Academic literature on the topic 'Indirizzo GENETICO MOLECOLARE'

2012/2013
L’anemia di Fanconi (FA) è una malattia genetica rara caratterizzata da malformazioni congenite, pancitopenia, predisposizione al cancro e aumentata sensibilità ad agenti, quali diepossibutano e mitomicina C, che formano legami tra i due filamenti di DNA. La FA è causata da almeno 16 geni che costituiscono, insieme ad altri componenti, un pathaway di riparazione del DNA. L’eterogeneità è uno dei principali motivi che complica la diagnosi molecolare della FA. E’ pertanto necessario un processo a più livelli che implica lo screening di molti esoni o, in alternativa, l’allestimento di linee cellulari e l’analisi di complementazione per la caratterizzazione del gene candidato. Gli scopi di questa tesi pertanto sono diretti a: • Ridurre i tempi per l’identificazione del gene mutato sostituendo l’analisi di complementazione con quella di espressione delle proteine FA basandosi sul presupposto che prodotti mutati siano rapidamente degradati; • Caratterizzare dal punto di vista molecolare gli effetti delle varianti identificate dall’analisi di sequenza. Per quanto riguarda il primo obiettivo, ci siamo focalizzati sullo studio della proteina FANCA in 44 linee cellulari linfoblastoidi appartenenti ai diversi gruppi di complementazione. E’ emerso che, fatta eccezione per FA-G, l’espressione di FANCA non è alterata da mutazioni nei geni FANCB, FANCC e FANCD2. Per quanto riguarda i pazienti con mutazioni in FANCA, invece, abbiamo osservato una correlazione tra il tipo di mutazione e il livello di espressione della proteina che può quelli essere paragonabile a quella dei controlli nel caso di mutazioni missenso o ampie delezioni in frame. In accordo con l’ipotesi invece, in presenza di mutazioni nonsenso e frameshift in entrambi gli alleli del gene, non si ha produzione di proteina. Sulla base di questi dati possiamo concludere che l’analisi di FANCA non è soddisfacente per assegnare ai pazienti il corrispondente gruppo di complementazione. Tuttavia, da questo studio è emersa l’ipotesi di un’associazione tra l’espressione stabile delle proteine FANCA mutate e un fenotipo meno grave nei pazienti. I dati preliminari dimostrano che queste proteine non sono traslocate nel nucleo e che quindi un’eventuale attività residua non sia da attribuire al processo di riparazione del DNA. Un potenziale ruolo andrebbe forse indagato a livello citoplasmatico dove, come sta emergendo dalla letteratura, almeno FANCG e FANCC, svolgono una funzione all’interno del mitocondrio tale da giustificare l’elevato grado di stress ossidativo delle cellule FA. Per il secondo obiettivo, lo studio dei casi arruolati nell'ambito dell'AIEOP (Associazione Italiana Ematologia Oncologia Pediatrica) ha consentito l'identificazione delle mutazioni in 100 famiglie. Dall’analisi dei dati emerge che la maggior parte delle mutazioni colpisce il gene FANCA (85%), seguito da FANCG (9%), FANCC (3%), FANCD2 (2%) e FANCB (1%). In assenza del dato di complementazione e/o in presenza di varianti alle quali non è sempre possibile attribuire un chiaro effetto patogenetico, sono state eseguite ulteriori indagini. Si citano a titolo di esempio la caratterizzazione delle ampie delezioni intrageniche mediante MLPA, l’analisi bioinformatica e a livello di RNA delle alterazioni di splicing che, qualora in frame, sono state ulteriormente confermate anche a livello proteico e, infine, lo studio bioinformatico di patogenicità delle sostituzioni aminoacidiche. La formulazione di un algoritmo efficace e rapido per la diagnosi molecolare della FA, nonché la chiara definizione del significato patogenetico delle varianti identificate, è molto importante per corretta presa in carico del paziente e della famiglia sia per l’identificazione dei portatori che per la diagnosi prenatale.
XXVI Ciclo
1984

2013/2014
Nel corso di questo lavoro e stato ottimizzato un metodo per ottenere –mediante idrolisi acquosa- campioni di DNA danneggiati in maniera controllata (r2= 0.997). Uno di questi campioni, denominato trial sample (TS), veniva sottoposto ad un esperimento interlaboratorio (n=25) nel corso del quale ogni partecipante doveva fornire dati relativi alla quantificazione del campione ed al suo l’assetto genotipico. L’impiego della qPCR ha dimostrato che, in campioni danneggiati, e possibile fornire solo una indicazione che e relativa (ed inversamente proporzionale) alla lunghezza (r2=0.891) della regione target. Circa i genotipi forniti, veniva osservato che, a causa di un’elevata frequenza di artefatti di PCR, l’esecuzione di un basso numero di tre repliche(≤ 3)puo portare ad errori(n=4. Lo sviluppo del metodo “consensus TSPV", invece,eliminava tali errori di genotipizzazione. L’utilizzo di tale metodo di “consensus” ha dimostrato che, per campioni degradati ed in condizione di Low Copy Number (≤ 96 pg/PCR), neanche l’esecuzione di sette repliche mette totalmente al riparo da errori di genotipizzazioni.Anche la tecnologia Illumina di Next Generation Sequencing e stata testata mediante un set di campioni danneggiati. Pure la fedeltà di questa tecnologia e stata molto influenzata dalla qualità del templato. Il“consensus TSPV”, inoltre, evidenziava che errori di genotipizzazione possono emergere quando vengono eseguite due sole repliche. Il maggiore limite dell’analisi forense sembra derivare proprio dall’elevatissima sensibilità analitica oggi ottenibile.
