Dissertations / Theses on the topic 'Inhibiteurs des interleukines'

Les IL-36α, β et γ sont des cytokines appartenant à la famille de l’IL-1. Elles sont exprimées notamment dans la peau et sont impliquées dans la pathogenèse du psoriasis. Leurs inhibiteurs connus ou hypothétiques l’IL-36Ra et l’IL-38 agissent en limitant l’inflammation. Dans la polyarthrite rhumatoïde (PR) et la maladie de Crohn, l’expression et le rôle de ces cytokines sont encore débattues. Les travaux de cette thèse se consacrent à l’étude du profil d’expression des IL-36 et de leurs inhibiteurs ainsi qu’à déterminer l’impact d’une surexpression de l’IL-38 in vivo et in vitro. La première étude a été réalisée chez les patients atteints de PR en comparaison avec les patients psoriasiques et ceux atteints de maladie de Crohn ainsi que dans les modèles murins correspondants. Cette étude a montré que ces cytokines étaient exprimées majoritairement par les kératinocytes et les macrophages mais possédaient cependant des profils d’expression distincts. Elle a également permis d’identifier un sous-groupe de patients pour lesquelles les IL-36 pourraient avoir un rôle important et pourraient représenter une cible en clinique. La seconde partie de la thèse a permis de montrer un effet anti-inflammatoire d’une surexpression de l’inhibiteur IL-38 dans différents modèles d’arthrite in vivo et dans des macrophages in vitro. Les thérapies basées sur l’inhibition de cytokines ont déjà prouvé leur efficacité en clinique et sont une cible thérapeutique très prometteuse. Cette thèse a pour objectifs d’une part de mieux comprendre la biologie des nouvelles cytokines de la famille de l’IL-1 et d’autre part de participer à la découverte de nouvelles cibles thérapeutiques dans les pathologies inflammatoires chroniques telles que la PR
IL-36α, β and γ are cytokines belonging to the IL-1 family. IL- 36 are expressed especially in the skin and are involved in the pathogenesis of psoriasis. Their inhibitors (well-known or hypothetical) IL-36Ra and IL-38 act in reducing inflammation. In rheumatoid arthritis (RA) and Crohn's disease, the expression and role of these cytokines need to be elucidated. This thesis is dedicated to the study of IL-36 agonists and antagonists expression profile and the better understanding of in vivo and in vitro impact of IL-38 overexpression. The firts study was conducted in patients with RA in comparison with psoriasis and Crohn's disease patients as well as in the corresponding relevant murine models. This study showed that these cytokines were expressed predominantly by keratinocytes and macrophages but had distinct expression profiles. A subgroup of patients for which the IL-36 could have an important role and may represent a clinical target was also identified. In the second part of the thesis, we demonstrated an anti-inflammatory effect following overexpression of the inhibitor IL-38 in several in vivo arthritis models and in macrophages in vitro. Cytokine neutralization based therapies have already proven effective in the clinic and are still a promising therapeutic target. This thesis aims firstly to better understand the biology of new IL-1 family cytokines and also to participate in the discovery of new therapeutic targets in chronic inflammatory diseases such as RA

Les trois genes codant pour des inhibiteurs de serine-proteases du rat, spi-2. 1, 2. 2 et 2. 3, ont ete clones et sequences. Ces genes couvrent environ 7. 5 kb et sont organises en 5 exons et 4 introns. Les parties structurales de spi-2. 1 et 2. 2 sont identiques a plus de 90%, et environ a 70% a celle de spi-2. 3. Par contre, les regions 5-flanquantes presentent des divergences susceptibles d'expliquer leurs regulations differentielles. En effet, spi-2. 1 et 2. 2, maximalement exprimes a l'etat sont totalement ou partiellement reprimes apres hypophysectomie ou au cours de l'inflammation. A l'inverse, spi-2. 3, peu exprime chez l'animal normal, est induit par une inflammation aigue. A l'exception d'une insertion de 42 pb specifique de spi-2. 3 les trois promoteurs des genes presentent de fortes homologies dans les 250 pb precedant le site d'initiation de la transcription. L'etude des proteines se fixant sur ces promoteurs indique l'existence de 3 sites de fixations communs sur les regions proximales. Ces sites sont reconnus surtout par des facteurs de la famille c/ebp, mais egalement par d'autres facteurs non-identifies. Le site 3 reconnait un facteur specifique du foie, induit par l'hormone de croissance. La sequence specifique de spi-2. 3 est reconnue par 2 facteurs ubiquitaires, dont un est apparente a nfkb. L'occupation du premier site c/ebp est suffisante pour activer la transcription du promoteur spi-2. 1 de facon quasi-maximale. Mais les aspects de regulation trouves in vivo sont perdus dans le systeme de transcription in vitro. En effet, in vivo, l'activation par la famille c/ebp semble inhibee

Le gène de l'α-1-microglobuline/Bikunine précurseur (AMBP) code pour deux protéines plasmatiques humaines, l'α-1-microglobuline et la Bikunine. L'utilisation de la technique des gènes rapporteurs a montré que le gène de l'AMBP possède un promoteur minimal faible et ubiquitaire, assisté d'un enhancer fort, d'activité restreinte au tissu hépatique et situé à -2,8 kb du site de départ de la transcription. Cet enhancer est constitué de 6 sites potentiels (appelés boîtes 1 à 6) pour la fixation de facteurs nucléaires de type HNF1, HNF3 ou HNF4. Les expériences de retard sur gel, de mutagénèse dirigée de chacune des 6 boîtes ont montré respectivement que les boîtes 1 et 4 fixaient le facteur HNF1, que la boîte 3 fixait le facteur HNF3 et que 5 boîtes (1 à 5) sur 6 étaient importantes dans l'activité enhancer. De plus, nous avons montré d'une part que le facteur HNF1 est indispensable à l'activité enhancer, d'autre part que les combinaisons de facteurs (HNF1, HNF3) et (HNF1, HNF4) ont un effet synergique sur l'activité enhancer. Enfin, nous avons testé l'effet de glucocorticoïdes et des médiateurs principaux de l'inflammation (interleukines 1 et 6) sur l'expression du gène AMBP dans les cellules HepG2. Nos résultats de Northern montrent que le niveau de transcription du gène AMBP diminue en présence de dexaméthasone associée à l'IL-1 et/ou l'IL-6. La mutation de la boîte 5 entraîne la perte de la réponse à l'IL-1. La boîte 5 est chevauchée par un site de fixation potentiel pour le facteur NF-IL-6 qui pourrait être impliqué dans la modulation par l'IL-1 de l'activité de l'enhancer du gène AMBP

