Dissertations / Theses on the topic 'Lymphocyte B mémoire'

L’autophagie est un processus catabolique lié aux lysosomes, essentiel à la l’homéostasie cellulaire notamment dans les lymphocytes. Elle est impliquée dans la pathogenèse de nombreuses maladies et pourrais jouer un rôle dans le développement de maladies auto-immunes. Nous avons voulu étudier son rôle in vivo dans les lymphocytes B et T. Nous avons généré des souris déficientes en autophagie spécifiquement dans ces cellules et montré que l’autophagie n’est pas essentielle au développement des LB, mais que dans un contexte auto-immun la persistance de plasmocytes et la production d’autoanticorps été diminuée. Cela démontre un rôle de l’autophagie dans les réponses à long terme. Les réponses humorales à long-terme T dépendantes sont également impactées. De plus des souris transplantées avec des LT CD4+ déficients en autophagie montrent une réponse humorale mémoire diminuée. Nous nous sommes également intéressé aux voies de signalisation conduisant à l’induction de l’autophagie en réponse à une stimulation du TCR dans des LT normaux et pathologiques. Nos résultats préliminaires montrent une implication de la voie calcique
Autophay is a catobolic lysosomal process essentail for cellular maintenance and fucntion such as lymphocyte homeosatsis. The generation of mice models with an Atg5 conditional knock-out in B and T cells respectively, have allowed us to study autophagy requirements of those immune cells in vivo. We have demonstrated that autophagy was dispensable for B cell development but that in autoimmune settings B cell autophagy was required for the maintenance of long-lived plasma cells and for the production of autoantibodies. In mice deficient for autophagy in T cells, long-term tumoral response to a T-dependent antigen is decreased. We also showed that in mice adoptively transferred with autophagy deficient CD4 T cells, the antigen specific memory humoral immune response was impaired. We also investigated the signaling pathways leading to autophagy induction upon TCR stimulation in normal and lupus T cells and showed that the calcium signaling is highly involved

Les lymphocytes T CD4 (LT CD4) jouent un rôle central dans la régulation des réponses immunitaires vis-à-vis des agents infectieux et des vaccins. Cependant, leur différenciation in vivo est encore mal comprise et les caractéristiques des LT CD4 capables de persister à long terme tout en assurant une réponse immunitaire protectrice sont mal définies. L’approfondissement de ces connaissances est indispensable pour le développement de nouveaux vaccins.

Pour approcher cette question, nous avons utilisé deux approches expérimentales. La première est un suivi de la différenciation des LT CD4 au cours de la réponse immune primaire chez des sujets vaccinés contre l’hépatite B ;la deuxième est la caractérisation phénotypique et fonctionnelle des LT CD4 mémoires antigène(Ag)-spécifiques pendant la phase d’état. Cette analyse a été réalisée au sein des LT CD4 spécifiques d’Ag vaccinaux, l’Ag de surface du virus de l’hépatite B (HBs) et la toxine tétanique (TT), ainsi que ceux spécifiques des Ag du cytomégalovirus (CMV). Les LT CD4 Ag-spécifiques ont été mis en évidence par cytométrie de flux après marquage intracytoplasmique du ligand du CD40 (CD40L) exprimé en réponse à une stimulation de courte durée par l’Ag. Des expériences basées sur la stimulation par la toxine du syndrome du choc toxique et le marquage du segment Vbeta2 du récepteur des LT ont démontré la bonne sensibilité et spécificité de cette méthode.

Le suivi de la réponse primaire chez 11 donneurs jusqu’à plus d’un an après immunisation par le vaccin anti-hépatite B a permis d’établir un modèle de différenciation des LT CD4 Ag-spécifiques in vivo chez l’homme. Nous avons mis en évidence des LT CD4 spécifiques d’un nombre limité de peptides immunodominants de la protéine HBs suggérant une réponse de type oligoclonale. Grâce à l’utilisation d’un cytomètre neuf couleurs, nous avons mené une analyse détaillée de l’hétérogénéité de la population mémoire HBs-spécifique. L’expression du CCR7 permet de distinguer des cellules de type mémoire centrale (LTCM, CCR7+) et effectrice (LTEM, CCR7-) se distinguant notamment par leur capacité à migrer vers les ganglions lymphatiques ainsi que par leurs propriétés fonctionnelles. Nous avons montré l’existence de ces deux sous-populations au sein des cellules HBs-spécifiques mais par opposition à leur définition initiale, ces LTCM sont capables de produire des cytokines effectrices. La proportion importante de LTCM exprimant le Ki67 témoigne d’une activité proliférative persistante in vivo et suggère la capacité de ces cellules à s’auto-renouveler et éventuellement à alimenter le pool des LTEM. La proportion importante de LTCM exprimant la chaîne alpha du récepteur à l’IL-7 (CD127) suggère que ces cellules sont sensibles aux signaux émanant de l’IL-7, une cytokine dont le rôle dans le maintien de la mémoire lymphocytaire T est connu. Compte tenu de la relevance potentielle de ces caractéristiques uniques pour le développement de vaccins et de l’accumulation de travaux montrant l’avantage sélectif des LTCM à conférer une immunité protectrice, nous avons focalisé la dernière partie de ces recherches sur cette sous-population. Une étude transversale des LTCM spécifiques de plusieurs types d’Ag (éliminés (HBs et TT) ou persistants (CMV)) a été menée. Nos résultats montrent une hétérogénéité, variable selon l’Ag, de la capacité de ces cellules à produire des cytokines effectrices et de leur phénotype de différenciation. Cette donnée nouvelle soulève la possibilité que les LTCM soient hétérogènes dans leur capacité à conférer une immunité protectrice. L’acquisition du marqueur KLRG1 par une fraction des LTCM s’associe à une capacité accrue à produire des cytokines effectrices et à une expression élevée du CD127. La possibilité que ces cellules soient particulièrement aptes à conférer une immunité protectrice et durable est discutée, tout comme les mécanismes menant à leur génération et l’intérêt de ces connaissances pour la conception de nouveaux vaccins.

