Dissertations / Theses on the topic 'Indirizzo NEUROBIOLOGIA'

2011/2012
La comunicazione alternativa attraverso le BCIs può risultare uno strumento per agevolare le condizioni di vita di pazienti affetti dai disturbi neurologici. La comunicazione via BCI è ancora molto più lenta rispetto alla comunicazione con il linguaggio naturale. L’obiettivo di questo lavoro di tesi si inserisce in tale ambito, consistendo nello sviluppo di nuove applicazioni in grado di migliorare la velocità di comunicazione con utilizzo delle BCIs. Sono stati sviluppati due sistemi di comunicazione alternativa basati sulla componente P300. Il primo sistema chiamato ‘Multimenu’ permette una selezione veloce di messaggi e di comandi impostati in una struttura gerarchica. Il secondo sistema di tipo predittivo, denominato PolyMorph, grazie ad algoritmi appositamente sviluppati, predice i caratteri e/o le parole successivi a quelli già selezionati in precedenza.
XXV Ciclo
1980

2012/2013
Il Glioblastoma (GBM), nonostante i migliori standard terapeutici, rimane una patologia a prognosi infausta. L’ipotesi delle Glioma Stem-like Cells (GSCs) prevede che, nella massa tumorale, sia presente una popolazione di cellule resistenti alla chemio e radioterapia e che tali cellule siano quindi le possibili responsabili della recidiva di malattia. Le GSCs, che possiedono caratteristiche comuni alle cellule staminali fisiologicamente presenti nel cervello adulto, sono cellule a lenta crescita, capaci di self-renewal, esprimono marker di staminalità, sono multipotenti e sono tumorigeniche quando vengono impiantate in vivo in modelli murini, formando lesioni istologicamente identiche a quelle originarie. Il relativo fallimento delle terapie ad oggi in uso ha portato a studiare nuove strategie dirette verso le GSCs e non soltanto verso le cellule a rapida divisione. Le terapie con virus oncolitici rappresentano, in questi termini, un approccio promettente. L’Herpes Simplex Virus di tipo 1 (HSV-1) è uno dei vettori più studiati e, nelle sue forme mutate, risulta sicuro ed efficace in vitro e in vivo. Questo studio dimostra come G47!, forma multimutata dell’HSV-1, sia in grado di infettare, replicarsi e uccidere le GSCs derivanti da linee primarie di GBM in vitro e in vivo sia in normossia, che in ipossia, condizione che, oltre ad essere comune in questo tumore, arricchisce la popolazione cellulare con caratteristiche stem-like. In questo progetto si descrive inoltre una nuova forma mutata di G47! denominata G47!Us11fluc, in cui il virus esprime luciferasi come gene late del ciclo di replicazione virale, offrendo una stima precisa del virus yield, nonchè un metodo di visualizzazione in tempo reale, con sistemi a bioluminescenza, della replicazione virale in vivo.
XXVI Ciclo
1980

2012/2013
Lo studio delle connessioni anatomiche e funzionali del cervello risulta essere un passo essenziale per comprendere i meccanismi alla base del funzionamento cerebrale. Diverse tecniche di Neuroimmagini sono state sviluppate negli ultimi anni al fine di approfondire la conoscenza della connettività cerebrale umana in vivo. Il presente studio si articola in quattro differenti esperimenti condotti su gruppi di soggetti sani e non, per valutare la validità di differenti tecniche e della loro combinazione nella caratterizzazione della connettività anatomica e funzionale e delle alterazioni che essa subisce nell'ambito di differenti patologie.
XXVI Ciclo
1985

2012/2013
La malattia di Parkinson (PD) e quella di Alzheimer (AD) appartengono entrambe ad una famiglia di patologie neurologiche, caratterizzate da neurodegenerazione, i cui deficit funzionali (motori, sensitivi e psicologici) sono progressivi, e la cui insorgenza si presenta tipicamente dopo la quinta o la sesta decade di vita. Diversi studi ipotizzano che esse possano essere la diversa manifestazione di uno stesso processo disfunzionale, poichè presentano vari aspetti neuropatologici in comune. Ambedue infatti sono caratterizzate da una deplezione massiva dei sistemi neurotrasmettitoriali a proiezione diffusa (quali ad esempio il colinergico, il dopaminergico ed il noradrenergico) e dalla presenza, nei tessuti coinvolti, di aggregati di proteine con alterata conformazione in sede intra- od extracellulare. Inoltre, entrambe sono associate all’insorgenza di disturbi cognitivi ed allo sviluppo di demenza. Il lavoro di questa tesi è stato volto ad indagare alcuni aspetti che caratterizzano queste patologie, per approfondire in che modo la comparsa di determinate disfunzioni anatomiche e neurochimiche influenzi il processo patologico, ed in particolare determini lo sviluppo di deficit cognitivi. Nello specifico abbiamo indagato i contributi rispettivamente del sistema colinergico del prosencefalo di base, di quello dopaminergico mesocorticolimbico e del sistema noradrenergico ascendente, nella regolazione della reference e della working memory, usando il ratto come animale modello. Attraverso l’iniezione neonatale di due immunotossine (192-IgG-saporina e anti-DBH-saporina) e di una neurotossina (6-OHDA) in età adulta, abbiamo osservato le conseguenze funzionali ed anatomiche della deplezione, singola o combinata, dei corrispettivi sistemi neurali, tramite appropriati test comportamentali (quali il Morris Water Maze ed il Radial Arm Water Maze) e procedure istologiche ad hoc. Alla luce dei risultati ottenuti è emerso che il sistema noradrenergico svolge un ruolo importante nel regolare i processi ippocampo-dipendenti, interagendo con gli altri due sistemi e, ove necessario, compensando funzionalmente alla loro mancanza. Inoltre abbiamo indagato gli effetti derivanti dalla deplezione del sistema colinergico del prosencefalo di base con, o senza, l’aggiunta dell’infusione di beta-amiloide 25-35 pre-aggregata in ippocampo, sull’apprendimento e la memoria spaziale di ratti così trattati; e le conseguenze neurochimiche di questi trattamenti sui tessuti prelevati post-mortem, soprattutto per quanto riguarda le alterazioni del metabolismo delle proteine APP, TAU e TDP-43, indagate tramite tecniche istologiche specifiche ed analisi con Western Blot. In questo modo è stato visto che c’è un’interazione sinergica tra l’ipofunzione colinergica e l’infusione di beta-amiloide esogena pre-aggregata nel determinare deficit cognitivi, sia nella reference che nella working memory; e che la deplezione colinergica riesce di per sè sia ad incrementare la fosforilazione della proteina Tau, e quindi di provocarne il distacco dai microtubuli e favorirne l’aggregazione a livello del soma cellulare, che sia a provocare delle alterazioni nel metabolismo della proteina TDP-43, che rispetto ad animali di controllo risulta sovraespressa e localizzata anche a livello del citoplasma. Mentre l’influenza dell’aggregazione della beta-amiloide in questi processi appare marginale o comunque avere una comparsa più tardiva. Il lavoro svolto propone quindi di considerare delle terapie farmacologiche e ristorative che hanno come target il sistema noradrenergico per la cura dei disturbi cognitivi che accomunano la malattia di Alzheimer e quella di Parkinson; e di approfondire maggiormente l’interazione che lega il sistema colinergico alla TDP-43, perchè potrebbe essere importante per capire i meccanismi che conducono alla comparsa di neurodegenerazione e di demenza.
XXVI Ciclo
1984

2011/2012
During the development of spinal cord, the maturation of neuronal circuits is a complex process, involving genetic and epigenetic mechanisms cooperating for the maturation of motor control (Jessell, 2000; Kiehn, 2006). Variations in the concentration of intracellular Ca2+ are crucial signals in this process of maturation; in fact, Ca2+ signals may lead to the emergence of specific neuronal phenotypes or guide the formation of cellular connectivity. The organotypic cultures of embryonic mouse spinal cord represent an ideal experimental approach to study the maturation and physiology of the individual neurons and spinal networks. In fact, this experimental model reproduces in vitro the heterogeneous populations of cells, the three dimensional connections between these cells and the basic cytoarchitecture of the spinal cord observed in in vivo development (Avossa et al., 2003). In this experimental model, three different types of Ca2+ activity have been identified and characterized: waves, bursts and oscillations (Fabbro et al., 2007; Sibilla et al., 2009). These Ca2+ signals are all generated by ventral interneurons, but each of them shows a specific pattern of expression during development and has different underlying mechanisms. In this thesis, I focused my attention on the most peculiar of these Ca2+ signals: the electrical activity-independent Ca2+ oscillations. The main aim of my thesis was to better clarify the mechanisms underlying the generation and role of Ca2+ oscillations in spinal neurons, by investigating the effects of pharmacological manipulation of intracellular Ca2+ buffering on Ca2+ oscillations behavior, neuronal biophysical properties and neuronal network activity in organotypic spinal cultures. To this aim, I treated spinal cord slices with two different intracellular Ca2+ buffers, BAPTA-AM and EGTA-AM, and I monitored their impact using both Ca2+-imaging and single cell patch-clamp techniques. Initially, I investigated the effects on Ca2+ oscillations induced by both chronic and acute treatment with BAPTA-AM. For the first time I described a change in the activity of oscillating neurons. In particular, after chronic incubation with BAPTA-AM, I reported a significant increase in the number of neurons recruited to generate Ca2+ oscillations, which was accompanied by a modulation of oscillations kinetic. Ca2+ oscillations recorded after chronic incubation with BAPTA-AM maintained their peculiar features (Fabbro et al., 2007; Sibilla et al., 2009), in particular their Ca2+-dependence, thus supporting the idea that the BAPTA-induced oscillations represent an amplification of the true oscillations phenomena, amplified by a prolonged intracellular Ca2+ buffering. Despite a potentiating effect of chronic BAPTA-AM treatment on Ca2+ oscillations, its acute application completely blocked Ca2+ oscillations in all neurons. The next step was to verify whether the observed effects could be related to changes in the biophysical properties of neurons or in neuronal network electrical activity. By patch clamp experiments I showed that the chronic BAPTA-AM treatment induces a significant enhancement in the frequency of heterogeneous (GABA-glycine and AMPA mediated) spontaneous post-synaptic currents (PSCs) when compared to untreated cultures. Neuronal membrane capacitance and input resistance were comparable to those of control neurons, thus confirming neuronal health. As the reported results pointed to an increased excitability at the level of single neuron, I analyzed the impact of BAPTA treatment on the functional expression of a family of channels extremely important in the regulation of neuronal excitability: voltage-gated K+ channels. I observed the presence of a significant increase in the amplitude of K+ currents (IK) in slices chronically treated with BAPTA-AM. To analyze the type of IK involved I separated the different IK components (Ca2+-dependent -IK(Ca)- , transient -IK(A)- and delayed-rectifier -IK(DR)-), demonstrating that, in BAPTA-AM treated cultures, the IK(Ca) and IK(A) components were similar to control cultures. Conversely, I found a potentiation of IK(DR), i.e. an increase in its maximal current amplitude. Furthermore, I found that acute application of BAPTA-AM partially reduces the magnitude of total IK. Action potentials are other critical players reflecting neuronal excitability. Chronic BAPTA-AM treatment did not affect action potential kinetic; however, I found that BAPTA-treated neurons show a different distribution profile of excitability, with a widening of the population of ventral spinal interneurons displaying a tonic firing pattern and a decrease in the one showing an adapting firing behavior. To explore the specificity of BAPTA-AM effects I employed another intracellular Ca2+ chelator: EGTA-AM. I reported, as a consequence of a chronic EGTA-AM treatment of spinal neurons, an increase in the population of oscillating neurons (similarly to BAPTA treatment), but, without changes in oscillations kinetic. However, the study of synaptic activity in EGTA-AM treated slices did not reveal any change in the frequency or kinetic of spontaneous or miniature PSCs. Interestingly, in contrast to BAPTA treatment, EGTA-AM had no effect on IK. Overall, the results reported in this thesis show, on one hand, a specific effect of BAPTA-AM on K+; most importantly, on the other hand, they support the needing of a correct intracellular Ca2+ homeostasis for the genesis of Ca2+ oscillations and indicate the presence of a homeostatic adaptation as a rebound effect of chronic manipulation of intracellular Ca2+.
XXV Ciclo
1982

