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Dissertations / Theses on the topic 'Les dommages à l'ADN'
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Cavelier, Cindy. "Etude du point de contrôle des dommages à l'ADN." Toulouse 3, 2010. http://thesesups.ups-tlse.fr/889/.
Full textAbstract:
Les Leucémies Aiguës Myéloïdes (LAM) représentent un groupe hétérogène de pathologies développées aux dépend des progéniteurs myéloïdes immatures normaux, caractérisées sur le plan moléculaire par des modifications de l'expression de facteurs transcriptionnels aboutissant à un blocage de la maturation, et par une activation aberrante de molécules de la transduction du signal conférant aux cellules leucémiques des avantages prolifératifs et de survie. Dans ce travail, nous avons montré que la protéine kinase CHK1, impliquée dans le maintien de l'intégrité du génome en contrôlant l'arrêt du cycle cellulaire à la transition G1/S et G2/M après dommages constitutifs à l'ADN, prolonge son activation après dommages dans les cellules de LAM immatures permettant ainsi leur maintien en phase G2. Cette meilleure efficacité du point de contrôle G2/M des cellules immatures contribue très probablement à la chimiorésistance naturelle observée et largement documentée des cellules leucémiques immatures. De plus, nous montrons que la kinase CHK1 est anormalement activée dans les échantillons de LAM en raison de la présence de dommages à l'ADN constitutifs dans ces cellules. L'étude des caractéristiques cytogénétiques des patients nous a permis de mettre en évidence un haut niveau de dommages dans les LAM de haut risque cytogénétique, en particulier celles avec des cellules à caryotype complexe. L'inactivation de CHK1 par l'inhibiteur UCN-01 et par interférence à l'ARN aboutit à une inhibition des capacités clonogènes des progéniteurs leucémiques et à une chimiosensibilisation vis-à-vis de l'agent chimiothérapeutique ara-C. En revanche, les cellules hématopoïétiques normales CD34+, qui ne présentent pas de dommages constitutifs, sont beaucoup moins sensibles à l'UCN-01. Cet agent n'affecte pas non plus les capacités clonogènes des progéniteurs granulo-monocytaires normaux aux doses utilisées sur les cellules de LAM. Ces résultats nous ont permis de montrer que la kinase CHK1 joue un rôle important à la fois dans la chimiorésistance des cellules leucémiques immatures et dans l'établissement de l'instabilité génétique observée dans les LAM à caryotype complexe. Enfin, ces travaux ouvrent des perspectives intéressantes sur l'utilisation de composés inhibiteurs des kinases du point de contrôle du cycle cellulaire dans les LAM et en particulier celles présentant le plus mauvais pronostic, les LAM à caryotype complexeAcute Myeloid Leukemia (AML) is a clonal hematopoietic disorder characterized by the accumulation of malignant hematopoietic progenitor cells with an impaired myeloid differentiation program. The molecular basis of AML is thought to be associated with the acquisition of at least two types of critical cooperating mutations occurring at the hematopoietic stem or committed progenitors level. Class I mutations, affecting tyrosine kinases receptors and key components of cellular signalling pathways, confer growth and proliferative advantages. They are associated with class II mutations, affecting transcription factors thus leading to impaired normal differentiation program. In this study, we were first interested in CHK1, a protein kinase involved in preserving genome integrity by playing a critical role at the intra-S and G2/M cell cycle checkpoint activated in DNA damage response. We have shown that activation of CHK1 was sustained in immature cell lines, leading to a more stringent G2/M checkpoint in response to DNA damage, thus impairing illegitimate entry into mitosis in presence of unrepaired DNA damage and participating in their resistance to genotoxic agents. In a second study, we have demonstrated an abnormal activation of the CHK1 kinase in a large panel of AML patient samples, associated with the presence of constitutive DNA damage in absence of genotoxic stress. Moreover, the level of CHK1 activation is significantly correlated with unfavourable cytogenetic samples, particularly with complex karyotype phenotype. CHK1 inhibition by the pharmacological inhibitor UCN-01 or by RNA interference was found to decrease the clonogenic capacity of the AML progenitors, and to induce a chemosensitisation to ara-C. In contrast, growth of normal hematopoietic progenitors, which do not display constitutive DNA damage, was not impaired by such treatment. Overall, all these results underline the dual role of CHK1 kinase in AML pathology in the chemoresistance of immature leukemic cells and in the establishment of the genomic instability observed in complex karyotype AML. These findings could have major pharmacologic consequences, because they open a therapeutic window for new compounds targeting the cell cycle checkpoint machinery in AML and more particularly in the worst prognostic group with complex karyotype
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Kumbhar, Ramhari. "Mécanismes d'ubiquitylation dans la réponse aux dommages de l'ADN." Thesis, Montpellier, 2016. http://www.theses.fr/2016MONT3509.
Full textAbstract:
L’ubiquitylation est une modification post-transcriptionelle qui est nécessaire pour la dégradation des protéines mais aussi pour la régulation et la localisation de nombreux facteurs. Un grand nombre de protéines impliquées dans la réplication de l’ADN et dans la réponse aux lésions de l’ADN sont ubiquitylées. L’ubiquitylation durant la réponse aux dommages de l’ADN dépend de l’enzyme d’activation de l’ubiquitine UBA1 qui est située au sommet de la cascade d’ubiquitination. Durant ma thèse, j’ai mis à jour le mécanisme de recrutement d’UBA1 au niveau de l’ADN endommagé ainsi qu’un rôle majeur de l’ubiquitylation dans la voie de signalisation ATR.A l’aide d’une approche in vitro qui mime la voie de signalisation ATR, j’ai montré qu’UBA1 est recrutée au niveau de molécules d’ADN linéaire et qu’elle est nécessaire à l’ubiquitylation des protéines recrutées sur ce substrat. J’ai également découvert que l’ubiquitylation et le recrutement d’UBA1 in vitro sont dépendants de la kinase DNA-PKcs et de la poly(ADP-ribose) polymérase PARP1, deux senseurs majeurs des lésions de l’ADN. Il apparait que PARP1 régule le recrutement d’UBA1 via la formation de chaines de poly(ADP)-ribose (PAR). De plus, j’ai montré qu’UBA1 est capable de se lier aux chaines PAR. J’ai identifié la région d’UBA1 capable d’interagir avec les chaines PAR : il apparait que cette région est désorganisée et riche en acide aminés hydrophobes. La comparaison de la protéine UBA1 de levure et la protéine UBA6 humaine qui ne lient pas PAR nous a permis d’identifier les acides aminées hydrophobes nécessaires pour la lésion à PAR.J’ai aussi démontré qu’UBA1 est nécessaire pour la réponse aux lésions de l’ADN. En effet, l’inhibition ou la déplétion d’UBA1 conduit à une perte de la phosphorylation de Chk1 dans notre système in vitro. De même, le traitement avec des molécules induisant des lésions de l’ADN telles que le CPT, le MMS et la bléocine conduit à une phosphorylation moindre de Chk1 lorsqu’UBA1 est inhibée. Afin de démontrer que la liaison d’UBA1 aux chaines PAR est cruciale pour la réponse aux dommages, j’ai mis en place un système in vivo permettant d’exprimer des mutants d’UBA1 incapable de lier les chaines PAR.Globalement mes résultats indiquent qu’UBA1 est recrutée au niveau de l’ADN endommagé à l’aide de PARP1 et DNA-PKcs. Plus précisément, il apparait que la liaison avec les chaines PAR et l’ubiquitylation de protéines spécifiques est nécessaire pour la mise en place de la voie de signalisation ATR. L’importance d’UBA1 dans le processus est soulignée par le fait que son inhibition ou son inactivation conduit à une phosphorylation moindre de Chk1. Il est raisonnable de penser que des inhibiteurs d’UBA1 puissent être utilisés pour cibler la voie ATR dans les cellules cancéreuses. Finalement, cette étude devrait permettre de mieux comprendre comment les interactions entre les processus d’ubiquitylation et de PARylation permettent de réguler la réponse aux dommagesUbiquitylation is an important posttranslational modification that is necessary for protein degradation as well as for the regulation and the localization of many cellular factors. A number of proteins implicated in DNA replication and DNA damage response are ubiquitylated. Ubiquitylation during the DNA damage response is selectively dependent on the ubiquitin-activating enzyme UBA1, which functions at the apex of the ubiquitylation cascade. In this thesis, I describe the mechanism of UBA1 recruited at damaged sites and uncover the role of ubiquitylation in ATR signaling.Using a cell free system developed in the lab that recapitulates ATR kinase-signaling pathway, I present evidence that, UBA1 is recruited to linear DNA substrates and mediate ubiquitylation of DNA-bound proteins. I found that protein ubiquitylation and the recruitment of UBA1 to DNA in cell-free extracts was dependent on the kinase DNA-PKcs and on the poly ADP-ribose polymerase PARP1, two sensors of DNA lesions. PARP1 regulates UBA1 recruitment in large part through poly (ADP)-ribose (PAR) chain formation. UBA1 exhibited affinity for PARP1 and for PAR chains. Furthermore, we have identified minimal region on UBA1 which is prominently hydrophobic and disordered region of UBA1 which are required for its PAR binding activity. Through comparison with yeast UBA1 and human UBA6 which failed to bind with PAR chains, we identified hydrophobic amino acid residues which are critical for PAR binding.I also show evidence that UBA1 is required for efficient DNA damage signaling. In a cell free system, chemical inhibition or siRNA depletion of UBA1 led to the loss of ChK1 phosphorylation, suggesting that UBA1 activity is required for efficient DNA damage response. Consistent with these observations, when cells were treated with DNA lesion inducing drugs like CPT, MMS and Bleocin, we observed less efficient Chk1 phosphorylation. I have developed UBA1 replacement system to demonstrate functional significance of mutation in PAR binding residues of UBA in DNA damage response.Collectively, these results indicate that UBA1 is recruited to DNA damaged sites in a DNA-PKcs and PARP1 dependent-manner, in a larger part through its interaction with PAR chains and that protein ubiquitylation on DNA damages is necessary for the assembly of a productive ATR signaling complex. The importance of role of UBA1 in DNA damage response is underscored by the finding that UBA1 inhibition leads to inefficient Chk1 phosphorylation which is required for efficient DNA damage response. Thus, UBA1 inhibitors could be used to target ATR signaling in cancer cells. This study should eventually lead us to provide more insights on how cell maintains genome integrity through crosstalk between posttranslational modifications including ubiquitylation and PARylation
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Dernoncourt, Emma. "SAF-A - hnRNP U : une protéine à l'interface du métabolisme de l'ARN et des dommages à l'ADN." Toulouse 3, 2013. http://www.theses.fr/2013TOU30246.
Full textAbstract:
Des connexions entre la réponse aux dommages à l'ADN et le métabolisme de l'ARN ont récemment été mises en évidence. Mon équipe a identifié une protéine de liaison à l'ARN, SAF-A/hnRNP U, comme un substrat de la DNA-PK, kinase clé de la réparation des cassures double-brin de l'ADN. J'ai étudié l'implication de SAF-A dans la réponse aux dommages de l'ADN. Après micro-irradiation laser, SAF-A-GFP est recrutée transitoirement sur le site de dommage avant d'en être exclue. Ces deux phases sont indépendantes. Le recrutement de SAF-A dépend de PARP, tandis que son exclusion dépend d'ATM, d'ATR et de la DNA-PK. Le domaine de liaison à l'ARN de SAF-A reproduit la dynamique de SAF-A. Ce domaine interagit majoritairement avec des protéines de liaison à l'ARN, dont FUS et TAF15, qui présentent une dynamique similaire. L'inhibition de la transcription abolit la phase d'exclusion de SAF-A, suggérant que l'exclusion concerne la fraction de SAF-A engagée dans la transcription. Des conditions anormales de transcription conduisent à la formation d'hybrides ARN:ADN (R-loop). Pour les détecter, nous avons construit une lignée cellulaire exprimant une RNAseHI fusionnée à la mCherry et inactive (RmC), mais qui peut se lier aux R-loops. Après micro-irradiation laser, la RmC est recrutée sur l'ADN endommagé. Lorsque l'exclusion de SAF-A est bloquée, le recrutement de la RmC est prolongé. La surexpression de la RNAseHI mutée compromet la survie cellulaire après irradiation aux rayons X. Ces résultats mettent en évidence l'exclusion des protéines de liaison à l'ARN comme la conséquence d'un mécanisme de résolution des R-loops se formant suite aux dommages de l'ADN dans les régions transcritesAn expanding aspect of the DNA Damage Response (DDR) is its connexion with RNA metabolism. My team has identified the RNA-binding protein SAF-A/hnRNP U as a substrate for DNA-PK, the key kinase in DNA double-strand breaks repair. I have investigated SAF-A involvement in the DDR. After laser microirradiation, SAF-A-GFP dynamics exhibited a two phases profile with a first transient recruitment in the damaged nuclear area followed by a prolonged exclusion. The two phases were uncoupled. SAF-A recruitment was PARP-dependent, while its exclusion relied on ATM, ATR and DNA-PK. SAF-A RNA-binding domain recapitulated SAF-A dynamics after DNA damage. Mass-spectrometry analysis using this domain as a bait identified mostly RNA-binding partners, at least two of them (FUS and TAF15) exhibited similar dynamics. Upon transcription inhibition, SAF-A exclusion was abolished, supporting that it concerns the pool of SAF-A engaged in RNA metabolism. Given that abnormal transcription conditions have been shown to promote RNA:DNA hybrids formation (R-loop), we constructed a cell line expressing a catalytically inactive mCherry-tagged RNAseHI (RmC), which retains its ability to bind R-loop. RmC recruitment to the laser damage site was abolished upon transcription inhibition. When SAF-A exclusion was blocked, RmC exhibited a prolonged recruitment, supporting that SAF-A release is a readout of R-loops resolution post-DNA damage. Finally, overexpressing this mutated RNAseHI negatively impacted cell survival after X-ray irradiation. These results uncover an anti-R-loop mechanism at DNA damage sites in transcribed areas testified by the post-damage exclusion of RNA-binding proteins from these sites
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Sattler, Ulrike. "Analyse des dommages oxydatifs de l'ADN et de leurs effets biologiques." Toulouse 3, 2002. http://www.theses.fr/2002TOU30052.
Full text
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Tyteca, Sandrine. "Rôle de l'histone acétyltransférase Tip60 dans la réponse aux dommages à l'ADN." Toulouse 3, 2008. http://thesesups.ups-tlse.fr/276/.
Full textAbstract:
Tip60 est une histone acétyltransférase qui agit sous forme d'un complexe multiprotéique dans la cellule : le complexe Tip60. Elle est impliquée dans de nombreux processus cellulaires comme la prolifération, l'apoptose et la réponse aux dommages à l'ADN. Concernant ce dernier aspect, nous avons tout d'abord montré l'implication de Tip60 dans la voie du suppresseur de tumeur p53 en réponse aux dommages à l'ADN. Puis, nous avons mis en évidence que Tip60 est requise pour l'apoptose et l'arrêt du cycle cellulaire en réponse aux UV, tout en révélant un antagonisme fonctionnel entre Tip60 et p400, une autre sous-unité du complexe Tip60. Enfin, nous avons récemment découvert l'implication de Tip60 dans la recombinaison homologue, une voie de réparation des cassures double-brin. Nous montrons également une interaction entre Tip60 et le complexe MRN, impliqué dans la reconnaissance des lésions. Nos résultats suggèrent que le complexe Tip60/MRN puisse être le complexe responsable de l'activation de la kinase ATM en réponse aux cassures double-brin. L'ensemble de ces travaux ont largement contribué à montrer l'importance cruciale de Tip60 à de multiples niveaux de la réponse aux dommages à l'ADN : signalisation, réparation, arrêt du cycle cellulaire et apoptoseTip60 is a histone acetyltransferase acting as as a multimolecular complex in the cell : the so-called Tip60 complex. It is involved in several cellular processes such as proliferation, apoptosis and DNA damage response. As far as the latter aspect is concerned, we showed that Tip60 is involved in the p53 tumour suppressor pathway in response to DNA damage. Then we showed that Tip60 is required for apoptosis and cell cycle arrest in response to UV irradiation, and revealed a functional antagonism between Tip60 and p400, another subunit of the Tip60 complex. We also recently discovered that Tip60 is involved in homology-driven double-strand break repair. We showed an interaction between Tip60 and the MRN complex which allows the recognition of double-strand breaks in DNA. Our results suggest that the Tip60/MRN complex could be the one responsible for the ATM kinase activation in response to double-strand breaks. Altogether, our results contributed to show the crucial role of Tip60 at multiple levels of the DNA damage response : damage signaling, DNA repair, cell cycle arrest and apoptosis
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Dextraze, Marie-Eve. "Radiosensibilisation de l'ADN par le 5-bromodéoxyuridine l'importance de la structure et de la séquence de l'ADN." Thèse, Université de Sherbrooke, 2010. http://savoirs.usherbrooke.ca/handle/11143/4313.
Full textAbstract:
Les dimères interbrins sont des lésions de type complexe, où les deux brins d'ADN sont pontés de façon covalente. Par conséquent, ce type de lésion est très toxique pour la cellule, car il nuit à la séparation des brins d'ADN nécessaire à des processus cruciaux pour la cellule, comme la réplication et la transcription. De plus, des expériences récentes montrent que la réparation des dimères interbrins passe par la formation d'un bris double brin, une autre lésion avec un potentiel toxique élevé. Ce n'est que tout récemment qu'on a montré que la radiation ionisante menait à la formation de dimères interbrins dans l'ADN cellulaire. On en sait donc encore très peu sur les conditions dans lesquelles se produisent les dimères et comment ils sont réparés. Récemment, à la suite d'une exposition aux radiations ionisantes, notre groupe a mis en évidence la formation de dimères interbrins dans un ADN où une thymidine avait été remplacée par le 5-bromo-2'-désoxyuridine (BrdU). Ces dimères n'étaient formés que lorsque le BrdU se trouvait au centre d'une zone mésappariée. Puisque c'était la première fois que ce type de dommage était observé lors d'une exposition de l'ADN bromé à la radiation ionisante, ma thèse a porté sur l'exploration de la formation du dimère interbrin, particulièrement sur les conditions qui favorisaient sa formation.Les trois articles présentés dans cette thèse montrent que la forme de l'ADN (forme A vs forme B), la séquence, ainsi que le type de radiation employé ont une influence importante sur le type et la fréquence du dommage produit. Ces résultats montrent qu'on en sait encore très peu sur le mécanisme réel de radiosensibilisation de l'ADN bromé dans les cellules. Cependant, ils mettent aussi en évidence la réactivité distincte des régions rnésappariées de l'ADN, ainsi que leur fort potentiel pour la formation de dimères. Or, ces régions mésappariées ne représentent qu'une fraction des structures secondaires et tertiaires de l'ADN présentes dans la cellule.
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Lahaie, Pierre-Olivier. "Nouvelle méthode expérimentale pour mesurer les dommages à l'ADN induits par la radiation." Mémoire, Université de Sherbrooke, 2015. http://hdl.handle.net/11143/7527.
Full textAbstract:
Résumé : Lors de l’utilisation de la radiation pour le diagnostic et le traitement du cancer, l’ADN est une cible importante due à son rôle dans la division cellulaire. La radiation y dépose de l’énergie par production abondante (10[indice supérieur 5] e[indice supérieur −]/MeV) d’électrons de basse énergie (EBE) (<50 eV) menant à la production de radicaux et à la dissociation de molécules. Une meilleure compréhension de ces phénomènes physico-chimiques mènera au développement de nouvelles stratégies en radioprotection et en radiothérapie. Il est primordial d’identifier et de quantifier ces dommages initiaux. Suite à des résultats obtenus par des expériences récentes (Li et al., 2010) sur des couches minces d’ADN irradiées par des EBE dans le vide, nous suggérons que certains produits désorbent en quantité significative. Nous proposons une méthode pour mesurer cette perte de matière en utilisant une balance à quartz pour mesurer in situ les changements de masse totale. Ce mémoire présentera la conception et la construction de l’appareil ainsi que les résultats d’irradiation de la thymine et de la thymidine. À 25 ◦ C, le taux de perte de masse spontanée des échantillons joue un rôle important pour les petites molécules comme la thymine (126 uma). L’irradiation augmente d’abord ce taux qui diminue d’un facteur 5 à 15 après une exposition prolongée, signe de modifications notables de l’échantillon. Pour des molécules plus imposantes comme la thymidine (242 uma), il n’y a pas de désorption spontanée et le taux de désorption induite par des électrons de 50 eV est de 0,4 ± 0,1 uma/e[indice supérieur -]. Cette méthode, nécessaire à la calibration d’autres expériences réalisées par HPLC et spectrométrie de masse, permet de compléter la quantificationdes fragments, qui peuvent aussi être l’origine de lésions subséquentes.Abstract : DNA is the principle target of radiotherapy (RT) due to its crucial role in cellular growth and function. Ionizing radiation (IR) delivers its energy into the cell and its nucleus via sequential ionization events that produce many low-energy electrons (LEE)(10[superscript 5]e[superscript −] per MeV) which drive subsequent molecular dissociations and the formation of radicals and other reactive species. Since a better understanding of these mechanisms is needed to develop new strategies for radioprotection and RT, it is essential to identify and to quantify the initial damage induced by IR. Recent chromatographic (HPLC) analysis of short oligonucleotide irradiated with LEE in vacuo (Li et al., 2010) revealed that only ∼30 % of the loss of intact molecules could be explained by the formation of identifiable radiation products. We hypothesize that electron stimulated desorption (ESD) may account for some of the unexplained loss of the missing molecules. Here we propose a new experimental method to quantify this loss using a quartz crystal microbalance to measure in situ the total mass change due to ESD. This thesis describes the design and the construction of the novel apparatus and presents results for LEE irradiated thymine (thy) and thymidine (dT). We find that at 25 ◦ C, the thermal-induced mass loss is important for small molecules such as thy (126 amu). Upon irradiation at 50 eV, the rate of mass loss initially increases, but then decreased by factors between 5 and 15 indicating structural changes occurring at the sample surface. For larger molecules such as dT (242 amu), there is no thermal evaporation at 25 ◦ C and the LEE induced rate of desorption at 50 eV is 0.4 ± 0.1 amu/e[superscript -]. This work is needed to calibrate HPLC and mass spectrometry experiments allowing us to quantify the fragment species produced by LEE that are expected to induce further and biologically significant damage.
