Dissertations / Theses: 'Imagerie multiplexé en fluorescence'

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Chouket, Raja. "New dimensions for multiplexed fluorescence imaging." Electronic Thesis or Diss., Sorbonne université, 2019. http://www.theses.fr/2019SORUS606.

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Abstract:

Notre groupe de recherche avait déjà mis au point les protocoles OPIOM pour l’imagerie par fluorescence. En exploitant les sections efficaces de photoswiching de fluorescence, OPIOM permet d’extraire sélectivement la réponse des fluorophores réversiblement photoswitchables (RSFs) en présence de fluorophores interférant spectralement. Cependant, OPIOM nous a permis de ne distinguer que 3 RSFPs spectralement similaires. L’objectif de cette thèse était d’augmenter ce nombre. Pour atteindre cet objectif, un nouvel instrument automatisé appelée photoswichomètre a été mis au point pour cribler la signature photochimique de 22 RSFP en analysant leur réponse de fluorescence aux sauts de lumière dont l’intensité couvre 5 ordres de grandeur. Cette signature a d’abord été exploitée dans un nouveau protocole d’imagerie par fluorescence appelé HIGHLIGHT, qui a capitalisé sur OPIOM et amélioré encore sa sélectivité. Dans HIGHLIGHT, les RSFs sont soumis à une modulation harmonique de la lumière et leur contribution aux signaux d’émission de fluorescence globale est sélectivement récupérée en exploitant leur réponse non linéaire singulière dans des conditions optimisées. HIGHLIGHLIGHT a été implémenté pour l’imagerie des RSFPs dans les cellules sans interférence d’autofluorescence, pour réaliser l’imagerie multiplexée de 3 RSFPs qui ne pouvaient pas être discriminés avec OPIOM, aussi pour améliorer l’effet de sectionnement optique. La signature des RSF a ensuite été utilisée dans un deuxième protocole d’imagerie par fluorescence appelé LIGHTNING. Contrairement à OPIOM et HIGHLIGHT qui exploitent les sections efficaces de la photoswitching en régime permanent de faible intensité lumineuse, LIGHTNING exploite le régime transitoire des RSFs sous de multiples illuminations impliquant diverses gammes d’intensités lumineuses pour la discrimination RSF. Ainsi, LIGHTNING nous a permis d’améliorer le degré de multiplexage du contraste dynamique en imagerie de fluorescence jusqu’à 20 RSFP sur 22 RSFP étudiés
Our research group had previously developed the OPIOM protocols for fluorescence imaging. By exploiting their cross sections of fluorescence photoswiching, OPIOM can selectively extract the response of reversibly photoswitchable fluorophores (RSFs) in the presence of spectrally interfering fluorophores. However, OPIOM allowed us to discriminate only 3 spectrally similar reversibly photoswitchable fluorescent proteins (RSFPs). The goal of this PhD was to augment this number. To reach this goal, a new automated instrumental setup called photoswichometer was first developed to express and screen the rich photochemical signature of 22 RSFPs by analyzing their fluorescence response to light jumps with intensities covering 5 orders of magnitude. This signature has been first exploited in a new fluorescence imaging protocol called HIGHLIGHT, which capitalized on OPIOM and further improved its selectivity. In HIGHLIGHT, the RSFs are submitted to harmonic light modulation and their contribution to the overall fluorescence emission signals is selectively retrieved from exploiting their singular non-linear response under optimized conditions. HIGHLIGHT has been implemented to image RSFPs in cells without interference of autofluorescence, to perform multiplexed imaging of 3 RSFPs which could not be discriminated with OPIOM, and used for its intrinsic optical sectioning. The RSF signature has been then used in a second fluorescence imaging protocol called LIGHTNING. In contrast to OPIOM and HIGHLIGHT which exploit the cross sections of fluorescence photoswitching in a steady-state regime of low light intensity, LIGHTNING exploits the transient time fluorescence response of RSFs under multiple illuminations involving various ranges of light intensities for RSF discrimination. Thus, LIGHTNING allowed us to improve the multiplexing degree of dynamic contrast in fluorescence imaging up to 20 RSFP among 22 studied RSFPs

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Deiss, Frédérique. "Développement de réseaux multiplexés de biocapteurs électrochimiques." Thesis, Bordeaux 1, 2009. http://www.theses.fr/2009BOR13883/document.