2012/2013
Col termine generale di “plasticità sinaptica” si intendono tutti i meccanismi che stanno alla base della capacità del sistema nervoso di plasmarsi a seguito della sua maturazione e a fronte di stimoli esterni. Variazioni nella forma e nelle dimensioni oltre che l’instaurazione di nuove sinapsi o l’eliminazione di altre (sinaptogenesi) sono i meccanismi che regolano la plasticità sinaptica. Il sistema nervoso centrale è in grado di mettere in atto fenomeni di plasticità sinaptica in grado di modificarne la struttura e la funzionalità sia a corto che a lungo termine. Uno dei più studiati meccanismi cellulari alla base della memoria e dell’apprendimento è il potenziamento a lungo termine (Long Term Potentiation – LTP), una forma di plasticità neuronale che porta a un incremento dell’efficienza della trasmissione sinaptica durevole nel tempo. A livello cellulare, l’LTP aumenta la capacità di due neuroni di comunicare attraverso le sinapsi. Il meccanismo molecolare alla base di tale aumento dell’efficienza della trasmissione sinaptica non è univocamente stabilito, questo in parte è dovuto al fatto che l’LTP è determinato da diversi meccanismi che variano in base alla specie e alla regione del cervello in cui viene indotto. Una volta innescato, l’LTP conduce a varie modificazioni postsinaptiche, tra cui sintesi di nuovi recettori, nascita di nuove sinapsi (in particolare a livello del recettore glutamatergico NMDA) e cambiamenti a livello delle spine dendritiche (Engert and Bonhoeffer, 1999). Ragionevolmente, per indurre potenziamento a lungo termine è necessario che la membrana postsinaptica sia depolarizzata nell’intervallo di tempo in cui il terminale presinaptico libera glutammato: la depolarizzazione rimuove il blocco degli ioni magnesio dai recettori NMDA consentendo il passaggio (oltre al sodio e al potassio) anche agli ioni calcio. Il calcio è l'elemento centrale del processo perché, una volta raggiunta una certa concentrazione nella cellula, è in grado di attivare un processo per cui i recettori AMPA presenti nella cellula vengono trasferiti sulla membrana e i recettori già presenti lasciano passare una maggiore quantità di ioni. La sinapsi risulta così rinforzata. Questa condizione è stata sperimentalmente dimostrata su campioni di fettine di ippocampo usando una stimolazione elettrica (tetanica) (Nishi et al., 2001). Dopo la stimolazione tetanica, il neurone bersaglio rafforzato dall’LTP è molto più responsivo e produce un aumento dell’ampiezza delle correnti eccitatorie post-sinaptiche (Excitatory Post Synaptic Currents – EPSC) che perdura nel tempo. Questo comportamento trova spiegazione in una modificazione delle spine dendritiche sia nella forma, sia nel numero e dimensione. L’attività del mio dottorato di ricerca è stata condotta nell’ambito del progetto NanoMosquito, il cui scopo prinicipale consiste nell’indurre fenomeni di plasticità neuronale in cellule dissociate d’ippocampo di ratto e, successivamente, nel caratterizzare le mutazioni funzionali (tramite la tecnica elettrofisiologica del patch-clamping) e morfologiche, in scala micro e nanometrica, utilizzando tecniche quali la microscopia confocale e la microscopia a forza atomica (Atomic Force Microscopy – AFM). Diverse stimolazioni sono state testate per carcare di capire quali potessero indurre potenziamento della rete. Studi di plasticità vengono condotti in genere su fettine organotipiche, ma queste rendono impossibile studiare i cambiamenti che avvengono a livello delle spine dendritiche con tecniche in scala nanometrica, quali l’AFM. Diversi protocolli di stimolazione (treni a bassa frequenza, theta burst) sono stati utilizzati in esperimenti a doppio patch (due elettrodi usati in simultanea) su due cellule neuronali vicinali. Questo tipo di stimolazione ha portato però solo a un numero limitato di sinapsi potenziate e per questo motive abbiamo deciso di uitlizzare una particolare forma di plasticità sinaptica che prende il nome di Spike-Timing Dependent Plasticity (STDP). In questo tipo di plasticità il preciso ordine temporale tra i potenziali d’azione presinaptici e postsinaptici determina i cambiamenti che avverrano a livello della sinapsi stessa; per ottenere un potenziamento a livello del contatto sinaptico, il potenziale d’azione a livello postsinaptico deve seguire la depolarizzazione a livello presinaptico in una finestra temporale che va dai 5 ai 20 millisecondi (Bi and Poo, 1998). Anche in questo caso, monitorando successivamente l’ampiezza delle EPSCs, solo poche sinpasi andavano incontro a plasticità e il meccanismo che sta alla base di questo deve essere ancora determinato. Al contrario, il Brain Derived Neurotrophic Factor (BDNF), membro della famiglia delle neurotrofine e abbondantemente espresso nel sistema nervoso centrale (SNC), sta emergendo come un importante mediatore nella sopravvivenza, sviluppo e funzione dei neuroni (Lu, 2003). Colture embrionali dissociate di ippocampo sono state per la prima volta trattate cronicamente con BDNF promuovendo la formazione di nuove sinapsi, sia a livello eccitatorio che inibitorio, con conseguente aumento dell’attività spontanea dell’intera rete. Il BDNF inoltre si pensa induca modificazioni morfologiche sia nella complessità dell’albero dendritico che nel promuovere la crescita delle terminazioni assonali (Vicario-Abejon et al., 1998). Registrazioni elettrofisiologiche sono state effettuate per monitare l’attività spontanea della rete: nel dettaglio sono state misurate le EPSC e le IPSC tra neuroni incubati in BDNF e campioni di controllo mentre registrazioni doppie sono state effettuate per confrontare la percentuale di accoppiamento. Abbiamo così visto come il BDNF rafforzi l’attività sinaptica della rete e aumenti il numero di connessioni sinaptiche eccitatorie. Registrazioni paired-pulse ed esperimenti di imaging con FM1-43 hanno invece dimostrato come il BDNF induca anche delle modificazioni nella probabilità di rilascio vescicolare, in quanto, anche in questo caso l’ampiezza della risposta risulta aumentata nelle colture incubate. Marcando i neruoni (β-tubulin III) abbiamo visto anche come il BDNF aumenti la sopravvivenza neuronale, sopratutto a carico delle cellule piramidali, riconosciute dalla loro forma. Inoltre, eseprimenti condottti su cellule transfettate con cds-BDNF hanno confermato ulteriormente i nostril dati su come il BDNF aumenti la trasmissione sinpatica. La caratteristica comune di tutti questi diversi approcci è stata quella di indurre modifiche funzionali nelle connessioni sinaptiche eccitatorie. Successivamente l'induzione della plasticità sinaptica, la microscopia a scansione sarà utilizzata per seguire in tempo reale i cambiamenti morfologici delle sinapsi.
The brain is programmed to drive behaviour by exactly wiring the appropriate neuronal circuits. Wiring and rewiring of neuronal circuits widely depends on the orchestrated changes in the strengths of synaptic contacts. For many years, neuroscientists believed that neurogenesis - the generation of new neurons – and establishment of new neuronal connections was restricted to early brain development (Segal et al, 2005). New findings have challenged this view and currently many neuroscientists believe that the capacity for circuitry rearrangement is maintained throughout life. However the mechanisms that controls plasticity in the adult brain are still not entirely clear. The connection between neurons is named synapse. The synapse is the most fundamental unit of information transmission in the nervous system. Information storage, including all forms of memory and behavioural adaptation, are believed to come out from changes in neuronal transmission, both in the short-term and the long-term, a property known as synaptic plasticity. Synaptic plasticity is a highly regulated process, refers to all the mechanisms that underlie the ability of the nervous system to adapt to external stimuli. Variations in the shape and size as well as establishment of new synapses or the elimination of others (synaptogenesis) are the mechanisms that regulate synaptic plasticity. Thus, understanding the mechanisms underlying synaptic plasticity may help to apprehend general learning and memory processes. Changes in synaptic plasticity are achieved by changes in inhibitory or excitatory neurotransmission or both. This thesis deals with the modulation of excitatory neurotransmission. The principal excitatory neurotransmitter in the brain is glutamate. The regulation of glutamate-mediated excitatory neurotransmission has been shown to play a critical role in many aspects of synaptic plasticity. One of the most studied cellular mechanisms is the long-term potentiation (LTP), a form of synaptic plasticity that leads to an increase in the efficiency of synaptic transmission (Engert et al., 1999). The induction of LTP is classically achieved by tetanic stimulation but it is also possible to induce chemically a long-term potentiation of the synaptic efficacy, thus enhancing a larger number of synapses compared to electrical stimulation. The work of this thesis has been conducted in the wider framework of the NanoMosquito project, whose major aim was to combine electrophysiological measurements, scanning probe microscopy (AFM-Atomic Force Microscopy) and fluorescence microscopy in order to develop new generation neurophysiological tool to understand neuronal plasticity at the nanoscale. Studies of synaptic plasticity are often carried out in slices of hippocampus, but these prevent to study change in nanoscale with a surface-microscopy technique such is AFM: dissociated hippocampal neurons lend themselves well for this purpose. Understanding in detail the mechanism of action of these processes may be of critical importance not only for a detailed view of memory related processes but also in the case of some diseases: being able to control synaptic plasticity may help to restore a functional connectivity lost, for example, in the case of brain lesions. The first part of this thesis handles the setting of an electrophysiological stimulation to induce neuronal plasticity, starting from the stimulations trains usually performed in hippocampal slices, such as slow frequency stimulation and theta burst. Long-term synaptic modifications can be induced also by a particular form of synaptic plasticity named Spike-Timing Dependent Plasticity (STDP) where the precise timing and the order of presynaptic and postsynaptic action potentials determine the magnitude and the direction of the changes in synaptic strength (Bi and Poo, 1998). I have tested trains of with a delay of 5, 10 and 20 milliseconds between pre- and postsynaptic neuron. By monitoring the amplitude and frequency of the EPSCs, responses varied from no changes to potentiation but just in a small sample of coupled neurons where we measured a strong increase in the amplitude and frequency of spontaneous EPSCs after the stimulation. The cellular basis that gives rise to the induction of such synaptic modifications remains to be determined. On the other hand, BDNF ability to mediate activity-dependent modifications in synaptic strength (Bolton et al., 2000; Vicario-Abejón et al., 1998) has recently received considerable attention; in particular the acute BDNF effects on excitatory synapses have been the object of an increasing amount of studies. On the contrary, the role of BDNF in regulating long-lasting changes in synaptic function is comparably less investigated and may have large impact on post injury alteration of synaptic networks and neuronal rescue. To address this issue, during my PhD, I studied the long-term (chronic) effects of BDNF on AMPA receptor mediated excitatory synaptic transmission and on neuronal survival in vitro. Dissociated rat (P2-P3) hippocampal cultures were chronically treated (4 days) with BDNF between 4 and 8 days in vitro (DIV). Single and dual patch-clamp recordings in whole-cell configuration were used to monitor spontaneous and evoked post synaptic currents (IPSCs and EPSCs) in hippocampal network grown in culture for 8-10 DIV. Excitatory PSCs (EPSC) were identified by their kinetic (fast decay τ) and pharmacology (CNQX sensitivity). EPSCs recorded from BDNF-treated cultures show a strong increase in their mean frequency and amplitude when compared to controls untreated sister cultures. In the presence of TTX, miniature excitatory PSCs (mEPSCs) in BDNF treated networks still displayed an increase in both frequency and amplitude. In BDNF-treated cultures pair recordings showed an increased probability of finding coupled pairs. Paired pulse (20 Hz) experiments and FM1-43 fluorescence imaging suggested that BDNF treatment increased the probability of release. Immunofluorescence (β-tubulin III) visualization of neurons allowed to quantify neuronal density and showed that BDNF mediated an increase (40%) in neuronal survival, when compared to controls, together with an increase in the pyramidal neuron/interneuron ratio (0.33 for BDNF, 0.19 for controls). Additionally, neuronal cells were transfected with different BDNF-GFP expressing vectors to gain insights in the specific molecular mechanisms involved in long term BDNF effects on synapses. However the common feature of all these functional modifications is in the direction of a pronounced potentiation of excitatory synaptic connections. Subsequently to the induction of synaptic plasticity, scanning probe microscopy would be used to follow in real time morphological changes of synapses undergoing potentiation or neuronal processes development with submicrometrical resolution in all 3 dimensions. Final goal of the entire project, whereof this thesis is the fundamental initial step, will be the development of new paradigms to evaluate and induce synaptic plasticity on specific synapses to govern in a controlled way neuronal outgrowth and synaptogenesis.
XXVI Ciclo
1985

