacia della procedura di decellularizzazione (marcatura con DAPI) la matrice acellulare è stata caratterizzata tramite colorazione con ematossilina/eosina. A seguito del cross-linking della matrice extracellulare (intera e liofilizzata) con l’idrogelo in PVA ossidato all’1%, la capacità dello scaffold composito nel sostenere l'adesione e la proliferazione cellulare è stata indagata utilizzando cellule staminali mesenchimali da tessuto adiposo umano. A 7 gg dalla semina è stato possibile riscontrare una crescita cellulare significativa sugli scaffold compositi in confronto al solo supporto polimerico. Infine, sulla scorta del modello TESI (Tissue Engineering Small Intestine), tali scaffold sono stati impiantati in omento di ratti adulti, dimostrando, ad un end-point di 4 settimane, la capacità di generare uno pseudoepitelio composito con caratteristiche di tipo intestinale.

INTRODUCTION Kidney transplantation has progressively established as the treatment of choice for end stage renal disease (ESRD). The progressive loss of function of the transplanted organ is the leading cause of graft failure. The outcome of graft is influenced by many parameters: one of them is the "delayed graft function" (DGF). Graft damage can be influenced by events occurred during donor reanimation or at the time of brain death. The more recent available studies on this subject are almost exclusively based on an adult population. Assuming that some variables concerning donor resuscitation can influence DGF development and transplant outcome, the main purpose of this project was to understand whether this correlation also exists in the pediatric renal transplantation. MATERIALS AND METHODS We reviewed the data of all patients (<15 years) who underwent a kidney transplantion from 26/12/2003 to 18/04/2011. Donor data were extracted from observations of the intensive care units (ICU) after diagnosis of brain death. We considered: type and volume of plasma expander, transfusions, inotropic drugs, shock episodes, episodes of cardiac arrest, time of stay in ICU , serum creatinine, blood urea and urine output. the recipients data were obtained through the systematic review of medical records. Patients were divided into two Groups: Group 1 (DGF positive) and group 2 (DGF negative). Endpoints of the study were: DGF incidence, graft function and patient survival at 6,12,24 months after transplantation. RESULTS In this period were performed 141 kidney transplants of which 116 with complete donation data. Univariate analysis of donor’s parameters has shown that age, cause of death and donor sex are risk factors for development of DGF. The multivariate logistic regression model confirmed age of the donor as independent risk factor for DGF. CONCLUSIONS Donor age has been revealed as an important independent risk factor for development of DGF. DGF is also an important risk factor for long term loss of graft function, but has no effect on patient’s survival
INTRODUZIONE ED OBIETTIVI Da quando è stato introdotto 40 anni fa, il trapianto di rene si è progressivamente affermato come la terapia di scelta dell'insufficienza renale terminale. La progressiva perdita di funzione dell'organo trapiantato rimane, tuttavia, la principale causa di fallimento del trapianto. L'outcome del graft è influenzato da molteplici parametri: uno di questi è la €"delayed graft function"€ (DGF), ovvero la ritardata ripresa funzionale dell'organo trapiantato. C'è crescente evidenza che il grado di danno dell'organo da trapiantare possa essere influenzato da eventi intercorsi in terapia intensiva o durante il periodo di morte cerebrale. Un punto chiave, quindi, per capire la qualità dell'organo da trapiantare, sembrerebbe essere la gestione rianimatoria del donatore in morte cerebrale. Gli studi disponibili in letteratura sull'argomento sono quasi esclusivamente basati su una popolazione adulta oppure prendono in considerazione un numero ristretto di parametri. Non ci risulta che esistano attualmente studi simili condotti su pazienti pediatrici. Partendo quindi dall'ipotesi, dimostrata nell'adulto, che alcune variabili riguardanti la rianimazione del donatore possano influenzare la DGF e quindi l'outcome del trapianto, scopo principale del presente progetto di ricerca è stato capire se esista questa correlazione anche nell'ambito del trapianto renale pediatrico. SCOPI Analisi della prevalenza di DGF e i suoi fattori di rischio in una popolazione selezionata. Valutazione dell'impatto della DGF sulla funzionalità del trapianto e sulla sopravvivenza del paziente e del graft a 24 mesi dopo il trapianto. MATERIALI E METODI Sono stati presi in considerazione i dati di tutti i pazienti con età inferiore ai 15 anni sottoposti a trapianto di rene presso il nostro Dipartimento di Pediatria (Chirurgia