Academic literature on the topic 'Kallicréines – Inhibiteurs'

Les kallicreines sont des proteases a serine responsables de la liberation de peptides vasoactifs : les kinines (bradykinine et kallidine) par hydrolyse des kininogenes lors des phenomenes inflammatoires. Depuis une dizaine d'annees, la generation des kinines par les kallicreines est consideree comme cruciale dans les maladies inflammatoires. Ainsi un certain nombre d'antagonistes des recepteurs des kinines sont actuellement en developpement. En revanche, la strategie visant a empecher la formation des kinines reste peu etudiee. Ainsi, a partir de la sequence des substrats naturels de ces proteases (les kininogenes) nous avons synthetise des molecules de petites tailles et de nature non peptidiques. Pour cela nous avons utilise un motif contraint non peptidique (une benzothiazepinone) remplacant le dipeptide pro-phe present dans la sequence c-terminale des kinines. L'introduction de divers groupements chimiques de part et d'autre de ce motif nous a permis d'obtenir une molecule tete de serie. Apres avoir mis au point les tests pharmacologiques permettant l'evaluation de l'activite inhibitrice des molecules synthetisees, nous avons realise une etude de relation structure activite a partir de notre tete de serie et obtenu des inhibiteurs des kallicreines plasmatique et tissulaire humaines dont les activites sont inferieures au micromolaire. Ces composes sont en majorite selectifs de la kallicreine plasmatique. Une etude par modelisation moleculaire a egalement ete realisee sur deux molecules presentant une forte homologie de sequence mais ayant une activite inhibitrice tres differente sur la kallicreine tissulaire. Cette etude nous a permis d'envisager un certain nombre de modifications pour ameliorer l'activite inhibitrice de nos inhibiteurs.

Les kallikréines (KLKs) tissulaires humaines sont des protéases à sérine « (chymo)trypsine-like » impliquées dans divers processus physiologiques. Parmi les 15 isoformes connues dans la littérature, la kallikréine 7 (KLK7) est particulièrement impliquée dans les processus de desquamation. La dérégulation de cette enzyme est associée à diverses atteintes dermatologiques, telles que le psoriasis ou la maladie de Netherton. Il est également admis que cette enzyme participe à l'invasion tumorale et à la progression du cancer de la prostate, des ovaires et du pancréas. L'utilisation d'inhibiteurs de la KLK7 pourrait donc constituer une approche prometteuse pour le traitement de certaines atteintes dermatologiques, et pour lutter contre la dissémination métastatique.Depuis deux décennies, plusieurs inhibiteurs synthétiques de cette isoforme ont été développés. Toutefois, la plupart de ces molécules présentent une sélectivité insuffisante et sont dépourvues de propriétés physicochimiques adaptées à une utilisation in vivo. Ce travail de thèse est consacré à la synthèse d'inhibiteurs réversibles et sélectifs de la KLK7. A ce titre, deux séries de composés ont été explorées. La première est issue d'un criblage de molécules pyrido-imidazodiazépinones, qui a permis d'identifier un inhibiteur réversible et sélectif de la KLK7, le JMV4967 (IC50 = 57,0 µM). Ce composé se caractérise par la présence, en position 2 du cycle diazépinique, d'un noyau phényle substitué en ortho par un groupement méthyle. Sur la base de ces résultats, une étude de relations structure-activité (SAR), a été initiée. Les meilleures inhibitions ont été obtenues avec les analogues du JMV4967 possédant en position 2 du cycle diazépinique, un groupement 3,4,5-triméthoxyphényle ou 3,4-diméthoxyphényle. Cette étude a permis l'identification du composé JMV5046 (IC50 = 33,5 µM). Une étude biochimique du JMV5046, a mis en évidence son caractère réversible et compétitif vis-à-vis du substrat dans le site actif de la KLK7, comme le hit initial. La seconde série a été développée à partir d'une quinazoline substituée par un amino-benzimidazole, et une étude de RSA a également été menée. Finalement, une étude de réactivité chimique, a été également entreprise afin d'accéder à deux nouvelles séries de