2013/2014
It is well established that in healthy brain, the interplay between neurons and glia play a very important role in the maintenance of a correct physiological activity. Recent studies have shown the existence of an active involvement of glia in both the formation and function of the synapse (Araque et al. 1999; Parpura et al. 2012). These findings have led to reconsider the role of glia also in the case of pathological situations. Indeed, beyond its fundamental implication in healthy brain, glia has been found to play a critical role in several neurological disorders. It is now clear (Nguyen at al. 2012, Maezawa and Jin, 2010) that glial cells are involved not only in neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease (Angelova PR at al. 2014), but also in diseases characterized by intellectual disability. In this regard, recent evidence has shown the involvement of glial cells in Rett Syndrome (Ballas et al., 2009, Maezawa et al., 2009, Derecki et al., 2012 Okabe 2012). The purpose of my thesis is to investigate the role of different populations of astrocytes in the development and survival of neurons using in vitro models of both neurodegenerative and neurodevelopmental disorders. To this aim, in the first part of my project I participated in the setting up of a microfluidic system, an experimental model aim at studying the interconnections between different brain cells, focusing my attention on the contribution of glial cells derived from different brain areas in these pathological states. Secondly, through the use of the microfluidic system, we have shown that astrocytes derived from distinct brain areas have different effects on neurons if exposed to several harmful stimuli. Specifically I have evaluated both the development and viability of hippocampal neurons co-cultured with either cortical or hippocampal astrocytes in a neuroinflammatory context represented by the stimulation of beta amyloid peptide (Aß) together with several proinflammatory cytokines. Taking advantage of the microfluidic system, we showed that hippocampal and cortical astrocytes exposed to these stimuli were able to significantly increase neuronal cell death. Interestingly, hippocampal astrocytes induced an elevated neuronal cell death if compared to cortical astrocytes. (Bianco F, N Tonna, Lovchik RD, Mastrangelo R, Morini R, Ruiz A, E Delamarche, Matteoli M. Anal. Chem. 2012). To assess whether neuronal death was due to soluble factors released by astrocytes, we monitored the neuronal calcium responsiveness upon the exposure of astrocytes to Aß and IL 1ß. We found that both cortical and hippocampal astrocytes elicited a specific calcium transient in neurons upon stimulation, however, the calcium transients were higher in neurons exposed to stimulated hippocampal rather than cortical astrocytes. Such calcium transient were blocked by the specific NMDA receptor antagonist APV, thus highlighting that the calciumtransients were mediated by the activation of these receptors following the release of astrocytic glutamate. More importantly, hippocampal astrocytes exposed to neuroinflammatory environment induced higher cell death and neuronal calcium transient compared to cortical astrocytes (Bianco F, N Tonna, Lovchik RD, Mastrangelo R, Morini R, Ruiz A, E Delamarche, Matteoli M. Anal. Chem. 2012) We also used the microfluidic system to perform a pharmacological study in an experimental model of Alzheimer's disease. In particular, we evaluated the effectiveness of the drug FTY720 (Fingolimod, normally used for the treatment of multiple sclerosis) to prevent cell death in neurons cultured alone or co-cultured with microglia upon the stimulation with either fibrillar or oligomeric Aß form. The results showed that the drug prevented cell death in neurons exposed to Aß oligomers, both in the presence and absence of microglia. (Ruiz A, Joshi P, R Mastrangelo, Francolini M, Verderio C, Matteoli M Lab Chip. 2014). In the second part of my PhD thesis, I have focused my attention on the role of different populations of astrocytes in supporting neuronal development in a model of Rett Syndrome. Observations made by Prof. Tongiorgi's lab, showed a different neuronal atrophy at the level of cortex and hippocampus in mouse model of Rett Syndrome, thus prompting us to investigate the effects of glial cells derived from these two different brain areas on neurons. Neurons were grown in conditioned medium obtained from hippocampal or cortical astrocytes established from WT or KO mouse, and the growth in terms of neurites length was evaluated. The morphological analysis showed that neurons grown in conditioned medium derived from hippocampal astrocytes displayed longer neuritic processes than those grown in cortical astrocytes-derived medium. In contrast, the growth of hippocampal neurons in conditioned medium from wt cortical astrocytes, hippocampal and cortical astrocytes Rett not significantly different compared to neurons cultured alone. This suggests that hippocampal astrocytes have a higher trophic effect on neuronal development than cortical astrocytes. In light of these results, we can assume that the atrophy observed in cortical region of Rett Syndrome mouse model may be due to a lower trophic capability of cortical astrocytes compared to hippocampal in supporting neuronal development. Taken together these data suggest that astrocytic populations belonging to distinct brain areas have different capability in supporting neuronal growth, thus opening the possibility that region-specific atrophy observed in RETT mouse model may stem from a different release of trophic factors from glial cells.
XXVII Ciclo
1984

2010/2011
Esistono più di 50 diverse patologie neurologiche che hanno una confermata o sospetta eziologia autoimmune e che si stima colpiscano 75 milioni di persone nel mondo. Sebbene negli ultimi anni sia cresciuto l’interesse per i meccanismi immunopatologici anticorpo-mediati, le evidenze di un ruolo primario degli autoanticorpi nella patogenesi delle malattie autoimmuni del SNC sono ancora poche. La maggior parte di queste patologie è rara e per molte di esse non esiste un metodo di diagnosi in quanto l’antigene (o gli antigeni) bersaglio della risposta autoimmune sono sconosciuti. A tale scopo risulta fondamentale il supporto di un test diagnostico che aiuti ad identificare la presenza di tali anticorpi nel siero dei pazienti. Lo scopo del mio progetto di Dottorato è stato la messa a punto di un metodo di identificazione di anticorpi anti-neurali caratteristici di diverse patologie che utilizza l’immunoistochimica su sezioni di cervello di ratto. Questo metodo è stato quindi testato per la rilevazione di autoanticorpi antineurali in particolare in 4 gruppi di patologie neurologiche: le sindromi Paraneoplastiche, la Neuromielite Ottica, le Neuropatie periferiche e Sclerosi Laterale Amiotofica (SLA). La ricerca di questa tesi di dottorato si è sviluppata seguendo tre obbiettivi specifici: 1. Creare un metodo di controllo qualità per il saggio di analisi immunoistochimica TABA e valutare la sua validità diagnostica. 2. Sviluppare un test che permetta l’analisi della reattività dei sieri di pazienti che presentano neuropatie non ancora classificate perché ad antigene ignoto. 3. Testare con la metodica TABA di immunoistochimica semi-quantitativa su sezioni di cervello di ratto sieri di pazienti affetti da SLA al fine di individuare un disegno di marcatura specifico. Il metodo utilizzato riguarda lo screening di anticorpi anti sistema nervoso basato su un’analisi immunoistochimica (IHC) semi quantitativa (metodo TABA) su sezioni di cervello di ratto al fine di descrivere e quantificare la reattività contro particolari regioni del cervello (Boscolo et al. 2007) e di discriminare le specifiche marcature associate alle differenti neuropatologie. L’innovazione di questa ricerca è stato quello di creare un metodo di controllo qualità per il saggio di analisi immunoistochimica mediante l’ideazione di un protocollo standard che si avvale dell’utilizzo di un controllo positivo (siero a reattività nota), la cui stabilità viene monitorata nel tempo tramite l’utilizzo di un algoritmo statistico. E’ stato scelto all’interno della sieroteca presente in laboratorio, un siero fortemente positivo all’analisi TABA e sono state marcate 80 sezioni di cervello con questo anticorpo. E’ stata quindi eseguita la densitometrie su 3 aree cerebrali: il midollo allungato, il V° strato della corteccia e le cellule del Purkinjie. Quindi è stato possibile definire un intervallo di confidenza densitometrico per standardizzare l’uso dell’ IHC, da utlizzare come protocollo di controllo qualità. L’identificazione di un metodo di controllo qualità per l’analisi immunoistochimica rappresenta un grande passo avanti nella diagnostica di laboratorio in quanto permette la standardizazzione di un metodo da molti sottovalutato ma indispensabile nell’identificare la reattività di un siero verso antigeni ignoti, nel caso in cui i kit attualmente in uso non ne identifichino l’antigene. Infine, grazie al confronto tra la diagnosi basata sul metodo TABA e i kit diagnostici è stato possibile valutare i parametri qualitativi del metodo TABA in termini di predittività e specificità. La seconda parte di questo lavoro è focalizzata allo sviluppo di un test che permetta l’analisi della reattività dei sieri di pazienti che presentano neuropatie non ancora classificate perché ad antigene ignoto. Attualmente in commercio esistono kit diagnostici per l’individuazione degli antigeni target delle neuropatie periferiche, tuttavia il numero di neuropatie autoimmuni non identificate è ancora alto. Pertanto abbiamo deciso di sfruttare la tecnica dell’IHC su nervo sciatico di ratto per individuare la presenza di un’autoimmunità nel caso in cui i kit commerciali risultino negativi. Questo studio prevede l’analisi di 25 sieri di pazienti affetti da neuropatie e il successivo confronto tra i vari protocolli al fine di individuare un metodo per l’analisi immunoistochimica su nervo sciatico di ratto utilizzando anticorpi secondari specifici anti IgG ed IgM umane. E’ stato effettuato quindi uno studio in relazione ai diversi disegni di marcatura delle sezioni, al fine di trovare una correlazione tra la patologia e il pattern di marcatura (sugli assoni, sull’endonevrio ed un pattern misto). I risultati ottenuti con questo nuovo approccio “home made” sono stati in seguito paragonati con quelli riscontrati utilizzando un kit diagnostco commerciale Euroimmun Italia. Tuttavia, la metodica di IHC non è risultata in nessun caso idonea per la rilevazione di autoanticorpi IgG o IgM nelle neuropatie periferiche. Paralellamente è stato svolto uno studio riguardante un gruppo di pazienti afferri da sclerosi laterale amiotrofica (SLA), per cui vi sono evidenze di una possibile componente autoimmune (Pagani et al. 2006). Sono stati analizzati 14 sieri di pazienti con confermata diagnosi di SLA e 9 sono risultati positivi all’esame immunoistochmico TABA per le IgG di cui 2 erano positivi kit per autoanticorpi paraneoplastici. Pertanto in 7 pazienti, si è riscontrata una reazione anti-neurale non spiegata da anticorpi noti. E’ stato possibile inoltre identificare un pattern di marcatura comune nei sieri affetti da SLA che corrisponde ad una marcatura del nucleolo (Parker et al. 2009). Quattro di questi sieri sono risultati positivi per l’antigene Ro52 con il metodo line blot. Questi risultati supportano l’ipotesi autoimmune nella SLA e confermano l’uso della IHC con il metodo TABA come con importante strumento di diagnosi e di ricerca di nuovi autoanticorpi.
XXIV Ciclo
1983

2010/2011
Glioblastoma (GBM) is the most common and malignant primary brain tumour. GBM prognosis remains dismal despite available treatments, be- cause of tumour recurrence. According to the "Glioma Stem-like Cell" (GSC) hypothesis, GBM recurrence is sustained by a fraction of cells that share similarities with normal Neural Stem Cells / Neural Precursors (NSCs). In potential agreement with this possibility, primary cell cultures with characteristics of GSCs can be established from GBM. These cells display typical hallmarks of NSCs, namely unlimited self-renewal and ability to differentiate into different neural lineages in vitro. Most importantly, GSCs are highly tumorigenic when transplanted intracranially in vivo and their in vitro self-renewal potential correlates positively with tumorigenicity and negatively with prognosis in Glioma patients. We hypothesize that the tumour-forming potential of GSCs may result from the deregulation of molecular mechanisms normally involved in NSC self-renewal, proliferation and/or differentiation. In this regard, the fork-head transcription factor, FOXG1, promotes the self-renewal of both embryonic and adult NSCs. Here we show that FOXG1 mRNA and protein are up-regulated in human Gliomas and that elevated FOXG1 expression is a bad prognostic factor in GBM patients. We show further that FOXG1 is expressed in a sub-population of GBM cells with NSC-like characteristics, as well as in cultured GSCs. More importantly, knockdown of FOXG1 significantly decreases GSC self-renewal, with a concomitant increase of the cell-cycle inhibitor, p21Cip1. We also show that FOXG1 is co-expressed in GBM and GSCs with the transcriptional co-repressor TLE, a protein known to work together with FOXG1 during forebrain development. The effect of FOXG1 knockdown on GSC self-renewal is phenocopied by TLE knockdown, as well as by the forced over-expression of the previously characterized TLE:FOXG1 antagonist, GRG6, a protein with little or no expression in GBM. More importantly, mouse orthotopic implantations of human GSCs, which were either silenced for FOXG1 or over-expressing GRG6, gave rise to smaller tumours when compared to control condition; this tumor size reduction resulted in prolonged mice survival. Together, these results suggest that FOXG1 and TLE are important regulators of GBM tumorigenesis.
XXIV Ciclo
1977