Pediatrica e Nefrologia Pediatrica- Azienda Ospedaliera e Università degli Studi di Padova) ed è quindi stato condotto uno studio retrospettivo su tutti i casi di trapianto di rene da donatore non vivente eseguiti dal 26/12/2003 al 18/04/2011. E'stato escluso il periodo antecedente per la sostanziale differenza nella terapia immunosoppressiva, fatto che avrebbe costituito una notevole fonte di errore nell'analisi dei dati. I dati dei donatori sono stati estratti dalle osservazioni delle unità di terapia intensiva dalla diagnosi di morte cerebrale al prelievo dell'organo. Sono state considerate: tipo e volume di Plasma Expander, trasfusioni, utilizzo di inotropi, episodi di shock ipotensivo, episodi di arresto cardiocircolatorio, ermanenza in terapia intensiva, creatininemia, uremia e diuresi. I dati dei riceventi sono stati ottenuti attraverso la revisione sistematica delle cartelle cliniche dei reparti di Chirurgia Pediatrica e Nefrologia Pediatrica del nostro centro. I criteri di inclusione sono stati:età inferiore ai 18 anni, donatore cadavere in morte cerebrale, follow-up di almeno un anno. I pazienti sono stati divisi in gruppo 1 (11 pz.) con Delayed Graft Function (DGF) e gruppo 2 (105 pz.) senza DGF. Gli endpoints dello studio sono stati: DGF, funzione dell‘organo trapiantato a 6-12-24 mesi dal trapianto e sopravvivenza del paziente a 6-12-24 mesi. RISULTATI Nel periodo di tempo considerato sono stati eseguiti un totale di 141 trapianti di rene, 126 da donatore cadavere, dei quali in 116 bambini i dati relativi alla donazione erano completi. L'analisi univariata dei parametri del donatore in morte cerebrale ha mostrato che l'età , la morte da accidente cerebrovascolare e dil sesso del donatore sono fattori di rischio per lo sviluppo di DGF. Il modello di regressione logistica multivariata haconfermato come fattore di rischio indipendente per DGF l'età del donatore. A 6 mesi di follow-up, il gruppo con DGF ha mostrato una funzionalità renale e un quadro istologico bioptico peggiori rispetto al gruppo senza DGF, ma non abbastanza da raggiungere la significatività . CONSIDERAZIONI CONCLUSIVE L'età del donatore si è rivelata un importante fattore di rischio indipendente per lo sviluppo di DGF, a sottolineare quanto già presente in letteratura di come reni provenienti da donatori pi๠“anziani” siano pi๠suscettibili ad esaurire prima la loro funzionalità . La DGF è risultato inoltre un importante fattore di rischio la perdita di funzione del graft a lungo termine , ma non ha alcun effetto sulla sopravvivenza del paziente

ABSTRACT BACKGROUND: Oesophageal Atresia (OA) is a congenital defect that occurs during gestation and prevents the correct oesophagus development in 1 every 3000-4500 ¬births. Tissue Engineering could represent a therapeutic alternative for the most severe cases, where oesophageal replacement becomes necessary. Decellularised matrices are the ideal option because they are derived from tissue-specific extracellular-matrix (ECM) after removing all the cells therefore avoiding the risk of incompatibility and rejection. However, appropriate preservation may significantly affect scaffold behaviour. AIM: here we aim to create a decellularised oesophageal scaffold in a large animal and to establish an innovative method of scaffold storing. METHODS: rabbit oesophagi were decellularised using a detergent-enzymatic treatment (DET) and evaluated at 2 and 4 weeks, 3 and 6 months of storage. Four storage methods were compared: SCM (slow cooling in medium with 10% DMSO at -1°C/min, then stored in liquid nitrogen), SF (snap-freezing in liquid nitrogen, then stored in -80°C), FD (freeze-drying, then stored in -20°C) and 4C (phosphate-buffered saline solution at 4°C). Structural and functional analyses were performed prior to and after each storage condition. RESULTS: efficient decellularisation with preservation of the ECM was achieved after 2 DET cycles as evidenced by histology and DNA quantification. Only the SCM method maintained the architecture and biomechanical properties of the scaffold up to 6 months. On the contrary, all other methodologies failed long-term preservation of the original structure. In particular, SF-oesophagi displayed irreversible tissue collapse, FD-samples were impossible to rehydrate 3 and 6 months post-storage and the 4C option led to a progressive distortion of the tissue architecture. DISCUSSION: scaffolds for oesophageal tissue engineering can be obtained in a large animal using a combination of detergent and enzymatic agents. Efficient storage allows a timely use of decellularised oesophagi, essential for clinical translation. Here we describe for the first time that slow cooling in a DMSO/medium solution and liquid nitrogen leads to reliable long-term storage of decellularised scaffolds.