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Silerme, Stéphanie. "Etude des dommages de l'ADN impliquant des pontages ADN-protéines et ADN-polyamines." Thesis, Grenoble, 2014. http://www.theses.fr/2014GRENV050/document.
Full textAbstract:
Un pontage ADN-protéine se forme lorsqu'une protéine se lie de façon covalente à l'ADN, ce qui a pour conséquence de bloquer certains processus biologiques tels que la réplication, la transcription, la réparation ou la recombinaison. Ces travaux de thèse consistent en l'étude des pontages se produisant lors d'une oxydation à un électron de l'ADN. La guanine possède le potentiel d'ionisation le plus bas parmi les composants de l'ADN; elle est donc facilement oxydée pour former un radical cation, lui-même impliqué dans la formation de nombreuses lésions oxydatives. Des travaux antérieurs ont permis de mettre en évidence la formation d'un adduit entre la guanine et la lysine, résultant de l'oxydation à un électron d'un oligonucléotide TGT en présence d'un peptide trilysine. Le mécanisme de cette réaction est une addition nucléophile de l'acide aminé central par le groupement amine ε, en position C8 du radical cation de la guanine. L'objectif de cette thèse a été de caractériser l'adduit guanine-lysine, de le quantifier dans l'ADN isolé puis dans l'ADN cellulaire, et d'étudier son implication dans la formation des pontages ADN-protéines. Différentes espèces nucléophiles sont capables de s'additionner sur le radical cation de la guanine. Nous nous sommes intéressés au cas des polyamines endogènes, qui sont des cations organiques présents en particulier dans le noyau des cellules. Ces molécules interviennent dans la stabilisation et la condensation de l'ADN, mais elles participent également à de nombreux processus cellulaires. Le lien entre polyamines et cancer a été largement décrit. Cependant le mécanisme par lequel la perturbation de leur métabolisme est impliquée dans le processus cancérogenèse reste à ce jour peu connu.Dans un premier temps, ces lésions ont été synthétisées chimiquement, sous la forme de nucléosides modifiés, afin de les caractériser. Par la suite des méthodes de quantification de ces dommages par chromatographie liquide haute performance couplée à la spectrométrie de masse en tandem ont été développées. Ces méthodes analytiques nous ont permis de démontrer que les adduits guanine-lysine et guanine-polyamines pouvaient se former dans l'ADN isolé suite à une oxydation à un électron. Des pontages entre guanine et lysine ont été mis en évidence dans l'ADN extrait de cellules THP1 irradiées par impulsions laser à 266 nm. Nous avons ensuite développé différents modèles de pontages entre un peptide et un oligonucléotide, afin d'étudier la structure chimique du pontage, et de déterminer si celui-ci pouvait se produire entre la guanine et la lysine. Des adduits guanine-polyamines ont également été détectés dans de l'ADN extrait de spermatozoïdes. Ces résultats ouvrent de nouvelles perspectives dans la compréhension du rôle physiologique des polyamines ainsi que de leur implication dans la fertilité masculineA DNA-protein crosslink (DPC) occurs when a protein becomes covalently bound to DNA. This kind of lesions seems to affect several metabolic processes, including DNA replication, transcription, repair and recombination. This PhD work deals with crosslinks which are formed through a one-electron oxidation of DNA. Guanine exhibits the lowest ionization potential among DNA components, therefore it is readily oxidized leading to the formation of a radical cation, which is involved in the formation of numerous oxidative DNA lesions. In a previous study, a crosslink between guanine moiety and a lysine residue, generated subsequently to a one electron oxidation of a TGT oligonucleotide in the presence of a trilysine peptide, has been described. The mechanism of formation of this adduct relies on the nucleophylic addition of the ε amino group of lysine onto the C8 position of the guanine radical cation. The aim of the present work was to characterize the guanine-lysine adduct and to quantify this lesion in isolated DNA and then in cellular DNA, and to investigate their implication in DNA-protein crosslinks. Several nucleophylic species are able to react with the guanine radical cation. We focused on polyamines, which are organic cations localized in the nucleus of cells at millimolar concentration ranges. These molecules are involved in stabilization and condensation of DNA, and participate also in numerous cellular processes. The relation between polyamine and cancer has been widely described. The mechanism by which dysregulation in their metabolism is related to carcinogenesis is still unknown.In the first part of this project, we focused on the synthesis and the characterization of these lesions as modified nucleosides. Subsequently, we have developed and optimized methods of quantification of these damages, using HPLC coupled with tandem mass spectrometry. Thanks to these analytical methods, we have demonstrated that guanine-lysine and guanine-polyamines adducts could be formed in isolated DNA following a one electron oxidation. Crosslinks between guanine and lysine have been highlighted in DNA extracted from THP1 cells exposed to laser pulses at 266 nm. We have then developed several crosslinks models between a peptide and an oligonucleotide, in order to investigate the chemical structure of the crosslink and determine whether it could occur between guanine and lysine. Guanine-polyamines adducts have also been detected in DNA extracted from sperm cells. These results open new prospects in the understanding of the physiological role of polyamines as well as their involvement in male fertility
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Jobin-Robitaille, Olivier. "Dynamique chromatinienne dans la réparation de l'ADN : analyse fonctionnelle du complexe histone acétyltransférase NuA4 dans la réparation des dommages à l'ADN." Thesis, Université Laval, 2005. http://www.theses.ulaval.ca/2005/22935/22935.pdf.
Full textAbstract:
La cellule dispose de plusieurs mécanismes de réparation, nécessitant tous l'accès à l'ADN, afin de prévenir les perturbations occasionnées par l'instabilité génomique. La structure des chromosomes eucaryotes (chromatine) forme une barrière physique empêchant l'accessibilité à l'ADN et ainsi les processus biologiques nucléaires tels la transcription, réplication, recombinaison et réparation des dommages de l'ADN. Dans ce dernier processus clé, certaines activités reconfigurant la chromatine pourraient donc s’avérer essentiels en facilitant l’accès à la machinerie de réparation. Nous avons démontré le recrutement spécifique du complexe histone acétyltransférase NuA4 par immunoprécipitation de chromatine à une cassure double brin de l’ADN, le type de dommage le plus dangereux pour la cellule. Des cinétiques ont permis de déterminer à quel moment NuA4 apparaît au site de cassure en relation avec les modifications de la chromatine environnante et de vérifier l’apparition subséquente de complexes de remodelage ATP dépendant. En parallèle, de nouveaux sites de phosphorylation d’histones qui pourraient être impliqués dans la réparation de dommages sur l’ADN ont été investigués. En conclusion, nos travaux permettent de lier fonctionnellement des complexes de modification/reconfiguration de la chromatine avec le processus de réparation de dommages à l’ADN.Inscrit au Tableau d'honneur de la Faculté des études supérieures
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Bezine, Elisabeth. "Analyse des dommages à l'ADN induits par la toxine CDT et de leur réparation." Thesis, Toulouse, INPT, 2015. http://www.theses.fr/2015INPT0142/document.
Full textAbstract:
La Cytolethal Distending Toxin (CDT) est un facteur de virulence produit par de nombreuses bactéries pathogènes Gram négatives. Sa production est associée à différentes pathologies, dont le développement de cancers. Un lien de causalité a été établi entre dommages à l’ADN, mutagénèse et cancérogenèse. Or, différentes études ont classé CDT dans la famille des génotoxines bactériennes. L’action génotoxique de CDT repose sur l’activité de sa sous-unité catalytique CdtB, connue pour induire des cassures double-brin (CDBs) de l’ADN génomique eucaryote. Cependant, des travaux de l’équipe ont montré qu’à des doses 1000 fois plus faibles que celles utilisées dans la littérature, CDT induit des dommages primaires (probablement de type cassure simple-brin), qui dégénèrent en CDB lors de la phase S. Afin de mieux documenter ce modèle, nous avons étudié ici les systèmes de réparation impliqués dans la réponse aux dommages à l’ADN induits par CDT. Nous avons ainsi confirmé l’importance des voies de réparations des CDBs (Homologous Recombinaison et Non-Homologous End-Joining). Nous avons également montré que le Nucleotide Excision Repair, impliqué dans la réparation des adduits à l’ADN, n’est pas impliqué dans la prise en charge des dommages induits par CDT. En revanche, nous avons démontré, pour la première fois, l’implication de systèmes de réparation de dommages plus précoces, comme le Single-Strand Break Repair et la voie de l’Anémie de Fanconi. Pour finir, afin de mieux caractériser ces dommages et leur induction, nous avons initié des travaux visant à étudier, in vitro, l’activité catalytique de CdtB. Dans ce but, différents mutants catalytiques ont été générés, purifiés, et leur activité nucléase a été testée. Une activité nucléase similaire entre les CdtB sauvages et mutantes a été obtenue lors d’un test in vitro (digestion d’un plasmide super-enroulé). Cependant, un test cellulaire (expression nucléaire en cellules eucaryotes de la sous-unité CdtB sauvage ou mutante) indique bien la perte de l’activité nucléase de la sous-unité mutante. Nos résultats montrent donc l’importance de tester les différentes sous-unités dans différents contextes. En conclusion, notre travail conforte les données selon lesquelles CDT induit des CSB, et non des CDB directes de l’ADN. De plus, notre travail a permis d’éclaircir les processus cellulaires activés dans la cellule hôte, suite aux dommages à l’ADN induits par CDTThe Cytolethal Distending Toxin (CDT) is a virulence factor produced by many pathogenic gram-negative bacteria, its production being associated to various diseases, including tumorigenesis. A causal relationship has been established between DNA damage, mutagenesis and cancerogenesis. Different studies classified CDT among the bacterial genotoxins. The CDT-related pathogenicity relies on the catalytic subunit CdtB action, shown to induce double-strand breaks (DSB) on the host genomic DNA. Previously, our team showed that, at doses 1000 times lower than those used in the literature, CDT probably induces single-strand breaks that degenerate into DSB during S-phase. To document this model, we studied the repair systems involved in host-cell in response to CDT-induced DNA damage. Since various repair pathways allow cells to respond different type of DNA damage, we speculated that non-DSB repair mechanisms might contribute to the cellular resistance to CDT-mediated genotoxicity. First, we confirm that HR is involved in the management of CDT-induced lesions, but also Non Homologous End Joining, the second major DSB repair mechanism. Next we show that nucleotide excision repair, involved in adducts repair, is not important to take care of CDT-induced DNA damage, whereas base excision repair impairment sensitizes CDT-treated cells, suggesting that CDT induce single-strand breaks. Moreover, we demonstrate for the first time the involvement and the activation of the Fanconi Anemia repair pathway in response to CDT. Finally, to better characterize CDT-induced damage, we initiate experiments to study CdtB nuclease activity in vitro. For this, different CdtB mutants have been generated, purified and their nuclease activity tested. A similar nuclease activity has been obtained for the wt or mutant CdtB in an in vitro assay (digestion of a supercoiled plasmid). However, a cell assay (nuclear expression of CdtB in eukaryotic cells) confirms the loss of activity for the mutant subunit. Our results thus indicate the importance to test the CdtB subunit in different context. To conclude, our work reinforces a model where CDT induces single-strand damage and not direct DSB. This also underlines the importance of cell proliferation to generate DSB and sheds light on the activated host-cell systems, after CDT-induced DNA damage
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Mouche, Audrey. "Stabilité du génome et rôle des INGs dans la réponse aux dommages de l'ADN." Thesis, Rennes 1, 2017. http://www.theses.fr/2017REN1B015.
Full textAbstract:
ING2 et ING3 (Inhibitor of Growth 2 and 3) sont des protéines suppressives de tumeurs appartenant à une famille de 5 protéines ING1 à ING5. Le travail de thèse a consisté à étudier l’implication des protéines ING2 et ING3 dans la réponse aux dommages à l’ADN. Les fonctions d’ING3 en tant que gène suppresseur de tumeur sont peu connues. L’étude principale a été d’analyser l’impact de l’inhibition d’ING3 sur la réponse aux cassures double brins de l’ADN. De plus, une étude antérieure de l’équipe a observé que l’inhibition de la protéine ING2 était associée à l’accumulation de H2AX, un marqueur des cassures double brins de l’ADN. Ainsi nous avons également cherché à savoir si ING2 pouvait jouer un rôle dans la signalisation et la réparation des cassures double brins de l’ADN. Nous montrons pour la première fois un rôle d’ING3 dans la signalisation et la réparation des cassures double brins. En effet, ING3 joue un rôle crucial dans la signalisation des cassures permettant la phosphorylation et l’activation de la kinase ATM. En accord avec ces fonctions, ING3 est impliquée dans la réparation des cassures double brins par NHEJ et HR ainsi que dans la recombinaison de classe des immunoglobulines. Nous avons également montré l’implication d’ING2 dans la réponse aux cassures double brins de l’ADN. En effet, ING2 est nécessaire pour le recrutement de la protéine médiatrice de la réponse aux dommages 53BP1. Nos travaux montrent que ING2 est nécessaire pour la réparation par le mécanisme de la NHEJ. L’étude de son implication dans le mécanisme de recombinaison de classe des immunoglobulines montre qu’ING2 est un acteur essentiel de la voie classique de la NHEJ. Ces travaux identifient, pour la première fois, une fonction de type « caretaker » pour ING3 dans la réponse aux cassures doubles brins. Nous montrons une nouvelle fonction de type « caretaker » pour ING2 qui joue un rôle dans la stabilité du génome via son implication dans la réponse aux cassures double brins de l’ADNING2 and ING3 (Inhibitor of Growth 2 and 3) are tumor suppressor proteins belonging to the ING family (ING1 to ING5). The aim of my research project was to analyze the involvement of ING2 and ING3 proteins in response to DNA damages. The functions of ING3 as a tumor suppressor gene are little known. In the present study, we have investigated the impact of ING3 inhibition in response to DNA double strand breaks. Previous study in the lab showed . In addition, a previous study in the lab found that inhibition of ING2 protein is associated with the accumulation of H2AX, a marker of DNA double-strand breaks. Thus, we also demonstrate that ING2 plays a role in the signaling and repair of DNA double-strand breaks. In the present study, we describe for the first time the involvement of ING3 in the signaling and repair of DNA double-strand breaks. ING3 allowed the phosphorylation and activation of the ATM kinase and the repair of double strand breaks by NHEJ and HR as well as in immunoglobulin class switch recombination. We also show the involvement of ING2 in this process. Indeed, ING2 is necessary for 53BP1 recruitment in response to DNA damages and repair by the mechanism of NHEJ. ING2 was also an essential actor for the class switch recombination demonstrated that ING2 is an essential actor of the classical NHEJ pathway. This work identifies, for the first time, a "caretaker" function for ING3 in the response to DNA double strand breaks; and . We show a new caretaker function for ING2 that plays a role in the stability of the genome through its involvement in DNA damage response
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Dubois, Cécile. "Approche intégrée des dommages des rayonnements ionisants chez Caenorhabditis elegans : de l'ADN aux protéines." Thesis, Montpellier, 2017. http://www.theses.fr/2017MONTT151/document.
Full textAbstract:
De par l'omniprésence des rayonnements ionisants, l’évaluation de leur impact sur les écosystèmes est devenue une préoccupation environnementale majeure. Cependant, l’évaluation des risques environnementaux liés aux expositions chroniques souffre d’un manque de connaissances, d’autant que l’extrapolation des données acquises après exposition aiguë (plus nombreuses) ne semble pas adaptée pour la prédiction des effets des expositions chroniques. Pour exemple, les effets sur les paramètres individuels i.e. la reproduction, diffèrent entre ces deux modes d’expositions, suggérant que les mécanismes moléculaires sous-jacents diffèrent également. Il est donc nécessaire de réaliser des études au niveau individuel et subcellulaire afin de mieux comprendre les différences de radiotoxicité observées entre les deux modes d’irradiation. Les protéines sont les molécules fonctionnelles dans les organismes, elles peuvent être les cibles de dommages oxydatifs (i.e carbonylation), et sont susceptibles d’être des marqueurs pertinents et sensibles de l’exposition aux rayonnements ionisants. Ainsi, l’objectif de ce projet de thèse était d’améliorer la compréhension des mécanismes moléculaires de radiotoxicité (aigu vs chronique) en étudiant particulièrement la contribution du protéome chez un organisme modèle, le nématode Caenorhabditis elegans. Pour ce faire, l’étude des effets d’irradiation gamma aiguë et chronique sur une large gamme de doses (0,5 - 200Gy, dont 4 doses communes aux deux modes d’exposition) a été opérée au niveau individuel, et en particulier sur la reproduction, paramètre susceptible d’influencer directement la dynamique des populations. En complément, la modulation de l'expression des protéines mais aussi leurs dommages (i.e carbonylation) et leur dégradation par le protéasome ont été évalués. Les résultats ont montré que l’irradiation aiguë induit un effet sur le succès d’éclosion et sur la ponte totale dès 30Gy alors que seule la ponte totale est impactée par l’irradiation chronique à partir de 3,3Gy. A l’échelle moléculaire, les niveaux de protéines carbonylées sont très peu modulés après exposition chronique ou aiguë aux rayonnements ionisants. Le protéasome semble être impliqué dans la dégradation des protéines carbonylées après irradiation chronique. En revanche, après irradiation aiguë, celui-ci semble dépassé, suggérant une possible implication d’autres mécanismes de défense (autophagie). Les profils d’expression des protéines, et notamment de protéines impliquées dans l’apoptose, la réparation des dommages à l’ADN, la réplication et la reproduction sont différents après irradiation aiguë et chronique. Ainsi, les protéines nécessaires au développement embryonnaire sont réprimées après irradiation aiguë dès 0,5 Gy alors que celles impliquées dans le développement de la lignée germinale sont surexprimées. Ces dernières sont réprimées après irradiation chronique dès 0,5 Gy. Ces résultats, suggèrent que les mécanismes de radiotoxicité entre les expositions aiguës et chroniques sont bien distincts, et que les effets de l’irradiation aiguë pourraient être dus à une perturbation de l’embryogénèse (via l’accumulation de dommages génotoxiques). A l’inverse, l’irradiation chronique induirait un effet sur la gamétogénèse se traduisant par une baisse de la ponte totale sans affecter l’embryogénèse. Ce projet de recherche nous a permis d’apporter des connaissances sur les cascades d’évènements moléculaires suite à différentes conditions d'irradiation gamma et illustre l’intérêt d’utiliser une approche intégrée pour mieux prédire et comprendre les effets observés sur les grandes fonctions biologiques. De plus ces travaux ont permis de caractériser des marqueurs protéiques d’exposition plus sensibles que les marqueurs individuels puisque l’activité du protéasome et l’expression des protéines est modulée dès 0,5Gy. In fine cet ensemble de données contribuera à améliorer l’évaluation des risques pour l’environnementBecause of the ubiquitous nature of ionizing radiation, the risk assessment on ecosystems has become a major environmental concern. However, the environmental risk assessment of chronic exposures suffers from a lack of knowledge, especially because the extrapolation of data acquired after acute exposure in order to predict the effects of chronic exposures is not always relevant. Indeed, the effects on the individual parameters, i.e reproduction, differ between these two irradiation modes, suggesting that underlying mechanisms are also different. It is therefore necessary to carry out studies at the individual and at the subcellular level in order to better understand molecular mechanisms governing these differences in the observed effects. Proteins are the functional molecules in organisms, they can be the targets of oxidative damage (i.e carbonylation), and are likely to be relevant and sensitive markers of exposure to ionizing radiation. Thus, the objective of this research project was to improve the understanding of molecular mechanisms of radiotoxicity (acute vs chronic), particularly by studying the proteome contribution, on the biological model Caenorhabditis elegans. The study of the acute and chronic gamma irradiation effects, on a large dose range (between 0.5 and 200Gy, including 4 common doses to both irradiation modes), was performed at the individual level with the reproduction as endpoint, a parameter likely to directly influence the dynamic of populations. In addition, the modulation of protein expression but also their damage (i.e. carbonylation) and their degradation by the proteasome were evaluated. The results showed that acute irradiation induced an effect on hatching success and on total spawning from 30 Gy whereas only total spawning was impacted after chronic irradiation from 3.3 Gy. At the molecular level, the global level of carbonylated proteins was not so modified after chronic or acute exposure to ionizing radiation. The proteasome appears to be involved in the degradation of carbonylated proteins after chronic irradiation whereas after acute irradiation, it seems overtaken, suggesting a possible involvement of other defense mechanisms (autophagy). The protein expression, and particularly proteins involved in apoptosis, DNA repair, replication and reproduction, is differentially modulated after acute and chronic exposure. Thus, the proteins involved in embryonic development are repressed after acute irradiation as soon as 0.5 Gy whereas those involved in the germline development are overexpressed. These results suggest that the radiotoxicity mechanisms between acute and chronic exposures are quite different and that the effects of acute irradiation may be due to an embryogenesis disturbance (via the accumulation of genotoxic damage). Conversely to acute, chronic irradiation induces an effect on gametogenesis, resulting in a decrease of the total spawning without impacting embryogenesis. This research project allowed us to provide knowledge on the molecular cascade events following different gamma irradiation conditions and highlights the need of using an integrated approach to better predict and understand the observed effects on major biological functions. Moreover, this work allowed characterizing more sensitive markers of exposure than the individual ones as the proteasome activity and the protein expression is modulated from 0.5Gy. Ultimately this dataset would help to improve the environmental risk assessment
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Lebraud, Emilie. "Rôle du médiateur et des cohésines dans la réparation des dommages oxydatifs de l'ADN." Thesis, Université Paris-Saclay (ComUE), 2018. http://www.theses.fr/2018SACLS407/document.