In the course of this work has been optimized a method to obtain -by hydrolysis in water- damaged DNA samples in a controlled manner (r2=0.997). One of these samples, called trial sample (TS), was subjected to an inter-laboratory experiment (n=25)during which each participant had to provide data on the quantification of the sample and its trim genotype. The use of the qPCR showed that, in damaged samples, it is possible to provide only an indication that is relative (and inversely proportional) to the length (r2=0891)of the target region. About the genotypes provided, was observed that, due to a high frequency of PCR artifacts, the execution of a low number of three replicates (≤3)may lead to errors (n=4). Method development "consensus TSPV", instead, eliminated these errors genotyping. The use of this method "consensus" has shown that, for degraded samples and under Low Copy Number conditions (≤96pg/PCR),even the execution of seven replicas puts totally immune from errors in genotyping. Even Illumina technology of Next Generation Sequencing was tested using a set of damaged samples. Even the fidelity of this technology has been very influenced by the quality of the template. The "consensus TSPV" also showed that genotyping errors can arise when running only two replicas. The major limitation of the forensic analysis seems to derive just by the very high analytical sensitivity obtainable today.
XXVII Ciclo
1973

2013/2014
La candidiasi muco-cutanea cronica (CMC) costituisce una condizione caratterizzata da infezioni persistenti di cute e mucose causata da Candida albicans. Fra le cause genetiche responsabili di questa patologia sono note mutazioni gain of function (GOF) del gene STAT1. Abbiamo condotto l’analisi genetica su una coorte di pazienti con CMC e abbiamo identificato otto portatori di mutazioni in eterozigosi di STAT1: due pazienti con L351F,due pazienti con L283M e un paziente con L400V.Queste mutazioni non sono ancora state descritte in letteratura. In tre pazienti abbiamo identificato mutazioni già note: T385M e A267V. Per confermare il carattere gain of function di queste mutazioni abbiamo analizzato la fosforilazione di STAT1 su sangue intero in risposta a IFN-γ e IFN-α, la capacità dei linfociti T CD4+ di polarizzare in Th17 e, per le nuove mutazioni, l’efficienza di attivazione di un gene reporter (Luciferasi) posto sotto il controllo della sequenza promotore GAS, in seguito a stimolazione con IFN-γ e IL-27. Tutti i pazienti mostrano una iperfosforilazione di STAT1, un deficit di Th17 e una capacità di attivazione di sequenze GAS maggiore rispetto ai controlli analizzati. Dallo studio della storia clinica di questi pazienti è emerso che alcuni soggetti soffrivano di infezioni virali e infezioni causate da patogeni intracellulari come Criptococco e Leishmania. Questo complesso quadro clinico, non può essere spiegato dal solo deficit di Th17, ma suggerisce un possibile coinvolgimento di altre popolazioni cellulari del sistema immunitario. I linfociti Natural Killer (NK) giocano un ruolo fondamentale nella difesa contro le infezioni sostenute da virus e da microorganismi intracellulari e sono importanti produttori di IFN-γ, citochina fondamentale nel contrastare questi patogeni. Per questo motivo abbiamo valutato la capacità citotossica delle cellule NK dei pazienti con l’espressione del marcatore di degranulazione CD107a e la capacità di produzione di IFN-γ. In questo modo, nei pazienti è stato possibile apprezzare una lieve riduzione della citotossicità e una ridotta produzione di IFN-γ in presenza di IL15. Inoltre, le difficoltà riscontrate nel differenziare in vitro le cellule NK dei pazienti ci ha fatto sospettare un deficit di crescita di queste cellule. L’ ipotesi è stata confermata dalla riduzione dell’ espressione del marcatore di proliferazione Ki67 anche dopo stimolazione con IL2 e IL15. Queste due citochine hanno un ruolo fondamentale nella proliferazione delle cellule NK attraverso l’ azione sul mediatore STAT5. Per questo motivo abbiamo valutato l’ attivazione di STAT5 attraverso l’induzione delle cellule NK con IL2 e IL15 e in questo modo abbiamo osservato una riduzione dei livelli di fosforilazione di STAT5 nei pazienti rispetto ai controlli sani. Queste evidenze ci hanno permesso di confermare che le mutazioni da noi identificate possono essere considerate causative di CMC, le mutazioni non note hanno carattere GOF e che l’alterazione della funzionalità di STAT1 può interferire negativamente sulla attività delle cellule NK attraverso l’inibizione della capacità di fosforilazione di STAT5.