2011/2012
Regenerative medicine is a broad interdisciplinary field, tremendously grown in the last decades, which encompasses several different research areas, such as biomaterial sciences and tissue engineering, whose unifying concept holds an enormous therapeutic potential, being that of restoring impaired organs or tissue functions, resulting from congenital defects, trauma or disease (Greenwood et al.; 2006; Mason and Dunnill, 2008). The main challenge faced by tissue engineering is the need to have a renewable source of cells and biomaterials possessing the right mechanical, chemical and biological features, to create constructs resembling native tissues. The design of scaffolds able to support and promote tissue regeneration and/or functional restore, in particular, is a critical step for the success of an implant, as it should recapitulate the complex architecture of the physiological microenvironment, e.g. the appropriate extracellular matrix, which has been shown to actively direct the behaviour of cells, through both chemical and physical cues (Daley et al., 2008; Place et al., 2009; Rozario and DeSimone, 2010). In this context, nanotechnology tools may greatly enhance the success of tissue engineering strategies, by providing the chance of producing surfaces and materials with topographical features that mimic the natural ones, in addition to the possibility to functionalize nanomaterials with bioactive molecules (Gelain et al., 2008; Zhang and Webster , 2009; Dvir et al., 2011; Koh et al., 2008). Among nanomaterials, carbon nanotubes (CNTs) stood out, since their discovery, for their outstanding mechanical, electrical and thermal properties, like their extraordinary strength coupled with remarkable flexibility, or their high electrical conductivity, which make them a well-suited platform technology for biomedical applications. Recently, several works have been published, which support the use of CNT-based scaffolds to promote neuronal attachment, differentiation and growth (Mattson et al., 2000; Hu et al., 2004; Hu et al., 2005; Galvan-Garcia et al., 2007). Moreover, in the last decade, our group showed that CNT/neuronal hybrid networks show a boost in synaptic transmission (Lovat et al., 2005; Mazzatenta et al., 2007) and that the direct contact established between single CNT and neuronal membranes affect single neuron integrative abilities (Cellot et al., 2009), besides promoting network connectivity and synaptic plasticity phenomena in cortical cultured circuits (Cellot et al., 2011). Here, to extend our knowledge about interactions between CNT and neurons, we long-term cultured organotypic spinal explants, possessing a complex multilayered cytoarchitecture, with highly purified MWCNT scaffolds and then investigated, via a multidisciplinary approach, their growth and synaptic activity. Our aim was to verify whether and how a CNT-induced effect on neuronal performance could be transferred to network locations, which are far from the neuronal/MWCNT layer of interaction, but sinaptically communicating with it. We documented, via TEM investigations, the presence of tight connections established between the neuronal membranes of neurons belonging to the bottom layer of the spinal tissue and the CNT meshwork underlying it. By means of confocal microscopy, SEM and AFM techniques, we showed, for the first time, that the long-term interfacing of spinal cord explants to CNTs induced an increase in the number and length of peripheral neuronal fibres outgrowing the spinal tissue, associated to changes in growth cone activity and in fibre elastomechanical features. We also demonstrated, via patch-clamp recordings performed from interneurons in the ventral (premotor) area of the explants, that both spontaneous and evoked synaptic currents displayed a potentiation in the presence of the CNT scaffold, detected as an increase in current amplitude in neurons which were as far as 5 cell layers from the tissue/substrate site of interaction. We speculate that these two effects (the increased fibres growth and the boosting in synaptic activity) rely upon two different mechanisms, a direct and a remote one, by which CNTs affect the spinal tissue development. Indeed, the first exerted on fibres directly adhering to the CNT substrate, while the second is likely to be mediated by alterations occurring at the tissue layer integrated with CNTs, which are transmitted, through a remote effect, to distant network locations, synaptically communicating with such a layer. These results support the hypothesis that CNTs may be employed to boost spinal neurite re-growth and functional spinal performance, in the perspective of re-establishing the physical and functional communication between disconnected spinal segments, We therefore decided to implement a model in which two organotypic spinal explants grow together on the same support, as a useful model for neuronal reconnection investigations and to test the possibility that a CNT-based scaffold, interposed between the two explants, may act as a bridge to promote the physical and electrical communication between the two spinal segments. By means of immunostaining experiments and confocal microscopy we reported the presence of a huge amount of fibres, projecting from the two spinal slices and integrating in a complex network, especially localized in the DRG regions, while very few fibres seemed to directly connect the two explanted tissues at the level of the explants cores. When, via voltage-clamp pair recordings, we looked for the presence of an electrical reconnection between explants, we found a small percentage of co-cultured explants displaying a complex coupled behaviour, detected as a strongly correlated bursting activity. These preliminary data seem to confirm the goodness of such an in vitro model to investigate the intrinsic reparative potential of spinal cord tissue and to improve such ability via nanotechnological tools.
XXV Ciclo
1982