RIASSUNTO INTRODUZIONE: vi sono patologie nelle quali è necessario procedere a sostituzione totale o parziale dell'esofago. Tra di esse vi è l'atresia esofagea, una malattia dello sviluppo esofageo che colpisce 1 ogni 3000-4500 neonati. Tra le terapie emergenti ed innovative per il trattamento delle forme più gravi si propone l'uso di matrici decellularizzate create mediante tecniche di Tissue Engineering. Queste strutture rappresenterebbero la scelta ideale, in quanto esse mantengono le caratteristiche della matrice extracellulare (ECM) dell'esofago nativo, ma sono private della componente cellulare abbattendo il rischio di incompatibilità e di rigetto. Tuttavia va identificata un'adeguata strategia di conservazione delle matrici prodotte in laboratorio per garantirne la preservazione in modo da renderle disponibili e utilizzabili nella pratica clinica. SCOPI: identificare un metodo efficace di produzione e conservazione delle matrici esofagee decellularizzate in un modello di grande animale. MATERIALI E METODI: esofagi di coniglio sono stati prelevati e decellularizzati utilizzando un metodo che combina l'uso di detergenti ed enzimi (DET). Le matrici sono state analizzare dopo 2-4 settimane e 3-6 mesi dopo averle conservate in 4 modi differenti: SCM (congelate lentamente in medium e conservate in azoto liquido); SF (snap-frozen in azoto liquido e conservate a -80°C), FD (freeze-dryed e poi conservate a -20°C); 4C (in PBS a 4°C). Analisi di struttura e meccanica sono state effettuate ad ognuno dei 4 time-points. RISULTATI: abbiamo raggiunto una decellularizzazione efficace con preservazione dell'ECM dopo 2 cicli DET (come mostrato dalla quantificazione del DNA e dall'istologia). Solo il metodo SCM preserva le caratteristiche strutturali e meccaniche della matrice fino all'ultimo time point dei 6 mesi. Gli altri metodi non sono efficaci, in particolar modo SF porta a collasso della micro-architettura tissutale, i campioni in FD non possono essere reidratati dopo 3 o 6 mesi e la conservazione a 4°C porta a progressiva distorsione delle strutture. DISCUSSIONE: è possibile creare matrici esofagee decellularizzate utilizzando la combinazione di detergenti ed agenti enzimatici. Un metodo di conservazione efficace permette di preservare la matrice esofagea decellularizzata rendendola uno strumento concretamente utilizzabile nella terapia sostitutiva dell'esofago. Abbiamo illustrato come il metodo SCM sia il migliore a tale scopo.