XXVII Ciclo
1983

2013/2014
Il sistema uditivo è uno degli organi sensoriali più complessi e coinvolge cellule ciliate, neuroni cocleari, e molti altri elementi regolati da basi molecolari. L'analisi genetica dei tratti complessi/malattie come la funzione uditiva e la presbiacusia potrebbe far luce su questi meccanismi molecolari. Fino ad ora solo pochi geni sono noti per contribuire alla variabilità della funzione uditiva. Capirla dal punto di vista genetico può essere molto interessante e può anche fornire indizi importanti per individuare le cause genetiche della presbiacusia. La questione è di fondamentale importanza per la nostra società che invecchia sempre più. La presbiacusia è la perdita sensoriale più diffusa negli anziani e colpisce il 30 % delle persone di età superiore ai 60 anni. La malattia non dà direttamente pericolo di vita, ma contribuisce alla perdita di autonomia ed è associata all'ansia, alla depressione e alla perdita di funzioni cognitive che compromettono seriamente la qualità della vita. Inoltre, le interazioni con fattori ambientali dovrebbero essere prese in considerazione. Per tenere conto di questi fattori, ci siamo concentrati su popolazioni isolate, dove le persone condividono lo stesso ambiente e occupazioni/abitudini analoghe. L'obiettivo principale della tesi è la comprensione delle basi molecolari della variazione della funzione uditiva utilizzando: a) Genome-Wide Association Studies (GWAS) per identificare nuovi geni/loci; b) l'associazione statistica per replicare i candidati identificati; c) studi di espressione per valutare il ruolo dei candidati nella coclea di topo. In primo luogo abbiamo replicato 9 geni precedentemente pubblicati (CSMD1, ANK2, CDH13, DCLK1, ARSG, EVI5, GRM8, RIMBP2, SLC16A6) con un’analisi di associazione per geni candidati nella coorte della Silk Road (SR) che comprende diverse comunità isolate nel Caucaso e in Asia centrale. In seguito, una grande collaborazione con la coorte britannica TwinsUK ha portato ad una nuova meta-analisi di GWAS, in cui abbiamo identificato uno SNP significativo nel gene SIK3. Infine, con la disponibilità dei dati del progetto 1000Genomes per l’imputazione, un’ulteriore meta-analisi ci ha permesso di individuare altri due loci vicino ai geni PCDH20 e SLC28A3, che siamo stati in grado di replicare in due coorti indipendenti dal Regno Unito (B58C) e dalla Finlandia (FITSA). Tutti i geni identificati sono risultati espressi nella coclea. Per quanto riguarda contributi originali alla metodologia GWAS, abbiamo sviluppato un pacchetto R chiamato MultiMeta. Si tratta di un metodo statisticamente efficace per eseguire la meta-analisi in un contesto multivariato, con un approccio flessibile e strumenti per gestire facilmente la visualizzazione dei risultati. Il metodo può essere applicato a qualsiasi insieme di risultati multivariati e sarà molto utile per analizzare i dati uditivi e possibilmente per individuare nuove associazioni, sfruttando la correlazione tra fenotipi.
The auditory system is one of the most complex sensory organs, involving hair cells, cochlear neurons and many other components, strongly regulated by the underneath molecular bases. The genetic analysis of complex traits/diseases such as normal hearing function (NHF) and Age-Related Hearing Loss (ARHL) could shed light on these molecular mechanisms. Until now, only few genes are known to contribute to the variability of NHF. Understanding NHF from the genetic point of view can be very interesting and also provide important clues to solving ARHL genetic causes. This issue is of fundamental importance for our ageing society. In fact, Age-Related Hearing Loss is the most prevalent sensory impairment in the elderly affecting 30% of people aged over 60. The disease is not directly life threatening but it contributes to loss of autonomy and is associated with anxiety, depression, and cognitive decline largely compromising the quality of life. Moreover, interactions with lifestyle and environmental determinants should be taken into account. In order to overcome these confounding factors, we focused on isolated populations, where people share the same environment and similar occupations/habits. The main aim of the thesis is the understanding of the molecular bases of variation of normal hearing function using: a) Genome Wide Association Studies (GWAS) to identify new genes/loci; b) Statistical association to replicate new candidate findings; c) expression studies to evaluate their role in the mouse cochlea. Firstly we replicated 9 previously published genes (CSMD1, ANK2, CDH13, DCLK1, ARSG, EVI5, GRM8, RIMBP2, SLC16A6) by running a candidate association analysis in the Silk Road cohort (SR) including several isolated communities in Caucasus and Central Asia. Afterwards a large collaboration with the TwinsUK cohort led to a GWAS meta-analysis, which identified a significant SNP in SIK3 gene. Finally, with the availability of 1000Genomes Project imputation data another GWAS meta-analysis allowed us to identify two more loci close to PCDH20 and SLC28A3 genes, which we were able to replicate in two independent cohorts from UK (B58C) and Finland (FITSA). All the identified genes were expressed in mouse cochlea. As regards new contribution in GWAS methodology, we developed an R package software called MultiMeta. It is a novel statistically efficient method to perform meta-analysis in a multivariate setting with a flexible approach and tools for easily visualizing results. The method can be applied to any multivariate set of results and will be very useful for analysing hearing data and hopefully leading to novel association discovery, by taking into account the underlying correlations between phenotypes.
