Academic literature on the topic 'Larves de poisson zèbre'

En raison de sa simplicité d’utilisation, la culture cellulaire reste le matériel de choix pour l’étude des mécanismes impliqués dans le cancer. Toutefois, la mise en culture des cellules est souvent responsable de la perte de certaines de leurs caractéristiques et de l’acquisition de nouvelles propriétés. Aussi, les modèles animaux sont essentiels à l’étude des phénomènes physiologiques et pathologiques comme la tumorigenèse. Parmi les modèles animaux utilisés en cancérologie, le poisson zèbre apparaît comme un modèle particulièrement pertinent. En effet, la facilité et les faibles coûts d’élevage du poisson zèbre, tout comme le large éventail de possibilités en termes de manipulation génétique et d’imagerie in vivo classent ce modèle vertébré parmi les outils les plus remarquables pour l’étude du cancer. Cette revue a pour objectif de faire le point sur les apports et le potentiel du poisson zèbre dans la lutte contre le cancer.

Pour éclairer la série que nous vous proposons, il nous a semblé important de rappeler les règles définissant ce que sont les organismes-modèles ainsi que la réglementation en vigueur quant à leur utilisation en recherche biomédicale. Les études in vitro ou ex vivo, sur cellules ou tissus, ou les analyses in silico ne permettent pas d’aborder des problématiques complexes. Elles sont certes utiles pour des analyses mécanistiques, mais ne permettent pas l’étude de réponses biologiques intégrées qui nécessitent l’analyse d’un organisme entier. Ces organismes sont soumis à une réglementation stricte. Elle les distingue selon qu’ils sont vertébrés ou invertébrés. Si les mammifères modélisent nombre de pathologies humaines, certains organismes simples permettent également de mener ce type d’études et de répondre à des questions liées à la génétique. Leur intérêt est leur rapidité et leur capacité de reproduction qui facilitent les expérimentations. Le poisson zèbre en est un bon exemple avec les nombreuses versions de morphants qui ont été développés et qui ont permis de révéler les conséquences d’altérations génomiques sur un phénotype particulier. Cet organisme-modèle est donc particulièrement utilisé pour l’étude de pathologies monogéniques ou pour déterminer le rôle d’un gène dans l’étiologie de diverses pathologies. La transparence du poisson zèbre rend de plus les investigations plus faciles. Caenorhabditis elegans est également un excellent modèle d’organisme simple et qui, contrairement au poisson zèbre, ne relève pas de la réglementation concernant l’expérimentation animale. Son utilisation est ainsi, comme pour les insectes, plus aisée. Connaître les différences entre les organismes-modèles, leurs avantages et leurs limites, et les règles dictant leur utilisation est donc primordial pour la réalisation d’expérimentations qui restent nécessaires à l’acquisition de nouvelles connaissances dans le domaine de la biologie et de la santé.

La myopathie de Bethlem (BM) est une maladie caractérisée par des rétractions et une faiblesse musculaires. Cette pathologie résulte de mutations dans un des gènes codant l’une des trois chaînes α du collagène VI (COLVI), un composant de la matrice extracellulaire musculaire squelettique. Aujourd’hui, une question non résolue est de comprendre comment l’altération de COLVI présent à l’extérieur des cellules musculaires conduit à des modifications fonctionnelles dans les fibres musculaires. Le modèle poisson zèbre col6a1Δex14 est actuellement un modèle animal unique de la BM puisqu’il est le seul à reproduire spécifiquement l’une des mutations la plus fréquemment retrouvée chez les patients. Chez les patients et le poisson col6a1Δex14, la structure du réticulum sarcoplasmique est altérée, suggérant une perturbation de l’homéostasie calcique musculaire et/ou des canaux ioniques qui, en contrôlant cette homéostasie, jouent un rôle crucial dans la fonction et la pathogenèse musculaire. Notre projet vise ainsi à étudier à l’aide de techniques électrophysiologiques et de mesure de Ca2+ les propriétés des canaux ioniques et la régulation du Ca2+ intracellulaire au repos et en activité dans la fibre musculaire du poisson col6a1Δex14. Nos recherches devraient contribuer à mieux comprendre comment la perturbation de la matrice influe sur la fonction musculaire et conduire à terme à identifier des cibles thérapeutiques pour traiter cette maladie actuellement incurable. Enfin, du fait de la rareté des études fonctionnelles sur la cellule musculaire de poisson zèbre, ce projet permettra de constituer une base de données de référence sur les propriétés électrophysiologiques de ce modèle.

