Dissertations / Theses on the topic 'Lymphome du manteau'

Le Lymphome à Cellules du Manteau (LCM) est une entité récemment identifiée qui se caractérise par la translocation génétique t(11 ;14)(q13 ;q32) et compte pour 2 à 10 % de tous les Lymphomes non-Hodgkiniens. Avec une survie médiane entre 3 et 5 ans après le diagnostic, le LCM est une pathologie agressive et malgré les récentes avancées thérapeutiques, peu d’informations sont disponibles concernant ses facteurs pronostiques. Certaines études ont analysé le rôle des caractéristiques clinicopathologiques et des nouvelles stratégies thérapeutiques, mais on connait peut le rôle des facteurs environnementaux et du mode de vie sur le pronostic des patients atteints de LCM. Entre 2008 et 2012, le groupe LYSA a mené en France deux essais cliniques prospectifs multicentriques : LM manteau 2010 SA "RiBVD" (NCI01457144) et Manteau 2007 SJ "LyMa" (NCT00921414). Après une comparaison de ces patients avec les patients de population générale, l’effet de facteurs socioéconomiques et des habitudes de vie sur la survie des patients a été étudié à l’aide d’un questionnaire qualitatif administré à tous les volontaires après le diagnostic. Nos résultats suggèrent qu’un faible niveau d’éducation, un indice de masse corporelle élevé et de la consommation d’alcool sont associés à un risque de décès plus élevé chez les patients atteints de LCM. Toutefois, l’étude de tels facteurs et de leur influence sur un sous-type de LNH aussi rare requiert des échantillons d’étude de taille plus importante. L’élargissement des critères d’inclusion des patients dans les essais cliniques permettrait de sélectionner davantage de patients mais aussi des patients mieux représentatifs de la population générale. Enfin, l’intégration systématique de ce type de questionnaire dans les protocoles d’essais cliniques serait aussi un atout majeur
Mantle Cell Lymphoma (MCL) is a recently defined entity, typically characterised by the genetic translocation t(11 ;14)(q13 ;q32) and counting for 2 - 10% of all non-Hodgkin Lymphomas. With a median survival between 3 and 5 years after diagnosis, MCL is an agressive disease and despite the recent therapeutic advances little in know about its prognostic factors. Some studies had investigated clinicopathological features and new treatment strategies, but there is a lack of knowledge regarding the impact of lifestyle and environnemental factors on outcome of MCL patients. From 2008 to 2012, the LYSA Group conducted in France two prospective multi center clinical trials on MCL : LM manteau 2010 SA "RiBVD" (NCI01457144) and Manteau 2007 SJ "LyMa" (NCT00921414). After a comparison of these patients with population-based data, socioeconomic factors, lifestyle factors and their influence on survival had been investigated through a qualitative survey administrated to each volunteer after diagnosis. Our findings suggest that low educational attainment, low body body mass index and alcohol consumption are associated with a higher risk of death in MCL. However, to investigate lifestyle factors in this rare NHL subtype, larger studies should be carried out. Clinical trial inclusion criteria must be widen to select more patients and patients more representative of general population. Implementation of these epidemiological studies in clinical practice should be considered

Le lymphome à cellules du manteau (LCM) est une hémopathie maligne B mature, appartenant à la famille des lymphomes non hodgkiniens. Le LCM est caractérisé par la translocation t(11;14)(q13;q32) qui provoque une expression aberrante de cycline D1. C’est une pathologie rare mais à haut risque de rechute, et qui reste le plus souvent incurable suite à l’apparition de clones chimiorésistants. L’acquisition de résistance est intimement liée aux interactions entre les cellules tumorales et leur microenvironnement. Afin de mimer de la manière la plus pertinente possible ces interactions, nous avons mis en place un modèle murin de xénogreffe en utilisant les lignées cellulaires de LCM JeKo1, REC1, Z138 et Granta-519 que nous avons modifiées afin qu’elles expriment un fluorophore (GFP ou m-cherry) et/ou le gène codant pour la luciférase. Après injection aux souris du substrat de la luciférase, la luciférine, nous sommes en mesure de suivre au cours du temps la progression tumorale. Nous pouvons également évaluer le degré d’infiltration tumorale dans la moelle osseuse, la rate, le cerveau et le sang après euthanasie des animaux, par des techniques de cytométrie en flux et d’immunocytochimie. Ce modèle nous a permis de montrer l’intérêt thérapeutique d’un inhibiteur de l’exportine 1 (XPO1) : le KPT 330 (ou selinexor) qui est capable de contenir cycline D1 uniquement au niveau nucléaire. Nous avons montré que la localisation subcellulaire de cycline D1, est retrouvée majoritairement cytoplasmique dans certaines lignées cellulaires de LCM (2/7) et chez un certain nombre de patients (6/42, 14%), et est associée à un fort potentiel d’invasion, de migration et à un phénotype agressif. Par ailleurs, grâce à ce modèle, nous avons pu objectiver le manque d’efficacité in vivo d’agonistes aux récepteurs aux œstrogènes de type β (ER β). Ces récepteurs, présents sur les lymphocytes B étaient supposés inhiber la prolifération cellulaire et provoquer la mort des cellules par apoptose. L’utilisation de deux agonistes des ER β, le diarylpropionitrile (DPN) et l’ERB-041 a montré une absence d’effet de ces molécules, lorsque les cellules tumorales sont au contact de leur microenvironnement. D’autre part, afin de mieux comprendre les mécanismes de résistance aux chimiothérapies, nous avons étudié la résistance de la lignée cellulaire REC-1 traitée par des agents génotoxiques. Nous avons montré que cette lignée présentait une anomalie de dégradation de cycline D1 associée à une activité diminuée du protéasome 26S. Enfin, nous avons montré dans des travaux préliminaires que la protéine fused in sarcoma (FUS) pourrait, lorsqu’elle est associée à cycline D1, être capable de réguler les voies de réparation des dommages à l’ADN. Des anomalies de ces voies induisent une grande instabilité génétique responsable de l’échappement des tumeurs aux traitements, le ciblage de FUS pourrait par conséquent présenter un intérêt thérapeutique.Pris dans leur ensemble, ces résultats permettent de renforcer ou d’infirmer l’intérêt de certaines cibles thérapeutiques dans l’espoir de pouvoir continuer à améliorer la prise en charge des patients. Ils fournissent également un outil pour l’évaluation de nouvelles molécules dans un modèle murin prenant en compte les interactions entre la cellule tumorale et son microenvironnement