BACKGROUND The etiology and pathogenesis of anorectal malformations (ARM) are multifactorial, poorly understood and controversial. The classification of ARM from a genetic perspective, it is not easy due to the fact that these malformations exist in various forms probably influenced by different factors such as gender and associated anomalies. In the literature, several chromosomal genetic syndromes have been associated with this malformations; the analysis of associated malformations is an important aspect of the genetic study of ARM, because the association of anomalies with mendelian transmission or with a recognized causative gene can be an essential starting point for further investigations. The normal development of the hindgut depends on the proper development of the cloaca and the cloacal membrane, and epithelial-mesenchymal interactions on the correct essential for proper morphogenesis. Sonic Hedgehog (Shh) is an excellent candidate as a mediator in the interaction between endoderm and mesoderm, multiple studies in animal models have shown that the reduced or non-presence of Shh or its downstream signal mediators, are able to cause defects of different anorectal region. AIM OF THE STUDY The first part of the study is for the most part retrospective, and has the purpose of classifying the genetic point of view and clinical the patients suffering from ARM followed at the Department of Pediatric surgery until the year 2011 (period 1991-2011), dividing them into syndromic forms and not , in isolated or familial cases. Another part of the study aims to identify chromosomal abnormalities associated with ARM. The second part is intended to perform a morphological and immunohistochemical staining of tissue taken from the site of the malformation to verify such alteration parietal are present, and assess the expression of Shh in the context of normal and pathological tissue. MATHERIALS AND METHODS The first retrospective of the project has been obtained by re-evaluating the clinical history of all patients followed at the Department of Pediatric Surgery from 1991 until 2011. To achieve the second objective was performed classical and molecular cytogenetic analysis (by FISH: Fuorescence in situ hybridization or array-CGH: array-based comparative genomic hybridization) of the peripheral blood of patients followed since 2000, with possible extension to their parents or other family members. For the morphological study of the material coming from the site of the malformation, was evaluated by light microscopy and subjected to classical staining hematoxylin-eosin, with the aim to evaluate: the type of coating, the presence of erosion and/or ulceration, edema of the lamina own, the structural architecture of the muscularis layer, the presence of the connective tissue and its disposal. Study of some immunohistochemical markers of muscle differentiation and maturation processes (myogenin), stem cell markers (CD34, CD133,) and the possible pathogenetic pathways involved Shh. RESULTS Were identified in the period 1991-2011, 143 patients divided into 56 isolated forms, 82 associated forms with 6 syndromic forms, 4 clinical associations; 5 cases are not classified. In the male are 50 associated forms and 32 with isolated forms, in the female are 32 associated forms and 24 with the isolated forms. Syndromic forms are found: 2 chromosomal syndromes, 4 genetic syndromes. Was not identified familial form. The most interesting observations of histological study relate to the muscularis evaluated both in its internal and external component: in most of the defects is observed an important disarray of muscle fibers with significant fibrosis. The expression of CD133 was evaluated in the different layers of the intestinal wall and it shows there is an intense expression of this marker but to a lesser extent than the CD34 that presents an intense positivity in all the layers, especially in the lamina propria directly to below the epithelium. The myogenin is constantly negative. Regarding Shh levels of signal strength is considerably lower in the muscularis. CONCLUSIONS The results of this work indicate, in agreement with the literature, that 60% of patients with ARM has a defect associated. Rectovescical fistula in 80% of cases are associated with other malformations, followed by: cloaca (78%), rectourethral fistula (71%), vestibular fistula (65%), perineal fistula (49%). From the reduced expression of Shh in the mesodermal tissue can mean that, or an alteration that affects directly Sonic or its downstream mediators, that causes absence of an optimal gradient parietal necessary for a correct shaping of the intestinal wall layers, and hence the changes in the observed in this preliminary study. This down-regulation may provide a molecular support to the hypothesis that the incomplete formation and division of the cloaca results in a wide variety of malformations of the hindgut. To confirm this hypothesis are still needed further studies on the expression of mediators downstream of the Shh signal such as for example Gli2, Bmp-4, Hox genes and the Wnt protein.