L’étude expérimentale de la résilience d’un réseau complexe repose sur la capacité à reproduire l’organisation structurelle et fonctionnelle du réseau à l’étude. Ayant choisi le réseau neuronal du poisson-zèbre larvaire comme modèle animal pour sa transparence, on peut utiliser des techniques telles que l’imagerie calcique par feuillet de lumière pour imager son cerveau complet plus de deux fois par seconde à une résolution spatiale cellulaire. De par les bonnes résolutions spatiale et temporelle, les données à segmenter représentent par le fait même un gros volume de données qui ne peuvent être traitées manuellement. On doit donc avoir recours à des techniques numériques pour segmenter les neurones et extraire leur activité.Trois techniques de segmentation ont été comparées, soit le seuil adaptatif (AT), la forêtd’arbres décisionnels (ML), ainsi qu’un réseau de neurones à convolution (CNN) déjà entrainé. Alors que la technique du seuil adaptatif permet l’identification rapide et presque sans erreurdes neurones les plus actifs, elle génère beaucoup plus de faux négatifs que les deux autres méthodes. Au contraire, la méthode de réseaux de neurones à convolution identifie plus deneurones, mais en effectuant plus de faux positifs qui pourront, dans tous les cas, être filtrés parla suite. En utilisant le score F1 comme métrique de comparaison, les performances moyennes de la technique de réseau de neurones (F1= 59,2%) surpassent celles du seuil adaptatif (F1= 25,4%) et de forêt d’arbres de décisions (F1= 48,8%). Bien que les performances semblent faibles comparativement aux performances généralement présentées pour les réseauxde neurones profonds, il s’agit ici d’une performance similaire à celle de la meilleure techniquede segmentation connue à ce jour, soit celle du 3dCNN, présentée dans le cadre du concours neurofinder (F1= 65.9%).
The experimental study of the resilience of a complex network lies on our capacity to reproduceits structural and functional organization. Having chosen the neuronal network of the larvalzebrafish as our animal model for its transparency, we can use techniques such as light-sheet microscopy combined with calcium imaging to image its whole brain more than twice every second, with a cellular spatial resolution. Having both those spatial and temporal resolutions, we have to process and segment a great quantity of data, which can’t be done manually. Wethus have to resort to numerical techniques to segment the neurons and extract their activity. Three segmentation techniques have been compared : adaptive threshold (AT), random deci-sion forests (ML), and a pretrained deep convolutional neural network. While the adaptive threshold technique allow rapid identification and with almost no error of the more active neurons, it generates many more false negatives than the two other methods. On the contrary, the deep convolutional neural network method identify more neurons, but generates more false positives which can be filtered later in the proces. Using the F1 score as our comparison metrics, the neural network (F1= 59,2%) out performs the adaptive threshold (F1= 25,4%) and random decision forests (F1= 48,8%). Even though the performances seem lower compared to results generally shown for deep neural network, we are competitive with the best technique known to this day for neurons segmentation, which is 3dCNN (F1= 65.9%), an algorithm presented in the neurofinder challenge.

Le comportement animal est souvent conçu comme résultant d'une association entre un stimulus et une réponse. Selon cette vision, comprendre le cerveau revient à dénouer les liens entre les entrées sensorielles et les sorties motrices. Toutefois, dans des conditions naturelles, l'influence entre l'action motrice et la perception sensorielle est réciproque. Les animaux utilisent constamment les rétroactions sensorielles causées par leurs actions pour ajuster les commandes motrices. Par ailleurs, le comportement n'est pas seulement une réponse à l'environnement sensoriel mais peut être généré par l'activité endogène du cerveau. Afin de comprendre le dialogue sensorimoteur en observant de larges régions cérébrales à une résolution cellulaire, j'ai étudié les comportements induits et spontanés chez la larve du poisson-zèbre. Les atouts de la larve du poisson zèbre sont sa petit taille et sa transparence. On peut utiliser des méthodes d'imagerie fonctionnelle optique, comme la microscopie par nappe laser, afin d'enregistrer l'activité dans une large portion des neurones. Afin d'étudier le comportement de navigation chez la larve dans des conditions compatibles avec l'observation du cerveau, j'ai développé un système de réalité virtuelle visuelle pour la larve du poisson zèbre. L'environnement visuel est mis à jour en fonction des mouvements du poisson. Cette rétroaction peut être choisie comme étant similaire à la rétroaction visuelle que le poisson expérimente en nage libre. En modifiant la rétroaction visuelle naturelle, on peut étudier la manière dont la larve s'adapte aux perturbations. Dans cette optique, j'ai d'abord généré une librairie de mouvements de nage libre. A partir de celle-ci, j'ai extrait la relation entre la trajectoire de la larve et la cinématique de ses mouvements de queue. Cette relation permet de décoder les intentions de déplacements chez une larve dont la tête est restreinte dans un gel et de mettre à jour un environnement visuel selon ses mouvements de queue. Dans un environnement virtuel, la larve parvient à contrôler son orientation et sa vitesse afin de suivre un mouvement d'ensemble ou