XXVII Ciclo
1987

2013/2014
Il ferro è un elemento fondamentale per molti processi di cellule e tessuti ma è potenzialmente tossico e un eccesso può danneggiare diversi componenti cellulari. A livello fisiologico il ferro circolante è regolato da segnali da pathway che lo consumano e da cellule che lo forniscono. Il principale ormone regolatore epcidina agisce insieme al recettore cellulare ferroportina nel controllare l’assorbimento con la dieta, l’immagazzinamento e la distribuzione del ferro nel flusso sanguigno. Disturbi genetici che colpiscono i componenti del pathway così altamente regolato possono causare serie malattie nell’uomo come l’emocromatosi ereditaria e l’anemia sideropenia refrattaria al ferro (IRIDA) principalmente causate da mutazioni note nei geni HFE e TMPRSS6. Gli studi descritti in questa tesi hanno lo scopo di evidenziare varianti nuove e causative che hanno un ruolo nella regolazione del pathway di ecpidina-ferroportina per spiegare l’effetto delle variazioni di ferro e le basi molecolari dell’insorgenza dei disturbi genetici del ferro nell’uomo. Studi di associazione sull’intero genoma (GWAS) sono stati condotti sui valori quantitativi di epcidina, parametri del ferro e tratti eritroidi misurati nell’ampia popolazione della Val Borbera che include 1785 individui genotipizzati da un isolato genetico italiano. Il principale risultato mostra che l’associazione di HFE e TMPRRS6 ai tratti eritroidi dipendono in maggior parte dal totale di ferro disponibile e non da un effetto diretto di HFE e TMPRSS6. I livelli di epcidina sono stati associati alle variazioni in HFE e TMPRSS6 e una prima ampia meta-analisi condotta su circa 6,000 individui VBI e olandesi ha evidenziato 2 nuovi loci associati significativamente (p<5x10-8) all’epcidina: il primo sul cromosoma 10 vicino al gene FOXI2 e il secondo sul cromosoma 2 nel gene EML6 e vicino a SPTBN1 (alias ELF). SPTBN1 è un gene interessante in quanto essenziale nel signaling TGF-β mediante le proteine SMAD, una delle quali svolge un ruolo anche nella regolazione della trascrizione dell’epcidina. Per identificare ulteriori loci che hanno un ruolo nell’omeostasi del ferro è stata condotta un’ampia meta-analisi sui marcatori clinici dello stato del ferro su 48,000 individui di origine europea in collaborazione con il consorzio australiano per lo studio genetico del ferro (GIS): lo studio mostra associazioni più significative ed effetto pleiotropico dei geni noti del ferro HFE, TF, TFR2 and TMPRSS6 e cinque nuovi geni associati a livello Bonferroni (ABO, ARNTL, FADS2, NAT2, TEX14). In particolare la trasferrina è associata a NAT2 precedentemente associato a disturbi dei lipidi e a rischio cardiovascolare e FADS2 le cui variazioni hanno un effetto su diversi fenotipi come gli acidi grassi, il glucosio nel sangue e gli enzimi del fegato. I risultati mostrano una forte correlazione tra omeostasi del ferro e metabolismo dei lipidi nell’uomo e quindi il ferro potrebbe avere un ruolo nell’insorgenza dei disturbi cardiovascolari. I risultati confermano che l’isolato della Val Borbera ha costituito un modello della popolazione generale adatto a studi genetici su malattie comuni. Per aumentare la possiblità di trovare varianti rare e causative sfruttando i vantaggi e le caratteristiche delle popolazioni isolate, la coorte della Val Borbera e gli altri isolati genetici italiani si sono riuniti in un progetto che utilizza le tecniche innovative di sequenziamento dell’intero genoma allo scopo di creare un pannello di riferimento ricco di sequenze italiane rare e di altà qualità per ulteriori studi genetici sul ferro, epcidina e altri tratti di rischio.
Iron is a key element for cellular and tissue processes. It is also potentially toxic and excess iron can damage various cellular components. At physiological levels circulating iron is regulated by signals from pathways that use iron and from cells that supply iron. The main iron-regulatory hormone hepcidin and its receptor iron channel ferroportin play a critical role controlling the dietary absorption, storage, and tissue distribution of iron through the bloodstream. Genetic disorders that affect the components of the tightly regulated hepcidin-ferroportin pathway could cause severe pathologies in humans as hereditary hemocromatosis and iron-refractory iron-deficiency anemia or IRIDA mainly caused respectively by mutation in two known loci, HFE and TMPRSS6. The studies described in this thesis aimed at highlighting novel and causative variants in loci that have a role in the regulation of hepcidin-iron pathway to explain the effect of unbalanced iron in humans and the molecular basis of the onset of genetic iron disorders. First, genome-wide association studies (GWAS) have been carried out on quantitative hepcidin, iron parameters and erythrocyte traits measured in the population of Val Borbera (VBI) that includes 1785 genotyped individuals from an Italian genetic isolate. The main result showed that association of HFE and TMPRSS6 to erythroid traits is mostly dependent on the amount of iron available and not a direct effect of HFE and TMPRSS6 variants. Hepcidin levels have been associated to HFE and TMPRSS6 variations and a first large meta-analysis, performed on 6,000 VBI and Dutch individuals, revealed two novel loci associated to hepcidin at genome-wide significance (p<5x10-8): the first on chromosome 10, near the gene FOXI2 and the second signal on chromosome 2 in the EML6 gene and near SPTBN1 (alias ELF). SPTBN1 is an interesting gene as it is essential in TGF-β signaling by SMAD proteins and one of the SMADs is involved in hepcidin transcription regulation. To identify additional loci affecting iron homeostasis, a large international meta-analysis on the serum biomarkers commonly used to determine the clinical iron status has been carried out in 48,000 European ancestry individuals in collaboration with Australian Genetic Iron Status (GIS) Consortium: the study showed more significant associations and pleiotropic effect for known loci as HFE, TF, TFR2 and TMPRSS6 and five novel associated loci at significant levels (ABO, ARNTL, FADS2, NAT2, TEX14). In particular, transferrin is associated to NAT2, previously associated to lipids affections and cardiovascular risk, and to FADS2 that affects several phenotypes as lipids fatty acids, fasting glucose and liver enzyme. The results highlighted a strong correlation between iron homeostasis and lipid metabolism in humans that could have implication on the onset of cardiovascular disorders. The Val Borbera genetic isolate has represented a suitable model for genetic study on common disease. To increase the power of detection of rare and causative variants and to take advantage of the characteristics of genetic isolates, VBI and other Italian isolated populations are now involved in an innovative whole-genome sequencing (WGS) project with the aim to create an Italian specific panel enriched in lower-frequency high-quality variants to be used in further genetic analysis on iron parameters, hepcidin and other traits.
