Dissertations / Theses on the topic 'Makrolider'

Streptococcus pneumoniae (pneumokok) je  jedan  od  vodećih  uzroka morbiditeta i mortaliteta širom sveta, kada su u pitanju infektivne bolesti. Pretežno izaziva infekcije gornjih respiratornih puteva (sinuzitis, otitis) i konjunktivitis. Vodeći je uzročnih vanbolničkih pneumonija, bakterijskog meningitisa i sepse. Lekovi izbora u terapiji pneumokoknih bolesti su beta laktamski antibiotici i makrolidi. Iako se makrolidni antibiotici uveliko koriste u lečenju pneumokoknih infekcija širom sveta, porast rezistencije na makrolide  bi  mogao  da  kompromituje  njihovu  upotrebu. Rezistencija pneumokoka na makrolide je posredovana putem dva glavna mehanizma: modifikacija ciljnog mesta delovanja leka  i aktivni efluks leka. Metilaciju 23S ribozomalne ribonukleinske kiseline (rRNK) obavlja enzim metilaza, čiju sintezu kodira ermB gen. Kod ovog tipa rezistencije dolazi do ukrštene rezistencije na makrolide (M), linkozamide (L) i streptogramine B (Sb). Ovakav vid rezistencije se ispoljava kao MLS_b - fenotip i karakteriše ga visok nivo rezistencije. Može se javiti kao konstitutivni (cMLS) i inducibilni (iMLS). Drugi mehanizam rezistencije na makrolide je aktivni efluks leka, kodiran od strane mefA  gena. Efluks antibiotik a determiniše rezistenciju samo na 14-člane i 15-člane makrolide, bez ukrštene rezistencije. Ispoljava se kao M-fenotip, a karakteriše ga niži stepen rezistencije. Cilj ove studije je bio  da  se  odredi u čestalost  makrolidne  rezistencije Streptococcus pneumoniae među invazivnim i neinvazivnim izolatima kod dece i odraslih, da se odrediti u čestalost korezistencije i multiple rezistencije kod makrolid rezistentnih sojeva  Streptococcus pneumoniae, da se fenotipski odredi tip rezistencije na makrolide i da se ispita genska osnova makrolidne rezistencije (detektovati prisustvo ermB i mefA gena). Analizirani su podaci o 326 sojeva Streptococcus pneumoniae rezistentnih na makrolide (MRSP) sakupljenih širom  Srbije  u  periodu  od  januara  2010.  do  decembra  2012.  godine. Sakupljeni  MRSP  izolati  su  transportovani  u  Nacionalnu  referentnu laboratoriju za streptokok radi daljih ispitivanja. Identifikacija je vršena na osnovu mikroskopskih, kulturelnih i biohemijskih osobina. Konzervacija je vršena u moždano-srčanom bujonu sa 10% sadržajem glicerola na -80°C. Dvostruki  disk  difuzioni  test,  kombinovani  difuzion odilucioni  test  i automatizovani VITEK 2 sistem su korišćeni za određivanje fenotipova rezistencije na makrolide. Geni koji kodiraju rezistenciju na makrolide su detektovani PCR metodom. Ukupna rezistencija sojeva S.pneumoniae na makrolide u Srbiji je iznosila 34%. Sojevi S.pneumoniae rezistentni na makrolide su češće bili izolovani kod dece (36%) u odnosu na odrasle (29%) osobe, i češće su izolovani iz neinvazivnih (35,5%) u odnosu na invazivne (27,4%) materijale. Dominantan fenotip rezistencije na makrolide je bio MLS_b fenotip (78,5%). Konstitutivan MLS fenotip je bio zastupljen kod 73,9%, a inducibilan MLS kod 4,6% MRSP izolata. Potvrđena je udruženost mefA  gena i M fenotipa; ermB gena i iMLS fenotipa, kao i ermB gena i cMLS fenotipa. Prisustvo oba ermB i mefA gena rezistencije je potvrđeno kod 43,9 % izolata. Svi izolati sa koji su imali oba gena rezistencije su ispoljili  MLS_b fenotip.  Istovremena  neosetljivost  na  penicilin  je bila zastupljena kod 16% MRSP sojeva. Visok nivo rezistencije na penicilin je imalo svega 5,8% MRSP izolata. Među MRSP sojevima je bio prisutan visok nivo  rezistencije  na  tetraciklin  (81,3%)  i  trimetoprim-sulfametoksazol (74,3%). Multirezistenti sojevi, koji su bili rezistentni na tetracikline i trimetoprim-sulfametoksazol su predstavljali dve trećine (66,1%) MRSP izolata.  Zastupljenost  udružene  rezistencije  MRSP  na  tetraciklin i trimetoprim-sulfametoksazol je bila veća kod sojeva sa MLS fenotipom (73,1%)  u  odnosu  na  sojeve  sa  M  fenotipom  (36,7%). Zastupljenost istovremene rezistencije na makrolide i druge antibiotike među kojima su penicilin, amoksicilin, cefotaksim, tetraciklin, trimetoprim-sulfametoksazol, kao  i  multirezistentnih  sojeva  je  bila  veća  kod pedijatrijskih  izolata pneumokoka  u  odnosu  na  sojeve  dobijene  kod  odraslih.  U čestalost istovremene rezistencije na makrolide i druge antibiotike među kojima su tetraciklin i ofloksacin je bila više prisutna među neinvazivnim u odnosu na invazivne MRSP izolate. Invazivni MRSP izolati iz likvora su pokazivali veću rezistenciju na beta laktamske antibiotike u odnosu neinvazivne sojeve. MRSP sojevi su pokazali veoma visok nivo osetljivosti na levofloksacin (99,6), telitromicin (98,4%), cefotaksim (93,5%), i mipenem (97,3%). MRSP sojevi su u potpunosti bili osetljivi na vankomicin, linezolid, moksifloksacin, sparfloksacin, rifampicin  i  pristinamicin.  Među  invazivnim  sojevima S.pneumoniae rezistentnim na makrolide je nađeno 12 različitih serotipova. Polovina izolata je pripadala serotipovima 19F (25%) i 14 (23%), dok su sledeći po učestalosti bili 6A (10,4%) i 23F (8,3%). Istovremena rezistencija na makrolide, penicilin, tetracikline i trimetoprim-sulfametoksazol je nađena kod serotipova 19F, 14 i 23F, dok su serotpovi 12F i 31 bili neosetljivi samo na makrolide. Naše istraživanje predstavlja prvu detaljnu analizu fenotipskih i  genotipskih  osobina  sojeva  pneumokoka  rezistentnih  na  makrolidne antibiotike u Srbiji. Dobijeni rezultati ukazuju na  potrebu za aktivnim nadzorom nad pneumokoknim infekcijama u Srbiji.
Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) is one of the leading morbidity and  mortality  causes  all  over  the  world  with  respect  to  infectious  diseases. Streptococcus  pneumoniae is  a  leading  cause  of upper  respiratory  tract infections  (  sinusitis,  otitis)  and  conjunctivitis. It  is  also  the  most  common cause  of  community-acquired  pneumonia, bacterial  meningitis  and  sepsis. Beta lactam and  macrolide antibiotics remained a first choice for empirical treatment of pneumococcal infections. Although macrolides are widely used for   treatment   of   pneumococcal   infections, an   increase   in   macrolide resistance  might compromise  their use. Pneumococcal  macrolide resistance is  mediated  by  two  major  mechanisms:  target  site  modification  and  active drug  efflux.  Methylation  of  the  23S  ribosomal  ribonucleic  acid  (rRNA)  is performed   by   the   enzyme   methylase,   encoded   by   the ermB gene. Modification  of  ribosomal  targets  leads  to  cross-resistance to  macrolides (M),  lincosamides  (L)  and  streptogramins  B  (Sb). It  is  expressed  as  the MLS_b –phenotype,  which  confers  a  high-level  resistance. This  phenotype  can   be   either   constitutively   (cMLS)   or   inducibly   (iMLS). expressed. Another macrolide resistance mechanism is the active drug efflux, encoded by  the mefA  gene.  The  drug  efflux  confers  resistance  to  14-  and  15-membered  macrolides  only,  with  no  cross-resistance.  It  is  expressed  as  the M-phenotype,  which  confers  low-level  resistance.  The  objective of  this study   was   :   1) to   examine   the   prevalence of   macrolide   resistant Streptococcus   pneumoniae (MRSP) among   invasive   and   noninvasive isolates in children and adults, 2) to examine the prevalence of coresistance and multiple-resistance among MRSP strains, 3) to examine the prevalence of  macrolide  resistant  phenotypes,  and  4)  to  examine  the  prevalence  of macrolide  resistant  genotypes  (detect  the  presence of  the ermB   and mefA gene).  A  total  of   326  MRSP  strains  were  analyzed,  which  were  collecte dall  over  Serbia  in  the  period  from  January,  2010  - December,  2012.  The collected   MRSP   isolates   were   referred   to   the   National  Reference Laboratory  for  streptococci  and  pneumococci for  further  investigation. Identification based on microscopic, culture and biochemical features of the isolates. Conservation was performed in the brain-heart infusion broth with a  10%  glycerol  content  at  -80°C.  Macrolide  resistance  phenotypes  were determined by a double disc diffusion test, combine d diffusion-dilution test and   automatized   VITEK  2 system. Macrolide   resistance   genes   were  determined by PCR. Overall, macrolide nonsusceptibility rate in Serbia was 34%.  MRSP  isolates  were  more  prevale nt  among  children  (36%)  than adults  (29%),  and  were  more  prevalent  among   noninvasive  (35.5%)  than invasive  (27.4%)  samples.  Predominant  macrolide  resistance  phenotype was  the  MLS b  phenotype  (78.5%),  from  which  73.9 %  belonged  to  cMLS and  4.6%  to  iMLS  phenotype.  All  the  strains  assigne d  to  the  MLS_b phenotype harbored ermB gene, while all the strains with M phenotype had the mefA gene.  The  presence  of  both ermB and mefA resistance  genes  was confirmed  in  43.9  %  of  isolates. All  the  isolates  which  harbored  both resistance genes expressed the MLS_b phenotype. Among macrolide resistant strains,  penicillin  nonsusceptiblility  was  observed   in  16% .  A  high  level resistance was confirmed in 5. 8% of MRSP isolates. MRSP strains showed high  resistance rates to tetracyclin  (81.3%) and  trimethoprim-sulfamethoxazole  (74.3%).  Multiresistant  strains,  resistant  to  tetracyclines and  trimethoprim-sulfamethoxazole,  made  two  thirds  (66.1  %)  of  MRSP isolates.  Among  MRSP,  co-resistance  to  tetracycline  and  trimethoprim-sulfamethoxazole  was  more  prevalent  among  MLS  phenotypes  (73.1%) than  M  phenotypes  (36.7%).  Co-resistance  strains  to  macrolides  and  other antibiotics including    penicillin,   amoxicillin,    cefotaxime,  tetracyclin, trimethoprim-sulfamethoxazole and multiresistant  strains  were more prevalent among children than adult. Coresistance to macrolides and other antibiotics  including  tetracycline  and  ofloxacin  was  more  prevalent  among noninvasive   than   invasive   strains.   Invasive   MRSP   isolates   from   the cerebrospinal fluid showed a higher resistance rate to beta lactam antibiotics than  noninvasive  strains.  MRSP  strains  had  a  high  susceptibility  rates  to levofloxacin   (99.6),   telithromycin   (98.4%),   cefotak sime   (93.5%)   and imipenem  (97.3%).  MRSP  strains  were  fully  susceptible  to  vancomycin, linezolid, moxifloxacin, sparfloxacin, rifampicin a nd pristinamycin. Among macrolide   resistant S.pneumoniae strains,   12 different   serotypes   were identified.  One  half  of  these  isolates  belonged  to the  19F  (27.1%)  and  14 (22.  9%)  serotype,  followed  in  frequency  by  the  6A  (10.41%)  and  23F (8.3%)  serotype .  Multiresistant  strains  (macrolides,  penicillin,  tetracyclines and  trimethoprim-sulfamethoxazole)  belonged  to  serotypes 19F,  14  and 23F, while the 12F and 31 serotype were resistant to macrolides only. This in vestigation   represents   the   first   detailed   analysis of   phenotypes   and genotypes  of  macrolide  resistant  pneumococcal  strains  in  Serbia.  The obtained  results suggest  the need for an active surveillance  of pneumococcal infections in Serbia.