Mantle cell lymphoma (MCL) is a mature malignant hemopathy, belonging to the non-Hodgkin's lymphoma family. The MCL is characterized by the translocation t(11;14)(q13;q32) which causes an aberrant expression of cyclin D1. It is a rare disease but at high risk of relapse, and it is most often incurable due to the appearance of chemoresistant clones. The acquisition of resistance is intimately linked to the interactions between the tumor cells and their microenvironment. In order to mimic, in the most relevant way, these interactions, we have implemented a mouse xenograft model using the MCL cell lines JeKo1, REC1, Z138 and Granta-519 which we have modified so that they express a fluorophore (GFP or m-cherry) and / or the gene encoding the luciferase. After injection to the mice of the luciferase substrate, luciferin, we are able to follow over time the tumor progression. We can also assess the degree of tumor infiltration in bone marrow, spleen, brain and blood after euthanasia of animals, by flow cytometry and immunocytochemistry. This model allowed us to show the therapeutic interest of an inhibitor of exportin 1 (XPO1): the KPT 330 (or selinexor) which is able to contain cyclin D1 only on the nuclear level. We have shown that the subcellular localization of cyclin D1 is mainly cytoplasmic in some LCM (2/7) cell lines and in a number of patients (6/42, 14%), and is associated with a high potential Invasion, migration and an aggressive phenotype. Moreover, thanks to this model, we have been able to objectify the in vivo lack of efficacy of agonists to β-type estrogen receptors (ER β). These receptors, present on B lymphocytes, were thought to inhibit cell proliferation and cause cell death by apoptosis. The use of two ER β agonists, diarylpropionitrile (DPN) and ERB-041 showed an absence of effect of these molecules, when the tumor cells are in contact with their microenvironment. On the other hand, in order to better understand the mechanisms of resistance to chemotherapies, we studied the resistance of the REC-1 cell line treated with genotoxic agents. We have shown that this line has an abnormality of cyclin D1 degradation associated with decreased activity of the 26S proteasome. Finally, we have shown in preliminary work that the fused in sarcoma protein (FUS) could, when associated with cyclin D1, be able to regulate the repair pathways of DNA damage. Abnormalities of these pathways induce a great genetic instability responsible for the escape of tumors to treatments, the targeting of FUS could therefore be of therapeutic interest.Taken as a whole, these results reinforce or invalidate the interest of certain therapeutic targets in the hope of continuing to improve the management of patients. They also provide a tool for evaluating new molecules in a murine model that takes into account the interactions between the tumor cell and its microenvironment

La cycline D1 est une protéine impliquée dans la régulation du cycle cellulaire et la transcription. Elle est exprimée dans certaines hémopathies lymphoïdes B : myélome multiple (MM), lymphome à cellule du manteau (MCL) et leucémie à tricholeucocytes (HCL) alors que les lymphocytes B ne l’expriment pas physiologiquement. La cycline D1 est codée par CCND1 et transcrite par épissage alternatif en deux formes (a et b). Les protéines cycline D1a et b diffèrent au niveau d’une région impliquée dans la dégradation des protéines et la localisation subcellulaire. Nous avons étudié l’expression des transcrits et protéines de la cycline D1 dans trois hémopathies B (MM, MCL et HCL). La cycline D1b est principalement présente dans le MCL et rarement dans le MM. Le taux de transcrit a est supérieur au taux de transcrit b. Les deux isoformes ont des demi-vies comparables et sont présentes dans le noyau et le cytoplasme. La cycline D1b ne possède pas les propriétés (stabilité, localisation) associée à son potentiel oncogénique. Elle ne semble donc pas jouer un rôle prépondérant dans la physiopathologie du MM et du MCL. Afin de caractériser le mécanisme d’action de la cycline D1a, nous avons transduit cette protéine dans des lignées cellulaires de MM et de lymphomes n’exprimant pas de cycline D1 endogène et représentant des niveaux de différenciation différents. La transduction de la protéine exogène entraîne une augmentation de la prolifération dans des lignées lymphoïdes pro-B (NALM-6, 697), et un blocage du cycle cellulaire dans des lignées B (RAMOS) et de MM (OPM2, LP1). Ce dernier effet est observé après transduction des cellules par une protéine cycline D1 mutée (K112E). Ceci est en faveur d’un effet indépendant de la phosphorylation de pRb. Cet effet pourrait passer par l’activation de la liaison à l’ADN des sous-unités p65 et c-Rel de NF-kappaB. Parmi les perspectives de ce travail, il faudra rechercher de nouveaux partenaires ou cibles transcriptionnelles de la cycline D1
Cyclin D1 is a protein involved in cell cycle regulation and transcription. It is expressed in some hematological B lymphoid neoplasms: multiple myeloma (MM), mantle cell lymphoma (MCL) and hairy cell leukemia (HCL), but not in B cells. Cyclin D1 is encoded by CCND1 gene and transcribed by alternative splicing in two forms (a and b). The proteins cyclin D1a and b differ in the N-terminal region involved in degradation and subcellular localization. We studied the expression of cyclin D1 RNA and protein in three B hemopathiesl (MM, MCL and HCL). Cyclin D1b is mainly present in MCL and rarely in MM. The rate of transcript a is higher than transcript b. The half-life of both isoforms is similar and both proteins are present in nucleus and cytoplasm. Cyclin D1b has not the properties (stability, localization) associated with its tumorigenic potential. Thus, cyclin D1b does not appear to play a role in the pathophysiology of MM and MCL. To characterize the mechanisms of action of cyclin D1a, we transduced the protein in various MM and lymphoma cell lines with no endogenous cyclin D1 and representative of various levels of differentiation. Transduction of exogenous cyclin D1 leads to an increase of proliferation rate of pro-B cell lines (NALM-6, 697) and a block of cell cycle in B cell line (RAMOS) and MM cell lines (OPM2, LP1). The latter effect is also observed after transduction of cells with a mutated cyclin D1 protein (K112E). This argue for an effect independent of the phosphorylation of pRb. This effect could be mediated by the activation of the DNA binding subunit p65 and c-Rel of NF-kappaB. In the future, we have to look for new binding partners or transcriptional targets of cyclin D1

Le lymphome est un cancer des ganglions lymphatiques, lieu de prolifération et différenciation des cellules immunitaires en particulier des lymphocytes B qui sont des cellules productrices d'anticorps. Les lymphomes résultent de l’accumulation de mutations génétiques dans le génome d’une cellule B normale contribuant à la transformation en cellule B maligne. Cette cellule B dite transformée prolifère alors pour engendrer un clone de cellules B malignes qui s’accumulent au niveau des ganglions lymphatiques, formant alors une tumeur appelée ‘lymphome B’ (pour cancer lymphoïde issu de la transformation maligne des lymphocytes B). Le ganglion lymphatique normal a une structure histologique qui se décompose ainsi, du centre à la périphérie : le centre germinatif, la zone du manteau et la zone marginale. Les lymphomes B sont classés en différents sous-types histologiques en fonction de leur origine topographique au niveau du ganglion lymphatique et de leurs caractéristiques bio cliniques spécifiques. Parmi ces sous-types, une forme particulièrement agressive peut être distinguée : le lymphome à cellules du manteau. Ce sous-type de lymphome est caractérisé par des rechutes successives et une survie qui est généralement courte (médiane de survie de 4 à 5 ans) même si certains patients, avec des formes plus indolentes de lymphomes à cellules du manteau, présentent des survies prolongées (médiane de survie de 7 à 10 ans). Des biomarqueurs prédictifs de la courte survie manquent aujourd’hui, ce qui rend difficile la prise en charge optimisée des patients. Ce projet s’intéresse à cette question. Plus précisément, nous nous proposons de rechercher des mutations génétiques associées à la résistance thérapeutique. Notre approche sera basée sur le séquençage ciblé à haut débit du génome de cellules B tumorales issus de patients présentant des cas classiques du lymphomes à cellules du manteau mais aussi des cas plus particuliers comme ceux présentant des résistances thérapeutiques précoces, par exemple. Par cette approche dite de ‘cartographie’ à l’échelle du génome, nous espérons identifier des nouveaux prédicteurs moléculaires de la survie chez ces patients atteints de lymphome à cellules du manteau et également apporter de nouvelles connaissances dans l’interconnexion entre la génétique et l’épigénétique dans cette maladie