composés diazépiniques fusionnés avec l'imidazo[1,2-a]pyridine ou l'indole. Cette étude a montré que la 2-amino-imidazopyridine pouvait subir une alkylation en position 3 du cycle, dans le cadre de la réaction de nitro-Michael. Les produits d'addition de Michael ainsi formés peuvent ensuite conduire, après réduction du groupement nitro, aux dérivés diazépiniques correspondants. Par ailleurs, nous avons pu montrer que l'acylation du 2-amino-indole, en présence d'un donneur d'acyle de type ester activé d'acide aminé, conduisait aux dérivés N-acylés correspondants. Ces derniers ont été utilisés par la suite, pour la synthèse de dérivés indolodiazépiniques via la réaction de cyclisation de Pictet-Spengler. La synthèse de ces composés, l'étude de leur activité inhibitrice sur la KLK7 sont décrites. Les expériences de modélisation moléculaire par docking in silico, permettant de préciser les bases structurales de l'inhibition de la KLK7 par le JMV5046, sont également présentées
Human tissular kallikreins (KLKs) are members of (chymo)trypsin-like serine proteases, involved in various physiological pathways. Among the 15 known isoforms in the literature, kallikrein 7 (KLK7) plays a significant role in physiological and pathophysiological processes of the skin, like psoriasis and the Netherton syndrome. Several studies report also its implication in multiple processes leading to invasive and metastatic tumor growth, especially in prostatic, ovarian and pancreatic cancers. Strategies focused on KLK7 inhibition are a promising alternative for the treatment of such dermatological diseases, and to avoid metastatic dissemination. In the last two decades, many synthetic inhibitors of this KLK isoform have been developed. However, most of these molecules exhibit low selectivity and unsuitable physicochemical properties for in vivo use. This thesis is devoted to the synthesis of selective and reversible inhibitors of KLK7. Two series of compounds have been explored. The first one, derived from a screening of pyrido-imidazodiazepinones compounds, which led to the discovery of a reversible and selective inhibitor of KLK7, JMV4967 (IC50 = 57.0 µM). This compound is characterized by the presence of an ortho methyl substituted phenyl group, at position 2 of the diazepine ring. Based on these results, a structure-activity relationships (SAR) study was initiated. The best inhibitions were obtained with JMV4967analogs bearing a 3,4,5- trimethoxyphenyl group or 3,4- dimethoxyphenyl group, at position 2 of the diazepine ring. This study led to the discovery of one compound, JMV5046 (IC50 = 33.5 µM). A biochemical study of JMV5046, highlighted its reversible and competitive behavior against the substrate in the KLK7 active site, as previously observed for the initial hit. The second series was developed from an amino-benzimidazole substituted quinazoline, and a SAR study was also carried out. A chemical reactivity study was also initiated to access two new series of imidazo[1,2-a]pyridine-fused or indole-fused diazepine compounds. This study showed that 2-amino-imidazopyridine could undergo alkylation at position 3 of the ring, in the nitro-Michael reaction context. The obtained Michael adducts could then give, after reduction of the nitro group, the corresponding diazepine derivatives. We also showed that, in the presence of an acyl donor (as an activated amino acid ester), 2-amino-indole was N-acylated, unlike the 2-amino-imidazopyridine which leads to an exclusive C-acylation in the same conditions. The N-acylated derivatives were then used for the indolodiazepines synthesis, using Pictet-Spengler cyclization reaction.The synthesis of these compounds and their inhibiting activity against KLK7 are described. Molecular modeling experiments by in silico docking, to determine the structural requirements for KLK7 inhibition by JMV5046, are also presented

