Dissertations / Theses on the topic 'Lingulodinium'

Thesis (Ph. D.)--University of California, San Diego, 2007.
Title from first page of PDF file (viewed October 3, 2007). Available via ProQuest Digital Dissertations. Vita. Includes bibliographical references.

Marine dinoflagellates are an ecologically important phytoplanktonic group that accounts for two thirds of all known harmful algal bloom (HAB) species. This study explores the population ecology of Lingulodinium polyedrum (F. Stein) J.D. Dodge, a common bloom-forming dinoflagellate species in Southern California. Lingulodinium polyedrum is not considered a HAB species, but functions as one of the main model organisms for dinoflagellate biology. As such, knowledge about this species also contributes significantly to the understanding of dinoflagellate population dynamics at a more general level. In an attempt to understand some of the complex interactions that govern L. polyedrum population ecology, laboratory experiments of life cycle control and intraspecific phenotypic diversity were linked with an in situ study of the population dynamics and the intraspecific genetic diversity of this species in coastal waters of Southern California. The life cycle experiments showed that processes such as gametogenesis and ecdysis of L. polyedrum are influenced by photon flux density (PFD) and gave a first indication for an involvement of the photosynthetic apparatus in the induction of gametogenesis in dinoflagellates. The light acclimation experiments revealed, for the first time, intraspecific phenotypic diversity in L. polyedrum. The two studied strains differed distinctly in their light requirements and light acclimation ‘strategies’. For the study of intraspecific genetic diversity in L. polyedrum a novel method was developed that allowed the genotyping of individual cells. The application of this novel approach to natural populations showed that population genetic exchange of L. polyedrum in the Southern California Bight is tied to water circulation patterns and that both habitat structure and environmental change leave their signatures in the population genetic composition of L. polyedrum. This thesis represents one of the most comprehensive studies of dinoflagellate population ecology and builds the basis for the development of a holistic concept of the population ecology of L. polyedrum and other dinoflagellate species.

Devido à necessidade de se conhecer os impactos que as diversas atividades antropogênicas exercem sobre os ecossistemas torna-se relevante o estudo dos organismos aquáticos perante os resíduos tóxicos resultantes, com o objetivo de facilitar a identificação de áreas poluiídas ou contaminadas e estudos de meios atingidos por estes agentes poluentes. Estudo da microalga em contato com o fenol em concentrações conhecidas, compreende a determinação dos efeitos tóxicos e geração de metabólitos, caracterizando uma possível utilização deste microorganismo como bioindicador para contaminações do poluente. Determinou-se as concentrações de fenol capazes de em 24 horas inibirem o crescimento das células de L. polyedrum em 20 e 50% (IC 20 e IC 50) respectivamente 40 µmol.L-1 e 120 µmol.L-1. Identificou-se a necessidade de padronização das variáveis na execução dos ensaios dose-resposta com algas, permitindo construir protocolos que auxiliariam a obtenção de legislações que assegurem os limites de compostos tóxicos aos organismos costeiros. Calculou-se que a microalga L. polyedrum possui uma taxa de biodegradação do fenol por célula na média de aproximadamente (0,02 µmol.h-1.cel-1), capaz de biotransformar 120 µmol.L-1 de fenol em um período de 16 horas. Vias de biotransformação do fenol na microalga L.polyedrum se dão pela conjugação com a glutationa, catalisada por glutationa S-transferase e pela via metabólica de fenol hidroxilase e catecol 2,3-dihidroxigenase. Identificou-se a geração do ácido 2-hidroximucônico semialdeído, 1,2-dihidroxibenzeno (Catecol) e ácido 2-oxo 4-pentenóico como metabólitos resultantes da exposição de L. polyedrum ao fenol. O composto orgânico fenol é capaz de induzir um estado de aumento na atividade antioxidante da microalga L. polyedrum, sendo as enzimas superóxido dismutase e catalase os melhores biomarcadores, por terem sua expressão até três vezes maior no grupo exposto. Determinou-se que a razão GSH/GSSG no grupo tratado com fenol é menor, devido ao aumento de 20 ng.mL-1 de GSSG, expressando o efeito oxidativo no sistema glutationa, que em condições normais possui os níveis de GSSG muito abaixo dos de GSH. A avaliação fotossintética sugeriu que o fenol interferiu relativamente na fotossíntese da microalga em um curto intervalo de tempo, demonstrando a promissora sensibilidade a este poluente presente no ambiente marinho.
Due necessity of knowing and understand the impacts of diverse anthropogenic activities exerted above ecosystems became relevant the study of aquatic organisms exposed to toxic waste, this can facilitate the identification of polluted or contaminated areas. Study of microalgae in contact with phenol at known concentrations, comprehended a determination of the toxic effects and generation metabolites of characterizing the possible use of the organism as a bioindicator to contamination of the pollutant. In this work it was determined in 24 hours those inhibitor phenol concentrations of cell growth of L.polyedrum on 20% and 50% (IC 20 and IC 50) respectively 40 µmol.L-1 and 120 µmol.L-1. Acknowledged need for standardization of variables in the implementation of dose-response tests with algae, allowing you to build protocols that would help to obtain laws that ensure the limits of toxic compounds to coastal organisms. It was assumed that the L. polyedrum microalgae has a biodegradation rate of phenol per cell on average of about (0,02 µmol.h-1.cel-1), capable of biotransformation 120 µmol.L-1 of phenol in a period of 16 hours. Biotransformation pathways of phenol in the microalgae L. polyedrum occur by conjugation with glutathione, catalyzed by glutathione S-transferase and the metabolic pathway of phenol hydroxylase and catechol 2,3-dihydroxygenase. We identified 2- hydroxy muconic semialdehyde acid, 1,2-dihydroxybenzene (catechol) and 2-oxo-4-pentenoic acid as metabolites resulting from exposure to phenol. The phenol is able to induce a high active antioxidant enzymes on L. polyhedron, and the enzymes superoxide dismutase and catalase the best biomarkers since were induced three times more in the exposed group. It was determined that the GSH / GSSG ratio in the group treated with phenol, GSSG has an increase of 20 ng.mL-1. Evaluation suggested that the phenol interfered on photosynthesis of microalgae in a short time, showing promising sensitivity to this pollutant in the marine environment.