Diploma thesis is focused on determination of macrolide antibiotics in wastewater. Environmental contamination with drugs currently represents a major problem. To determine the level of contamination is necessary to develop the appropriate analytical techniques. From the group of macrolide antibiotics were selected four representatives: erythromycin, clarithromycin, azithromycin and roxithromycin due to their frequent use in Czech Republic. For their isolation from wastewater was selected solid phase extraction and for analysis high performance liquid chromatography with mass spectrometric detection was chosen. Under optimized conditions, the ten days analysis of wastewater from the WWTP Brno-Modřice, two days analysis of wastewater from the WWTP Mikulov and one day analysis of wastewater from WWTP of University of Veterinary and Pharmaceutical Sciences Brno was performed.

Uvod: U prošlosti žučne kiseline su uglavnom razmatrane sa stanovišta njihove funkcije koju obavljaju u crevima jer posreduju u varenju masti i apsorpciji liposolubilnih vitamina. Nedavne studije potvrđuju da žučne kiseline ne igraju samo ulogu u varenju masti, nego se ponašaju i kao signalni molekuli koji stupaju u interakciju sa raznim receptorima uključujući nuklearne receptore i receptore vezane za G-proteine. Kao amfipatični molekuli one su sposobne da reaguju sa fosfolipidima ćelijskih membrana i da poboljšavaju prolazak lekova kroz njih. Stoga se žučne kiseline razmatraju kao promoteri u bukalnim, okularnim i nazalnim farmaceutskim formulacijama. Cilj: Svrha ovog istraživanja je bila da se ispitaju žučne kiseline i njihovi okso derivati kao jedinjenja koja utiču na propustljivost ćelijskih membrana i prolazak lekova do ciljnih tkiva. Materijal i metod: Interakcije makrolidnih antibiotika i žučnih kiselina su ispitivane uz pomoć NMR difuzionih merenja i relaksacije paramagnetičnim jonima. Retencioni parametri odabranih žučnih kiselina su dobijeni korišćenjem hromatografije na normalnim fazama i evaluisani su primenom pet različitih softvera. In vivo ekaperimenti su sprovedeni na 126 eksperimentalnih životinja koje su bile podeljene u 21 grupu. Rezultati: Vezivanje žučnih kiselina za micele je indikovano razlikama u hemijskom pomeranju makrolida i proširenju signala kao posledica redukovane mobilnosti unutar micela. Dodatak micela žučnih kiselina povećava solubilizaciju makrolida za faktor približno 2-3. Sprovedena korelaciona analiza pokazala je značajnu zavisnost između faktora retencije i intestinalne apsorpcije, prodora u MDCK epitelne ćelije, permeabilnost kroz kožu, logBB i PPB%. Putem implementacije in vivo eksperimentalnog dela pokazano je da žučne kiseline utiču na prolazak makrolida u tkivo mozga, bubrega i jetre. Zaključak: Ispitivane žučne kiseline pokazuju dobre farmakokinetske karakteristike i olakšavaju prolazak makrolida kroz različite ćelijske membrane.
Introduction: In the past, bile acids were mostly considered to function in the intestine where they play a role in digestion of fats and mediate absorption of fat-soluble vitamins. Recent studies confirm that bile acids not only facilitate solubilization of fats but behave as signal molecules that interact with various receptors including nuclear receptors and G protein-coupled receptors. As amphipathic molecules they are able to interact with phospholipids of cells membranes and enhance drugs permeation. Thus, bile acids are considered as drug promoters in buccal, ocular, nasal, and transdermal dosage forms. Purpose: The purpose of this research was to investigate bile acids and its oxo derivatives as enhancers in drug permeability. Three research methods to evaluate the characteristics of bile acids and its properties were used. Material and method: The interaction between macrolide antibiotics and bile acids was investigated by NMR chemical-shift titration, self-diffusion measurements and paramagnetic relaxation enhancements. Retention parameters of selected bile acids are acquired by normal-phase thin layer chromatography and evaluated using five different softwares. In vivo experiments were conducted on 126 animals which were divided in 21 groups. Results: Binding bile acids to the micelles is indicated by differences in the chemical shift of the macrolides and line broadening as a consequence of reduced mobility in the micelle. Addition of bile micelles increases the solubility of macrolide antibiotics by a factor of approximately 2–3. Examined correlation analysis confirmed significant dependence between retention factor and intestinal absorption, MDCK epithelial cells, skin permeability, logBB and PPB%. Through the implementation of in vivo experiments it is shown that bile acids promote penetration of macrolides in brain tissue, kidney and liver. Conclusion: Investigated bile acids showed good pharmacokinetic properties and facilitate in macrolides permeation through various membranes.

VÝSLEDKY Analýza okolí genu msr(A) 45 součástí kompletního transpozonu Tn552 a s rekombinačním místem resbinR je identická až k místu rekombinace (resbinR site I). Druhá, v pozici JCSC1435 261884-2618311, je součástí sekvence transpozonu Tn5404. Kompletní transpozon Tn5404 je na vnějších okrajích ohraničen 7 bp dlouhou přímou repeticí (AGTAACT), jež vznikla zdvojením místa inzerce transpozonu (Obr. 5.3.), stejné inzerční místo pro Tn552 bylo pozorováno v chromozómu Entereococcus faecalis CH116 (146, 155). Shrnutí výsledků: Gen msr(A) byl u 41 izolátů lokalizován na chromozómu ve společném místě, pouze u dvou izolátů byl gen lokalizován na plazmidu. Oblast chromozomálně kódovaného genu msr(A) je u všech patnácti podrobněji studovaných izolátů (Tab. 5.1.) vysoce homologní s plazmidem πSh1, integrovaným v genomu S. haemolyticus JCSC1435 izolovaného v Japonsku (179). Uspořádání genů na tomto plazmidu je konzervovaným souborem jednotlivých genových motivů, jehož menší fragmenty byly odděleně popsány v několika dřívějších studiích. Rozdíly v msr(A) hybridizačních profilech jsou dány výhradně variabilitou v úseku kódujícím resolvasu Bin a rekombinasu Sin. Nalezli jsme pět různých typů uspořádání msr(A) oblastí, které se liší od JCSC1435 tímto: i) vložením části transpozonu Tn552 (typ KM50; 7,2kb msr(A)...