La thèse s’inscrit dans le cadre d’un projet ANR ‘GENOPAT’ visant à identifier des inhibiteurs organiques de protéases à sérine impliquées dans le syndrome de Netherton. Le syndrome de Netherton est une maladie génétique cutanée rare due à des mutations au niveau du gène SPINK5 codant pour l’inhibiteur macromoléculaire (LEKTI), celui-ci perd alors sa fonction régulatrice de l’activité de protéases à sérine (les kallikréines tissulaires 5,7 et 14) indispensable à l’homéostasie de la peau. Il n’existe à ce jour aucun traitement curatif, une application topique d’inhibiteurs exogènes permettrait donc de restaurer les fonctions de la barrière épidermique. Trois stratégies ont été suivies pour identifier de nouveaux inhibiteurs organiques de kallikéines, une approche rationnelle et une approche par criblages in silico et in vitro. 1) À partir de la petite collection du laboratoire de dérivés coumariniques (240 molécules), des inhibiteurs de type « substrat suicide » des kallikréines ont été sélectionnés et caractérisés d’un point de vue mécanistique. 2) En parallèle, une approche semi-rationelle basée sur l’exploitation de bases de données de criblages expérimentaux haut débit a permis de révéler de nouveaux composés 1,2,4 triazoles, formant des acyl-enzymes de stabilités variables. 3) Un criblage virtuel de la chimiothèque commerciale Chembridge qui comptait environ 600 000 molécules organiques a permis d’identifier des inhibiteurs non-covalents des kallikréines, ces inhibiteurs présentent une grande diversité structurale. La plupart des inhibiteurs parmi les plus efficaces sont dépourvus de toxicité vis-à-vis de kératinocytes sains. Leur effet sur des cytokines pro-allergiques et inflammatoires a été analysé sur des kératinocytes de patients atteints du syndrome de Netherton. Une inhibition significative de l’expression de ces cytokines a été observée
The thesis is part of an ANR 'GENOPAT' project aiming to identify organic inhibitors of serine proteases involved in Netherton syndrome. Netherton's syndrome is a rare genetic skin disease caused by mutations in the gene encoding SPINK5 macromolecular inhibitor (LEKTI), it loses its regulating function of the activity of serine proteases (tissue kallikrein 5 , 7 and 14) esential for the skin homeostasis. There is currently no cure, topical application of exogenous inhibitors would therefore restore function of the epidermal barrier. Three strategies have been followed to identify new organic inhibitors of kallikreins, both rational approach and approaches based screening in silico and in vitro. 1) From a small laboratory collection of coumarin derivatives (240 molecules), suicide substrates of kallikreins were selected and characterized from a mechanistic point of view. 2) In parallel, a semi-rational approach based on the use of databases of experimental high throughput screening revealed 1,2,4-triazole compounds, forming acyl-enzyme with varying stabilities. 3) A virtual screening of the Chembridge commercial chemical library with about 600,000 organic molecules identified non-covalent kallikrein inhibitors, these inhibitors have a great structural diversity. Most inhibitors are among the most effective non-toxic with respect to healthy keratinocytes. Their effect on pro-allergic and inflammatory cytokines was analyzed in keratinocytes of patients with Netherton syndrome. A significant inhibition of the expression of these cytokines was observed

La maladie d’Alzheimer est une maladie neurogénédérative progressive. Cependant, il n’existe pas à ce jour de traitement ni de diagnostic pré-mortem. L’un des enjeux de la recherche sur cette maladie est de la diagnostiquer avant l’apparition de symptômes irréversibles et donc de prévenir sa progression. Une nouvelle hypothèse serait que la kallicréine 8 (KLK8) ou neuropsine, une protéase à sérine majeure du système nerveux central, serait impliquée dans le développement de différentes voies physiopathologiques associées à la maladie. Cependant, malgré l’intérêt croissant pour cette cible, aucun inhibiteur thérapeutique potentiel n’avait été identifié au début du travail de thèse. Par ailleurs, la dyshoméostasie du fer est également une caractéristique clé des maladies neurodégénératives, telle que la maladie d'Alzheimer. Après un criblage initial à large spectre, nous avons découvert