bien à générer une séquence de mouvements nécessaires à atteindre une cible mobile. Lorsque la rétroaction visuelle n'est pas mise à jour continuellement mais à la fin de chaque mouvement, on observe que les mouvements sont alors plus longs. Cette faible perturbation réduit significativement le succès des déplacements du poisson vers des cibles virtuelles. Le comportement peut aussi résulter de l'activité endogène du cerveau. En absence de stimulus externe, la larve produit des mouvements stéréotypés similaires à ceux produits lorsqu'elle navigue en réponse à un stimulus. Après avoir établit une nouvelle méthode de classification des mouvements de queue, j'ai analysé la séquence des mouvements générés spontanément. Ces séquences sont composées de successions quasi rythmiques qui alternent avec de longues périodes de repos. Les mouvements consécutifs sont davantage similaires lorsqu'ils s’enchaînent rapidement (~10s). Afin d'étudier les mécanismes neuronaux responsables de la décision d'effectuer un mouvement spontané, j'ai couplé l’imagerie par nappe laser à l'analyse des mouvements. Des résultats préliminaires mettent en évidence des groupes de neurones dont l'activité prédit la direction des mouvements des virages. Deux groupes repartis bilatéralement oscillent en opposition de phase et l'état de cet oscillateur avant un mouvement prédit sa direction. Les neurones responsables de la décision du type de mouvement à effectuer spontanément sont différents des neurones qui contrôlent le timing de leur déclenchement. Ensemble, ces résultats éclairent les processus de rétroaction et de dynamique interne qui façonnent le comportement et ouvre la voie à l'étude de processus sensorimoteurs complexes dans des systèmes simples
Behavior is often conceived as resulting from a stimulus-response association. Under this paradigm, understanding the nervous system is reduced to finding the relation between a sensory input and a motor output. Yet, in naturally behaving animals, motor actions influence sensory perceptions just as much as the other way around. Animals are continuously relying on sensory feedback to adjust motor commands. On the other hand, behavior is not only induced by the sensory environment, but can be generated by the brain's rich internal dynamics. My goal is to understand the sensory-motor dialogue by monitoring large brain regions, yet, with a single-neuron resolution. To tackle this question, I have used zebrafish larva to study visually induced and internally driven motor behaviors. Zebrafish larvae have a small and transparent body. These features enable using large-scale optical methods, such as selective plane illumination microscopy (SPIM), to record brain dynamics. In order to study goal-driven navigation in conditions compatible with imaging, I developed a visual virtual reality system for zebrafish larva. The visual feedback can be chosen to be similar to what the animal experiences in natural conditions. Alternatively, alteration of the visual feedback can be used to study how the brain adapts to perturbations. For this purpose, I first generated a library of free-swimming behaviors from which I learned the relationship between the trajectory of the larva and the shape of its tail. I then use this technique to infer the intended displacements of head-fixed larvae. The visual environment was updated accordingly. In the virtual environment, larvae were capable of maintaining the proper speed and orientation in the presence of whole-field motion and produced fine changes in orientation and position required to capture virtual preys. I demonstrate the sensitivity of larvae to visual feedback by updating the visual world only after the discrete swimming episodes. This feedback perturbation induced a decay in the performance of prey capture behavior, suggesting that larva rely on real-time visual feedback during swimming. Behavior can also be induced by the internal dynamics of the brain. In the absence of salient sensory cues, zebrafish larva spontaneously produces stereotypical tail movements, similar to those produced during goal-driven navigation. After having developed a new method to classify tail movements, I analyzed the sequence of spontaneously generated tail movements. The latter switched between period of quasi-rhythmic activity and long episodes of rest. Moreover, consecutive movements were more similar when executed at short time intervals (~10s). In order to study the mechanisms responsible for the spontaneous decisions to move, I coupled SPIM to tail movement analysis. Using dimensionality reduction, I identified clusters of neurons predicting the direction of spontaneous turn movements but not their timings. This Preliminary result suggests that distinct pathways could be responsible for the timing (when) and the selection (what) of spontaneous actions. Together, the results shed light on the role of feedback and internal dynamics in shaping behaviors and open the avenue for investigating complex sensorimotor process in simple systems