Doctorat en Sciences médicales
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Les alloanticorps anti-HLA sont dirigés vis-à-vis de différents épitopes des molécules du système HLA. Cette immunisation survient lors d'une transplantation d'organe, de transfusions sanguines ou d'une grossesse. On retrouve aussi ces anticorps, lorsque les techniques de détection sont sensibles, en l'absence de tout évènement immunisant. En transplantation d'organe, rénale en particulier, la présence d'anticorps anti-HLA, du fait des lésions de rejet humoral qu'ils induisent, constitue une des premières causes de perte de fonction des greffons à moyen et long terme. Néanmoins, les cellules lymphocytaires qui sont la source de ces anticorps anti-HLA demeurent mal identifiées.Dans la première partie de ce travail, nous avons étudié, dans une cohorte de patients en attente de transplantation rénale, la distribution des différentes sous-populations lymphocytaires B circulantes par cytométrie de flux en relation avec la nature des évènements immunisants vis-à-vis du système HLA, la présence et la diversité des anticorps anti-HLA. Nous avons étudié en parallèle les concentrations sériques de BAFF ("B cell activating factor belonging to the TNF family"), principal facteur impliqué dans la survie et la différenciation des lymphocytes B matures. Nous avons retrouvé une association entre la présence et la diversité des anticorps anti-HLA, et l'augmentation de la proportion de lymphocytes B naïfs activés Bm2, par rapport aux autres sous-populations lymphocytaires B, et indépendamment de l'existence d'évènements immunisants. Les concentrations sériques de BAFF étaient également associées positivement à la présence et à la diversité des anticorps anti-HLA. Ces données suggèrent que l'augmentation des lymphocytes B naïfs activés et des concentrations sériques de BAFF favorise le développement des anticorps anti-HLA à la suite d'un événement immunisant. A l'instar du mécanisme évoqué en auto-immunité, BAFF pourrait intervenir en présence de l'alloantigène en favorisant la survie de clones B alloréactifs.Dans la deuxième partie de notre travail, nous nous sommes intéressés plus particulièrement à l'implication des lymphocytes B mémoire alloréactifs dans la réponse humorale anti-HLA. Pour détecter les lymphocytes B mémoire circulants, nous avons utilisé un test de stimulation polyclonale permettant leur différenciation en plasmablastes puis nous avons recherché et étudié la spécificité des anticorps anti-HLA produits dans les surnageants de culture. Un premier résultat important a été la possibilité de détecter, chez les patients présentant des anticorps anti-HLA, des lymphocytes B mémoire alloréactifs circulants plusieurs années après un événement immunisant. En deuxième lieu, la présence de ces lymphocytes B mémoire était associée au nombre d'évènements immunisants. En effet, les patients ayant développé, en l'absence d'événement immunisant des anticorps anti-HLA - dont nous montrons par ailleurs le caractère potentiellement pathogène - n'ont pas présenté de lymphocytes B mémoire alloréactifs circulants. Enfin, à l'aide du logiciel HLAMatchmaker, nous avons montré que les anticorps produits par les lymphocytes B mémoire étaient dirigés contre un nombre restreint d'épitopes partagés par plusieurs antigènes HLA, ce qui suggère une oligoclonalité du contingent B mémoire alloréactif. Chez les mêmes patients, les anticorps anti-HLA circulants présentaient une diversité de spécificité plus large, étant dirigés contre de multiples épitopes HLA. Ces résultats suggèrent l'existence d'au moins deux types de réponse humorale vis-à-vis des alloantigènes HLA : l'une aboutissant à la production de lymphocytes B mémoire et de plasmocytes à la suite d'une réaction de centre germinatif T-dépendante, l'autre impliquant seulement des plasmocytes, possiblement issus de réponses extra-folliculaires. Les facteurs orientant vers l'un ou l'autre type de réponse sont encore mal définis mais pourraient impliquer la dose et la voie d'exposition aux alloantigènes.