In most cases, organic materials exist in the solid phase as polymorphs, solvatomorphs or amorphous forms. Physico-chemical properties in the solid-state are all affected primarily in terms of dissolution, solubility, bioavailability, stability and processability. Therefore investigation into the polymorphic behaviour of APIs has become a mandatory part of drug characterisation studies by pharmaceutical companies (Giron, 2001). The influence polymorphism has on bioavailability and the need for the development of drugs in the amorphous form have instigated regulatory bodies such as the FDA to require solid-state characterisation of pharmaceuticals (Strachan et al., 2005). Subsequently a study was conducted to determine the physico-chemical properties of two poorly watersoluble macrolides; clarithromycin and spiramycin. Characterisation methods included: XRPD, IR, TGA, DSC, SEM, Karl Fischer titration, solubility and stability studies. Recrystallisations of spiramycin from various solvents indicated that this API mainly exists in the amorphous form. The DSC proved to be of little value in the characterisation of this particular macromolecular antibiotic, since wide inter-sample variations were mostly obtained. TGA results showed higher solvent uptake than expected. This was ascribed to the amorphous, sponge-like character of this drug. For the sake of reproducibility and quality of the results, characterisation of spiramycin was more reliant on spectroscopic and crystallographic methods. Samples generated from 2- butanol, chloroform, ethyl acetate, 1.4-dioxane, methanol, n-propanol, iso-propanol and tetrahydrofuran showed characteristic peaks in the range of 2000-2400 cm-1 that were not present in the IR spectrum of the raw material. Conversely, the XRPD patterns were all identical, exhibiting a characteristic “halo” pattern with no detectable Bragg diffraction peaks. A solubility assessment showed no significant differences between the raw material and the recrystallisation products. In fact the raw material seemed to be the form with the highest solubility, albeit it only by a small margin. According to the literature, clarithromycin exists in five forms. Form 0 exists as a solvate, form I is a metastable form, form II is the stable form (Liu & Riley 1998; Deshpande et al., 2006), form III is a solvate of acetonitrile (Liu et al., 2003; Liang & Yao, 2008) and form IV is a hydrate (Avrutov et al., 2003). The stable form II is used in formulations currently on the market. A follow-up study was done relating to a study performed by De Jager (2005). The raw material (form II) was recrystallised from acetonitrile, chloroform and ethyl acetate. Two new crystal forms were prepared from chloroform and acetonitrile. With the necessary driving force, both of these crystals forms are able to convert to the thermodynamically stable form II. In addition, a solvate recrystallised from chloroform together with its corresponding desolvate, showed a 4 and 1.5 fold respective increase in solubility when compared to the raw material. The recrystallisations from ethyl acetate delivered crystals with an XRPD pattern similar to form II. This proved that clarithromycin can be recrystallised directly from this solvent without the need of an additional conversion step, as was the case in the study done by De Jager (2005).
MSc (Pharmaceutics), North-West University, Potchefstroom Campus, 2013

Antibiotika sind für die Behandlung von bakteriellen Infektionskrankheiten in der Human- und Veterinärmedizin von immenser Bedeutung. Angesichts der Korrelation zwischen Antibiotika-Einsatzmengen und der Häufigkeit resistenter Organismen ist eine unsachgemäße bzw. übermäßige Verwendung dieser antibakteriellen Wirkstoffe sowie deren Eintrag über die Kläranlagen in die Umwelt äußerst problematisch. Neben Vermeidungs- und Verminderungsstrategien besteht ein Ansatz zur Problemlösung in der Entwicklung innovativer Technologien zur Entfernung von Antibiotikarückständen aus Wässern, da konventionelle Kläranlagen dieser Anforderung nicht vollständig genügen. Das im Rahmen dieser Arbeit entwickelte und charakterisierte biologische Verfahren basiert auf genetisch modifizierten Saccharomyces cerevisiae-Zellen, welche spezielle Enzyme sezernieren, die zur Umsetzung von Antibiotika herangezogen werden können. Als Modellsystem diente die enzymatische Hydrolyse des β-Lactam-Antibiotikums Ampicillin mit der β-Lactamase TEM-1. Unter Verwendung von enzymhaltigen Hefe-Kulturüberständen gelang es, die grundsätzliche Eignung des Systems zur Entfernung dieses Antibiotikums nachzuweisen. Untersuchungen mit weiteren β-Lactam-Antibiotika zeigten in Übereinstimmung mit der Literatur, dass TEM-1 Penicilline und Cephalosporine der 1. Generation hydrolysieren kann. Am Beispiel der TEM-8 wurde die Übertragbarkeit des Expressionssystems auf andere Lactamase-Varianten erfolgreich demonstriert. Das erweiterte Wirkspektrum dieses Enzyms, welches neben Penicillinen auch Monobactame und Cephalosporine bis zur 4. Generation umfasst, konnte bestätigt werden. Eine mittels Histidin-tag gereinigte TEM-1-His wurde eingesetzt, um systematisch den Einfluss