deux séries de composés chimiques, les 1,2,4-triazoles et les N,N,N-triacylamines, qui inhibent la KLK8. Nous avons entrepris de concevoir et synthétiser de façon rationnelle les premiers inhibiteurs organiques de la KLK8 à l’aide de pharmacomodulations puis de caractériser leur mécanisme d'inhibition. Pour chaque série, une étude de relation structure-activité a été réalisée dans l’objectif d’optimiser le pouvoir inhibiteur, et la sélectivité des inhibiteurs envers d'autres protéases à sérine a été également évaluée. Ainsi, les N,N,N-triacylamines démontrent une très bonne affinité envers la KLK8 tandis que les dérivés du Déférasirox inhibent certes la KLK8 avec une affinité modérée mais présentent simultanément des propriétés de chélation avec le fer. En conclusion, ce travail de thèse a permis d’identifier deux séries chimiques constituant les premiers inhibiteurs rapportés de la KLK8 et une base pour l’optimisation de nouvelles générations de composés multifonctionnels
Alzheimer’s disease is a progressive neurodegenerative disease. However, to date, there is no treatment or pre-mortem diagnosis. One of the challenges of research into this disease is to diagnose it before the apparition of irreversible symptoms, and thus prevent its progression. A new hypothesis is that kallikrein 8 (KLK8) or neuropsin, a major serine protease of the central nervous system, is involved in the development of various pathophysiological pathways associated with Alzheimer's disease. However, despite growing interest in this target, no potential therapeutic inhibitor had been identified at the beginning of the thesis. Iron dyshomeostasis is also a key feature of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's. After an initial broad-spectrum screening, we identified two series of chemical compounds, 1,2,4-triazoles and N,N,N-triacylamines, which efficiently inhibit KLK8. We set out to rationally design and synthesize the first organic KLK8 inhibitors using pharmacomodulations, and then to characterize their mechanism of inhibition. For each series, a structure-activity relationship study was carried out with the aim of optimizing inhibitory potency, and the inhibitors' selectivity towards other serine proteases was also assessed. Hence, N,N,N-triacylamines showed very good affinity towards KLK8, while derived from deferasirox inhibited KLK8 with moderate affinity, but simultaneously exhibited iron chelation properties. In conclusion, this thesis work has identified two original chemical series constituting the first reported KLK8 inhibitors and a basis for the optimization of new generations of multifunctional compounds

Dans la prostate humaine trois gènes de kallicréines tissulaires codent les protéases HK1, HK2 et HK3, libérées dans le fluide séminal. HK2, récemment purifiée, est étudiée comme marqueur sérique des pathologies prostatiques en remplacement ou en complément du marqueur actuel HK3 (PSA, Prostate specific antigen). HK1 est connue pour son activité productrice de kinine. Dans le tractus génital et les foyers métastatiques. Le rôle de ces protéases est méconnu. L'activité enzymatique de HK1 peut être suivie avec des substrats synthétiques contrairement à celles de HK2 et HK3. Des inhibiteurs de la famille des serpines régulent leur activité ; le PCI (protein C inhibitor) inhibe les trois enzymes. L'#1-Antichymotrypsine (ACT) inhibe HK3 et la Kallistatine HK1. Ces serpines interagissent comme des substrats suicides avec leur protéase cible et sont clivées au niveau de leur boucle réactive. Les séquences entourant ces sites de clivage ont été utilisées pour élaborer des substrats peptidiques fluorogéniques. La même stratégie a été utilisée pour développer des substrats à partir des semenogelines, protéines structurales du coagulum seminal et substrats naturels de HK3. Les peptides dérivés du PCI sont clivés préférentiellement par HK1 et HK2, et après modification permettent d'obtenir des substrats spécifiques pour chacune. Aucun substrat sensible de HK3 n'a pu être développé à partir des serpines ; le clivage d'un peptide dérivé de l'act, inhibiteur physiologique de HK3, obtenu dans des conditions expérimentales optimisées, suggère un mode d'interaction particulier entre ces deux partenaires. Un substrat 100 fois plus sensible que les substrats actuels a été synthétisé pour HK3 à partir d'une séquence entourant un site de clivage post-éjaculatoire de la semenogeline. Les séquences peptidiques de cibles naturelles des Kallicréines ont permis de synthétiser des substrats sensibles et spécifiques ; leur utilisation permettra de mieux comprendre le rôle biologique des enzymes