Harmful algae blooms (HABs) have caused millions dollars in annual losses to the aquaculture industry, inhibited beach recreation, and have threatened marine and human health. HABs and red tides can develop suddenly and their frequency, geographic range, and intensity have increased over the past decade. A possible source for spreading and seeding new areas expanding the geographic range of HABs is ballast water. The process of ballast water discharge has been identified as a primary vector for the translocation of non-indigenous species (NIS) and invasive species. National and international efforts are currently underway to address the impact of NIS and invasive species. Policy is being developed detailing stringent rules to kill, remove, or otherwise inactive organisms in ballast water prior to or upon discharge. Currently, vendors are developing technologies to treat ballast water and U.S. and international facilities are testing these technologies to verify their efficacy. Ultraviolet (UV) radiation is commonly employed in ballast water treatment technologies. Previous studies have shown that UV light is effective for disinfecting drinking water, but the response of non-pathogenic and marine organisms is largely unknown. The purpose of this research was to measure the viability of the durable red-tide forming dinoflagellate, Lingulodinium polyedra following UV treatment. Two methods were used to measure the viability signal; manual epifluorescence microscopy with correlated viability stains and Pulse Amplitude Modulated (PAM) fluorometry to measure the physiological state of the organism following UV treatment. The number of cysts was also enumerated. The results showed that there was a significant decrease in the number of living L. polyedra cells following a UV treatment of more than 100 mWs cm-2. The results also have showed a significant increase in the number of L. polyedra cysts following UV treatment as low as 50 mWs cm-2.

Com o aumento de atividades humanas nocivas ao meio ambiente e principalmente ao meio aquático, torna-se importante a elucidação dos mecanismos de defesa que envolvem os organismos expostos. As algas têm particular importância por serem a base da cadeia alimentar do ecossistema marinho. Ao acumular as substâncias tóxicas presentes no ambiente e servirem de alimento para outras espécies, elas podem provocar biomagnificação do agente tóxico ao longo da cadeia. A escolha da microalga Lingulodinium polyedrum deve-se à sua ampla distribuição em âmbito nacional e mundial e por ser um organismo modelo para estudos de toxicologia envolvendo metais. Este trabalho tem como objetivos padronizar as condições do meio de cultivo de forma a proporcionar o crescimento ideal da espécie, traçar a curva de crescimento e monitorar os aspectos biológicos que sofrem alterações frente a metais, tais como: taxa fotossintética, atividade da enzima antioxidante superóxido dismutase, balanço entre glutationa reduzida e oxidada, bioacumulação intracelular dos metais a que foram expostas e identificação de substâncias quelantes sintetizadas pelas algas, conhecidas como fitoquelatinas. Para alcançar estes objetivos foram utilizadas técnicas analíticas tais como espectrofotometria, espectrometria de massas e espectrometria de emissão atômica com plasma acoplado indutivamente. Dentre os resultados obtidos estão diminuição da quantidade de glutationa reduzida e oxidada quando algas são expostas a metais, diminuição da quantidade de cádmio presente no meio, aumento da atividade de superóxido dismutase e síntese de fitoquelatinas. Com os resultados obtidos podemos concluir que as fitoquelatinas podem ser usadas como biomarcadores de exposição ao cádmio e o organismo, por ser capaz de diminuir a quantidade de metais disponíveis no ambiente, tem potencial para biorremediar ambientes poluídos.
Given the increase of environmentally harmful human activities, in particular the ones injurious to the aquatic environment, it is important to elucidate the defense mechanisms utilized by organisms exposed to damaging agents. Those species can later be suggested to be used as pollution bioindicators or bioremediatiors. Algae are of particular importance because they are the basis of the marine ecosystem food chain. Given that these organisms can accumulate toxic substances from the environment and they serve as food for other species, it will cause biomagnification of the toxic agent in the chain. The choice of the microalgae Lingulodinium polyedrum was due to its wide national and global distribution and the fact that it is a model organism for toxicology studies involving metals. This work aims to standardize the medium conditions in order to provide the ideal growth of the species; plot the growth curve; and monitor the biological aspects that change in the presence of metals, such as: photosynthetic rate, antioxidant enzyme superoxide dismutase activity, balance between oxidized and reduced glutathione, intracellular accumulation of metals and identification of chelating substances synthesized by the alga, known as phytochelatins. To achieve these objectives there were used analytical techniques such as spectrophotometry, mass spectrometry and inductively coupled plasma atomic emission spectroscopy. Among the obtained results there are the decrease in the amount of reduced and oxidized glutathione when algae are exposed to the metal; reduction in the quantity of cadmium in the medium; and increase in superoxide dismutase activity and phytochelatin synthesis. Based on the results it can be concluded that phytochelatins can be used as biomarkers of exposure to cadmium and the organism have potential to bioremediate polluted environments.