verschiedener Faktoren, wie Temperatur, Substratkonzentration oder pH-Wert, unbeeinflusst von der Matrix der Hefe-Kulturüberstände untersuchen zu können. In diesem Zusammenhang wurde auch die Übertragbarkeit der Ergebnisse von Modell- auf Realwässer, wie Kläranlagenzu- und -ablauf, untersucht, mit dem Ergebnis, dass zumindest die TEM-1 temporär in allen getesteten Matrices aktiv ist. Mit dem Ziel, auch weitere Antibiotikaklassen transformieren zu können, wurden Esterase Ere-A-produzierende Zellen zur Umsetzung von Makrolid-Antibiotika, wie Erythromycin, herangezogen. Die Analyse der gebildeten Transformationsprodukte ergab, dass die antibakterielle Wirkung jeweils durch hydrolytische Spaltung des β-Lactam- bzw. des Makrolid-Ringes irreversibel verloren geht. Somit kann dieses biologische Verfahren prinzipiell zur gezielten Inaktivierung von Antibiotika eingesetzt werden, wobei der größte Vorteil in der erheblichen Beschleunigung der natürlicherweise ablaufenden Umsetzungsprozesse besteht. Diese Methode kann als ergänzende Technologie bei der Aufbereitung von Konzentraten und Wässern aus Spezialanwendungen angewendet werden.:Glossar Abkürzungsverzeichnis Symbolverzeichnis Kurzfassung Abstract 1 Einleitung 1.1 Motivation 1.2 Zielstellung 2 Theoretische Grundlagen 2.1 Antibiotika und Antibiotikaresistenzen 2.1.1 Antibiotika: Definition, Bedeutung, Einsatzmengen, Klassifikation 2.1.2 Wirkmechanismen: Antibiotika versus Antibiotikaresistenzen 2.1.3 Antibiotika und antibiotikaresistente Organismen in der Umwelt 2.1.4 β-Lactam-Antibiotika 2.1.5 Resistenzen gegenüber β-Lactam-Antibiotika 2.1.6 Makrolid-Antibiotika 2.1.7 Resistenzen gegenüber Makrolid-Antibiotika 2.2 Gentechnische Methoden zur gezielten Proteinbiosynthese 2.3 Der eukaryotische Modellorganismus Saccharomyces cerevisiae 2.4 Enzymkinetik 2.5 Spurenstoffanalytik mittels LC-MS/MS-Technik 2.5.1 Einleitung, Entwicklung und Bedeutung 2.5.2 Elektrospray-Ionisation 2.5.3 Der Quadrupol als Massenanalysator 2.5.4 Analysenmodi bei der Tandem-Massenspektrometrie 3 Material und Methoden 3.1 Verwendete Geräte und Chemikalien 3.2 Arbeiten mit gentechnisch veränderte S. cerevisiae-Zellen 3.2.1 Eingesetzte S. cerevisiae-Stämme 3.2.2 Nährmedien und Kultivierung 3.3 Gewinnung von rekombinanten, in S. cerevisiae exprimierten Enzymen 3.3.1 Gewinnung von β-Lactamase-haltigen Kulturüberständen und gereinigter MFα-TEM-1-His 3.3.2 Zellaufschluss zur Gewinnung der intrazellulären Enzyme 3.4 Einsatz der rekombinanten Enzyme zur Umsetzung von β-Lactam- und Makrolid-Antibiotika 3.4.1 Herstellung und Lagerung von Antibiotika-Stammlösungen, internen Standards und Pufferlösungen 3.4.1.1 Antibiotika-Stammlösungen 3.4.1.2 Interne Standards 3.4.1.3 Herstellung von Kaliumphosphatpuffer 3.4.2 Einsatz von enzymhaltigen Kulturüberstand 3.4.2.1 Nitrocefin-Assay 3.4.2.2 Allgemeine Vorgehensweise und Standardversuchsbedingungen 3.4.2.3 Variation der Antibiotika Konzentration 3.4.2.4 Untersuchungen mit TEM-8-haltigen Kulturüberständen 3.4.3 Einsatz von gereinigter TEM-1 β-Lactamase 3.4.3.1 Proteinbestimmung 3.4.3.2 Allgemeine Vorgehensweise und Standardversuchsbedingungen 3.4.3.3 Variation der Enzymkonzentration 3.4.3.4 Einfluss der Art des Puffers 3.4.3.5 Pufferkonzentration und Leitfähigkeit 3.4.3.6 Variation des pH Wertes 3.4.3.7 Einfluss der Temperatur 3.4.3.8 Variation des eingesetzten β-Lactam-Antibiotikums (Substrat) 3.4.3.9 Variation der AMP-Konzentration 3.4.3.10 Bestimmung der Michaelis-Menten-Konstante Km bei der AMP-Umsetzung mittels TEM-1-His 3.4.3.11 Aktivität und Stabilität der TEM-1-His in Realwässern 3.4.3.12 Bestimmung der spezifischen Enzymaktivität 3.4.4 Einsatz von zellfreien Rohextrakten 3.4.4.1 Allgemeine Versuchsbedingungen 3.4.4.2 Untersuchungen zur Esterase Ere-A 3.5 LC-MS/MS-Analytik 3.5.1 Probenvorbereitung und Herstellung von Kalibrierstandards 3.5.2 HPLC-Parameter 3.5.2.1 Zusammensetzung der Eluenten 3.5.2.2 HPLC-Methoden 3.5.3 Massenspektrometrische Parameter 3.5.4 Auswertung mittels Analyst 3.5.5 Leistungsgrenzen für die qualitative und quantitative AMP Bestimmung 3.5.6 Charakterisierung von Transformationsprodukten 4 Ergebnisse und Diskussion 4.1 Einsatz von TEM-1-haltigem Kulturüberstand zur Transformation von β-Lactam-Antibiotika 4.1.1 Entwicklung einer Versuchsvorschrift zum Nachweis der Enzymaktivität gegenüber β-Lactam-Antibiotika im Kulturüberstand 4.1.1.1 Nachweis der enzymatischen Aktivität mittels Nitrocefin-Assay 4.1.1.2 Versuche mit β-Lactam-Antibiotika 4.1.1.3 Probenvorbereitung 4.1.2 Optimierung einer HPLC-MS/MS-Methode zur Quantifizierung von β-Lactam-Antibiotika unter Berücksichtigung der Probenmatrix 4.1.3 Nachweis der Antibiotika Umsetzung mit TEM-1-haltigen Kulturüberständen 4.1.4 Wirksamkeit der TEM-1-haltigen Kulturüberstände in Abhängigkeit von ausgewählten Randbedingungen 4.1.4.1 Einfluss der Enzymkonzentration 4.1.4.2 Einfluss der Leadersequenz 4.1.4.3 Einfluss des pH-Wertes 4.1.4.4 Einflüsse auf die Enzymkonzentration im Kulturüberstand 4.1.4.5 Enzymatische Stabilität bei Lagerung 4.1.4.6 Variation der Substratkonzentration 4.1.4.7 Substratspezifität 4.1.5 Zwischenfazit 4.2 Einsatz von TEM-8-haltigem-Kulturüberstand