Academic literature on the topic 'Interazioni proteina'

The concept of "druggable genome" limits the molecular targets for which commercially viable compounds can be developed. In humans, whose genome accounts for about 30,000 genes, it has been calculated that a subset of no more than 3,000 genes express proteins able to bind drug-like molecules. This limit derives from the fact that the ability of a protein to bind a small molecule with the appropriate chemical properties does not necessarily make it a potential drug target, this latter feature being only applied to proteins that are also linked to disease. Among these, it has become evident that the proteins participating in intra- or intercellular communication represent the largest family with about 20-25% of the druggable genome consisting of kinases followed by G-protein coupled receptors (15%) and cation channels (5%), three of the fundamental groups of proteins implicated in signal transduction. For this reason, protein kinases have turned out to be one of the richest target mines, since drugs inhibiting specific kinases are in constant development, and some of them are currently investigated in clinical trials such as Gleevec and Iressa. Most of the structural information currently available about protein kinases is resulting from the continuously growing number of crystallographic structures solved. These studies suggest that the overall architecture of the kinases is quite similar, however, since the ATP-binding site possesses some distinct subsites, different kinases can be targeted by quite selective drugs. Two main objectives will be pursued: a) a search for new potent and selective inhibitors and b) an analysis of the interactions between kinases and related substrates. a) Our laboratory has a long-lasting expertise in targeting the human kinome, especially the protein kinase CK1, CK2 and Aurora-A, all implicated in carcinogenesis; we performed a new virtual screening approach searching for new potent and selective scaffolds against the three kinases. Virtual screening involves the rapid assessment of large libraries of chemical structures in order to guide the selection of potential drug candidates. The results obtained was really encouraging; in fact new good inhibitors for all the three kinases where obtained from the virtual screening strategy. b) The interaction of protein kinases with their substrates and/or effectors represents a key event in the overall picture of cellular regulation. In the case of CK2 more than 300 substrates have been identified the majority of which are phosphorylated both in vitro and in vivo. Our purpose is to highlight the molecular features underlying the interaction between CK2 and its peptides or protein substrates by using our protein-protein docking approach. Protein-protein docking is a computational tool for the prediction of three-dimensional structure of protein complexes from the coordinates of the component's structure.

Leparan solfato è un polisaccaride lineare altamente solfatato appartenente alla famiglia dei glicosamminoglicani. Esso è ubiquitariamente presente in tutte le cellule dei mammiferi e gioca un ruolo importanti in una serie di processi fisiologici e patologici come sviluppo embrionale, infezioni batteriche e virali, risposta infiammatoria e coagulazione del sangue Leparan solfato è composto da ununità disaccaridica di acido glucuronico o iduronico legato ad unammina che può essere solfata o acetilata. La disposizione dei gruppi solfato e la posizione dellacido iduronico sulle catene di eparan solfato sono essenziali per la sua funzione biologica nonostante le relazioni struttura-attività non siano ancora completamente chiarite. Una nuova sintesi chemioenzimatica è stato utilizzata per sintetizzare una serie di derivati oligosaccaridici delleparan solfato con struttura ben definita. Metodi basati sulla risonanza magnetica nucleare sono stati utilizzati per studiare la conformazione dei derivati oligosaccaridici delleparan solfato sia liberi in soluzione che legati allantitrombina. LNMR è stato inoltre utilizzato per determinare la struttura e la conformazione di un mimetico delleparan solfato, attualmente in fase III di sperimentazione clinica, con effetti anti-tumorali grazie alla sua azione inibitoria nei confronti delleparanase. La nuova sintesi chemioenzimatica è stata utilizzata come un valido strumento per progettare e sintetizzare un nuovo inibitore delleparanase.
Heparan sulfate (HS) is a linear highly sulfated polysaccharide belonging to glycosaminoglycans family ubiquitously present in all mammals cell surface that play an important role in different physiological and pathological biological events, like embryonic development, viral and bacteria infections, inflammation response and blood coagulation processes. HS is composed by disaccharide repeating units of glucuronic acid (GlcA) or iduronic acid (IdoA) linked to N-sulfated or N-acetylated glucosamine. The sulfation patterns and locations of IdoA containing domains are essential for the function of HS. The conformation of HS also contributes to its biological function even though the relation structure-activity are still unclear. Novel chemoenzymatic approach was used to synthesize a series of HS derivates with a well-defined structure. NMR-based methods are used study the conformation of heparan sulfate-like oligosaccharides at the free state in solution and in complex with Antithrombin. NMR was used to obtain information regarding the structure and the conformation of a Heparan Sulfate mimetic which deters tumor growth by blocking tumor angiogenesis and prevents tumor cells from spreading via heparanase inhibition. Novel chemoenzymatic synthesis was used as a valid tool to design and synthetize a novel heparanase inhibitor.

Despite a century of often successful prevention and treatment efforts, infectious diseases remain an important global problem in public health, causing over 13 million deaths each year. This work has been developed on two areas of major concern nowadays: HIV-1 infection and emerging antimicrobial resistance. The first part of this thesis focused on the definition of the biological role of the dimerization of Nef, HIV-1 accessory protein. This function has been reported to take place in vivo, neveretheless it hasn’t been well characterized yet. We believe that the inihibition of Nef oligomerization may become an innovative and successful antiviral therapy. For this reason, we screened two different libraries of small molecules and peptides, to discover compounds hindering Nef-Nef interaction in vitro. The characterization of the viral protein aminoacidic residues taking part in the interaction with the compounds will provide precise indications about the dimerization surface. This region has not been identified unambiguously yet. Moreover, the administration of small molecules to HIV-1 infected cells will shed light on the effects of Nef dimerization inhibition on the viral life and infectious cycle. The second part of this work, aimed at determining the prevalence of fluoroquinolone resistance in Enterobacteriaceae samples, within our region. We focused our attention on the recently discovered plasmid-mediated mechanisms (PMQR). In the recent years, PMQR have spread rapidly all over the world, causing serious health concern, as they are often linked to both quinolone resistance and ESBL, giving rise to multi-resistant strains. Our study proved the large diffusion of these resistance determinants in the North East Italy. Furthermore, as the identification of new effective antimicrobial drugs is gaining more and more importance recently, we analysed the pharmacological activity and the mechanism of action of simocyclinone (SD8), a new antibiotic. SD8 has been demonstrated to have a broad spectrum of action, affecting both Gram positive and Gram negative bacterial species, so SD8 is likely to become a new antitopoisomerase drug.
Nonostante l’ultimo secolo sia stato caratterizzato da un’intensa ed efficace attività di prevenzione e trattamento farmacologico, l’incidenza delle patologie di origine infettiva, che causano la morte di 13 milioni di individui ogni anno, continua a destare forte preoccupazione, rimanendo uno dei problemi maggiori per la sanità pubblica mondiale. Il lavoro svolto in questa tesi è stato sviluppato su due argomenti di rilevante interesse in questo periodo, le infezioni da HIV-1 e la diffusione della resistenza ai farmaci antimicrobici. La prima parte del lavoro ha analizzato il ruolo biologico della dimerizzazione di Nef, proteina accessoria di HIV-1, funzione già dimostrata avvenire in vivo, ma finora non approfonditamente caratterizzata. Ritenendo che l’inibizione della formazione di oligomeri possa essere un’innovativa e promettente strategia antivirale, sono stati selezionati composti chimici e piccoli peptidi, che interferiscono con l’interazione Nef-Nef in vitro. L’analisi dei residui amminoacidici della proteina oggetto di studio, coinvolti nel legame ai composti, darà precise indicazioni sulla regione coinvolta nella formazione degli oligomeri, regione ancora non definita dai precedenti lavori presenti in letteratura. Inoltre, la somministrazione delle molecole a cellule infettate dal virus HIV-1, rivelerà quali siano le conseguenze dell’inibizione della dimerizzazione di Nef sul ciclo infettivo virale. La seconda parte del lavoro ha, invece, riguardato la determinazione della prevalenza della resistenza ai fluorochinoloni negli isolati di Enterobacteriaceae all’interno della nostra regione. Sono stati presi in considerazione i meccanismi di resistenza mediati da plasmide (PMQR). Si tratta di tipologie di resistenza recentemente descritte, ad ampia e rapida diffusione in tutto il mondo, spesso in correlazione con ESBL (Extended Spectrum Beta Lactamase), che stanno destando notevole preoccupazione in ambito clinico. Lo studio svolto ha rivelato che si tratta di plasmidi largamente diffusi anche nella nostra regione, che in molti casi veicolano resistenza a più classi di antibiotici, ad esempio chinoloni e beta-lattamici. Vista, inoltre, l’importanza di individuare nuove efficaci molecole ad attività antimicrobica, è stata analizzata l’attività farmacologica e il meccanismo d’azione dell’antibatterico simociclinone (SD8). È stato dimostrato che SD8 abbia un ampio spettro d’azione, agendo sia su ceppi batterici Gram positivi che Gram negativi, e sia un buon candidato per lo sviluppo di un nuovo farmaco antitopoisomerasico.