Les esters de phtalate constituent une famille de composés synthétiques très répandue du fait de leurs usages comme plastifiants. Ils entrent dans la composition de plusieurs produits plastiques tels que les emballages, les jouets, les produits cosmétiques, certains systèmes de toiture en plastique, ainsi que les matériaux de décoration de meubles. Les phtalates ne sont pas liés de manière covalente à la matrice des polymères et sont donc facilement rejetés dans l'environnement, entraînant par conséquent une exposition animale et humaine. En absence de produits de substitutions non-toxiques, les composés de type phtalate restent encore largement utilisés dans l'industrie en dépit de la classification de certains d'entre eux dans la catégorie des substances présumées toxiques par l'European Chemicals Agency (ECHA), en tant que perturbateurs endocriniens. De plus, ils sont cancérigènes et tératogènes. L'effet délétère des esters de phtalates sur les organismes est établi mais le caractère multiple des effets observés montre que les mécanismes d'action des phtalates ne sont que très partiellement élucidés. Nous avons utilisé deux approches de protéomique ciblée pour tenter d'éclairer nos connaissances sur les mécanismes d'actions des esters de phtalate. Pour cela, le dibutyl phtalate (DBP) a été utilisé comme phtalate modèle, et le poisson zèbre (D. rerio) comme organisme modèle. L'utilisation de la première approche de protéomique ciblée, le profilage protéique basé sur l'affinité (affinity-based protein profiling, AfBPP) a permis de montrer la perturbation fonctionnelle de protéines par le DBP avec des sondes photoactivables issues de la synthèse de types aryle azide. L'optimisation des conditions de fixation des sondes diazirine (Diazirine 2) devrait nous permettre de disposer d'une sonde pouvant être utilisée pour identifier les cibles protéiques du DBP dans le protéome du poisson zèbre. La deuxième approche, le profilage basé sur l'activité des enzymes (activity-based protein profiling, ABPP) a permis d'utiliser une sonde réactive spécifique des hydrolases à sérine (SHs) pour cartographier pour la première fois des SHs actives dans le protéome du poisson zèbre. L'identification des SHs dérégulées en présence de DBP chez les larves de poisson zèbre a également été rapportée dans cette étude. Nos résultats globaux indiquent que les approches de protéomiques ciblées telles que l'ABPP ou l'AfBPP peuvent être un atout pour comprendre les mécanismes d'action liés aux xénobiotiques en écotoxicologie
Phthalate esters are a family of synthetic compounds widely used as plasticisers. They are used in a number of plastic products such as packaging, toys, cosmetics, plastic roofing system and furniture decoration materials. Phthalates are not covalently bonded to the polymer matrix and are therefore easily released into the environment, resulting in animal and human exposure. In the absence of non-toxic substitutes, phthalate compounds are still widely used in industry, despite the classification of some of them by the European Chemicals Agency (ECHA) as suspected toxic substances and as endocrine disruptors. In addition, they are carcinogenic and teratogenic. The deleterious effect of phthalate esters on organisms is established, but the multiple nature of the effects observed shows that the mechanisms of action of phthalates are only partially elucidated. We used two targeted proteomics approaches to shed light on the mechanisms of action of phthalate esters. Dibutyl phthalate (DBP) was used as a model phthalate and zebrafish (D. rerio) as a model organism. Using the first targeted proteomics approach, affinity-based protein profiling (AfBPP), the functional disruption of proteins by DBP with photoaffinity probes from aryl azide synthesis was demonstrated. Optimisation of the binding conditions for diazirine probes (Diazirine 2) should provide us with a probe that can be used to identify DBP protein targets in the zebrafish proteome. The second approach, activity-based protein profiling (ABPP), used a reactive probe specific for serine hydrolases (SHs) to map active SHs in the zebrafish proteome for the first time. The identification of deregulated SHs in the presence of DBP in zebrafish larvae was also reported in this study. Overall, our results indicate that targeted proteomics approaches such as ABPP or AfBPP can be an asset for understanding xenobiotic-related mechanisms of action in ecotoxicology

La larve de poisson-zèbre est un animal modèle pour l'étude du système nerveux des vertébrés, dont certains mutants expriment des rapporteurs calciques (GCaMP) à l'intérieur de leurs neurones. Ces mutants sont utilisés pour des expériences d'imagerie fonctionnelle dans lesquelles l'activité de la quasi-totalité de leur système nerveux est enregistrée simultanément. La première partie de cette thèse est consacrée à la conception d'une expérience comportementale permettant de suivre et d'analyser les mouvements de nage de larves de poisson-zèbre plongées dans un écoulement d'aspiration. Les contributions de la ligne latérale, organe spécifique aux poissons et amphibiens responsable de la perception des stimulations hydrodynamiques, et des yeux ont été découplées afin de pouvoir décrire les interactions entre ces deux modalités sensorielles et leurs effets respectifs sur les réactions des larves à une aspiration, analysés par le biais de leur mouvements de nage. Cette expérience devait être préliminaire à une étude des réponses neuronales à une aspiration grâce au montage expérimental de microscopie par nappe laser développé au laboratoire depuis quatre ans, afin de réaliser des expériences de cross-modal en imagerie fonctionnelle, c'est-à-dire l'observation dynamique des réseaux neuronaux consacrés au deux modalités sensorielles lorsque celles-ci sont stimulées soit simultanément, soit séparément. Devant les difficultés rencontrées pour observer les réponses de la ligne latérale des larves en imagerie calcique, ce qui n'a à ce jour jamais été réalisé, nos expériences d'imagerie fonctionnelle se sont reportées sur l'audition de la larve de poisson-zèbre, qui a remplacé la perception des écoulements. La deuxième partie de cette thèse décrit donc les protocoles, les méthodes d'analyse et les résultats issus de cette série d'expériences dont les résultats, encore exploratoires, donnent une idée des réseaux de neurones impliqués dans la perception des vibrations par la larve de poisson-zèbre. Ces premières analyses encourageantes, en plus de présenter pour la première fois des enregistrements d'une grande partie du système neuronal sous stimulation auditive, ouvrent la porte à de nouvelles méthodes d'analyse de données pour des populations de neurones à la fois nombreuses et spatialement étendues