Les dinoflagellés sont des eucaryotes unicellulaires retrouvés dans la plupart des écosystèmes aquatiques du globe. Ces organismes amènent une contribution substantielle à la production primaire des océans, soit en tant que membre du phytoplancton, soit en tant que symbiontes des anthozoaires formant les récifs coralliens. Malheureusement, ce rôle écologique majeur est souvent négligé face à la capacité de certaines espèces de dinoflagellés à former des fleurs d'eau, parfois d'étendue et de durée spectaculaires. Ces floraisons d'algues, communément appelées "marées rouges", peuvent avoir de graves conséquences sur les écosystèmes côtiers, sur les industries de la pêche et du tourisme, ainsi que sur la santé humaine. Un des facteurs souvent corrélé avec la formation des fleurs d'eau est une augmentation dans la concentration de nutriments, notamment l’azote et le phosphore. Le nitrate est un des composants principaux retrouvés dans les eaux de ruissellement agricoles, mais également la forme d'azote bioaccessible la plus abondante dans les écosystèmes marins. Ainsi, l'agriculture humaine a contribué à magnifier significativement les problèmes associés aux marées rouges au niveau mondial. Cependant, la pollution ne peut pas expliquer à elle seule la formation et la persistance des fleurs d'eau, qui impliquent plusieurs facteurs biotiques et abiotiques. Il est particulièrement difficile d'évaluer l'importance relative qu'ont les ajouts de nitrate par rapport à ces autres facteurs, parce que le métabolisme du nitrate chez les dinoflagellés est largement méconnu. Le but principal de cette thèse vise à remédier à cette lacune. J'ai choisi Lingulodinium polyedrum comme modèle pour l'étude du métabolisme du nitrate, parce que ce dinoflagellé est facilement cultivable en laboratoire et qu'une étude transcriptomique a récemment fourni une liste de gènes pratiquement complète pour cette espèce. Il est également intéressant que certaines composantes moléculaires de la voie du nitrate chez cet organisme soient sous contrôle circadien. Ainsi, dans ce projet, j'ai utilisé des analyses physiologiques, biochimiques, transcriptomiques et bioinformatiques pour enrichir nos connaissances sur le métabolisme du nitrate des dinoflagellés et nous permettre de mieux apprécier le rôle de l'horloge circadienne dans la régulation de cette importante voie métabolique primaire. Je me suis tout d'abord penché sur les cas particuliers où des floraisons de dinoflagellés sont observées dans des conditions de carence en azote. Cette idée peut sembler contreintuitive, parce que l'ajout de nitrate plutôt que son épuisement dans le milieu est généralement associé aux floraisons d'algues. Cependant, j’ai découvert que lorsque du nitrate était ajouté à des cultures initialement carencées ou enrichies en azote, celles qui s'étaient acclimatées au stress d'azote arrivaient à survivre près de deux mois à haute densité cellulaire, alors que les cellules qui n'étaient pas acclimatées mourraient après deux semaines. En condition de carence d'azote sévère, les cellules arrivaient à survivre un peu plus de deux semaines et ce, en arrêtant leur cycle cellulaire et en diminuant leur activité photosynthétique. L’incapacité pour ces cellules carencées à synthétiser de nouveaux acides aminés dans un contexte où la photosynthèse était toujours active a mené à l’accumulation de carbone réduit sous forme de granules d’amidon et corps lipidiques. Curieusement, ces deux réserves de carbone se trouvaient à des pôles opposés de la cellule, suggérant un rôle fonctionnel à cette polarisation. La deuxième contribution de ma thèse fut d’identifier et de caractériser les premiers transporteurs de nitrate chez les dinoflagellés. J'ai découvert que Lingulodinium ne possédait que très peu de transporteurs comparativement à ce qui est observé chez les plantes et j'ai suggéré que seuls les membres de la famille des transporteurs de nitrate de haute affinité 2 (NRT2) étaient réellement impliqués dans le transport du nitrate. Le principal transporteur chez Lingulodinium était exprimé constitutivement, suggérant que l’acquisition du nitrate chez ce dinoflagellé se fondait majoritairement sur un système constitutif plutôt qu’inductible. Enfin, j'ai démontré que l'acquisition du nitrate chez Lingulodinium était régulée par la lumière et non par l'horloge circadienne, tel qu'il avait été proposé dans une étude antérieure. Finalement, j’ai utilisé une approche RNA-seq pour vérifier si certains transcrits de composantes impliquées dans le métabolisme du nitrate de Lingulodinium étaient sous contrôle circadien. Non seulement ai-je découvert qu’il n’y avait aucune variation journalière dans les niveaux des transcrits impliqués dans le métabolisme du nitrate, j’ai aussi constaté qu’il n’y avait aucune variation journalière pour n’importe quel ARN du transcriptome de Lingulodinium. Cette découverte a démontré que l’horloge de ce dinoflagellé n'avait pas besoin de transcription rythmique pour générer des rythmes physiologiques comme observé chez les autres eukaryotes.