Suite a la stimulation par un antigene thymo-dependant, les lymphocytes b matures naifs des organes lymphoides secondaires proliferent dans les zones extra-folliculaires. A l'issue de cette phase d'expansion les lymphocytes b peuvent se differencier en plasmocytes secretant des immunoglobulines de faible affinite ou coloniser les follicules, au sein desquels ils induisent la reaction du centre germinatif. La reaction du centre germinatif conduit a la generation de plasmocytes et de lymphocytes b a memoire exprimant des imunoglobulines de forte affinite. La premiere partie de ce travail a ete centree sur l'identification et la caracterisation de differentes sous-populations de lymphocytes b matures humains des amygdales. Ces sous-populations comprennent, deux populations de lymphocytes b naifs, deux populations de lymphocytes b du centre germinatif, les lymphocytes b a memoire et les plasmocytes. De plus, cette etude a permis : i) l'identification d'une nouvelle population de lymphocytes b initiant la reaction du centre germinatif, ii) la decouverte d'une voie de differenciation des lymphocytes b, utilisant une commutation isotypique vers l'igd, et conduisant a la generation de plasmocytes secretant uniquement cet isotype. Les cellules utilisant cette voie de differenciation pourraient servir de cible a une transformation maligne, puisqu'elles partagent plusieurs caracteristiques avec les myelomes a igd. Dans la deuxieme partie de ce travail, nous nous sommes interesses aux signaux moleculaires impliques dans la differenciation des lymphocytes b matures en plasmocytes ou en lymphocytes b a memoire. Nous avons pu montrer que la molecule cd40 represente l'aiguillage entre ces deux voies de differenciation. L'engagement prolonge de cette molecule par son ligand induit les lymphocytes b du centre germinatif a se differencier en lymphocytes b a memoire et l'interruption de cette interaction est necessaire pour qu'ils se differencient en plasmocytes. Par ailleurs, nous avons pu montrer que l'engagement de la molecule cd40 inhibe egalement la differenciation en plasmocytes des lymphocytes b naifs et a memoire. Toutefois, les lymphocytes b a memoire sont predestines a se differencier en plasmocytes. Ainsi, les capacites de differenciation intrinseques a certains lymphocytes b, controlent l'equilibre homeostatique du repertoire recirculant.

La transplantation rénale est le meilleur traitement de l’insuffisance rénale chronique terminale, que ce soit en termes d’espérance ou de qualité de vie. Malgré les progrès réalisés en immunologie de la transplantation et dans la gestion globale des patients transplantés, la principale étiologie de perte de greffon reste le rejet, et en particulier le rejet humoral.L’évaluation du risque de rejet humoral repose principalement sur le dosage des anticorps anti-HLA dirigés contre le greffon. Pourtant, il apparait que ces anticorps ont un faible pouvoir prédictif de l’incidence et du pronostic du rejet, ce qui pourrait être expliqué par une hétérogénéité de leurs caractéristiques intrinsèques. Ces caractéristiques dépendent des cellules responsables de leur sécrétion, plasmocytes à courte et longue durée de vie, et donc indirectement des cellules responsables du maintien du pool de ces cellules sécrétrices d’anticorps : les lymphocytes B mémoires. Il a été montré en pathologies infectieuses que ces lymphocytes B mémoires sont hétérogènes en termes de phénotype, de fonction, de degré de clonalité et de diversification de leur BCR (B-cell receptor). Néanmoins, ceci n’a pas encore été analysé en transplantation rénale. Un des objectifs de cette thèse était d’étudier le degré d’hétérogénéité des lymphocytes B mémoires HLA-spécifiques chez des patients immunisés en attente de transplantation rénale. Pour ce faire, une analyse en cellule unique de lymphocytes B mémoires HLA-spécifiques de patients présentant différents contextes et degré d’immunisation a été réalisée, dans le but d’identifier leurs caractéristiques phénotypiques et transcriptomiques et la diversification de leur répertoire BCR.La deuxième partie des travaux s’est concentrée sur les modalités diagnostiques du rejet de greffe rénale. Depuis quelques années, des outils de biologie moléculaire sont disponibles, permettant d’évaluer des centaines de transcrits exprimés dans le tissu de biopsie. Ces outils donnent la possibilité de décrire de nouvelles voies physiopathologiques, et potentiellement d’améliorer le diagnostic du rejet, en particulier le rejet humoral. Néanmoins, leur utilisation en pratique courante est restreinte du fait de leur faible disponibilité, des difficultés à interpréter les données produites, et de leur coût. De plus, du fait de cette sous-utilisation en pratique clinique, leur impact exact dans la prise en charge des patients n’est pas déterminé. Au cours de cette thèse, un outil de diagnostic moléculaire ayant des caractéristiques compatibles avec une utilisation en pratique clinique a été développé. Celui-ci permet de diagnostiquer le rejet et de le classer en rejet humoral ou cellulaire. Dans un second temps, cet outil a été confronté à des situations cliniques litigieuses, afin d’évaluer son intérêt en pratique courante.À travers ces travaux, cette thèse vise d’une part à améliorer la compréhension de la réponse humorale en transplantation rénale, afin de contribuer à terme à mieux stratifier le risque immunologique en transplantation, et d’autre part à améliorer les modalités diagnostiques du rejet en aidant à la généralisation des outils de biologie moléculaire appliqués aux biopsies de greffons rénaux