Lymphoma is a cancer of the lymph nodes which are organs in which immune cells, particularly the antibody producing B cells, proliferate and differentiate before circulating in the blood and tissues to fight infection. B cell lymphoid cancers – ‘B cell lymphoma’ arise as a consequence of the occurrence of gene mutations in B cells. By affecting the functions of key B cell genes, these mutations drive the malignant transformation of the affected B cells which then begin to divide abnormally eventually destroying normal lymph node organization and function. The lymph node is divided into distinct micro-anatomical compartments or zones which are called (from the inner to outer most compartment – germinal centre, mantle zone, and marginal zone). B cell lymphoma classification follows this general organization and classifies tumours depending on the compartment of origin of the particular tumour B cell population. This classification thus defines lymphoma according to a ‘histological subtype’ with defined clinic-biological features. Among these subtypes, mantle cell lymphoma (MCL) is a particularly aggressive form of B lymphoid cancer. This type of lymphoma is characterised by successive relapses and short survival (median is 4 to 5 years), although some patients can show long survival. Predictive biomarkers of this clinical behavior are lacking. This project aims to address this question. More specifically we propose to perform whole ‘exome’ sequencing – i.e. sequencing of all protein coding sections of all known protein coding genes in the genome – of the tumour B cell DNA from patients who show refractory or early relapsing disease compared to patients who show relatively long survival. By doing this genome scale study we hope to identify new gene mutations that can serve as molecular predictors of survival and bring new knowledges in the understanding between genetics and epigenetics in MCL

La voie PI3Kinase/AKT/mTOR, est une cible thérapeutique du temsirolimus, un inhibiteur de mTORC1. Dans le but d'obtenir une inhibition plus importante de cette voie j’utilise dans ce projet deux nouvelles molécules :- le NVP-BEZ 235 (BEZ) qui inhibe à la fois mTORC1 et la PI3kinase- l'AZD8055 (AZD), un inhibiteur des complexes mTORC1 et mTORC2. En utilisant différentes lignées de LCM, j’ai démontré que l'effet de ces nouveaux inhibiteurs sur la survie cellulaire est plus important que celui du temsirolimus. Cela est probablement dû à l'inhibition de la phosphorylation de l'AKT et la 4EBP. La deuxième partie de ce projet étudie la synergie entre les inhibiteurs de m-TOR kinase et l'aracytine. Un effet additif important a été démontré. J’ai trouvé en western blot que l’aracytine inhibe la phosphorylation des substrats de la voie Akt –mTOR notamment le 4EBP. L’ibrutinib (un inhibiteur de la voie Btk) a un effet modeste mais j’ai pu démontrer qu'il est capable à induire une inhibition plus importante de la survie cellulaire lorsqu'il est associé à l’aracytine. Cependant il s'est révélé antagoniste aux inhibiteurs de la voie PI3K-AKT-mTOR, cela reste difficile à décortiquer. Enfin, j’ai trouvé un effet additif de l’ibrutinib en combinaison avec la doxorubicine. Cependant les inhibiteurs de m-TOR n'ont pas le même effet. Afin d’expliquer ces résultats, j’ai étudié l’effet de ces molécules sur l’expression de GSTPi, enzyme de détoxification connue pour avoir un rôle important dans la résistance de LCM à l’anthracycline. J’ai mis en évidence une diminution de l’expression de cet enzyme par l’Ibrutinib. En revanche, les inhibiteurs de mTOR n’ont pas un effet sur l’expression de GSTPi. L’ibrutinib pourrait donc sensibiliser le LCM à l’anthracycline en diminuant l’expression de GSTPi
The PI3K / AKT / mTOR pathway is the target of Temsirolimus. However, important resistance is observed. We tried to obtain a more important inhibition of PI3K / AKT pathway using two new molecules :- NVP-BEZ 235 (BEZ) which inhibits both mTORC1 and PI3K- AZD8055 (AZD) an inhibitor of mTORC1 and mTORC2 complexes. Using different cell lines of MCL, we have shown that the effect of these new inhibitors on cell survival was more important than that of Temsirolimus. This is probably because contrary to Temsirolimus, the two new molecules can inhibit AKT and 4EBP phosphorylation. In the second part of this project we studied the synergy between the m-TOR kinase inhibitors and aracytine (conventional treatment of MCL). We revealed a significant additive effect in MCL cell lines. We demonstrated by Western blot analysis that aracytine inhibits S6 and 4EBP phosphorylation. This may explain the results obtained from this drug association. We then showed that Ibrutinib (an inhibitor of Btk pathway) can induce a significant inhibition of cell survival when combined with aracytine. In this study, Ibrutinib proved antagonist effect to PI3K-AKT-mTOR inhibitors. The mechanisms of these results remain unclear. Finally, we demonstrated an additive effect of Ibrutinib in combination with doxorubicin. We did not obtain the same results when we combined m-TOR inhibitors with doxorubicin. To explain these data, we studied the effect of these drugs on the expression of GSTPi by western blot. This enzyme is known to have an important role in MCL resistance to anthracycline. Importantly, Ibrutinib induced a decrease in the expression of GSTPi but AZD8055, Temsirolimus and NVP-BEZ235 had no effect

Le lymphome à cellules du manteau (LCM) est une pathologie rare qui présente une grande diversité de profil clinique, biologique et de réponse aux thérapeutiques. Actuellement l’immunochimiothérapie et la consolidation par autogreffe de cellules souches hématopoïétiques est le traitement standard proposé à tous les patients jeunes mais environ 10% d’entre eux sont d’emblée réfractaires alors que d’autres sont en rémission très prolongée. C’est pourquoi le développement de nouveaux marqueurs pronostiques permettrait d’adapter de façon personnalisée la stratégie thérapeutique. Une première partie de ce document rappelle les aspects fondamentaux et le contexte scientifique de cette pathologie. Une seconde partie rapporte les résultats des travaux menés dans le cadre de cette thèse. Nous avons exploré le potentiel pronostique des anomalies du nombre de copies des chromosomes intrinsèques aux cellules de la tumeur chez 100 patients traités en première ligne par une immunochimiothérapie dans l’essai clinique LyMa. Cette évaluation pan-génomique, réalisée par SNP-array sur de l’ADN hautement dégradé de la tumeur, nous a permis d’identifier que des gains de 7p22 sont associés à une bonne réponse en dépit de la présence d’autres anomalies de haut risque (délétion TP53 et CDKN2A). Nous avons identifié que des gains de CCND1 correspondant à des copies surnuméraires des réarrangements CCND1/IGH sont associés à une mauvaise réponse clinique. Ces derniers résultats ont été confirmés dans une seconde cohorte indépendante de patients. Ce travail est publié..Des travaux en cours de finalisation sont également présentés. Nous sommes ainsi en train d’évaluer, en corrélation avec l’immunohistochimie, dans la même cohorte protocolaire, le rôle des anomalies de CDKN2A et p16INK4A. La surexpression de p16INK4A ou la délétion homozygote de CDKN2A qui ont été mises en évidence pourraient être utilisées comme biomarqueurs pronostiques au moment du diagnostic pour prédire la réponse au traitement de première ligne. Enfin, nous avons utilisé une approche innovante d’analyse transcriptomique par Reverse Transcriptase Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (RT-MLPA) adaptée aux acides nulcéiques dégradés des échantillons conservés en paraffine. Des variations intrinsèques ou extrinsèques à la cellule tumorale ont été explorées. Des variations quantitatives des monocytes/macrophages, des lymphocytes T et NK ont été observées en comparaison avec des tissus non tumoraux. D’autres variations ont été observées dans le contexte de lymphome agressif, en cas d’anomalies de p53 et à la rechute. Une troisième partie aborde les travaux envisagés en perspective. Une étude de la clonalité des lymphocytes infiltrant la tumeur devrait permettre d’approfondir le contexte immunitaire dans le LCM. Enfin, une analyse combinée des anomalies intrinsèques et extrinsèques à l’échelle de la cellule unique pourrait permettre d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et de nouveaux biomarqueurs permettant de mieux positionner les différentes stratégies thérapeutiques disponibles