Questa tesi è incentrata sulla modellazione del binding ligando-proteina con metodi computazionali basati sulla dinamica molecolare. La comprensione di questo processo è fondamentale per la progettazione e la scoperta di nuovi farmaci e l'uso di metodi computazionali per supportare la ricerca sperimentale in questo campo è in costante crescita. Oggi, grazie alla crescente potenza dei computer, è possibile studiare l'intero processo di binding/unbinding del ligando e ottenere stime sulle proprietà termodinamiche e cinetiche. Alla luce di ciò, durante il mio dottorato, diversi metodi avanzati di dinamica molecolare classica (MD) sono stati impiegati e confrontati per identificare un approccio computazionale efficace per studiare i processi di binding/unbinding dei ligandi. In particolare, è stato sviluppato un protocollo basato sulla combinazione degli approcci steered MD (sMD) e Metadinamica (MetaD) con Path Collective Variables (PCVs) con lo scopo di utilizzare i vantaggi di entrambi i metodi per ottenere una descrizione completa del processo. Mentre il metodo SMD è stato impiegato per studiare diversi percorsi di disassociazione e identificare quello preferito, la MetaD con le PCVs è stato utilizzato per determinare più accuratamente l'energia libera di legame. Il protocollo proposto è stato applicato con successo per studiare il legame del ligando al fattore inducibile dell'ipossia (HIF-2α) e ha dimostrato di essere efficace per le simulazioni effettuate sia su una struttura a raggi X nota del ligando-proteina che su una posa di docking. D'altra parte, la maggior parte dei metodi MD richiede la produzione di diverse repliche o lunghe simulazioni per campionare più volte l'evento di binding/unbinding al fine di ottenere una statistica affidabile del processo. Questo produce la necessità di metodi in grado di analizzare tutti gli eventi simulati in una sola volta e di fornire un quadro chiaramente interpretabile delle differenze nei pathway campionati. Per questo motivo, è stato sviluppato un tool basato sulle mappe auto-organizzanti (SOM). Lo strumento PathDetect-SOM (Pathway Detection on SOM), sfruttando i vantaggi dell'ordinamento topologico della SOM, permette di rappresentare visivamente i percorsi di legame campionati durante diversi eventi/repliche MD in una chiara rappresentazione bidimensionale. Inoltre, possono essere derivati suggerimenti sulle proprietà cinetiche e termodinamiche del processo. Lo strumento è stato applicato con successo a diversi casi di studio per dimostrare la sua applicabilità generale. Inoltre, come parte di un progetto eseguito presso il centro di ricerca Jülich (Istituto di Simulazioni Avanzate e Istituto di Neuroscienze e Medicina) sotto la supervisione del Prof. Paolo Carloni, è stata testata una nuova interfaccia ibrida di meccanica quantistica/meccanica molecolare (QM/MM) (MiMiC). Il codice, che permette simulazioni di dinamica molecolare QM/MM di sistemi biomolecolari, è stato applicato alla proteina chinasi mitogeno-attivata p38 in complesso con il ligando 2g per studiare il processo di unbinding del ligando. L'attenzione si è concentrata sulla prima fase del processo che coinvolge la dinamica del ligando nel suo stato legato. Le simulazioni MD QM/MM sono state efficaci nel descrivere accuratamente le interazioni ligando-proteina. In particolare, monitorando il cambiamento delle cariche atomiche durante la simulazione e calcolando la differenza di densità elettronica tra il ligando nel suo stato legato e nel vuoto, sono stati ottenuti approfondimenti sugli effetti di polarizzazione del campo elettrico della proteina sul ligando. Ci si aspetta che questi effetti, anche se piccoli nello stato legato, diventino molto importanti nelle fasi successive del processo di unbinding.
This thesis focused on modeling of ligand-protein binding with computational methods based on molecular dynamics. Understanding this process is crucial for the design and discovery of new drugs and the use of computational methods to support experimental research in this field is constantly growing. Nowadays, thanks to the increasing computer power, it is possible to study the complete ligand binding/unbinding process and obtain estimate on thermodynamic and kinetic properties. In view of this, during my PhD, different advanced classical molecular dynamics (MD) methods were employed and compared to identify an effective computational approach for studying ligand binding/unbinding processes. Specifically, a protocol based on combination of the steered MD (sMD) and the Metadynamics (MetaD) with Path Collective Variables (PCVs) approaches was developed with the aim of using the advantages of both methods to obtain a complete description of the process. While the sMD method was employed to investigate different unbinding pathways and identify the preferred one, MetaD with PCVs was used to determine more accurately the binding free energy. The proposed protocol was successfully applied to study ligand binding to the Hypoxia Inducible Factor (HIF-2α) and it demonstrated to be effective for simulations performed both on a known ligand-protein X-ray structure and on a docking pose. On the other hand, most of the MD methods requires the production of several replicas or long simulations to sample the binding/unbinding event several times in order to obtain a reliable statistics of the process. This produces the need of methods able to analyze all the simulated events at once and to provide a clearly interpretable picture of the differences in the sampled pathways. For this reason, a tool based on the self-organizing maps (SOMs) was developed. The PathDetect-SOM (Pathway Detection on SOM) tool, exploiting the advantages of the topological ordering of the SOM, allowing to visually represent the binding paths sampled during different MD events/replicas in a clear bidimensional representation. In addition, hints on the kinetic and thermodynamic properties of the process can be derived. The tool was successfully applied to different study-cases to demonstrate its general applicability. Furthermore, as part of a project performed at the Jülich research center (Institute of Advanced Simulations and Institute for Neuroscience and Medicine) under the supervision of Prof. Paolo Carloni, a novel hybrid quantum mechanics/molecular mechanics (QM/MM) interface (MiMiC) was tested. The code, that allows QM/MM molecular dynamics simulations of biomolecular systems, was applied to the mitogen-activated protein kinase p38 in complex with the 2g ligand to investigate the ligand unbinding process. The focus was on the first step of the process involving the dynamics of the ligand in its bound state. QM/MM MD simulations were effective in describing ligand-protein interactions accurately. In particular, by monitoring the change of the atomic charges during the simulation and calculating the electronic density difference between the ligand in its bound state and in vacuum, insights into the polarization effects of the protein electric field onto the ligand were obtained. It is expected that these effects, albeit small in the bound state, become very important in the following steps of the unbinding process.