XXVII Ciclo
1981

2012/2013
Taste has been described as the body's “nutritional gatekeeper”, affecting the identification of nutrients and toxins and guiding food choices. Genetic variation in taste receptor genes can influence perception of sweet, umami and bitter tastes, whereas less is known about the genetics of sour and salty taste. Differences in taste perception, influencing food selection and dietary behavior, have also shown important long-term health implications, especially for food-related diseases such as obesity, diabetes, cardiovascular diseases. To date, a lot of studies are focused on taste receptor genes and function but further investigations are needed to better understand which factors, including genetic ones, are involved in influencing taste and food preferences and the corresponding connections with health status. The aim of this thesis is to understand the genetic bases of taste perception and its relationship to food preferences and health outcomes. Data from ~3500 subjects coming from isolated villages located in Italy, Caucasus and Central Asia were collected. The ability to taste PROP (6-n-propylthiouracil) bitterness and NaCL saltiness, food liking and intake were measured. Additional information such as clinical parameters, professional activity, lifestyle, eating habits and family history were also collected. To learn more about taste biology the following steps were performed in this thesis: 1) genome-wide association studies (GWAS) of bitter and salty taste perception; 2) analysis of the possible impact of bitter taste perception on food preferences; 3) investigation of the relationship between differences in taste perception genes, food preferences and dental caries, as example of health outcome. The main specific results emerging from this PhD thesis work are: 1) GWAS revealed two SNPs closed to TRPV7 and KCNA5 genes associated to salty perception; 2) always through GWAS a SNP closed to GHRL gene, encoding for ghrelin and obestatin, was found to be associated to PROP bitter perception. An additional SNP closed to the 5’ region of the T2R38 gene showed association to the same phenotype; 3) ability to perceive PROP could be a marker for general perception of taste stimuli suggesting that differences in taste perception may be a driver of food liking; 4) the risk to develop dental caries is associated to genetic differences in sweet taste genes. In addition, sweet food liking but not sugar intake results linked to dental caries prevalence, suggesting that food preferences may predictive of health outcomes better than food intake. Overall, these data represent a starting point to better understand how chemosensory differences may interact to influence and predict food choices and human nutritional behavior.
Il gusto può essere considerato il “guardiano alimentare” del corpo, permettendo l’identificazione di sostanze nutritive o tossiche e guidando le scelte alimentari. Variazioni genetiche nei geni che codificano per i recettori del gusto possono influenzare la percezione del gusto dolce, umami e amaro, mentre poco conosciuta è la genetica del gusto acido e salato. Differenze nella percezione gustativa, incidendo sulla scelta del cibo e sul comportamento alimentare, hanno anche mostrato importanti implicazioni a lungo termine per la salute, specialmente per malattie relate alla dieta come l’obesità, il diabete e le malattie cardiovascolari. Finora, molti studi si sono focalizzati sui geni e la funzione dei recettori del gusto, ma ulteriori indagini sono necessarie per comprendere meglio, quali fattori, inclusi quelli genetici, possono influenzare gusto e preferenze alimentari e il corrispondente legame con lo stato di salute. Lo scopo di questa tesi è di comprendere le basi genetiche della percezione del gusto e la sua connessione con le preferenze alimentari e lo stato di salute. Sono stati raccolti dati su ~3500 soggetti provenienti da villaggi isolati situati in Italia, Caucaso e Asia centrale. Sono stati misurati la capacità di percepire l'amarezza del PROP (6-n-propylthiouracile) e il gusto salato del NaCL, le preferenze e i consumi alimentari. Sono stati anche raccolti ulteriori informazioni come parametri clinici , attività professionale, stile di vita, abitudini alimentari e storia familiare. Per comprendere meglio la biologia del gusto in questa tesi sono stati svolti i seguenti steps: 1) studi di associazione su tutto il genoma (GWAS) volti a identificare nuovi geni coinvolti nella percezione del gusto amaro e salato; 2) analisi del possibile impatto della percezione del gusto amaro sulle preferenze alimentari; 3) studio della relazione tra differenze genetiche nella percezione del gusto, preferenze alimentari e carie dentale, come esempio di relazione con lo stato di salute. Le principali scoperte emerse da questa tesi sono: 1) uno studio GWA ha identificato due SNPs vicini ai geni TRPV7 e KCNA5 associati alla percezione del gusto salato; 2) sempre attraverso GWAS uno SNP vicino al gene GHRL, che codifica per la grelina e l’obestatina, è stato trovato associato alla percezione amara del PROP. Un ulteriore SNP localizzato vicino alle regione 5' del gene T2R38 mostra, inoltre, associazione con lo stesso fenotipo PROP; 3) la capacità di percepire il PROP potrebbe essere un marker per la percezione generale degli stimoli gustativi, suggerendo che le differenze nella percezione del gusto possono rappresentare un “driver” del gradimento del cibo; 4) il rischio di sviluppare carie dentali è associato a differenze nei geni che codificano per il gusto dolce. Inoltre, la preferenza per i cibi dolci, ma non il consumo di zuccheri, risulta associata alla prevalenza di carie dentale, suggerendo che le preferenze alimentari possano risultare migliori predittori dello stato di salute rispetto ai consumi alimentari. Complessivamente, questi dati rappresentano un punto di partenza per capire meglio come le differenze chemio-sensoriali possono interagire nell’influenzare e prevedere le scelte alimentari e il comportamento alimentare nell’uomo.