The Zebrafish larva is a model for the study of vertebrate central nervous system. Mutants have been developped which express calcium reporter (GCaMP) in their neurons. These mutants are used in functional imaging experiments in which the activity of almost all the neurons is simultaneously recorded. The first chapter of this thesis is devoted to the conception of a behavioral experiment designed to record and analyse the swim movements of zebrafish larvae submitted to a succion flow. The contributions of lateral line (specific fish organ responsible for the perception of hydrodynamic stimulations) and visual system have been separated in order to describe the interactions between those two modalities and their respective effects on larvae reactions to aspiration, analysed through their swim patterns. This experiment was thought to prepare a study of neuronal responses to aspiration, thanks to the laser sheet microscopy setup developped in the laboratory since four years. The aim was to use calcium imaging to work on cross-modal experiment, by the dynamic observation of neural networks dedicated to the two sensory modalities when stimulated simultaneously or separatly. Facing difficulties to record lateral line response using calcium imaging, which are not been recorded yet, functional imaging experiments have adressed zebrafish larvae auditory system instead of hydrodynamic perception. The second part of this thesis describes protocols, analysis and results from these experiments. The results are still at an exploratoty stage but draw a scheme of neural networks involved in vibrations perception in zebrafish larvae : they present recordings of a huge part of central nervous system and the activity evoked by auditory stimulations

Les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) sont des polluants ubiquistes dont le niveau d’émission est en constante augmentation en raison de l’intensification des activités anthropiques. Ces composés semi-persistants dans l’environnement représentent une menace pour les organismes. La santé et l’équilibre des systèmes naturels sont essentiels au maintien de la vie et au fonctionnement de la société. L’évaluation de l’impact de ces composés est alors devenue un véritable enjeu sociétal, établissant ainsi des mesures européennes législatives (Directive Cadre sur l’Eau) et réglementaires (REACH, enregistrement, évaluation, autorisation et restriction de produits chimiques) pour une meilleure gestion des risques (éco)toxicologiques. Dans ce contexte, de nombreux biotests ont vu le jour afin d’évaluer la dangerosité des substances chimiques (ou de leurs mélanges), la qualité du milieu environnant et de comprendre les mécanismes d’action toxique sur les organismes. L’objectif de cette étude était alors de définir les risques (éco)toxicologiques liés à des expositions par les HAP à travers des tests embryo-larvaires de poisson, utilisant un modèle éprouvé, le poisson zèbre Danio rerio. Afin d’évaluer le transfert, le devenir et les effets toxiques de HAP, deux approches complémentaires (chimique et biologique) ont été utilisées. Les réponses biologiques induites ont été évaluées à différents niveaux d’intégration biologique, des réponses moléculaires (stress oxydatif, dommages à l’ADN, EROD) aux modifications comportementales (Réponse PhotoMotrice), en passant par des altérations morphologiques et physiologiques (rythme cardiaque). Parmi les trois voies de contamination utilisées, l’exposition par contact avec le sédiment ne s’est pas révélée appropriée pour l’évaluation de la toxicité de HAP, contrairement aux expositions par voie aqueuse à partir de fractions hydrosolubles de produits pétroliers, qui sont plus reproductibles, intégratives et révélatrices des effets toxiques à plusieurs échelles. Suite à ces expérimentations, le champ d’observation des effets induits devrait être élargi au-delà des temps normalisés par l’Organisation de Coopération et de Développement Économique afin de ne pas sous-estimer le caractère létal du ou des composé(s) exposés. De plus, notre étude multigénérationnelle a mis en évidence des perturbations physiologiques et comportementales chez la première génération de descendance issue de parents contaminés par voie trophique à trois extraits aromatiques d’origine pyrolytique et pétrogénique (lourd et léger). Bien que le transfert de la contamination n’a pas été révélé, les altérations observées (probablement dues à des modifications génétiques et épigénétiques) chez les stades précoces de poisson zèbre, pourraient avoir des conséquences néfastes sur la survie et le recrutement des populations. Les études multigénérationnelles constituent ainsi des approches intégrées pour l’évaluation de la toxicité des composés exposés et permettent de renforcer le caractère prédictif des effets. Ces études écotoxicologiques devraient être largement déployées afin d’évaluer le potentiel qu’une population exposée a pour se maintenir dans le futur