Mantle cell lymphoma (MCL) is a rare disease displaying a great diversity in terms of clinic, biology and response to therapies. Currently, immunochemotherapy and consolidation by autologous hematopoietic stem cell transplantation is the standard treatment proposed to all younger patients, yet about 10% are refractory while others enjoy long remissions. The development of new prognostic markers could help to adapt a personalized approach of therapeutic strategies. In the first part of this document, fundamental and scientific aspects of this disease are described The second part reports the results obtained in the context of this thesis. The prognostic value of chromosomal copy number anomalies intrinsic to the tumor cells was investigated in 100 MCL patients enrolled for first-line therapy in the LyMa clinical trial. This pan-genomic approach, performed on highly degraded tumoral DNA by SNP-array, allowed to identify that 7p22 gains are associated to a good response is spite of the presence of high-risk anomalies (TP53 or CDKN2A deletions). We also identified that gains of CCND1, corresponding to additional copies of CCND1/IGH rearrangements, are associated to poor response to therapy. These data were confirmed in a second independent cohort of MCL patients. This work has been published..Investigations in progress are also presented. In the same LyMa cohort, the role of CDKN2A and p16INK4 anomalies is being evaluated, in correlation with immunohistochemistry. Overexpression of the p16INK4A protein or homozygous deletion of CDKN2A have been characterized, that could be used as prognostic biomarkers at diagnosis, to predict the patient’s response to first line therapy. Finally, we used a novel approach of transcriptomic analysis by Reverse Transcriptase Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (RT-MLPA), adapted to the degraded nucleic acids of our formalin-fixed paraffin-embedded samples. Variations intrinsic or extrinsic to the tumor cell have been explored. Quantitative anomalies of monocytes/macrophages, as well as T and NK cells have been observed, in comparison to non-tumoral samples. Other variations have been identified to be associated to aggressive forms of the MCL, in case of p53 anomalies or at relapse. A third part announces projects envisioned in the future. An analysis of the clonality of tumor-infiltrating T-cells should allow to better understand the immune context of MCL. Finally, a combined analysis of intrinsic and extrinsic anomalies at the single cell level could allow to identify new therapeutic targets and new biomarkers for a better-adapted management of patients

Les lymphomes primitifs du SNC (PCNSL : Primary Central Nervous System Lymphoma) sont génotypiquement associés aux lymphomes diffus à larges cellules B (DLBCL). Ce sont des affectations multifocales pouvant toucher les méninges, la moelle épinière mais plus fréquemment l’œil et le cerveau. Le lymphome primaire de l’œil (PIOL) et le lymphome primaire du cerveau (PCL) sont des atteintes agressives, avec un pronostic vital sombre, et sans thérapie spécifique. Malgré les avancées considérables découvertes sur la pathogenèse de ces atteintes, leur physiopathologie reste encore mal connue. Le diagnostic est aujourd’hui basé sur les techniques modernes d’imagerie et sur l’étude des marqueurs moléculaires, cependant il reste parfois difficile, notamment pour le PIOL qui peut être considéré comme une « pseudo-uvéite ». Par ailleurs, en dépit des progrès réalisés dans la thérapie de ces tumeurs (chimiothérapie, radiothérapie), le traitement actuel entraîne une grande toxicité et une rechute est notée en quelques années. En vue de définir de nouveaux biomarqueurs d’orientation diagnostique précoce et en perspective d’amélioration de la thérapie actuelle des lymphomes oculo-cérébraux, nous avons d’abord identifié une nouvelle combinaison cytokinique (les ratios IL-10/IL-6 and IL-10/IFNγ) différentielle du PIOL et de l’uvéite, à partir de dosages moléculaires sur des échantillons de vitré et d’humeur aqueuse. Par la suite, nous avons montré un effet thérapeutique d’un nouvel anticorps anti-hCD20 optimisé, testé dans nos modèles murins de PIOL et de PCL, et un effet intéressant du CpG-DNA sur les cellules lymphomateuses B, dépendant de leur microenvironnement moléculaire
Primary central nervous system lymphoma (PCNSL) belongs to the systemic diffuse large B-cell lymphoma family. It can affect meninges as well as cranial, spinal, and peripheral nerves, but most frequently, it develops into the brain and/or eye. Primary cerebral lymphoma (PCL) and primary intraocular lymphoma (PIOL) are highly aggressive malignancies with a dark prognosis. Although the important advances founded from the pathogenesis of extraneural non-Hodgkin's lymphoma, the unique organotropism of PCL/PIOL remains poorly understood. Diagnosis now is facilitated by modern imaging techniques and molecular markers, but remains difficult in particular with PIOL as it is a “uveitis masquerade syndrom”. Moreover, in spite of remarkable progress through methotrexate-based chemotherapy, the majority of patients experience relapses within a few years. Better diagnostic tools are required for earlier diagnosis and monitoring of treatment response, and a deeper understanding of the pathogenesis of primary nervous system lymphoma may reveal new therapeutic targets. My PhD project was first to find new cytokine combinations as diagnostic and prognostic markers and then to explore new immunotherapeutic strategies on PIOL and PCL preclinical mouse models. Using vitreous and aqueous humor samples from French and Tunisian patients, we define a new highly discriminative combination of the IL-10/IL-6 and IL-10/IFNγ ratios between PIOL and uveitis patients. Besides, we show an encouraging therapeutic effect of a novel glycoengineered anti-hCD20 antibody in PCL and PIOL murine lymphomas, and intriguing differences in B-cell lymphoma responsiveness to CpG

Les intéractions entre les protéines de la famille Bcl-2 contrôlent la survie de la cellule tumorale. Les BH3 mimétiques représentent une nouvelle classe thérapeutiques de petites molécules se fixant avec une forte affinité aux protéines anti-apoptotiques, et déclenchant la mort cellulaire en libérant les protéines pro-apoptotiques activatrices de l'apoptose. Ce travail a évalué l'activité anti-tumorale de deux BH3 mimétiques, l'ABT-737 (ciblant Bcl-2 et Bcl-XL) et l'ABT-199 (ciblant Bcl-2) sur les cellules tumorales de myélome multiple et de lymphome à cellules du manteau, deux hémopathies lymphoïdes B considérées incurables à l'heure actuelle. Nous avons mis en évidence une importante hétérogénéité de sensibilité à ces drogues. L'expression relative de Bcl-2 et de Mcl-1 a été montrée comme le principal facteur sous-tendant la résistance aux BH3 mimétiques. L'analyse de la dépendance mitochondriale à Bcl-2 par la technique de BH3 profiling permet également de prédire la sensibilité aux BH3 mimétiques. De manière intéressante, la sensibilité des cellules de myélome multiple à l'ABT-199 est principalement retrouvée chez les patients présentant une translocation t(11 ;14), un sous groupe représentant près de 20% des patients. L'ABT-199 connait actuellement un développement clinique très prometteur. Il nous apparait important de valider de manière prospective dans le cadre d'essais cliniques les biomarqueurs décrits dans ce travail de thèse (ratio Bcl-2 / Mcl-1, BH3 profiling), afin de pouvoir à terme sélectionner les patients les plus à même de bénéficier de cette drogue