Dinoflagellates are unicellular eukaryotes found in most aquatic ecosystems of the world. They are major contributors to carbon fixation in the oceans, either as free-living phytoplankton or as symbionts to corals. Dinoflagellates are also infamous because some species can form spectacular blooms called red tides, which can cause serious damage to ecosystems, human health, fisheries and tourism. One of the factors often correlated with algal blooms are increases in nutrients, particularly nitrogen and phosphorus. Nitrate is one of the main components of agricultural runoffs, but also the most abundant bioavailable form of nitrogen in marine environments. Thus, agricultural activities have globally contributed to the magnification of the problems associated with red tides. However, bloom formation and persistence cannot be ascribed to human pollution alone, because other biotic and abiotic factors are at play. Particularly, it is difficult to assess the relative importance of nitrate addition over these other factors, because nitrate metabolism in dinoflagellate is mostly unknown. Filling part of this gap was the main goal of this thesis. I selected Lingulodinium polyedrum as a model for studying nitrate metabolism, because this dinoflagellate can easily be cultured in the lab and a recent transcriptomic survey has provided an almost complete gene catalogue for this species. It is also interesting that some molecular components of the nitrate pathway in this organism have been reported to be under circadian control. Thus, in this project, I used physiological, biochemical, transcriptomic and bioinformatic approaches to enrich our understanding of dinoflagellate nitrate metabolism and to increase our appreciation of the role of the circadian clock in regulating this important primary metabolic pathway. I first studied the particular case of dinoflagellate blooms that occur and persist in conditions of nitrogen depletion. This idea may seems counterintuitive, because nitrogen addition rather than depletion, is generally associated with algal blooms. However, I discovered that when nitrate was added to nitrogen-deficient or nitrogen-sufficient cultures, those that had been acclimated to nitrogen stress were able to survive for about two months at high cell densities, while non-acclimated cells died after two weeks. In conditions of severe nitrogen limitation, cells could survive a little bit more than two weeks by arresting cell division and reducing photosynthetic rates. The incapacity to synthesize new amino acids for these deprived cells in a context of on-going photosynthesis led to the accumulation of reduced carbon in the form of starch granules and lipid bodies. Interestingly, both of these carbon storage compounds were polarized in Lingulodinium cells, suggesting a functional role. The second contribution of my thesis was to identify and characterize the first nitrate transporters in dinoflagellates. I found that in contrast to plants, Lingulodinium had a reduced suite of nitrate transporters and only members of the high-affinity nitrate transporter 2 (NRT2) family were predicted to be functionally relevant in the transport of nitrate. The main transporter was constitutively expressed, which suggested that nitrate uptake in Lingulodinium was mostly a constitutive process rather than an inducible one. I also discovered that nitrate uptake in this organism was light-dependent and not a circadian-regulated process, as previously suggested. Finally, I used RNA-seq to verify if any transcripts involved in the nitrate metabolism of Lingulodinium were under circadian control. Not only did I discovered that there were no daily variations in the level of transcripts involved in nitrate metabolism, but also that there were no changes for any transcripts present in the whole transcriptome of Lingulodinium. This discovery showed that the circadian timer in this species did not require rhythmic transcription to generate biological rhythms, as observed in other eukaryotes.

Les Dinoflagellés sont des eucaryotes unicellulaires photosynthétiques qui participent à une production importante du phytoplancton et sont donc à la base de la chaîne alimentaire. Bien qu’ils soient des eucaryotes, leur organisation génétique présente plusieurs particularités qui leur sont singulières. Contrairement à tous les eucaryotes chez qui les chromosomes ne se condensent qu'au moment de la mitose, les chromosomes des dinoflagellés restent condensés pendant tout le cycle cellulaire. La mitose des dinoflagellés est distinguée de la mitose ordinaire des cellules eucaryotes. Le noyau de Lingulodinium polyedrum reste intact et son enveloppe nucléaire ne se brise pas pendant la mitose. Les microtubules devraient ainsi se coller à la membrane nucléaire du côté du cytoplasme pour tenter de s'accrocher aux chromosomes qui eux sont attachés à la surface interne de la membrane, le fuseau mitotique traverse donc le noyau par une ou plusieurs invaginations nucléaires ou canaux. Lingulodinium polyedrum est considéré un organisme modèle pour étudier les rythmes circadiens. Cette étude illustre les changements morphologiques des chromosomes durant les différents stades de la mitose, en utilisant le microscope électronique à transmission et microscope à fluorescence. Le transcriptôme de Lingulodinium polyedrum a été utilisé pour recenser les composants régulateurs conservés contrôlant l’entrée en phase S ou en phase M, telles que des cyclines ou des Cdks. Mots-clés : Lingulodinium polyedrum, dinoflagellé, cycle cellulaire, rythme circadien, mitose, phase S, phase M, cycline, CDK, transcriptome
Dinoflagellates are unicellular photosynthetic eukaryotes comprising a major part of the phytoplankton and thus, represent the foundation of the food chain. Although dinoflagellates are eukaryotes, their genetic organization has several features which are unique to them. Unlike all eukaryotes in which the chromosomes condense only at the moment of mitosis, dinoflagellates chromosomes stay condensed throughout the cell cycle. Furthermore, the mitosis of dinoflagellates is distinguished from the ordinary mitosis of eukaryotic cells. The nucleus of Lingulodinium polyedrum remains intact and its nuclear envelope does not break down during mitosis. Microtubules stick to the nuclear membrane on the side of the cytoplasm and link to the chromosomes that are attached to the inner surface of the membrane by transmembrane proteins. The mitotic spindle therefore passes through the nucleus by one or more nuclear invaginations or channels. Lingulodinium polyedrum is considered as model organism for studying circadian rhythms among which is featured the cell cycle. This study illustrates the morphological changes of chromosomes during the various stages of mitosis, by transmission electron microscope and a fluorescence microscope. The transcriptome of Lingulodinium polyedrum was used to identify conserved regulatory components controlling entry into S-phase or M phase, such as cyclins or Cdks.