zur Transformation von β-Lactam-Antibiotika 4.2.1 Nachweis der enzymatischen Aktivität von TEM-8 4.2.1.1 Auswahl der Modellsubstanzen AMP und CEF 4.2.1.2 Versuche zum Nachweis der TEM-8-Aktivität in nicht-gepuffertem Kulturüberstand 4.2.1.3 Nachweis der TEM-8-Aktivität unter Verwendung von MES-gepuffertem Kulturmedium 4.2.2 Wirksamkeit der TEM-8-haltigen Kulturüberständen in Abhängigkeit von ausgewählten Randbedingungen 4.2.2.1 Einfluss der Leadersequenz 4.2.2.2 Einfluss des Polyhistidin-tags 4.2.2.3 Substratspezifität 4.2.3 Vergleich TEM-1 und TEM-8 4.2.3.1 Prinzipielle Unterschiede in der Kultivierung zur Gewinnung von TEM-8 4.2.3.2 Versuche zur AMP-Umsetzung 4.2.3.3 Abnahme der AMP-Konzentration in den Kontrollproben 4.2.3.4 Versuche zur CEF-Umsetzung 4.2.4 Zwischenfazit 4.3 Einsatz von isolierter TEM-1-His zur Transformation von β-Lactam-Antibiotika 4.3.1 Nachweis der Enzymaktivität 4.3.2 Wirksamkeit des Enzyms TEM-1-His in Abhängigkeit von ausgewählten Randbedingungen 4.3.2.1 Variation der Enzymkonzentration 4.3.2.2 Variation der Pufferkonzentration und Pufferart 4.3.2.3 Variation des pH-Wertes 4.3.2.4 Variation der Temperatur 4.3.2.5 Variation des Substrates 4.3.2.6 Variation der Substratkonzentration 4.3.2.7 Kinetik der enzymatischen Reaktion mit TEM-1-His 4.3.2.8 Untersuchungen zur Umsetzung in Realwässern 4.3.2.9 Langzeitstabilität der isolierten TEM-1-His 4.3.3 Zwischenfazit: spezifische enzymatische Aktivität der TEM-1-His in Abhängigkeit von verschiedenen Versuchsparametern 4.4 Einsatz von Esterase Ere-A-haltigen Rohextrakten 4.4.1 Nachweis der Enzymaktivität im Rohextrakt 4.4.2 Wirksamkeit der Esterase Ere-A in Abhängigkeit von ausgewählten Randbedingungen 4.4.2.1 Einfluss verschiedener Puffer 4.4.2.2 Einfluss von C- und N-terminal angefügten Sequenzen 4.4.2.3 Substratspezifität 4.4.3 Zwischenfazit 4.5 Charakterisierung von Transformationsprodukten 4.5.1 Vorbemerkungen 4.5.2 Transformationsprodukte bei der Umsetzung von β-Lactam-Antibiotika 4.5.3 Einsatz der Esterase Ere A zur Transformation von Makrolid-Antibiotika 4.5.3.1 Transformationsprodukte von Erythromycin 4.5.3.2 Transformationsprodukte von Clarithromycin 4.5.3.3 Transformationsprodukte von Roxithromycin 4.5.4 Zwischenfazit 5 Zusammenfassung 6 Ausblick Literaturverzeichnis Abbildungsverzeichnis Tabellenverzeichnis Anhang A-1 Weitere Analysenmodi bei der Tandem-Massenspektrometrie A-2 Verwendete Geräte und Chemikalien A-3 HPLC-Methoden A-4 Massenspektrometrische Parameter A-5 Erster Versuch zum Nachweis der enzymatischen Aktivität von TEM-1-haltigen Kulturüberstand A-6 Nachweis der Inhibitorwirkung von Sulbactam in Kombination mit TEM-1-His A-7 TEM-1: Variation der Substratkonzentration A-8 TEM-8: Substratspezifität A-9 Vergleich der AMP-Umsetzung mit TEM-1- und TEM-8-haltigen Kulturüberständen sowie den Rohextrakten A-10 TEM-1-His: Variation des pH-Wertes A-11 TEM-1-His: Substratspezifität A-12 Ere-A: Variation der Puffer A-13 Ere-A: Substratspezifität Selbstständigkeitserklärung
Antibiotics play an important role in human and veterinary medicine for the treatment of bacterial infectious diseases. However, regarding the known correlation between the quantities of antibiotics applied and the frequency of resistant organisms, the improper and excessive use of these antibacterial agents leads to serious problems. Their presence in the environment is largely caused by sewage systems due to their incomplete removal in conventional wastewater treatment plants. Therefore, besides avoidance and reduction strategies, one approach to address this issue is to develop innovative technologies for the removal of antibiotic residues from water. The biological method developed and characterized within this work is based on genetically modified Saccharomyces cerevisiae cells, which secrete special enzymes that can be used for the transformation of antibiotics. The enzymatic hydrolysis of the β-lactam-antibiotic ampicillin by the β-lactamase TEM-1 was employed as a model system. By using enzyme-containing yeast culture supernatants, it was possible to prove the suitability of the developed system for the removal of the mentioned antibiotic. The obtained results with other β-lactam-antibiotics showed in accordance with the literature, that TEM-1 was able to hydrolyse penicillins and the cephalosporins of the first-generation. Taking TEM-8 as an example, the transferability of this expression system to alternative lactamase was successfully demonstrated. The activity of this enzyme toward an extended substrate spectrum, which includes not only penicillins but also monobactams and cephalosporins up to the fourth-generation, could be confirmed. The histidine-tagged purified TEM-1-His was used to systematically investigate the influence of various factors, such as temperature, substrate concentration or pH value, independently from the matrix of the yeast culture supernatants. Furthermore, the transferability of the results from model to real water (e. g. influent and effluent from a sewage treatment plant) was investigated with the result that TEM-1 was at least temporarily active in all tested matrices. In order