Kidney transplantation is the best treatment of end-stage renal disease, improving life quality and quantity. Despite advances in pathophysiological knowledge of kidney transplant immunology, kidney transplant rejection remains the major cause of allograft dysfunction, especially antibody-mediated rejection.Antibody-mediated rejection risk assessment is based on the evaluation of donor-specific anti-HLA antibodies. However, these antibodies have a poor predictive value for incidence and prognosis of rejection. This could be explained by the heterogeneity of their intrinsic characteristics. These characteristics depend on cells responsible for their secretion, which include short- and long- lived plasma cells. Consequently, they indirectly depend on the cells responsible for maintaining the pool of these antibody-secreting cells, such as memory B cells. In infectious diseases, it is known that memory B cells are heterogeneous in terms of phenotype, function, degree of clonality, and diversification of their B-cell receptor (BCR). However, this heterogeneity has not been examined in the context of kidney transplantation.The aim of the first part of this thesis was to study the heterogeneity of HLA-specific memory B cells in sensitised patients on kidney transplant waiting list. To this end, single-cell analysis of HLA-specific memory B cells from patients with various aetiologies and degrees of immunisation was performed. This led to their phenotypic and transcriptomic characterisation and to the assessment of their BCR repertoire.The second part of this thesis was dedicated to the diagnosis of kidney transplant rejection.In recent years, biopsy-based transcriptomics has emerged, enabling the assessment of hundreds of transcripts in kidney biopsy tissue. These tools provide the opportunity to elucidate new physiopathological pathways and potentially enhance the diagnosis of rejection, especially humoral rejection. However, their application in clinical practice is still limited due to their restricted availability, required expertise for data processing and interpretation, and cost. Furthermore, their exact impact on patient management remains undetermined. Here, a molecular diagnostic tool with characteristics suitable for clinical use was developed. This tool enables the diagnosis of rejection and its classification between antibody-mediated and T-cell mediated rejection. Subsequently, this tool was assessed in ambiguous clinical situations to evaluate its impact in clinical practice.Through these studies, this thesis focused on enhancing our understanding of the humoral response in renal transplantation, which could help improving immunological risk stratification in transplantation. Additionally, it aimed to improve biopsy-based transcriptomics in the diagnosis of kidney transplant rejection

Les infections opportunistes sont l’une des principales causes de mortalité associées à la greffe de cellules souches. Afin d’aider à reconstituer le système immunitaire des patients greffés, nous proposons d’exploiter les plasmocytes autologues générés in vitro dans notre modèle de culture basé sur l’interaction CD40-CD154. Pour ce faire, les milieux de culture doivent être exempts de protéines animales. Deux milieux sans sérum ont été préalablement développés à Héma-Québec. Notre hypothèse est qu’il serait maintenant possible de promouvoir la différenciation des lymphocytes B et de maintenir la survie des plasmocytes en modifiant la composition de ces milieux sans sérum. Nos résultats montrent que notre milieu sans protéines animales permet de générer un grand nombre de plasmocytes et que ceux-ci ont un profil d’expression de CD38 qui est stabilisé par la vitamine A. En conclusion, la formulation de ce milieu représente un progrès quant à la possibilité d’utiliser ces plasmocytes en immunothérapie.

L’immunité humorale, que les lymphocytes B chapeautent via la production d’anticorps, fournit à l’organisme des armes solubles et spécifiques permettant de combattre une infection en cours, et d’en conserver une mémoire immunologique. Traditionnellement, on associe la réponse des lymphocytes B naïfs à la première apparition d’un antigène et celle des cellules mémoires à l’apparition subséquente d’un antigène déjà rencontré. Ces deux sous-populations, pouvant être distinguées par l’expression différentielle de la molécule CD27, circulent simultanément en périphérie chez l’humain. Au cours de ce projet de doctorat, la réponse in vitro des lymphocytes B naïfs (CD27) et mémoires (CD27+) isolés du sang a été étudiée, dans un système exploitant l’interaction CD40-CD154, normalement médiée par les lymphocytes T, en présence de facteurs solubles. Cette étude a mis en évidence la réponse distincte des cellules naïves et mémoires lorsque stimulées séparément, reflétant la disparité de leurs besoins. La comparaison de leur stimulation simultanée ou séparée a mis au jour une possible interaction entre les cellules B naïves et mémoires, suggérant une vision nouvelle de l’initiation de la réponse primaire in vivo. De plus, cette étude a permis l’identification d’une sous-population de cellules mémoires distinctes en périphérie, au phénotype CD27-IgG+, remettant en question l’utilisation du CD27 comme marqueur de cellules B mémoires chez l’humain. La comparaison des populations stimulées suggère qu’un rôle régulateur pourrait être associé à ces cellules mémoires, pouvant contribuer à contenir la réponse des cellules naïves une fois l’infection prise en charge. En bout de ligne, ce projet a permis de modéliser la réponse humorale primaire et secondaire en tenant compte de cette nouvelle sous-population mémoire, ainsi que des interactions entre cellules B pouvant intervenir in vivo.