PAHs are ubiquitous widespread contaminants which emissions are overgrowing with increasing anthropogenic activities. These semi-persistent chemicals are threatening organisms in the environment. Ecosystems health and resilience are essential to life and societal functioning. Impact assessment of these chemicals is a real requirement for society thereby establishing the european legislative (DCE, Water Framework Directive) and regulations (REACH, Registration, Evaluation, Authorisation and Restriction of Chemicals) for better (eco)toxicological risk management. In this context, many bioassays have been developed to assess environmental quality, the toxicity of chemicals (including mixture) on organisms and its underlying mechanisms. This study aimed to identify (eco)toxicological risks in the context of fish embryo-larval assay, using a relevant and well-known model : the zebrafish Danio rerio. Two complementary approaches (chemical and biological) were used to assess transfer, fate and toxicity of PAHs. Induced-responses were evaluated at different levels of biological organization, from molecular (oxidative stress, DNA damage, EROD) to physiological (cardiac activity), behavioral (PhotoMotor Response) and morphological levels. Among the three exposure routes tested, the sediment contact exposure was not suitable for PAHs toxicity assessment. In contrast, exposures to water-accommodated fractions (WAF) of petroleum products represented a more reproducible, sensitive and integrative approach for testing multiscale toxic effects. Following these experiments, the observation scope of induced effects should be broadened beyond the standard duration recommended by the Organization for Economic Cooperation and Development in order not to underestimate the acute effect of the tested-compounds. Furthermore, our multigenerational study showed physiological and behavioral disturbances on the first generation of offspring providing from parents exposed to contaminated-food with three aromatic extracts pyrolytic and petrogenic origin (heavy and light). Although the contamination transfer of PAHs has not been revealed, the observed alterations (probably due to a transfer through genetic and epigenetic modifications) in the early stages of zebrafish could have adverse effects on survival and recruitment populations. Multigenerational studies prove to be an integrated approach for the toxicity assessment of chemicals and strengthen the predictive effects. These ecotoxicological studies should be widely undertaken to evaluate the potential for exposed-population to maintain in the future time

Le transport moléculaire dans les neurones joue un rôle essentiel dans leur développement et la maintenance de leurs fonctions, en raison notamment de leurs longues arborescences. Les conséquences d’anomalies du transport axonal ont été associées de longue date à la maladie d’Alzheimer telle que le gonflement des axones consécutif à l’accumulation des organelles transportés, mais il y a peu d’outils permettant l’étude fine sur le long terme de ce transport en culture et encore moins in vivo.L’équipe dans laquelle cette thèse a été réalisée a développé une méthode de mesure du transport intraneuronal en culture de neurone de souris reposant sur le suivi d’endosomes ayant internalisé spontanément des nanodiamants fluorescents. Elle a également démontré la grande sensibilité de cette méthode à détecter des facteurs de risques génétiques de maladies neuropsychiatriques.L’objectif de ma thèse a été d’étendre cette méthode de mesure au circuit neuronal intègre du cerveau de larves de poisson zèbre. Pour ce faire j’ai utilisé des nanocristaux (NCs) à réponse optique non-linéaires, pouvant être excité dans une fenêtre de transparence des tissus, à une longueur d’onde ≈1 µm, et générant un signal de second harmonique (SHG). Nous avons utilisé le microscope multiphoton de la plateforme Emerg’In (INRAE, Jouy-en-Josas) qui est installée au sein d’une pisciculture et dispose de scanners galvanométriques résonants et de détecteurs hybrides, ce qui nous a permis de maintenir une cadence de 20 champs par seconde malgré la nécessité de balayer le faisceau laser, contrairement aux études en culture, menées en champ large.Nous avons mis au point un nouveau protocole de mesure, depuis l’injection des NC jusqu’à l’extraction des paramètres de transport à partir des données vidéos. Pour cela, j’ai optimisé et automatisé les analyses des données en développant deux programmes écrits en Python : l’un permettant de reconstruire automatiquement les trajectoires des NCs de manière la plus fidèle possible et l’autre permettant de segmenter les trajectoires en phases de mouvement et de pauses afin d’en extraire des paramètres de transport.J’ai appliqué ces nouveaux outils à l’étude, sur un modèle transgénique de poisson zèbre, de l’impact fonctionnel d’une mutation présente dans des neuropathies dont une paraplégie spastique héréditaire et la maladie de Charcot-Marie-Tooth périphérique. Chez des patients atteints par l’une de ces maladies, plusieurs mutations ont été identifiées sur le gène KIF5A codant pour la chaine lourde du moteur moléculaire kinésine 1 qui assure des déplacements antérogrades (du corps cellulaire vers la périphérie). Nous avons mesuré le transport d’endosomes dans les axones de neurones du cerveau de larve de poissons zèbres transgéniques portant une mutation sur kif5a, et avons observé des modifications subtiles de ce transport. Pour cela, plus de 500 trajectoires d’endosomes (acquises à une profondeur de ≈100 µm sous la surface de la tête) ont été analysées, issues de 40 larves.En guise de contrôle, nous avons également étudié le transport endosomal dans des mutants privés des moteurs dynéines, les seuls à assurer le transport rétrograde, et avons observé que le transport bidirectionnel était totalement arrêté dans les mutants.La méthodologie mise en place peut servir à cribler des anomalies fonctionnelles résultant de facteurs génétiques de troubles neurologiques ou neurodégénératifs