to be able to transform other classes of antibiotics, esterase Ere-A-producing cells were employed to transform macrolide antibiotics, such as erythromycin. The analysis of the formed transformation products revealed that the antibacterial activity is irreversibly lost by the hydrolytic cleavage of the β-lactam or macrolide ring. Therefore, the biological process can be generally used for the selective inactivation of antibiotics, affording a considerable acceleration of the naturally occurring transformation process as its greatest advantage. This method is considered to be a complementary technology for the treatment of concentrates and water from special applications.:Glossar Abkürzungsverzeichnis Symbolverzeichnis Kurzfassung Abstract 1 Einleitung 1.1 Motivation 1.2 Zielstellung 2 Theoretische Grundlagen 2.1 Antibiotika und Antibiotikaresistenzen 2.1.1 Antibiotika: Definition, Bedeutung, Einsatzmengen, Klassifikation 2.1.2 Wirkmechanismen: Antibiotika versus Antibiotikaresistenzen 2.1.3 Antibiotika und antibiotikaresistente Organismen in der Umwelt 2.1.4 β-Lactam-Antibiotika 2.1.5 Resistenzen gegenüber β-Lactam-Antibiotika 2.1.6 Makrolid-Antibiotika 2.1.7 Resistenzen gegenüber Makrolid-Antibiotika 2.2 Gentechnische Methoden zur gezielten Proteinbiosynthese 2.3 Der eukaryotische Modellorganismus Saccharomyces cerevisiae 2.4 Enzymkinetik 2.5 Spurenstoffanalytik mittels LC-MS/MS-Technik 2.5.1 Einleitung, Entwicklung und Bedeutung 2.5.2 Elektrospray-Ionisation 2.5.3 Der Quadrupol als Massenanalysator 2.5.4 Analysenmodi bei der Tandem-Massenspektrometrie 3 Material und Methoden 3.1 Verwendete Geräte und Chemikalien 3.2 Arbeiten mit gentechnisch veränderte S. cerevisiae-Zellen 3.2.1 Eingesetzte S. cerevisiae-Stämme 3.2.2 Nährmedien und Kultivierung 3.3 Gewinnung von rekombinanten, in S. cerevisiae exprimierten Enzymen 3.3.1 Gewinnung von β-Lactamase-haltigen Kulturüberständen und gereinigter MFα-TEM-1-His 3.3.2 Zellaufschluss zur Gewinnung der intrazellulären Enzyme 3.4 Einsatz der rekombinanten Enzyme zur Umsetzung von β-Lactam- und Makrolid-Antibiotika 3.4.1 Herstellung und Lagerung von Antibiotika-Stammlösungen, internen Standards und Pufferlösungen 3.4.1.1 Antibiotika-Stammlösungen 3.4.1.2 Interne Standards 3.4.1.3 Herstellung von Kaliumphosphatpuffer 3.4.2 Einsatz von enzymhaltigen Kulturüberstand 3.4.2.1 Nitrocefin-Assay 3.4.2.2 Allgemeine Vorgehensweise und Standardversuchsbedingungen 3.4.2.3 Variation der Antibiotika Konzentration 3.4.2.4 Untersuchungen mit TEM-8-haltigen Kulturüberständen 3.4.3 Einsatz von gereinigter TEM-1 β-Lactamase 3.4.3.1 Proteinbestimmung 3.4.3.2 Allgemeine Vorgehensweise und Standardversuchsbedingungen 3.4.3.3 Variation der Enzymkonzentration 3.4.3.4 Einfluss der Art des Puffers 3.4.3.5 Pufferkonzentration und Leitfähigkeit 3.4.3.6 Variation des pH Wertes 3.4.3.7 Einfluss der Temperatur 3.4.3.8 Variation des eingesetzten β-Lactam-Antibiotikums (Substrat) 3.4.3.9 Variation der AMP-Konzentration 3.4.3.10 Bestimmung der Michaelis-Menten-Konstante Km bei der AMP-Umsetzung mittels TEM-1-His 3.4.3.11 Aktivität und Stabilität der TEM-1-His in Realwässern 3.4.3.12 Bestimmung der spezifischen Enzymaktivität 3.4.4 Einsatz von zellfreien Rohextrakten 3.4.4.1 Allgemeine Versuchsbedingungen 3.4.4.2 Untersuchungen zur Esterase Ere-A 3.5 LC-MS/MS-Analytik 3.5.1 Probenvorbereitung und Herstellung von Kalibrierstandards 3.5.2 HPLC-Parameter 3.5.2.1 Zusammensetzung der Eluenten 3.5.2.2 HPLC-Methoden 3.5.3 Massenspektrometrische Parameter 3.5.4 Auswertung mittels Analyst 3.5.5 Leistungsgrenzen für die qualitative und quantitative AMP Bestimmung 3.5.6 Charakterisierung von Transformationsprodukten 4 Ergebnisse und Diskussion 4.1 Einsatz von TEM-1-haltigem Kulturüberstand zur Transformation von β-Lactam-Antibiotika 4.1.1 Entwicklung einer Versuchsvorschrift zum Nachweis der Enzymaktivität gegenüber β-Lactam-Antibiotika im Kulturüberstand 4.1.1.1 Nachweis der enzymatischen Aktivität mittels Nitrocefin-Assay 4.1.1.2 Versuche mit β-Lactam-Antibiotika 4.1.1.3 Probenvorbereitung 4.1.2 Optimierung einer HPLC-MS/MS-Methode zur Quantifizierung von β-Lactam-Antibiotika unter Berücksichtigung der Probenmatrix 4.1.3 Nachweis der Antibiotika Umsetzung mit TEM-1-haltigen Kulturüberständen 4.1.4 Wirksamkeit der TEM-1-haltigen Kulturüberstände in Abhängigkeit von ausgewählten Randbedingungen 4.1.4.1 Einfluss der Enzymkonzentration 4.1.4.2 Einfluss der Leadersequenz 4.1.4.3 Einfluss des pH-Wertes 4.1.4.4 Einflüsse auf die Enzymkonzentration im Kulturüberstand 4.1.4.5 Enzymatische Stabilität bei Lagerung 4.1.4.6 Variation der Substratkonzentration 4.1.4.7 Substratspezifität 4.1.5 Zwischenfazit 4.2 Einsatz von TEM-8-haltigem-Kulturüberstand zur Transformation von β-Lactam-Antibiotika 4.2.1 Nachweis der enzymatischen Aktivität von TEM-8 4.2.1.1 Auswahl der Modellsubstanzen AMP und CEF 4.2.1.2 Versuche zum Nachweis der TEM-8-Aktivität in nicht-gepuffertem Kulturüberstand 4.2.1.3 Nachweis der TEM-8-Aktivität unter Verwendung von MES-gepuffertem Kulturmedium 4.2.2 Wirksamkeit der TEM-8-haltigen Kulturüberständen in Abhängigkeit von ausgewählten Randbedingungen 4.2.2.1 Einfluss der