Contexte : L’asthme est une maladie inflammatoire des voies aériennes inférieures très fréquente dans la population générale. Parmi les patients asthmatiques, 5 à 10 % développent des formes sévères, caractérisées par une réponse insuffisante aux corticoïdes inhalés. Chez ces patients, le remodelage bronchique est un phénomène qui aggrave le handicap respiratoire associé à l’asthme sévère. Cependant, le remodelage bronchique reste un défi thérapeutique, en l’absence de traitement spécifique actuellement. Peu de modèles animaux réussissent à en reproduire fidèlement les caractéristiques, et c’est tout particulièrement le cas en contexte d’inflammation « T2low » des voies aériennes, caractérisée par une prédominance neutrophilique sur le plan cellulaire et par une résistance aux corticoïdes. Nous avons développé un modèle murin d’asthme induit par l’allergène de chien qui reproduit les caractéristiques du remodelage bronchique humain dans un contexte d’inflammation neutrophilique et Th17 des voies aériennes, associés à une production accrue d’IL-17A et d’IL-22.Objectifs : L’objectif de nos travaux était, d’une part, de valider la pertinence de ce modèle comme modèle d’asthme sévère corticorésistant, et, d’autre part, d’étudier l’impact thérapeutique de la neutralisation de l’IL-22 dans ce modèle.Méthodes : L’asthme était induit par l’allergène de chien, administré par voie intranasale, chez des souris C57BL/6J. Au cours de la dernière semaine de provocation par l’allergène, les souris recevaient 1 mg.kg-1 de dexaméthasone par voie intrapéritonéale pour l’évaluation de la corticorésistance du modèle. Pour l’évaluation de l’impact de la neutralisation de l’IL-22, les souris recevaient, au cours de la dernière semaine de provocation par l’allergène, trois doses de 200 μg d’anticorps anti-IL-22 à 48 heures d’intervalles. Vingt-quatre heures après la dernière injection, l’hyperréactivité bronchique était évaluée par la mesure des résistances des voies aériennes par cathétérisation trachéale, en réponse à des doses croissantes de méthacholine nébulisée. L’inflammation des voies aériennes était étudiée grâce à l’étude cytologique du lavage bronchoalvéolaire et la mesure de l’expression et de la production pulmonaire cytokinique et chimiokinique. Les paramètres du remodelage bronchique étaient étudiés par méthode histologique et immunohistochimique. Résultats : Dans un premier temps, nous avons observé une persistance à des niveaux significativement élevés de l’hyperréactivité bronchique, de l’inflammation neutrophilique, de la surexpression du gène codant pour l’IL-17A, ainsi que de l’hyperproduction de mucus, de la fibrose sous-épithéliale et de l’hypertrophie du muscle lisse bronchique associés au remodelage bronchique. Dans un second temps, la neutralisation de l’IL-22 par l’anticorps n’a pas montré d’impact sur les principaux paramètres inflammatoires du modèle, mais induisait une diminution significative de l’hypertrophie du muscle lisse bronchique, et, dans une moindre mesure, de la fibrose sous-épithéliale. Conclusion : Le modèle murin d’asthme induit par l’allergène de chien est un modèle pertinent d’asthme sévère corticorésistant, et l’IL-22 pourrait être une cible thérapeutique intéressante dans le traitement du remodelage bronchique chez les patients asthmatiques sévères
Background: Asthma is a common inflammatory disease of the lower airways in the general population. Among asthmatic patients, 5-10% develop severe forms, characterized by a poor response to inhaled corticosteroids. In these patients, airway remodelling is a phenomenon that worsens severe asthma-associated respiratory disability. However, airway remodelling remains an area of unmet therapeutic needs in the field of severe asthma treatment. Only scarce animal models accurately reproduce its pathological features, particularly in a context of T2low airway inflammation, which is characterized by a predominance of neutrophils and corticosteroid resistance. We developed a murine model of asthma, induced by dog allergen, that replicates the features of human airway remodelling in a context of neutrophilic and Th17 airway inflammation, associated with increased production of IL-17A and IL-22. Objectives: The objectives of our work were, first, to validate the relevance of this model as a model of severe corticosteroid-resistant asthma, and second, to study the therapeutic impact of IL-22 neutralization in this model.Methods: Asthma was induced by intranasal administration of dog allergen in C57BL/6J mice. During the final week of allergen challenge, mice received 1 mg.kg-1 of intraperitoneal dexamethasone to assess response to steroids. To evaluate the impact of IL-22 neutralization, mice received three 200 μg-doses of anti-IL-22 antibody every 48 hours during the final week of allergen challenge. Twenty-four hours after the last injection, airway hyperresponsiveness was evaluated by measuring airway resistances via tracheal canulation in response to increasing doses of nebulized methacholine. Airway inflammation was assessed through cytological analysis of bronchoalveolar lavage and measurement of pulmonary cytokine and chemokine expressions and productions. Airway remodelling parameters were studied using histological and immunohistochemical methods. Results: First, we observed a significant persistence of airway hyperresponsiveness, neutrophilic inflammation, overexpression of the gene encoding IL-17A, as well as mucus hyperproduction, subepithelial fibrosis, and airway smooth muscle hypertrophy associated with airway remodelling. Subsequently, antibody-mediated IL-22 neutralization had no impact on the main airway inflammatoryparameters of the model, but significantly reduced airway smooth muscle hypertrophy and, to a lesser extent, subepithelial fibrosis. Conclusion: The dog allergen-induced murine asthma model is a relevant model of severe corticosteroid-resistant asthma, and IL-22 may be a promising therapeutic target for treating airway remodelling in patients with severe asthma