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La kallikréine humaine 6 (hK6) ou neurosine est la protéase à sérine la plus abondante du système nerveux central (SNC). Sa dualité de fonction dans les processus neurodégénératifs font d’elle une cible privilégiée pour la conception de modulateurs pharmacologiques de son activité. Cependant, il existe aujourd’hui très peu de composés répondant à cette attente. Aussi, le principal objectif de ces travaux de thèse a consisté à identifier des inhibiteurs et activateurs organiques de faible poids moléculaire (<500 Da) de la hK6, compatibles avec un développement clinique. L’étude de la hK6 sous ses différents aspects a permis d’établir son profil catalytique et dynamique et de mettre en évidence son rôle anti-agrégatif de l’α-synucléine endogène. L’exploration de diverses chimiothèques regroupant près de 1 200 molécules a permis d’identifier des molécules touches (hits) qui ont fait l’objet d’études mécanistiques approfondies. Des évaluations par modélisation moléculaire ont également été réalisées afin d’établir les bases structurales de la modulation et un profil de sélectivité de ces molécules vis-à-vis d’autres protéases à sérine concurrentes a pu être établi. Pour la première fois, un modulateur bimodal ainsi qu’un activateur, tous deux hautement sélectifs de la hK6, ont été identifiés et un modèle de régulation allostérique a pu être proposé. Plusieurs inhibiteurs originaux possédant un bon profil de sélectivité vis-à-vis de la hK6 ont également été sélectionnés. Ces molécules ne présentent pas d’effet cytotoxique sur des cultures primaires de neurones. Les composés identifiés au cours de cette thèse constituent ainsi une excellente base pour le développement d’agents pharmacologiques à visée neuroprotectrice et anti-inflammatoire et ouvre la voie à l’exploration de nouveaux sites allostériques au sein de cette enzyme et des protéases à sérine tryptiques
The human kallikrein 6 (hK6) or neurosin is the most abundant serine protease of the central nervous system (CNS). Its dual implication in neurodegenerative processes makes it an emerging target for the design of pharmacological modulators of its activity. Yet today there are only very few compounds that meet this expectation. Thus, the main aim of these thesis was to identify organic low molecular weight (<500 Da) inhibitors and activators of hK6 compatible with clinical development. The study ofhK6 through various aspects has established its catalytic and dynamic profile and highlights its anti-aggregative role of endogenous α-synuclein. Exploring the diverse libraries comprising nearly 1 200molecules led to the identification of key compounds (hits) that have been subjected to extensive mechanistic studies. Assessments by molecular modeling were also carried out to establish the structural basis for activity modulation and selectivity profiling toward competing serine proteases has also been established. For the first time, a bimodal modulator as well as an activator, both highly selective to hK6, were identified and an allosteric regulatory model was proposed. Several original inhibitors having a good selectivity profile toward hK6 were also selected. Furthermore, these molecules do not exhibit any cytotoxic effect on primary neuronal cultures. The compounds identified in this thesis provide an excellent basis for the development of pharmacological agents with neuroprotective and anti-inflammatory properties and pave the way for the exploration of new allosteric sites in hK6 and tryptic serine proteases in general