Molecular transport in neurons plays an essential role in their development and the maintenance of their functions, due in particular to their long branches. The consequences of axonal transport abnormalities have long been associated with Alzheimer's disease, such as the swelling of axons caused by the accumulation of transported organelles. However, there are few tools allowing the detailed long-term study of this transport in culture and even less in vivo.The team in which this work was conducted has developed a method for measuring intraneuronal transport in mouse cultured neurons based on the tracking of endosomes having spontaneously internalized fluorescent nanodiamonds. This technique was able to detect genetic risk factors of neuropsychiatric diseases, proving its high sensitivity.The objective of my thesis was to extend this measurement method to the neuronal circuit of the zebrafish larvae’s brain. For this purpose, I have used nanocrystals (NCs) with non-linear optical response, which can be excited in a tissue transparency window at a wavelength ≈1 µm, and generate a second harmonic signal. We have used the multiphoton microscope of the Emerg'In facility (INRAE, Jouy-en-Josas), which is installed next to a fish farming and has resonant galvanometric scanners and hybrid detectors, which allowed us to maintain a frame rate of 20 fps despite the need to scan the laser beam, unlike in culture studies conducted in wide field.We have developed a new measurement protocol, from the injection of the NC to the extraction of transport parameters from the videos data. To do this, I have optimized and automated the data analysis by developing two programs written in Python: one that automatically reconstructs the trajectories of the NCs as faithfully as possible and the other that segments the trajectories into motion and pause phases in order to extract transport parameters.I have applied these new tools to study, in a transgenic zebrafish model, the functional impact of a mutation present in neuropathies including hereditary spastic paraplegia and peripheral Charcot-Marie-Tooth disease. In patients suffering from one of these diseases, several mutations have been identified in the KIF5A gene coding for the heavy chain of the kinesin 1 molecular motor which ensures anterograde movements (from the cell body to the periphery). We have measured endosome transport in axons of neurons in the brain of transgenic zebrafish larvae bearing a mutation on kif5a, and we observed subtle changes in this transport. More than 500 endosome trajectories (acquired at a depth of ≈100 µm below the surface of the head) were analyzed from 40 larvae.As a control, we also studied endosomal transport in mutants deprived of dynein motors, the only ones to ensure retrograde transport, and observed that bi-directional transport was totally stopped in the mutants.This methodology can be used to screen for functional abnormalities resulting from genetic factors of neurological or neurodegenerative disorders

L'utilisation de modèles animaux a permis la découverte de mécanismes importants du développement tumoral et la mise au point de nouveaux traitements. Le poisson zèbre (Danio rerio), est de plus en plus utilisé dans le cadre de ces recherches du fait de ses nombreux avantages comme la transparence de ses larves. Des approches par transplantation de cellules tumorales de mammifères se sont développées récemment chez ce téléostéen. Elles permettent d’étudier le devenir des cellules injectées et leurs réponses aux traitements en tenant compte des interactions entre cellules cancéreuses et leur environnement. Dans ce contexte, nous avons mis au point des modèles de leucémies par transplantation de cellules de lignées humaines et validé la pertinence de ces modèles dans des études pharmacologiques. Une seconde approche, basée sur la transplantation de cellules leucémiques primaires de patients a permis une caractérisation des cellules susceptibles de coloniser les larves de poisson. Le monoxyde d’azote (NO) semble jouer un rôle ambivalent dans le développement tumoral. Nous avons développé un nouveau modèle in vivo afin de mieux comprendre l’origine et les conséquences de la production de NO dans l’environnement tumoral. L’utilisation de diaminofluorophores dans un modèle de xénotransplantation de gliomes de rat nous a permis de mettre en évidence une production de NO in situ dans l’environnement tumoral. Enfin, la possibilité de suivre le développement de cellules cancéreuses in vivo d’étudier des protéines potentiellement impliquées dans la progression tumorale. Nous avons caractérisé une famille de protéines susceptibles d’intervenir dans ce processus : les nonaspanines