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Abstract:

Ce travail de thèse a porté sur le développement de réseaux de micro- et nanocapteurs opto-électrochimiques pour la bioanalyse. Ils répondent à la demande grandissante dans le domaine de la recherche et du diagnostic pour des outils permettant de réaliser de multiples analyses simultanément avec des échantillons de faibles volumes. Ces nouvelles biopuces de haute densité sont fabriquées à partir de faisceaux cohérents de fibres optiques. Une des deux faces est micro- ou nanostructurée par une attaque chimique, puis fonctionnalisée avec une sonde biologique. La première biopuce est un réseau de nanocapteurs fluorescents à ADN où les sondes ont été immobilisées grâce aux propriétés d’électropolymérisation du pyrrole. La lecture est réalisée à distance au travers du faisceau d’imagerie. En combinant la technique d’immobilisation avec des microleviers électrochimiques, plusieurs sondes différentes ont pu être adressées sur le même réseau nanostructuré. La seconde biopuce permet d’effectuer des immunodosages multiplexés en utilisant l’imagerie électrochimiluminescente résolue à l’échelle d’une microsphère. Le développement de cette technique permet de combiner les avantages de l’électrochimiluminescence avec des immunodosages multiplexés. L’élaboration de ces réseaux allie différentes techniques physico-chimiques, notamment électrochimiques, pour obtenir des biopuces avec un fort potentiel, grâce à une densité et un degré de multiplexage importants
This work presents the development of optoelectrochemical micro- and nanosensor arrays for bioanalytical applications. These platforms respond to the growing need in research and diagnostic for tools allowing multiple and simultaneous analysis in small-volume samples. These new high density biochips are made from coherent optical fiber bundles: one face is micro- or nanostructured by chemical etching and then functionnalized with biological probes. The first biochip is a fluorescent DNA nanosensor array where probes have been immobilized by electrodeposition of a polypyrrole thin film. The detection of the hybridization is remotely performed through the imaging fiber. Different probes were succesfully addressed onto the same nanostructured array thanks to electrochemical cantilevers. The second biochip allows multiplexed sandwich immunoassays using electrochimiluminescent imaging resolved at the single bead level. In particular, the development of this new readout mechanism allows extending electrochemiluminescent detection for multiplexed immunoassays. Design and implementations of both platforms take advantages of different physical and chemical techniques, especially electrochemical, to obtain biochips with a great potential through high density and high multiplexing level

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Valisa, Paolo. "Imagerie spectrale en raman et fluorescence : developpement et applications (doctorat : pharmacie)." Reims, 1997. http://www.theses.fr/1997REIMP204.

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Provencher, David. "Imagerie 3D de l'anatomie interne d'une souris par dynamique de fluorescence." Mémoire, Université de Sherbrooke, 2012. http://hdl.handle.net/11143/6205.

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Abstract:

L'imagerie médicale sur petits animaux est d'une grande utilité en recherche préclinique, car elle permet d'imager in vivo et en 3D l'intérieur de l'animal. Ceci sert au développement de nouveaux médicaments et au suivi de l'évolution de certaines pathologies. En effet, les techniques d'imagerie éliminent la nécessité de sacrifier les animaux, ce qui permet le suivi de processus biomoléculaires sur un même individu et l'obtention de données statistiquement plus significatives. Cependant, l'information moléculaire recueillie s'avère généralement de faible résolution spatiale, notamment en imagerie optique à cause de la diffusion de la lumière, et donc difficile à localiser dans le corps de l'animal. Le jumelage de modalités d'imagerie complémentaires permet donc d'obtenir des images anatomiques et moléculaires superposées, mais cela s'avère toutefois relativement coûteux. Le projet présenté vise à améliorer une technique d'imagerie 2D toute optique à faible coût permettant d'obtenir une carte approximative 3D des organes internes d'une souris. Cette technique devrait permettre le recalage spatial automatique d'informations moléculaires obtenues sur le même appareil, bien que cela n'ait pas encore été démontré. L'amélioration apportée par le projet consiste à obtenir des images anatomiques 3D, plutôt que 2D, en utilisant une caméra tournante et des techniques de vision numérique stéréo. Pour ce faire, la technique existante est d'abord reproduite. Celle-ci consiste à injecter de l'ICG , un marqueur fluorescent non spécifique qui demeure confiné au réseau vasculaire une fois injecté, à une souris anesthésiée. De par leurs métabolismes distincts et le temps que met l'ICG à atteindre chacun d'eux, la dynamique de fluorescence varie entre les organes, mais demeure relativement uniforme à l'intérieur d'un même organe. Certains organes peuvent donc être segmentés par des techniques appropriées de traitement de signal, telles l'analyse en composantes principales et la régression par moindres carrés non négative. Un système d'imagerie à caméra rotative comme le QOS® de Quidd permet d'obtenir des images 2D segmentées de l'anatomie. interne de l'animal selon plusieurs plans de vue. Ces plans de vue servent à reconstruire l'information anatomique en 3D par des techniques de vision numérique. La procédure pourrait être répétée avec un ou plusieurs marqueurs fluorescents fonctionnalisés dans le but d'obtenir des images moléculaires 3D du même animal et de les superposer aux images anatomiques 3D. La technique développée devrait ainsi permettre d'obtenir à faible coût et de manière toute optique des images 3D anatomiques et moléculaires recalées spatialement automatiquement.

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Maunoury, Vincent. "Imagerie de fluorescence ph dependante en oncologie : approche experimentale chez l'animal." Lille 2, 1994. http://www.theses.fr/1994LIL2P264.