Interactions between proteins of the Bcl-2 family determine tumor cell'survival. BH3 mimetics represent a new therapeutic class of small molecules that bind with high affinity to anti-apoptotic proteins, and triggers cell death by releasing pro-apoptotic protein activator of apoptosis. In this study, we evaluated the anti-tumor activity of two BH3 mimetics, ABT-737 (targeting Bcl-2 and Bcl-XL) and ABT-199 (targeting Bcl-2) in multiple myeloma (MM) and mantle cell lymphoma (MCL). MM and MCL are two B-cell lymphoid malignancies still considcered as incurable. Sensitivity toboth ABT-199 and ABT-263 was found to be very heterogeneous. The relative expression of Bcl-2 and Mcl-1 has been shown as the main facto implied in the resistance to BH3 mimetics. The mitochondrial dependence to Bcl-2 analyzed using the functionnal assay BH3 profiling also predicted sensitivity to BH3 mimetics. Interestingly, sensitivity of multiple myeloma cells to ABT-199 was restricted to patients with t(11; 14) translocation, a sub group representing almost 20% of patients. The clinical development of ABT-199 is currently very promising. Biomarkers described in this work (Bcl-2 ratio / Mcl-1 BH3 profiling) should be evaluated in a context of prospective clinical trials

L’altération de la protéostase peut être la cause ou conséquence de pathologies comme le lymphome à cellules du manteau (MCL), lymphome non-hodgkinien agressif avec un faible taux de survie et des rechutes après un traitement par l'inhibiteur de protéasome Bortezomib (BTZ). Les voies Ubiquitine-protéasome (UPS) et autophagie-lysosome (ALS) reposent sur l'Ubiquitine (Ub) pour la dégradation intracellulaire des protéines au sein d’un seul réseau protéolytique coordonné. A l’aide de pièges à Ub (TUBEs) associés à la spectrométrie de masse (MS) pour comparer le protéome de l'Ub de la lignée cellulaire MCL résistante au BTZ (ZBR) et de son homologue parental (Z138), notre équipe a découvert que l’Ub joue un rôle dans la réponse au BTZ et dévoilé un passage moléculaire de l'UPS à l'ALS, décrivant la protéaphagie comme une caractéristique de la résistance au BTZ. On observe également un enrichissement des chaînes d'Ub K63 dans la lignée ZBR. Notre hypothèse est que cet enrichissement pourrait la prédisposer à activer l'autophagie et les événements de signalisation liés à la résistance au BTZ, le but étant d’identifier le mécanisme et protéines impliqués. A cette fin, nous avons identifié le protéome d'Ub associé aux chaînes d'Ub K63 et K48 des cellules Z138/ZBR. Des traitements chimiques combinatoires permettent en outre de bloquer les enzymes E3 enrichies dans ZBR (TRIM24, UBR2, UBR4 et UBR5) et le récepteur d'autophagie p62. TRIM24 est plus enrichi dans les cellules ZBR aux niveaux basaux. Sa stabilité est compromise différemment dans les cellules Z138 et ZBR après inhibition du protéasome ou de l'autophagie en utilisant la Bafilomycine A (BafA), suggérant qu’elle joue un rôle dans la diaphonie UPS-ALS. Nous avons utilisé dTRIM24, une chimère validée ciblant la protéolyse (PROTAC) pour cibler TRIM24 dans nos modèles. Un traitement dTRIM24/ZBR réduit le protéasome et favorise les effets apoptotiques coopératifs dans les cellules ZBR. Leur traitement par dTRIM24 favorise la formation des chaînes K48 et K63 et la fraction associée à l'Ub de p62 et des sous-unités du protéasome. Les protéines UBR participent à la régulation de la voie de la règle N-end, qui cible le protéome Arg pour la dégradation via le domaine ZZ du récepteur d'autophagie p62/SQSTM1 en situation de stress protéotoxique. La vertéporfine (VTP) induit fortement l'apoptose des cellules ZBR, seule ou en combinaison avec le BTZ. Comme la VTP induit des espèces ROS, nous avons utilisé un inhibiteur du domaine ZZ de la p62 (XRK3F2) pour explorer le rôle de la p62 sur les enzymes UBR. Nous avons constaté que XRK3F2 a un impact différent sur la stabilité des enzymes UBR dans les cellules ZBR et Z138. La viabilité des cellules Z138 et ZBR est similaire lors d'un traitement individuel ou combiné au BTZ, ce qui suggère que les changements dans les niveaux de protéines des enzymes UBR ne sont pas associés à la résistance au BTZ et que la VTP est un meilleur traitement pour augmenter l'apoptose dans les cellules ZBR.Pour mieux comprendre la réponse à la VTP dans les cellules résistantes au BTZ, nous avons caractérisé les nanobodies spécifiques des chaînes K48 et K63 avec Hybrigenics (outils commercialisés par Nanotag). Après avoir établi les conditions pour les nanobodies-précipitations (NP), le protéome d'Ub des cellules ZBR et Z138 traitées ou non avec la VTP a été analysé par MS. Les résultats confirment l’enrichissement des chaînes K63 dans ZBR, fournissant une liste de protéines candidates jouant un rôle dans la résistance au BTZ
Disruption of proteostasis is often the cause or consequence of pathologies, including haematological malignancies like Mantle Cell lymphoma (MCL). MCL is an aggressive non-Hodgkin lymphoma, with a poor rate of survival and frequent relapses after Bortezomib (BTZ) treatment. The two major intracellular degradation pathways, the Ubiquitin-proteasome (UPS) and autophagy-lysosome (ALS) systems, rely on Ubiquitin (Ub) to drive protein degradation acting as a single coordinated network. Using Ub traps (TUBEs) associated to mass spectrometry (MS) to compare the Ub proteome of the BTZ-resistant MCL cell line (ZBR) and its parental BTZ-sensitive counterpart (Z138), the hosting lab found Ub playing a major role in BTZ response/resistance and unveiled a molecular switch from UPS to ALS, describing proteaphagy as a hallmark of resistance. K63 Ub chains and other enzymes were also detected enriched in ZBR in this analysis. We hypothesized that this enrichment could predispose them to activate autophagy and signaling events implicated in MCL cell survival and BTZ resistance, being focused on the identification of mechanism and proteins directly involved. To explore this hypothesis, we used several experimental strategies including the isolation and identification of the Ub proteome, and the used of combinatorial chemical treatments. TRIM24, which is known to regulate the activity of the tumor suppressor p53, was found more enriched in ZBR cells at basal levels. TRIM24 stability is compromised differently after inhibition of the proteasome (BTZ) or autophagy using Bafilomycin A (BafA), in Z138 and ZBR cells suggesting a possible role in UPS-ALS crosstalk. We have used dTRIM24, a validated Proteolysis Targeting Chimeric (PROTAC) to target TRIM24 in our MCL model. Our results show that a combined dTRIM24/ZBR treatment reduces proteasome levels and promotes cooperative apoptotic effects in the ZBR cell line. Interestingly, a dTRIM24 treatment enhanced the formation of K48 and K63 chains and the Ub-associated fraction of p62 and proteasome subunits in ZBR cells. UBR proteins (UBR2, UBR4 and UBR5 found enriched in ZBR) are involved in the regulation of the N-end rule pathway, related to the ZZ domain of the autophagy receptor p62/SQSTM1 under proteotoxic stress conditions. Verteporfin (VTP), one of the most effective p62 inhibitors, strongly induces apoptosis in ZBR cells. However, since VTP also induces ROS (oxygen-containing reactive species), we used an inhibitor of the p62 ZZ domain (XRK3F2) to further explore the role of p62 and its impact on UBR enzymes. We found that XRK3F2 differently affects the stability of UBR enzymes in ZBR compared to Z138 cells. However, the viability of Z138 and ZBR cells was similar, suggesting that changes in protein levels of UBR enzymes are not associated to BTZ resistance and that VTP is a better treatment to enhance apoptosis in ZBR cells. To better understand the response to VTP in BTZ-resistant cells, we collaborated with Hybrigenics to characterise K48 and K63 Ub chain specific nanobodies (now commercialised by Nanotag)