Humoral immunity, managed by B lymphocytes and their antibody production, provides to the body soluble and specific weapons to clear current infections and to preserve an immunological memory. Traditionally, naive B cell response is associated with the first encounter with an antigen, while memory cell response is related to its subsequent appearance. Both populations, circulating in human peripheral blood, can be distinguished by the differential expression of the CD27 molecule. During this project, the in vitro response of peripheral naive (CD27) and memory B cells (CD27+) was studied, in a system exploiting CD40-CD154 interaction, normally provided by T cells, in the presence of soluble factors. This study highlighted a distinct response from naive and memory cells when separately stimulated, reflecting their different requirements. Comparison between their stimulation, together and separately, also underlined possible B-B cell interactions, suggesting a new vision of primary response initiation in vivo. Furthermore, this study conducted to the identification of a distinct memory cell subset in periphery, displaying a CD27IgG+ phenotype, which questions the use of CD27 as a memory B cell marker in humans. A potential regulatory role has also been suggested for the CD27-IgG+ memory subset, presumably aimed to suppress naive cell response once the infection is controlled. Overall, this project supports the elaboration of a model for primary and secondary humoral responses, taking into account the new memory subset identified and the interactions among B cells that likely occur in vivo.

La réponse humorale est altérée lors de l’infection par le virus de l’immunodéficience humaine (VIH). Les lymphocytes T CD4+ folliculaires helper (Tfh) sont impliqués dans la maturation des lymphocytes B (LB) dans les organes lymphoïdes secondaires. Mon travail de thèse s’est articulé autour de deux axes complémentaires visant à étudier les Tfh et les réponses B mémoires lors de l’infection par le VIH. J’ai d’abord étudié les Tfh spléniques lors de la phase chronique de l’infection par le VIH. J’ai mis en évidence une augmentation des populations de Tfh dans les rates de patients VIH+. D’autre part l’infection par le VIH a un impact sur le profil transcriptionnel des Tfh de la rate et la production de cytokines impliquées dans la différenciation des LB, suggérant un défaut fonctionnel des Tfh. Parallèlement, la maturation des LB est altérée dans les rates VIH+. Dans le second axe de ma thèse, j’ai étudié les réponses B mémoires anti-VIH dans différentes cohortes de patients VIH+ : Elite controller (EC) contrôlant l’infection sans traitements et des patients VIH+ traités. J’ai mis en évidence que les EC préservent naturellement leurs compartiments B mémoires et que les réponses B mémoires spécifiques du VIH sont maintenues dans le sang de ces patients. Les réponses B mémoires IgG1+ anti-VIH sont majoritaires chez les EC, tandis que les réponses IgG2+ et IgG3+ sont plus rares. Ces travaux permettent une meilleure compréhension de la physiopathologie de l’infection par le VIH en apportant de nouveaux éléments sur la fonctionnalité des Tfh et les réponses B mémoires anti-VIH
HIV infection is associated with a defect of humoral response. T follicular helper cells (Tfh) support multiple steps of B cell maturation and antibody production. My work was divided in two complementary axes aiming to characterize Tfh and memory B cell responses in HIV-infected patients.I identified several Tfh populations in HIV+ and HIV- spleens by FACS. These three populations were increased in HIV+ spleen. I also evidenced an impact of HIV infection on transcriptional profile and a compromised production of B cell differentiation-related cytokines by splenocytes from HIV+ donors. These results suggest Tfh functions impairment during HIV-infection. In parallel, we noticed an altered maturation of B cells in HIV+ spleens. In a cohort study, we compared memory B cell responses in the blood of Elite controllers (EC) who naturally control HIV and treated HIV+ patients. I evidenced that EC naturally preserve their memory B cell compartments. In contrast to anti-HIV IgG2 and IgG3 secreting B cells, most EC exhibit a high frequency of anti-HIV IgG1 secreting B cells. My work highlights a defective Tfh differentiation, which might explain why B cell maturation is severely affected in HIV-progressors. The status of HIV-controller seems associated with the presence of an IgG1 B cell memory response. Further work will highlight whether Tfh functions are preserved in EC

Depuis sa découverte, le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) a causé la mort de 33 millions de personnes, et 36,7 millions sont actuellement infectées. Malgré l’existence des thérapies antirétrovirales, celles-ci ne conduisent pas à d’éradiquer le virus. En outre, il n’existe pas de vaccin. Les lymphocytes B, dont la fonction est de produire les anticorps sont dysfonctionnels au cours du VIH-1. Or la majorité des stratégies vaccinales se basent sur la production d’anticorps dépendante des cellules T CD4. Ainsi, la première partie de mon doctorat a été consacré à la compréhension de l’impact du VIH-1 sur les cellules T CD4 folliculaires auxiliaires (Tfh) essentielles à l’activation des lymphocytes B et à la production d’anticorps spécifiques, dans la rate l’organe majeur de la réponse des lymphocytes B. Dans la deuxième partie, j’ai analysé les cellules T CD4 mémoires, Tfh et les lymphocytes B dans les ganglions mésentériques: un site inducteur de la réponse immunitaire intestinale, qui alimente la lamina propria (site effecteur) de la muqueuse intestinale en cellules mémoires. Étant donné l’impossibilité d’étudier ces organes profonds en particulier en phase aiguë chez l’homme, j’ai utilisé le modèle du macaque rhésus infecté par le virus de l’immunodéficience simienne (VIS). Les résultats de ces études montrent que l’évolution vers le SIDA est associée à une déplétion précoce des cellules Tfh et T CD4 mémoires dans la rate et les ganglions mésentériques. Concomitant à cela, je rapporte une déplétion des lymphocytes B mémoires dans la rate et un faible titre d’IgG anti-VIS dans le sérum. En plus, les cellules Tfh commutent leur phénotype d'effecteur mémoire vers celui de centrale mémoire associé à l’expriment de CD127 (récepteur de l’IL-7) et de T-bet (marqueur de cellules Th1). De plus, je montre que la déstructuration des organes lymphoïdes secondaires, ainsi que les cytokines environnementales comme l’IL-7 ou l’IL-27 peuvent contribuer au dysfonctionnement des cellules Tfh puisque ces dernières induisant les facteurs de transcription inhibiteurs des cellules Tfh tels que T-bet, Foxo1, Stat5 et KLF2. En conclusion, mes résultats permettent de mieux comprendre que le dysfonctionnement des lymphocytes B et l’immunodéficience dans la muqueuse intestinale sont associés à la déplétion soudaine des lymphocytes T CD4 mémoires et Tfh dans la rate et les ganglions mésentériques. Par conséquent, prévenir la perte de ces cellules pourrait être une approche thérapeutique et vaccinale prometteuse pour la neutralisation du virus et pour une meilleure immunité intestinale, afin d’empêcher la translocation bactérienne.