Full textAbstract:
Les composants cellulaires sont constamment exposés à un stress oxydatif, lié à l’environnement et au métabolisme cellulaire. Les espèces réactives de l’oxygène produites par ce stress induisent de nombreuses lésions dans l’ADN, telles que l’oxydation des bases, la formation de sites abasiques ou la cassure de brins d’ADN. Ces dommages sont corrigés par un panel de systèmes de réparation, qui jouent un rôle critique dans la survie cellulaire et dans la prévention de pathologies telles que les maladies neurodégénératives ou le cancer. La modification de bases est le type de dommage le plus abondant, généré spontanément ou par des agents exogènes. Notre laboratoire s’intéresse ainsi au système de réparation par excision de base (BER), qui élimine les bases nucléotidiques altérées. Des études antérieures ont montré la formation « d’usines de réparation du BER » suite à des traitements induisant l’oxydation des bases dont la forme la plus courante est la 8-oxoguanine (8-oxoG). Dans le cas de cette lésion mutagène, l’assemblage du complexe BER dépend du recrutement d’OGG1 à la chromatine, l’enzyme qui reconnaît et excise la 8-oxoG. Cependant, ce recrutement ne nécessite pas la reconnaissance de la 8-oxoG, indiquant que d’autres signaux interviennent pour initier la réparation de la 8-oxoG par OGG1. Un crible à haut débit a été réalisé dans des cellules humaines pour rechercher des protéines impliquées dans le recrutement d’OGG1. Deux complexes ont été identifiés, les cohésines et le médiateur de la transcription.Dans ce projet de recherche, nous avons exploré le rôle de ces protéines dans la relocalisation d’OGG1 suite à un stress oxydatif. Nos études ont tout d’abord permis d’identifier des protéines essentielles au recrutement d’OGG1 : les protéines formant l’anneau de cohésines (SMC1, SMC3 et RAD21), plusieurs sous-unités du médiateur dont MED14, ainsi que le module CDK (MED12, MED13, Cycline C et CDK8). De plus, ces protéines sont nécessaires pour le recrutement d’OGG1 tout au long du cycle cellulaire. Nos résultats montrent que la relocalisation d’OGG1 sur la chromatine est liée à sa fonction de réparation de la 8-oxoG. Nous avons d’autre part montré que deux sous-unités du médiateur (MED12 et CDK8) sont relocalisées dans l’euchromatine, comme OGG1, de façon dépendante du corps du médiateur et des cohésines. Enfin, l’association d’OGG1 avec ses partenaires a été validée par microscopie FLIM-FRET et co-immunoprécipitation dans des conditions de stress oxydatif.En conclusion, ces résultats montrent pour la première fois un lien entre la réparation des bases oxydées et les complexes du médiateur et des cohésines, tous deux connus pour leur participation à d’autres voies de réparation de l’ADN. L’identification des mécanismes moléculaires et de nouveaux facteurs impliqués dans la réparation des bases oxydées pourrait fournir à terme des éléments essentiels pour la prise en charge de maladies telles que le cancer ou les maladies neurodégénérativesOur laboratory focuses on the base excision repair (BER) mechanism that is responsible for the removal of damaged bases in DNA. Oxidative DNA damage is generated spontaneously by the endogenous metabolism of the cells or induced exogenously by chemical or physical agents. Our aim is to understand how BER complexes are assembled in the context of the cell nucleus in response to genotoxic stress. We previously found that after treatments generating oxidized bases into cellular DNA BER complexes are assembled on the chromatin. In the case of the 8-oxoguanine (8-oxoG) mutagenic lesion, assembly of the BER complex depends on the recruitment to the chromatin of OGG1, the DNA glycosylase that recognizes and excises the lesion. Surprisingly, characterization of OGG1 mutants that are not able to recognize 8-oxoG showed that the recruitment of this initiator protein does not require the recognition of the damaged base. This suggests that there are other mechanisms that allow recruitment of the enzyme to chromatin and thus initiation of the repair of the 8-oxoG by the BER. We performed a high-throughput siRNA screen in human cells to identify proteins required for the recruitment of OGG1 to chromatin. Among the candidates issued from the screen, two groups of proteins were selected for further study: members of the mediator and cohesin complexes.In this project, we explored the role of these proteins in OGG1 relocalization after an oxidative stress. Our studies confirmed the requirement of essential proteins for OGG1 recruitment: cohesins subunits (SMC1, SMC3 and RAD21), mediator subunits including the central protein MED14, and CDK subunits (MED12, MED13, Cyclin C and CDK8). Requirement of all these proteins is independent of the cell cycle. Furthermore we show that recrutement of OGG1 is essential for its 8-oxoG repair function. Microscopy studies revealed recruitment and colocalization of two mediator subunits (MED12 and CDK8) with OGG1 on euchromatin domains after an oxidative stress. Finally, the association between OGG1 and its partners, specifically after an oxidative stress, was validated by FLIM-FRET microscopy and co-immunoprecipitation.To conclude, these results show for the first time a link between repair of oxidized bases and mediator and cohesin complexes, both of them being already involved in other DNA repair pathways. The identification of molecular mechanisms and new factors involved in the repair of oxidized bases may ultimately provide new elements for the management of diseases such as cancer and neurodegenerative diseases
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Quinet, De Andrade Annabel. "Implication de l'ADN polymérase eta dans la réponse aux dommages de l'ADN dans des cellules déficientes en réparation par excision de nucléotides." Phd thesis, Université Paris Sud - Paris XI, 2012. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00779419.
Full textAbstract:
Les dommages de l'ADN interfèrent avec sa réplication et sa transcription. Ils sont en général éliminés par des mécanismes de réparation, en particulier par la réparation par excision de nucléotides (NER). Ils peuvent également être tolérés grâce à la synthèse translésionnelle (TLS). Au cours de mon travail de thèse, nous avons étudié l'implication de la voie NER et de l'ADN polymérase η (Polη) associée à la TLS dans la réponse aux lésions de l'ADN induites par les rayons ultraviolet (UV) et par une drogue chimiothérapeutique, la doxorubicine. Les principales lésions induites par les rayons UV sont les dimères de pyrimidine cyclobutane (CPDs) et les pyrimidines (6-4) pyrimidones (6-4PPs) qui sont éliminées par la NER. Les données obtenues sur la formation de régions d'ADN simple brin et celles du cycle cellulaire suggèrent que les lésions 6-4PPs sont tolérées par un mécanisme de réparation post-réplicative dans des cellules XP-C déficientes en NER (xeroderma pigmentosum du groupe C). Dans un second temps, mon objectif a été de déterminer la contribution de Polη dans la prise en charge des lésions induites par les rayons UV dans les cellules XP-C. En effet, il est connu que Polη est responsable de la réplication des CPDs, mais l'absence de Polη dans des cellules proficientes en NER ne les rend pas hypersensibles aux rayons UV. De plus, il a été suggéré que Polη soit impliquée dans la TLS des 6-4PPs. En réprimant par shARN l'expression du gène codant Polη dans les cellules XP-C, j'ai réussi à établir la première lignée stable de fibroblastes humains déficients à la fois en NER et en Polη (XP-C/PolηKD). Cette réduction fonctionnelle de l'expression de Polη dans les cellules XP-C irradiées à faible dose d'UV a entraîné un arrêt irréversible du cycle cellulaire, la génération de cassures simple- et double-brin de l'ADN et une mortalité cellulaire significative. Ces résultats montrent un rôle crucial de Polη dans la survie des cellules déficientes en NER après irradiation UV et suggèrent que Polη puisse participer aussi à la TLS des 6-4PPs.Par ailleurs, nous avons montré que les cellules déficientes en NER ou en Polη ont été sensibilisées par un traitement à la doxorubicine indiquant que la NER et Polη participent également de la prise en charge des lésions induites par cet agent. Donc au cours de mon travail de thèse, j'ai mis en évidence des interconnexions complexes entre Polη et la voie NER en réponses à différents agents génotoxiques.
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Gruosso, Tina. "Rôle de jund et du stress oxydant chronique dans la réponse aux dommages de l'ADN." Paris 7, 2012. http://www.theses.fr/2012PA077074.
Full textAbstract:
La phosphorylation de H2AX (y-H2AX) est un élément clé dans la réponse aux dommages de l'ADN. Nos travaux révèlent une nouvelle régulation de H2AX par le stress oxydant chronique. En effet, nous observons que l'accumulation persistante d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) réduit la quantité de H2AX dans différents types cellulaires et dans différentes conditions de stress oxydant incluant la déficience en des facteurs clé de l'homéostasie redox ainsi que la vieillissement. Un traitement antioxydant à long terme prévient la diminution de H2AX dans ces modèles ; confirmant l'action prépondérante des ROS dans cette régulation. L'accumulation persistante de ROS induit la dégradation de la fraction nucléoplasmique de H2AX et diminue significativement la quantité de H2AX associé à la chromatine. Cette diminution de H2AX par les ROS est responsable de l'accumulation réduite de la forme phosphorylée de H2AX détectée après un stress génotoxique ; favorisant ainsi une instabilité génétique. Le niveau de H2AX est significativement réduit dans les sous-types de cancer du sein de mauvais pronostic caractérisés -entre autres- par des signatures de stress. Enfin, la chimiothérapie et la radiothérapie, thérapies anticancéreuses inductrices de ROS, réduisent la quantité de H2AX dans les cancers du sein. De façon intéressante, plus la baisse de H2AX induite par la thérapie anticancéreuse est importante, meilleure est la réponse thérapeutique. L'amplitude de la diminution de H2AX par ces traitements semble prédire leur efficacité. En conclusion, nos résultats mettent en évidence un nouveau mécanisme de régulation de H2AX par les ROS ; proposant ainsi un modèle pour expliquer l'origine de l'instabilité génétique des cellules et des tissus souffrant de stress oxydant chroniqueHistone H2AX is a H2A variant histone that is ubiquitously expressed throughout the genome and important to preserve genomic stability. Its phosphorylation (-H2AX) is a key event in the DNA damage response and repair. Here, we unravel a new regulation of H2AX by oxidative stress. Indeed, we observe that persistent accumulation of Reactive Oxygen Species (ROS) reduces H2AX protein levels in various physiological situations of chronic oxidative stress including cells and organs from mouse models deficient for key redox factors such as junD and Nrf2 as well as normal aging. Long-term anti-oxidant treatment prevents H2AX down-regulation in this model System, confirming ROS are central in that process. Persistent accumulation of ROS targets the nucleoplasmic form of H2AX for degradation and significantly reduces the total levels of H2AX associated with the chromatin. Down-regulation of H2AX by ROS accounts for the reduced levels of phosphorylated H2AX detected following genotoxic stresses and further promotes genetic instability. Furthermore, we found that total H2AX protein level is significantly higher in the stroma and epithelium of human breast cancer subtypes with a good prognosis, as compared with aggressive subtypes, characterized -among others- by oxidative stress signatures. Finally, chemo- and radiotherapy, well known to act through increases in ROS levels, also markedly reduce total H2AX protein levels in human breast tumours. Interestingly, the more H2AX levels are reduced, the better is the response of the patient to treatment. Thus, the extent of H2AX down-regulation in response to treatment appears to be a predictive biomarker for therapeutic outcome. Taken together, our data uncover a new mechanism for H2AX regulation by ROS, which provides new insights into the origin of genetic instability in cells and tissues suffering from chronic oxidative stress
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Lévy, Nicolas. "XRCC1, un élément clef de la réparation des dommages de l'ADN couplée à la réplication." Université Louis Pasteur (Strasbourg) (1971-2008), 2007. https://publication-theses.unistra.fr/public/theses_doctorat/2007/LEVY_Nicolas_2007.pdf.
Full textAbstract:
XRCC1 est un facteur central des voies de réparation des cassures simple brin (SSBR) ou des bases endommagées (BER). Il organise un réseau complexe d’interactions protéiques avec les acteurs de la réparation grâce à ses domaines BRCT1 et BRCT2. Le domaine BRCT1 interagit avec l'enzyme qui détecte et signale les cassures dans l'ADN, PARP-1, ainsi qu'avec le poly(ADP-ribose) (PAR), permettant son recrutement rapide au site de dommage. Afin de mieux comprendre les fonctions du domaine BRCT1 de XRCC1 dans la réparation des dommages de l’ADN, nous avons cherché à isoler de nouveaux partenaires par une approche protéomique s'appuyant sur la spectrométrie de masse. Nous avons identifié deux nouveaux partenaires : la sous unité catalytique de la protéine kinase DNA-PK impliquée dans la réparation de l'ADN par recombinaison non homologue (NHEJ) et la sous unité p58 du complexe ADN polymérase α-primase impliqué dans la replication de l'ADN. XRCC1 interagit avec DNA-PK et stimule son activité in vitro de phosphorylation de la sérine 15 de p53. En retour, XRCC1 est phosphorylé par DNA-PK au niveau de sa sérine 371 en réponse à une exposition aux rayonnements X et cette phosphorylation régule la transition entre une forme monomère et une forme dimère de XRCC1 et est requise pour la réparation efficace des casssures double brin in vitro. Le mutant non phosphorylable XRCC1-S371L perd sa capacité à stimuler DNA-PK, et induit un défaut de réparation des cassures double brin induites par des rayonnements X. Nos résultats suggèrent que XRCC1 pourrait recruter DNA-PK pour engager la voie de réparation NHEJ lorsqu'une cassure simple-brin a été convertie en cassure double-brin lors de la phase S. XRCC1 interagit par son domaine BRCT1 avec la sous-unité p58 du complexe replicatif Pol α-primase et les deux protéines co-localisent in vivo. Nous montrons que p58 lie le PAR ce qui entraîne l’inhibition de l’activité primase. La surexpression du domaine BRCT1 de XRCC1 dans des cellules HeLa induit l’hétéromodification du domaine BRCT1 surexprimé et l’accumulation des cellules en début de phase S après traitement par un agent alkylant. Nous montrons que ce blocage de la réplication à lieu entre la formation des complexes de pré-initiation et le recrutement de PCNA, et qu’elle est dépendante de la synthèse de PAR Ce travail révèle une nouvelle fonction de XRCC1 et du PAR, qui est de réguler l'initiation de la réplication lorsque l'ADN est endommagé. L’ensemble de nos résultats décrivent XRCC1 et PARP-1 comme des éléments centraux de la coordination entre réparation et réplication de l’ADN, ainsi que dans la transition entre SSBR et DSBR. Lors de la réplication d’un ADN endommagé, le couple XRCC1/PARP-1, via le PAR porté par le domaine BRCT1 de XRCC1, freine l’avancement de la fourche de réplication en interagissant avec p58, inhibant de la sorte l’ADN primase. Ceci permettrait à la cellule de réparer les lésions présentes sur l’ADN afin d’éviter la collision entre la fourche de réplication et une cassure simple-brin de l’ADN non réparée. Néanmoins, en cas de conversion du SSB en DSB, XRCC1 stimule l’activité de DNA-PK afin de promouvoir la réparation du DSB.
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Sfaxi, Rym. "Régulation de la maturation en 3' des pré-ARNm en réponse aux dommages de l'ADN." Thesis, Université Paris-Saclay (ComUE), 2017. http://www.theses.fr/2017SACLS358.
Full textAbstract:
La maturation 3’ des pré-ARNm constitue une étape majeure dans la régulation post-transcriptionnelle de l’expression des gènes, indispensable à la stabilité, l’export vers le cytoplasme et la traduction des ARNm. Elle est composée de deux réactions : un clivage à l’extrémité 3’ suivie de l’addition d’une queue poly(A). Des études ont montré que la maturation en 3’ est inhibée en réponse aux dommages de l’ADN. Cependant, la cellule a mis en place des mécanismes compensatoires qui permettent à certains pré-ARNm d’être correctement maturés assurant ainsi le maintien de son intégrité. Les travaux que nous avons menés ont mis en évidence un mécanisme de résistance à l’inhibition de maturation en 3’ du pré-ARNm codant pour le suppresseur de tumeur p53. Ce mécanisme fait intervenir l’hélicase DHX36 qui déplie une structure secondaire appelée G-quadruplexe située en aval du site de clivage. Par ailleurs dans une deuxième étude, nous avons montré que la maturation en 3’ maintenue du pré-ARNm p53 en réponse aux dommages de l’ADN, est découplée du processus de transcription, contrairement au pré-ARNm TBP dont la maturation 3’ est inhibée en réponse aux dommage de l’ADN. Ce découplage a lieu grâce à un clivage co-transcriptionnelle du pré-ARNm p53 au niveau de la chromatine qui entraîne sa libération dans le nucléoplasme où il subit sa maturation en 3’. Une étude à grande échelle nous a permis de montrer que ce mécanisme de maturation en 3’ survenant dans le nucléoplasme est associé au maintien d'une maturation en 3’ efficace en réponse aux dommages de l’ADNThe 3’-end processing of pre-mRNA, a key step in the post-transcriptional gene expression regulation, is essential for mRNA stability, export and translation. This process is a two-step reaction composed of a cleavage at the 3’-end followed by the addition of a poly(A) tail. Studies have shown that pre-mRNA 3’-end processing is inhibited in response to DNA damage. However, compensatory mechanisms exist to allow some pre-mRNA to be properly processed at their 3’-end in order to maintain cell integrity. For instance, in response to DNA damage, the 3’-end processing of the pre-mRNA coding for the tumor suppressor p53 is able to escape from its inhibition. In the present work, we have shown that the underlying mechanism involves the DHX36 helicase that unwinds a secondary structure called G-quadruplex located downstream of the cleavage site of the p53 pre-mRNA. Moreover, in a second study, we have shown that the maintained p53 pre-mRNA 3’-end processing in response to DNA damage is uncoupled from the transcription process, unlike the inhibited TBP pre-mRNA 3’-end processing. This uncoupling takes place through a co-transcriptional cleavage of p53 pre-mRNA from the chromatin and its release in the nucleoplasm where it undergoes its 3’-end processing. A genome-wide study allowed us to show that the pre-mRNA 3’-end processing occurring in the nucleoplasm is associated with a maintained 3’end processing in response to DNA damage
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Chrabaszcz, Elodie. "Comment la proximité des lésions module les voies de tolérance des dommages de l'ADN in vivo." Electronic Thesis or Diss., Aix-Marseille, 2017. http://www.theses.fr/2017AIXM0661.
Full textAbstract:
Le génome de tous les organismes vivants est constamment menacé par de nombreux agents qui causent des dommages à l'ADN. Lorsque la fourche de réplication rencontre une lésion de l'ADN non réparée, deux voies de tolérance aux dommages de l'ADN sont possibles : la voie de synthèse translésionnelle (TransLesion Synthesis - TLS) potentiellement mutagène et les voies fidèles de contournement des lésions (Damage Avoidance - DA) qui utilisent l'information du brin complémentaire non endommagé. L’équilibre entre ces deux voies de tolérance fidèle et mutagène est un paramètre essentiel puisqu’il permet de définir le niveau de mutagénèse lors de la réplication d'un ADN endommagé. Afin d’étudier in vivo ces différentes voies de tolérance ainsi que leur équilibre, le laboratoire a développé un système qui permet l’introduction d’une lésion unique sur le chromosome de la bactérie Escherichia coli. Il a montré que cet équilibre est contrôlé par le niveau d'expression des ADN polymérases translésionnelles, ainsi que par la capacité de la cellule à faire de la recombinaison homologue. Au cours de cette thèse, nous montrons que cet équilibre est également régulé par des contraintes structurales au niveau de la fourche de réplication. Nous montrons que la proximité de deux lésions sur des brins opposés entraine une forte inhibition de la voie fidèle DA due à un chevauchement des régions d’ADN simple brins générées en aval des lésions. Cette inhibition conduit alors à une augmentation de la TLS, indépendamment de la réponse SOS. Ces données révèlent ainsi que la proximité des lésions de l'ADN est un facteur essentiel dans l’équilibre des voies de tolérance, pouvant favoriser la mutagénèseThe genome of all living organisms is constantly injured by several agents that cause DNA damages. When the replication fork encounters an unrepaired DNA lesion, two DNA damage tolerance pathways are possible : the potentially mutagenic Translesion Synthesis (TLS) pathway and the error-free Damage Avoidance (DA) pathways that use the information of the undamaged complementary strand. The balance between these error-free and error-prone tolerance pathways is an essential parameter since it defines the level of mutagenesis during replication of a damaged DNA. In order to study these different pathways of tolerance and their balance in vivo, the laboratory has developed a genetic system that allows the introduction of a single lesion on the chromosome of Escherichia coli. They showed that the balance is controlled by the level of expression of the TLS polymerases, as well as the capacity of the cell to perform homologous recombination. In this thesis, we show that this balance is also modulated by structural constraints at the level of the replication fork. We show that the proximity of two lesions on opposite strands results in a strong inhibition of DA due to an overlap of the single stranded DNA regions generated downstream of the lesions. This inhibition leads to an increase in TLS independently of the SOS response. These data reveal that the proximity of DNA lesions is an essential factor in the balance of DDT pathways, favoring mutagenesis
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Chrabaszcz, Elodie. "Comment la proximité des lésions module les voies de tolérance des dommages de l'ADN in vivo." Thesis, Aix-Marseille, 2017. http://www.theses.fr/2017AIXM0661.