Les héparines peuvent modifier le phénotype de fibroblaste dermique, gingivaux desmodontaux. Les polysaccharides étudiés modulent la prolifération cellulaire en fonction de leurs concentrations. Ainsi de faibles quantités d'héparine (800nM) stimulent la prolifération fibroblaste, alors que des concentrations plus élevés (supérieur à 8μM) l'inhibe. Les héparinoïdes agissent ainsi sur l'expression basale ou induite par l'interleukine 1 des métalloprotéinases matricielles sécrétées par les fibroblastes dermiques ou gingivaux. L'héparine et son fragment SR80258A inhibent, de façon dose-croissante, les sécrétions induites par la cytokine des MMP1, MMP3, TIMP1, MMP2, et du TIMP2. Les polysaccharides n'ont pas d'effets sur le niveau basal de TIMP1 et stimulent la sécrétion de la MMP2et du TIMP2 pour une concentration proche de 10μg/ml de milieu de culture. Le mode d'action des héparines pour la modulation de ces phénotypes est complexe. En effet, l'héparine agit à des niveaux très variés : liaison directes avec les constituants de la matrice extracellulaire, couplage aux membranes cellulaires, internalisation intracytoplasmique et intra-cellulaire, couplage au cytosquelette,. . . Nos futurs travaux concerneront les mécanismes de transduction qui pourraient être impliqués dans l'activité des héparines. Nos résultats démontrent que les fibroblastes gingivaux peuvent proliférer dans des conditions restrictives et que les fragments d'héparine sont capables de moduler la fonction des fibroblastes gingivaux durant la cicatrisation en influençant leur prolifération. De même les héparinoïdes, qui agissent sur la synthèse des métalloprotéases et de leurs inhibiteurs, peuvent constituer un agent pharmocologique utile pour contrôler la dégradation de la matrice qui survient lors des parodonpathies.

Le criblage virtuel est largement employé pour la recherche de nouveaux médicaments.La sélection de structures pour les méthodes de criblage virtuel basées sur la structure reste problématique. Nous avons montré que les propriétés physico-chimiques du site de liaison, critères simples et peu coûteux en temps de calcul, pouvaient être utilisées pour guider celle-ci.L’évaluation des méthodes de criblage virtuel, critique pour vérifier leur fiabilité, repose sur la qualité de banques d’évaluation. Nous avons construit la NRLiSt BDB, n’incluant que des données vérifiées manuellement et prenant en compte le profil pharmacologique des ligands. Une étude à l’aide du logiciel Surflex-Dock montre qu’elle devrait devenir la base de données de référence, pour l’évaluation des méthodes de criblage virtuel et pour rechercher de nouveaux ligands des récepteurs nucléaires. L’application d’un protocole hiérarchique de criblage in silico/in vitro, a permis d’identifier de nouveaux composés inhibiteurs de l’IL-6, potentiellement utilisables dans le traitement de la polyarthrite rhumatoïde. Les résultats in vitro devront être confirmés par des tests in vivo
Virtual screening is widely used in drug discovery processes.Structure selection in structure-based virtual screening methods is still problematic. We showed that simple and “low cost” binding site physico-chemical properties could be used to guide structure selection.The evaluation of virtual screening methods, necessary to ensure their reliability, relies on benchmarking databases quality. We created the NRLiSt BDB, gathering only manually curated data and taking into account ligands pharmacological profiles. A study using Surflex-Dock showed that the NRLiSt BDB should become the reference, both for the evaluation of virtual screening methods and for the identification of new ligands of the nuclear receptors.The use of a in silico/invitro hierarchical approach screening allowed to identify new IL-6 inhibitors, that could be used in rheumatoid arthritis treatment. In vitro results should be confirmed in vivo

Chez l'homme, les protéines de la famille de l'inter-alpha-trypsine inhibiteur (ITI) sont synthétisées dans le foie par quatre gènes différents et sont structurées à partir de différents assemblages des formes matures des précurseurs polypeptidiques : trois chaînes lourdes H1, H2, H3 et une chaîne légère L. Leurs taux sériques varient en fonction de l'état inflammatoire. Il a été montré que les protéines de cette famille assurent la stabilité de la matrice extracellulaire. La première partie de notre étude porte sur la régulation de l'expression des gènes de l'ITI pendant le processus inflammatoire. A l'aide du modèle cellulaire d'hépatome HepG2 et des sondes d'ADNc H1, H2, H3 et L, nous avons pu analyser les variations quantitatives des transcrits de l'ITI sous l'influence de médiateurs de l'inflammation. Les résultats obtenus indiquent que l'interleukine-6 (IL-6), l'un des médiateurs majeurs de l'inflammation, a un effet stimulant sur le taux des ARNm H1 et H3 et un effet inhibiteur sur le taux des ARNm H2 et L. Ces variations sont fonction de la concentration d'IL-6 et de la durée d'induction ; elles ne sont pas observées en présence d'inhibiteurs de la transcription tels que l'actinomycine D. Ces résultats ainsi que le dosage in vitro de la transcription des gènes l'ITI permettent d'affirmer que l'IL-6 augmente l'activité transcriptionnelle des gènes ITI H1 et ITI H3 et diminue celle des gènes ITI H2 et ITI L. L'IL-6 n'a aucun effet sur la durée de vie des ARNm de H3 et L, mais stabilise les ARNm de H2. Ces résultats montrent que l'IL-6 régule l'expression des gènes de l'ITI de manière différentielle. Dans la deuxième partie de ce travail, nous avons réalisé une étude structurale et fonctionnelle de la région promotrice du gène ITI H3. Nous avons séquencé 3000 paires de bases en amont du site d'initiation de la transcription du gène ITI H3. Des fragments délétés dans cette région ont été clonés dans un vecteur d'expression en amont du gène indicateur luciférase. La transfection transitoire des cellules HepG2 en culture par ces constructions révèle une activité promotrice importante qui est modulée par la présence ou l'absence d'IL-6. Un élément cis-régulateur de classe I de réponse à l'IL-6 a pu être localisé en position -1331 par rapport au site d'initiation de la transcription du gène ITI H3. L'analyse des interactions ADN-protéines dans cette région, par retardement sur gel, révèle la fixation de facteurs nucléaires de la famille C/EBP sur cet élément. L'utilisation d'antisérums dirigés contre les facteurs nucléaires C/EBP alpha et C/EBP beta montre leur implication dans la régulation de l'expression du gène ITI H3. Lors de l'induction des cellules HepG2 par l'IL-6 le facteur C/EBP alpha serait déplacé par la présence en excès du facteur C/EBP beta. Ces résultats suggèrent que ce dernier constitue le facteur transactivateur de la régulation positive de l'expression du gène ITI H3 par l'IL-6. L'ensemble de ces résultats nous a permis de caractériser l'élément cis et les facteurs trans, importants pour l'activation transcriptionnelle du gène ITI H3 par l'IL-6.