Human cytomegalovirus (HCMV) is a leading cause of severe disease in immunocompromised individuals, including AIDS and transplanted patients, and in congenitally infected newborns. Despite the availability of several drugs, pharmacological treatment of HCMV infections is associated with poor bioavailability, toxicity and the emergence of resistant strains. Furthermore, no vaccine is available and no drugs are approved to prevent vertical transmission during pregnancy, therefore, it is essential to identify new potential targets of therapeutic intervention. HCMV DNA polymerase accessory protein UL44 plays an essential role in viral replication, conferring processivity to the DNA polymerase catalytic subunit UL54 by tethering it to the DNA. Binding of UL44 to dsDNA occurs in the absence of ATP and clamp loaders, and depends on UL44 homodimerization. Indeed, our research group previously demonstrated that the protein can dimerize in cells and point mutations disrupting protein self-interaction also prevent DNA binding and abolish viral OriLyt-dependent DNA replication in transcomplementation assay. Therefore, disruption of UL44 homodimerization represents an attractive target for the development of new antivirals. Based on these observations, using the recently published crystal structure of UL44 hodimers our research group previously performed a virtual screening with the Glide software in combination with a library of 1.3 x 106 small molecules (SMs) to identify SMs potentially interfering with UL44 homodimerization. After three rounds of screening (HTVS: high-throughput virtual screening, SP: standard precision, XP: extra precision), followed by an in depth analysis of compounds chemical properties, 18 SMs were selected for further analysis. Selected compounds were obtained from a commercial supplier, to be tested in a variety of assays for their ability to inhibit UL44 homodimerization both in cell and in vitro, as well as on HCMV replication. For this purpose, we applied two in vitro methods to monitor the effect of our candidates on UL44 dimerization such GST-pulldown Assay and Thermal Shift Assay (TSA). Furthermore, Plaque Reduction Assay (PRA) and Fluorescence Reduction Assay (FRA) were performed to study their inhibitory effects on viral replication. Initially we validated that GST-pulldown assay was suitable to study UL44 dimerization and its perturbation caused by SMs. Therefore, we performed a first screening to test the effect of the 18 SMs on UL44 dimerization, and we identified 3 of these which reproducibly inhibited the dimerization. Prompted by these results, we selected such SMs to investigate a possible dose-response relationship between the dimerization inhibition and the compounds concentration. Unfortunately, data analysis revealed a high variability, and lack of correlation between the inhibition and the concentration of SMs used in the assays. In parallel, PRAs were performed to validate the effect of selected SMs, but these were unable to inhibit viral replication with high potency. Subsequently, two recombinant HCMV viruses (TB4-IE2-EYFP and TB4-UL83-EYFP) were obtained from Michael Winkler (Leibniz-Institut für Primatenforschung Goettingen, Germany) in order to study the effect of our molecules on HCMV replication by FRAs. Therefore, after a screening of the 18 SMs, 4 of these were identified as possible inhibitors of viral replication and were selected to further studies. We investigated their and 50% effective dose (ED50) and 50% cytotoxic concentration (CC50) values and their effects on the viral gene expression. Only 2 SMs reproducibly inhibited expression of Early and Late genes. Then we evaluated an alternative in vitro assay and among the various possibilities, we have chosen TSA that is able to inform whether a SM induce the disruption of constitutive oligomeric interfaces. In a first moment we validated that the assay allow the discrimination between monomeric and dimeric forms of UL44, suggesting its potential for the screening of our SMs. As result of the SMs screening by TSA, one molecule revealed a possible inhibition of dimerization.
Cytomegalovirus (CMV) è un importante patogeno di interesse umano. Al momento gli antivirali disponibili ed utilizzati per la terapia contro l’infezione da CMV presentano una serie di problematica quali l’alto costo, bassa biodisponibilità, alta tossicità ed il presentarsi di ceppi virali resistenti. Inoltre non è disponibile un vaccino ed ancora non è stato approvato alcun farmaco per prevenire la trasmissione verticale durante la gravidanza. Per questi motivi, sono necessari nuovi efficaci farmaci antivirali. La proteina accessoria UL44 della DNA polimerasi di CMV, svolge un ruolo essenziale nella replicazione virale, conferendo processività alla subunità catalitica UL54 ancorando il complesso oloenzimatico al DNA. Il legame di UL44 al dsDNA avviene in assenza di ATP e dei clamp loaders, e dipende dalla omodimerizzazione di UL44. Il nostro gruppo di ricerca, infatti ha recentemente dimostrato che la proteina può dimerizzare in cellule e che mutazioni puntiformi in grado di inficiare tale dimerizzazione prevengono il legame con il DNA ed aboliscono la replicazione del DNA virale oriLyt-dipendente in saggi di transcomplementazione transiente. Perciò, la distruzione dell’omodimerizzazione UL44 rappresenta un potenziale ed allettante target per lo sviluppo di nuovi antivirali. Partendo da queste osservazioni ed usando la struttura cristallografica degli omodimeri UL44 che è stata recentemente pubblicata, il nostro gruppo di ricerca ha eseguito un virtual screening con il software Glide in combinazione con una libreria di 1.3 x 10^6 piccole molecole (SMs) per identificare SMs che potenzialmente potessero interferire con l’omodimerizzazione di UL44. Dopo tre rounds di screening (HTVS: high-throughput virtual screening, SP: standard precision, XP: extra precision), seguiti da un’analisi delle proprietà chimiche dei composti, sono state selezione 18 SM per ulteriori analisi. I composti selezionati sono stati acquistati presso un fornitore commerciale, per essere testati in diversi saggi per valutare le loro abilità di inibire l’omodimerizzazione di UL44 in vitro, sia la replicazione virale. Con questo scopo, abbiamo utilizzato due metodi in vitro per monitorare l’effetto dei nostri candidati sulla dimerizzazione di UL44, quali GST-pulldown assay e Thermal Shift Assay (TSA). Inoltre per studiare l’inibizione sulla replicazione virale sono stati eseguiti saggi di Plaque Reduction Assay (PRA) e Fluorescence Reduction Assay (FRA). Inizialmente abbiamo confermato che il GST-pulldown assay fosse idoneo per studiare la dimerizzazione di UL44 e la sua perturbazione causata dalle SMs. Pertanto abbiamo eseguito un primo screening per saggiare l’effetto delle 18 SMs sulla dimerizzazione di UL44, ed abbiamo identificato 3 molecole che inibivano la dimerizzazione in modo riproducibile. Incoraggiati da questi risultati, abbiamo selezionato queste SMs per valutare una possibile relazione dose-risposta tra l’inibizione della dimerizzazione e la concentrazione dei composti. Sfortunatamente, l’analisi dei dati hanno rivelato alta variabilità, e perdita di correlazione tra l’inibizione e la concentrazione delle SMs utilizzate nei saggi. In parallelo, abbiamo eseguito PRAs per validare l’effetto delle SMs precedentemente selezionate, ma queste si sono presentati incapaci di inibire la replicazione virale in modo consistente. Successivamente abbiamo ottenuto due virus CMV ricombinanti (TB4-IE2-EYFP and TB4-UL83-EYFP) da Michael Winkler (Leibniz-Institut für Primatenforschung Goettingen, Germany) per studiare l’effetto delle nostre molecole sulla replicazione di CMV mediante FRAs. Pertanto, dopo uno screening delle 18 SMs, 4 di queste sono state identificate come possibili inibitori della replicazione virale e sono state selezionate per essere ulteriormente studiate. Abbiamo valutato la loro dose effettiva 50% (ED50) e la loro concentrazione citotossica 50% (CC50) e gli effetti relativi all’espressione genica. Solo due SMs in modo riproducibile inibivano l’espressione dei geni Early e Late. Poi abbiamo valutato un saggio in vitro alternativo e tra le varie possibilità, abbiamo scelto il TSA che è un saggio in grado di informare se una SM induce la distruzione delle interfacce di un oligomero costitutivo. In un primo momento abbiamo confermato che il saggio permettesse la discriminazione tra le forme monomeriche e dimeriche di UL44, suggerendo il suo potenziale per lo screening delle nostre SMs. Come risultato di questo screening, una molecola ha rivelato possibile inibizione della dimerizzazione.