Full textAbstract:
Le génome de tous les organismes vivants est constamment menacé par de nombreux agents qui causent des dommages à l'ADN. Lorsque la fourche de réplication rencontre une lésion de l'ADN non réparée, deux voies de tolérance aux dommages de l'ADN sont possibles : la voie de synthèse translésionnelle (TransLesion Synthesis - TLS) potentiellement mutagène et les voies fidèles de contournement des lésions (Damage Avoidance - DA) qui utilisent l'information du brin complémentaire non endommagé. L’équilibre entre ces deux voies de tolérance fidèle et mutagène est un paramètre essentiel puisqu’il permet de définir le niveau de mutagénèse lors de la réplication d'un ADN endommagé. Afin d’étudier in vivo ces différentes voies de tolérance ainsi que leur équilibre, le laboratoire a développé un système qui permet l’introduction d’une lésion unique sur le chromosome de la bactérie Escherichia coli. Il a montré que cet équilibre est contrôlé par le niveau d'expression des ADN polymérases translésionnelles, ainsi que par la capacité de la cellule à faire de la recombinaison homologue. Au cours de cette thèse, nous montrons que cet équilibre est également régulé par des contraintes structurales au niveau de la fourche de réplication. Nous montrons que la proximité de deux lésions sur des brins opposés entraine une forte inhibition de la voie fidèle DA due à un chevauchement des régions d’ADN simple brins générées en aval des lésions. Cette inhibition conduit alors à une augmentation de la TLS, indépendamment de la réponse SOS. Ces données révèlent ainsi que la proximité des lésions de l'ADN est un facteur essentiel dans l’équilibre des voies de tolérance, pouvant favoriser la mutagénèseThe genome of all living organisms is constantly injured by several agents that cause DNA damages. When the replication fork encounters an unrepaired DNA lesion, two DNA damage tolerance pathways are possible : the potentially mutagenic Translesion Synthesis (TLS) pathway and the error-free Damage Avoidance (DA) pathways that use the information of the undamaged complementary strand. The balance between these error-free and error-prone tolerance pathways is an essential parameter since it defines the level of mutagenesis during replication of a damaged DNA. In order to study these different pathways of tolerance and their balance in vivo, the laboratory has developed a genetic system that allows the introduction of a single lesion on the chromosome of Escherichia coli. They showed that the balance is controlled by the level of expression of the TLS polymerases, as well as the capacity of the cell to perform homologous recombination. In this thesis, we show that this balance is also modulated by structural constraints at the level of the replication fork. We show that the proximity of two lesions on opposite strands results in a strong inhibition of DA due to an overlap of the single stranded DNA regions generated downstream of the lesions. This inhibition leads to an increase in TLS independently of the SOS response. These data reveal that the proximity of DNA lesions is an essential factor in the balance of DDT pathways, favoring mutagenesis
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Dumont, Ariane. "Protection des ions organiques contre les dommages induits à l'ADN par les électrons de basse énergie." Mémoire, Université de Sherbrooke, 2009. http://savoirs.usherbrooke.ca/handle/11143/4025.
Full textAbstract:
Il a été démontré que les électrons de basse énergie (EBE) peuvent induire des cassures simple brin (CSB) à l'ADN, via la formation d'anions transitoires qui décroissent par attachement dissociatif, ou dans d'autres états électroniques dissociatifs menant à la fragmentation. Afin d'effectuer une étude complète des effets des électrons de basse énergie sur la matière biologique, il est nécessaire de comprendre leur mécanisme d'interaction non seulement avec l'ADN, mais avec les constituants de son environnement. Les histones sont une composante importante de l'environnement moléculaire de l'ADN. Leur charge positive leur permet de s'associer aux groupements phosphate anionique de l'ADN. Le rôle principal de ces protéines basiques consiste à organiser l'ADN et l'empaqueter afin de former la chromatine. Les cations sont une autre composante importante de la cellule; ils jouent un rôle dans la stabilisation de la conformation B de l'ADN in vitro par leurs interactions avec les petits et grands sillons de l'ADN, ainsi qu'avec le groupement phosphate chargé négativement. Avec les histones, ils participent également à la compaction de l'ADN pour former la chromatine. Cette étude a pour but de comprendre comment la présence d'ions organiques (sous forme de Tris et d'EDTA) à proximité de l'ADN modifie le rendement de cassures simple brin induit par les électrons de basse énergie. Le Tris et l'EDTA ont été choisis comme objet d'étude, puisqu'en solution, ils forment le tampon standard pour solubiliser l'ADN dans les expériences in vitro (10mM Tris, 1mM EDTA). De plus, la molécule Tris possède un groupement amine alors que l'EDTA possède 4 groupements carboxyliques. Ensemble, ils peuvent se comporter comme un modèle simple pour les acides aminés. Le ratio molaire de 10 :1 de Tris par rapport à l'EDTA a pour but d'imiter le comportement des histones qui sont riches en arginine et lysine, acides aminés possédant un groupement amine chargé positivement additionnel. Des films d'ADN de différentes épaisseurs, possédant entre 0 et 32 ions organiques/ nucléotide, ont été irradiés avec des électrons de 10eV. Les dommages induits par les électrons, sous forme de cassures, ont été détectés par électrophorèse. Nous avons démontré que le rendement de cassure simple brin diminuait de façon dramatique en fonction du nombre d'ions organiques/ nucléotide. Aussi peu que 2 ions organiques/ nucléotide sont suffisant pour décroître le rendement de SSB de 70%. Cet effet radioprotecteur est en partie expliqué par l'augmentation de l'épaisseur des films, mais surtout par la modification du champ électrique à proximité de l'ADN, due à l'ajout de molécules chargées positivement. La modification du champ électrique près de l'ADN altère les paramètres de résonance comme le temps de vie de l'anion transitoire et la limite de dissociation, qui influent directement sur la section efficace d'attachement dissociatif. L'effet protecteur peut également être expliqué par la restauration des bases anioniques déshydrogénées induites par l'attachement dissociatif de l'électron sur une base (G(-H)[indice supérieur -]). Ce sont les molécules Tris qui, en transférant un atome d'hydrogène ou un proton, restaurent les bases déshydrogénées et inhibent par le fait même la formation de cassures simple brin. Ces résultats indiquent que les histones peuvent également participer à la réparation de dommages précoces induits à l'ADN avant qu'elles ne mènent à des dommages encore plus nocifs et difficiles à réparer, comme les cassures simples brins.
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Jacquet, Karine. "Fonction et régulation du complexe acétyltransférase TIP60 au cours de la réponse aux dommages de l'ADN." Doctoral thesis, Université Laval, 2016. http://hdl.handle.net/20.500.11794/27557.
Full textAbstract:
La chromatine protège et organise la molécule d'ADN dans le noyau. Sa dynamique est essentielle afin de réguler l'accès direct à l'information génétique encodée dans la séquence de l'ADN durant les processus de la réplication, la transcription et la réparation. Le complexe acétyltransférase TIP60/NuA4 est un régulateur clé de la stabilité et de l'expression du génome, fréquemment dérégulé dans certains cancers. L'analyse de ce complexe multiprotéique a constitué le cœur de mes études doctorales. Mon projet portait sur l'étude de la fonction et de la régulation du complexe au cours de la réparation des dommages de l'ADN. Il s'est ainsi découpé en 3 axes: comprendre le recrutement du complexe TIP60 à la cassure double-brin, sa régulation durant la réparation et sa fonction exacte au cours de la réponse aux dommages. Mon objectif initial était de purifier le complexe TIP60 natif afin d'effectuer des analyses par spectrométrie de masse. Dans un premier temps, nous avons développé une méthode alliant édition du génome et étude protéomique afin d'améliorer et de faciliter l'exploration des interactions protéiques au sein de complexes à sous-unités multiples comme TIP60. Elle rend possible l'étude des activités biochimiques et des liens structure-fonction. De plus, nous avons étudié les modifications post-traductionnelles du complexe comme l'acétylation et la phosphorylation. Finalement, j'ai cherché à clarifier la fonction du complexe durant la réparation via l'identification de nouveaux substrats d'acétylation. Ainsi, nous avons identifié MBTD1 comme étant une nouvelle sous-unité stable du complexe, ce qui nous a permis de clarifier la fonction de TIP60. De façon intéressante, l'identification d'un nouveau substrat au sein de la chromatine a éclairci la fonction précoce de TIP60 lors du choix de voie de réparation. Finalement, une fonction plus tardive de TIP60 est suggérée par l'identification de nouveaux substrats non histone au sein de la voie de recombinaison homologue. L'ensemble de ces travaux a permis d'éclaircir la régulation et la fonction de TIP60 au cours de la réparation des cassures double-brin de l'ADN conduisant à une meilleure compréhension des mécanismes d'oncogenèse.
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Martin, Corinne. "Modélisation des dommages radioinduits sur l'ADN : prise en compte des radicaux libres et des réparations primaires." Toulouse 3, 2003. http://www.theses.fr/2003TOU30050.
Full text
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Mamouni, Kenza. "Rôle de la GTPase RhoB dans la réponse aux dommages à l'ADN induits par la camptothécine." Toulouse 3, 2013. http://thesesups.ups-tlse.fr/2031/.
Full textAbstract:
RhoB est une GTPase impliquée dans diverses fonctions intracellulaires comme l'organisation du cytosquelette. En plus de ses rôles bien établis, RhoB a récemment émergé comme un gène de réponse précoce aux dommages à l'ADN. RhoB est surexprimée et activée en réponse à divers génotoxiques bien que les mécanismes d'induction et la relevance fonctionnelle de cette induction restent mal compris. RhoB possède également des propriétés de suppresseur de tumeurs. Son expression diminue lors de la progression tumorale et la perte de RhoB favorise la prolifération cellulaire et l'invasion. Pour étudier le rôle de RhoB dans la réponse aux dommages à l'ADN et son implication potentielle dans la progression tumorale, nous avons utilisé la camptothécine (CPT), un inhibiteur sélectif de la topoisomérase I qui produit des cassures double-brin (DSBs) de l'ADN. Nous montrons que, dans les cellules traitées par la CPT, les DSBs induisent l'expression de RhoB par un mécanisme qui dépend de Chk2 et de son substrat HuR qui se lie à l'ARNm de RhoB et prévient sa dégradation. Des cellules déficientes en RhoB présentent un défaut de déphosphorylation de gamma-H2AX après le retrait de la CPT, suggérant un défaut de réparation des DSBs. Ces cellules présentent également une diminution de l'activité de PP2A, une phosphatase pour gamma-H2AX et d'autres protéines de la signalisation et de la réparation des dommages à l'ADN. Nous proposons que les DSBs activent une voie Chk2-HuR-RhoB qui favorise la déphosphorylation de gamma-H2AX par PP2A. Enfin, nous montrons que les cellules déficientes en RhoB accumulent du gamma-H2AX endogène et des anomalies chromosomiques, suggérant que la perte de RhoB augmente l'instabilité génomique induite par les DSBs et la progression tumoraleRhoB is a GTPase implicated in various intracellular functions such as cytoskeletal organization. Besides its well-established roles, RhoB recently emerged as an early DNA damage-inducible gene. RhoB is overexpressed and activated in response to various genotoxics although the mechanism of induction and functional relevance remain unclear. RhoB also possesses tumor suppressor properties. Its expression decreases during tumor progression and loss of RhoB promotes cell proliferation and invasion. To study the role of RhoB in the DNA damage response and its potential implication in tumor progression, we used camptothecin (CPT), a selective inhibitor of topoisomerase I that produces DNA double-strand breaks (DSBs). We show that, in CPT-treated cells, DSBs induce RhoB expression by a mechanism that depends on Chk2 and its substrate HuR that binds to and protects RhoB mRNA against degradation. RhoB deficient cells fail to dephosphorylate gamma-H2AX following CPT removal suggesting defective DSB repair. These cells also show decreased activity of PP2A, a phosphatase for gamma-H2AX and other DNA damage signaling and repair proteins. We propose that DSBs activate a Chk2-HuR-RhoB pathway that promotes PP2A-mediated dephosphorylation of gamma-H2AX. Finally, we show that RhoB deficient cells accumulate endogenous gamma-H2AX and chromosomal abnormalities, suggesting that RhoB loss increases DSB-mediated genomic instability and tumor progression
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Rezaee, Mohammad. "Sensitization of plasmid DNA to ionizing radiation by platinum chemotherapeutic drugs." Thèse, Université de Sherbrooke, 2013. http://hdl.handle.net/11143/6260.
Full textAbstract:
Abstract: Concomitant chemoradiation therapy based on platinum chemotherapeutic drugs (Pt-drugs) is a common treatment modality for several types of cancers and has dramatically improved patient survival. The radiosensitization capacity of Pt-drugs results essentially from their binding to nuclear DNA. Although several mechanisms such as increase in the radiation damage to DNA and inhibition of their repair have been proposed, the contribution and efficiency of the underlying molecular mechanisms of the radiosensitization remain unknown. This PhD thesis determines the relative efficiency of Pt-drugs, in terms of the type of drug and the quantity of Pt-DNA adducts, in the sensitization of DNA to the direct and indirect effects of ionizing radiations, and elucidates the major mechanism responsible for this radiosensitization. In particular, it addresses the role of low-energy electrons (LEEs), hydroxyl radicals and hydrated electrons in the radiosensitization of DNA modified by Pt-drugs. This thesis includes a review of the literature on the molecular basis of radiotherapy, Pt-based chemotherapy, and their combination in cancer treatment. Five articles, on which I am first author, are presented, and followed by a comprehensive discussion that integrates all results and their implications in the clinic and future research. With respect to the direct effect of radiation, LEEs are found to be the main species responsible for the enhancement in DNA damage, particularly cluster damage including DSB and interduplex cross-links. Irradiation of a 3199-bp plasmid DNA modified by an average of 2 Pt-drug adducts with 10-eV electrons results in significant increases in DSB formation by factors of 3.1, 2.5 and 2.4, respectively, for carboplatin, cisplatin and oxaliplatin relative to unmodified DNA. Irradiation of these samples with subexcitation-energy electrons (i.e., 0.5 eV) generates substantial number of DSB in the modified DNA, while no DSB is observed in the unmodified DNA. Since 0.5 eV is well below that energy required for the electronic excitation of organic molecules, dissociative electron attachment must be the main mechanism responsible for the formation of strand breaks in the presence of Pt-adducts. For indirect effects of radiation, our results show that both hydroxyl radicals and hydrated electrons are responsible for the enhanced formation of damage in modified DNA. In the presence of Pt-adducts, hydroxyl radicals mainly contribute to the SSB formation, while hydrated electrons are the main species responsible for the DSB formation. Our results indicate that carboplatin and oxaliplatin have higher efficiency than cisplatin in the enhancement of radiation damage to DNA. At low frquencies of Pt-DNA adducts (i.e., less than 3.1x10-4 adducts per nucleotide), radiosensitization of DNA, in terms of the damage per adduct, increases by an order of magnitude compared with that at large frquencies of adducts. In conclusion, Pt-drug modification is an extremely efficient means of enhancing the formation of DNA DSBs by both LEEs and hydrated electrons created by ionizing radiation.//Résumé: La radiochimiothérapie concomitante, basée sur les médicaments antinéoplasiques platinés (Pt-antinéoplasiquesm), est une modalité de traitement utilisé contre plusieurs types de cancers et a considérablement amélioré la survie des patients. Parmi ces médicaments anticancéreux, les analogues de platine sont les plus couramment utilisés. Leur capacité à radiosensibiliser résulte essentiellement de leur liaison à l'ADN nucléaire. Bien que plusieurs mécanismes aient été proposés telles que l'augmentation des dommages induits à l'ADN et l'inhibition de leur réparation, la contribution et l’efficacité des mécanismes moléculaires sous-jacents à la radiosensibilisation restent inconnus. La présente étude examine l'efficacité Pt-antinéoplasiques à sensibiliser l'ADN aux rayonnements ionisants et détermine le rôle des électrons secondaires, des radicaux d'hydroxyles et des électrons hydratés dans ce processus. Cette thèse comprend un revue des données scientifiques concernant la base moléculaire de la radiothérapie, de la chimiothérapie Pt-antinéoplasiques et de leur combinaison dans le traitement de cancer. Cinq articles, donc je suis premier auteur, sont présentés suivis d'une discussion qui intègre mes résultats et leurs implications dans la clinique et la recherche future. En ce qui concerne l'effet direct des radiations, les électrons de faible énergie s'avèrent être la principale espèce responsable de l’augmentation des dommages à l’ADN, en particulier les dommages multiples localisés, les CDBs et les pontages inter-brin. L'irradiation de plasmides de 3199 paires de bases, contenant en moyenne deux adduits Pt-ADN, avec des électrons de 10 eV conduit à une augmentation significative des CDBs par des facteurs de 3.1, 2.5 et 2.4, respectivement, pour le carboplatine, le cisplatine et l'oxaliplatine par rapport à l’irradiation des plasmides non modifiés. L'irradiation avec des électrons de 0.5 eV genère un nombre substantiel de CDBs dans les plasmides modifiés, alors qu'aucune CDB n'est observée dans les plasmides non modifiés. Puisque 0.5 eV est une énergie bien inférieure à celle nécessaire à l'excitation électronique des molécules organiques, l'attachement dissociatif de l’électron doit être le principal mécanisme responsable de la formation de cassures en présence de Pt-antinéoplasiques. Pour les effets indirects des rayonnements, nos résultats montrent que les radicaux hydroxyles et les électrons hydratés sont, tous les deux, responsables de la formation accrue des dommages dans l'ADN modifié. En présence d'adduits Pt-ADN, les radicaux hydroxyles contribuent principalement à la formation de cassures simple brin, tandis que les électrons hydratés sont les principales espèces responsables de la formation de CDBs. Nos résultats indiquent que le carboplatine et l'oxaliplatine sont plus efficaces que le cisplatine pour augmenter les dommages à l'ADN. À faible concentration de Pt-ADN (soit moins de 3.1x10[indice supérieur -4] adduit par nucléotide), la radiosensibilisation de l'ADN, en termes de dommages par adduit, est d'un ordre de grandeur supérieure à celle aux concentrations élevées. En conclusion, l’ajout de Pt-antinéoplasiques est un moyen extrêmement efficace d'augmenter la formation de CDBs dans l’ADN par l’intermédiaire des électrons de faible énergie et des électrons hydratés produits par les rayonnements ionisants. [symboles non conformes]
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Batal, Mohamed. "Etude de la formation et de la réparation des dommages à l'ADN causés par l'ypérite chez l'animal." Thesis, Grenoble, 2013. http://www.theses.fr/2013GRENV079/document.
Full textAbstract:
L'ypérite est une arme chimique de guerre de la famille des vésicants. Sa facilité de synthèse et l'existence de stocks importants dans le monde en font une menace à la fois pour les populations civiles et les militaires. Cette menace est renforcée par le fait qu'à l'heure actuelle il n'existe pas d'antidote efficace contre ce toxique de guerre. L'alkylation de l'ADN par l'ypérite aboutit à la formation d'adduits. L'objectif de cette thèse a consisté à mettre au point une méthode de détection quantificative de ces adduits par chromatographie liquide haute performance couplée à la spectrométrie de masse en tandem (HPLC-MS/MS) et d'appliquer cette méthode à l'étude de leur formation et de leur persistance après une exposition cutanée chez la souris SKH-1. Les résultats ont montré dans la peau exposée que la fréquence des adduits était maximale dès 6h post-exposition. Toutefois, leur persistance était relativement longue puisqu'ils étaient toujours détectables 3 semaines après exposition. Une diffusion radiale de l'ypérite a été mise en évidence par la détection des adduits qu'elle forme dans des échantillons de peau non directement exposés. Les adduits ont été également détectés dans plusieurs organes internes. La fréquence maximale des adduits a été mesurée 6h ou J1 post-exposition. Ils ont été décelés jusque J21 post-exposition. Les résultats ont montré qu'il se formait plus d'adduits dans le cerveau et les poumons que dans les reins, la rate et le foie. La persistance des adduits dans le cerveau et les poumons était moindre après la détersion de la peau exposée, illustrant ainsi la constitution dans cette dernière d'un réservoir d'ypérite. La mesure des activités de réparation de l'ADN a montré que l'ypérite exerçait une double action génotoxique, à savoir formation de dommages à l'ADN et inhibition des activités de réparationSulphur mustard is a chemical warfare which belongs to the vesicants family. Its easy synthesis and the existence of important stocks in the world make it a threat for both the general population and militaries. This threat is reinforced by the fact that currently there is not efficient antidote against this war toxic. DNA alkylation by sulphur mustard leads to adducts formation. The objective of this thesis consisted in developing a method of quantification of these adducts by high performance liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) and to apply this method to the study of the formation and persistence of the adducts after cutaneous exposure in SKH-1 mouse. Results have shown in exposed skin that adducts frequency was maximal as soon as 6h post-exposure. A radial diffusion of sulphur mustard was highlighted by the detection of adducts it forms in skin samples non-directly exposed. Adducts were also detected in several internal organs. Maximal frequency was measured at 6h or d1 post-exposure. They were detected until d21 post-exposure. Results have shown that adducts were produced in larger amount in brain and lungs than in kidneys, spleen and liver. The persistence of adducts was lower in brain and lungs after the detersion of exposed skin, thus illustrating the constitution of a reservoir of sulphur mustard in this tissue. Measurement of DNA repair activities showed that suilphur mustard behave as a two-edge sword genotoxic, namely formation of DNA damages and inhibition of repair activities
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Mourgues, Sophie. "Aspect moléculaire et potentiel génotoxique de dommages oxydants créés par une oxométalloporphyrine sur les guanines de l'ADN." Toulouse 3, 2005. http://www.theses.fr/2005TOU30111.