Le peptide hCAP18/LL-37, une partie de la défense immunitaire innée, a maintenant été reconnu comme multifonctionnelle pour les cellules eucaryotes. Nos études démontrent sa contribution au développement du cancer, montrant qu'il est surexprimé dans la plupart des tumeurs mammaires humaines, active la signalisation la famille de ERBB et augmente le potentiel métastatique des cellules cancéreuses du sein. Notre comparaison des deux lignées du cancer du sein n'a pas révélé de récepteurs communs, mais une structure peptidique identiques mais de chiralité différente est pré requis pour le peptide dans toutes ses activités. Nous émettons l'hypothèse que LL-37 active indirectement des récepteurs transmembranaires en se liant à la membrane cellulaire. Des peptides tronqués dérivés de LL-37 inhibent ses activités et peuvent aider à concevoir une future thérapie anticancéreuse
The peptide hCAP18/LL-37, part of the innate immune defense, has now been recognized as multifunctional for eukaryotic cells. Our studies demonstrate its contribution to cancer development, showing that it is overexpressed in most human breast tumors, activates ERBB signaling and increases the metastatic potential of breast cancer cells. Our comparison on two breast cancer lines did not reveal any common receptors but identical structural prerequisites for the peptide in all its activities. We hypothesize that LL-37 indirectly activates transmembrane receptors by attaching to the cellular membrane. Truncated derivatives inhibit its activities and may help to design a future anticancer therapy

La réponse immunitaire contre les agents infectieux met en jeu les cellules dendritiques (CD) activées via des récepteurs de structures microbiennes tels que les Toll-like (TLR). Les tumeurs expriment des antigènes spécifiques de lymphocytes T (LT) CD8 cytotoxiques et sont infiltrées par des CD (TIDC) pouvant potentiellement déclencher une réponse anti-tumorale après activation par des ligands de TLR. Cependant, des mécanismes permettent à la tumeur d'échapper au système immunitaire. L'IL-10 comme la présence de LT régulateurs (Treg) diminuent l'activation des LT CD8 par les TIDC. Par des mécanismes différents mais complémentaires, le blocage de l'IL-10 et la déplétion des Treg permettent la génération d'une réponse CD8 effectrice spécifique d'un antigène tumoral, inhibent l'induction de LT CD8+ suppresseurs, et se traduisent par l'éradication de tumeurs en réponse au ligand CpG de TLR9. Ces observations devraient permettre une meilleure utilisation des ligands de TLR en thérapie anti-cancéreuse

L'activité fonctionnelle des cellules immunes est régulée par un équilibre entre des signaux activateurs et inhibiteurs. Les récepteurs inhibiteurs KIR (Killer cell Ig-like Receptors) exprimés par les cellules NK et par les lymphocytes T effecteurs mémoires lient les molécules du CMH-I et suppriment l'activation cellulaire via le recrutement de SHP-1. Pour mieux comprendre le rôle des KIR sur les cellules T CD4⁺, des transfectants KIR2DL1 ont été obtenus à partir d'une lignée T Jurkat et de lymphocytes T CD4⁺ primaires. Suite à une stimulation du TCR, la production d'IL-2 est augmentée dans les cellules T CD4⁺ transfectées par le KIR2DL1 indépendamment de son engagement, mais suite à son engagement l'activation induite par le TCR est inhibée. La co-stimulation du signal positif initié par le TCR via le KIR2DL1 nécessite des ITIM intacts et fait suite à leur phosphorylation. Il s'en suit le recrutement de SHP-2 et une augmentation de la phosphorylation de PKCθ et ERK. Lors du contact avec une cellule cible, la synapse est caractérisée par une augmentation du recrutement des p-Tyr, de SHP-2 et de la PKCθ. L'interaction avec une cellule cible exprimant les ligands du KIR2DL1 induit sa forte accumulation à la synapse et le recrutement de SHP-1/SHP-2 qui inhibent la production d'IL-2. Le KIR2DL1 induirait deux signaux opposés dans les cellules T CD4⁺ dépendant ou non de son engagement. Les résultats inattendus observés sur la régulation des cellules T CD4⁺ par le KIR2DL1, de part la dualité fonctionnelle des ITIM est fondamentale pour déterminer la capacité du système immunitaire à développer une réponse appropriée, c'est à dire à maintenir la balance tolérance/immunité
The functional activity of immune cells is controlled by a balance between activators and inhibitors signals. The Inhibitory killer Ig-like receptors (KIR) expressed on NK cells and memory effectors T-cell recognize the CMH-I molecules and inhibit cellular activation by SHP-1 recruitment. To better understand the fonction of KIR receptors on CD4⁺ T-cells, KIR2DL1 transfectants were obtained from human T-cell line and from primary CD4⁺ T-cells. Following TCR stimulation, IL-2 production is increased in CD4+ T cells transfected by KIR2DL1 independently of its engagement. When KIR2DL1 is engaged by its cognate ligand the TCR activation is inhibited. Co-stimulation of the TCR signaling by KIR2DL1 requires intact ITIM and their phosphorylation. It induces a subséquent SHP-2 recruitment and an increased of PKCθ and ERK phosphorylation. Synapses leading to activation are characterized by an increase in the recruitment of p-Tyr, SHP-2, and p-PKCθ. Interaction of KIR2DL1 with its ligand leads to a strong synaptic KIR2DL1 accumulation and SHP-1/SHP-2 recruitment resulting in the inhibition of TCR-induced IL-2 production. These data reveal that KIR2DL1 may induce two opposite signaling outputs in CD4⁺ T cells, depending on whether the KIR receptor is bound to its ligand. The unexpected results observed on the regulation of CD4⁺ T cells by KIR2DL1 receptors, through the functional duality of ITIM, is fundamental to determine the immune System capacity to develop an adapted answer, i. E. To maintain the balance between tolerance and immunity