The presence of protein in white wines represents a major problem for the wine industry mainly due to the fact that proteins generate haze in the bottled white wines. Protein instability, which results in wine haze formation, is due to some grape PR-Proteins that thanks to their intrinsic resistance survive the vinification process, pass into the wine where cause the appearance of undesirable haze and deposits, leading to rejection by consumers. Protein hazing of white wines is considered to be a three-step process, involving protein denaturation followed by aggregation into colloidal particles able to scatter the visible light and make the wine turbid. Because of the complexity and the variability of the wine matrix, the factors and mechanisms involved in this process are still largely unknown. Commonly, winemakers prevent haze formation by removing the proteins through the use of bentonite. However, this treatment causes loss of wine and, being unspecific, also the removal of some aroma compounds. It has been calculated that the total cost deriving from bentonite treatments corresponds to a worldwide total amount of 1 billion dollars per year. Therefore, basic and applied research is still needed to solve the problem of protein haze formation in white wines. Firstly, the present thesis faces the problem of the impairment of aroma due to bentonite fining. In particular, the study arises from a previous investigation which suggested the existence of an interaction between proteins and aroma compounds. In this context, the interaction of the main wine protein VVTL1 with some fatty acid ethyl esters (FAEE), which are important fermentative aroma compounds has been investigated. Due to the difficulty to determine this interaction at the molecular level, Synchrotron Radiation Circular Dichroism (SRCD) has been used to study the secondary structure of the wine protein as affected by the interactions with FAEE having different chain lengths. Subsequently, the research continued with the investigation of the role played by tannins in the phenomena leading to protein instability of white wines. To this purpose, the effects of several polyphenols (deriving from wine and not) on the stability of VVTL1 has been investigated using SRCD. In parallel, the capability of tannins to react with the proteins over time in bottled wine has been evaluated by Dynamic Light Scattering (DLS) studies in a model wine system. In addition, the thermal stability of two purified proteins, which are representative of the major classes of proteins in white wine (i.e. a class IV Chitinase and the VVTL1), has been investigated by Differential Scanning Calorimetry (DSC) in the presence of the tannins purified from wine at different times after bottling. Finally, the last part of the research focuses on the possibility to produce good quantities of grape proteins in pure form starting from the in vitro culture of berry pulp tissues. These proteins can be used for molecular and functional characterisation. In particular, with this technique it is possible to label the proteins by cultivating the cellular tissues in the presence of N15 which allows the study of their fine structure and interactions by spectroscopic methods.
La presenza di proteine nei vini bianchi rappresenta un problema di grande importanza per l’industria del vino, principalmente dovuto alla formazione di torbidità nei vini bianchi in bottiglia. L’instabilità proteica, nonché formazione di torbidità, è associata ad alcune proteine di difesa della pianta che per mezzo della loro intrinseca resistenza e stabilità sopravvivono al processo di vinificazione, passando nel vino dove causano la comparsa dell’indesiderata torbidità e di depositi in bottiglia, la quale non incontra le aspettative del consumatore e viene quindi scartata. La torbidità proteica nei vini bianchi è considerata come un processo a tre stadi, che coinvolge la denaturazione delle proteine seguita dall’aggregazione in particelle colloidali capaci di disperdere la luce visibile e far divenire il vino torbido. Data la complessità e la variabilità della matrice vino, i fattori e meccanismi coinvolti in questo fenomeno sono ancora largamente sconosciuti. Normalmente gli enologi prevengono la formazione di torbidità rimuovendo le proteine attraverso l’uso della bentonite. Tuttavia questo trattamento causa la perdita di vino, ed essendo aspecifico, causa anche la rimozione di alcuni composti aromatici. È stato calcolato che il costo totale derivante dall’uso di bentonite corrispondi a 1 miliardo di dollari l’anno. Pertanto è ancora necessaria della ricerca di base e applicata per risolvere il problema della formazione di torbidità proteica nei vini bianchi. La prima parte di questa tesi tratta il tema dell’impoverimento aromatico causato dal trattamento con bentonite. In particolare questo studio prende ispirazione da un precedente lavoro, il quale suggerisce l’esistenza di un’interazione tra le proteine e i composti aromatici. In questo contesto è stata studiata l’interazione della principale proteina dei vini bianchi, la VVTL1, e alcuni esteri etilici degli acidi grassi, i quali sono importanti aromi fermentativi del vino. Data la difficoltà di determinare a livello molecolare questo tipo d’interazione è stata sfruttata la luce di sincrotrone applicata al dicroismo circolare (SRCD) per studiare l’effetto di alcuni esteri etilici di acidi grassi a media catena sulla struttura secondaria della proteina del vino. In seguito, la ricerca è proseguita con lo studio mirato a comprendere l’esatto ruolo dei tannini nel fenomeno che conduce all’instabilità proteica dei vini bianchi. A questo scopo, sono stati studiati tramite sincrotrone gli effetti di diversi polifenoli (derivati o no dal vino) sulla stabilità della VVTL1. In parallelo la capacità nel tempo dei tannini di reagire con le proteine in bottiglia è stata valutata svolgendo degli studi di diffusione dinamica della luce (DLS) in vino modello. Con l’ausilio della Calorimetria differenziale a scansione (DSC), è stato inoltre studiata, la stabilità termica di due tra le più rappresentative proteine del vino (la VVTL1 e la chitinasi classe IV) in presenza di tannini purificati a tempi diversi di evoluzione da vino imbottigliato. Infine, l’ultima parte della ricerca si focalizza nella possibilità di produrre proteine dell’uva in quantità accettabili in forma pura partendo dalla coltivazione in vitro di tessuti di polpa della bacca. Queste proteine possono essere utilizzate per la caratterizzazione strutturale e funzionale. In particolare, con questa tecnica si rende possibile la marcatura delle proteine facendo crescere i tessuti cellulari d’uva in presenza di N15, il quale consentirebbe, per mezzo di metodi spettroscopici, lo studio in dettaglio della loro struttura e delle loro interazioni.