Les dinoflagellés sont des eucaryotes unicellulaires que l’on retrouve autant en eau douce qu’en milieu marin. Ils sont particulièrement connus pour causer des fleurs d’algues toxiques nommées ‘marée-rouge’, ainsi que pour leur symbiose avec les coraux et pour leur importante contribution à la fixation du carbone dans les océans. Au point de vue moléculaire, ils sont aussi connus pour leur caractéristiques nucléaires uniques, car on retrouve généralement une quantité immense d’ADN dans leurs chromosomes et ceux-ci sont empaquetés et condensés sous une forme cristalline liquide au lieu de nucléosomes. Les gènes encodés par le noyau sont souvent présents en multiples copies et arrangés en tandem et aucun élément de régulation transcriptionnelle, y compris la boite TATA, n’a encore été observé. L’organisation unique de la chromatine des dinoflagellés suggère que différentes stratégies sont nécessaires pour contrôler l’expression des gènes de ces organismes. Dans cette étude, j’ai abordé ce problème en utilisant le dinoflagellé photosynthétique Lingulodinium polyedrum comme modèle. L. polyedrum est d’un intérêt particulier, car il a plusieurs rythmes circadiens (journalier). À ce jour, toutes les études sur l’expression des gènes lors des changements circadiens ont démontrées une régulation à un niveau traductionnel. Pour mes recherches, j’ai utilisé les approches transcriptomique, protéomique et phosphoprotéomique ainsi que des études biochimiques pour donner un aperçu de la mécanique de la régulation des gènes des dinoflagellés, ceci en mettant l’accent sur l’importance de la phosphorylation du système circadien de L. polyedrum. L’absence des protéines histones et des nucléosomes est une particularité des dinoflagellés. En utilisant la technologie RNA-Seq, j’ai trouvé des séquences complètes encodant des histones et des enzymes modifiant les histones. L polyedrum exprime donc des séquences conservées codantes pour les histones, mais le niveau d’expression protéique est plus faible que les limites de détection par immunodétection de type Western. Les données de séquençage RNA-Seq ont également été utilisées pour générer un transcriptome, qui est une liste des gènes exprimés par L. polyedrum. Une recherche par homologie de séquences a d’abord été effectuée pour classifier les transcrits en diverses catégories (Gene Ontology; GO). Cette analyse a révélé une faible abondance des facteurs de transcription et une surprenante prédominance, parmi ceux-ci, des séquences à domaine Cold Shock. Chez L. polyedrum, plusieurs gènes sont répétés en tandem. Un alignement des séquences obtenues par RNA-Seq avec les copies génomiques de gènes organisés en tandem a été réalisé pour examiner la présence de transcrits polycistroniques, une hypothèse formulée pour expliquer le manque d’élément promoteur dans la région intergénique de la séquence de ces gènes. Cette analyse a également démontré une très haute conservation des séquences codantes des gènes organisés en tandem. Le transcriptome a également été utilisé pour aider à l’identification de protéines après leur séquençage par spectrométrie de masse, et une fraction enrichie en phosphoprotéines a été déterminée comme particulièrement bien adapté aux approches d’analyse à haut débit. La comparaison des phosphoprotéomes provenant de deux périodes différentes de la journée a révélée qu’une grande partie des protéines pour lesquelles l’état de phosphorylation varie avec le temps est reliées aux catégories de liaison à l’ARN et de la traduction. Le transcriptome a aussi été utilisé pour définir le spectre des kinases présentes chez L. polyedrum, qui a ensuite été utilisé pour classifier les différents peptides phosphorylés qui sont potentiellement les cibles de ces kinases. Plusieurs peptides identifiés comme étant phosphorylés par la Casein Kinase 2 (CK2), une kinase connue pour être impliquée dans l’horloge circadienne des eucaryotes, proviennent de diverses protéines de liaison à l’ARN. Pour évaluer la possibilité que quelques-unes des multiples protéines à domaine Cold Shock identifiées dans le transcriptome puissent moduler l’expression des gènes de L. polyedrum, tel qu’observé chez plusieurs autres systèmes procaryotiques et eucaryotiques, la réponse des cellules à des températures froides a été examinée. Les températures froides ont permis d’induire rapidement un enkystement, condition dans laquelle ces cellules deviennent métaboliquement inactives afin de résister aux conditions environnementales défavorables. Les changements dans le profil des phosphoprotéines seraient le facteur majeur causant la formation de kystes. Les phosphosites prédits pour être phosphorylés par la CK2 sont la classe la plus fortement réduite dans les kystes, une découverte intéressante, car le rythme de la bioluminescence confirme que l’horloge a été arrêtée dans le kyste.