L'interleukine (IL)-15 est une cytokine pléiotrope structurellement proche de l'IL-2, partageant toutes deux les sous-unités des récepteurs IL-2Rβ et γc. L'IL-15 joue un rôle important dans l'immunité innée et adaptative, soutenant l'activation et la prolifération des cellules NK, NK-T et CD8+ T. En cas de dérèglement, des niveaux élevés d'IL-15 ont été détectés, entraînant des réponses immunitaires anormales et des maladies auto-immunes ou inflammatoires telles que la polyarthrite rhumatoïde ou le psoriasis. Ainsi, notre objectif est de synthétiser des petites molécules inhibitrices qui se lient spécifiquement à l'IL15 sur l'interface IL-2Rᵝ. Nous décrivons ici deux nouvelles familles d'inhibiteurs de l'IL-15. En s’appuyant sur nos précédents nos travaux, de nouvelles modifications ont été apportées à notre première série labellisée IBI. Dans un deuxième temps, nous avons réalisé un docking à partir du criblage virtuel de bibliothèques de composés sur un pharmacophore affiné basé sur des résidus spécifiques de l'IL-15, identifiés sur le site de liaison de l'IL-15 avec l'IL-2Rᵝ donnant ainsi notre deuxième famille labellisée IBIS. Ces séries de composés ont été évaluées pour leur capacité à inhiber la liaison entre l'IL-15 et son récepteur, ainsi que la cascade de signalisation en aval des cellules dépendantes de l'IL-15 et leur prolifération
Interleukin (IL)-15, is a pleiotropic cytokine structurally close to IL-2, both sharing the IL-2Rβ and γc receptor subunits. IL-15 plays important roles in innate and adaptative immunity, supporting the activation and proliferation of NK, NK-T, and CD8+ T cells. In case of dysregulation, high levels of IL-15 have been detected, leading to abnormal immune responses and autoimmune or inflammatory diseases such as polyarthritis rheumatoid or psoriasis. Hence, our goal is to synthesize small molecule inhibitors that bind specifically to IL15 on the IL-2Rᵝ interface. Herein, we describe two new families of IL-15 inhibitors. Taking advantage of our previous work, extending modifications were done on our first series called IBI. On a second time, we applied a similar docking-based virtual screening of compounds libraries on a refined pharmacophore-based on IL-15 specific residues identified on the binding site of IL-15 with IL- 2R giving so our second family named IBIS. These series of compounds were evaluated for their capacity to inhibit the binding to IL-15 to its cognate receptor, as well as the down-stream signaling of IL-15-dependent cells and their proliferation

La maladie cœliaque réfractaire de type II (MCRII), autrement appelé lymphome intraépithélial, est une complication rare mais sévère de la maladie cœliaque caractérisée par une expansion clonale d'une population particulière de lymphocytes intraépithéliaux (LIE) innés, présents dans l'intestin normal chez l'Homme comme chez la souris. Notre laboratoire a montré que cette population particulière de LIE innés partage des caractéristiques communes à celles des lymphocytes T et des cellules NK. Ces « LIE iCD3+ innés » sont caractérisées par une expression de CD3 au niveau intracellulaire mais pas à la surface, de récepteurs NK et présentent des réarrangements des gènes codant le récepteur T. En outre, le laboratoire a montré que ces cellules se développent dans l'épithélium intestinal à partir de précurseurs de la moëlle osseuse en réponse à une combinaison de signaux induits à travers la voie NOTCH et l'interleukine 15. Durant la lymphomagénèse, les LIE iCD3+ innés acquièrent des mutations somatiques gain-de-fonction dans JAK1et/ou STAT3. Ces mutations pourraient favoriser l'expansion clonale des LIE iCD3+ mutés aux dépens des lymphocytes T normaux résidents en leur conférant une sensibilité accrue à l'interleukine 15 (IL-15), une cytokine surexprimée dans l'intestin des patients. Ainsi, notre hypothèse est que ces mutations ont un rôle central dans l'initiation de la lymphomagénèse dans un contexte de production chronique d'IL-15 et, de ce fait, représentent une cible thérapeutique. Le premier objectif de ma thèse a été d'étudier l'intérêt des inhibiteurs de la voie JAK/STAT dans le traitement de la MCRII. Dans un premier temps, nous avons testé in vitro différents inhibiteurs de JAK/STAT sur des lignées cellulaires IL-15-dépendantes issues soit de LIE de MCRII soit de LIE T normaux. Nous avons démontré que ces drogues inhibent la prolifération et la phosphorylation de STAT3 et augmentent l'apoptose cellulaire aussi bien dans les LIE MCRII que dans les LIE T normaux. Dans un second temps, nous avons généré un modèle de xénogreffe en injectant des cellules issues de biopsies intestinales ou du sang d'un patient MCRII dans des souris immunodéficientes surexprimant l'IL-15 humaine dans l'épithélium intestinal (Rag-/-Gc-/-IL-15TgE ou IRGC) afin de tester l'efficacité des inhibiteurs de JAK/STAT in vivo. Le traitement des souris xénogreffées par le ruxolitinib, inhibiteur de JAK1/JAK2, a permis une diminution de la fréquence et du nombre ainsi que de l'activité cytotoxique des cellules tumorales humaines et une amélioration de l'état général des souris. Ces résultats encourageants restent à confirmer. Le second objectif de ma thèse a été de vérifier si la mutation pD661V de STAT3 était suffisante pour induire le développement de la MCRII dans un contexte de surproduction d'IL-15 dans des souris IRGC. Nous avons généré avec succès les LIE iCD3+ innés murins semblables aux LIE iCD3+ innés humaines à partir de précurseurs communs aux cellules lymphoïdes (CLP) en combinant un signal NOTCH et IL-15. Nous avons ensuite transduit les CLP avec un vecteur rétroviral contenant Stat3 sauvage ou muté (D661V). Les cellules transduites ont alors été injectées chez des souris IRGC suivies pendant 8 semaines. Les résultats préliminaires ont montré que les LIE iCD3+ innés se logent préférentiellement dans l'intestin mais aucun développement d'un lymphome intraépithélial n'a été observé au bout de 8 semaines suggérant que la mutation pD661V de STAT3 seule ne suffit pas en présence d'IL-15 à induire in vivo un lymphome intraépithélial. Ces résultats préliminaires sont toutefois à reproduire et à confirmer. Le modèle mise en place pour l'étude de STAT3 va désormais être utilisé afin d'évaluer la contribution respective de mutations canoniques de JAK1 et STAT3 et des autres mutations récurrentes retrouvées dans le lymphome intraépithélial
Refractory coeliac disease type II (RCDII), also called intraepithelial lymphoma, is a rare but severe complication of coeliac disease characterized by the clonal expansion of a small subset of innate intraepithelial lymphocytes (IEL), present in the normal human and murine intestine. Our lab has shown that this population displays shared features between T and natural killer (NK) cells. These so-called iCD3+ innate IEL are mainly characterized by intracellular expression of CD3, which is not detected at the cell surface, expression of NK receptors as well as DNA rearrangement of T cell receptor genes. Our lab has also shown that iCD3+ innate IEL originate from bone marrow precursors through coordinated NOTCH1 and interleukin (IL)-15 signals. During lymphomagenesis, iCD3+ innate IEL of most RCDII patients were shown to have acquired somatic gain-of-function mutations in JAK1 and/or STAT3 that confer increased sensitivity to interleukin-15, a cytokine overexpressed in the intestine of coeliac patients, thereby promoting their clonal expansion. Thus, our hypothesis is that JAK1/STAT3 mutations play a key role in initiating lymphomagenesis associated to coeliac disease in an IL-15-rich environment and that they could represent an attractive therapeutic target.The first objective of my thesis was to study the interest of JAK/STAT inhibitors for RCDII treatment. First, we have tested in vitro different JAK/STAT inhibitors on IL-15-dependent RCDII or normal IEL-T cell lines. We have shown that these inhibitors decrease the proliferation and phosphorylation of STAT3 and increase cellular apoptosis in both RCDII and normal T cell lines. Secondly, we have established a xenograft model based on the injection of cells derived from biopsy or blood from one RCDII patient into immunodeficient mice overexpressing the human IL-15 transgene in their gut epithelium (Rag-/-Gc-/- IL-15TgE; IRGC) to test the efficacy of JAK/STAT inhibitors in vivo. Treatment of xenografted mice with ruxolitinib, a potent inhibitor of JAK1/JAK2 decreased the frequency, number and cytotoxic potential of human tumoral cells and allowed clinical restoration. These preliminary results are encouraging but need to be confirmed. The second objective of my thesis was to test whether the Stat3 pD661V mutation is sufficient to induce the intraepithelial lymphoma in an IL-15-rich context in IRGC mice. We have successfully generated murine iCD3+ innate IEL in vitro, resembling their human counterparts from common lymphoid precursors by combining NOTCH and IL-15 signals. We then transduced CLP with a retroviral vector containing wild-type or mutated Stat3 pD661V. The transduced cells were injected into IRGC mice that subsequently were followed-up during a period of 8 weeks. In vitro generated iCD3+ innate IEL preferentially homed to the intestine. However, no development of intraepithelial lymphoma was observed suggesting that the Stat3 pD661V variant alone is not sufficient to induce the intraepithelial lymphoma. These preliminary results need to be reproduced and confirmed. The murine model used to test the role of STAT3 will now be used to evaluate the respective contribution of canonical mutations in JAK1 and STAT3 and of other recurrent mutations identified in RCDII