2012/2013
RIASSUNTO La syndrome di Rett (RTT) è una patologia dello sviluppo neuronale postnatale causata dalle mutazioni del gene MeCP2, situato nel cromosoma X, codificante per la Methyl CpG binding protein 2, un modulatore della trascrizione. La forma classica si manifesta in 1:10,000 bambine ed è caratterizzata da una progressiva regressione generale fisica e mentale, in seguito ad un normale sviluppo nei primi 2 anni di vita. Molti degli aspetti della patologia sono stati riprodotti in diversi modelli murini deleti per il gene MeCP2 (MeCP2-/y), inclusi la riduzione della massa cerebrale, l’atrofia neuronale e le disfunzioni cardiorespiratorie, che costituiscono i parametri più robusti e riproducibili tra i diversi modelli murini, accanto ai meno conservati parametri comportamentali, come l’ansia, la socievolezza e l’aspetto motorio. Il fenotipo Rett è caratterizzato inoltre da una riduzione dei livelli di espressione della serotonina (5HT), norepinefrina (NE) e del BDNF (Brain Derived Neurotrophic Factor). Tuttavia, è noto che i farmaci antidepressivi sono in grado di modulare i livelli di BDNF in parte regolando il sistema monoaminergico. Lo scopo di questo lavoro consiste perciò nel valutare gli effetti del trattamento cronico con antidepressivi in un modello della sindrome di Rett. Abbiamo scelto la Desipramina (DMI) come farmaco di controllo, dal momento che è già stata precedentemente utilizzata per un trial clinico della sindrome di Rett. La Desipramina è un antidepressivo che blocca il recupero di 5HT e NE a livello dello spazio sinaptico, tuttavia presenta delle complicanze cliniche a livello cardiaco. Per evitare tale effetto collaterale della DMI, abbiamo selezionato un antidepressivo altamente tollerabile, la Mirtazapina (MIR), un antagonista degli α2 autorecettori ed eterorecettori centrali e uno specifico inibitore dei recettori 5HT2 e 5HT3. Il lavoro si divide in 4 fasi: Fase 1: analisi degli effetti del trattamento con antidepressivi sul peso del corpo e del cervello ed analisi della morfologia dei neuroni piramidali della corteccia somatosensoriale in un modello murino della sindrome di Rett Fase 2: analisi degli effetti del trattamento con antidepressivi sui parametri vitali, inclusi il battito cardiaco e la frequenza respiratoria nel modello murino della sindrome di Rett Fase 3: analisi degli effetti del trattamento con antidepressivi sul comportamento nel modello murino della sindrome di Rett Fase 4: analisi degli effetti del trattamento con antidepressivi sul livello di espressione del BDNF Fase 1: analisi degli effetti del trattamento con antidepressivi sul peso del corpo e del cervello ed analisi della morfologia dei neuroni piramidali della corteccia somatosensoriale in un modello murino della sindrome di Rett Prima di tutto abbiamo valutato le caratteristiche generali del modello murino della sindrome di Rett (MeCP2-/y), osservando che il peso del corpo e del cervello dell’animale era significativamente ridotto a 42 giorni dalla nascita. Inoltre, come osservato in precedenza (Kishi and Macklis, 2004, Fukuda et al., 2005), abbiamo confermato la significativa riduzione dello spessore totale della corteccia somatosensoriale (la più compromessa in questa patologia), in particolare degli strati II-III e VI a 42 giorni dalla nascita. Abbiamo quindi trattato gli animali per due settimane a partire dal 28° giorno dalla nascita con DMI alla concentrazione 10 mg/Kg e con MIR a due differenti concentrazioni (10 o 50 mg/Kg) ed analizzato gli effetti del trattamento sul peso del corpo e del cervello. Non abbiamo riscontrato differenze per quanto riguarda il peso del corpo dopo trattamento farmacologico, tuttavia abbiamo notato un significativo aumento del peso del cervello in topi MeCP2-/y dopo 2 settimane di trattamento con MIR 50 mg/Kg, confrontato con il peso del cervello di topi MeCP2-/y della stessa età non trattati. Per meglio definire le strutture coinvolte nel recupero del peso cerebrale dopo trattamento con MIR 50 mg/Kg, abbiamo effettuato una colorazione Nissl su sezioni coronali di cervello di topo e abbiamo analizzato l’ippocampo e la corteccia somatosensoriale. Abbiamo osservato che non c’erano differenze nelle proporzioni di ogni strato ippocampale rispetto allo spessore totale dell’ippocampo lungo l’asse rostro-caudale. Tuttavia, l’analisi della corteccia somatosensoriale ha rivelato che il trattamento con DMI 10 mg/Kg e MIR 50 mg/Kg fa recuperare lo spessore totale della corteccia in topi MeCP2-/y a 42 giorni dalla nascita ed in particolare lo spessore degli strati II-III e VI che sono principalmente compromessi nel modello murino della sindrome di Rett (Kishi and Macklis, 2004, Fukuda et al., 2005). Per avere maggiori informazioni sull’effetto della MIR 50 mg/Kg a livello dei neuroni corticali, abbiamo esaminato la morfologia dei neuroni piramidali dello strato II-III della corteccia somatosensoriale in topi MeCP2-/y a 42 giorni dalla nascita utilizzando la colorazione di Golgi. Abbiamo osservato che il trattamento con MIR 50 mg/Kg induce un recupero dei deficit morfologici presenti nel modello murino (Kishi and Macklis, 2004, Fukuda et al., 2005) inclusi, la ridotta area del soma, il diametro ridotto dei dendriti apicali, l’atrofia dell’albero dendritico apicale ed in particolare quello basale, il numero delle spine “stubby” sia nei dendriti secondari apicali che basali. Infine, dal momento che è stato precedentemento osservato un deficit di rilascio del GABA in topi MeCP2-/y (Chao et al., 2010), abbiamo deciso di valutare se la MIR 50 mg/Kg era in grado di recuperare questo deficit. Abbiamo quindi dimostrato che le correnti GABA sono parzialmente recuperate dopo trattamento con MIR 50 mg/Kg nella corteccia di topi MeCP2-/y a 42 giorni dalla nascita. Fase 2: analisi degli effetti del trattamento con antidepressivi sui parametri vitali, inclusi il battito cardiaco e la frequenza respiratoria nel modello murino della sindrome di Rett I pazienti Rett e i topi MeCP2-/y presentano alterazioni cardiache e un respiro anomalo allo stato avanzato della patologia. Attraverso uno strumento non invasivo (MouseOX), abbiamo raccolto i dati relativi alla saturazione dell’ossigeno (percentuale di siti dell’emoglobina occupati dalle molecole di ossigeno), il battito cardiaco e la frequenza respiratoria (numero di battiti e respiri al minuto) e la distensione dell’arteria in base al battito cardiaco in topi Wild Type e MeCP2-/y non trattati e trattati con DMI 10 mg/Kg or MIR 50 mg/Kg. Abbiamo osservato che non ci sono alterazioni nella saturazione dell’ossigeno, tuttavia la frequenza dei battiti cardiaci e del respiro, che è ridotta nei topi MeCP2-/y non trattati, viene recuperata in seguito a trattamento con gli antidepressivi, in particolare con la MIR. Inoltre, l’effetto negativo sulla distensione dell’arteria osservato per la DMI 10 mg/Kg, non viene alterato dal trattamento con MIR 50 mg/Kg. Fase 3: analisi degli effetti del trattamento con antidepressivi sul comportamento nel modello murino della sindrome di Rett I topi MeCP2-/y sono caratterizzati dal disturbi motori e una ridotta ansia (Chahrour and Zoghbi, 2007), cosi abbiamo deciso di testare gli effetti degli antidepressivi sul comportamento del modello murino della sindrome di Rett. Attraverso il test dell’”open field”, abbiamo dimostrato che i topi MeCP2-/y trattati con i farmaci trascorrono la maggior parte del tempo del test immobili, e la loro attività in termini di capacità di alzarsi e tenersi sulle zampe posteriori e di cura personale è ridotta. Queste osservazioni sono probabilmente dovute all’effetto sedativo indotto dal trattamento con antidepressivi. Tuttavia, l’ansia che è ridotta nei topi MeCP2-/y non trattati osservata nel test dell’”elevated plus maze”, ritorna a valori normali dopo trattamento con gli antidepressivi. Fase 4: analisi degli effetti del trattamento con antidepressivi sul livello di espressione del BDNF Precedenti studi hanno dimostrato che il livello di espressione del BDNF totale è significativamente ridotto nel cervello dei topi MeCP2-/y (Chang et al., 2006, Wang et al., 2006). In questo lavoro abbiamo dapprima dimostrato come i livelli delle diverse isoforme del BDNF variano sulla base della mutazione del gene MeCP2 nei pazienti Rett. Successivamente abbiamo valutato le diverse isoforme del BDNF nel prosencefalo di topi MeCP2-/y dimostrando come esse siano significativamente ridotte a 42 giorni dalla nascita. Tuttavia, il trattamento con DMI 10 mg/Kg e MIR 50 mg/Kg non è in grado di recuperare in modo significativo il livello di mRNA. Abbiamo quindi valutato il livello proteico del BDNF, dimostrando un aumento della neurotrofina a livello corticale e una diminuzione a livello ippocampale in topi MeCP2-/y non trattati ma non statisticamente significativo. Tuttavia il trattamento con MIR 50 mg/Kg sembra recuperare il livello del BDNF, sebbene non sia significativo.
ABSTRACT Rett syndrome (RTT) is an X-linked postnatal neurodevelopmental disorder caused by the mutations on MeCP2 gene which encodes for the Methyl CpG binding protein 2, a transcriptional regulator. The classical form manifests in girls with an incidence of 1:10,000 with a progressive general physical and mental regression after a normal development during the first two years of age. Several clinical features are recapitulated in MeCP2-/y mice, including the reduced brain mass, neuronal atrophy and the cardiorespiratory abnormalities, which are considered the most robust and reproducible parameters among the Rett mouse models and the less conserved alterations on mice behavior. Rett phenotype was characterized by a reduction on serotonin, norepinephrine (5HT; NE) and BDNF (Brain Derived Neurotrophic Factor) expression level. However, it is known that the antidepressants drugs modulate BDNF expression level partly by regulation of monoamine systems. The aim of the project is to evaluate the effects of repeated antidepressant treatments in a Rett mouse model. We choose Desipramine (DMI) as control drug because it was previously used in a clinical trial of Rett syndrome. DMI blocks the reuptake of 5HT and NE, but it has some cardiac complications. To overcame the cardiac side effect of DMI, we selected the highly tolerable antidepressant Mirtazapine (MIR), which is an antagonist of central α2 autoreceptors and α2 heteroreceptors and a specific blocker of 5HT2 and 5HT3 receptors. The project comprises four phases: Phase1: Analysis of the effects of antidepressant treatments on body and brain weight, including the morphology of the somatosensory pyramidal neurons in a model of Rett syndrome (MeCP2-/y) Phase2: Analysis of the effects of antidepressant treatments on the vital signs parameters, including heart and breath rate in MeCP2-/y mice Phase3: Analysis of the effects of antidepressant treatments on the behavior of the mice (open field and plus maze test) in MeCP2-/y mice Phase4: Analysis of the effects of antidepressant treatments on brain derived neurotrophic factor (BDNF) expression level Phase1: Analysis of the effects of the drugs on body and brain weight, including the morphology of the somatosensory pyramidal neurons in a model of Rett syndrome (MeCP2-/y) First of all, we evaluated the general features of the Rett mouse model, observing that the body and the brain weight of MeCP2-/y mice were reduced at postnatal day 42 (p42). We found also that there is a significant reduction on total cortical thickness, in particular of layers II-III and VI at p42 as observed in previous studies (Kishi and Macklis, 2004, Fukuda et al., 2005). Then, we analyzed the effects of DMI 10 mg/Kg and MIR (at two different concentration: 10 or 50 mg/Kg) treatments on body and brain weight. No difference was observed for body weight, while an increase in brain weight was noticed after treatment with MIR 50 mg/Kg in p42 MeCP2-/y mice compared to MeCP2-/y untreated mice. To better define the brain structures involved in the rescue of the brain weight after MIR 50 mg/Kg treatment, we performed a Nissl staining and we analyzed the hippocampus and the somatosensory cortex. We found that among p42 MeCP2-/y treated mice, there were no differences in the proportion of each hippocampal layer to the total thickness along the rostro-caudal axis. However, the analysis of the somatosensory cortex revealed that DMI 10 mg/Kg and MIR 50 mg/Kg rescued the total cortical thickness in p42 MeCP2-/y mice and in particular the layers II-III and VI which are principally compromised in Rett mouse model (Kishi and Macklis, 2004, Fukuda et al., 2005). To gain further insight regarding the effect of Mirtazapine treatment on cortical neurons, we investigated the morphology of layer II-III pyramidal neurons of the somatosensory cortex in MeCP2-/y mice using Golgi staining. We observed that MIR 50 mg/Kg treatment was able to recover the neuronal morphology deficits of p42 MeCP2-/y mice (Kishi and Macklis, 2004, Fukuda et al., 2005), including, the small soma area, the reduced diameter of apical dendrites, the atrophy of apical and, in particular, the basal dendritic arborization, the number of secondary basal dendrites, the number of stubby spines both in secondary apical and basal dendrites. Finally, as a deficit on GABA release in MeCP2-/y mice was previously described (Chao et al., 2010), we investigatd if Mirtazapine could rescue this deficit. Indeed, we found that GABA currents were rescued by MIR 50 mg/Kg treatment in the cortex of p42 MeCP2-/y mice, although without reaching full recovery. Phase2: Analysis of the effects of the drugs on the vital signs parameters, including heart and breath rate in MeCP2-/y mice Rett patients and MeCP2-/y mice presents cardiac alterations and breathing abnormalities in a later stage of the disorder. Through a non-invasive instrument (MouseOX) we collected the data regarding the Oxygen Saturation (percentage of sites of arterial hemoglobin occupied by oxygen molecules), the Hearth and the Breath Rate (number of beats or breaths per minute) and the Pulse Distention (change in distension of the arterial blood vessels due to a cardiac pulse) on Wild Type and MeCP2-/y mice untreated or treated with DMI 10 mg/Kg or MIR 50 mg/Kg. We found that no alterations was observed for the oxygen saturation, however the frequency of heart and breath are rescued after drug treatments. A negative effect of Desipramine was observed in pulse distention which is not affected with Mirtazapine treatment. Phase3: Analysis of the effects of the drugs on the behavior of the mice (open field and plus maze test) MeCP2-/y mice are characterized by motor abnormalities and a decreased anxiety (Chahrour and Zoghbi, 2007), thus, we tested the effects of the antidepressant drugs on the behavior of MeCP2-/y mice. Through an open field test, we found that the MeCP2-/y mice treated with the drugs spent more of the time immobile, and their activity in terms of number of rearing and grooming was reduced. These observations are probably due to the sedative effect of antidepressant treatments. However, the anxiety was recover to normal levels in MeCP2-/y mice treated with the antidepressants in the elevated plus maze. Phase4: Analysis of the effects of treatments on BDNF expression level Previous studies showed that total BDNF expression level was significantly reduced in the brain of MeCP2-/y mice (Chang et al., 2006, Wang et al., 2006). First of all, we demonstrated that the levels of BDNF isoforms depend on mutations in MeCP2 gene in Rett patients. Then, we evaluated the BDNF splice variants in the forebrain of MeCP2-/y mice and we demonstrated that they were significantly reduced at p42. However, treatments with DMI 10 mg/Kg or MIR 50 mg/Kg not rescue significantly the mRNA of BDNF. Therefore, we evaluated the protein level of BDNF and we demonstrated a no statistically significant increase of the neurotrophin in the cortex and a decrease in the hippocampus in MeCP2-/y untreated mice. However, the treatment with MIR 50 mg/Kg seemed to rescue the protein level of BDNF, even if no statistically significant.
XXVI Ciclo
1985

2010/2011
The long-term potentiation (LTP) represents a widely studied form of synaptic plasticity related to learning and memory processes, which involves a long-lasting strengthening of synaptic connections through changes of their transmission and cytoarchitecture. The induction of LTP is classically achieved by tetanic stimulation of presynaptic components but it is also possible to in- duce chemically a long-term potentiation of the synaptic efficacy, thus enhancing a larger number of synapses compared to electrical stimulation and facilitating the biochemical and morphological study. The first part of this thesis is a methodological study of glycine and tetraethylammonium (TEA) induced chemical LTP (cLTP) in cultured hippocampal cells. Brief glycine (in Mg2+-free) application activate NMDA receptors, whereas TEA blocks of K+ channels inducing a depolariza- tion responsible for Ca2+ influx. Both drugs were briefly superfused and mEPSCs were monitored for all the duration of the experiments (≃60 min). This was considered as a necessary step to detect later the role of the Brain Derived Neurophic Factor (BDNF) in cLTP. Healthy hippocampal cells were dissected from rats of postnatal day 1-2. After a period of 10-12 days in vitro the cells reached optimal density, a typical mature pyramidal neuron morphology, and an extended dendritic arborization which facilitates synaptic contacts. At this stage patch-clamp technique in the whole-cell configuration was used to study the electrophysiological properties of pyramidal hippocampal neurons, able to produce spontaneous electrical activity. cLTP was tested recording miniature excitatory postsynaptic currents (mEPSCs) in voltage-clamp mode focusing on changes in their amplitude and frequency. A significant decrease in mEPSCs inter-event intervals was observed after glycine and TEA application, without significant changes in aptitudes. Therefore 20 min after glycine application an increase (≃ 61.6 %) in mEPSCs frequency was observed. A similar result was obtained also after TEA application (≃ 66 %). Following cLTP we observed also morphological changes such as an increase in density and a remodeling of different classes of dendritic spines. The role of BDNF in this cLTP model was assessed testing by ELISA assay the total BDNF expres- sion on cell lysate and by blocking Tropomyosin Receptor Kinase (Trk) with K252A. A significant increase in BDNF levels (≃ 120 %) was observed 50 min after cLTP induction. A switch from cLTP into cLTD was observed blocking Trk receptors. Moreover, confocal images collected before and after chemical potentiation in the presence of K252A showed a significant reduction (≃10%) in the average spine density both at the proximal and distal level. A significant reduction of the p-TrkB/TrkB ratio, after both gly- and TEA-LTP, was observed in distal dendrites compared to the soma. This therefore suggests a translocation of the activated receptor from periphery to the soma.
XXIV Ciclo
1983