PRESUPPOSTI DELLO STUDIO L’eziopatogenesi delle malformazioni anorettali è sconoscosiuta e multifattoriale. La classificazione delle MAR dal punto di vista genetico non è semplice per il fatto che tali malformazioni si presentano sotto differenti forme influenzate probabilmente, da fattori diversi come il genere e le anomalie associate. Sono descritte in letteratura sindromi genetiche e cromosomiche associate a tali malformazioni e per tale motivo risulta importante conoscere il fenotipo con le quali si manifestano ed eseguire un analisi citogenetica classica nei pazienti con MAR al fine di per poterle individuare anomalie cromosomiche che potrebbero essere associate ad una certa ereditarietà. Il normale sviluppo dell’intestino posteriore (hindgut) dipende dal corretto sviluppo della cloaca e della membrana cloacale, nonché dalle corrette interazioni epitelio-mesenchimali indispensabili per una morfogenesi corretta. Sonic Hedgehog (Shh) è un eccellente candidato come mediatore nelle interazione tra endoderma e mesoderma , multipli studi su modelli animali hanno evidenziato come la ridotta o mancata presenza di Shh o dei mediatori a valle del suo segnale, siano in grado di causare difetti diversi nello sviluppo della regione anorettale. SCOPO La prima parte dello studio è per la maggior parte retrospettivo, ed ha lo scopo di classificare dal punto di vista genetico e clinico, i pazienti affetti da MAR seguiti presso il reparto di chirurgia pediatrica fino all’anno 2011 (periodo 1991-2011), suddividendoli in forme sindromiche e non, in casi sporadici o familiari. Un ulteriore parte dello studio ha lo scopo di identificare anomalie cromosomiali associate alle MAR. La seconda parte ha lo scopo di effettuare una caratterizzazione morfologica e immunoistochimica del tessuto prelevato dal sito della malformazione per verificare quali alterazione parietali siano presenti, e valutare l’espressione di Shh nel contesto del tessuto normale e patologico. MATERIALI E METODI La prima parte del lavoro retrospettivo è stato ottenuto rivalutando la storia clinica di tutti i pazienti seguiti presso il reparto di chirurgia Pediatrica dall’anno 1991 fino al 2011. Per il conseguimento del secondo obiettivo è stata effettuata l’analisi citogenetica classica e molecolare (mediante FISH: Fuorescence in situ Hybridization o con array-CGH: array based-comparative genomic Hybridization), del sangue periferico dei pazienti seguiti dall’anno 2000, con eventuale estensione ai genitori o altri familiari. Per lo studio morfologico il materiale proveniente dalla sede della malformazione, è stato valutato al microscopio ottico e sottoposto alla colorazione classica Ematossilina-Eosina, con lo scopo di valutare: il tipo di rivestimento, presenza di erosione e/o di ulcerazione, edema della lamina propria, l’architettura strutturale della tonaca muscolare, la presenza della trama connettivale e della sua disposizione. Per lo studio immunoistochimico sono stati utilizzati di alcuni marcatori dei processi di maturazione e differenziazione muscolare (Miogenina), dei marcatori di staminalità (CD34, CD133,) e delle possibili vie patogenetiche coinvolte (Shh). RISULTATI Sono stati individuati nel periodo 1991-2011, 143 pazienti affetti da MAR suddivisi in forme isolate 56, forme associate 82, con 6 forme sindromiche , 4 associazioni cliniche; 5 casi non sono classificabili. Nel maschio sono 50 le forme associate e 32 le forme isolate; nella femmina sono 32 le forme associate e 24 le forme isolate. Le forme sindromiche riscontrate sono: 2 sindromi cromosomiche, 4 sindromi genetiche. Non è stata identificata nessuna forma familiare Le osservazioni più interessanti dello studio istologico riguardano la tonaca muscolare valutata sia nella sua componente circolare interna che longitudinale esterna: nella maggior parte dei difetti si osserva un importante disarrangiamento delle fibre muscolari con rilevante dissociazione da parte della componente fibrosa. L’espressione di CD133 è stata valutata nei diversi livelli della parete intestinale; vi è un’intensa espressione di tale marker ma in misura minore rispetto il CD34 che presenta un’intensa positività in tutti gli strati, soprattutto nella lamina propria direttamente al di sotto dell’epitelio. La miogenina è costantemente negativa. Per quanto riguarda Shh i livelli di intensità del segnale è notevolmente più basso nella tonaca muscolare. CONCLUSIONI I risultati di questo lavoro indicano, in accordo con la letteratura, che il 60% dei pazienti con MAR ha un difetto associato. La fistola rettovescicale nel 80% dei casi si associa ad altre malformazioni seguita da: cloaca (78%), fistola rettouretrale (71%), fistola rettovestibolare (65%), fistola perineale (49%). Dalla ridotta espressione di Shh a livello del tessuto mesodermico del difetto si può ipottizare che o, ad un alterazione che colpisce direttamente Sonic o i suoi mediatori a valle, porti all’assenza di un ottimale gradiente parietale necessario per un corretto modellamento degli strati parietali intestinali, e quindi alle alterazioni in parte osservate in questo studio preliminare. Questa down-regulation può fornire una supporto molecolare all’ipotesi che l’incompleta formazione e divisione della cloaca determina un’ampia varietà di malformazioni dell’intestino posteriore. Per confermare tale ipotesi sono comunque necessari ulteriori studi sull’espressione dei mediatori a valle del segnale Shh quali per esempio Gli2, Bmp-4, Hox geni e le proteine Wnt.