De récentes études épidémiologiques et expérimentales ont montré que la consommation de certains aliments (thé, oignons, fruits) exerçaient un effet protecteur vis-à-vis de la perte osseuse. Ces aliments sont riches en quercétine et kæmpférol, deux flavonols de la classe des flavonoïdes. Nous avons dans le cadre de notre travail, émis l'hypothèse que ces deux composés pouvaient être responsables des effets bénéfiques sur l'os. Au cours de cette étude, nous avons évalué leurs effets sur l'activité phosphatase alcaline et la production d'IL-6 dans la lignée d'ostéoblastes humains MG-63. Nos résultats ont montré que ces deux flavonols stimulent l'activité de la phosphatase alcaline (PAL), de façon dose-dépendante. L'utilisation d'un inhibiteur pharmacologique de la voie ERK (PD 98059) a permis de bloquer les effets des flavonols sur l'activité PAL. L'implication de la voie des MAPK a été confirmée par la mise en évidence d'une rapide activation de ERK1/2. L'activation des MAPK ainsi que l'effet sur la PAL sont complêtement abolis en présence d'ICI 182780, un antagoniste pur des récepteurs des oestrogènes (ER). Ces résultats suggèrent que la quercétine et le kæmpférol sont susceptibles s'interagir avec le ER et d'induire une augmentation de l'activité PAL via une activation des MAPkinases. Utilisés aux plus fortes doses (50γM) les deux composés et tout particulièrement la quercétine, conservent leurs propriétés antioxydantes. Nous montrons également que la quercétine diminue de manière significative le stress oxydant généré par le TNFα. Cette cytokine est connue pour exercer un puissant effet hyper-résorbant lié en partie à la secrétion de facteurs favorisant l'ostéoclastogenèse comme l'interleukine 6 (IL-6). La quercétine s'oppose à l'action du TNFα sur la production d'ARNm codant l'IL-6, sa synthèse protéique, la phosphorylation de p38 et la translocation de NFKB, facteur de transcription connu pour être sensible au stress oxydant. D'autres antioxydants comme le PDTC et la vitamine E ont sensiblement les mêmes effets. Ces résultats suggèrent l'existence d'une relation entre l'état rédox de la cellule et la production de l'IL-6 induite par le TNFα. En conclusion, l'ensemble de ces données démontre, d'une part que la quercétine et le kæmpférol exercent un effet stimulant sur la phosphatase alcaline via leurs propriétés œstrogéniques et d'autre part que la quercétine, grâce à ses propriétés antioxydantes, pourraient s'opposer aux effets délétères du TNFα dans le microenvironnement osseux. Ces résultats, associés à ceux que nous avons récemment obtenus dans notre laboratoire montrant que les flavonols bloquent la résorption osseuse in vitro, identifient la quercétine et le kæmpférol comme des substances potentiellement actives dans le traitement de l'ostéoporose.