2010/2011
The principal aim of my PhD was the setting of a protocol for the creation of phage libraries to display cDNA fragments encoding real ORF sequences, that could correspond to potential epitopes. A similar phage display library contains all the potential ORF repertoire of a cell or tissue. This tool can be specially used in the study of autoimmune diseases to perform different kind of analysis, such as the identification of epitopes involved in pathological reaction, the comparison between healthy and pathological conditions, or between different pathological conditions. A complex protocol was developed. It provides for: cDNA normalization, cDNA fragmentation to obtain peptides with useful size, and ORF enrichment to obtain really coding fragments. With this system we have created a epitopes library from Human brain mRNA.
Il principale obiettivo del mio lavoro di ricerca è la messa a punto di un protocollo per la costruzione di librerie fagiche di frammenti di cDNA codificanti per frammenti ORF, e che quindi potrebbero corrispondere a potenziali epitopi. Questo tipo di librerie contengono, potenzialmente, tutto il repertorio ORF di una cellula o di un tessuto e possono quindi essere utilizzate nello studio di malattie autoimmuni al fine di identificare nuovi epitopi coinvolti nella risposta immunitaria, di fare un confronto tra lo stato patologico e quello sano o tra diverse condizioni patologiche. Abbiamo quindi messo a punto un complesso protocollo che prevede: la normalizzazione del cDNA, la sua frammentazione per ottenere peptidi di dimensioni opportune, e l'arricchimento in frammenti realmente codificanti. Con questo sistema abbiamo realizzato una libreria di epitopi a partire da mRNA di cervello umano.
XXIV Ciclo
1984

2012/2013
My PhD project concerns neurodegenerative processes in the mouse spinal cord, with a particular attention to amyotrophic lateral sclerosis (ALS). During my PhD I have used as a model the organotypic spinal slice cultures and I have focused my studies on: early changes in spinal tissue excitability in an ALS genetic model; spinal network activity changes induced by oxidative stress in wild type (WT) and synaptic activity in premotor circuits when challenged by neuroinflammation in WT. The principal aim of my work was to understand the dialogue between a general stress condition and the spinal premotor network. To this aim, I combined electrophysiological techniques and immunofluorescence analysis to characterized the ventral interneurones located in spinal microcircuits. For that purpose I exploited the organotypic cultures developed from embryonic mouse spinal cord that are generally accepted as a good model to study the neuronal premotor activity and provide high experimental access to interneurones (Avossa et al., 2003). In the first part of my research I compared WT cultures with SOD1G93A transgenic cultures, one of the more investigated ALS model. In cultured spinal networks, as described in acute preparation collected at different stages of development, there is a progressive fastening of glycinergic currents, represented by the reduction of the decay time constant (tau value) of synaptic currents along with the slices growth. WT and SOD1G93A cultures display a different maturation profile since in transgenic slices this developmental process is significantly steeper not only in glycinergic post synaptic currents (PSCs) but also in miniature PSCs (mPSCs). This difference in the glycinergic PSCs kinetic properties can be strongly reduced by the presence of TBOA that lowers the GABA synthesis. These results support the hypothesis that in SOD1G93A cultures there is an increase amount of glycine and GABA co-release leading to the conclusion that the synaptic release is conditioned by the presence of the mutation at an early stage of development, before any evident neuronal degeneration. Moreover, I supported this data also with preliminary results regarding the co-staining of GlyT2 and GAD65 (markers for presynaptic glycine and GABA, respectively). In fact, SOD1G93A spinal organotypic slices seem to display an higher amount of mixed synapses. Next, I tested other stress processes of the tissue that could potentially affect synaptic activity and, ultimately, alter network activity. I tested chronic incubations of the spinal slices, since they are long-term preparations, with stress key players: hydrogen peroxide (H2O2) to create an oxidative stress and lipopolysaccharide (LPS) or a mixture of cytokines (CKs: TNF-α, IL-1β and GM-CSF) to mimic neuroinflammation. For these sets of experiments I have used another strain of mice with no genetic manipulation. All these chronic treatments increase the AMPA receptor mediated PSCs frequency; moreover, a neuroinflammation state is able to enhance the overall network activity; LPS treatment increases also the amplitude of AMPA-mediated synaptic currents in both spontaneous and miniature events, while CKs accelerate the disinhibited burst rhythm induced by the pharmacological removal of the synaptic inhibition that switch on the rhythmogenic centre contained in the spinal network. Summarizing, I detected that the treatments with these environmental cues affected the synaptic component, in this case the excitatory one, of the premotor network. Altogether, my work highlighted that a genetic predisposition (in the case of familial ALS) and environmental factors of different kind (oxidative and inflammatory factors or an alterate SOD1) trigger changes in synaptic transmission and we may speculate that these alterations in the premotor circuit could cooperate in synergy leading to the development of misconnected networks that contribute to induce motoneuronal neurodegeneration. Riassunto Il mio progetto di dottorato riguarda processi neurodegenerativi del midollo spinale, con una particolare attenzione verso la sclerosi laterale amiotrofica (SLA). Durante il mio dottorato ho usato come modello le fettine organotipiche di midollo spinale e ho concentrato i miei studi su: cambiamenti precoci nell’eccitabilità del tessuto spinale in un modello genetico di SLA; cambiamenti nell’attività del network spinale indotti da stress ossidativo in wild type (WT) e cambiamenti nell’attività sinaptica dei circuiti premotori sottoposti ad uno stress infiammatorio in WT. Il fine principale del mio lavoro era quello di capire il dialogo tra una condizione di stress generale ad il network spinale premotorio. A questo scopo, ho unito tecniche elettrofisiologiche e analisi di immunofluorescenza per caratterizzare gli interneuroni ventrali localizzati nel microcircuito spinale. Per raggiungere questo obiettivo ho sfruttato le colture organotipiche derivate dal midollo spinale di embrioni di topo che sono generalmente accettate come un buon modello per studiare l’attività premotoria neuronale e garantiscono un facile accesso sperimentale agli interneuroni (Avossa et al., 2003). Nella prima parte della mia ricerca ho confrontato colture WT con colture transgeniche SOD1G93A, uno dei modelli di SLA maggiormente studiati. Nei network spinali in coltura, come già descritto in preparazioni acute ottenute a diversi stadi di sviluppo, c’è una progressiva velocizzazione delle correnti glicinergiche, rappresentata dalla riduzione del decay time constant (valore di tau) delle correnti sinaptiche durante la crescita delle fettine. Le colture WT e SOD1G93A presentano un diverso profilo di maturazione dato che nelle colture transgeniche questo processo di sviluppo è significativamente più marcato non solo nelle correnti postsinaptiche (PSCs) ma anche negli eventi in miniatura (mPSCs). Questa differenza nelle proprietà cinetiche delle correnti glicinergiche può essere fortemente ridotta dalla presenza di TBOA che diminuisce la sintesi del GABA. Questi risultati supportano l’ipotesi che nelle colture SOD1G93A ci sia un aumento del co-rilascio GABA/glicina portando alla conclusione che il rilascio sinaptico sia condizionato dalla presenza della mutazione ad uno stadio precoce dello sviluppo, prima di qualsiasi degenerazione neuronale evidente. Inoltre, ho supportato questo dato anche con risultati preliminari riguardanti la marcatura di GlyT2 e GAD65 (due marker per la glicina ed il GABA presinaptici rispettivamente). Infatti, le fettine spinali organotipiche SOD1G93A sembrano caratterizzate da un aumento delle sinapsi miste. Successivamente, ho testato altri processi di stress del tessuto che potrebbero interferire con l’attività sinaptica e, conseguentemente, alterare l’attività del network. Dato che le fettine spinali sono preparazioni a lungo termine, ho testato incubazioni croniche con molecole chiave nei processi di stress: perossido di idrogeno (H2O2) per creare uno stress ossidativo e lipopolisaccaride (LPS) o una miscela di citochine (CKs: TNF-α, IL-1β and GM-CSF) per mimare uno stato infiammatorio. Per questo set di esperimenti ho usato un altro ceppo di topi privo di manipolazione genetica. Tutti questi trattamenti cronici aumentano la frequenza delle correnti mediate dai recettori AMPA; inoltre, uno stato infiammatorio è in grado di incrementare l’attività globale del network; il trattamento con LPS aumenta anche l’ampiezza delle correnti sinaptiche AMPA-mediate, sia spontanee che in miniatura, mentre le CKs accelerano il ritmo dei burst indotto dall’eliminazione farmacologica dell’inibizione sinaptica che accende il centro ritmogenico presente nel network spinale. Riassumendo, ho dimostrato che i trattamenti con questi fattori ambientali alterano la componente sinaptica, in questo caso eccitatoria, del network premotorio. Nel complesso il mio lavoro ha evidenziato che una predisposizione genetica (nel caso della SLA familiare) e fattori ambientali di varia natura (ossidativi, infiammatori o di alterata SOD1) inducono cambiamenti nella trasmissione sinaptica e possiamo speculare sul fatto che queste alterazioni nel circuito premotorio possono cooperare in sinergia causando lo sviluppo di network inefficienti che concorrono a determinare la neurodegenerazione motoneuronale.
XXVI Ciclo
1985