XXVI Ciclo
1983

2013/2014
La sindrome WHIM è un’immunodeficienza rara che si manifesta nei pazienti affetti con neutropenia cronica, verruche, ipo-gammaglobulinemia ed infezioni ricorrenti batteriche e virali. La neutropenia è la diretta conseguenza dell’incapacità da parte dei neutrofili di migrare dal midollo osseo verso la periferia (Mielochetassi). Dal punto di vista genetico le cause della malattia sono da associarsi a mutazioni in eterozigosi nel gene CXCR4 con trasmissione autosomica dominante. Questo gene codifica per una proteina a sette domini trans-membrana. La porzione extra-cellulare è specializzata nel riconoscimento del ligando specifico CXCL-12 (SDF-1α) mentre la porzione intracellulare è associata alle proteine-G e quindi deputata alla trasduzione del segnale. Nei pazienti affetti da sindrome WHIM è possibile identificare mutazioni che causano la formazione di un codone di stop prematuro in CXCR4. Tali mutazioni determinano la perdita di gran parte della porzione citoplasmatica con conseguente alterazione della funzionalità della proteina, una mancata down-regolazione di CXCR4 ed una incrementata risposta al suo ligando specifico CXCL12 (SDF-1). La ragione principale di questa alterazione è la perdita di regioni ricche in serine e treonine, siti di fosforilazione importanti per il corretto funzionamento di CXCR4. L’attività di CXCR4 può essere regolata, tramite trans-attivazione, dal recettore CXCR7. Lo studio di quest’interazione è di notevole interesse dato che sono state riscontrate malformazioni cardiache simili a quelle osservate nella Tetralogia di Fallot sia in modello murino mutato in CXCR7 sia in alcuni pazienti WHIM. Caratterizzare le diverse mutazioni di CXCR4 può aumentare la comprensione genetico-molecolare dei meccanismi che causano la sindrome WHIM. Durante il corso di dottorato di ricerca, mi sono occupato della caratterizzazione di una nuova mutazione in CXCR4 e dello studio di mutazioni già note mediante esperimenti in vitro. Grazie al contatto diretto con i pazienti è stato possibile analizzare le mutazioni e i relativi effetti su cellule linfocitarie attivate (PHA-T blasti) provenienti da campioni di sangue periferico. Questi studi hanno compreso sia saggi funzionali, come la chemotassi e il flusso del calcio intracellulare, sia biologici e molecolari, come lo studio della fosforilazione delle proteine ERK. Tutti gli esperimenti sono stati effettuati dopo stimolo del recettore CXCR4 mediante un ligando specifico, la chemochina SDF-1α. Le analisi eseguite sulle cellule dei pazienti con mutazioni fino ad ora note hanno sempre mostrato un comportamento gain of function del recettore CXCR4: gli effetti evidenti in seguito ad esposizione al suo ligando specifico CXCL12 sono l’iper-fosforilazione delle proteine ERK1/2, l’aumentato flusso del calcio intracellulare e l’aumentata risposta chemotattica. Oltre a questo abbiamo trovato e caratterizzato una nuova mutazione di CXCR4 (L317fsx3) non descritta in letteratura, che genera un codone stop situato più a monte delle mutazioni finora descritte. Questa mutazione genera un recettore CXCR4 completamente privo della porzione citoplasmatica contenente tutti i siti di fosforilazione del recettore. Sulle cellule di questi pazienti abbiamo valutato per primo la via di segnale delle MAP chinasi, in particolare la fosforilazione di ERK1 ed ERK2, ed in seguito il flusso del calcio intracellulare e la chemotassi in risposta dose-dipendente a SDF-1. Al contrario delle altre mutazioni già note, le analisi condotte sulle cellule T attivate dei pazienti con mutazione L317fsx3 hanno mostrato una ridotta capacità di fosforilazione delle proteine ERK1/2, una ridotta chemotassi e diminuzione del flusso del calcio intracellulare in risposta allo stimolo con SDF-1α. Il risultato della fosforilazione delle proteine ERK1/2 si è ripetuto anche sulle cellule della linea B immortalizzate con il vius Epstein Barr (EBV) dei pazienti in questione. Per confermare i risultati ottenuti sulle cellule dei pazienti, cellule HEK293 sono state trasfettate con un vettore eucariotico wild-type, un vettore eucariotico mutagenizzato L317fsx3 o con un vettore eucarotico mutagenizzato per la mutazione più frequente e rappresentativa (R334X). Su queste cellule è stata valutata la fosforilazione delle proteine ERK1/2. In accordo con i risultati ottenuti sulle cellule dei pazienti, la trasfezione con il vettore mutagenizzato L317fsx3 riduce la capacità di CXCR4 di fosforilare le proteine ERK e di mediare il flusso del calcio intracellulare rispetto alle cellule trasfettate con il plasmide wild-type o il plasmide contenente la più frequente mutazione R334X. I risultati che abbiamo visualizzato in questi esperimenti hanno mostrato un effetto differente della nuova mutazione rispetto a quelli causati dalle mutazioni precedentemente caratterizzate; questo comportamento potrebbe essere dato dalla perdita dell’intera coda citoplasmatica dal parte del recettore CXCR4. Questo troncamento della coda citoplasmatica comporta la perdita di tutti i siti di fosforilazione del recettore in grado di associarsi alle proteine G e necessari alla corretta trasduzione delle diverse vie di segnale. Questa incapacità di legare le proteine G da parte del recettore CXCR4 comporta una riduzione della funzionalità recettoriale.