ABSTRACT Introduction and Aim of the Study. Studies devoted to brain dead donor parameters are all based on adult populations. The aim of this study was to analyze the correlation of delayed graft function (DGF) with brain-dead donor variables in a population of 116 consecutive pediatric recipients and to compare the clinical outcomes of non-DGF versus DGF recipients. Patients and Methods. We classified the recipients into two groups: group 0 (No. 11) with DGF and group 1 (No. 105) without DGF. Endpoints of the study were: DGF, 6 months graft function and short-term patient and graft survival. Multivariate analysis was performed to determine independent risk factors of DGF. Results. Monovariate analysis of donor parameters showed that donor age above 15 years, gender combination female donor/male recipients, and vascular cause of donor brain death were risk factors for prolonged DGF. The multivariate logistic regression model confirmed as independent risk factors for DGF donor age > 15 years and gender combination female donor to male recipient. After 6 months follow-up, the DGF group showed worse graft function, as well as a smaller incidence of normal histological pattern at graft biopsies. Conclusions. About parameters associated with brain-death donor resuscitation, except for non-traumatic cause of death, the others did not demonstrate any relationship with DGF. Importantly we show that donor age > 15 years and gender combination female donor to male recipient are clearly major independent risk factors for prolonged DGF in children. Furthermore in our paediatric series DGF revealed an important predictor of poor short-term graft function.
RIASSUNTO Introduzione e scopo dello studio. In pazienti adulti, danni legati allo stato di morte cerebrale e alle manovre rianimatorie possono influenzare la ”delayed graft function” (DGF) e l‟outcome dell‟organo trapiantato. Scopo dello studio è stato valutare, in trapiantati di rene in età pediatrica, la correlazione tra parametri rianimatori del donatore cadavere e l‟outcome dell‟organo trapiantato. Materiali e Metodi. Il campione casistico è consistito in 116 pazienti (età ≤ 16 anni), sottoposti a trapianto di rene da cadavere dal 2004 al 2011. I pazienti sono stati divisi in gruppo 0 (No. 11) con DGF e gruppo 1 (No. 105) senza DGF. Gli “endpoints” dello studio sono stati: DGF, funzione dell‟organo trapiantato a 6 mesi dal trapianto e sopravvivenza del paziente e del rene trapiantato a 6 mesi. Risultati. L‟analisi monovariata dei parametri del donatore in morte cerebrale ha dimostrato che l‟età superiore a 15 anni, la combinazione donatore femmina/ricevente maschio e morte da accidente cerebrovascolare rappresentano fattori di rischio per lo sviluppo di DGF. Il modello di regressione logistica multivariata ha confermato come fattori di rischio indipendente per DGF l‟età del donatore e la combinazione donatore femmina/ricevente maschio. A 6 mesi di follow-up, il gruppo con DGF ha dimostrato una funzionalità renale e un quadro istologico bioptico significativamente peggiori rispetto al gruppo senza DGF. Conclusioni. Ad eccezione della causa di morte non traumatica, nessuna variabile ha influenzato la DGF nei bambini trapiantati. L'età del donatore (>15 anni) e la combinazione donatore femmina/ricevente maschio si sono rivelati importanti fattori di rischio indipendente per lo sviluppo di DGF. Inoltre, la DGF è risultato un fattore predittivo di funzionalità a breve termine dell‟organo trapiantato.