Full textAbstract:
L'importance de dégâts biologiques induits par l'oxydation de l'ADN a conduit à étudier, au niveau moléculaire, les lésions des acides nucléiques. Au cours de ces travaux la réactivité de l'agent oxydant meso-tétrakis(4-N-méthylpyridiniumyl)porphyrine de manganèse (Mn-TMPyP) activée par le monopersulfate de potassium (KHSO5) a été évaluée sur divers modèles et séquences d'ADN. La guanine est une cible privilégiée, la connaissance des mécanismes de formation des différentes lésions a permis d'augmenter le rendement de formation en lésions souhaitées. Nous avons préparé des nucléosides triphosphates portant des lésions guanine et nous avons évalué leur incorporation par des ADN polymérases lors de la synthèse de l'ADN. L'incorporation possible a été utilisée pour préparer des substrats modifiés par une lésion définie à une position précise. Des expériences préliminaires concernant la génotoxicité de produits d'oxydation de la guanine sur l'activité de la topoisomérase I ont été effectuéesDNA oxidation is a field of intense interest due to the delerious effects that oxidative damage promote within cells. During this work the reactivity of manganese(III)-bis-aqua-meso-tetrakis(4-N-methylpyridiniumyl)-porphyrin (Mn-TMPyP) activated by potassium monopersulfate (KHSO5) was evaluated on DNA models and sequences. Guanine is the most oxidizable base and constitutes the main target of oxidants, the yield of formation of given lesions was increased. Nucleosides triphosphates carrying oxidized guanine were prepared and their incorporation by DNA polymerases during DNA synthesis was investigated. Then, we developed a tool to prepare tailored modified oligonucleotides carrying one guanine modification. In preliminary experiments we investigated the genotoxic potential of guanine lesions on topoisomerase I activity
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Martelli, Alain. "Génération de dommages multiples au niveau des sites abasiques de l'ADN : synthèse et étude de molécules spécifiques." Université Joseph Fourier (Grenoble), 2001. http://www.theses.fr/2001GRE10013.
Full textAbstract:
Le site abasique est une des lesions les plus frequentes de l'adn. Il est forme par des agents antitumoraux tels que les agents alkylants qui provoquent une quantite toxique de cette lesion. Notre travail a pour but la synthese de molecules capables de reconnaitre les sites abasiques et de provoquer un dommage a proximite. Ce projet s'inscrit dans une strategie de potentialisation des agents antitumoraux en generant des dommages multiples au niveau des sites abasiques dans le but d'interferer avec la reparation cellulaire. Les molecules mises au point sont basees sur la structure optimisee lors des precedents travaux du laboratoire pour la reconnaissance specifique des sites abasiques. Cette structure comporte une base nucleique reliee via une chaine polyaminee a un intercalant, la 9-amino-6-chloro-2-methoxyacridine. Nous avons modifie la partie acridine pour lui conferer une activite endommageante de l'adn susceptible de generer une lesion a proximite du site abasique. Trois familles ont ete obtenues : 1) famille des acridines photo-activables : la 9-amino-6-chloro-2-methoxyacridine a ete remplacee par trois autres noyaux acridines. 2) famille des derives nitrobenzamides : quatre molecules ont ete obtenues en fonctionnalisant le noyau acridine par le systeme nitrobenzamide, decrit dans la litterature comme agent de coupure photochimique de l'adn. 3) famille des derives 1,10-phenantroline : nous avons synthetise deux molecules comportant le noyau 1,10-phenantroline possedant une activite de coupure radicalaire de l'adn en presence de cuivre et d'un reducteur. Les composes ont ete testes sur plasmide pbr322 et sur oligonucleotide de synthese comportant un analogue stable du site abasique. Cette etude a permis de montrer que la plupart des molecules possede une activite endommageante de l'adn et que les lesions observees sont toutes localisees a proximite du site abasique.
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Vaurijoux, Aurélie. "Étude des conséquences génétiques et épigénétiques consécutives à la signalisation persistante des dommages radio-induits de l'ADN." Thesis, Université Paris-Saclay (ComUE), 2016. http://www.theses.fr/2016SACLS515/document.
Full textAbstract:
Les cassures double-brin de l’ADN (CDB) sont des événements clés dans la réponse aux rayonnements ionisants qui, avec le profil génétique et épigénétique individuel, peuvent conditionner le devenir des tissus sains d’un individu exposé. À la suite des cassures de la molécule d’ADN et de la déstabilisation de la chromatine, une série de modifications post-traductionnelles des histones se produit, notamment la phosphorylation de la serine 139 de l'histone H2A.X (gamma-H2A.X), conduisant à la formation de foyers radio-induits. La réparation des CDB, et donc la disparition de ces foyers, a lieu dans les heures suivant l’exposition. Toutefois, une certaine proportion de ces foyers gamma-H2A.X persiste 24 heures après l’irradiation. La nature et le rôle de ces foyers persistants sont encore peu clairs. L’objectif de ce travail est d'explorer les caractéristiques de ces foyers persistants et leurs conséquences sur le devenir des cellules. Pour étudier la dynamique des foyers radio-induits, nous avons exposé des HUVEC synchronisées en phase G0/G1 à des doses de 1 et 5 Gy de rayons X. Les foyers radio-induits ont été étudiés à partir de 10 minutes et jusqu'à 7 jours après l'exposition par l’analyse de gamma-H2A.X et de l’association temporelle de la protéine 53BP1 et des CN-PML (corps nucléaires PML). L’impact des foyers persistants sur la prolifération cellulaire a également été exploré. Nous avons analysé en microscopie à fluorescence une moyenne de 4 000 cellules pour chaque condition à l'aide d'une analyse d’image permettant la détection automatique des noyaux et des foyers. L'analyse d'un grand nombre d‘évènements nous a permis de discriminer des sous-populations de cellules ou de foyers sur la base de différentes caractéristiques, telles que leur aire ou la phase du cycle cellulaire, et de mesurer leur représentativité dans l'ensemble de la population de cellules exposées. Ainsi, nous avons déterminé que les foyers gamma-H2A.X persistant ont une aire supérieure à 0,72 ± 0,11 µm² et qu’ils sont toujours colocalisés avec 53BP1. Plus de 70% des cellules exposées à 5 Gy ont au moins un foyer persistant 24 heures après l'exposition. De plus, ces foyers persistants sont observables au moins jusqu'à 7 jours après l’irradiation. Une association spatiale significative entre les CN-PML et les foyers gamma-H2A.X a été observée à partir de 10 minutes après l'exposition et 24 heures après l’exposition, environ 90% des foyers persistants sont associés à un CN-PML. De plus, la présence de foyers persistants ne bloque pas définitivement la prolifération des cellules. Cependant, la fréquence des foyers persistants est plus faible dans les cellules filles que dans les cellules irradiées, probablement en raison d'une certaine proportion de distribution asymétrique des foyers persistants entre les cellules filles. Nous avons également mesuré une corrélation positive entre la présence d'un foyer persistant et la probabilité de mauvaise ségrégation de l'ADN par l'observation de phénomènes de catastrophes mitotiques. Il semble donc que la structure formée après le passage d'un foyer persistant à travers les phases S et G2 soit susceptible d’empêcher la séparation correcte des chromatides sœurs du chromosome affecté. Nous suggérons donc que la nature des foyers persistants n’est pas la même avant et après la première division cellulaire due à une résolution anormale de l'anaphase. Ces assemblages chromosomiques atypiques résultants d’anaphases anormales pourraient être létaux pour la cellule ou entraîner un déséquilibre du dosage génique et une instabilité génomique accrue pouvant conduire à une mosaïque de phénotypes cellulairesThe DNA double-stranded breaks (DSB) are key events in the cell response to ionizing radiation that may affect, with the individual genetic and epigenetic profile, the fate of healthy tissues of people exposed. Following initial breaks and chromatin destabilization, a set of post-translational modifications of histones occurs, including the phosphorylation of serine 139 of histone H2AX (gamma-H2A.X), which leads to the formation of ionizing radiation-induced foci (IRIF). DSB repair results in the disappearance of most IRIF within hours after exposure. However, a proportion of IRIF remains 24 hours upon irradiation. The nature and role of these persistent IRIF are still unclear. The goal of this work is to explore the characteristics of these persistent IRIF and their consequences on the cell behavior. To investigate the dynamic of IRIF in our model, we exposed G0/G1-phase synchronized HUVECs to 1 or 5 Gy of X-rays. IRIF were studied from 10 minutes up to 7 days after exposure by monitoring gamma-H2A.X foci, their temporal association with 53BP1 protein and PML NBs (Promyelocytic leukemia nuclear bodies), and their impact on cell proliferation. We analyzed a mean of 4 000 cells for each condition using an automated detection of nuclei and foci. The analysis of a large number of cells and foci allowed us to screen subpopulations of cells or foci through different characteristics, such as size, shape or cell cycle phase among others, and to weight their representativeness in the whole population of exposed cells. We identified that persistent gamma-H2A.X foci after irradiation had a size superior to 0.72 ± 0.11 µm² and always collocated with 53BP1. More than 70% of cells exposed to 5 Gy had at least one persistent IRIF 24 hours after exposure and we observed these persistent IRIF up to 7 days post irradiation. A significant spatial association between PML NBs and IRIF was observed from 10 minutes after exposure; at 24h post irradiation, around 90% of persistent IRIF were associated with PML NBs. Moreover we demonstrated that persistent IRIF did not block cell proliferation definitively. The frequency of IRIF was lower in daughter cells, probably due to a certain amount of asymmetric distribution of IRIF between them. We report a positive association between the presence of an IRIF and the likelihood of DNA missegregation by observation of mitotic catastrophes. Hence, the structure formed after the passage of a persistent IRIF across the S and G2 phases may impede the correct segregation of sister chromatids of the chromosome affected. Consequently, the nature of IRIF in the nucleus of daughter cells might differ before and after the first cell division due to an abnormal resolution of anaphase. The resulting atypical chromosomal assembly may be lethal or result in a gene dosage imbalance and possible enhanced genomic instability, and could lead to a patchwork of cell phenotypes
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Le, Peillet Jeanne. "Fonctions et régulations de la polo kinase Cdc5 dans l'adaptation aux dommages à l'ADN chez Saccharomyces cerevisiae." Electronic Thesis or Diss., Sorbonne université, 2022. http://www.theses.fr/2022SORUS353.
Full textAbstract:
Les dommages à l'ADN constituent une grave menace pour l'intégrité du génome. Lorsque l'ADN d'une cellule est endommagé, le point de contrôle des dommages à l'ADN les détecte et arrête le cycle cellulaire, laissant ainsi du temps pendant lequel la cellule peut réparer son ADN. Toutefois, si les dommages ne sont pas réparés après plusieurs heures, chez la levure Saccharomyces cerevisiae, les cellules finissent par reprendre leur cycle cellulaire malgré la persistance du dommage. Ce processus, appelé adaptation aux dommages de l'ADN, semble agir comme une dernière tentative de survie des cellules, bien qu'il favorise les mutations et l'instabilité génomique dans les cellules filles. Chez Saccharomyces cerevisiae, la polo-kinase Cdc5PLK1, impliquée par ailleurs dans de nombreux processus liés au cycle cellulaire, est critique pour l'adaptation. Cependant, ses cibles spécifiques de l'adaptation ne sont pas encore clairement définies, et son rôle exact dans ce processus reste incertain. Ces travaux de thèse font état de nos avancées sur les régulations transcriptionnelles et post-traductionnelles de Cdc5 en réponse à un dommage à l’ADN de type déstabilisation télomérique. En particulier, nous sommes parvenus à identifier des résidus de Cdc5 dont la phosphorylation module l’efficacité de l’adaptation et avons mis en évidence que le checkpoint de dommages à l’ADN provoque une régulation négative de l’expression de Cdc5 via l’action de Mec1, Rad53 et Ndd1, retardant l’adaptation. Ces travaux ont mené à la rédaction d’un article déposé sur bioRxiv et en cours de soumission. Par ailleurs, Cdc5 cible de nombreux substrats au cours d’un cycle cellulaire normal. Identifier les substrats spécifiques de l’adaptation permettrait de comprendre son rôle au sein de ce processus. Nous avons entrepris un crible à grande échelle en utilisant une méthode basée sur l’insertion aléatoire d’un transposon dans le génome entier et de façon unique (Saturated Analyses Transposons Assay in Yeast). De ce crible sont ressortis un certain nombre de gènes potentiellement impliqués dans l’adaptation et que nous avons analysé, à la fois à une échelle globale par Gene Ontology, et à une échelle assez fine, en repérant les gènes enrichis et en s’intéressant particulièrement aux gènes inclus dans un même complexe afin de gagner en robustesse. Dans les trois expériences indépendantes menées pour ce crible, nous voyons ressortir un certain nombre de complexes, notamment MRX, qui est impliqué dans les voies de réparation de l’ADN, la gestion du stress réplicatif et qui participe à l’activation du checkpoint de dommages à l’ADN. En plus des analyses bio-informatiques, l’implication potentielle des gènes du complexe MRX a été testée expérimentalement. Cdc5 joue un rôle essentiel dans l’adaptation au dommage à l’ADN, mais son rôle dans ce processus reste mal défini. Nous avons mis en évidence que Cdc5 est fortement phosphorylée et que ses sites de phosphorylation régulent l’efficacité de l’adaptation, et est aussi régulée au niveau de sa quantité. D’autre part, nous avons réalisé une caractérisation approfondie des gènes candidats détectés par nos cribles, ce qui aide à révéler les mécanismes moléculaires de l’adaptationDNA damage is a serious threat to genome integrity. When a cell's DNA is damaged, the DNA damage checkpoint detects it and stops the cell cycle, allowing time for the cell to repair its DNA. However, if the damage is not repaired after several hours, in the yeast Saccharomyces cerevisiae, the cells eventually resume their cell cycle despite the persistence of the damage. This process, called adaptation to DNA damage, appears to act as a last-ditch attempt at cell survival, although it promotes mutations and genomic instability in the daughter cells. In Saccharomyces cerevisiae, the Cdc5PLK1 polo-kinase, otherwise involved in many cell cycle-related processes, is critical for adaptation. However, its specific targets in adaptation are not yet clearly defined, and its exact role in this process remains unclear. In this thesis, we report on the transcriptional and post-translational regulation of Cdc5 in response to telomere destabilization-type DNA damage. In particular, we identified Cdc5 residues whose phosphorylation modulates adaptation efficiency and demonstrated that the DNA damage checkpoint down-regulates Cdc5 expression via the action of Mec1, Rad53 and Ndd1, delaying adaptation. This work has led to the writing of a paper filed on bioRxiv and currently being submitted. Moreover, Cdc5 targets many substrates during a normal cell cycle. Identifying the specific substrates of adaptation would help to understand its role in this process. We undertook a large-scale screen using a method based on random insertion of a transposon in the whole genome in a unique way (Saturated Analyses Transposons Assay in Yeast). From this screen, a certain number of genes potentially involved in adaptation emerged and we analyzed them, both on a global scale using Gene Ontology, and on a fairly fine scale, by identifying enriched genes and by focusing on genes included in the same complex in order to gain robustness. In the three independent experiments conducted for this screen, we see a number of complexes stand out, notably MRX, which is involved in DNA repair pathways, replicative stress management and participates in DNA damage checkpoint activation. In addition to the bioinformatics analyses, the potential involvement of the MRX complex genes was tested experimentally. Cdc5 plays an essential role in adaptation to DNA damage, but its role in this process remains poorly defined. We have shown that Cdc5 is highly phosphorylated and that its phosphorylation sites regulate the efficiency of the adaptation, and is also regulated in its quantity. On the other hand, we performed an extensive characterization of the candidate genes detected by our screens, which helps to reveal the molecular mechanisms of adaptation
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Audebert, Marc. "Caractéristisation de formes mutantes et polymorphes du gène de réparation de l'ADN hOGG1 dans des tumeurs humaines." Paris 7, 2002. http://www.theses.fr/2002PA077013.
Full text
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MEYER, Vincent. "Détection d'homologies lointaines à faibles identités de séquences : Application aux protéines de la signalisation des dommages de l'ADN." Phd thesis, Université Paris-Diderot - Paris VII, 2007. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00361212.
Full textAbstract:
L'objectif de mon doctorat est de développer une méthode d'analyse des séquences protéiques permettant de cribler, le plus efficacement possible, les alignements non significatifs produits par le logiciel PSI-BLAST afin d'identifier des relations d'homologies lointaines. La stratégie développée repose sur deux étapes de criblage, une première s'appuyant sur les prédictions de structures secondaires, une seconde tirant profit du développement récent de méthodes de comparaison profil/profil performantes. La méthode développée a été initialement calibrée sur une base de données de séquences particulière. Cette base rassemble des séquences de domaines dont les structures sont connues permettant ainsi de contrôler l'existence effective d'homologues lointains. Cette phase a permis d'établir les seuils de détection optimaux permettant une utilisation semi-automatique du programme. Dans une seconde phase, la méthode a été testée sur un ensemble de 100 protéines impliquées dans la signalisation et la réparation des dommages de l'ADN. Au travers de différents exemples, nous montrons les potentialités du programme développé pour des recherches d'homologies lointaines à grande échelle. En particulier, mon étude suggère une nouvelle hypothèse pour comprendre l'origine d'une maladie rare, le syndrome de Nijmejen, provoqué par une mutation dans la protéine Nbs1.
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Lafont, Florian. "Implication des modifications post-traductionnelles de DNA-PKcs dans la régulation de la réponse aux dommages à l'ADN." Thesis, Nantes, 2017. http://www.theses.fr/2017NANT1023/document.
Full textAbstract:
Les cellules humaines sont soumises à des stress induisant des cassures double-brin de l’ADN principalement réparées par la voie NHEJ, où la kinase DNA-PKcs joue un rôle central. L’activité de DNA-PKcs, régulée par de nombreuses phosphorylations, est cruciale pour le maintien de l’intégrité génomique. Plus récemment, il a été montré que cette protéine était également modifiée par l’O-GlcNAcylation dans la lignée COS7. Sachant l’équilibre existant entre phosphorylation et O-GlcNAcylation, nous avons étudié le rôle de cette nouvelle MPT dans la régulation de l’activité de DNA- PKcs. Nous avons montré que DNA-PKcs est O-GlcNAcylée dans les cellules HeLa. Puis nous avons montré que la modulation de l’O-GlcNAcylation de DNA-PKcs impacte son autophosphorylation en Ser2056, suggérant l’existence d’une balance O-GlcNAcylation /phosphorylation, ainsi que la capacité des cellules à réparer les DSBs par la voie NHEJ. De plus, nos résultats nous laissent envisager que cette modification puisse jouer un rôle dans la stabilité de la protéine. DNA-PKcs est une cible potentielle dans les stratégies de lutte contre le cancer. Nous avons étudié l’impact d’un composé sur DNA-PKcs. Cette molécule provoque une réduction de la quantité et de l’activité de DNA-PKcs, impliquant son ubiquitinylation et sa dégradation par le protéasome et menant à une sensibilisation des cellules à un traitement génotoxique. Dans ce contexte, nous avons développé une puce à anticorps pour évaluer le profil phosphoprotéique des voies de réparation de l’ADN et ainsi évaluer l’effet d’inhibiteurs de DNA-PKcs. L’ensemble de ces résultats contribuent à une meilleure compréhension de la régulation de DNA-PKcsHuman cells are subjected to stresses inducing DNA double-strand breaks mainly repaired by the NHEJ pathway, where the kinase DNA-PKcs plays a central role. The activity of DNA-PKcs, regulated by numerous phosphorylations, is crucial for the maintenance of genomic integrity. More recently, it has been shown that this protein is also modified by O-GlcNAcylation in the COS7 cell line. Knowing the balance between phosphorylation and O-GlcNAcylation, we studied the role of this new PTM in the regulation of DNA-PKcs activity. We have shown that DNA-PKcs is O-GlcNAcylated in HeLa cells. We then showed that the modulation of DNA-PKcs O-GlcNAcylation affects its autophosphorylation on Ser2056, suggesting an O-GlcNAcylation/phosphorylation balance, as well as the ability of cells to repair DSBs by NHEJ pathway. Moreover, our results allow us to consider that this modification may play a role in protein stability. DNA-PKcs is a potential target in anticancer strategies. We studied the impact of a chemical compound on DNA-PKcs activity. This molecule causes a reduction in the amount and activity of DNA-PKcs, through its ubiquitinylation and its degradation by the proteasome and leading to sensitization of the cells to genotoxic treatment. In this context, we have developed an antibody microarray to evaluate the phosphoprotein level of DNA repair pathways and thus estimate the effect of DNA-PKcs inhibitors. All these results contribute to a better understanding of the regulation of DNA-PKcs
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Meloche, Jolyane. "Nouvelles avenues thérapeutiques dans l'hypertension artérielle pulmonaire : un regard sur la réparation des dommages à l'ADN et l'épigénétique." Doctoral thesis, Université Laval, 2018. http://hdl.handle.net/20.500.11794/31446.