Le lymphome à cellules du manteau (MCL) est un lymphome agressif caractérisé par une prolifération; de lymphocytes B matures CD5+ issus de la zone du manteau folliculaire des ganglions. Le MCL est défini pai' la translocation chromosomique t(11 ; 14) (q13 ; q32) qui entraine une surexpression de la cycline Dl. Cependant cette translocation ne suffit pas par elle-même pour induire la lymphomagénèse et des études récentes suggèrent un rôle de la sélection antigénique et de la signalisation du récepteur B (BCR) dans l'émergence du clone malin. Sur cette base, nous avons cherché à identifier dans des cellules primaires de patients MCL, des voies de signalisation dérégulées en aval du BCR et aboutissant à l'activation de facteurs de transcription impliqués dans les processus de survie des cellules tumorales. Nous avons tout d'abord montré que le facteur de transcription STAT3 est constitutivement phosphorylé dans les cellules de MCL et que cette phosphorylation est fortement augmentée en réponse à la stimulation du BCR. Les phosphorylations constitutive et induite par la stimulation du BCR de STAT3 sont le résultat d'une boucle autocrine de sécrétion d'IL6 et/ou d'IL10 dépendante du facteur de transcription NF-kB. L'inhibition de la voie Jak/STAT3 induit l'apoptose des cellules de MCL et supprime le signal de survie cellulaire induit par la stimulation antigénique. De plus, le traitement des cellules par le bortezomib, un inhibiteur du protéasome utilisé en clinique dans le traitement du MCL, supprime la phosphorylation de STAT3 ainsi que le signal de survie cellulaire induit par le BCR. Nous avons ensuite cherché à identifier d'autres facteurs de transcription, induits plus précocement en réponse à la stimulation du BCR et qui pourraient également être impliqués dans la dérégulation de la prolifération des cellules de MCL. Nous avons montré que la stimulation du BCR entraîne une augmentation importante et rapide (dès 30' avec maximum à 1h) du facteur de transcription EGR1 suivi de celle de c-MYC. De plus, l'inhibition spécifique de la kinase JNK constitutivement activée dans les cellules de MCL, entraîne une diminution de l'expression d'EGR1 associée à une augmentation de l'apoptose et à une inhibition du signal de survie cellulaire induit par le BCR. Par ailleurs, nous avons mis en évidence une activation constitutive des kinases de la famille Src (SFK) et plus précisément de Lyn, activation renforcée en réponse à la stimulation du BCR. Sur cette base, nous avons évalué l'efficacité du dasatinib (BMS-354825), une drogue qui cible les kinases SFK. Nous avons montré que le dasatinib à de très faibles doses (100nM) inhibe in vitro la phosphorylation constitutive et induite par le BCR de Lyn et de JNK, supprime l'expression d'EGR-1 et induit l'apoptose des cellules de patients leucémiques. En conclusion, nos résultats ont permis de mettre en évidence une dérégulation de voies de signalisation (SFK, JNK) et de facteurs de transcription (STAT3, EGR1, C-MYC) qui, de manière constitutive ou induite en réponse à la stimulation antigénique, participent au processus de prolifération et des cellules de MCL. L'ensemble de ces résultats ouvre ainsi la voie vers le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblées dans cette pathologie
Mantle cell lymphoma (MCL) is an aggressive and incurable malignant lymphoma, representing approximately 5% of non Hodgkin lymphomas. Its hallmark is the translocation t(11:14)q (13;32), leading to overexpression of cyclin Dl. However this chromosomal alteration is not sufficient to induce MCL and recent studies suggest the involvement of antigenic stimulation and B-cell receptor (BCR) signaling in this pathogenesis. In this context, we aimed at identifying in primary MCL cells deregulated signaling pathways downstream of BCR and leading to activation of transcription factors and to increased MCL cell survival. We evidenced a constitutive and BCR-induced phosphorylation of the transcription factor STAT3 resulting from an autocrine IL6 and/or IL10 secretion. Inhibition of the JAK/STAT3 pathway increased spontaneous apoptosis and suppressed BCR-induced cell survival. Moreover, treatment with Bortezomib induced apoptosis and a decrease of both IL6/IL10 secretions and STAT3 phosphorylation. In addition, bortezomib inhibited B-cell receptor-triggered STAT3 phosphorylation and cell survival. To further identify early genes involved in BCR-induced survival, we looked at differential expression of genes upon BCR stimulation and found that BCR engagement also led to a quick and transient induction of EGR1 expression, following by the one of c-Myc. We next evaluated the role of EGR1 in MCL cell survival and showed that inhibition of JNK by SP600125 induced a decrease of both constitutive and BCR-induced EGR1 expression, associated with an increase of apoptosis and a suppression of BCR-induced survival. We also showed that primary MCL cells displayed a constitutive and BCR-induced activation of Src family kinases including LYN and that efficient inhibition of these kinases by dasatinib led to apoptosis through inhibition of the downstream JNK/EGR1 pathway. In conclusion, our study performed on primary MCL lymphocytes evidenced that constitutive and BCRinduced signaling provide important survival signal which can be efficiently inhibited by Bortezomib and Dasatinib. Of interest, our result indicated for the first time that Dasatinib through inhibition of SFK/LYN kinases could be used as a new therapeutic agent in MCL by overcoming pro-survival signal emanating from the BCR

El limfoma de cèl•lules del mantell (LCM) és una neoplàsia heterogènia en relació a les característiques clíniques, biològiques i moleculars que presenten els pacients. La morfologia, l’immunofenotip i el genotip no són suficients per explicar aquesta gran diversitat. Encara que es considera una neoplàsia agressiva alguns pacients segueixen un curs clínic indolent sense la necessitat de tractament en el moment del diagnòstic i presenten una supervivència llarga. Els resultats d’aquesta tesi demostren que els LCM amb elevada càrrega mutacional en els gens de les immunoglobulines (IGHV)(<97% d’identitat amb la línia germinal) utilitzen preferencialment certes famílies de gens IGHV, suggerint la presència de processos de selecció antigènica com a mecanisme de patogènesi d’aquesta neoplàsia i donant importància a la caracterització del receptor de les cèl•lules B (BCR). Els LCM amb gens IGHV mutats (M-LCM) presenten una menor complexitat genòmica, són preferencialment negatius per a l’expressió del factor de transcripció SOX11 i presenten afectació ganglionar amb més freqüència que els casos sense mutacions (U-LCM). Per altra banda, el perfil d’expressió gènica entre casos amb i sense mutacions en els gens IGHV, també mostra expressió diferencial de programes cel•lulars relacionats amb poblacions de cèl•lules B normals incidint amb la ontogènia d’ambdós grups. El perfil d’expressió de microRNAs també permet diferenciar entre dos grups de pacients amb diferent supervivència, reforçant la idea de la presència de dos subgrups que pertanyen a una mateixa entitat. La identificació i la correcte identificació d’aquests pacients de limfoma de cèl•lules del mantell són rellevants per al posterior maneig i tractament dels mateixos.