Leadersequenz 4.2.2.2 Einfluss des Polyhistidin-tags 4.2.2.3 Substratspezifität 4.2.3 Vergleich TEM-1 und TEM-8 4.2.3.1 Prinzipielle Unterschiede in der Kultivierung zur Gewinnung von TEM-8 4.2.3.2 Versuche zur AMP-Umsetzung 4.2.3.3 Abnahme der AMP-Konzentration in den Kontrollproben 4.2.3.4 Versuche zur CEF-Umsetzung 4.2.4 Zwischenfazit 4.3 Einsatz von isolierter TEM-1-His zur Transformation von β-Lactam-Antibiotika 4.3.1 Nachweis der Enzymaktivität 4.3.2 Wirksamkeit des Enzyms TEM-1-His in Abhängigkeit von ausgewählten Randbedingungen 4.3.2.1 Variation der Enzymkonzentration 4.3.2.2 Variation der Pufferkonzentration und Pufferart 4.3.2.3 Variation des pH-Wertes 4.3.2.4 Variation der Temperatur 4.3.2.5 Variation des Substrates 4.3.2.6 Variation der Substratkonzentration 4.3.2.7 Kinetik der enzymatischen Reaktion mit TEM-1-His 4.3.2.8 Untersuchungen zur Umsetzung in Realwässern 4.3.2.9 Langzeitstabilität der isolierten TEM-1-His 4.3.3 Zwischenfazit: spezifische enzymatische Aktivität der TEM-1-His in Abhängigkeit von verschiedenen Versuchsparametern 4.4 Einsatz von Esterase Ere-A-haltigen Rohextrakten 4.4.1 Nachweis der Enzymaktivität im Rohextrakt 4.4.2 Wirksamkeit der Esterase Ere-A in Abhängigkeit von ausgewählten Randbedingungen 4.4.2.1 Einfluss verschiedener Puffer 4.4.2.2 Einfluss von C- und N-terminal angefügten Sequenzen 4.4.2.3 Substratspezifität 4.4.3 Zwischenfazit 4.5 Charakterisierung von Transformationsprodukten 4.5.1 Vorbemerkungen 4.5.2 Transformationsprodukte bei der Umsetzung von β-Lactam-Antibiotika 4.5.3 Einsatz der Esterase Ere A zur Transformation von Makrolid-Antibiotika 4.5.3.1 Transformationsprodukte von Erythromycin 4.5.3.2 Transformationsprodukte von Clarithromycin 4.5.3.3 Transformationsprodukte von Roxithromycin 4.5.4 Zwischenfazit 5 Zusammenfassung 6 Ausblick Literaturverzeichnis Abbildungsverzeichnis Tabellenverzeichnis Anhang A-1 Weitere Analysenmodi bei der Tandem-Massenspektrometrie A-2 Verwendete Geräte und Chemikalien A-3 HPLC-Methoden A-4 Massenspektrometrische Parameter A-5 Erster Versuch zum Nachweis der enzymatischen Aktivität von TEM-1-haltigen Kulturüberstand A-6 Nachweis der Inhibitorwirkung von Sulbactam in Kombination mit TEM-1-His A-7 TEM-1: Variation der Substratkonzentration A-8 TEM-8: Substratspezifität A-9 Vergleich der AMP-Umsetzung mit TEM-1- und TEM-8-haltigen Kulturüberständen sowie den Rohextrakten A-10 TEM-1-His: Variation des pH-Wertes A-11 TEM-1-His: Substratspezifität A-12 Ere-A: Variation der Puffer A-13 Ere-A: Substratspezifität Selbstständigkeitserklärung

Streptomycetes are soil filamentous Gram-positive bacteria that produce wide variety of pigments and biologically active substances including macrolides. Some of them are used as very efficient antibiotics and strong antifungal agents in medicine, others have became useful tools for staining biomembranes and detecting cholesterol via their internal fluorescence. Actinomycete Streptomyces durmitorensis (wild type strain MS405T ) is a bacteria isolated from Durmitor National Park in Montenegro soil samples. It produces secondary metabolite that has been identified as 32,33-didehydroroflamycoin (DDHR) closely related to the macrolides roflamycoin and generaly used filipin. DDHR exhibits cytototoxic activity against mammalian cells and yeast Saccharomyces cerevisiae strain EGY48. In addition it has interesting fluorescence properties allowing visualization of some membrane components. DDHR interacts with biomembranes, causes their disintegration leading to changes of the actin and tubulin cytoskeleton organization and in higher concentrations it causes cells necrosis. DDHR-sterol interaction in cell membranes decreases fluorescence intensity of DDHR. The compound is able to fluorescently stain aberrant lysosomes and could be therefore potentially used in diagnostics of some lysosomal storage disease.

Protein Vga(A) gives staphylococci resistance to streptogramins A. The recently discovered protein Vga(A)LC differs from Vga(A) only by 7 amino acid residues, but this difference is sufficient for shift of its substrate specificity towards lincosamides. The group of four amino acids in the central part of protein (LGAG in Vga(A) and SVTS in Vga(A)LC) was detected to be crucial for the substrate specificity. In this diploma thesis 5 alternativesets of vga(A)LC gene point mutations were prepared in order to determine the impact of individual amino acids of the aforementioned group on the resistance phenotype. Mutations were prepared in vector pGEM® -T and cloned into shuttle vector pRB374. The prepared constructs were transformed by electroporation into the sensitive strain of Staphylococcus aureus RN4220 and values of minimum inhibitory concentration (MIC) were measured for lincomycin, clindamycin and pristinamycin IIA by the agar dilution method. The transformation was not successful in one of the mutations. Results of setting MIC for the remaining four mutations do not make it possible to specify uniquely the ratio of individual amino acids for determining substrate specificity. Two of the amino acids were found to be important. We anticipate preparation of more mutations.