Influenza (flu) is an airborne highly-infectious disease, characterized by high morbidity and significant mortality, especially in at-risk population (young children, elderly people, patients with cronical disease). Annually, 20% of general population is affected by seasonal epidemics sustained by genetic variants of already circulating influenza virus strains. For this reason the vaccine has to be changed every year with a considerable economic impact. Furthermore, the influenza virus is responsible for occasional pandemics affecting million of people worldwide. The migratory water bird are the natural reservoir for the avian flu. The recent avian flu virus that affected humans suggests that a new flu epidemic could be able to overcome the species barrier and spread from human to human. For these reasons there is an urgent need to develop a new drug able to target a conservative flu motif. To date, there are a few commercially available drugs that target some envelope viral proteins: neuraminidase (NA) and the M2 ion channel. Oseltamivir (Tamiflu) and zanamivir are NA inhibitors, which prevent the release of the viral particle from infected cells and are active against flu A and flu B. Amantadine and rimantadine inhibit the protein M2 and viral uncoating. These drugs have important drawbacks including neurological toxicity, they can't be administrated to subjects younger than 12 year-old, finally, they have to be taken at the time of onset of symptoms. Furthermore, they can very frequentely cause the induction of drug-resistant strains. Moreover, although an anti-flu vaccine is available, it has to be changed every year because the virus is prone to antigenic modifications. For all of the above, there is still an urgent need for effective anti-flu compounds with a different mechanism of action from the current anti-flu drugs. A possible novel anti-influenza strategy is rapresented by the RNA polymerase encoded by flu virus; in fact, the influenza virus polymerase is a conserved element among different viral strains, as it is not subjected to genetic variability. The influenza virus RNA polymerase is a heterocomplex which consists of three proteins (PB1, PB2, and PA) that interact each other, in particular PB1 interacts with PB2 and PA, while PA and PB2 do not interact. It has been demonstrated that the PA/PB1 interaction is crucial for flu virus replication: in fact, the inhibition of this interaction cause the inhibition of flu replication. Thus, the inhibition of such interactions may represent a feasible strategy for the development of anti-flu compounds able to block the replication of the virus independently from the viral strain. The main aim of this project is to identify small molecules able to block the interaction between the PA and PB1 subunits of the viral RNA polymerase and consequently to inhibit virus replication. To this aim, an in silico screening has been conducted on approximately 3 millions of virtual compounds taking advantage of the crystallographic structure of a truncated form of PA bound a PB1-derived peptide. In this screening we identified 32 compounds potentially able to inhibit the PA/PB1 interaction. We then tested these compounds using an ELISA to verify their capability to disrupt the physical interaction between PA and PB1 in vitro. From this analysis, we identified 3 compounds able to block the PA/PB1 interaction with an IC50 comparable to that of a peptide corresponding to aa 1-15 of PB1, that rapresent the PA-binding domain. In addition, the cytotoxicity of the active compounds has been evaluated in a panel of cell lines. Analogs of the most promising compounds have been synthesized to increase antiviral activity and decrease the toxicity. The compound activity has been further characterized by the "minireplicon assay", a cellular assay that evaluates the compounds effects on flu A and flu B polymerase activity. We identified some compounds able to inhibit the polymerase activity with an IC50 value comparable to that of the PB11-15 peptide. We also analised the ability of the compounds to inhibit the viral replication by a plaque reduction assay. We found that 3 compounds inhibit flu A/PR/8/34 replication with EC50 values comparable to that of the reference compound ribavirin (RBV). Furthermore, we evaluated the activity of these compounds on the replication of a flu B strain (B/Malaysia/2506/4) and of some flu A strains (A/WSN/67/05, A/Solomon Island/3/06, and Tamiflu-resistant A/PARMA/24/09). Compounds 1 and 34 showed an antiviral activity against these flu strains comparable with that of RBV (EC50 18-22,5 µM for compound 1; EC50 17-25 µM for compound 34; EC50 7-18 µM for RBV). The antiviral activity of the compound 34 has been also characterised at different time post-infection. We found that this molecule has higher antiviral activity until 12 hours post-infection (1-2 µM). Finally, its activity was evaluated also on the intranuclear traslocation of the PA/PB1 complex and on viral protein expression. Compound 34 showed antiviral activity also in these assays. Studies to characterise further its activity and to identify more potent analogues are in progress. Finally, another line of research characterized at the same time, some Stealth siRNAs directed against PB1 mRNA and evaluated their capability to inhibit the flu polymerase activity. Previously data reported an antiviral activity for one of these siRNAs in infected cells; we have confirmed its antiviral activity by minireplicon assays (80% of inhibition at 30 nM). We can conclude that we identified two compounds, compound 1 and 34, and a siRNA that are a good candidate for development of a new anti-flu compound. In the future, we are going to characterize the antiviral activity of the selected compounds and identify new analogues compounds to increase their antiviral activity.
L'influenza è un'infezione respiratoria, di origine virale, caratterizzata da elevata morbidità  e mortalità  soprattutto nella popolazione ad alto rischio (bambini, anziani, pazienti con malattie croniche/debilitanti, ecc.). Ogni anno il 20% della popolazione è affetto da un'epidemia causata dalla variabilità antigenica dei diversi ceppi di influenza, questo comporta che il vaccino anti-influenza debba essere riformulato di anno in anno con un considerevole impatto economico. Inoltre il virus dell'influenza è responsabile di pandemie occasionali che colpiscono milioni di persone in tutto il mondo e che si verificano ogni 10-30 anni con incidenza di morte dell'ordine del milione. Gli uccelli selvatici (uccelli acquatici, anatre selvatiche, etc.) sono il serbatoio naturale del virus aviario, e i recenti casi di influenza aviaria che hanno colpito l'uomo indicano che una nuova epidemia influenzale potrebbe essere in grado non solo di saltare le barriere tra le specie ma anche di trasmettersi da uomo a uomo causando milioni di morti. Per questi motivi esiste la necessit  di trovare un nuovo farmaco che abbia come bersaglio un elemento virale conservato. Attualmente esistono in commercio pochi farmaci anti-influenza, che hanno come bersaglio alcune proteine virali di superficie: neuraminidasi (NA) e una proteina che costituisce un canale ionico (M2). Oseltamivir (Tamiflu) e zanamivir sono inibitori di NA e prevengono il rilascio delle particelle virali dalle cellule infettate (per flu A e flu B). Amantadina e rimantadina invece hanno come bersaglio la proteina M2, e agiscono sulla scapsidazione del virus. Questi farmaci presentano però numerosi svantaggi: possono avere effetti collaterali causando tossicità  a livello neurologico, non possono essere somministrati al di sotto dei 12 anni di età , infine per essere efficaci devono essere assunti entro le 48 ore dall'insorgenza dei sintomi; inoltre, per tali farmaci si è registrata la comparsa di molti ceppi virali resistenti. Il vaccino anti-influenza che viene messo a disposizione per la popolazione ha lo svantaggio di dover essere riformulato ogni anno a causa dell'elevata variabilità  antigenica dei diversi ceppi. Di fatto, non esiste una terapia efficace e persiste quindi una necessità  reale di sviluppare nuovi farmaci anti-influenza soprattutto dotati di un meccanismo d'azione diverso da quello dei farmaci attualmente a disposizione. Un possibile bersaglio per lo sviluppo di nuovi farmaci antivirali è l'RNA polimerasi codificata dal virus dell'influenza, in quanto è un elemento conservato fra i diversi ceppi virali e non è soggetto a riassortimento genico. Le tre subunità  proteiche che costituiscono la RNA polimerasi virale (un eterotrimero costituito da PB1, PB2 e PA in rapporto stechiometrico 1:1:1) interagiscono fisicamente tra loro e, in particolare, la subunità  PB1 interagisce sia con PB2 che con PA, ma non c'è interazione tra PB2 e PA. E' stato dimostrato che l'interazione PA/PB1 è essenziale per la replicazione del virus dell'influenza: infatti l'inibizione di questa interazione causa anche inibizione della replicazione virale. L'utilizzo della polimerasi come target farmacologico permetterebbe quindi di inibire la replicazione virale ovviando al problema della variabilità  antigenica e si otterrebbe un farmaco attivo contro moltissimi, se non tutti, i ceppi del virus dell'influenza. Il fatto che il sito di legame PA-PB1 sia molto conservato e che l'interazione sia cruciale per molte funzioni virali fa sì che esso rappresenti un potenziale bersaglio per lo sviluppo di nuovi composti antivirali. Scopo di questo progetto è stato quello di identificare small molecules in grado di