Mantle cell lymphoma is a malignant and heterogeneous disease regarding the clinical, biological and molecular characteristics presented by patients, all of them with the translocation t(11;14) and CCND1 overexpression. Although is considered an aggressive neoplasm some patients follow and indolent clinical course without treatment at the time of diagnosis and long survival. The results of this studies demonstrate that LCM with high mutational load in the immunoglobulins genes (IGHV) (<97% of identity with the germ line) use preferentially specific IGHV gene families, suggesting the presence of antigenic selection process as a mechanism of pathogenesis of this neoplasm and giving importance to the characterization of the B cell receptor. The LCM cases with IGHV mutated genes (M-LCM) present less genomic complexity are preferentially negative for the expression of the transcriptor factor SOX11 and also present lymphadenopathies more frequently compared with the IGHV unmutated cases (U-LCM). Furthermore, the gene expression profile between cases with and without IGHV mutations also shows differential expression of cellular programs related to normal B cell populations maybe related with the ontogeny for both groups. The expression profile of microRNAs also differentiates between two groups of patients with different survival and other molecular characteristics, reinforcing the idea of the presence of two subgroups that belong to the same entity. The correct identification and classification of these patients are relevant for subsequent handling and treatment of the patients.

El limfoma de cèl•lules de mantell (MCL) és una neoplàsia limfoide sense tractament curatiu, per la qual cosa es requereix la recerca de nous fàrmacs. La identificació de noves dianes terapèutiques pel MCL i l’estudi del mecanisme d’actuació dels fàrmacs tenen una gran importància translacional. Atès que s’ha observat resposta clínica al fàrmac immunomodulador lenalidomida en pacients de MCL i que el seu mecanisme d’acció encara roman parcialment desconegut, hem volgut investigar si l’expressió i la localització subcel•lular de la ciclina D1, un important regulador del cicle cel•lular sobreexpressat en el MCL, i l’inhibidor de cinases dependents de ciclines, p27KIP1 podrien identificar casos de MCL sensibles a la lenalidomida, i si el fàrmac podria modular els complexos de ciclina D1/p27KIP1. Es va trobar que la ciclina D1 i p27KIP1 s’expressaven de forma coordinada en tots els casos testats de MCL. Les anàlisis d’immunoprecipitació i els assajos de siRNA van suggerir un rol directe de la ciclina D1 en la regulació dels nivells de p27KIP1. L’acumulació nuclear de totes dues proteïnes va correlacionar amb la tumorigenicitat del MCL in vivo, i la sensibilitat a l’activitat de la lenalidomida in vitro i in vivo. El mecanisme d’acció de la lenalidomida va dependre de la depleció de la ciclina D1 i de la dissociació dels complexos ciclina D1/p27KIP1, seguida de l’acumulació citosòlica de p27KIP1, aturada de cicle, apoptosi i inhibició de l’angiogènesi. Per tant, aquests resultats revelen un mecanisme d’acció de la lenalidomida en casos de MCL amb una incrementada tumorigenicitat in vivo que consisteix en la dissociació dels complexos ciclina D1/p27KIP1 i el subseqüent bloqueig de la proliferació i la inducció d’apoptosi. A més, es va analitzar la localització subcel•lular de p27KIP1 en línies cel•lulars en assajos in vitro, i no es va trobar correlació entre els nivells nuclears de p27KIP1 i la proliferació cel•lular. Resultats similars es van trobar en comparar el rati p27KIP1/ciclina D1 amb el percentatge de cèl•lules en fase S. També va ser analitzat el paper de p27KIP1 a mostres primàries in vitro i tampoc no es va trobar correlació. Aquests resultats suggereixen que ni p27KIP1 ni el complex que forma amb ciclina D1 estan implicats en la regulació de la proliferació en mostres de MCL in vitro. Com que el tractament amb bortezomib ha mostrat una activitat clínica prometedora en el MCL però sovint es desenvolupen resistències, hem volgut investigar sobre aquest esdeveniment. Ratolins immunodeprimits van ser inoculats amb línies de MCL amb diferent sensibilitat al fàrmac i a continuació es va procedir a determinar el perfil d’expressió gènica dels tumors i la validació funcional de les signatures gèniques identificades. Vàrem observar una augmentada tumorigenicitat in vivo en els casos de MCL resistent a bortezomib, que va ser associada a trets de diferenciació plasmocítica, com un augment en IRF4. La lenalidomida va ser particularment efectiva en aquest subgrup de tumors, actuant sobre el programa de diferenciació plasmocític i superant la resistència a bortezomib. La inhibició del gen diana d’IRF4, MYC, en les cèl•lules resistents a bortezomib (per knockdown o bé amb CPI203, un inhibidor de proteïnes BET), va induir de forma sinèrgica la mort cel•lular quan es va combinar amb la lenalidomida. En ratolins, l’addicció del CPI203 i la lenalidomida, va promoure la reducció de la càrrega tumoral, implicant la disminució simultània de MYC i d’IRF4 i la inducció d’apoptosi. Aquests resultats suggereixen que la senyalització exacerbada d’IRF4/MYC està associada a la resistència a bortezomib en el MCL in vivo i garanteix l’avaluació clínica de la lenalidomida conjuntament amb el CPI203 en casos de MCL refractaris a bortezomib.