Thoracic Non-Rhabdo Soft Tissue Sarcomas (NRSTS) are a rare entity in paediatric age, and are characterized by a dismal prognosis. Being a seldom occurring site, thorax is grouped together with other infrequent localizations, following the classification used for Rhabdomyosarcomas. Inside the thorax, clinicians divide three different sub-localizations: thoracic wall, paraspinal site and intrathoracic region. The most frequent histotype is represented by Ewing Sarcomas (ES)/pPNET, followed by the “adult-type” NRSTS, the Synovial Sarcoma and other histotypes. The aim of the present analysis has been to evaluate the data about patients with thoracic NRSTS enrolled in three subsequent Italian Paediatric Protocols since 1979 to 2005, in order to improve the knowledge on this rare subject. Ninety-nine patients have been considered: 66 were localized in the thoracic wall, 18 were intrathoracic, 15 paraspinal; 58 were ES/pPNET, 29 “adult-type” NRSTS, 5 Synovial Sarcoma and 7 other histotypes. We have identified the prognostic role played by dimensions, local invasiveness, loco-regional lymph nodes involvement and metastatic distant spread; but we have also identified the undoubtful prognostic advantage determined by the initial complete excision, itself correlated to the over mentioned characteristics. These patterns are common to all the localizations and to all histotypes, even if paraspinal tumours present a worst prognosis compared to other sites and ES/pPNET more often are diagnosed with advanced disease and metastatic spread. We are aware of the wide variety of the examined population and of the complexity of this analysis, therefore no definitive conclusions are possible, but this work improves the knowledge on this topic. Thoracic NRSTS represent a challenge in particular for paediatric surgeons, especially from the technical point of view: on one hand the “radicality”, with the aim to remove completely the tumour, on the other side the reconstructive program. The local control is fundamental in order to give good chances to obtain a long-term survival, but a satisfying functional and aesthetic result is equally important in young patients. And thoracic cage presents some peculiar characteristics of resistance and elasticity, therefore being a good subject to research new operative techniques and innovative reconstructing strategies, respecting the radicality and thus avoiding radiotherapy and its long-term sequelae.
I Sarcomi delle Parti Molli non Rabdomiosarcoma (NRSTS) localizzati al torace rappresentano un’entità rara in età pediatrica, caratterizzata da una prognosi infausta. Il torace, proprio per il fatto di essere una sede raramente colpita da questi tumori, viene raggruppato insieme ad altre sedi infrequenti, seguendo quella che è la classificazione applicata ai Rabdomiosarcomi: al suo interno si possono distinguere la parete toracica, la sede paraspinale e la regione intratoracica. L’istotipo più frequentemente rappresentato è il Sarcoma di Ewing (ES)/pPNET, seguito dal gruppo dei NRSTS “adult-type”, dal Sarcoma Sinoviale e da altri istotipi. Scopo della presente analisi è stato quello di analizzare la popolazione di NRSTS toracici registrati nei tre Protocolli Italiani che si sono susseguiti dal 1979 al 2005, al fine di incrementare le conoscenze su questo raro gruppo di neoplasie. Sono stati presi in considerazione 99 pazienti, 66 localizzati a livello della parete toracica, 18 a localizzazione intratoracica, 15 paraspinali; 58 erano ES/pPNET, 29 “adult-type” NRSTS, 5 Sarcomi Sinoviali e 7 altri istotipi. E’ stato riconosciuto il ruolo prognostico giocato da dimensioni, invasività locale, estensione linfonodale loco-regionale e disseminazione metastatica a distanza; ma anche l’indubbio vantaggio prognostico determinato dall’exeresi iniziale completa, che a sua volta è correlata alle caratteristiche summenzionate. Queste caratteristiche sono trasversali a tutte le sottosedi e a tutti gli istotipi, sebbene i tumori paraspinali dimostrino una prognosi più severa rispetto alle altre sedi ed i ES/pPNET si manifestino più frequentemente in una forma avanzata di malattia con metastasi a distanza. Sicuramente l’eterogeneità del campione preso in esame rende difficili delle conclusioni definitive, tuttavia questa analisi apporta un incremento nelle conoscenze su questo argomento, che rappresenta una sfida particolare per il chirurgo pediatra anche dal punto di vista delle difficoltà legate alla chirurgia, sia nella sua parte demolitiva sia nella sua parte ricostruttiva. Infatti, se è pur vero che il controllo locale è fondamentale per dare delle valide possibilità di guarigione, è altrettanto importante garantire un risultato funzionale ed estetico soddisfacente a questi piccoli pazienti, e la gabbia toracica, con le sue caratteristiche di resistenza ed elasticità, costituisce uno stimolo alla ricerca di strategie operatorie e di tecniche ricostruttive innovative, sempre nel rispetto della radicalità che consente di evitare la radioterapia ed i suoi possibili effetti collaterali.