Full textAbstract:
L’hypertension artérielle pulmonaire (PAH) est une condition clinique rare caractérisée par une augmentation progressive de la résistance vasculaire pulmonaire menant à une défaillance cardiaque droite. Sur le plan histologique, plusieurs processus coexistent au sein des artères pulmonaires, notamment de l’inflammation, une vasoconstriction et un remodelage vasculaire. Ce dernier est principalement la conséquence d’une prolifération incontrôlée des cellules musculaires lisses (PASMC) résidentes et d’une résistance à l’apoptose de celles-ci. À ce titre, la PAH présente de fortes similitudes avec le cancer. En dépit d’une augmentation des connaissances des mécanismes physiopathologiques et des progrès dans la prise en charge des patients, cette maladie demeure toujours incurable avec un taux de survie de 60% à 5 ans. Il est donc nécessaire de trouver de nouvelles avenues thérapeutiques pour ces patients. Plusieurs stress environnementaux sont présents dans la PAH, notamment l'inflammation, le stress de cisaillement et la pseudo-hypoxie. Malgré ces conditions favorisant les dommages à l’ADN, les cellules vasculaires sont prolifératives et résistantes à l’apoptose. Par des études translationnelles basées sur des tissus humains, nous avons mis en évidence le rôle du dommage à l’ADN et des mécanismes épigénétiques dans la physiopathologie de la PAH. De par ses similitudes avec le cancer, nous nous sommes d’abord intéressés à la poly(ADPribose) polymérase 1 (PARP-1), une enzyme clé dans les processus de réparation de l’ADN et dans le contrôle de la survie cellulaire. Dans le chapitre 2, nous montrons que les poumons, les artères pulmonaires et les PASMC isolées de patients atteints de PAH présentent davantage de dommages à l’ADN et une surexpression de PARP-1. De manière intéressante, nous avons montré que PARP-1 pouvait réguler des facteurs de transcription impliqués dans la pathogénèse de la PAH tels que HIF-1α (Hypoxia-inducible factor 1- alpha) et NFAT (Nuclear factor of activated T-cells). La surexpression de PARP-1 entraînait également la diminution d’expression du microARN miR-204, un autre acteur clé de la maladie. L’effet thérapeutique des inhibiteurs de PARP-1 a été évalué dans deux modèles animaux de la PAH. L’administration de ces inhibiteurs a diminué le remodelage vasculaire pulmonaire et amélioré les paramètres hémodynamiques. De plus, l’inhibiteur pharmacologique de PARP-1 était plus efficace que les traitements de première ligne offerts aux patients atteints de PAH. Dans le chapitre 3, nous avons étudié les mécanismes par lesquels PARP-1 était surexprimé dans la PAH. En se basant sur des études dans le cancer et sur des prédictions bio-informatiques, nous nous sommes intéressé au microARN miR-223. Nous avons démontré que miR-223 est diminué au niveau vasculaire pulmonaire et dans les PASMC isolées de patients atteints de PAH. Par une approche bidirectionnelle, nous avons mis en évidence qu’une augmentation de HIF-1α diminue l’expression de miR-223 et que la diminution de miR-223 entraîne une augmentation de PARP-1, ce qui favorise la réparation des dommages à l’ADN. Nous avons montré que la diminution de miR-223 était également associée à une augmentation de la prolifération des PASMC et de la résistance à l’apoptose de celles-ci. Dans un modèle animal de la maladie, nous avons montré que l’augmentation ectopique de miR-223, à l’aide de mimic, permettait d’améliorer les paramètres hémodynamiques pulmonaires et cardiaques. Dans le chapitre 4, nous avons étudié un mécanisme épigénétique en aval de PARP-1 et miR-204. Nous avons montré que le lecteur épigénétique BRD4 (Bromodomain-containing protein 4) était surexprimé dans les tissus pulmonaires de patients atteints de PAH. Les lecteurs épigénétiques se lient aux queues acétylées des histones afin de favoriser la transcription de différents gènes. Dans la PAH, nous avons mis en évidence que BRD4 régule l’expression d’oncogènes impliqués dans la physiopathologie de la maladie, tels que p21, NFAT, Bcl-2 et Survivin. BRD4 régule également le métabolisme mitochondrial des PASMC. Nous avons montré que l’inhibition de BRD4 permettait de diminuer la prolifération, d’augmenter l’apoptose et de restaurer l’activité mitochondriale des PASMC. L’utilisation d’inhibiteurs de BRD4 dans un modèle de rat atteints de PAH a permis de mettre en évidence le potentiel thérapeutique de l’inhibition de ce lecteur épigénétique dans la PAH. En conclusion, ces études ont permis de mettre en lumière de nouvelles voies de signalisation impliquées dans la physiopathologie de la PAH et d’ouvrir la porte à de nouvelles avenues thérapeutiques dans le traitement de cette maladie toujours incurable.Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a rare clinical condition characterized by a progressive increase in pulmonary vascular resistance leading to right heart failure and death. Histologically, several processes coexist within the pulmonary arteries, including inflammation, vasoconstriction and vascular remodeling. Remodeling of the pulmonary vessel is due to abnormal and uncontrolled growth of resident pulmonary artery smooth muscle cells (PASMC). As such, PAH exhibits some cancer-like characteristics. In spite of recent progress in understanding the pathophysiological mechanisms involved in disease development and progression, as well as major improvements in symptomatic treatments, no substantial modification in the fatal course of this disease has been achieved. The mean survival rate is about 60% 5 years after diagnosis. Therefore, the identification of new targets has become mandatory. PAH is associated with sustained inflammation, oxidative stress, shear stress and pseudo-hypoxia, all known to promote DNA damage. Despite these unfavorable environmental conditions, PAH PASMC exhibit increased proliferation and resistance to apoptosis. Using a translational approach, we highlighted the role for DNA damage signaling and epigenetic mechanisms in the pathophysiology of PAH. Since PAH shares many hallmarks with cancer, we first studied Poly(ADP-ribose) polymerase-1 (PARP-1), a key enzyme in DNA repair mechanisms and in cell survival in the pathophysiology of PAH. In Chapter 2, we demonstrate that PAH is associated with sustained DNA damage leading to PARP-1 activation. Interestingly, we showed that PARP-1 overexpression triggers the expression and activation of transcription factors known to be implicated in PAH progression, such as HIF-1α (Hypoxia-inducible factor 1-alpha) and NFAT (Nuclear factor of activated T-cells). Overexpression of PARP-1 alsoresulted in decreased expression of microRNA miR-204, another key player in the disease. In animal studies, administration of a clinically available PARP-1 inhibitor decreased PAH in two experimental rat models. In addition, PARP-1 inhibitor was more effective than the first-line treatments offered to patients with PAH. In Chapter 3, we investigated the mechanisms by which PARP-1 was overexpressed in PAH. In silico analyses and studies in cancer demonstrated that miR-223 downregulation triggers PARP-1 overexpression. We provided evidence that miR-223 is downregulated in human PAH lungs, distal pulmonary arteries, and isolated PASMC. Furthermore, using a gain and loss of function approach, we showed that increased HIF-1α (hypoxia-inducible factor 1α), which is observed in PAH, triggers this decrease in miR-223 expression and subsequent overexpression of PARP-1 allowing PAH-PASMC proliferation and resistance to apoptosis. We also demonstrated that restoring the expression of miR-223, by using a mimic, allowed to improve pulmonary and cardiac hemodynamic parameters. In Chapter 4, we investigated epigenetic mechanisms downstream of PARP-1 and miR- 204. Interestingly, the epigenetic reader BRD4 (Bromodomain-containing protein 4) is a predicted target of miR-204 and has binding sites on NFAT’s promoter region. In our study, we showed that BRD4 is upregulated in lungs, distal pulmonary arteries and PASMC of PAH patients. Epigenetic readers bind to acetylated histone tails to promote gene transcription. In PAH, we demonstrated that BRD4 increases the expression of oncogenes involved in PAH pathogenesis, such as NFAT, Bcl-2, p21 and Survivin. BRD4 also regulates mitochondrial metabolism of PASMC. Blocking this oncogenic signature led to decreased proliferation and increased apoptosis of PAH-PASMC in a BRD4-dependant manner. In addition, pharmacological or molecular inhibition of BRD4 reversed established PAH in a rat model of the disease. In conclusion, these studies showed a key role for DNA damage signaling and epigenetic mechanisms in PAH pathophysiology. Our studies also offer new therapeutic perspectives for patients with PAH.
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Szalat, Raphaël. "Rôle des voies de réparation des dommages de l'ADN dans l'instabilité génomique observée au cours du myélome multiple." Thesis, Sorbonne Paris Cité, 2019. http://www.theses.fr/2019USPCC094.
Full textAbstract:
Le myélome multiple (MM) est une hémopathie maligne caractérisée par la prolifération clonale de plasmocytes. Le MM est cliniquement et moléculairement hétérogène et comprend différents sous-groupes avec des pronostics différents. Divers événements génomiques, notamment des translocations récurrentes impliquant le gène des immunoglobulines (Ig) avec différents partenaires, des anomalies chromosomiques et de nombreuses mutations contribuent à l'hétérogénéité de la maladie. Si les translocations impliquant le Ig gene sont supposées survenir durant la maturation des lymphocytes B, les mécanismes conduisant au large spectre des lésions de l'ADN observées au cours du MM restent largement méconnus. Les processus de réparation des dommages de l’ADN sont largement impliqués dans l’instabilité génomique et la résistance aux chimiothérapies endommageant l’ADN comme les agents alkylants. Ces derniers, demeurent l’un des traitements de référence du MM malgré l’arrivée de nouveaux traitements efficaces qui ont amélioré de façon significative la survie globale des patients, à l’exception des patients à haut risque qui ont encore une survie courte avec une médiane de survie inférieure à 3 ans. Dans ce travail, nous avons étudié les mécanismes impliqués dans l’hétérogénéité génomique observée au cours du MM. En particulier, nous avons utilisé des méthodes de séquençage de nouvelle génération pour caractériser les processus mutationnels et l’existence de gènes de fusion dans une grande cohorte de patients. De plus, nous avons concentré notre analyse génomique sur le sous-groupe de myélome avec translocation t(4; 14) en étudiant un groupe de 58 patients avec cette translocation. Nous avons ainsi identifié de nouvelles mutations «driver» de ce sous-groupe de MM associé à un mauvais pronostic, affectant ATM, ATR, FGFR3 et PRKD2. Enfin, nous avons combiné les données de séquençage de nouvelle génération et un nouveau test fonctionnel pour évaluer le rôle de la réparation des lésions de l’ADN parexcision de nucléotides (NER) dans la résistance aux agents alkylants et avons pu cibler thérapeutiquement ce mécanisme à l’aide de petites molécules. Au total, nos données révèlent un rôle majeur des processus de réparation des dommages de l'ADN dans lagénération de mutations exprimées et dans la résistance aux agents alkylants. Par ailleurs, nous avons identifié de nouveaux marqueurs d'instabilité génomique spécifiques aux MM avec t(4; 14) et de nouveaux gène de fusion impliqués dans la progression de la maladie. Nos résultats suggèrent qu'une stratégie thérapeutique ciblant le NER et en particulier l’hélicase XPB peut être efficace pour traiter le MM et sensibiliser les cellules aux agents alkylants. Nos résultats ont identifié le rôle et l’impact de certains mécanismes de réparation des dommages de l’ADN dans la biologie du MM ainsi que de nouvelles cibles thérapeutiquesMultiple myeloma (MM) is a malignant hemopathy characterized by clonal proliferation of plasma cells. MM is clinically and molecularly hetereogenous and featured by different subgroups of MM with different prognosis. Various recurrent genomic events including reccurent translocations involving the immunoglobulin (Ig) gene, chromosomal abnormalities and various mutations contribute to MM heterogeneity. While the recurrent translocations the Ig gene gene are considered to occur during the Ig gene rearrangement, the maturation affinity or the isotype switch that are part of the B cell maturation process, the mechanisms leading to the observed wide spectrum of DNA lesions in MM remain largely unknown. DNA damage and repair pathways play an important role in DNA damage response, genome instability and resistance to DNA damage chemotherapies such as alylating agents that remain the gold standard of therapy despite the advent of new and effective treatments that have markedly improved patient’ survival with the exception of high-risk patients that still have short overall survival with a median inferior to 3 years. In this work, we have investigated the mechanisms involved in the complex genomic heterogeneity observed in MM. In particular we used next generation sequencing methods to characterize the mutational processes and the fusion genes landscape in a large cohort of MM patients. In addition, we have focused our genomic analysis on the myeloma subgroup harboring t(4; 14) translocation by studying a group of 58 t(4;14) MM. We identified new potential driver of this poor prognosis MM subgroup including mutations in ATM/ATR, FGFR3 and PRKD2. Finally, we combined next generation sequencing data and a novel functionnal assay to assess the role of nucleotide excision repair (NER) in resistance to alkylating agents. Altogether our data reveal a major role of DNA damage repair processes in the generation of expressed mis-sense mutations, and in resistance to alkylating agents, new markers of genomic instability specific to t(4; 14)MM and new fusion gene. Finally, our results suggest that a therapeutic strategy targeting the NER, and especially the helicase XPB, is potentially efficient to treat MM, and to sensitize cells to alkylating agents. Altogether, our data highlighted the impact of distinct DNA damage and repair mechanisms in MM biology and identified new potential therapeutic targets
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Meyer, Vincent. "Détection d'homologies lointaines à faibles identités de séquences : Application aux protéines de la signalisation des dommages de l'ADN." Paris 7, 2007. http://www.theses.fr/2007PA077021.
Full textAbstract:
L'objectif de mon doctorat est de développer une méthode d'analyse des séquences protéiques permettant de cribler, le plus efficacement possible, les alignements non significatifs produits par le logiciel PSI-BLAST afin d'identifier des relations d'homologies lointaines. La stratégie développée repose sur deux étapes de criblage, une première s'appuyant sur les prédictions de structures secondaires, une seconde tirant profit du développement récent de méthodes de comparaison profil/profil performantes. La méthode développée a été initialement calibrée sur une base de données de séquences particulière. Cette base rassemble des séquences de domaines dont les structures sont connues permettant ainsi de contrôler l'existence effective d'homologues lointains. Cette phase a permis d'établir les seuils de détection optimaux permettant une utilisation semi-automatique du programme. Dans une seconde phase, la méthode a été testée sur un ensemble de 100 protéines impliquées dans la signalisation et la réparation des dommages de l'ADN. Au travers de différents exemples, nous montrons les potentialités du programme développé pour des recherches d'homologies lointaines à grande échelle. En particulier, mon étude suggère une nouvelle hypothèse pour comprendre l'origine d'une maladie rare, le syndrome de Nijmejen, provoqué par une mutation dans la protéine Nbs1The aim of my PhD thesis lay in the development of a new automatic approach for efficiently detecting remote homologues lost in the non significant output of PSI-BLAST program. My strategy is based on a two steps procedure : first, we take advantage of secondary structure predictions, second, based on the recent development of highly sensitive profil/profil comparison method. The method was initially calibrated on a sequence database. This database gathers sequences of domains whose structures so that effective existence of remote homologies could be controlled. This step was essential to deduce the optimal thresholds leading to the best detection capabilities for a semi-automatic use of the program. In a second step, the method was tested on a set of 100 protein sequences involved in DNA damage signalling and repair. Through various examples, we show the potentialities of the developed program for the large scale analysis of remote homologies in protein sequences. In particular, my work stimulated a new hypothesis for the understanding of the defects observed in a rare disease, the Nijmejen breakage syndrome, brought about by a mutation in the Nbs1 gene
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Bouzid, Hana. "Réponse cellulaire induite par les dommages de l'ADN créés par les ecteinascidines, une classe unique de médicaments anticancéreux." Thesis, Paris 6, 2015. http://www.theses.fr/2015PA066502.
Full textAbstract:
Les ectéinascidines (la trabectédine, la lurbinectédine) sont de nouveaux dérivés de produits naturels marins qui se lient de façon covalente à l'ADN, actifs contre les cancers chimio-résistants. L'objectif de ma thèse est 1) d'identifier les principales voies de transduction activées en réponse à l'apparition des lésions de l'ADN induites par les ETs 2) d'établir si l'abrogation pharmacologique de la réponse cellulaire induite par l'endommagement de l'ADN (ATM, ATR, Chk1, Chk2) peut moduler l'activité thérapeutique des ETs. Dans un premier temps, nous avons montré que la voie ATR/Chk1 activée principalement en réponse à l'apparition d'un stress réplicatif et la voie ATM/Chk2 qui initie la réponse cellulaire suite à la formation de lésions double-brins, sont activées en réponse aux adduits créés par les ETs. Dans un second temps, nous avons montré que les combinaisons des ETs avec les inhibiteurs Chk1/Chk2 ou les inhibiteurs ATR ou ATM seuls s'accompagnent d'une modeste potentialisation. Inversement, la combinaison simultanée des ETs avec les inhibiteurs ATR et ATM entraine une forte synergie dans les modèles du cancer de l'utérus et de l'ovaire sensibles ou résistants au cisplatine. Enfin, nous avons montré que cette potentialisation passe par l'inhibition du recrutement des protéines impliquées dans l'initiation et la réalisation des mécanismes de réparation par recombinaison homologue. Ces résultats suggèrent qu'en inhibant simultanément les vois initiés par ATR et ATM, l'activité thérapeutique des ETs pourrait être potentialisée en cliniqueEcteinascidins (Trabectedin, Lurbinectedin) are novel marine derived natural products, DNA minor groove binders and active against chemo-resistant cancers. The purpose of my thesis was to 1) characterize the DNA damage response (DDR) to both trabectedin and lurbinectedin 2) to establish whether the pharmacological abrogation of cell response induced by DNA damage (ATM, ATR, Chk1, Chk2) can modulate the therapeutic activity of ETs. Our results show that both compounds activate the ATM/Chk2 (ataxia-telangiectasia mutated/checkpoint kinase 2) and ATR/Chk1 (ATM and RAD3-related/checkpoint kinase 1) pathways. Interestingly, the pharmacological inhibition of either Chk1/2, ATR or ATM kinases is not accompanied by a significant improvement of either trabectedin or lurbinectedin cytotoxic activity. However, the simultaneous inhibition of both ATM and ATR strongly potentiates the activity of both ETs. Importantly, these results are not restricted to HeLa cells but can also be extended to cisplatin-sensitive or -resistant ovarian carcinoma cell lines. Finally, we showed that the concomitant inhibition of both ATR and ATM is an absolute requirement to efficiently block the initiation and realization of homologous recombination repair mechanisms. Together, our data identify ATR and ATM as central coordinators of the DDR to trabectedin and lurbinectedin and provide a mechanistic rational for combinations of these compounds with both ATR and ATM inhibitors
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TRUCCO, CARLOTTA. "La poly(adp-ribose)polymerase : analyse mutationnelle de son domaine de liaison a l'adn ; reponses cellulaires aux dommages dans l'adn a l'aide de cellules et de souris deficientes." Université Louis Pasteur (Strasbourg) (1971-2008), 1998. http://www.theses.fr/1998STR13030.
Full textAbstract:
La poly(adp-ribose) polymerase (parp) est une enzyme nucleaire, impliquee dans la reponse cellulaire aux dommages generes dans l'adn par des agents genotoxiques, tels que les agents alkylants et les radiations ionisantes. En se fixant sur les coupures de l'adn, la parp catalyse la formation d'un polymere d'adp-ribose, greffe de maniere covalente sur la parp elle-meme ou sur des proteines nucleaires acceptrices. Afin d'explorer la fonction de liaison a l'adn dont depend l'activite catalytique de la parp, nous avons selectionne, par mutagenese aleatoire du domaine de liaison a l'adn (dbd), des proteines recombinantes criblees pour leur perte d'activite catalytique. Ces proteines portant une mutation ponctuelle sur le dbd conservent encore leur capacite a lier l'adn et a dimeriser. Afin de mieux comprendre le role physiologique de la parp, nous avons etabli dans un premier temps des lignees cellulaires surexprimant constitutivement le dbd, mutant dominant-negatif, qui inhibe l'activite de l'enzyme. Les lignees generees montrent une sensibilite aux agents alkylants qui se traduit par une augmentation du temps de doublement, une diminution de la survie cellulaire, une augmentation d'echanges de chromatides soeurs et une accumulation des cellules dans la phase g2/m du cycel cellulaire 24 heures apres le stress genotoxique. Dans un deuxieme temps, nous avons genere des souris deficientes en parp par l'inactivation du gene. Les souris parp -/- sont viables et ne possedent pas d'anomalies macroscopiques. Par contre, elles sont extremement sensibles aux agents genotoxiques comme les radiations ionisantes et le methyl-nitroso-uree (mnu). Un defaut dans la reparation par excision de base a ete mis en evidence dans les cellules deficientes en parp. De plus, les cellules parp -/- montrent une instabilite genomique elevee, un arret du cycle cellulaire en phase g2/m et le declenchement plus rapide du processus apoptotique concomitant a une accumulation de la proteine p53, apres traitement aux agents alkylants monofonctionnels. Ces resultats suggerent que la parp est impliquee dans la reparation par excision de base.
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Chollat-Namy, Alexia. "Nouvelles sondes nucléiques pour la mesure d'activités enzymatiques de réparation des dommages de l'ADN par un test de fluorescence." Université Joseph Fourier (Grenoble), 2006. http://www.theses.fr/2006GRE10131.