New cancer model development allowed new approach to understand important mechanisms involved in tumour progression and to develop new treatments. Due to its advantages, such as embryos transparency, zebrafish (Danio rerio) is more and more used in biological experimentation, and recently in cancer research. By transplanting mammalian tumour cells in zebrafish larvae, several models have been obtained. Such models allowed cancer cells development and response to several treatment , considering cancer cells and tumour interactions. We developed leukaemia models based on human cell lines transplantations. We also validated our models in pharmacological assays. Another model was obtain by injecting human leukaemia primary cells extract from patient blood and allowed us to define leukaemia cell fraction that can colonize zebrafish larvae. Nitric oxide (NO) involvement during tumour progression is ambivalent and still discussed. We developed a new in vivo model to analyse nitric oxide production and roles in tumour environment by using diaminofluorophores in a rat glioma xenograft model. By following tumour cell in vivo, we are able to study proteins that may be involved in tumour progression. We characterized a protein family called nonaspanins

Il a été démontré que les protéines de choc thermique (HSP) jouent un rôle important dans l'érythropoïèse. Or, l'expression des gènes HSP est contrôlée par le facteur de choc thermique 1 (HSF1), un facteur de transcription hautement conservé. Jusqu'à présent, une compréhension détaillée de la fonction d’HSF1 dans l'érythropoïèse reste à établir. Dans notre étude, nous avons utilisé le poisson zèbre, modèle animal pertinent, pour étudier le rôle du gène hsf1 pendant l'érythropoïèse embryonnaire. Nous avons établi des lignées de poisson-zèbre invalidées pour le gène hsf1 en utilisant la technologie CRISPR/Cas9 et nous avons effectué des analyses phénotypiques tout au long de l'embryogenèse. Nous avons constaté que les embryons déficients en Hsf1 ont un nombre réduit d'érythrocytes primitifs, alors que le nombre d'érythrocytes chez les poissons zèbres adultes reste inchangé. L'expression des gènes embryonnaires des chaînes a et b-globines est réduite ainsi que l'expression de gata1. De plus, la morphologie des érythrocytes révèle une inhibition de la maturation des érythrocytes. En revanche, aucun changement significatif n'a été observé dans les cellules myéloïdes.Nos résultats montrent que le gène hsf1 est un régulateur positif de la maturation des érythrocytes in vivo
Heat shock proteins (HSPs) are reported to play an important role in erythropoiesis. The expression of HSP genes is mainly controlled by Heat shock factor 1 (HSF1), a highly conserved transcription factor. So far, a detailed understanding of the function of HSF1 in erythropoiesis remains uncharacterized. This study has employed zebrafish as a relevant model to investigate the role of Hsf1 during embryonic erythropoiesis. We established hsf1-disrupted zebrafish lines using the CRISPR/Cas9 technology and performed phenotypic analyses throughout embryogenesis. We found that Hsf1 deficient embryos had a decreased number of primitive erythrocytes, while erythrocyte number in adults was unchanged. In Hsf1 deficient embryos, expression of embryonic a and b-globin genes was reduced as well as gata1 expression. In addition, the morphology of erythrocytes suggested an inhibition of erythrocyte maturation. On the other hand, no significant changes were observed in myeloid cells.Altogether our results support a key role for Hsf1 in erythrocyte maturation in vivo

Contrairement aux mammifères, le système nerveux central du poisson téléostéen adulte possède un potentiel énorme de neurogenèse et de régénération après une lésion cérébrale. Chez le poisson zèbre adulte, de nouveaux neurones peuvent être régénérés à partir de progéniteurs constitutifs ou latents. Au cours de mon doctorat, je me suis intéressée aux capacités de régénération neuronale du cerveau moyen dorsal (le toit optique, TO) chez le poisson zèbre. Le TO présente à sa périphérie une zone de progéniteurs de type neuroépithélial à l’origine des neurones et des cellules épendymogliales qui le constituent. J’ai tout d’abord identifié un enhancer potentiel du gène meis2a, qui m’a permis d’effectuer des lignages cellulaires de progéniteurs neuroépithéliaux. En contexte homéostatique, j’ai montré que ces progéniteurs construisent la totalité du TO pendant le développement et soutiennent sa neurogenèse continue pendant la croissance post-embryonnaire. A la suite d’une lésion cérébrale chez la larve et l’adulte, le TO à la capacité de générer de nouveaux neurones, toutefois sa structure topographique n’est pas restaurée. Chez l’adulte, j’ai montré que les progéniteurs constitutifs neuroépithéliaux et des progéniteurs latents épendymogliaux sont activés lors du processus de régénération
Unlike mammals, the adult teleost brain exhibits widespread neurogenic activity and can regenerate after injury. The adult zebrafish has the capacity to regenerate neurons from constitutive or latent progenitors. During my PhD, I studied the neuronal regeneration in the zebrafish dorsal midbrain (optic tectum, OT). At adult stage, neuroepithelial-like progenitors at the OT periphery contribute to neuronal and glial lineages during homeostasis.I identified a putative enhancer of meis2a, which allowed me to trace the progeny of neuroepithelial-like progenitors. In a non-regenerative context I showed that enhancer-targeted progenitors were at the origin of the whole structure during development and of its continued neurogenesis during post-embryonic growth.Following lesion, OT displayed reactive neurogenesis, at larval and adult stages, nevertheless its topographical structure remained altered. In adults, I showed that both constitutive neuroepithelial-like progenitors and latent ependymoglial progenitors were activated in a regenerative context