dissociare l'interazione fisica tra le subunità  PB1 e PA della RNA polimerasi del virus dell'influenza e quindi la replicazione virale. E' stato condotto uno screening in silico di molecole, a partire da circa 3 milioni di composti virtuali, utilizzando la struttura cristallografica del complesso PA/PB1 e ne sono state identificate 32 potenzialmente capaci di inibire questa interazione. Questi 32 composti sono stati inizialmente saggiati mediante ELISA, per verificare la loro effettiva capacità  di dissociare in vitro l'interazione PA/PB1. Da questa prima analisi sono stati identificati 3 composti in grado di dissociare l'interazione con un valore di IC50 comparabile al peptide corrispondente ai 15 aa di PB1, che rappresenta la regione di interazione con PA e che è stato dimostrato essere sufficiente per inibire l'interazione PA/PB1. Successivamente è stata valutata la citotossicità  delle molecole e sono stati disegnati dei composti analoghi a quelli maggiormente attivi per cercare di aumentarne l'attività  antivirale e/o diminuirne la citotossicità . L'attività  dei composti è stata confermata mediante minireplicon assay, un saggio cellulare che permette di determinare l'effetto delle molecole sull'attività  polimerasica sia del virus dell'influenza A che B. Sono stati identificati alcuni composti in grado di inibire l'attività  polimerasica virale con un valore di IC50 comparabile a quello del peptide di controllo. E' stata valutata, a questo punto, la capacità  dei composti di inibire la replicazione virale mediante saggio di riduzione delle placche. Quello che è emerso è che 3 composti inibiscono la replicazione del virus A/PR/8/34 con valori di EC50 comparabili a quelli della ribavirina (RBV), utilizzata come controllo, e a quelli dei farmaci attualmente utilizzati in terapia. Inoltre, è stata valutata la capacità  di questi composti di inibire anche la replicazione di un virus dell'influenza B (B/Malaysia/2506/4) e altri ceppi di influenza A (A/WSN/67/05, A/Solomon Island/3/06 e A/PARMA/24/09 Tamiflu-resistente). E' stato osservato che i composti 1 e 34 sono attivi contro questi ceppi di influenza in maniera analoga al composto di riferimento RBV (EC50 18-22,5 µM composto 1; EC50 17-25 µM composto 34; EC50 7-18 µM RBV). Per il composto 34 è stata anche valutata l'attività  antivirale nel tempo; quello che è emerso è che una elevata attività  è mantenuta fino a 12 h post-infezione (1-2 µM). L'attività  antivirale dei composti 1 e 34 è stata valutata anche caratterizzando il loro effetto sull'espressione delle proteine virali. Entrambi i composti hanno mostrato attività  antivirale. Inoltre à stato determinata l'attività  del composto 34 sulla traslocazione intranucleare del complesso PB1/PA; il composto 34 ha mostrato attività antivirale anche in questo saggio. Studi per caratterizzarne ulteriormente l'attività e per identificarne dei nuovi analoghi possibilmente più attivi sono in corso. In parallelo sono stati saggiati alcuni Stealth siRNA disegnati contro il trascritto di PB1 per valutare la loro capacità  di inibire l'attività  polimerasica. Dati precedenti hanno dimostrato attività  antivirale per uno di questi siRNA in cellule infettate; la capacità  di inibire anche l'attività  polimerasica è stata confermata mediante minireplicon assay (inibizione dell'80% a concentrazione 30 nM). Possiamo quindi concludere di aver identificato due composti, composto 1 e 34, e un siRNA che possono essere considerati dei buoni candidati per lo sviluppo di un farmaco anti-influenza. Ci proponiamo di caratterizzare ulteriormente l'attività  antivirale dei composti identificati, e, per quanto riguarda i composti selezionati mediante lo screening in silico, di identificare dei composti analoghi in modo da aumentare la loro attività  antivirale.

Feline Immunodeficiency Virus (FIV) is a non-primate lentivirus that causes an immunodeficiency syndrome in domestic cats, that is striking similar to AIDS in humans. FIV is similar to Human Immunodeficiency Virus type 1 (HIV-1) in many molecular and biochemical properties, thus representing an attractive model for AIDS research in many different aspects ranging from pathogenesis to therapeutic approaches. In this context, understanding the interplay between viral and host factors plays a crucial role in the efforts for elucidating the molecular mechanisms involved in virus pathogenicity and thus for the development of effective therapeutic and vaccine approaches. In order to fully take advantages of these important properties and considering that the present understanding of FIV biology lags behind knowledge accumulated on HIV, different aspects of FIV life cycle need to be further investigated. In particular, we focused our attention on viral budding. As for all the other retroviruses, FIV Gag can assemble and lead to Virus Like Particles (VLPs) budding from cells in the absence of other proteins / viral determinants. To accomplish this, RNA-enveloped viruses bud from infected cells by exploiting the Multivesicular Body (MVB) pathway. In this context, ubiquitination of structural viral proteins and their direct interaction with cellular factors involved in the MVB biogenesis through short proline rich regions, named Late domains (L domains), are crucial mechanisms. The overall goal of the study is to characterize the late steps of FIV replication. In particular, our attention has been focused on i) dissecting viral/cellular protein interactions involved in budding and ii) the identification of the host factors that can interfere in this process. Firstly, we focused our attention on the role of the major structural FIV Gag protein in viral budding and the pathways that FIV exploits for its budding. Here we report that, in contrast with HIV-1, FIV is strictly dependent for its budding on a ‘‘PSAP’’-type L-domain, mapping in the carboxy-terminal region of Gag, irrespective of a functional viral protease. Moreover, we demonstrate that FIV egress is related to Gag ubiquitination, that is linked to the presence of an active L-domain. We demonstrate that FIV, thanks to its L domain, hijacks the MVB biogenesis machinery to execute its efficient exit from cells. In order to further characterize the contribution of the entire p2 region in FIV egress and the role of cellular proteins in the process, we noticed that a p2 mutant characterized by the complete disrupting of the PSAP late domain could be rescued by the over-expression of the cellular protein AIP1/Alix. Interestingly we were able to identify in p2, down-stream the PSAP sequence, an LLDL motif, which is reminiscent of the YPXnL L-domain. It is well known that in EIAV, a sequence “YPDL”, mapping at the level of Gag p9, is essential for viral budding through the interaction with AIP1/Alix. In particular, we demonstrated that the complete destruction of LLDL motif, in the context of PSAP late domain intact, has no impact in the release of FIV. Next, we analyzed whether the LLDL motif may function as an auxiliary L-domain in the context of FIV-Gag, and, specifically, mimicking the YPXnL type of L-domains. We were able to show that, also under these conditions, AIP1/Alix is still capable of rescuing VLPs production and any p2 sequences are strictly necessary for its incorporation in FIV VLPs. The data obtained indicate that the LLDL motif does not represent an auxiliary late domain for FIV. In the context of HIV-1, it has recently been proposed that the nucleocapsid domain (NC) cooperates with p6 in recruitment of cellular proteins required for viral budding and, in particular, it has been shown that the zinc finger present in NC represent additional binding sites for AIP1/Alix. To investigate this aspect in FIV, we analyzed the contribution of the NC domain in the cooperation with the late domain in the budding and its possible interaction with AIP1/Alix. Thus, we mutagenized FIV zinc finger motifs and, in particular, we generated different NC mutants in combination with alterations at the level of the carboxyterminal region of Gag. In contrast to what occours in HIV-1, we demonstrated the absence of involvement of FIV NC in the budding rescue ability of AIP1/Alix. In the second part of the research, we analyzed some molecular aspects underlying the specie-specificity of the late step of FIV replication. Recently it has been reported that the human cellular protein tetherin (or hBST2) is able to block the release of HIV-1 viral particles from infected cells and that HIV-1 has evolved specific countermeasures to antagonize its effects. Starting from these findings, by means of a detailed bioinformatics analysis in the feline genome, it was possible to identify the ortholog of the human protein BST2/tetherin, renamed cBST2 or feline tetherin. We were able to show that cBST2 is unable to interfere with FIV release, since its effect is antagonized by a combined action of the structural Env protein and the accessory Orf-A protein. Furthermore, in agreement with the specie-specificity of these antiviral factors, we demonstrated that the feline tetherin is able to prevent the particle release of HIV-1, a human primates lentivirus, and that human tetherin blocks the particle release of FIV, a lentivirus which infects the non human primates. In conclusion our data bring to light peculiar aspects of FIV biology and, in particular, put the basis for the identification of cellular mechanisms either shared or highly divergent between FIV and HIV-1, with profound implication for the use of FIV as model for studying HIV pathogenesis and therapy.