XXVII Ciclo
1983

2012/2013
L'antigene leucocitario umano (HLA)-G presenta, in condizioni fisiologiche, una ristretta espressione tessuto-specifica ed ha funzione immuno-tollerogenica. Però, la presenza della molecola HLA-G è stata associata a diverse patologie autoimmuni e virali. In questo progetto di dottorato di ricerca abbiamo analizzato la possibile associazione tra la varianti genetiche nel gene HLA-G, che si suppone regolino l'espressione di HLA-G, e la suscettibilità allo sviluppo e al decorso della malattia celiaca, del lupus eritematoso sistemico, dell'artrite reumatoide e dell'infezione dal virus dell'epatite C. Inoltre, abbiamo analizzato se variazioni all'interno del promotore di HLA-G possano alterare la sua trascrizione genica, a questo scopo è stato condotto il saggio della luciferasi. Per gli studi di associazione sono stati analizzati 800 bp del promotore, l’intero 3’UTR e la delezione di una citosina all’esone 3 (ΔC, allele HLA-G*0105N) in 402 pazienti celiaci e 509 controlli italiani; 114 pazienti con lupus eritematoso sistemico e 128 controlli sani provenienti dal Nord -Est del Brasile, 127 pazienti con artrite reumatoide e 128 controlli dal Nord-Est del Brasile, e 286 pazienti caucasici HCV positivi e 285 controlli provenienti dalla stessa area geografica. Il saggio della luciferasi è stato condotto su 9 diversi aplotipi al promotore del gene HLA-G: CCTAGGACCG, CGTAGGACCG, CTTAGGACCG, TCGGTACGAA, TGGGTACGAA, TTGGTACGAA, CCTAGGAGCG, CGTAGGAGCG, e CTTAGGAGCG. Numerosi SNPs e aplotipi del gene HLA-G sono stati associati con le malattie analizzate. Inoltre, il saggio della luciferasi ha permesso di constatare che la presenza di polimorfismi, nel promotore del gene HLA-G, altera la trascrizione genica; nello specifico, in condizioni di stress, l’allele -725 C era significativamente associato ad un aumento della trascrizione del gene rispetto agli alleli -725 G e T. I nostri i risultati indicano un'associazione tra i polimorfismi del gene HLA-G e la suscettibilità allo sviluppo delle malattie studiate, suggerendo che molecola HLA-G è coinvolta nella patogenesi di queste malattie. Inoltre, possiamo ipotizzare che il gene HLA-G sia un gene stress-inducibile e che la presenza di SNPs al promotore alterati i livelli di trascrizione del gene
The Human Leukocyte Antigen (HLA)-G present a physiological restricted tissue-specific expression and an immuno-tolerogenic functions. The HLA-G expression has been associated with various autoimmune and viral diseases. In this PhD project we analyzed the possible association between genetic variant in the HLA-G gene, supposed to regulate HLA-G expression, and the susceptibility to develop celiac disease, systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis and hepatitis C virus infection. Furthermore, we analyzed if variations within the HLA-G promoter could alter its transcription, and for this reason luciferase reporter gene assays was conducted. The HLA-G 5’ upstream regulatory region (URR), 3’ untranslated region (UTR) and a cytosine deletion at exon 3 (ΔC, HLA-G*0105N allele) were analyzed in 402 celiac patients and 509 controls from Italy; 114 systemic lupus erythematosus patients and 128 healthy controls from North East Brazil; 127 rheumatoid arthritis patients and 128 controls from North East Brazil; and 286 Hepatitis C virus Caucasian patients and 285 controls from the same geographical area. The luciferase reporter gene assay was used for the HLA-G promoter CCTAGGACCG, CGTAGGACCG, CTTAGGACCG, TCGGTACGAA, TGGGTACGAA, TTGGTACGAA, CCTAGGAGCG, CGTAGGAGCG, and CTTAGGAGCG haplotypes. Several HLA-G SNPs and haplotypes were associated with the diseases analyzed. By luciferase reporter gene assay, we found that the presence of polymorphisms in the HLA-G promoter altered gene transcription, specifically -725 C allele was significantly associated with an increased of the HLA-G transcription with respect to -725 G and T alleles in stress condition. Our findings indicate an association between HLA-G gene polymorphisms and susceptibility to diseases development, suggesting that HLA-G molecule is involved in the pathogenesis of the diseases. Also, we can hypothesize that HLA-G gene is a stress-inducible gene and that the presence of SNPs to the promoter alter levels of transcription of the gene
XXVI Ciclo
1980

2011/2012