2013/2014
Lo stress è stato definito come "una risposta specifica del corpo a qualsiasi richiesta non specifica (stressor) su di esso". Quando lo stress, reale o percepito, è duraturo o la risposta non è appropriata (distress), i cambiamenti fisiologici di breve termine lasciano spazio ad alterazioni di lungo termine che possono causare condizioni patologiche, tra cui malattie mentali. Secondo questo modello di "carico allostatico", i mediatori primari come le catecolamine e gli ormoni steroidei, innescano alterazioni multi-sistemiche su mediatori secondari che portano a manifestazioni negative in diversi sistemi corporei, inclusi quello nervoso e immunitario. Neurotrofine, in particolare il Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF), e mediatori del sistema immunitario, come citochine e chemochine, sono possibili modulatori della risposta allo stress cronico. Pertanto, ci siamo posti l’obiettivo di valutare i loro livelli circolanti in soggetti sani in condizioni di stress lavoro-correlato. Prima di ciò, poiché la misurazione del BDNF circolante è di grande interesse per la sfera psichiatrica, ma soffre per inconsistenze probabilmente a causa della mancanza di procedure standard di selezione e valutazione, abbiamo cercato di superare queste limitazioni definendo una metodologia standardizzata sia per la raccolta dei campioni che per la misurazione di BDNF. Per fare ciò, abbiamo selezioniamo il siero come fluido elettivo per la quantificazione di BDNF e, utilizzando sieri di 40 soggetti adulti sani, abbiamo confrontato le prestazioni di sei kit di ELISA commerciali specifici per BDNF. Tutti i kit hanno mostrato la capacità di misurare il BDNF nel 100% dei campioni e, con una sola eccezione, range paragonabili. Tuttavia, essi hanno mostrato variazioni inter-assay molto diverse, dal 5% al 38%. Tali variazioni, erano superiori a quelle dichiarate dai produttori fatta eccezione per un kit, che nel complesso ha mostrato le prestazioni migliori. In aggiunta, l’analisi Dot-blot ha rivelato che due kit hanno riconosciuto selettivamente la forma matura di BDNF, mentre gli altri hanno reagito anche con il suo precursore, il pro-BDNF. Occorre notare che, avendo definito una procedura standardizzata che riduce l'elevata variabilità dovuta ai differenti passaggi tecnici nelle fasi pre-analitiche e analitiche, questo studio fornisce la base per ottenere una misura affidabile del BDNF nel siero umano, adatto per potenziali applicazioni cliniche future. Come accennato, il passo successivo è stato quello di valutare il BDNF e i mediatori immunitari circolanti in soggetti con stress lavoro correlato. Abbiamo quindi misurato il BDNF e, utilizzando la tecnologia ELISA multiplex, altri 48 analiti tra citochine, chemochine e fattori di crescita nel siero di 122 soggetti sani (87 femmine e 35 maschi). I partecipanti sono stati arruolati tra assistenti sanitari e valutati per lo stress lavoro-correlato con scale stress psicofisico e burnout estratte da un questionario di auto-valutazione standardizzato per il contesto italiano (test Qu-BO). Lo stress psicofisico è stato valutato con cinque elementi, vale a dire ansia, disturbi emotivi, gastrointestinali, cardiaci e disfunzioni ergonomiche sul posto di lavoro più uno stato generale di stress stimato come la media delle cinque dimensioni; il burnout è stato misurato con tre elementi adattati dal Maslach Burnout Inventory, nello specifico esaurimento emotivo, depersonalizzazione e realizzazione personale. Alti punteggi di score sono associati a situazioni di stress cronico elevato, ad eccezione della scala di realizzazione personale. Abbiamo individuato che le donne avevano punteggi più elevati rispetto agli uomini per tutti gli elementi di stress psicofisico e per lo stato di esaurimento emotivo. Oltre a ciò, dopo aver corretto per sesso e indice di massa corporea (IMC), abbiamo cercato di correlare le variabili biologiche con i punteggi delle diverse scale di stress, utilizzando una combinazione di analisi univariate (correlazioni parziali) e multivariate (analisi dei minimi quadrati e fattoriale), per tener conto delle correlazioni tra analiti. Come risultato, non abbiamo trovato alcuna associazione tra le variabili biologiche e lo stato di burnout, mentre, d'altra parte, abbiamo rilevato associazioni negative tra elementi dello stress psicofisico e alcuni marcatori del pattern di chemochine. In particolare, abbiamo osservato che i livelli di MCP-1/CCL2, CTACK/CCL27, RANTES/CCL5 e Eotassina/CCL11 correlano negativamente con diverse scale di stress psicofisico quali ansia, problemi gastrici e cardiaci e disfunzioni ergonomiche sul posto di lavoro. Inoltre, abbiamo osservato che IL-17, una citochina caratteristica del sottotipo T-helper 17 (Th17) e associata a danni a diversi tessuti, incluso quello intestinale, correla positivamente con alti punteggi in soggetti che accusano problemi gastrici (r=0.280, p=0,010). Curiosamente, abbiamo rilevato anche una relazione positiva tra BDNF e il punteggio di disfunzione ergonomica sul posto di lavoro (r=0.284, p=0,009), potenzialmente a causa di meccanismi di compensazione protettivi. Nel loro insieme, i nostri risultati supportano l'ipotesi che lo stress cronico induce una generale soppressione sia risposta immunitaria cellulare e umorale. Tuttavia, le conseguenze sono difficili da prevedere in quanto lo stress è noto per avere un effetto sia soppressivo che stimolante sul sistema immunitario. Per esplorare ulteriormente il potenziale ruolo protettivo di BDNF in condizioni di stress cronico, a livello cellulare, ci siamo serviti di un modello di stress citotossico in-vitro, consistente in una linea di cellule di neuroblastoma umano, le SK-N-BE, trattata con cisplatino, un farmaco chemioterapico. Da ciò abbiamo osservato che il cisplatino, in particolare dopo 24 di trattamento, aumenta la produzione di BDNF sia a livello trascrizionale che proteico. In aggiunta, lo stimolo citotossico dato dal cisplatino aumenta anche il tasso di trasduzione BDNF. Abbiamo ipotizzato che l'induzione della traduzione di BDNF avvenga attraverso l'attività di Aurora chinasi, come avviene, ad esempio, per la chinasi II dipendente da α-Ca2+/calmodulina (αCaMKII), in quanto si tratta di un meccanismo conservato a partire dagli ovociti di Xenopus fino a livello delle sinapsi neuronali di ippocampo. Pertanto, bloccando l’attività di Aurora chinasi grazie al potente inibitore PHA-680.632, ci aspettavamo di osservare una riduzione nella traduzione di BDNF e un aumento della mortalità cellulare come risultato del diminuito supporto trofico. Sorprendentemente, nonostante un aumento della morte cellulare, ma solo in combinazione con cisplatino, abbiamo osservato una maggiore induzione della traduzione di BDNF, soprattutto da quei trascritti contenenti in particolare l’esone 6 di BDNF (una variante di splicinge della porzione 5’ non tradotta), il cui ruolo è già stato osservato essere cruciale in condizioni di stress citotossico. In conclusione, i nostri risultati delineano un meccanismo di induzione della traduzione degli mRNA di BDNF potenzialmente indipendente da Aurora chinasi, almeno in condizioni di stress citotossico. Sebbene non dimostrato per BDNF, tali meccanismi potrebbero includere il reclutamento dell’unità trascrizionale con modalità indipendenti dalla presenza del cap al 5’ non tradotto degli mRNA. Le suddette osservazioni potrebbero avere importanti implicazioni cliniche nell'uso di inibitori di Aurora come coadiuvanti nel trattamento del neuroblastoma in quanto, nonostante inducano un aumento della mortalità, facilitano la selezione di cellule resistenti che producono una maggiore quantità di BDNF.
Stress was defined as “a specific response of the body to any non-specific demand (stressor) made on it”. When the real or perceived stressor is lasting or the response is inappropriate (distress), the physiological short-term changes switch to long-term alterations driving to pathological conditions, including mental illness. According to this “allostatic load” model, primary mediators such as catecholamines and steroid hormones trigger multi-systemic alterations of secondary signaling mediators possibly causing adverse manifestation in different body systems, including nervous and immune ones. Neurotrophins, in particular the Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF), and immune mediators, like cytokines and chemokines, are possible modulators of the chronic stress response. Therefore, we aimed to assess their circulating levels in healthy persons in conditions of work-related stress. Before that, since measurement of peripheral BDNF is of great interest for psychiatrists but suffers for inconsistencies, possibly due to the lack of consistent procedures for BDNF samples collection and assessment, we aimed to overcome these limitations and defined a standardized methodology for both sample collection and BDNF measurement. Hence, we have selected the serum as the elective body fluid for BDNF quantification and, using sera from 40 healthy adult subjects, we compared the performance of six commercial BDNF ELISA kits. All kits showed 100% of sample recovery and, with one exception, comparable range. However, they exhibited very different inter-assay variations from 5% to 38%. Inter-assay variations, were higher than those declared by the manufacturers with only one exception which also had the best overall performance. Dot-blot analysis revealed that two kits selectively recognize mature BDNF, while the others reacted with both pro-BDNF and mature BDNF. Of note, having defined a standardized procedure which reduces the high variability due to technical, pre-analytical and analytical steps, this study provides the basis to obtain an accurate measure BDNF in human serum, suitable for future clinical applications. As mentioned, the next step was to assess circulating BDNF and immune mediators in subjects with job-related stress. We therefore measured BDNF and, using the multiplex ELISA technology, other 48 analytes among cytokines, chemokines and growth factors in the sera of 122 healthy subjects (87 female and 35 male). The participants were enrolled among healthcare assistants and evaluated for work-related stress using psychophysical stress and burnout scales extracted from a self-assessed questionnaire standardized for the Italian context (Qu-BO test). Psychophysical stress addressed five items, namely anxiety, emotion (depression-like), gastrointestinal disturbances, cardiac disturbances, ergonomic dysfunction at the workplace and an overall stress state as the average of the five items; burnout state has been measured using three cores adapted from the Maslach Burnout Inventory, specifically emotional exhaustion, depersonalization and personal accomplishment. Higher scores mean higher stress status, except for personal accomplishment. We found that female had higher scores than male for all psychophysical stress items and for the emotional exhaustion core. Then, after correcting for gender and body-mass index (BMI), we attempted to correlate the biological variables with the score scales, using a combination of univariate (partial correlations) and multivariate analysis (partial least square and factor analysis) which took in account correlations among analytes. As a result, we found no associations between burnout state and biological variables while, on the other hand, we detected negative associations between psychophysical stress items and some markers of the chemokine profile. In particular, we observed that levels of MCP-1/CCL2, CTACK/CCL27, RANTES/CCL5 and Eotaxin/CCL11 negatively correlate, with different grade, with the scores of anxiety, gastric and cardiac problems and ergonomic dysfunction at the workplace. In addition, we observed IL-17, a feature cytokine of the T-helper subtype 17 (Th17) which have been associated to tissue damage also at intestine level, to be positively associated with score in subjects reporting gastric problems (r=0.280, p=0.010). Intriguingly, we detected also a positive relationship between BDNF and score of ergonomic dysfunction at the workplace (r=0.284, p=0.009), potentially as a result of compensatory protective mechanisms. Taken together, our results support the hypothesis that chronic stress induces suppression of both cellular and humoral response. However, the consequences are hard to predict since stress is known to have both suppressive and enhancing effects on immune system. To further explore the potential protective role of BDNF in chronic stress conditions, we moved to an in-vitro cellular model of cytotoxic stress, consisting in SK-N-BE human neuroblastoma cell line treated with cisplatin, a chemotherapeutic drug. We found that cisplatin, in particular after 24 of treatment, enhances BDNF production at both transcriptional and protein levels. Of note, it induces also an increment in the transduction rate of BDNF mRNA transcripts. We hypothesized that BDNF translation induction occurs through the activity of Aurora kinase, like what happen for α-Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II (αCaMKII) mRNA, as it is a conserved mechanism from Xenopus oocytes to synapses of hippocampal neurons. Therefore, by blocking Aurora kinase activity thanks to the potent inhibitor PHA-680632, we were expecting to detect a reduction in BDNF translation and increased cell mortality as a result of the decreased trophic support. Surprisingly, despite an improved cell death only in combination with cisplatin, we observed an enhanced BDNF translation induction especially from those transcripts containing exon 6, a splice variant of the 5’ untranslated region, which have been already observed to be crucial in cytotoxic stress conditions. In conclusion, our results pointed toward a BDNF translation induction mechanism that is Aurora kinase independent, at least in conditions of cytotoxic stress. Although not investigated, some of these mechanisms may include 5’cap-independent recruitment of the translational machinery. Furthermore, our observations could have important clinical implications in the use of Aurora inhibitors as adjuvant in neuroblastoma treatment as, even if with a cell mortality increase, they facilitate the selection of resistant cells that further enhance BDNF production.
XXVII Ciclo
1985