Il Virus dell'Immunodeficienza Felina (FIV) è un lentivirus che infetta i non primati e causa una sindrome da immunodeficienza nel suo ospite, il gatto domestico, simile all'AIDS nell'uomo. FIV presenta numerose omologie molecolari e patogenetiche con il Virus dell’Immunodeficienza Umana di tipo 1 (HIV-1), rappresentando quindi un ottimo modello per lo studio di HIV-1 e per lo sviluppo di vaccini e di vettori per la terapia genica. In questo contesto, la caratterizzazione dei determinanti virali e cellulari, che regolano il rilascio delle particelle dalle cellule infettate, riveste un ruolo cruciale non solo dal punto di vista dello studio della biologia del virus, ma anche per l'identificazione di nuovi target terapeutici e per lo sviluppo di vettori lentivirali basati su FIV, da impiegare per l’espressione ed il trasferimento di transgeni in cellule eucariotiche. In particolare, la nostra attenzione si è focalizzata sulla fase di gemmazione. La sola poliproteina strutturale Gag di FIV, così come quella degli altri retrovirus, è in grado di assemblarsi e mediare il rilascio di particelle simil-virali (Virus-like particles, VLPs) in assenza di altre proteine/determinanti virali. A tal fine, questi virus ad RNA dotati di envelope gemmano dalle cellule infettate, sfruttando il pathway dei Multivesicular Bodies (MVB), attraverso l’ubiquitinazione delle proteine strutturali e/o la loro diretta interazione con proteine cellulari, le quali sono coinvolte nella biogenesi di questi organelli, mediante corti motivi aminoacidici ricchi in prolina, noti come domini tardivi (Late domain o L domain). Il presente lavoro di dottorato si è proposto di caratterizzare le fasi tardive del ciclo replicativo di FIV. L’attenzione è stata focalizzata sullo studio i) delle interazioni tra proteine cellulari e virali coinvolte nella gemmazione e ii) dei fattori dell’ospite in grado di interferire a livello di tale processo. Nella prima parte della ricerca è stato caratterizzato il contributo della poliproteina Gag nel rilascio delle particelle virali e il pathway cellulare impiegato da FIV durante la gemmazione. E’ stato possibile dimostrare come FIV sia strettamente dipendente dal dominio tardivo PSAP, contenuto nella regione carbossiterminale p2 di Gag, per il rilascio delle particelle virali, a prescindere dalla presenza di una proteasi virale attiva. E’ stato inoltre documentato come il suddetto dominio tardivo permetta a FIV di sfruttare il pathway dei MVB per gemmare in modo efficiente dalle cellule e come questo sia correlato all'ubiquitinazione di Gag, possibile solo in presenza del dominio tardivo attivo. Nel tentativo di caratterizzare ulteriormente il ruolo dell'intera regione p2 nella gemmazione, è stato osservato che la capacità di produrre VLPs da parte del mutante con il dominio tardivo PSAP inattivato poteva essere ripristinata over-esprimendo nelle stesse cellule la proteina cellulare AIP1/Alix. Significativamente, analizzando la regione p2 è stato possibile identificare un motivo LLDL a valle di PSAP, reminiscente del late domain YPDL, che in EIAV risulta essere essenziale per la gemmazione virale in quanto interagisce con la proteina cellulare AIP1/Alix. E’ stata quindi verificata la possibilità che tale motivo avesse funzione di dominio tardivo in FIV. In particolare, è stato dimostrato come la completa distruzione del motivo LLDL, nel contesto del dominio tardivo PSAP intatto, non abbia alcuna funzione nella gemmazione del virus. E’ stata quindi vagliata la possibilità che il motivo LLDL potesse funzionare da late domain ausiliario coinvolgendo, in alcuni casi, la proteina AIP1/Alix. Si è quindi proceduto ad analizzare la capacità di AIP1/Alix di ripristinare il rilascio di VLP di mutanti a livello del dominio p2 di Gag. E’ stato dimostrato come la over-espressione di AIP1/Alix sia in grado di ristabilire la gemmazione dei mutanti difettivi a livello del dominio tardivo e di come tale proteina sia incorporata nelle stesse VLPs, in assenza di un’interazione con il motivo LLDL. I dati ottenuti indicano come il motivo LLDL non rappresenti per FIV un dominio tardivo ausiliario. Nel contesto di HIV-1, di recente è stato proposto che il dominio nucleocapside (NC) cooperi con p6 nel reclutamento delle proteine cellulari richieste per la gemmazione virale ed, in particolare, è stato dimostrato come gli zinc finger presenti a livello di NC rappresentino addizionali siti di legame per la proteina AIP1/Alix. Alla luce di queste evidenze sperimentali, è stato quindi analizzato il contributo del NC di FIV nella cooperazione con i domini tardivi nella gemmazione e la sua possibile interazione con AIP1/Alix. A tale scopo, sono stati generati dei costrutti FIV-derivati recanti specifiche mutazioni a livello di NC in combinazione con alterazioni nella regione carbossiterminale. Diversamente da quanto accade in HIV-1, è stata dimostrata l’assenza di coinvolgimento del nucleocapside di FIV nel ripristino della gemmazione di tali mutanti del late domain, in presenza di sovraespressione di AIP1/Alix. Nella seconda parte della ricerca, sono stati analizzati alcuni aspetti molecolari alla base della specie-specificità degli eventi tardivi della replicazione di FIV. Recentemente in letteratura è stato riportato come la proteina cellulare umana teterina (o hBST2) sia in grado di interferire con il rilascio delle particelle virali di HIV-1 dalle cellule infettate e come tale virus abbia evoluto specifiche contromisure per antagonizzarne l’effetto. Sulle basi di tali studi, in seguito ad una profonda analisi bioinformatica nel genoma felino, è stato possibile identificare l’ortologo della proteina umana BST-2/teterina, rinominato cBST2 o teterina felina, e ne è stata valutata la funzionalità. I risultati indicano come cBST2 non sia in grado di interferire con il rilascio di FIV, in quanto il suo effetto è antagonizzato dall’azione combinata dalla proteina strutturale Env e della proteina accessoria Orf-A. Inoltre, in accordo con la specie-specificità di questi fattori antivirali, è stato dimostrato come la forma felina di BST2 sia in grado di impedire il rilascio delle particelle virali di HIV-1, lentivirus che infetta i primati umani, e come teterina umana, invece, blocchi la gemmazione di FIV, lentivirus che infetta i non primati. I risultati ottenuti permettono di approfondire le conoscenze legate alla biologia di FIV, in particolare quelle relative ai meccanismi cellulari, condivisi oppure altamente divergenti, con il ciclo biologico di HIV-1 e possiedono profonde implicazioni nell'uso di FIV come modello per l’AIDS e nelle applicazioni in ambito biotecnologico e veterinario.