Full textAbstract:
Les methodes classiques disponibles pour mesurer l'activite enzymatique de reparation des lesions de l'adn par des adn n-glycosylases sont longues et laborieuses a mettre en Œuvre (analyse par electrophorese sur gel couplee au marquage par un isotope radioactif ou encore par chromatographie liquide haute performance). Nous avons developpe dans le present travail, une nouvelle methode de quantification precise et aisee des activites de reparation basee sur une detection utilisant le principe physique du fret (transfert par resonance d'energie de fluorescence). Pour ce faire, un substrat d'adn original a ete conÇu : une structure autocomplementaire contenant des lesions specifiques dans la sequence double brin de l'epingle a cheveux et, ayant les deux extremites marquees par des chromophores. L'excision de la lesion par des adn n-glycosylases conduit a la separation des brins complementaires, induisant une diminution du processus de « quenching » de fluorescence. L'excision est donc detectee et quantifiee par l'augmentation de l'intensite du signal d'emission du fluorophore. Apres avoir etabli la linearite de la reponse du test, nous avons utilise cette approche experimentale pour acceder aux parametres cinetiques caracteristiques des enzymes de reparation. La validite de ces parametres a ete controlee par comparaison avec les donnees obtenues par analyse sur gel d'acrylamide (egpa). Les possibles applications de notre test en tant qu'outil de screening pour la detection d'activite de reparation ou d'inhibition enzymatique, sur enzymes purifiees ou a partir d'extraits cellulaires ont ete investiguees. Enfin, un projet de miniaturisation du format de lecture dans un microsysteme de type « lab-on-a-chip » a ete mene. L'ensemble des resultats obtenus prouve la pertinence de notre methode d'analyse en phase homogene, en vue d'extensions a l'analyse parallelisee haut debit pour des applications en recherche fondamentale, biomedicale et pharmaceutiqueClassical analysis methods for enzymatic dna repair activity monitoring are tedious and time-consuming (gel electrophoresis coupled to isotope labeling or high performance liquid chromatography). Hence, we developed a new dna repair assay based on fret (fluorescent resonance energy transfer) detection. This has required the design of an original dna probe: a hairpin structure containing specific lesions located at defined sites within the stem sequence, close to the chromophore-labeled extremities. The lesion excision by dna n-glycosylases leads to the complementary strand separation, causing a drop in fluorescence quenching. Thus, the cleavage extent is reflected by the fluorophore emission intensity increase and stabilization over the repair reaction time-course. After proving the linearity of the assay response, we demonstrated the ability of the current method to give access to repair enzyme kinetic parameters. The relevance of these parameters was checked by comparison to values, obtained by page analyses. Then, we investigated the capability of our test to be used as a high-throughput screening tool to quantify enzymatic repair activities and check inhibition effects (by using purified enzymes or cell extracts). Finally, a miniaturization project was carried out to improve the sensitivity of this new detection method. The performance of this homogeneous liquid-phase assay should lead to applications in the bioanalytical field related to fundamental, biomedical and pharmaceutical research
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Kerninon, Erwan Patrice Thierry. "Utilisation du test des comètes dans l'étude des dommages sur l'ADN et de leurs réparations après traitement par photochimiothérapie." [S.l.] : [s.n.], 2003. http://theses.univ-nantes.fr/thesemed/PHkerninon.pdf.
Full text
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Fages, Jérémie. "JMJD6 participe au maintien de l'intégrité de l'ADN ribosomique en réponse au dommage à l'ADN." Thesis, Toulouse 3, 2020. http://www.theses.fr/2020TOU30169.
Full textAbstract:
L'ADN est continuellement endommagé par des agents exogènes et endogènes générant des dommages à l'ADN. Un défaut dans la prise en charge de ces dommages peut générer des mutations à l'origine de pathologies telle que le cancer. Afin de maintenir l'intégrité du génome, les cellules ont mis en place des mécanismes de réparation qui se déroulent dans un contexte chromatinien. Celui-ci est façonné par de nombreuses modifications post-traductionnelles des histones qui sont régulées en réponse aux dommages à l'ADN pour permettre une réparation efficace. Parmi ces modifications, la méthylation des histones joue un rôle majeur. C'est une modification réversible et dynamique gérée par les histones méthyltransferases et les histones déméthylases. A l'aide d'un crible, nous avons identifié l'histone déméthylase JMJD6 dont la déplétion altère la réponse aux dommages à l'ADN et la survie cellulaire après irradiation. Nous observons que JMJD6 est spécifiquement et rapidement recruté dans le nucléole lorsque les dommages sont produits dans cette structure. De plus, JMJD6 influence la relocalisation de l'ADN ribosomique en réponse aux dommages dans une structure nouvellement formée en périphérie du nucléole, le nucleolar cap, sans affecter l'arrêt de transcription de l'ADNr. La délocalisation dans les nucleolar caps serait impliquée dans la gestion de la réparation des dommages afin d'éviter les réarrangements recombinogènes nuisible pour la cellule. Or, la suppression de l'expression de JMJD6 cause davantage d'instabilité génétique de l'ADNr par perte ou réarrangement des unités de l'ADNr. Afin de comprendre les mécanismes sous-jacents au rôle de JMJD6 dans la réparation de l'ADNr, nous avons créé des lignées cellulaires génétiquement modifiées exprimant une forme étiquetée de JMJD6. Ces dernières nous ont permis d'identifier par des approches protéomiques les partenaires de JMJD6 en absence et en réponse aux dommages. Parmi ceux-ci, la protéine nucléolaire Treacle qui est impliquée dans le recrutement de NBS1, un acteur bien connu de la réponse aux dommages à l'ADN, dans le nucléole en réponse aux dommages. L'ensemble de mes travaux montre un découplage entre l'arrêt de transcription de l'ADNr et la formation du nucleolar cap suggérant l'existence d'évènements les liant auxquels JMJD6 pourrait être impliqué et ainsi favoriser le maintien de la région de l'ADNrDNA is continuously damaged by exogenous and endogenous agents producing DNA damages. A defect in the management of this damage can lead to mutations that cause pathologies such as cancer. In order to maintain the integrity of the genome, the cells have evolved repair mechanisms that take place in a chromatinian context. It is shaped by numerous post-translational histone modifications that are regulated in response to DNA damage to allow effective repair. Among these modifications, histone methylation plays a major role in DNA repair. It is a reversible and dynamic modification managed by methyltransferase histones and demethylase histones. Using a screen, we identified histone demethylase JMJD6 whose depletion alters DNA damage response and cell survival after irradiation. We observe that JMJD6 is specifically and rapidly recruited into the nucleolus upon damage induced in this structure. In addition, JMJD6 influences the relocation of ribosomal DNA in response to damage in a newly formed structure at the periphery of the nucleolus, the nucleolar cap, without affecting the transcription inhibition of rDNA. Relocation in nucleolar caps would be involved in the management of damage repair to avoid harmful recombinogenic rearrangements for the cell (translocation and chromosomal rearrangement). Relevantly, JMJD6 depletion causes more genetic instability of rDNA by loss or rearrangement of rDNA units. In order to understand the mechanisms underlying the role of JMJD6 in rDNA repair, we have created genetically modified cell lines expressing a tagged version of JMJD6. These have allowed us to identify JMJD6 partners through proteomic approaches in absence and in response to the damage. Among these, the nucleolar protein Treacle which is involved in the recruitment of NBS1, a well-known actor in the response to DNA damage, into the nucleolus in response to damage. All my work shows a decoupling between the inhibition of rDNA transcription and the formation of nucleolar cap suggesting the existence of signaling mechanism in which JMJD6 could be involved and thus promote the maintenance of the rDNA region
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Ousset, Marielle. "Lien entre la signalisation des dommages de l'ADN et l'adaptation cellulaire à l'hypoxie : deux nouveaux rôles pour ATM (Ataxia Telangiectasia Mutated) et DNA-PK (protéine Kinase dépendante de l'ADN)." Toulouse 3, 2010. http://thesesups.ups-tlse.fr/907/.
Full textAbstract:
L'existence de zones hypoxiques est fréquemment observée dans les tumeurs humaines. Le régulateur central de la réponse à l'hypoxie est un facteur de transcription, HIF-1 (Hypoxia Inducible Factor 1), qui induit la transcription d'un grand nombre de gènes cibles, permettant l'adaptation des cellules à cet environnement hostile. HIF-1 est composé d'une sous-unité alpha, dégradée en normoxie, et d'une sous-unité beta constitutivement exprimée. Des arguments récents de la littérature suggèrent que l'hypoxie est impliquée dans l'activation de voies de réponse aux dommages de l'ADN. Cependant, les mécanismes d'initiation et les conséquences de leur activation sont peu connus. Au cours de ma thèse, je me suis intéressée à une famille de protéines de réponse au stress, les analogues de PI3K (Phosphatidyl Inositol 3 Kinase Like Kinase ou PI3KKs), comprenant entre autre les protéines ATM et DNA-PK et j'ai étudié leur activation en hypoxie et leur impact sur l'accumulation de HIF-1. Ainsi dans un premier temps, nous avons pu montrer que l'absence chronique de la protéine ATM est associée à une augmentation de l'expression des deux sous-unités alpha et beta du complexe HIF-1, en normoxie et en hypoxie. Outre un rôle dans l'adaptation à l'hypoxie, cet effet serait important afin d'expliquer certains aspects de l'Ataxie Telangiectasie, syndrome associé à l'absence d'ATM chez l'homme. Dans un deuxième temps, nous avons observé une activation d'ATM en condition d'hypoxie sévère (< 0. 1 % O2), avec de faibles conséquences sur l'accumulation de HIF-1. En revanche, nous avons montré que la protéine DNA-PK, impliquée dans la réparation des cassures doubles brins de l'ADN (CDBs), est activée en hypoxie, dès 1 % d'O2. Nos résultats suggèrent que la DNA-PK serait activée par une voie non classique, indépendante des CDBs. L'hypoxie est associée à des modifications des histones, parmi lesquelles l'acétylation, et nous avons démontré que ces modifications de la chromatine sont responsables de l'activation de la DNA-PK dans ces conditions. De plus, l'activation de la DNA-PK est impliquée dans le contrôle de la stabilité de HIF-1alpha, permettant l'adaptation cellulaire à l'hypoxie. Ensemble, nos résultats montrent un rôle des PI3KKs dans la régulation de HIF-1 et suggèrent que l'hypoxie induit une réponse aux dommages de l'ADN, favorisant l'adaptation des cellules à ce stress environnementalHypoxia is a frequent microenvironmental stress observed in human tumours. The key regulator of the cellular response to oxygen deprivation is the transcription factor, HIF-1 (Hypoxia Inducible Factor 1) whose function resulting in the induction of a plethora of target genes that collectively confers cellular adaptation to hypoxia. HIF-1 is comprised of an alpha sub-unit that is mainly targeted for degradation in normoxia whereas its beta sub-unit is constitutively expressed. Emerging evidences suggest that hypoxia induce a DNA damage response (DDR). However, the mechanism involved in the initiation of this DDR and the consequences of its activation are unknown. The goal of our project was to investigate the role of two proteins, which are involved in DDR belonging to the PI3KKs (Phosphatidyl Inositol 3 Kinase Like Kinase) family, ATM and DNA-PK, in the hypoxic response. We studied their activation and the consequences on HIF-1 accumulation in these conditions. So as a first step, we have demonstrated that the loss of ATM positively regulates the expression of both sub-units of HIF-1, in normoxia and hypoxia. Besides its role in the cellular adaptation to hypoxia, this effect might be important to explain some clinical features of Ataxia Telangiectasia, the disease associated to the mutation of ATM gene in humans. Moreover, we observed ATM activation in severe hypoxia (less than 0. 1% O2), with no consequences on HIF-1 accumulation. On the other hand, we have reported that DNA-PK, involved in double strand breaks (DSBs) signalling and repair, is activated in mild hypoxic conditions (less than 1 % O2). Our results suggest that its activation is independent from DSBs. Hypoxia is associated to histones modifications including acetylation and we demonstrated that these chromatin modifications are responsible for DNA-PK activation in hypoxic conditions. Finally, we have demonstrated that once activated DNA-PK regulates the stability of HIF-1alpha, promoting the cellular adaptation to hypoxia. Taken together, our results show a role of PI3KKs in HIF-1 regulation and suggest that hypoxia initiates DNA damage like-response, contributing to the adaptative response of cells to hypoxic conditions
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Larrieu, Delphine. "Identification de nouvelles fonctions suppressives de tumeurs pour ING2 : implication dans la réplication et la réponse aux dommages à l'ADN." Université Joseph Fourier (Grenoble), 2010. http://www.theses.fr/2010GRENV045.
Full textAbstract:
ING2 (INhibitor of Growth 2) est une protéine « candidate» suppressive de tumeurs appartenant à une famille de cinq protéines INGI à ING5. Les protéines ING sont impliquées dans l'induction de l'apoptose ou de la sénescence ainsi que dans la régulation de l'expression génique. Ces dernières années, plusieurs études ont montré que l'expression d'ING2 est perdue dans différents types tumoraux. Cependant, les mécanismes par lesquels cette perte d'expression pourrait favoriser l'émergence des tumeurs restaient inconnus. Dans ce contexte, l'objectif de mon projet de recherche était d'identifier de nouvelles fonctions d'ING2, pouvant l'impliquer dans le processus de tumorigenèse. Nous avons mis en évidence que l'inhibition de l'expression d'ING2 conduit à un ralentissement de la vitesse de progression des fourches de réplication, associée à une diminution de PCNA à la chromatine. De plus, nos travaux ont identifié qu'ING2 joue un rôle crucial dans le processus de réparation des cassures doubles brins en permettant l'accumulation de 53BPl aux sites de dommages. En accord avec ces fonctions, l'inhibition d'ING2 conduit à une mauvaise réparation des cassures doubles brins, et à une forte augmentation de l'instabilité génomique. ING2 pourrait donc agir comme un gène suppresseur de tumeurs de type « caretaker » en protégeant l'intégrité de l'ADN. Ces résultats permettent de proposer pour la première fois comment la perte d'ING2 pourrait favoriser la cancérogenèse. Enfin, ces travaux de thèse ont également permis d'identifier le premier mécanisme de régulation d'ING2 par modification post-traductionnelle. En effet, ING2 peut être sumoylée et cette sumoylation régule son interaction avec le complexe Sin3a/HDACl, et le ciblage de ce complexe au niveau des promoteurs de gènes pour réguler leur expression. Ces travaux ont ainsi contribué à comprendre le rôle d'ING2 et à conforter son statut de gène suppresseur de tumeurs. De plus, ils ont ouvert de nouvelles perspectives concernant les mécanismes de régulation des protéines INGING2 (INhibitor of Growth 2) is a « candidate» tumor suppressive protein belonging to a family of ' five proteins ING 1 to ING5. ING proteins are involved in the induction of apoptosis or senescence as well as in the regulation of genes expression. Recently, several studies have shown that ING2 expression is lost in different human tumor types. However, the mecanisms by which this loss of expression could drive tumorigenesis remained unknown. Ln this context, the aim of my research project was to identify new functions oflNG2 that may involve it in the tumorigenesis process. We have identified that the inhibition ofING2 expression leads to a global reduction ofDNA replication rate, associated with a decrease of PCNA bound to the chromatin. Ln addition, we have shown that ING2 plays a crucial role in the DNA damage response pathway by promoting the accumulation of 53BPl to DNA double strand breaks. Accordingly, ING2 downregulation leads to defects in repairing DNA double strand breaks, as well as an increased genome instability. Thus, ING2 could act as a caretaker tumor suppressor gene to maintain directly DNA integrity. These results allow for the first time to propose a mechanism by which ING2 loss of expression could drive tumorigenesis. Finally, our work also highlighted the first mechanism ofING2 regulation by a post-translational modification. Indeed, ING2 can be sumoylated and this sumoylation regulates its interaction with the Sin3a/HDACl complex, and the targeting ofthis complex at the promoter of genes to regulate their expression. This work has contributed to a better understanding of ING2 functions, hence comforting its tumor suppressor gene status. Moreover, it has opened new perspectives about the mechanisms by which ING proteins can be regulated
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Adam, Salomé. "Dynamique des variants de l'histone H3 en réponse aux dommages de l'ADN induits par les UVC dans les cellules humaines." Thesis, Paris 6, 2015. http://www.theses.fr/2015PA066288/document.
Full textAbstract:
Dans les cellules eucaryotes, la réponse aux lésions de l'ADN s'accompagne d'une réorganisation de la chromatine. Cette structure, associant l'ADN aux protéines histones, est porteuse de l'information épigénétique, qui définit l'identité cellulaire. Cependant, nos connaissances concernant les mécanismes impliqués dans la réorganisation de la chromatine dont l'intégrité structurale et fonctionnelle a été menacée par un stress génotoxique sont encore limitées, en particulier dans les cellules humaines. Au cours de ma thèse, je me suis donc intéressée à cette thématique en me concentrant sur l'étude de la dynamique des variants de l'histone H3 et de leurs chaperons associés après dommages UVC. En combinant une technologie innovante de suivi spécifique des histones parentales ou néo-synthétisées à des techniques de pointe d'induction de dommages locaux dans l'ADN, j'ai ainsi mis en évidence que le chaperon HIRA (Histone Regulator A) est recruté tôt aux sites de lésions où il stimule l'incorporation locale de nouveaux variants H3.3 et assure la reprise de la transcription après réparation des dommages UVC. Nous avons aussi démontré que les anciennes histones sont initialement redistribuées dans la chromatine autour des sites de lésions par un mécanisme faisant appel au facteur de détection des dommages DDB2 (DNA Damage Binding protein 2). A plus long terme, des histones parentales " reviennent " dans les régions de chromatine en cours de réparation où elles se mélangent aux nouvelles histones incorporées. Le " retour " d'histones préexistantes contribuerait ainsi au maintien de l'intégrité de l'information épigénétique véhiculée par la chromatine avant stress génotoxiqueIn eukaryotic cells, the DNA damage response involves a reorganization of chromatin structure. This structure, in which DNA is associated with histone proteins, conveys the epigenetic information, which is critical for cell identity. However, we are still far from understanding the mechanisms underlying chromatin dynamics in response to DNA damage, which challenges both the structural and functional integrity of chromatin architecture. During my PhD, I thus decided to explore this issue in human cells, by deciphering the dynamics of histone H3 variants and their dedicated chaperones in response to UVC lesions. By combining local UVC irradiation with an innovative technology that allows specific tracking of parental and newly synthesized histones, I revealed that the histone chaperone HIRA (Histone Regulator A) is recruited early to UVC-damaged chromatin regions, where it promotes local deposition of new histone H3.3 variant and facilitates transcription recovery upon repair completion. We also demonstrated that old H3 histones are initially redistributed around the damaged chromatin zone, this conservative redistribution requiring the UVC damage sensor DDB2 (DNA Damage Binding protein 2). Later in the repair process, most parental histones recover and mix with newly deposited histones in repairing chromatin regions. The recovery of pre-existing histones may contribute to preserve the integrity of the epigenetic information conveyed by chromatin before genotoxic stress
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Adam, Salomé. "Dynamique des variants de l'histone H3 en réponse aux dommages de l'ADN induits par les UVC dans les cellules humaines." Electronic Thesis or Diss., Paris 6, 2015. https://accesdistant.sorbonne-universite.fr/login?url=https://theses-intra.sorbonne-universite.fr/2015PA066288.pdf.
Full textAbstract:
Dans les cellules eucaryotes, la réponse aux lésions de l'ADN s'accompagne d'une réorganisation de la chromatine. Cette structure, associant l'ADN aux protéines histones, est porteuse de l'information épigénétique, qui définit l'identité cellulaire. Cependant, nos connaissances concernant les mécanismes impliqués dans la réorganisation de la chromatine dont l'intégrité structurale et fonctionnelle a été menacée par un stress génotoxique sont encore limitées, en particulier dans les cellules humaines. Au cours de ma thèse, je me suis donc intéressée à cette thématique en me concentrant sur l'étude de la dynamique des variants de l'histone H3 et de leurs chaperons associés après dommages UVC. En combinant une technologie innovante de suivi spécifique des histones parentales ou néo-synthétisées à des techniques de pointe d'induction de dommages locaux dans l'ADN, j'ai ainsi mis en évidence que le chaperon HIRA (Histone Regulator A) est recruté tôt aux sites de lésions où il stimule l'incorporation locale de nouveaux variants H3.3 et assure la reprise de la transcription après réparation des dommages UVC. Nous avons aussi démontré que les anciennes histones sont initialement redistribuées dans la chromatine autour des sites de lésions par un mécanisme faisant appel au facteur de détection des dommages DDB2 (DNA Damage Binding protein 2). A plus long terme, des histones parentales " reviennent " dans les régions de chromatine en cours de réparation où elles se mélangent aux nouvelles histones incorporées. Le " retour " d'histones préexistantes contribuerait ainsi au maintien de l'intégrité de l'information épigénétique véhiculée par la chromatine avant stress génotoxiqueIn eukaryotic cells, the DNA damage response involves a reorganization of chromatin structure. This structure, in which DNA is associated with histone proteins, conveys the epigenetic information, which is critical for cell identity. However, we are still far from understanding the mechanisms underlying chromatin dynamics in response to DNA damage, which challenges both the structural and functional integrity of chromatin architecture. During my PhD, I thus decided to explore this issue in human cells, by deciphering the dynamics of histone H3 variants and their dedicated chaperones in response to UVC lesions. By combining local UVC irradiation with an innovative technology that allows specific tracking of parental and newly synthesized histones, I revealed that the histone chaperone HIRA (Histone Regulator A) is recruited early to UVC-damaged chromatin regions, where it promotes local deposition of new histone H3.3 variant and facilitates transcription recovery upon repair completion. We also demonstrated that old H3 histones are initially redistributed around the damaged chromatin zone, this conservative redistribution requiring the UVC damage sensor DDB2 (DNA Damage Binding protein 2). Later in the repair process, most parental histones recover and mix with newly deposited histones in repairing chromatin regions. The recovery of pre-existing histones may contribute to preserve the integrity of the epigenetic information conveyed by chromatin before genotoxic stress
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Vergoni, Bastien. "Implication des dommages à l’ADN et de la voie p53 dans l’adipocyte dans le développement des maladies métaboliques lors de l’obésité." Thesis, Université Côte d'Azur (ComUE), 2017. http://www.theses.fr/2017AZUR4090/document.