2012/2013
The skeletal muscle is a terminally differentiated tissue. Its capacity to repair following injury or disease depends on a population of myogenic precursors, named satellite cells. These cells are localized beneath the skeletal muscle fiber, in a specialized microenvironment, the niche. The niche preserves the homeostatic conditions of satellite cell quiescence, but at the same time, it ensures their responsiveness to mechanical, physical and chemical triggers from the surrounding environment. Therefore, the composition of the external milieu is critical in determining satellite cell behavior. As a matter of fact, during aging or under pathological conditions, alterations of the extracellular environment entail a severe impairment of satellite cell ability to sustain regeneration and repair of the skeletal muscle tissue. The general goal of this thesis was to focus on some of the trophic factors potentially present in the satellite cell niche in vivo and to characterize their role on the modulation of satellite cell functions in vitro. The first part of the research activity dealt with the study of the trophic effect of ATP on mouse myoblast proliferation. From literature, it emerged that ATP is a potential regulator of the skeletal muscle regenerative program, however the signalling mechanism remained partially unknown. We observed that ATP increased myoblast growth rate, effect that was mimicked by low concentrations of H2O2. Reactive oxygen species (ROS) imaging revealed that ATP induced H2O2 production, at concentrations comparable to those effective in triggering myoblast proliferation. Interestingly, the exposure to equimolar concentrations of adenosine did not mimic the effect of ATP, excluding any role for the main hydrolysis product of ATP in the control of cell cycling. This result was in agreement with data reporting that the specific enzymes responsible for ATP degradation are poorly expressed in myoblasts and become upregulated after cell differentiation. In line with the latter observation, it appeared reasonable that the differentiating skeletal muscle cells were more exposed to ATP-derived adenosine than proliferating myoblasts, and this suggested a potential physiological role for the nucleoside adenosine in the later phases of myogenesis. Taking into account that adenosine receptors (ARs) are present in mouse myotubes, in a second study we hypothesized a crosstalk between nAChRs and ARs. Using the Ca2+-imaging technique, we observed that the pharmacological modulation of ARs triggered variations in the nAChR-driven ([Ca2+]i) spikes. Moreover, our preliminary results suggest not only an interplay between the two receptors but also that endogenous adenosine is tonically released by twitching myotubes and activates its receptors. The third research project was aimed at exploring the role of neural agrin, a heparan sulphate proteoglycan, so far known as the key organizer of post-synaptic elements during skeletal muscle differentiation/regeneration. Besides agrin’s canonical effect on the maturation of the NMJ, novel roles have been discovered in the recent years, suggesting that the neurotrophic factor has pleiotropic effects. In this new context, we pursued the identification of potential new roles for neural agrin in the determination of satellite cell behaviour. Firstly, the analysis of different cell models, including C2C12 cell line and primary mouse and human cells, and revealed an increase in IL-6 secretion following exposure to agrin. Secondly, we addressed the hypothesis of agrin as a potential modulator of human myoblasts proliferation. Our preliminary results demonstrate that agrin enhances the proliferative capacity of human satellite cells and suggest the potential mechanism involved in the signaling cascade.
Il muscolo scheletrico è un tessuto terminalmente differenziato. La sua capacità rigenerativa in seguito a danno o patologia dipende da una popolazione di precursori miogenici, le cellule satelliti. Esse sono localizzate sulla superficie della fibra muscolare, racchiuse in un ambiente altamente specializzato, la nicchia. La nicchia assicura il mantenimento della quiescenza cellulare, ma allo stesso tempo fa sì che la cellula satellite risponda a stimoli meccanici, fisici o chimici, provenienti dall’ambiente esterno. Per questo motivo, la composizione dell’ambiente circostante condiziona altamente il comportamento della cellula satellite. Infatti, le alterazioni che si verificano con l’invecchiamento o in seguito a patologia compromettono la capacità dei precursori miogenici di sostenere la rigenerazione del tessuto. Lo scopo di questo lavoro di tesi è stato quello di individuare e caratterizzare alcuni dei fattori trofici che compongono il microambiente della cellula satellite in vivo, per cercare di capire come essi modulino le funzioni dei precursori miogenici durante la rigenerazione in vitro. La prima parte dell’attività di ricerca ha riguardato lo studio dell’effetto trofico dell’ATP sulla proliferazione mioblastica. Studi in letteratura hanno fatto emergere il potenziale ruolo regolatore dell’ATP nella rigenerazione muscolare, anche se i meccanismi attraverso cui opera non sono ancora chiari. I risultati da noi ottenuti hanno dimostrato che l’ATP aumenta la proliferazione mioblastica e che un effetto simile si osserva in presenza di H2O2. L’imaging per le specie reattive dell’ossigeno (ROS) ha inoltre dimostrato che l’ATP induce la produzione di H2O2, a concentrazioni paragonabili a quelle capaci di aumentare la proliferazione. In presenza di concentrazioni equimolari di adenosina non è stato osservato alcun effetto sulla proliferazione cellulare, fatto che suggerisce che il ruolo dell’ATP non sia attribuibile all’adenosina, il suo principale prodotto di degradazione. Questo risultato è in accordo con quanto già riportato da altri Autori a proposito degli enzimi responsabili dell’idrolisi dell’ATP: essi sono poco espressi nei mioblasti in proliferazione, mentre la loro espressione aumenta notevolmente con il differenziamento cellulare. Alla luce di queste osservazioni, risultava verosimile che i miotubi fossero più esposti rispetto ai mioblasti all’adenosina derivante dall’ATP e che pertanto l’adenosina avesse un ruolo fisiologico preponderante nelle fasi avanzate della miogenesi. Dal momento che i recettori per l’adenosina (ARs) sono espressi nei miotubi murini, un secondo lavoro ha avuto come obiettivo quello di investigare un possibile “crosstalk” tra i ARs e i nAChRs. Esperimenti di Ca2+- imaging hanno dimostrato come la modulazione farmacologica dei ARs si traduca in una variazione nelle oscillazioni di [Ca2+]i indotte dall’attività del nAChR. Questi risultati, sebbene preliminari, suggeriscono non solo che i due recettori interagiscono tra loro, ma anche che l’adenosina è tonicamente secreta dai miotubi in contrazione e agisca attivando i suoi recettori. Il terzo progetto di ricerca è stato finalizzato allo studio del ruolo dell’agrina neuronale, un proteoglicano eparan solfato, già noto per la sua capacità di aggregare elementi sinaptici durante la fase di differenziamento e di rigenerazione del muscolo scheletrico. Accanto al ruolo canonico che la vede coinvolta nella maturazione della giunzione neuromuscolare, negli ultimi anni sono state descritte nuove funzioni per l’agrina neuronale, che la indicano come un fattore pleiotropico. In questo contesto, abbiamo esplorato nuove proprietà dell’agrina. In primo luogo, l’analisi di diversi modelli cellulari, incluse la linea cellulare C2C12 e cellule primarie murine e umane, ha dimostrato che il fattore neurotrofico potenzia il rilascio di IL-6. In un secondo studio, è stato ipotizzato un potenziale effetto di modulazione della proliferazione di mioblasti umani da parte dell’agrina neuronale. Risultati preliminari hanno dimostrato che l’agrina aumenta la capacità proliferativa delle cellule satelliti umane. Inoltre, sono stati individuati alcuni dei fattori molecolari che partecipano alla cascata di segnalazione.
XXVI Ciclo
1986

2013/2014
Objective: Parkinson's disease (PD) is a neurodegenerative disorder characterized by dopamine depletion in the striatum. Clinical studies show that the main function of the basal ganglia is related to motor behavior. However, PD is characterized by a series of non-motor symptoms. In fact, basal ganglia establish important anatomical connections with prefrontal areas through dorsolateral, orbitofrontal and anterior cingulated circuits, respectively involved in executive functions, regulation of social behaviour and motivation. Although cognitive decline insidiously occurs, PD patients show cognitive slowing and executive dysfunction at early stages; this condition can evolve into mild cognitive impairment before and subcortical dementia later. While motor symptoms show a good response, cognitive symptoms do not seem to adequately respond to the drug therapy. Neurofeedback (NF) is a conditioning method for the self-regulation of brain activity based on real-time feedback of EEG/fMRI signal. During NF training, patients learn to modulate their brainwave pattern, in order to improve cognitive or motor performances. The study aims to investigate the possible effect of specific Neurofeedback techniques on cognitive performance (particularly attentive) of patients with idiopathic PD and their impact on daily activities, in terms of change in scores at the neurocognitive assessment. Methods: 20 patients were recruited affected by idiopathic PD staged according to the Hoehn & Yahr scale and previously cognitively evaluated. Patients were selected according to the following inclusion criteria: aged from 55 to 85, intact or correct auditory and visual functions, phase on of dopaminergic therapy. Patients with previous cerebrovascular insults, with psychosis, with severe dyskinesias and patients taking ChIs drug were excluded. The sample was divided into two groups of 10 patients homogeneous for age, education level, cognitive impairment and disease severity, randomized to the experimental protocol (NF training) and to the traditional protocol (conventional computerized cognitive training). The experimental protocol consists of 2 weekly sessions of 40 minutes each (30 minutes NF Attention Training/10 minutes muscle relaxation). The traditional protocol consists of 2 weekly sessions of 40 minutes each (30 minutes conventional cognitive training /10 minutes muscle relaxation). The rehabilitation program has planned, in both group, 24 sessions of training. Treatment efficacy have been evaluated through an ANOVA model with a factor between subject (treatment) and a factor within subject (before-after the treatment). All analysis have been performed with SAS Software V 9.4 for PC. Significance level have been stated as p<0.05. Results: At the end of treatment path, cognitive re-evaluation showed a significant increase in scores in both groups; PD patients significantly improved in all investigated cognitive functions (attention, set-shifting, executive functions, verbal fluency, immediate and delayed memory, and visuospatial reasoning) compared with their baseline assessments, with a positive impact on reaction time, processing speed and global cognition. The comparison between cognitive performances showed no significant differences between the two groups linked to the type of treatment carried out (NF or conventional computerized training). However, the degree of satisfaction for treatment was significantly greater in the NF group, in term of general satisfaction and technical quality. To notice that in both groups the 4 months after the end of treatment follow-up control put into evidence a decrease in scores to baseline levels. It’s probably due to the degenerative nature of the disease. Conclusions: Both approaches to cognitive training, classic computerized cognitive training and neurofeedback training, as long as applied for a long time seems to improve cognitive abilities in PD patients with mild cognitive impairment who have a higher risk of developing dementia. The increase in the satisfactory levels of the experimental group appears to be due to how patients perceive the control they have on their cognitive performance (assumption of NF training), thus increasing the sense of self-efficacy. However, our experience so far shows that patients periodically need reminder therapy, otherwise recurrence of cognitive dysfunction is observed.
Premesse Le tecniche di neurofeedback sono utilizzate con successo nel trattamento dei disturbi di attenzione nei bambini affetti da ADHD. Partendo da questo dato si è pensato di applicare tali tecniche nel trattamento dei disturbi cognitivi di marca attentiva nel paziente neurologico adulto. Per valutare la fattibilità e l’aderenza dei pazienti al trattamento, inizialmente lo studio è stato rivolto a 4 patologie neurologiche caratterizzate da disturbi attentivi: Sclerosi Multipla, Malattia di Parkinson, Insulto cerebro-vascolare, Atassia cerebellare. Preliminarmente i pazienti hanno effettuato 5 sessioni di neurofeedback. I pazienti che sono apparsi più motivati e che hanno mostrato una rapida risposta al trattamento sono stati i pazienti affetti da malattia di Parkinson. Si noti che la malattia di Parkinson è una condizione patologica che condivide circuiti neurotrasmettitoriali simili a quelli coinvolti nell’ADHD; quindi, verosimilmente, anche i meccanismi di apprendimento che rendono efficace il trattamento potrebbero essere sovrapponibili. Introduzione La Malattia di Parkinson (MP) è una malattia neurodegenerativa caratterizzata dalla deplezione di dopamina a livello striatale. Studi clinici evidenziano che la prevalente funzione dei gangli della base è correlata al comportamento motorio. Tuttavia, essi stabiliscono connessioni anatomiche con aree prefrontali attraverso i circuiti dorsolaterale, orbitofrontale e cingolato anteriore, coinvolti nei processi esecutivi, nella regolazione del comportamento sociale e nella motivazione. La bradifrenia è il disturbo cognitivo caratteristico della MP. Si manifesta attraverso perdita di concentrazione e lentezza nei processi di pensiero, obiettivati dal rallentamento del segnale EEG. Attraverso l’applicazione di tecniche di Neurofeedback (NF), modulazione e autoregolazione EEG-mediata, il paziente impara a modificare la propria attività cerebrale sotto la guida del terapeuta e del computer. Lo studio è volto ad indagare l’effetto di tali tecniche sulle performance cognitive di pazienti affetti da MP, in termini di variazioni dei punteggi testistici. Materiali e Metodi Dei 35 pazienti esaminati, ne sono stati reclutati 20 affetti da MP idiopatica stadiati secondo la scala di Hoen&Yahr e preventivamente valutati cognitivamente. Criteri di inclusione: età compresa tra 55-85 anni, funzioni visive e uditive integre, fase on della terapia farmacologica. Il campione è stato suddiviso in 2 gruppi di 10 pazienti ciascuno randomizzati per età, scolarità e stadio della patologia, sottoposti rispettivamente al protocollo sperimentale (NF training) e al protocollo tradizionale (training cognitivo convenzionale). Il percorso riabilitativo ha previsto 24 sedute di terapia cognitiva. Nel NF training, come interfaccia cervello-computer, si è utilizzata la cuffia MindWave (NeuroSky) con relativo software per il trattamento. Risultati Al termine del percorso terapeutico, la rivalutazione cognitiva ha evidenziato un significativo incremento nei punteggi in entrambi i gruppi; il confronto tra le performance cognitive non ha evidenziato differenze significative tra i due gruppi legate alla tipologia di trattamento effettuato. Tuttavia, il grado di soddisfazione per il trattamento è risultato significativamente maggiore nel gruppo sperimentale. Va segnalato che in entrambi i gruppi i controlli al follow-up hanno evidenziato un decremento dei punteggi ai livelli basali. Conclusioni L’applicazione di tecniche di NF per il trattamento cognitivo di pazienti affetti da MP, purchè erogate per tempi lunghi, è apparsa valida al pari dei trattamenti cognitivi convenzionali. L’incremento dei livelli di soddisfazione del gruppo sperimentale sembra imputabile alla percezione che il paziente ha di esercitare un controllo sulle proprie prestazioni cognitive (presupposto del NF training) aumentando così il senso di autoefficacia. Prospettive future Essendo il tracciato EEG nettamente rallentato nella MP, lo studio sarà ampliato indagando le modificazioni EEG eventualmente indotte dalla neuroriabilitazione in entrambi i gruppi. Data la rapida diffusione delle tecnologie informatiche e della comunicazione nell’ambito sanitario, parte delle attività riabilitative può essere erogata a distanza (Teleriabilitazione). Seppur ancora agli albori, le tecniche di Tele-neurofeedback consentono al paziente di ricevere un trattamento cognitivo all’interno del proprio domicilio mantenendosi in contatto continuo con il terapeuta via web. Data la necessità di proseguire il trattamento cognitivo nel tempo al fine di ritardare l’evoluzione del mild cognitive impairement in demenza conclamata, le tecniche di tele-neurofeedback potrebbero applicarsi al momento della interruzione del trattamento in presenza.
XXVII Ciclo
1985