Many enveloped viruses complete their replication cycle by forming vesicles that bud from cellular membranes of different origin, but separation of virion from host membranes is not a trivial or spontaneous step. Several enveloped RNA viruses, such as retroviruses, rhabdoviruses, filoviruses, arenaviruses, and, probably, also ortho and paramyxoviruses, solve such a problem by coopting factors that cells usually employ during the formation of vesicles within specific endosome-derived organelles: the multivesicular bodies (MVBs). Actually, enveloped RNA viruses budding and formation of MVBs intraluminal vesicles are analogous processes: in both cases membranes must curve and bud away from (rather than into) the cytoplasm. Indeed, a productive infection requires that all the components necessary for the formation of infectious particles localize to the membrane at the site where budding will take place. To that end, RNA viruses evolved two possible strategies: the presence of special sequences named Late domains (L-domains) in their structural proteins and/or their ubiquitylation. In any case proteins involved are recruited to the MVBs pathway. Much less is known about herpesviruses and, in general, enveloped DNA viruses. In fact, even if the initial steps of the herpetic infection are quite well-known, the cellular site of assembly and pericapsid’s acquisition as well as the nature of the membranes involved in viral budding are not clear yet. The aim of this work was to elucidate the molecular mechanisms behind essential steps of herpesvirus replication, such as assembly and budding from infected cells. In particular, we used the -herpesvirus HSV-1 as a model. Two recent works pointed out a possible role of MVBs in HSV-1 replication: both virus gress and intracellular trafficking and maturation of the essential glycoprotein gB require functional biogenesis of MVBs. On the basis of those considerations, we evaluated whether MVBs membranes could be the recruiting site of other main structural proteins, such as the tegumental ones, in order to identify those organelles as the pericapsid’s acquisition and final assembly site of the viral particles. Most of all, we focused on four HSV-1 tegumental proteins: VP1/2, VP13/14, VP16 and VP22. Especially, we observed that both VP1/2 and VP16 possess sequences belonging to the L-domains motifs and that both VP1/2 and VP16 localize at the MVBs membranes. We also proved the interaction between the PSAP motif of theprotein and Tsg101, its cellular partner. We supposed that the recruitment of VP1/2 to the MVBs can be due, at least partially, to such interaction. Vice versa, the reason for the localization of VP16 are not as clear. We demonstrated that VP16 does not show any direct interactions between its PPLY motif and the corresponding cellular partners, the members of the Nedd4 ubiqutin-ligases family. Moreover, our data revealed that VP16 is not even ubiquitylated, a post-translational modification that would ensure its sorting to the MVBs. Supposing that its recruitment to the MVBs was indirect and due to other viral proteins, we verified two of the interactions ascribed to VP16 and other tegument proteins in the literature, especially those related to VP13/14 and VP22. We confirmed that VP16 direct interacts with VP22, in the absence of other viral factors, but not with VP13/14. Still, that interaction did not explain the intracellular localization of VP16 that could require viral and/or cellular factors other than those examined. Last, by a deeper investigation of both VP22 and VP13/14, we demonstrated that each of those proteins is ubiquitylated and that the ubiquitylation of VP13/14 is specific for the targeting to the MVBs pathway. Concluding, our data showed that at least four HSV-1 tegumental proteins are recruited to the MVBs or own the necessary features for such an intracellular localization, that are L-domains or ubiquitin conjugation. So it is possible to suppose that MVBs could provide the appropriate platform for the tegument assembly and the acquisition of the pericapsid as well as a possible exit from the infected cell.
Molti virus dotati di envelope completano il proprio ciclo replicativo formando delle vescicole che gemmano attraverso membrane cellulari di varia natura, ma la scissione del virione da tali membrane non è un passaggio semplice o spontaneo. Per quel che riguarda diversi virus a RNA, tra cui retrovirus, rabdovirus, filovirus, arenavirus e, presumibilmente, orto- e paramixovirus, tale problema è stato risolto mediante il reclutamento di fattori normalmente utilizzati dalla cellula durante la formazione di vescicole interne a specifici organelli membranosi derivati dagli endosomi: i multivesicular bodies (MVB). In effetti, la gemmazione dei virus a RNA dotati di envelope e la formazione delle vescicole interne ai MVB sono processi analoghi: in entrambi i casi si verifica una curvatura della membrana in allontanamento dal citoplasma. Affinché un’infezione possa considerarsi produttiva, quindi, è necessario che tutti i componenti utili alla formazione della particella siano convogliati a livello della membrana in cui si verificherà l’evento di gemmazione. A questo scopo, i virus a RNA hanno evoluto due possibili strategie: la presenza di particolari sequenze note come Late domain (L-domain) all’interno delle proprie proteine strutturali e/o la loro ubiquitinazione; in entrambi i casi le proteine coinvolte vengono reclutate nel pathway dei MVB. Molto meno è noto, invece, per quel che riguarda gli herpesvirus e, più in generale, i virus a DNA dotati di envelope. Infatti, se da un lato le fasi iniziali dell’infezione erpetica sono piuttosto conosciute, dall’altro rimangono aperte alcune controversie riguardanti il sito cellulare di assemblaggio e acquisizione del pericapside nonché la natura delle membrane implicate nella gemmazione della particella virale dalla cellula infetta. Lo scopo di questo lavoro è stato quello di contribuire al chiarimento dei meccanismi molecolari dell’assemblaggio e della gemmazione degli herpesvirus, prendendo come modello il virus dell’herpes simplex di tipo 1 (HSV-1). In particolar modo, due lavori pubblicati nell’ultimo periodo hanno evidenziato un possibile ruolo dei MVB nel ciclo replicativo di HSV-1 sottolineando l’importanza di una corretta biogenesi di tali organelli per garantire la gemmazione virale e il corretto trafficking intracellulare di una proteina virale essenziale, quale la glicoproteina B. Sulla base di tali riscontri si è deciso di valutare se le membrane dei MVB costituissero il sito di reclutamento di altre importanti proteine strutturali, quali quelle del tegumento, cosìda poter identificare tali organelli come il sito di acquisizione del pericapside e di assemblaggio definitivo della particella virale. Nel presente lavoro ci siamo focalizzati soprattutto su quattro proteine del tegumento di HSV-1: VP1/2, VP13/14, VP16 e VP22. In particolar modo, abbiamo dimostrato che VP1/2 e VP16 presentano al proprio interno sequenze riconducibili a L-domain noti e che sia VP1/2 che VP16 localizzano a livello delle membrane dei MVB. Il reclutamento di VP1/2 a livello di tali organelli può essere attribuito, almeno in parte, all’interazione tra il dominio PSAP in essa contenuto e la proteina Tsg101, suo partner cellulare, con cui abbiamo dimostrato l’associazione. Viceversa, le cause della localizzazione di VP16 non sono altrettanto chiare. Infatti, abbiamo dimostrato che VP16 non presenta alcuna interazione diretta tra il dominio PPLY in essa presente e i corrispondenti partner cellulari, i membri della famiglia delle ubiquitino-ligasi Nedd4. Inoltre, in base ai nostri dati, la medesima proteina non risulta nemmeno ubiquitinata, modifica post-traduzionale che ne garantirebbe il direzionamento ai MVB. Nell’ipotesi che il suo reclutamento ai MVB sia di tipo indiretto e dovuto all’azione di altre proteine virali, abbiamo quindi verificato alcune tra le interazioni riportate in letteratura per quel che riguarda VP16 e le altre proteine del tegumento, in particolare VP13/14 e VP22. Dai nostri esperimenti è emerso che VP16 interagisce direttamente con VP22, in assenza di altri fattori virali, ma non con VP13/14. Tuttavia, nemmeno il legame con VP22 è risultato tale da giustificare la localizzazione intracellulare di VP16, che quindi potrebbe richiedere fattori virali e/o cellulari diversi da quelli analizzati. Infine, mediante studi più approfonditi su VP22 e VP13/14, abbiamo dimostrato che entrambi tali proteine risultano ubiquitinate e che, nel caso specifico di VP13/14, tale ubiquitinazione è del tipo generalmente responsabile del direzionamento di una proteina al pathway dei MVB. In conclusione, i nostri dati dimostrano che almeno quattro proteine del tegumento sono effettivamente reclutate ai MVB o possiedono le caratteristiche necessarie ad una simile localizzazione, quali la presenza di L-domain o la coniugazione all’ubiquitina. E’ quindi possibile supporre che tali organelli, oltre a rappresentare una potenziale via d’uscita dalla cellula infettata, possano fornire anche la “piattaforma” cellulare adatta al completamento dell’assemblaggio del tegumento e all’acquisizione del pericapside da parte della particella virale.