Dinoflagellates are unicellular eukaryotes found in both marine and freshwater environments. They are best known for causing toxic blooms called ‘red-tides’, for their symbiosis with corals, and for their important contribution to carbon fixation in the ocean. On a more molecular level, they are also known for their unique nuclear characteristics, as they generally have huge amount of DNA found in chromosomes that are permanently condensed and packaged into liquid crystalline forms instead of nucleosomes. Nuclear-encoded genes are often present in multiple copies and arranged in tandem, and no putative promoter elements including the conserved TATA box, have yet been observed. The unique organization of dinoflagellate chromatin suggests different strategies may be required to regulate gene expression in these organisms. In this study, I have started to address this problem using the photosynthetic dinoflagellate Lingulodinium polyedrum as a model. L. polyedrum is of particular interest because it shows a number of circadian (daily) rhythms. To date, all circadian changes in gene expression studied are regulated at a translational level. I have used transcriptomic, proteomic and phosphoproteomic approaches along with biochemical studies to provide insight into the gene regulatory mechanisms in dinoflagellates, with particular emphasis on the importance of phosphorylation in the L. polyedrum circadian system. The absence of histone proteins and nucleosomes is a hallmark of the dinoflagellates. Using high throughput RNA-seq technology, I found complete set of sequences encoding the core histones as well as sequences encoding histone-modifying enzymes in L. polyedrum. Thus L. polyedrum expresses conserved histone transcripts, although levels of proteins are still below what can be detected using immunoblotting studies. Using the de novo assembly algorithm the RNA-seq data was used to generate a transcriptome. This transcriptome, a list of genes expressed by L. polyedrum, has been extensively characterized. First, homology based sequence searches were used to classify the transcripts in gene ontology (GO) categories, and this analysis revealed a reduced number of transcription factor types and a surprising predominance of sequences containing a cold shock domain. Alignments of reads from the RNA–seq to genomic copies of L. polyedrum tandem repeat sequences was performed to assess the possibility of polycistronic transcripts, a hypothesis proposed to explain the lack of promoter elements in the intergenic region of the tandem repeat gene sequences. This analysis also showed a surprisingly high conservation of tandemly repeated gene sequences. The transcriptome database was also used to fuel gene identification after protein sequencing by mass spectrometry, and a purified phosphoproteome fraction was found to be particularly amenable to high throughput approaches. A comparison of the phosphoproteome at two different times of day revealed that a major class of proteins whose phosphorylation state varied over time belonged to the RNA binding and translation GO category. The transcriptome was also used to define the spectrum of kinases present in L. polyedrum, which in turn was used to classify the different phosphorylated peptides as potential kinase targets. Predicted peptides of casein kinase 2 (CK2), a kinase known to be involved in the circadian clocks of other eukaryotes, were found to include many RNA binding proteins. To assess the possibility that some of the many cold shock domain proteins identified in the transcriptome might modulate gene expression in L. polyedrum, as has been observed in many other eukaryotic and prokaryotic systems, the cellular response to cold temperatures was examined. Cold temperatures were found to induce rapid encystment, a metabolically inactive cell type whose role is to combat unfavourable environmental conditions. Changes in phosphoproteome profile were found to be the major molecular correlates to cyst formation. Predicted CK2 phosphosites are the most highly reduced class of kinase targets, a finding of interest as measurements of the bioluminescence rhythm confirmed that the clock is stopped in cysts

Les dinoflagellés sont des eucaryotes unicellulaires qui composent une grande partie du phytoplancton et qui jouent un rôle important au niveau de la photosynthèse, de la production primaire et de la conservation des écosystèmes marins. Les dinoflagellés se distinguent des autres eucaryotes par leur biologie et leur organisation nucléaire unique. Lors de la mitose, leur membrane nucléaire demeure intacte et la ségrégation des chromosomes se fait à partir de fuseaux mitotiques formés dans le cytoplasme et qui traversent le noyau au travers de canaux spécialisés Aussi, leurs chromosomes sont condensés en permanence et le processus utilisé pour y arriver est encore très mal compris puisque les dinoflagellés ne possèdent aucunes histones détectables. Lingulodinium polyedrum est un dinoflagellé photosynthétique marin utilisé comme organisme modèle en ce qui concerne l’étude des rythmes circadiens (bioluminescence, migration verticale, mitose et photosynthèse). La découverte et l’étude des éléments régulateurs du cycle cellulaire peuvent nous amener à comprendre le mécanisme, l’influence et la portée du contrôle circadien sur le cycle cellulaire. De plus, l’étude du cycle cellulaire pourrait permettre de révéler des indices quant aux caractéristiques singulières des dinoflagellés qui sont pour le moment énigmatiques. Par le passé, une étude chez Lingulodinium polyedrum a permis d’identifier la cycline impliquée dans la mitose, LpCyc1, le premier régulateur du cycle cellulaire a être découvert chez les dinoflagellés. La présente étude s’attarde sur la caractérisation de la LpCyc1, soit son expression, sa localisation, sa phosphorylation. Ces trois éléments concordent de façon à synchroniser l’activité de la LpCyc1 (et ainsi la mitose) de façon circadienne. Cette étude présente aussi la création et le développement d’un outil majeur pour l’étude future de Lingulodinium polyedrum, le transcriptome des ARNm à partir d’un iv séquençage Illumina. C’est d’ailleurs avec cet outil que nous avons découvert la CDK responsable du contrôle de la phase M, LpCdk1. Cette CDK possède tous les domaines d’une CDK classique, un site de liaison des substrats, un site de liaison à l’ATP, une boucle activatrice, et une interface de liaison avec la cycline. Le transcriptome de Lingulodinium polyedrum a aussi permis de recenser toutes les protéines conservées normalement retrouvées dans le contrôle du cycle cellulaire, qui nous a permis de faire une ébauche préliminaire du cycle cellulaire de L. polyedrum. Cette analyse est une première chez Lingulodinium polyedrum et peut s’étendre pour l’étude d’une multitude d’autres processus métaboliques.