Since its discovery, HIV-1 has caused the death of 35 million people, and 36.9 million are living infected. Although researches have led to the development of antiretroviral therapies, which not only improve life expectation but also life quality of infected individuals, these therapies are not capable of eradicating the virus, and unfortunately there is no vaccine. The pathogenesis of HIV-1 is linked to a dysfunction of CD4 T cells that favors progression to AIDS. Therefore, given that most vaccines are based on T cell-dependent antibody production, the first part of my PhD research is devoted to understanding the impact of HIV-1 on CD4 T Follicular helper (Tfh) cells, which are essential for B cell activation and the production of specific antibodies. These cells are particularly crucial in the spleen, which is the major organ for B cell response. In the second part, I have analyzed the dynamics of memory CD4 T, Tfh and of B cells in mesenteric lymph nodes: an inductive site of the immune response that provides memory cells to the lamina propria (effector site) of the intestinal mucosa. Given the difficulties to study these deep organs, particularly during the acute phase in humans, I have used rhesus macaques infected with the simian immunodeficiency virus (SIV) to study the dynamics of Tfh cells. My results show an early depletion of splenic Tfh cells during the acute phase; a depletion that persists during the chronic phase within macaques in which the infection rapidly progresses to AIDS. Concomitantly, we report a depletion of memory B cells and low titers of anti-SIV IgG titers in these macaques. Furthermore, I observed a massive depletion of memory CD4 T, Tfh and B cells in mesenteric lymph nodes, as well as a phenotypic change of Tfh cells that become central memory cells associated with the upregulation of the expression of CD127 (IL-7 receptor). My results also show that environmental cytokines such as IL-7 and IL-27 contribute to their dysfunction as support the expression of transcription factors that inhibit Tfh cells such as T-bet, Foxo1 and Stat5. In conclusion, my results provide a better understanding of B cell dysfunction related to the early loss of the Tfh cells during HIV/SIV infection. Moreover, I hypothesize that the loss of immunity in the intestinal mucosa is due to the sudden depletion of memory CD4 T, Tfh and B cells in the mesenteric lymph nodes. Therefore, maintaining Tfh and memory CD4 T cells during the early phase of infection could be a promising therapeutic and vaccine approach for neutralizing HIV/SIV, as well as preventing bacterial translocation.

Les lymphocytes T CD8+ spécifiques de l'antigène sont impliqués dans la réponse immunitaire adaptative et jouent un rôle essentiel dans la protection de l'hôte contre l'infection par des pathogènes intracellulaires. Cette protection de longue durée dépend de la génération de réponses lymphocytaires T CD8+ mémoires, hautement fonctionnelles en termes de fréquence et de fonctionnalité, après réinfection.Après présentation de l'antigène, une cellule T CD8 naïve subit une forte expansion clonale, générant une population hétérogène de cellules activées qui est dominée, au sommet de l'expansion, par des effecteurs CD8 de courte durée (SLEC). Cette expansion est suivie d'une phase de contraction massive par apoptose. Quelques cellules survivent à cette phase de contraction et finissent par se différencier en cellules mémoire hautement compétentes. Les processus par lesquels et le moment où se différencient les précurseurs de mémoire (MPECs) restent largement inconnus, tout comme les étapes ultérieures de leur maturation en cellules mémoire pleinement fonctionnelles. Les signaux d'aide provenant des cellules T CD4+ sont clairement requis tout au long du processus de maturation des MPEC.Notre équipe a montré que les lymphocytes T CD4+ régulateurs FoxP3+ (Tregs) favorisent la maturation des MPEC en limitant l'exposition à l'IL-2 et en fournissant des signaux inhibiteurs, mais ce n'est probablement qu'une facette de l'aide complexe et multiforme apportée par les cellules T CD4+ au MPEC. Les Tregs agissent sur des MPEC préexistants. Les réponses mémoire B et CD8+ partagent des caractéristiques communes, telles que l'expression du facteur de transcription Bcl-6. Les lymphocytes T CD4+ folliculaires (Tfh) sont les principaux producteurs de la cytokine IL-21. Bien que les mécanismes par lesquels les Tfh induisent l’expression de Bcl-6 dans les cellules B doivent être clarifiés, ils pourraient inclure l’IL-21 et l’interaction CD40-CD40L.Dans ce projet de thèse, nous avons étudié le rôle potentiel des Tfh dans l'initiation de la différenciation mémoire T CD8+, dans des modèles de souris transgéniques permettant une déplétion transitoire et sélective des Tfh, infectées par la bactérie recombinante Listeria monocytogenes-OVA.Nous avons montré que dès 2 jours après l'infection, les MPECs très précoces peuvent être identifiés par l’expression du récepteur de chimiokine CXCR5. Ces précurseurs précoces, qui ont un phénotype effecteur, se développent et migrent temporairement à la jonction des