Full textAbstract:
Le tissu adipeux (TA) joue un rôle majeur dans les maladies métaboliques induites par l’obésité. L’activation de l’anti-oncogène p53 dans l’adipocyte a été impliquée dans le développement de la résistance à l’insuline lors de l’obésité. Cependant, les causes et les conséquences de cette activation étaient encore inconnues. Nos travaux montrent que, chez des souris obèses, le niveau d'oxydation de l'ADN est plus élevé et la longueur des télomères réduite dans le TA épididymaire. Nous observons également une augmentation des dommages à l’ADN dans les adipocytes. Ces dommages à l’ADN provoquent l’activation de la voie de réponse aux dommages à l’ADN puisque nous avons observé une activation de la voie p53 (stabilisation de la protéine et expression d’une cible p21). De manière intéressante, nous avons démontré que les dommages à l’ADN et l’activation de la voie p53 dans les adipocytes sont des événements précoces lors du développement de l’obésité qui pourraient être la conséquence d’une augmentation également précoce du stress oxydatif dans le tissu adipeux et les adipocytes. De plus, l’augmentation des dommages à l’ADN et l’activation de p53 dans les adipocytes précèdent l’inflammation du tissu adipeux et la résistance à l’insuline systémique. Nous apportons également des arguments en faveur d’un rôle causal des dommages à l’ADN et de l’activation de p53 dans l’adipocyte dans le développement de l’inflammation du tissu adipeux et la résistance à l’insuline adipocytaire. In vitro, nous montrons que la création expérimentale de dommages à l’ADN avec de la doxorubicine et l’activation pharmacologique de p53 avec l’inhibiteur de l’ubiquitine ligase Mdm2, la nutline3a, dans des adipocytes humains et murins en culture inhibent la signalisation insulinique, le transport de glucose et la translocation de Glut4 stimulés par l’insuline. Ils perturbent également l’activité sécrétoire des adipocytes. En particulier, le sécrétome de ces adipocytes possède une activité chimioattractive pour les neutrophiles et les macrophages. Des résultats préliminaires indiquent qu’il pourrait également affecter les préadipocytes en perturbant leur survie et leur différenciation en 8 adipocytes. In vivo, l’injection de doxorubicine à des souris provoque l’infiltration de neutrophiles et de macrophages dans le TA, l’inflammation du TA, et la résistance à l’insuline adipocytaire. Nous montrons également une induction précoce du locus CDKN2A dans le TA lors de l’obésité. Ce locus code pour p16INK4A, un inhibiteur des kinases dépendantes des cyclines CDK4/6, et p19ARF, un inhibiteur de Mdm2. Nous confirmons que la surexpression de p19ARF dans des adipocytes en culture permet la stabilisation de p53 et étudions actuellement l’impact de l’absence de p19ARF dans les adipocytes in vivo dans le développement des maladies métaboliques lors de l’obésité. En résumé, nos travaux démontrent que les dommages à l’ADN observés précocement dans les adipocytes lors du développement de l’obésité ont le potentiel de déclencher des signaux dépendants de p53 impliqués dans l'altération du métabolisme adipocytaire et de sa fonction sécrétoire conduisant à une inflammation du TA, un dysfonctionnement des adipocytes, et la résistance à l'insulineNon disponible
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Samson-Thibault, François. "Analyse des modifications de la cytosine après oxydation de l'ADN par digestion enzymatique et HPLC-MS/MS." Mémoire, Université de Sherbrooke, 2012. http://hdl.handle.net/11143/6359.
Full textAbstract:
Résumé: Les dommages à la cytosine, spontanés et induits par des oxydants, sont probablement la principale cause des transitions GC vers AT, la mutation du génome la plus commune chez les organismes aérobiques. Ces dommages sont impliqués dans le processus de mutagenèse, dans le vieillissement et dans le cancer. Les dommages à la cytosine par les oxydants et les radicaux libres sont nombreux et ont été découverts et étudiés dans les monomères de cytosines et dans de courts oligonucléotides. Dans cette étude, nous avons développé une méthode d'analyse par HPLC-MS/MS des plus importants produits d'oxydation de la cytosine dans l'ADN. Cette méthode permet l'analyse de la formation de 5-hydroxy-2'-désoxycytidine (5-OH-dC), de 5,6-dihydroxy-5,6-dihydro-2'-désoxyuridine (dUg), de 1-(2-désoxyribose)-5-hydroxyhydantoïne (HdU) et de 3-(2-désoxyribose)-1-carbamoy1-4,5-dihydroxy-2-oxo-imidazolidine (C422-dC) lors d'irradiation aux rayons gamma par réaction de type fenton et par ozonolyse. Les résultats de l'irradiation de l'ADN aux rayons gamma (en modifications/106bases/Gy) sont de 1.62 pour la 5-OH-dC, de 1.48 pour le dUg, de 7.43 pour la HdU et de 1.38 pour la C422-dC. La réaction de type fenton avec le cuivre donne une formation de dommages environ 25 fois plus grande qu'avec le fer et les deux types (cuivre et fer) donnent des ratios de produits semblables à ceux par les rayons gamma avec une augmentation de la 5- OH-dC et une diminution de la HdU. L'exposition .de l'ADN à l'ozone donne une très grande formation de la HdU et une faible formation des autres produits d'oxydation.//Abstract: The damages to cytosine, spontaneous and inducted by oxidants, are probably the principal cause of the GC to AT transition, the most important mutation of the genome for the aerobic organisms. Those damages are involved in the process of mutagenesis, aging and cancer. The damages to cytosine by oxidants and fre radicals are numerous and have been discovered and studied in monomers of cytosine and in short oligonucleotides. In this study, we have developed a analysis method of the most important oxidation products of cytosine in DNA by HPLC-MS/MS. This method allows the analysis of the formation of 5-hydroxy-2'-deoxycytidine (5-OH-dC), de 5,6-dihydroxy-5,6-dihydro-2'-desxyuridine (dUg), de 1-(2-deoxyribose)-5-hydroxyhydantoin (HdU) et de 3-(2-deoxyribose)- 1-carbamoyl-4,5-dihydroxy-2-oxo-imidazolidine (C422-dC) after irradiation by gamma rays, by fenton type reaction and ozonolysis. The results of the irradiation of DNA by gamma rays (in modifications10[indice supérieur 6] bases/Gy) are of 1.62 for 5-OH-dC, of 1.48 for dUg, of 7.43 for HdU and of 1.38 for C422-dC. The fenton type reaction with copper gives a formation of damages about 25 times higher than with ferrous and both kind gives a ratio of formation similar to the the ones by gamma rays with a increase of 5-OH-dC and a decrease of HdU. The exposition of DNA to ozone gives a strong formation of HdU and a small formation of the other modifications. [symboles non conformes]
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Bérubé, Roxanne. "Persistance des dommages à l'ADN induits par une irradiation chronique aux rayons ultraviolets B et leurs conséquences dans le génome humain." Master's thesis, Université Laval, 2017. http://hdl.handle.net/20.500.11794/27866.
Full textAbstract:
Les rayons ultraviolets (UV) sont les principaux responsables de l’initiation des cancers cutanée, car ils induisent différents dommages à l’ADN, dont les dimères cyclobutyliques de pyrimidines (CPD). Ces dommages sont principalement induits par les UVB et sont responsables de la formation des mutations trouvées les cancers cutanés non mélanocytiques. Nos résultats ont démontré qu’une irradiation chronique à de faibles doses de rayons UVB (CLUV) induit la formation de CPD, qui persistent dans le temps. Ces dommages résiduels s’accumulent dans le génome et ne semblent pas être réparés. Nous nous sommes donc intéressés à ces dommages résiduels et à leur impact dans le génome. Premièrement, la distribution post-irradiation des CPD résiduels a été observée pour des fibroblastes dermiques humains soumis à une irradiation CLUV (75 J/m² aux 12h, durant 7,5 jours). Ces analyses ont démontré que les CPD résiduels sont tolérés et dilués dans le génome lors des divisions cellulaires. Deuxièmement, la localisation des CPD résiduels a été observée pour les cellules irradiées avec une CLUV et pour les cellules irradiées avec une dose unique et aigüe (400 J/m²). La quantification des CPD résiduels a permis d’observer que pour les cellules irradiées avec une CLUV, environ deux fois plus de CPD résiduels sont présents dans l’hétérochromatine par rapport à l’euchromatine. Pour les cellules irradiées avec une dose aigüe, les CPD sont répartis également entre les deux fractions de la chromatine. Ces résultats suggèrent que l’état de compaction de la chromatine a un impact sur l’accumulation et la réparation des CPD. Troisièmement, la fréquence de chaque type dipyrimidinique de CPD résiduels a été déterminée par la technique de LC-MS/MS. Une proportion plus faible de CPD contenant des cytosines a été observée dans les cellules irradiées avec la CLUV par rapport aux cellules irradiées avec la dose aigüe. De plus, l’analyse a démontré que les photoproduit de pyrimidine (6-4) pyrimidone (6-4 PP) étaient presque complètement absents des dommages résiduels. Finalement, afin d’observer l’impact des CPD résiduels sur la stabilité génomique, la quantité d’échanges de chromatides sœurs (SCE) a été comparée pour les cellules irradiées par la CLUV et les cellules non irradiées. La quantité de SCE observée était plus élevée dans les cellules irradiées que dans les cellules non irradiées. Globalement, nous avons observés que les CPD résiduels, majoritairement de type TT, s’accumulent principalement dans l’hétérochromatine, où ils sont tolérés. Ces dommages sont dilués dans le génome au fil des divisions cellulaires, en causant une augmentation de l’instabilité génomique. Globalement, mon projet a permis de mieux comprendre l’impact des CPD résiduels induits par une irradiation chronique dans l’initiation de la cancérogenèse cutanée.Ultraviolet (UV) rays are known to be the main initiator of skin cancer, as they induce different types of DNA damage, including cyclobutane pyrimidine dimers (CPD). CPD are mostly produced by UVB rays and are the predominant premutagenic DNA damage responsible for non-melanoma skin cancers. While most CPD are repaired by the nucleotide excision repair (NER) pathway, some remain unrepaired and persist in the genome. We recently observed those residual CPD after exposure of human fibroblasts cells to chronic low dose of UVB (CLUV). Then, we aimed to observe the distribution of residual CPD occurring in dividing cells submitted to CLUV irradiation. Human dermal fibroblasts were irradiated with CLUV (75 J/m² every 12h for 7.5 days). Our results showed that residual CPD are tolerated and diluted in the genome by DNA replication. Then, localization of CLUV-induced residual CPD was observed and compared with residual CPD induced by a single and acute UVB irradiation (400 J/m²). Euchromatin and heterochromatin fraction were isolated and the amount of CPD was quantified in each fraction. The quantification showed that residual CPD accumulate mostly in the heterochromatin fraction of the genome, where the amount of CPD was two times greater than in the euchromatin. This suggests that DNA compaction has an impact on CPD accumulation and repair. Then, we measured the frequency of the different types of residual CPD by LC-MS/MS technique. A lower proportion of cytosine containing CPD was found in CLUV irradiated cells than in acute irradiated cells. The quantification of the different types of 6-4 photoproducts (6-4 PP) demonstrated that they were almost all absent after a CLUV irradiation, in the residual damage. Finally, genomic instability was investigated in CLUV irradiated cells by measuring the amount of SCE induced after the irradiation. A higher number of SCE was observed in CLUV-irradiated cells than in control cells, suggesting that residual CPD are responsible for an increase of genomic instability. Overall, we observed that residual CPD, mostly TT-CPD, accumulate in the heterochromatin where they are tolerated. These CPD are diluted during cellular division but they are causing genomic instability. Finally, my project aimed to characterise residual CPD induced by chronic irradiation and to gain more knowledge on their impact in skin carcinogenesis initiation.
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Vit, Jean-Philippe. "Réponse apoptotique aux radiations ionisantes : intégration de voies de signalisation induites indépendamment par les lésions de l'ADN et les dommages membranaires." Paris 5, 2002. http://www.theses.fr/2002PA05S023.
Full textAbstract:
Durant leur vie, les cellules sont soumises à des agressions génotoxiques par des agents physiques ou chimiques présents dans l'environnement, ainsi qu'à des stress cellulaires endogènes. Les dommages causés à l'ADN sont à l'origine de signaux dont va dépendre le destin cellulaire. Cependant, il apparaît de plus en plus clairement que les dommages perpétrés à l'extérieur du noyau de la cellule ont un rôle à jouer dans l'initiation d'autres signaux essentiels au devenir de la cellule. La problématique de cette thèse concerne, parmi les processus cellulaires induits par l'irradiation, l'apoptose. .During their life, cells are subject to genotoxic aggressions by physical or chemical agents that are, but also to endogenous cellular stress. DNA damage are able to induce signals determinating the cell fate. However, more and more evidences show that damages induced out of the nucleus have an important role for the initiation of others signals involved in the cell outcome. The field of this thesis is apoptosis, one among the radio-induced cellular processes. The disease used in this work as a main model is ataxia telangiectasia. . .
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Guérillon, Claire. "Les protéines suppressives de tumeurs ING1, ING2 et ING3 : régulation par sumoylation et implication dans la réponse aux dommages à l'ADN." Thesis, Rennes 1, 2014. http://www.theses.fr/2014REN1S181.
Full textAbstract:
Les gènes ING (Inhibitor of Growth) sont des gènes candidats suppresseurs de tumeurs conservés de la Levure à l'Homme. Les protéines ING ont des fonctions suppressives de tumeurs de type I ou « caretaker » car elles participent aux processus de maintien de la stabilité du génome en régulant la réplication et la réparation de l'ADN. Elles ont aussi des fonctions suppressives de tumeurs de type II ou « gatekeeper » puisqu'elles sont impliquées dans la régulation de la prolifération cellulaire de façon dépendante et indépendante de p53 et car elles contrôlent la transcription génique en participant au remodelage de la chromatine. L'objectif de ma thèse est de mieux comprendre l'implication de ING1, ING2 et ING3 dans les voies de suppression des tumeurs. Nos travaux montrent que ING1 est sumoylée sur la lysine 193 principalement par l'E3 SUMO ligase PIAS4, afin de réguler l'ancrage de ING1 sur le promoteur de gènes cibles pour réguler leur transcription. Nous avons aussi décrit pour la première fois l'implication de ING2 et de ING3 dans la réponse aux cassures double brin de l'ADN. Nous montrons que cette fonction est conservée entre ING2, ING3 et leur orthologues, respectivement, Pho23 et Yng2 chez la Levure Saccharomyces cerevisiae. ING2 contrôle l'accumulation de PIAS4 au niveau des sites de dommages et régule la sumoylation de l'E3 ubquitine ligase RNF168, afin de permettre la signalisation et la réparation des cassures double brin de l'ADN. ING3 est nécessaire à l'accumulation de 53BP1 et contrôle la réparation de ces dommages. Ces travaux contribuent donc à une meilleure connaissance du rôle des ING dans les voies de suppression des tumeurs. Ils permettent de mieux comprendre comment ING1 régule la transcription génique et décrivent une nouvelle fonction suppressive de tumeur de type I ou « caretaker » pour ING2 et ING3 dans le maintien de la stabilité du génomeING (Inhibitor of Growth) genes are tumor suppressor gene candidates conserved from Yeast to Humans. ING proteins have type I tumor suppressive functions or "caretaker" because they participate in the maintenance of genome stability by regulating DNA replication and repair processes. They have also tumor suppressive functions of type II or "gatekeeper" because they are involved in the regulation of cell proliferation in p53 dependent and independent manners. They also participate in the regulation of gene transcription by regulating chromatin remodeling. The aim of my thesis was to better understand how ING1, ING2 and ING3 are involved in tumor suppressive pathways. Our work shows that ING1 is sumoylated on lysine 193 mainly by the SUMO E3 ligase PIAS4 to regulate ING1 anchoring on target gene promoters to control gene transcription. We have also described the involvement of ING2 and ING3 in the DNA double strand breaks response. We show the conservation of this function between ING2, ING3 and their orthologs, respectively, Pho23 and Yng2 in Yeast Saccharomyces cerevisiae. ING2 controls the accumulation of PIAS4 at DNA damage sites and regulates the sumoylation of the E3 ubiquitin ligase RNF168, to regulate DNA double strand break signaling and repair. ING3 is necessary for the accumulation of 53BP1 and promotes DNA damage repair. This work contributes to a better understanding of the role of ING proteins in tumor suppression. It thus provides new insights of how ING1 regulates gene transcription and emphasizes a new tumor suppressive function of type I or "caretaker" for ING2 and ING3 in the genome stability maintenance
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Biau, Julian-Mickaël. "Analyse du rôle des voies de signalisation des dommages à l'ADN dans la radiorésistance : le cas du glioblastome et du mélanome." Thesis, Université Paris-Saclay (ComUE), 2016. http://www.theses.fr/2016SACLS402.
Full textAbstract:
Dans le glioblastome (GBM), nous avons recherché et comparé les facteurs de radiorésistance parmi 8 lignées cellulaires et 11 xénogreffes (5 issues de patients, et 6 issues de lignées cellulaires traitées par radiothérapie hypofractionnée 6x5Gy) en utilisant la technologie RPPA (Reverse Phase Protein Analysis). Nous avons exploré 89 marqueurs protéiques appartenant à 10 voies différents: réparation de l’ADN, cycle cellulaire, apoptose, adhésion/cytosquelette, stress et voies PI3K, tyrosine kinase, MAPK/ERK, SAPK/JNK et NFκB. Aucun marqueur de radiorésistance n’était commun entre les expériences in vitro (FAK, HSP90, HSF1, HSPA2, vimentine et integrin β4) et in vivo (EGFR, CHK1 et VCP). Nous avons ensuite, dans ces mêmes modèles de GBM étudié la potentielle radiosensibilisation par une classe innovante d’inhibiteurs de la réparation de l’ADN, Dbait. Les molécules Dbait sont de courts fragments d'ADN double brin mimant une cassure de l'ADN. Ces molécules agissent comme des leurres vis-à-vis des enzymes de signalisation des dommages à l'ADN notamment PARP et DNA-PK qui sont hyperactivés, ce qui empêche la détection des dommages réels induits par les traitements et inhibe la réparation. Les molécules Dbait se sont montrées capables de radiosensibilier 6/11 modèles de xénogreffes de GBM. Les marqueurs prédictifs de la résistance à Dbait étaient Phospho-H2AX/H2AX, Phospho-NBS1/NBS1 et cleaved-PARP/PARP. Nous avons également mené une étude préclinique étudiant le potentiel radiosensibilisant de Dbait/DT01 (DT01 = forme clinique de Dbait) dans un modèle de mélanome. Les souris xénogreffées sur flanc étaient traitées par un protocole de RT « palliatif » (10x3Gy) ou « curatif » (20x3Gy) en combinaison à des injections de Dbait/DT01. Les souris traitées par la combinaison Dbait/DT01 et RT avaient une inhibition significative de la croissance tumorale et une survie prolongée. Du fait de l’ensemble des résultats précliniques positifs sans toxicité ajoutée, les molécules Dbait/DT01 ont été testées lors d’un essai clinique de phase I en association à la RT dans le cadre des métastases cutanées de mélanome avec des résultats très encourageantsWe aimed to identify predictive biomarkers of GBM radioresistance in 8 GBM cell lines, 6 corresponding cell lines derived xenografts (CDX) and 5 patient derived xenografts (PDX) treated with hypofractionated radiotherapy (6x5Gy), using an RPPA (Reverse Phase Protein Array) approach. We explored 89 potential protein markersinvolved in DNA repair, PI3K pathway, apoptosis, tyrosine kinase signaling, stress signaling, cell cycle, MAPK/ERK signaling, SAPK/JNK signaling, NFκB signaling and adhesion/cytoskeleton. In vitro identified biomarkers (FAK, HSP90, HSF1, HSPA2, vimentin and integrin β4) were not found in vivo. The markers specific of in vivo resistance were Phospho-EGFR/EGFR, Phospho-Chk1/Chk1 and VCP. Then, in these GBM models, we assessed the potential radiosensitization of an innovative DNA repair inhibitor, Dbait. Dbait consists of 32 bp deoxyribonucleotides that mimics DNA lesions. They act as a bait for DNA damage signaling enzymes, the polyadenyl-ribose polymerase (PARP), and the DNA-dependent kinase (DNA-PK), inducing a “false” DNA damage signal and ultimately inhibiting DNA repair. 6/11 GBM models had been radiosensitized by Dbait.Phospho-H2AX/H2AX, Phospho-NBS1/NBS1 and cleaved-PARP/PARP were predictive markers of Dbait resistance. We assessed the efficacy and safety of combining radiotherapy with Dbait/DT01 (DT01 = clinical form of Dbait) in a preclinical model of human melanoma. Nude mice subcutaneously engrafted with human melanomas (SK28) were or were not treated with Dbait/DT01, “palliative” (10x3Gy) or “radical” (20x3Gy) RT, or a combination of Dbait/DT01 and RT. Mice treated with Dbait/DT01 and RT combination had significantly better tumor growth control and longer survival compared to RT alone with the “palliative” protocol or the “radical” protocol. The results of this preclinical study led to the conduction of a phase 1 study in the palliative management of melanoma in-transit metastases (DRIIM trial) with very encouraging results