Dinoflagellates are unicellular eukaryotes that constitute a large part of the phytoplankton. They are major contributors to the global photosynthesis and primary production and they possess an important role in conservation of marine ecosystems. Dinoflagellates are distincted from other eukaryotes by their unique biology and nuclear organization. During mitosis, their nuclear envelope stays intact and chromosome segregation is done by a mitotic spindle that passed through the nucleus inside several specialized cytoplasmic channels. In addition, the chromosomes are permanently condensed and are not thought to have histones. Lingulodinium polyedrum is a marine photosynthetic dinoflagellate widely used to study the control mechanisms of circadian rhythms, because many aspects of its physiology (bioluminescence, mitosis, photosynthesis and vertical migration) are circadian. The discovery of cell cycle regulators is essential for understanding the mechanism and the circadian control over the cell cycle. A previously study identified the M-phase cyclin, LpCyc1, the first dinoflagellate cell cycle regulator to be discovered. The present study presents the characterization of the LpCyc1, with respect to expression levels and phosphorylation patterns. These elements act together to ensure the synchronization of the LpCyc1 activity (and the mitosis) within the day. This study also presents the creation and the development of the transcriptome, a major tool for the upcoming studies of Lingulodinium polyedrum. With this tool, we identified the Lingulodinium polyedrum M-CDK, LpCdk1. The LpCdk1 has all the domains of a classic M-CDK, a substrate binding site, an ATP binding site, an activation loop and a cyclin binding interface. vi With the Lingulodinium polyedrum transcriptome, we also made a census of all the conserved proteins normally found in the cell cycle control of yeast. The identification of these proteins had provided a rough shape of L. polyedrum cell cycle. This kind of analysis is the first to be made with Lingulodinium polyedrum and could be expanded to other metabolic processes.

Les dinoflagellés sont un groupe très varié d’eucaryotes unicellulaires principalement retrouvés en milieu marin où ils ont un rôle écologique majeur dans la production primaire des océans et dans la formation des récifs coralliens. Ils sont aussi responsables de phénomènes néfastes comme les marées rouges et la production de toxines qui contaminent les crustacées et les poissons lorsque les conditions sont propices à leur multiplication rapide. Ces organismes possèdent des caractéristiques moléculaires uniques chez les eucaryotes, particulièrement en ce qui a trait au noyau. Le génome des dinoflagellés s’y retrouve condensé sous forme de cristal liquide stabilisé par des cations métalliques plutôt que sous forme de nucléosomes organisés par des histones. Cette forme condensée persiste tout au long du cycle cellulaire et limite la transcription des gènes à des boucles d’ADN qui se retrouvent à la périphérie des chromosomes. Ces caractéristiques inhabituelles, jumelées à une taille souvent imposante de leur génome, ont grandement limité l’étude des mécanismes moléculaires de base comme la régulation de la transcription. Afin de mieux caractériser ce processus chez ces organismes, le dinoflagellé Lingulodinium polyedrum, qui est étudié majoritairement pour ses multiples rythmes circadiens, a été utilisé. Tout d’abord, le séquençage à haut-débit a été utilisé afin de caractériser le transcriptome complet de l’organisme à quatre temps différents au cours d’une journée. De façon surprenante, ce séquençage a montré que très peu des transcrits varient entre les temps et que ces variations sont de faible amplitude, ce qui contraste fortement avec les résultats obtenus chez d’autres groupes d’organismes. Une inhibition pharmacologique de la transcription a aussi été effectuée et montre que les rythmes de photosynthèse et de bioluminescence continuent d’osciller de façon circadienne en absence de transcription. Ces résultats suggèrent que le modèle traditionnel de génération des rythmes circadiens par des boucles de rétroaction transcription/traduction est probablement absent chez Lingulodinium. La deuxième approche consiste en la caractérisation de deux protéines à domaine cold-shock (CSD), un domaine d’origine bactérienne qui est fortement surreprésenté chez les dinoflagellés et annoté comme potentiel facteur de transcription. Ces deux protéines ont une préférence pour la liaison de l’ADN simple brin versus l’ADN double brin tout en étant ii capable de lier de l’ARN. Par ailleurs, ces liaisons aux acides nucléiques ne sont pas spécifiques à une séquence particulière. L’analyse de leur abondance après un passage prolongé en condition froide n’a pas permis de déceler une augmentation importante de l’abondance des deux protéines et celles-ci sont également incapable de complémenter un quadruple mutant des protéines cold-shock chez E. coli. Ces données suggèrent que les CSDs des dinoflagellés ne sont probablement pas des facteurs de transcription séquence-spécifique et qu’ils ont également une fonction différente des protéines bactériennes. La troisième approche consiste en la réticulation in vivo des protéines interagissant avec la chromatine. Après réticulation, la chromatine a été purifiée et les protéines associées à ceux-ci ont été extraites et identifiées par spectrométrie de masse. Parmi les protéines identifiées, il y a un nombre réduit de protéines de liaison à l’ADN en comparaison avec des données similaires chez les animaux. Des peptides provenant d’une histone H4 ont aussi été identifiés, ce qui consiste en une des premières identifications de ce type de protéine chez les dinoflagellés. Plusieurs protéines de liaison à l’ARN ont été identifiées et pourraient permettre de réguler diverses étapes de la biologie des ARNm et ainsi moduler la traduction. Quelques protéines reliées au contrôle du cycle cellulaire et à la réparation de l’ADN ont aussi été identifiées. Mises ensemble, ces trois approches permettent de suggérer que la régulation de la transcription et de l’abondance des ARNm semblent avoir une importance moindre chez les dinoflagellés que chez les autres eucaryotes.