La sindrome di Hermansky-Pudlak definisce un gruppo di immunodeficienze primarie rare caratterizzate da albinismo parziale, di tipo autosomico recessivo che si presentano con un quadro di infezioni ricorrenti e predisposizione ad emorragie. I geni causativi di queste patologie codificano proteine coinvolte nella biogenesi e nel trasporto di organelli intracellulari correlati a endosomi e lisosomi. Il caso giunto alla nostra attenzione presentava solo alcuni dei sintomi caratteristici di queste immunodeficienze. Escluse le malattie genetiche più note tramite sequenziamento diretto si è ricorso ad exome sequencing in modo da poter rilevare anche nuove variazioni non note. E' stata infatti riscontrata una mutazione in omozigosi sul gene PLDN (BLOC1S6), codificante una proteina chiamata Pallidina, una componente del complesso BLOC-1. La condizione risultante è stata identificata con il nome di “sindrome di Hermansky-Pudlak di tipo 9” (HPS-9). In questo studio dimostriamo che tale mutazione è associata alla patologia e che compromette la funzionalità del reparto immunitario sia citotossico (linfociti Natual Killer e CD8+) sia presentante l'antigene (cellule dendritiche).
XXV Ciclo

2013/2014
The understanding of the genetic structure of a population is important to describe its population history, as well as designing studies of complex biomedical traits, including disease susceptibility. The Marco Polo expedition gave us the possibilities to explore several different populations in the Caucasus and Central Asia from Georgia to Kazakhstan, obtain information on taste, and smell perception and several other phenotypes in order to identify the genetic variants implicated. Considering the stratification issue in genetic association studies the aim is to fully characterize the genetic diversity in each population in order to provide a useful array of information for future association studies. Chemosensory phenotypes like olfactory perception, taste perception, are different between and within populations and are probably the results of the combination of gene-environment interactions, for this reason finding new variants could be challenging due to the small number of individuals sampled, in addition it is worth pointing out that a large number of individuals are needed to detect genetic variants with a modest effect on the variability of a phenotype. However, as a large sample size is not always a feasible option, especially in these countries, a population-based approach is needed to take into account the population history and the genetic structure in describing phenotype variation. This thesis defines the population genetic landscape and migration pattern of the population sampled during the Marco Polo expedition and an implementation of a methodology to describe it. In addition, we used an approach based on the population to interpret and analyze the observed pattern of olfactory perception, the role of genetic variation in eye color and finally the relationship between taste perception and food preferences across different countries.
La conoscenza della struttura genetica di una popolazione è importante per descriverne la storia, e per la progettazione di studi di tratti biomedici complessi. La spedizione Marco Polo ci ha dato la possibilità di esplorare diverse popolazioni differenti in Caucaso e Asia Centrale, dalla Georgia al Kazakistan, e ottenere informazioni sul gusto, la percezione olfattiva e molti altri fenotipi, tutto questo al fine di esplorare le varianti genetiche implicate in questi ultimi Considerando il problema della stratificazione nell’analisi di associazione genetica, l'obiettivo è di caratterizzare la diversità genetica in ogni popolazione al fine di fornire una gamma di informazioni utili per gli studi futuri di associazione. Fenotipi chemosensoriali come la percezione olfattiva, la percezione gustativa, sono diversi tra e all'interno delle popolazioni e sono probabilmente il risultato della combinazione d’interazioni gene-ambiente, e la ricerca di nuove varianti genetiche implicate in essi potrebbe essere difficile a causa del modesto numero di individui campionati nelle diverse popolazioni della Via della seta, in aggiunta è bene precisare che un grande numero di individui sono necessari a rilevare le varianti genetiche con un effetto modesto sulla variabilità di un fenotipo. Tuttavia ottenere un campione numeroso, non è sempre una possibilità fattibile, soprattutto in questi paesi; dunque un approccio basato sulla popolazione è necessario per tener conto della struttura della stessa nel descrivere la variabilità fenotipica. Questa tesi descrive la variabilità genetica delle popolazioni campionata durante la spedizione di Marco Polo e l’implementazione di una metodologia per descriverla. Inoltre è stato utilizzato un approccio basato sulla popolazione per comprendere la variazione nella percezione olfattiva, il ruolo di varianti genetiche in colore degli occhi e, infine, il rapporto tra percezione del gusto e le preferenze alimentari in diversi paesi.
XXVII Ciclo
1986