Mantle cell lymphoma (MCL) is an aggressive lymphoid neoplasm characterized by the overexpression of cyclin D1. Clinical responses to lenalidomide have been observed, although its mechanism of action remains partially unknown. We investigated whether the expression and subcellular localization of cyclin D1 and p27KIP1 could identify MCL cases sensitive to lenalidomide, and whether the compound could modulate cyclin D1/p27KIP1 complexes. We found cyclin D1 and p27KIP1 to be coordinately expressed in all the samples tested. Experiments suggested a direct role of cyclin D1 in the regulation of p27KIP1 levels. The nuclear accumulation of both proteins correlated with MCL cell tumorigenicity in vivo, and sensitivity to lenalidomide activity in vitro and in vivo. Lenalidomide mechanism of action relied on cyclin D1 downregulation and disruption of cyclin D1/p27KIP1 complexes, followed by cytosolic accumulation of p27KIP1, cell proliferation arrest, apoptosis, and angiogenesis inhibition, especially in MCL cases with increased tumorigenicity in vivo. Moreover, we analyzed the subcellular localization of p27KIP1 in cell lines. We then compared the nuclear p27KIP1 protein level or the nuclear p27KIP1/cyclin D1 ratio and the percentage of cells in S phase, and observed no correlation between these parameters. Similar results were found in primary cells from patients. Altogether, our results strongly suggest that p27KIP1 or its complex with cyclin D1 may not be involved in the regulation of MCL cell proliferation in vitro. Bortezomib therapy has shown promising clinical activity in MCL, but the development of resistance is common. Immunodeficient mice were engrafted with MCL cell lines with different levels of sensitivity to the drug, followed by gene expression profiling of the tumors. We observed an increased tumorigenicity of bortezomib-resistant MCL cells in vivo, which was associated with plasmacytic differentiation features, like IRF4 upregulation. Lenalidomide was particularly active in this subgroup of tumors targeting plasmacytic differentiation program, thus overcoming bortezomib resistance. Moreover, repression of the IRF4 target gene MYC in bortezomib-resistant cells (by gene knockdown or CPI203, a BET inhibitor), synergistically induced cell death when combined with lenalidomide. In mice, addition of CPI203 to lenalidomide therapy further decreased tumor burden, involving simultaneous MYC and IRF4 downregulation and apoptosis.

La hibridació in situ fluorescent, o FISH, és una tècnica molecular que s'utilitza en la rutina clínica pel diagnòstic i l'estratificació de diferents neoplàsies. En els estudis d'aquesta tesi s'ha observat que en neoplàsies limfoides de cèl·lula B, la tècnica de FISH té algunes limitacions i que són necessàries millores per fer un diagnòstic i una estratificació pronòstica més acurats. En l'estudi 1 proposem una nova plataforma de microarray per estratificar la Leucèmia limfàtica crònica (CLL) sense la necessitat d'utilitzar la tècnica de FISH. La CLL és una malaltia molt comú amb un curs clínic molt variable. S’ha descrit que diferents alteracions genètiques i la complexitat genòmica estan relacionades amb un pitjor pronòstic. L'objectiu de l'estudi 1 va ser dissenyar una plataforma de microarray, anomenada qChipHemo, que analitzés no només les quatre alteracions recurrents en la CLL, que s’analitzen amb la tècnica de FISH, sinó també altres regions recurrents, la complexitat genòmica i la cromotripsi. Utilitzant qChipHemo vam poder estratificar, en un sol experiment i amb elevada sensibilitat, els casos analitzant totes les alteracions amb significat pronòstic, com 11q, 13q, 17p, la complexitat genòmica o la cromostripsi. Per tant, podem concloure que l'ús de qChipHemo permet una millor estratificació pronòstica en la CLL comparat amb la tècnica de FISH i proposem que seria una bona opció per ser utilitzada en la rutina clínica. En l'estudi 2 vam poder identificar l'alteració oncogènica primària en la majoria de casos amb Limfoma de cèl·lules del mantell Ciclina D1-negatiu (MCL), un subgrup de MCL que no presenta la translocació oncogènica primària t(11;14)(q13;q32) ni la sobreexpressió de ciclina D1. Mitjançant la tècnica de FISH vam poder detectar que el 70% dels casos MCL Ciclina D1-negatius presentaven una translocació a CCND2 provocant la seva sobreexpressió. La resta dels casos sobreexpressaven CCND2, CCND3 o CCNE1 i CCNE2 concomitant sense reordenament aparent utilitzant la tècnica de FISH break-apart. Mitjançant tècniques de seqüenciació de nova generació (NGS) vam poder detectar una inserció críptica de l'enhancer de la immunoglobulina IGK o IGL que explicava la sobreexpressió de la ciclina D3 en 3 casos. A partir de la localització de la inserció obtinguda per NGS, vam poder dissenyar unes sondes específiques per poder detectar el reordenament críptic utilitzant FISH amb sondes de fusió i vam observar que en un 16% dels casos presentaven una inserció críptica de l'enhancer de les immunoglobulines proper a CCND3 i 7% dels casos proper a CCND2. Per tant, utilitzant una combinació de tècniques moleculars i FISH amb sondes específiques hem pogut detectar el reordenament primari oncogènic en el 93% dels casos MCL Ciclina D1-negatius. La detecció d'aquests reordenaments permet, doncs, diagnosticar d'una manera més acurada els casos MCL Ciclina D1-negatius. Per concloure, creiem que l'ús de FISH en la rutina clínica per al pronòstic i diagnòstic en neoplàsies limfoides de cèl·lula B té unes limitacions. No obstant, l'ús de noves tecnologies i la combinació del FISH amb tècniques moleculars permeten que el pronòstic i el diagnòstic en la CLL i el MCL sigui més acurat.
The main goal of study 1 and study of the thesis is the study of different B cell lymphomas using Next Generation Techniques (NGS) that enable us to better diagnose and stratify patients in an accurate way, that could replace techniques such as FISH. In the study 1, we propose a new microarray platform that could stratify Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL) patients without using FISH technique. CLL is a heterogeneous disease with a variable clinical course. It has been published different genetic alterations and genomic complexity related with worse prognosis. The aim of study 1 is to design a platform, named qChipHemo, that stratify CLL patients using not only the main 4 alterations (11q, 13q, 17 and trisomy 12), but also other frequently genetic alterations, genomic complexity and chromothripsis. In this study we conclude that the use of qChipHemo allows a better prognostic stratification of CLL patients compared to FISH techniques and we suggest using the platform in the clinical routine. In the study 2, we identified the primary oncogenic alteration in the vast majority of Cyclin D1-negative Mantle Cell Lymphoma (MCL) cases, a MCL subgroup that doesn’t harbour the main reciprocal oncogenic translocation t(11;14)(q13;q32) and neither overexpress cyclin D1. Using FISH techniques, we detected CCND2 translocations in 70% of MCL Cyclin D1-negative cases, overexpressing CCND2. The other cases without any apparent translocation by break-apart FISH, overexpress either CCND2, CCND3 or concomitant CCNE1 and CCNE2. By NGS techniques we detected a cryptic insertion of the immunoglobulin IGK or IGL enhancer near CCND3 in 3 cases. We could design specific probes to detect the cryptic insertion using FISH and we detected 16% and 7% of cases with cryptic insertion near CCND3 and CCND2, respectively. In this study, we conclude that using molecular techniques and FISH together we could detect primary oncogenic rearrangement in 93% of MCL Cyclin D1- negative cases. The rearrangement detection allows to better diagnose these cases. To conclude, the use of FISH has limitations in clinical routine. The use of new technologies and the combination of FISH and molecular techniques allow an accurate prognostic and diagnostic in CLL and MCL.