La modification post-traductionnelle des chimiokines par la dipeptidyl peptidase-4 (DPP4 ou CD26) régule négativement le trafic des lymphocytes, et son inhibition améliore la migration des lymphocytes T et l'immunité anti-tumorale en préservant la forme fonctionnelle de CXCL10. En étendant ces résultats initiaux aux humains et à un modèle préclinique de carcinome hépatocellulaire, nous avons découvert un nouveau mécanisme par lequel l'inhibition de DPP4 améliore les réponses anti-tumorales par le recrutement des éosinophiles. Plus précisément, l'administration d'inhibiteurs de DPP4 (DPP4i) conduit à des concentrations tumorales plus élevées de CCL11 (ou eotaxine) et à une augmentation de la migration des éosinophiles exprimant CCR3 dans les tumeurs. Un meilleur contrôle de la croissance tumorale a été observé lors du traitement par DPP4i, un effet conservé chez les souris Rag2–/– mais abrogé uniquement lors de la déplétion des éosinophiles ou de l'inhibition de leur dégranulation. Nous avons également démontré que l'expression tumorale d’IL-33 était nécessaire et suffisante pour une réponse anti-tumorale médiée par les éosinophiles et que ce mécanisme contribuait à l'efficacité des inhibiteurs de points de contrôle immunitaires. Ces résultats révèlent un nouveau mécanisme par lequel le contrôle tumoral est médiée par IL-33 et les éosinophiles, mécanisme ici révélé lorsque les mécanismes endogènes de régulation immunitaire par DPP4 sont inhibés
Dipeptidyl peptidase-4 (DPP4 or CD26)–mediated post-translational modification of chemokines has been shown to negatively regulate lymphocyte trafficking, and its inhibition enhances T cell migration and tumor immunity by preserving functional CXCL10. In extending these initial findings to humans and pre-clinical hepatocellular carcinoma models, we discovered a new mechanism whereby DPP4 inhibition improves anti-tumor responses by eosinophil recruitment. Specifically, administration of DPP4 inhibitors (DPP4i) resulted in higher concentrations of CCL11 (or eotaxin) and increased CCR3-mediated eosinophil migration into mouse tumors. Enhanced tumor control was observed upon treatment with DPP4i, an effect strikingly preserved in Rag2–/– mice, and abrogated only upon depletion of eosinophils or inhibition of their degranulation. We further demonstrated that tumor expression of IL-33 was necessary and sufficient for eosinophil-mediated anti-tumor responses, and that this mechanism contributed to checkpoint inhibitor efficacy. These findings provide new insight into IL-33- and eosinophil-mediated tumor control, revealed when endogenous mechanisms of DPP4 immune regulation are inhibited

L’approche Module X a été créée dans le but de concevoir de petits peptides modulateurs ayant des propriétés allostériques. Module X reproduit de petites parties des portions extracellulaires flexibles des récepteurs. Ces petits peptides vont interagir en s’interposant entre deux sous unités ou entre deux régions de la même sous-unité qui interagissent par des liens hydrogènes, des ponts salins ou des liens disulfure. Ces régions sont spécialement choisies à l’extérieur du domaine de liaison du ligand orthostérique et sont situées dans les régions inter domaines, la portion juxta membranaire ou dans les boucles. Étant donné que les boucles sont exposées durant les changements de conformation, une séquence peptidique reproduisant certaines régions de ces boucles pourrait s’insérer à un endroit approprié dans la structure où se lier à son partenaire de signalisation dans le complexe protéique, ce qui aurait comme effet de déplacer l’équilibre de l’ensemble vers un état particulier et modulerait ainsi la signalisation. De cette façon, certaines voies de signalisation pourraient être partiellement inhibées tandis que d’autres voies ne seraient pas touchées puisque le ligand orthostérique pourrait toujours se lier au récepteur. Dans une première étude, nous avons conçu des peptides inhibiteurs du récepteur de l’interleukine 1 (IL-1R/IL-1RAcP) plus précisément en reproduisant des régions flexibles de la protéine accessoire, sous-unité signalisatrice du récepteur. IL-1 est un médiateur majeur de l’inflammation, mais le seul antagoniste disponible est l’analogue naturel de IL-1, IL-1Ra qui compétitionne avec IL-1 pour le site de liaison sur le récepteur. Nous avons conçu plusieurs peptides à partir des boucles de la protéine accessoire. Un de ces peptides, rytvela (101.10) a démontré des propriétés de non-compétitivité et de sélectivité fonctionnelle caractéristiques des modulateurs allostériques. 101.10 bloque la prolifération des thymocytes et la synthèse de PGE2 avec un IC50 de 1 nM mais une efficacité de 100 % et 45 % respectivement et ne déplace pas IL-1 radioactif dans des essais de radioliaisons. De plus, 101.10 n’a qu’un effet minime sur l’affinité de IL-1 pour son récepteur. 101.10 démontre, de plus, une activité inhibitrice in vivo dans des modèles d’inflammation de l’intestin chez le rat (efficacité supérieure aux corticostéroïdes et à IL-1Ra) et de dermatite chez la souris de même que dans un modèle d’hyperthermie induite par IL-1. La deuxième étude démontre que Module X peut être utilisé pour concevoir des inhibiteurs pour une autre grande famille de récepteurs : les récepteurs couplés aux protéines G. La vasopressine joue un rôle important dans l’équilibre hydro-osmotique et un moindre rôle dans la vasomotricité. Six peptides ont été conçus à partir de régions juxta membranaires du récepteur de la vasopressine V2R. Le peptide le plus actif, VRQ397 (IC50 = 0,69 nM dans un modèle de vasorelaxation du crémastère), a démontré de la sélectivité fonctionnelle en inhibant la synthèse de prostacycline mais sans inhiber l’activation de la protéine Gs et la génération d’ AMP cyclique. Le peptide VRQ397 ne pouvait déplacer le ligand naturel AVP marqué radioactivement; de même VRQ397 radioactif ne se liait que sur V2R et non pas sur d’autres récepteurs de la même famille tel que V1R (récepteur de la vasopressine de type I). Ces études décrivent la caractérisation de petits peptides modulateurs de la signalisation de IL-1R et V2R et présentant des propriétés de modulateurs allostériques.
The Module X approach was conceived to generate small allosteric peptides that do not (by definition) compete with the natural ligand to inhibit or modulate signalling. Orthosteric inhibition blocks the entire signalling pathways while allosteric modulators will bind to another site on the target and show functional selectivity. By reproducing parts of the flexible regions (loops) of two receptors, the IL-1 and vasopressin receptors, we generated small peptides that showed allosteric properties. To prove our concept we started with a pro-inflammatory target: IL-1 receptor. Interleukin (IL)-1 is a major pro-inflammatory cytokine which interacts with the IL-1 receptor I (IL-1RI) complex, composed of IL-1RI and IL-1R accessory protein (IL-1RacP) subunits. Presently, there are no small antagonists of the IL-1RI complex. Given this void, we derived 15 peptides from loops of IL-1RacP, which are putative interactive sites with the IL-1RI subunit. Here we substantiate the merits of one of these peptides, rytvela (we termed, 101.10), as an inhibitor of IL-1R and describe its properties consistent with those of an allosteric negative modulator. 101.10 (IC50  1 nM) blocked human thymocyte proliferation in vitro, and demonstrated robust in vivo effects in models of hyperthermia and inflammatory bowel disease as well as topically in contact dermatitis, superior to corticosteroids and IL-1ra; 101.10 did not bind to IL-1RI deficient cells and was ineffective in vivo in IL-1RI knockout mice. Importantly, characterization of 101.10, revealed non-competitive antagonist actions and functional selectivity by blocking certain IL-1R pathways while not affecting others. The second study involved a representative of the biggest family of membrane proteins: G-protein coupled receptors. Vasopressin type 2 receptor (V2R) exhibits mostly important properties for hydro-osmotic equilibrium and to a lesser extent on vasomotricity. Drugs currently acting on this receptor are analogs of the natural neuropeptide, vasopressin (AVP), and hence are competitive ligands. Six peptides reproducing juxtamembranous regions of V2R were designed and screened; the most effective peptide, CRAVKY (labelled VRQ397), was characterized. VRQ397 was potent (IC50 = 0.69 ± 0.25 nM) and fully effective in inhibiting V2R-dependent physiological function (specifically DDAVP-induced cremasteric vasorelaxation; this physiological functional assay was utilized to avoid overlooking interference of specific signaling events). Dose-response profile revealed non-competitive property of VRQ397; correspondingly, VRQ397 bound specifically to V2R-expressing cells, could not displace its natural ligand, AVP, but modulated AVP binding kinetics (dissociation rate). VRQ397 exhibited pharmacological permissiveness on V2R-induced signals as it inhibited DDAVP-induced PGI2 generation, but not that of cAMP or recruitment of — arrestin2. Consistent with in vitro and ex vivo effects as a V2R antagonist, VRQ397 displayed anticipated in vivo aquaretic efficacy. Findings describe the discovery of potent and specific small (peptide) antagonists of IL-1RI and V2R with properties in line with an allosteric negative modulator.