zones T et B, où ils interagissent avec les Tfh puis perdent leur expression CXCR5.Cette interaction avec les Tfh, considérés jusqu'à présent comme des auxiliaires exclusifs des cellules B, est nécessaire pour que les MPECs CD8+ deviennent des cellules mémoire compétentes sensibles à l'IL-21, capables de générer des réponses effectrices secondaires efficaces.Cette étude dévoile les premières étapes cruciales dans la génération de la mémoire CD8+, identifie CXCR5 comme le premier marqueur connu des MPECs CD8+, révèle l’implication fondamentale des Tfh dans le CD4 help et indique une coordination possible, via les Tfh, entre les voies de différentiation mémoire CD8+ et B. Ces résultats peuvent avoir des implications pour la conception du vaccin et de l'immunothérapie
Antigen-specific CD8 T cells are involved in the adaptive immune response and play a critical role in protecting the host from infection by intracellular pathogens. This long-lasting protection depends on the generation of memory CD8+ T cell responses, which are highly functional in terms of frequency and functionality, after secondary infection.Following antigen activation, a naive CD8 T cell undergoes strong clonal expansion, generating a heterogeneous population of activated cells that is dominated, at the peak of expansion, by short-lived CD8 effectors (SLECs). This expansion is followed by a phase of drastic contraction through massive apoptosis. A few cells survive this contraction phase and eventually become highly competent memory cells. Precisely when and how these memory precursors (MPECs) are generated is largely unknown, and so are the subsequent steps of their maturation into fully functional memory cells. Help signals from CD4+ T cells are clearly required throughout the MPEC maturation process.Our team has previously shown that FoxP3+ regulatory CD4+ T cells (Tregs) favor MPECs maturation by limiting exposure to IL-2 and by providing inhibitory signals, but this is probably only one facet of the complex and multifaceted help provided by CD4+ T cells to MPEC, and Tregs act on pre-existing MPECs.B-cell memory and CD8+ T cell memory share some common features, such as the expression of the transcription factor Bcl-6. Tfh are major producers of the cytokine IL-21. The mechanisms by which Tfh induces Bcl-6 in B-cells need to be clarified, they might include IL-21 and CD40-CD40L.In this PhD project, we have investigated the potential role of Tfh on the initiation of CD8 memory differentiation, in transgenic mice models, allowing transient and selective depletion of Tfh cells, infected by recombinant Listeria monocytogenes-OVA.We have shown that as early as 2 days after infection, very early memory precursors can be identified by their expression of the chemokine receptor CXCR5. These early precursors, which have an effector phenotype, expand and temporarily migrate to the junction of T-cell and B-cell zones, where they interact with follicular CD4 T cells (Tfh) then lose their CXCR5 expression.Remarkably, this interaction with Tfh, hitherto considered as exclusive B-cell helpers, is required for memory precursors to become competent memory cells responsive to IL-21 and capable of mounting efficient cytotoxic secondary effector responses.This study thus unveils critical early steps in the generation of CD8 memory, identifies CXCR5 as the earliest known marker of CD8 memory precursors, reveals a major helper role for Tfh, and points to possible coordination, through Tfh, between the pathways of CD8 and B-cell memory generation. These findings may have implications for vaccine and immunotherapy design

Lors d’une infection par un pathogène, des lymphocytes T CD8+ naïfs (LTn) spécifiques de l’antigène sont activés, prolifèrent et se différencient en LT effecteurs (LTe). Les LTe produisent différentes cytokines et acquièrent une activité cytotoxique menant à l’élimination du pathogène. Seulement 5 à 10 % des LTe survivront et se différencieront en LT mémoires (LTm), qui sont capables de répondre plus rapidement lors d’une seconde infection par le même pathogène, contribuant au succès de la vaccination. Toutefois, la compréhension de l’ensemble des mécanismes régulant le développement des LTe et des LTm demeure incomplète. Afin de mieux comprendre les signaux requis pour la différenciation des LT CD8+ lors de la réponse immune, nous avons posé deux hypothèses. Nous avons d’abord proposé que différentes cellules présentatrices d’antigène (CPA) fournissent différents signaux au moment de la reconnaissance antigénique influençant ainsi le devenir des LT CD8+. Vu leur potentiel d’utilisation en immunothérapie, nous avons comparé la capacité d’activation des LT CD8+ par les lymphocytes B activés via le CD40 (CD40-B) et les cellules dendritiques (CD). Nous avons montré que l’immunisation avec des CD40-B induit une réponse effectrice mais, contrairement à l’immunisation avec des CD, pratiquement aucun LTm n’est généré. Les LTe générés sont fonctionnels puisqu’ils sécrètent des cytokines, ont une activité cytotoxique et contrôlent une infection avec Listeria monocytogenes (Lm). Nous proposons qu’une