Dinoflagellates are a diverse group of unicellular eukaryotes found in marine habitat where they have a major role in the primary production of the ocean and in the formation of coral reefs. They are also responsible for some of the harmful algal blooms whose toxin production can contaminate crustacean and fish. Dinoflagellates possess unique molecular characteristics in eukaryotes, especially for their nucleus. For example, their genome is found in a permanently condensed liquid crystalline state stabilized by metallic cations instead of the nucleosome organized by histones. This condensed form persists throughout the cell cycle and limits transcription to DNA loops localized at the periphery of the chromosomes. These unusual characteristics, coupled with a generally large genome size, have greatly limited the study of basic molecular mechanisms such as transcription regulation. In order to better characterize this process for the dinoflagellates, I used Lingulodinium polyedrum, a dinoflagellate studied extensively for its circadian rhythms. As a first approach, high-throughput sequencing was used to characterize the complete transcriptome of the organism at four different times throughout the day. Surprisingly, this sequencing revealed that an extremely low number of transcripts vary in abundance between time points and that those variations are of low amplitude, a result in stark contrast with what has been observed in other organisms. A pharmacological inhibition of transcription was also done and shows that bioluminescence and photosynthesis rhythms persist in absence of transcription, suggesting that the classical transcription/translation feedback loop used to generate rhythmic timing in eukaryotes is probably absent in Lingulodinium. The second approach was the characterization of two proteins with a cold-shock domain (CSD), a type of domain strongly overrepresented in dinoflagellates and predicted to be a potential transcription factor. Those two proteins showed a preferential binding to single stranded DNA versus double stranded DNA while also being able to bind RNA, and were not specific to a particular sequence. Protein abundance analysis after a prolonged cold shock did not yield a massive increase in the abundance of those two proteins, as seen in E. coli. Furthermore, neither protein was able to complement a quadruple cold shock protein (CSP) mutant in E. coli. Data gathered here suggest that CSD proteins in dinoflagellates are probably iv not sequence-specific transcription factors and may also have a function different from bacterial CSP. The third approach consisted of the in vivo cross-linking of chromatin-interacting proteins. After cross-linking, the chromatin was purified and the proteins associated with it extracted and identified by mass spectrometry. Of the identified proteins, few DNA binding proteins were found, unlike similar studies done in animals. Peptides derived from a histone H4 were discovered, one of the first instances of histone identification in dinoflagellates. Multiple proteins able to bind RNA have been identified and could be used to regulate multiple steps of RNA biology and therefore modulate RNA translation. Some proteins related to cell cycle control and DNA repair were also identified. Taken together, these three approaches support the view that the transcriptional regulation and control over mRNAs abundance seem to have a lower importance in dinoflagellate than in other eukaryotes.

Les dinoflagellés jouent un rôle très important dans l’écologie des océans en y réalisant une grande partie de la production primaire, en formant une association symbiotique avec les coraux et en ayant la capacité de produire des fleurs d’algues potentiellement toxiques pour les communautés côtières humaines et animales. Malgré tout, la biologie moléculaire des dinoflagellés n’a que très peu été étudiée dans les dernières années, les connaissances de processus de base comme la régulation de la transcription y étant fortement limitées. Une tentative pour élucider ce mécanisme a été réalisée chez les dinoflagellés photosynthétiques Lingulodinium polyedrum et Amphidinium carterae. Une expérience d’induction de la transcription du gène de la Peridinin chlorophyll-a binding protein, le complexe majeur de collecte de lumière, a été réalisée par une baisse de l’intensité lumineuse et a montré une faible augmentation (moins de 2 fois) du transcrit à court et long terme. Des expériences de simple-hybride et de retard sur gel (EMSA) ont été faits pour identifier de potentielles interactions protéine-ADN dans la région intergénique du gène PCP organisé en tandem. Ces essais ont été infructueux pour identifier de telles protéines. Une analyse du transcriptome de L. polyedrum a été effectuée, montrant une importante sous-représentation de domaines de liaison à l’ADN classique (comme Heat-shock factor, bZIP ou Myb) et une surreprésentation du domaine d’origine bactérienne Cold shock en comparaison avec d’autres eucaryotes unicellulaires. Ce travail suggère que les mécanismes de régulation transcriptionnelle des dinoflagellés pourraient différer substantiellement de ceux des autres eucaryotes.
Dinoflagellates are an important part of the ocean’s ecology due to their large contribution to global carbon fixation, the symbiotic association they can make with corals and by their ability to form algal blooms potentially toxic for humans and animals in coastal communities. However, the molecular biology of dinoflagellates has been poorly studied in the past. Basic knowledge, such as regulation of gene expression, is severely limited. An attempt at deciphering basic gene regulation has been undertaken in the photosynthetic dinoflagellate Lingulodinium polyedrum and Amphidinium carterae using a reduction in available light intensity to induce the expression of the peridinin chlorophyll-a binding gene encoding the major light harvesting complex protein. A small increase in transcript abundance (less than 2 fold) was found in both short and long term experiments, yet neither yeast one-hybrid assays nor electrophoretic mobility shift assays (EMSA) showed any potential protein interactions with sequence derived from the intergenic spacer of the PCP tandem gene array. Interestingly, an analysis of the recently sequenced L. polyedrum transcriptome revealed an important under-representation of classic DNA-binding domains (such has Heat-shock factor, bZIP and Myb) and an over-representation of the bacterial cold-shock DNA-binding domain. This suggested that components of the transcription regulation machinery may be at least partially different in dinoflagellates.