Favorisant plusieurs altérations physiologiques et autres conditions telle l'instabilité génomique, l'inflammation chronique joue un rôle central de l'initiation jusqu'au développement du cancer. Cette condition requiert la contribution de plusieurs types cellulaires et de médiateurs inflammatoires telle que la protéine transductrice du signal et activatrice de la transcription 3 (STAT3). Cette dernière est un médiateur majeur dans l'induction et le maintien d'un microenvironnement tumoral inflammatoire. En effet, la phosphorylation de STAT3 est essentielle à la régulation et à la transcription de plusieurs facteurs de croissance et cytokines incluant la cyclooxygénase-2 (COX)-2 et l'interleukine-6 (IL6), mais par son rôle de transducteur, elle répond aussi à plusieurs stimuli tant endogènes qu'environnementaux. Une des voies les plus importantes à cet effet est celle de JAK/STAT3. Une boucle rétroactive d'activation de STAT3 alimente d'ailleurs les processus impliqués dans le développement tumoral comme la prolifération, l'anti-apoptose, l'angiogenèse et la métastase. Les objectifs de notre étude sont, dans un premier temps, d'évaluer les effets de 5 polyphénols connus pour leur propriété anti-angiogénique; la lutéoline (Lut), l'apigénine (Api), l'épigallocatéchine gallate (EGCG), la delphinidine (Dp) et l'acide éllagique (EA), sur différentes étapes de l'angiogenèse déclenchée par l'IL-6 et d'en déterminer le mécanisme d'action au niveau moléculaire. Dans un deuxième temps, nous avons évalué chez les cellules souches mésenchymateuses (MSC) ayant un phénotype pro-inflammatoire induit par la concanavaline A (ConA), l'implication de la métalloprotéinase membranaire matricielle de type-1 (MT1-MMP) dans l'activation de STAT3 et l'expression de COX-2. Les résultats ont montré principalement que la Lut et l'Api inhibent très significativement la prolifération, la migration et la tubulogenèse des cellules endothéliales (EC) induite par l'IL-6 via la voie JAK/STAT3. En deuxième lieu, chez les MSC, la MT1-MMP semble être un contributeur important dans le phénotype pro-inflammatoire et implique également la voie JAK/STAT3. De façon inattendue l'inactivation de STAT3 potentialise l'expression de COX-2. Étant donné que les MSC sont recrutées aux sites inflammatoires de plusieurs cancers, ces résultats confirment l'importance de la MT1-MMP dans la régulation de la signalisation intracellulaire pro-inflammatoire des MSC. L'action double de STAT3 régulé par la MT1-MMP, montre son rôle majeur comme contributeur dans l'équilibre de l'expression de COX-2. Ce mécanisme permettrait ainsi aux MSC de s'adapter au microenvironnement inflammatoire pro-tumoral. Connaissant la diversité des polyphénols d'origine alimentaire et leur potentiel anti-inflammatoire, anti-angiogénique et anticancéreux on a aussi montré dans le cadre de cette étude que le potentiel de l'activité anti -inflammatoire de la Lut et d'Api permet, en partie d'expliquer leur activité anti-angiogénique et anti-cancer. Ainsi, ces flavones pourraient non seulement servir de base de recherche d'agents thérapeutiques anti-angiogéniques minimisant la résistance aux agents chimiothérapeutiques, mais aussi mettre en lumière le rôle majeur de l'alimentation dans la prévention du cancer. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : STAT3, MT1-MMP, angiogenèse, inflammation, IL6, COX-2