sécrétion plus faible de cytokines par les CD40 B ainsi qu’une interaction plus courte et moins intime avec les LT CD8+ comparativement aux CD contribuent au défaut de différenciation des LTm observé lors de la vaccination avec les CD40-B. Ensuite, nous posé l’hypothèse que, parmi les signaux fournis par les CPA au moment de la reconnaissance antigénique, la voie de signalisation Notch influence le développement des LTe, mais aussi des LTm CD8+ en instaurant un programme génétique particulier. D’abord, grâce à un système in vitro, le rôle de la signalisation Notch dans les moments précoces suivant l’activation du LT CD8+ a été étudié. Ce système nous a permis de démontrer que la voie de signalisation Notch régule directement l’expression de la molécule PD-1. Ensuite, grâce à des souris où il y a délétion des récepteurs Notch1 et Notch2 seulement chez les LT CD8+ matures, un rôle de la voie de signalisation Notch dans la réponse immune des LT CD8+ a été démontré. Nos résultats démontrent que suite à une infection avec Lm ou à une immunisation avec des CD, la signalisation Notch favorise le développement de LTe, exprimant fortement KLRG1 et faiblement CD127, destinés à mourir par apoptose. Toutefois, la signalisation Notch n’a pas influencé la génération de LTm. De façon très intéressante, l’expression des récepteurs Notch influence la production d’IFN- en fonction du contexte d’activation. En effet, suite à une infection avec Lm, l’absence des récepteurs Notch n’affecte pas la production d’IFN- par les LTe, alors qu’elle est diminuée suite à une immunisation avec des CD suggérant un rôle dépendant du contexte pour la voie de signalisation Notch. Nos résultats permettent une meilleure compréhension des signaux fournis par les différentes CPA et de la voie de signalisation Notch, donc des mécanismes moléculaires régulant la différenciation des LT CD8+ lors de la réponse immunitaire, ce qui pourrait ultimement permettre d’améliorer les stratégies de vaccination.
Following an infection with a pathogen, antigen-specific naive CD8+ T lymphocytes (Tn) will proliferate and differentiate into effector (Te) cells. Those Te cells will produce different cytokines and acquire a cytotoxic activity, leading to pathogen clearance. Only 5 to 10 % of Te cells will survive and differentiate into memory CD8+ T lymphocytes (Tm) able to respond rapidly following a second encounter with the same pathogen, contributing to the success of vaccination. However, the mechanisms regulating Te and Tm cells development remain incompletely understood. To better understand the signals required for CD8+ T lymphocytes during an immune response, we proposed two hypotheses. First, we propose that different antigen presenting cells (APCs) can deliver different signals to CD8+ T lymphocytes at the time of priming leading to different outcome. Given their potential for use in immunotherapy, we compared the ability of CD40 activated B lymphocytes (CD40-B) and dendritic cells (DCs) to activate CD8+ T lymphocytes. We have shown that CD40-B cell immunisation leads to an effector response but very few Tm cells are generated compared to DC immunisation. The Te cells generated following CD40-B cell immunisation are functional because they secrete cytokine, are cytotoxic and control a Listeria monocytogenes (Lm) infection. We propose that CD40-B cells secrete less cytokines and interact during shorter period of time with the CD8+ T lymphocytes, without engulfment, contributing to the decreased Tm generation observed following immunisation with CD40-B cells. Second, among the signals provided by APC at the time of CD8+ T lymphocyte priming, we have hypothesised that the Notch signalling pathway influences Te and Tm cell differentiation by inducing a particular genetic program. Using an in vitro system, we first studied the role of the Notch signalling pathway in the hours following CD8+ T lymphocyte priming. We demonstrated that Notch signalling directly regulates PD-1 expression. Then, studying mice where Notch1 and Notch2 receptor genes are deleted only in mature CD8+ T lymphocytes, we characterised the role of the Notch signalling pathway on Te and Tm differentiation during an immune response. Our results show that following Lm infection or a DC immunisation, the Notch signalling pathway promotes the differentiation of short lived effector cells Te cells (KLRG1highCD127low) meant to die by apoptosis. However, the Notch signalling pathway did not influence the generation of CD8+ Tm cells. Most interestingly, IFN- regulation by the Notch signalling pathway depends on the activation context. Indeed, following Lm infection, lack of Notch receptors does not impact IFN- secretion by Te cells while it is significantly decreased following a DC immunisation suggesting a context dependant role for the Notch signalling pathway. Our findings provide a better understanding of the key signals provided by APC as well as the Notch signalling pathway, and thus the molecular mechanisms leading to CD8+ lymphocyte effector and memory generation which is crucial as this knowledge may ultimately lead to improved vaccination.