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Lauffer, Mathieu. "Reconnaissance d'organismes aquatiques envahissants par traitement d'image et imagerie de fluorescence." Thesis, CentraleSupélec, 2015. http://www.theses.fr/2015SUPL0024.

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Abstract:

Le phytoplancton joue un rôle fondamental dans le monde du vivant. C’est un générateur de dioxygène et le plus important fixateur de dioxyde de carbone sur Terre. Cependant, sous certaines conditions, son développement peut devenir envahissant et il peut être néfaste pour la santé des autres végétaux et animaux aquatiques. Il s’agit du phénomène d’hyper eutrophisation. Ce phénomène peut mener à des conséquences dramatiques pour l’environnement, car il limite les échanges de gaz et le processus de photosynthèse des autres espèces végétales. Dans un cas extrême, ce processus peut causer la mort de tout l’écosystème aquatique. Il apparait donc essentiel de renforcer la vigilance et le contrôle de la prolifération du phytoplancton et notamment de leur toxicité. Dans une première approche la reconnaissance et l’identification des organismes aquatiques, nécessaires pour la surveillance, sont réalisés par des systématiciens par observations microscopiques. Néanmoins, dans certaines circonstances, il peut être utile d’avoir un système automatique de reconnaissance pour améliorer la surveillance et optimiser l’intervention de l’homme. Le développement d’un tel système de reconnaissance des organismes aquatiques est de plus en plus envisagé.Dans l’objectif d’identifier les organismes aquatiques, un système microscopique original a été développé au cours de cette thèse dans lequel les faisceaux incident et émis sont filtrés par bande sélective de longueur d’onde. Ce double système de filtration permet l’acquisition d’images microscopiques classiques et d’images de fluorescence de la matière organique végétale sous différente illumination. Ensuite, les différentes images obtenues sont analysées et traitées par deux algorithmes de segmentation pour extraire des caractéristiques morphologiques et la composition des pigments, utilisées par la suite pour la reconnaissance automatique. Finalement, toutes les caractéristiques associant la morphologie et les données de fluorescence des espèces du phytoplancton, sont réunies dans une base de données permettant la reconnaissance optique et automatique du phytoplancton
Phytoplankton plays a fundamental role in the living world. It is a dioxygen generator and the most important carbon dioxide fixer on Earth. However, under certain conditions, its development may become so excessive that it could be harmful to other vegetal and animal aquatic life in the water ponds in which it grows: it is the “hyper eutrophication” phenomenon. Such a situation leads to dramatic consequences on environment due to the difficulties that arise for photosynthesis and gas exchanges of other plant species. At the extreme limit, this can cause the death of the whole aquatic ecosystem. It appears therefore essential to strengthen the vigilance on controlling the proliferation of plankton and toxins with the necessity of risk evaluation. In a first approach, the recognition and the identification of aquatic organisms, necessary for such a control, are usually performed only by specialists algologists from microscopic observations. Nevertheless, in certain circumstances, it may be useful to dispose of an automatic recognition system to improve the monitoring of high-risk water ponds and optimize human intervention of specialists algologists. The development of such an automatic system of recognition of aquatics organism is more and more considered.In order to identify aquatic organisms, an original optical microscopy set up was developed in which the incident and emitted light beams are filtered in wavelengths. Such a set up enables the acquisition of classical microscopic images and microscopic images of fluorescence emission of the vegetal material under different illumination. These different images are then analyzed and processed by two algorithms of segmentation to collect characteristics data of the vegetals morphology and pigments compositions useful thereafter for their automatic recognition. Finally, all these different characteristic parameters linked to morphology and fluorescence emission of the vegetal species are collected to build a database useful for automatic optical recognition

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Piraux, Hélène. "Nanoparticules magnétiques : Vectorisation par la voie principale d'acquisition du fer : Elaboration et physico-chimie." Paris 7, 2014. http://www.theses.fr/2014PA077219.

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Abstract:

En raison de leurs propriétés magnétiques, les nanoparticules d'oxyde de fer sont de plus en plus utilisées pour le diagnostic et le traitement du cancer. L'un des principaux défis des nanoparticules magnétiques en nanomédecine est leur ciblage efficace, c'est-à-dire leur administration rapide et spécifique directement dans les cellules visées. La transferrine est une des deux protéines impliquées dans la principale voie d'acquisition du fer. En effet, la transferrine interagit avec son récepteur spécifique et le couple transferrine-récepteur traverse la membrane plasmique par endocytose en quelques minutes. De plus, la surexpression du récepteur 1 dans les cellules cancéreuses favorise l'internalisation de la transferrine, ce qui en fait un cheval de Troie idéal pour le transport des nanoparticules. Dans cette thèse, des nanoparticules de maghémite de taille 5, 10 et 15 nm ont été synthétisées par le procédé polyol, fonctionnalisées avec du 3-aminopropyltriéthoxysilane et couplées à la transferrine. Pour chaque taille, le taux de greffage a été déterminé et l'interaction in vitro avec le récepteur a été étudiée. Ensuite l'étude in cellulo a été réalisée en comparant l'internalisation des nanoparticules nues ou greffées à la transferrine. L'efficacité du ciblage a été étudiée par magnétophorèse et par microscopie confocale de fluorescence. Les nanoparticules vectorisées sont rapidement internalisées dans les cellules HeLa. Ainsi une relation entre la taille des nanoparticules et leur efficacité pour la vectorisation a été. La comparaison de nos résultats avec ceux de la littérature a mis en évidence un modèle prometteur à base de nanoparticules pour des applications théraneustiques
Due to their magnetic properties, iron oxide nanoparticles are widely used for their significant role in the diagnostic and treatment of cancer. One of the main challenges of magnetic nanoparticles in nanomedicine is their effective targeting, which consists of their fast and precis( delivery directly into destination cells. Transferrin is one of the two proteins involved in the major iron acquisition pathway. Indeed, via its interaction with Receptor 1, transferrin crosses the plasma membrane within few minutes by receptor-mediated endocytosis. Furthermore, the overexpression of transferrin-receptor 1 in cancer tells enhances transferrin internalization making it a perfect Trojan horse for nanoparticles delivery. In this work, 3 different sizes of maghemite nanoparticles (5, 10 and 15 nm) were synthetized by the polyol method, coated with 3-aminopropyltriethoxysilane and coupled to transferrin. For each size, the ratio of transferrin per nanoparticle was determined and the interaction in vitro with the receptor was investigated. Then a comparative study of internalization was conducted in cellulo between raw and grafted to transferrin nanoparticles. The efficiency of the targeting was analyzed by magnetophoresis and confocal fluorescence microscopy. All grafted nanoparticles were rapidly internalized in HeLa cells. Thus a relationship between the size of th( constructs and their efficacy in nanoparticles delivery was established. A comparison of our resuits with those of the literature shows a promising model for theragnostic devices

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Kieleck, Christelle. "Imagerie de fluorescence induite par laser : application à la reconnaissance des groupes de macroalgues." Brest, 2000. http://www.theses.fr/2000BRES2049.

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Abstract:

Les techniques classiques qui donnent les cartographies des macroalgues émergées ne permettent pas de diagnostic lorsque les algues sont immergées. Une méthodologie pour l'identification des groupes (rouge, vert, brun) de macroalgues immergées est proposée. Dans un premier temps, grâce à un spectrofluoromètre, l'enregistrement des spectres de fluorescence sous forme de matrice d'excitation-émission (eem) révèle le comportement spectral des trois groupes de macroalgues et fixe les paramètres spectraux de la technique d'imagerie. Ensuite, l'imagerie de la fluorescence émise par les macroalgues, induite par laser, ajoute la dimension spatiale aux informations spectrales pour le diagnostic. Une étude systématique est effectuée en laboratoire sur des macroalgues immergées dans un aquarium et excitées par un laser accordable de type opo (oscillateur paramétrique optique) de 400 à 640 nm. Une caméra ccd intensifiée précédée d'un filtre visualise la fluorescence émise par les algues à 680 nm. L’étude précise de la série d'images de fluorescence induite est réalisée et il est démontré que seul un rapport de deux de ces images correspondant à deux longueurs d'onde d'excitation différentes permet de définir des seuillages peu sensibles à la profondeur d'eau traversée par les faisceaux lumineux. Les performances de la méthode sont validées sur plusieurs macroalgues démontrant ainsi son potentiel pour une adaptation in situ. En conclusion, nous présentons une évaluation des paramètres physiques du système d'imagerie adaptés à un diagnostic in situ.

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Le, Cardinal de Kernier Isaure. "Cytométrie par imagerie grand champ en phase et fluorescence : applications en hématologie." Thesis, Aix-Marseille, 2019. http://theses.univ-amu.fr.lama.univ-amu.fr/191018_LECARDINALDEKERNIER_341bnro964jhs311fcdqc638rrosk_TH.pdf.

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Abstract:

L’analyse de populations cellulaires sanguines permet de détecter de nombreuses pathologies cliniques. Un grand nombre de cellules doit être pris en compte de manière à obtenir un résultat statistiquement répétable, et donc un diagnostic fiable. Les systèmes équipant les laboratoires spécialisés utilisent la cytométrie de flux, les mesures sont séquentielles pour chaque paramètre et cellule. Afin d’accélérer le processus d’analyse et minimiser la complexité et le coût des dispositifs, l’enjeu est de maximiser le contenu informationnel des acquisitions, afin d’en réduire le nombre. Dans cette thèse nous étudions l’imagerie grand champ comme alternative à la cytométrie de flux. L’objectif est de développer un système optique permettant l’étude de populations cellulaires tout en préservant une résolution subcellulaire. Nous suivons une approche multi-échelle et multimodale pour détecter, caractériser et classifier les cellules sanguines. Pour évaluer la faisabilité et la pertinence clinique de la méthode, nous avons mis au point deux systèmes. Le mésoscope, basé sur des développements optiques, couple les contrastes de phase et de fluorescence. La complémentarité des critères morphologiques et de l’expression spécifique d’un fluorophore permet une classification cellulaire, afin par exemple d’évaluer le taux d’érythrocytes infectés par le parasite P. falciparum. Les résultats sont systématiquement comparés aux méthodes de références. Afin de répondre aux enjeux posés par les analyses délocalisées, nous proposons également un imageur bimodal miniaturisé, basé sur la technologie d'imagerie sans lentilles, le miniscope
Blood cell population analyses allow detecting a wide scope of clinical disorders, ranging from anemias to malaria. A very large number of cells ought to be considered so as to ensure the statistical significance of the result, and in turn, yield a reliable diagnosis. Currently, hematology analyses are based on flow cytometry techniques. High throughput is obtained at the expense of the information content of each acquisition. To reduce the time-to-result, and to minimize the complexity and cost of the systems dedicated to analyzing cell populations, the current need is to reduce the number of acquisitions and optimize the information content. This thesis focuses on single-shot image cytometry as an alternative to flow-based cytometry. It aims at obtaining a set-up based on optical contrasts for the study of large cell populations while preserving the ability to resolve individual cells. We investigate a multi-scale and multi-modal approach to detect, characterize, and classify blood cells. To evaluate the feasibility and clinical relevance of the method, we developed two proof-of-concept set-ups, respectively called the mesoscope and the miniscope. The mesoscope, based on optical developments, combines phase contrast with fluorescence. The complementarity of morphological features and the expression of specific fluorophores enables us to accurately classify blood cells, and for example assess Plasmodium falciparum parasitemia in whole blood samples. The results are benchmarked to reference techniques. However, to address the need for point of care analyses, the system should be miniaturized. Hence, we designed the miniscope, a chip-based bimodal imager

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Pliquett, Jacques. "Development of fluorescent platforms for the design of multifunctional compounds for in vitro and in vivo applications in molecular imaging." Thesis, Bourgogne Franche-Comté, 2018. http://www.theses.fr/2018UBFCK067.

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Abstract:

Cette thèse s’inscrit dans le développement et l’évaluation de nouvelles plateformesmoléculaires pour une application en imagerie optique par fluorescence. Nous avons cherché àdévelopper de nouveaux outils multifonctionnels et modifiables à façon. Cette approche estnécessaire car l’introduction d’un fluorophore peut fortement influencer les propriétés ducomposé final. Cela signifie que l’introduction du fluorophore sur l’agent sélectionné doit avoirêtre réalisé dès le départ. Pour cela deux axes principaux ont été étudiés; le premier consiste àutiliser des BODIPY pour le développement d’agents thérapeutiques traçables pour uneapplication principalement in vitro; le deuxième cible sur la conception de plateformes à based’AzaBODIPY compatibles avec l’imagerie in vivo.Dans la première partie deux fluorophores à base de 3,5-dichloro-BODIPY ont été identifiéscomme plateformes prometteurs. Ils ont été fonctionnalisés sélectivement par un agent or(I)-phosphine, un thiosucre et un phosphonium afin de pouvoir étudier l’influence du positionnementde chaque substituant sur les propriétés finales. Nous avons pu démontrer qu’unefonctionnalisation sélective et spécifique est possible avec ces substituants fragiles ; cela nous apermis de développer 12 agents théranostiques à base d’or(I). Les propriétés photophysiques etbiologiques ont ensuite été évaluées; pour cela nous avons déterminé leurs propriétés antiprolifératives (3 lignés cellulaires), la balance hydrophile, l’accumulation d’or dans les cellules etla localisation des composés des composés par microscopie confocale. Cette stratégie deplateforme multifonctionnelle nous a permis de développer un panel de composés traçables ayantdes activités mixtes ainsi que des distributions cellulaires distinctes. Cette étude a permisl’identification et la sélection de trois ou quatre composés qui feront l’objet d’une étudeapprofondie.Dans la deuxième partie de cette thèse nous avons développé des plateformes multifonctionnellescompatibles avec l’imagerie in vivo; pour cela nous avons poursuivi deux approches différentes.La première était l’utilisation de 1,7-di(phenol)3,5-di(phenyl)-azaBODIPY, suivi par safonctionnalisation sur les groupements OH afin de développer un traceur bioconjugablefluorescent dans le proche infrarouge (NIR-I). Malheureusement ce traceur possède despropriétés optiques très défavorables. Nous avons alors développé une approche innovante baséesur la fonctionnalisation de l’atome de bore. En s’appuyant sur cette approche deux traceursfortement fluorescents dans le proche infrarouge et solubles dans l’eau ont été développés. Cesfluorophores ont été conjugués sur un anticorps innovateur afin de permettre l’imagerie optiquedu ligand PD-L1. Les traceurs se sont montrés stables pour au moins 48h dans le plasma murin etpossèdent de très bonnes propriétés optiques. Comme preuve de concept nous avons conduitune étude préclinique in vivo. Cette étude a montré que les traceurs sont fortement fluorescents(NIR-I) et ne possèdent pas de toxicité imminente.La méthodologie développée pendant cette thèse présente un grand potentiel pour des étudesallant plus loin et des futures applications ; il est possible d’appliquer les principes et outilsdéveloppés sur d’autre fluorophores ; la méthodologie permet une fonctionnalisation très richeavec une grande variété de substituants d’intérêt. Son utilisation n’est pas limitée aux applicationsbiologiques, biochimiques et médicinales
The objective of this thesis was the development and evaluation of new molecular platformsfor optical fluorescence imaging applications. This work sought to develop new tools that caneasily be modified and adapted to the specific needs of the intended use. This is required asthe fluorophore will influence the final properties and should thus be incorporated beforestructural optimization of the selected agent rather than at the very end. Two main axes wereexplored; the use of BODIPYs for the development of trackable therapeutic agents that areprimarily intended for in vitro applications and the use of azaBODIPYs for the design of an invivo compatible fluorescent platform.In the first part two fluorophores on the basis of a 3,5-dichloro-BODIPY were identified aspromising platforms. These platform molecules were selectively functionalized using a gold(I)-phosphine moiety, a thiosugar and a phosphonium to explore their selective functionalizationand investigate the influence of each substitutents position on the final properties. Weshowed that a site-specific, selective functionalization with these fragile substituents ispossible and developed 12 gold(I)-bearing therapeutic agents. We evaluated thephotophysical properties of all obtained compounds which was followed by a characterizationof their biological properties (antiproliferative properties on 3 cancer cell lines, lipophilicbalance and cellular gold accumulation as well as fluorescence imaging on 3 cell lines for upto 24h). We succeeded in developing a panel of closely related trackable compounds thatdisplay mixed activity in cells and distinct cellular localization. This investigation permitted theselection of three to four hits that will be studied further.In the second part we developed an in vivo-compatible multifunctional platform following twostrategies: the first was the use of 1,7-di(phenol)-3,5-di(phenyl)-azaBODIPY and thefunctionalization of the hydroxy groups for the development of a bioconjugable NIR-I probe.Unfortunately the developed probe displayed very unfavourable optical properties; wetherefore developed a new strategy that is entirely based on the functionalization of the boronatom. Using this approach we successfully synthesized 2 watersoluble, strongly fluorescent(NIR-I) molecular platforms that were conjugated to an innovative antibody to image the PD-L1 ligand. The developed probes displayed excellent optical properties, are stable for at least48h in mice plasma and were validated in a preclinical study on mice. The developed probesdisplayed strong fluorescence in vivo and showed no acute toxicity.The developed methodology shows great potential for further investigations and futurestudies; it can be transposed onto other closely related fluorophores and permits versatilefunctionalization with a large variety of compounds of interest. Its use is thus not limited tobiological, biochemical and medical applications

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Nguyen, Anh Dung. "Amélioration de la résolution spatiale en microscopie multiphotonique par saturation de la fluorescence." Doctoral thesis, Universite Libre de Bruxelles, 2015. http://hdl.handle.net/2013/ULB-DIPOT:oai:dipot.ulb.ac.be:2013/221923.

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Abstract:

-------------------------------Abstract--------------------------------Since the prediction by Maria Göppert-Mayer in the thirties of the possibility for a fluorescent molecule to be simultaneously excited by multiple photons and, more recently, the development of pulsed lasers, multiphoton microscopy has gradually evolved to finally become one of the most used fluorescent imaging techniques for the studies of thick scattering tissues or for in vivo observations of animals. Either for neurological, physiological or morphological studies, the non invasiveness and the limitation of the excited volume to the focal volume have made this fluorescence microscopy technique an essential tool for biologists.However, in a world where the biological studies always require better microscopes and where there is always a need for the spatial resolution to be improved, it is essential to offer techniques allowing to obtain a better resolution in the three dimensions and to access resolution beyond the diffraction limit defined by Ernst Abbe more than a century ago. In this thesis, the saturated excitation of fluorescence technique is adapted to multiphoton microscopy. This method achieves super-resolved images by temporally modulating the excitation laser-intensity and by demodulating the higher harmonics from the saturated fluorescence signal. As a proof of principle, the improvement of the lateral and axial resolution has been measured on a sample of fluorescent microspheres. While the third harmonic already provides an enhanced resolution, we show in this work that a further improvement can be obtained with an appropriate linear combination of the demodulated harmonics.In the end, a near twofold improvement of the resolution has been obtained in the lateral but also in the axial directions. This improvement is in agreement with the estimated resolution improvement predicted in the theoretical and the mathematical analysis of the technique carried out in this work.We also present in vitro imaging of fluorescent microspheres incorporated in HeLa cells. Enhancements of lateral and axial resolution has been observed, showing that this super-resolution technique performs well in biological samples.Finally, the strengths and weaknesses of the technique have also been analysed and detailed to see in which niche in the world of biological imaging this method can find its place. To this end, its characteristics are compared to other super-resolution and super-localisation techniques that have been previously studied in this thesis.It points out that the imaging depth, the non invasiveness and the relatively low illumination power on the samples but also the limitation of the excited volume in multiphoton microscope coupled with the simple and cost-effective implementation as well as the relatively low illumination power on the sample used in the saturated excitation technique make this method an excellent candidate for deep in vivo studies trough scattering tissue like the skin.
-----------------------Résumé-----------------------Depuis la prédiction de Maria Göppert-Mayer dans les années 30 de la possibilité pour une molécule fluorescente d'être excitée simultanément par plusieurs photons et, plus récemment, depuis le développement des lasers pulsés, la microscopie multiphotonique s'est peu à peu développée pour finalement s'imposer aujourd'hui comme un des outils d'observation par fluorescence les plus performants pour les études de tissus épais diffusants, ou encore pour l'observation in vivo d'animaux. Que ce soit pour des études neurologiques, physiologiques ou morphologiques, l'aspect non invasif et la limitation du volume excité au volume focal ont rendu cet outil de microscopie indispensable aux biologistes.Cependant, dans un monde où les études biologiques nécessitent toujours de meilleurs microscopes et où la résolution spatiale en particulier doit toujours être améliorée, il convient de proposer des techniques permettant d'obtenir une meilleure résolution dans les trois dimensions et d'aller au-delà de la limite de diffraction définie par Ernst Abbe il y a plus d'un siècle.Dans cette thèse, la technique de saturation de l'excitation de la fluorescence est adaptée à la microscopie multiphotonique. Cette méthode permet d'obtenir des images de superrésolution en modulant temporellement l'intensité laser d'excitation et en démodulant les harmoniques supérieures présentes dans le signal saturé de fluorescence. La démonstration de principe sur des microsphères fluorescentes a été réalisée montrant une amélioration de la résolution latérale et axiale. Alors que l'utilisation de la troisième harmonique produit déjà une meilleure résolution, ce travail de thèse montre qu'une amélioration supplémentaire peut être obtenue en utilisant une combinaison linéaire particulière des harmoniques démodulées.Au final, un quasi doublement de la résolution a pu être observé tant dans les directions latérales que dans la direction axiale. Cette amélioration correspond à l'amélioration prédite dans l'analyse théorique et mathématique réalisée également dans ce travail.De plus, le passage aux études in vitro a été réalisé avec succès en observant des microsphères fluorescentes incorporées dans des cellules HeLa. Des améliorations de la résolution latérale et axiale ont également été observées montrant que cette technique de superrésolution peut être appliquée à l'étude d'échantillons biologiques. Les forces et les faiblesses de cette méthode sont également analysées et détaillées afin de voir dans quel créneau d'études biologiques la technique de saturation de l'excitation de fluorescence pourrait se faire une place. A cette fin, ses caractéristiques sont comparées aux autres méthodes de superrésolution et de superlocalisation détaillées dans la première partie de ce travail.Il en resort que l'importante profondeur d'imagerie, l'aspect non invasif et la limitation du volume excité de la microscopie multiphotonique couplés à la simplicité d'implémentation et les relativement faibles puissances utilisées pour saturer l'excitation font de cette technique un excellent candidat pour des études in vivo dans des zones en profondeur dans des milieux diffusants comme la peau.
Doctorat en Sciences de l'ingénieur et technologie
info:eu-repo/semantics/nonPublished

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Salomé, Rémi. "Imagerie rapide et suivi de l'activité de réseaux de neurones en microscopie à deux photons." Université Louis Pasteur (Strasbourg) (1971-2008), 2004. http://www.theses.fr/2004STR13063.

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Loison, Olivier. "Imagerie plasmonique multimodale en vue d'applications biomédicales." Paris 7, 2013. http://www.theses.fr/2013PA077102.

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Abstract:

Les plasmons de surface sont des modes d'oscillation collectifs des électrons de conduction à l'interface entre métal et diélectrique. La plasmonique est un domaine de l'optique basé sur les propriétés de confinement et d'exaltation du champ électromagnétique offertes par ces modes. La plasmonique est en particulier utilisée dans les biocapteurs en permettant de quantifier et de suivre la dynamique d'interaction de biomolécules. La spécificité de ces capteurs dits à résonance de plasmon de surface, connus sous l'acronyme anglais SPR, est qu'ils ne nécessitent aucun marquage. La sensibilité de la SPR repose sur la forte dépendance des conditions de résonance à l'indice de réfraction local du diélectrique étudié. En particulier, l'indice de réfraction varie en fonction de la concentration en biomolécules à la surface du capteur. Nous proposons ici un dispositif original en transmission (tSPR) préservant la forte sensibilité caractéristique de la SPR standard. Nous montrons que cette configuration permet une haute densité de parallélisation des mesures. Le multiplexage offert par la tSPR est supérieur d'environ un ordre de gràndeur à celle de la SPR classique. Le plasmon de surface propagatif (PSP) est associé à un champ évanescent. L'intensité élevée du champ et son fort confinement axial ont été récemment mis à profit dans des expériences d'imagerie de fluorescence médiée par les plasmons de surface (SPF). De plus, la présence d'une interfade métallique au voisinage d'un fluorophore induit de nouveaux mécanismes de relaxation, notamment via le plasmon de surface, provoquant une chute abrupte de la durée de vie de fluorescence. L'information de durée de vie peut être extraite à l'aide d'un microscope d'imagerie de temps de vie de fluorescence (FLIM). Nous montrons que l'imagerie FLIM couplée avec des plasmons de surface permet obtenir une mesure nanométrique de la distance métal-fluorphore. Nous montrons qu'un tel dispositif est adapté à la tomographique de membrane plasmique sur des cellules avec une résolution axiale de l'ordre de 15 nm
Surface plasmons are collective oscillation modes of the conductive electrons at the interface between a metal and a dielectric. Plasmonic is a field of optics based on the properties of containment and exaltation of the electromagnetic field given by this mode. Plasmonics is particulary used in biosensors to quantify and to follow interaction dynamic between biomolecules. The specificity of these sensors named Surface Plasmon Resonance (SPR) is their unstrained characteristic. SPR sensitivity relies on the strong dependence of the resonance conditions to the refractive index of the studied dielectric. In particular, the refractive index depends on the biomolecules concentration at the sensor surface. Here, we suggest to use an original device in transmission (tSPR) preserving the strong sensitivity characteristic of standard SPR. We show that this configuration allows a high parallelization density of measurement. Multiplexing given by tSPR is around one order of magnitude more than the one of classical SPR. Propagative surface plasmon (PSP) is associated with an evanescent field. The high intensity of the field and its strong axial confinement have been recently been used in Surface Plasmon mediated Fluorescence (SPF) imaging. Moreover, the presence of a metallic interface in the vicinity of a fluorescent dye induces new relaxation processes, especially via the surface Plasmon, producing a sharp decrease of the fluorescence lifetime. Lifetime information can be extract with a fluorescence lifetime imaging microscope (FLIM). We show that FLIM imaging coupled with surface Plasmon provides nanometric accuracy of the dye-metal distance. We show that such a device is adapted to plasmic membrane tomography with an axial resolution about 15 nm

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Montcuquet, Anne-Sophie. "Imagerie spectrale pour l'étude de structures profondes par tomographie optique diffusive de fluorescence." Phd thesis, Université de Grenoble, 2010. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00557141.

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Abstract:

L'imagerie optique de fluorescence permet de localiser des cibles biologiques comme des tumeurs, marquées par des fluorophores. Pour des applications au diagnostic chez l'Homme où l'épaisseur des tissus atteint plusieurs centimètres, la détection parasite de l'autofluorescence naturelle des tissus compromet la détection de la fluorescence d'intérêt et son élimination est la condition sine qua non d'une localisation correcte de la tumeur. L'objet de cette thèse a été l'étude spectrale de l'auto fluorescence des tissus et la mise au point d'une méthode de séparation de spectres aveugle permettant de supprimer sa contribution des mesures. La Factorisation en Matrices Non-négatives a été privilégiée, et de nouveaux algorithmes ont été proposés et testés sur données réelles. Nous avons démontré les performances de notre méthode dans l'amélioration de la détection des marqueurs et la reconstruction de la position de la tumeur en tomographie optique diffuse de fluorescence.

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Bernardin, Aude. "Méthodes biocompatibles de fonctionnalisation de substrats et surfaces : évaluation par imagerie de fluorescence." Paris 11, 2009. http://www.theses.fr/2009PA112255.

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Abstract:

Ces travaux de thèse portent sur le développement de méthodes de fonctionnalisation compatibles avec le vivant et s’inscrivent dans un vaste domaine d’applications biomédicales. Une nouvelle méthode de couplage en conditions douces entre nitrones et cycloalcynes contraints a été développée par analogie avec la réaction de cycloaddition [3+2] entre cycloalcynes contraints et azotures existant dans la littérature. L’évaluation des couplages avec les azotures ou les nitrones a été réalisée par imagerie de fluorescence grâce à la synthèse de deux sondes portant des groupes cyclooctynes, l’une organique et l’autre à base de nanocristaux semi-conducteurs fluorescents. A cette occasion, nous avons montré l’intérêt de la fonctionnalisation de ces objets en l’absence de cuivre, qui permet de maintenir un rendement quantique de fluorescence élevé, contrairement à la chimie clic classique (catalysée au cuivre). Des lames de verre portant des azotures ou des nitrones ont également pu être fonctionnalisées par les sondes-cycloalcynes. Le marquage des acides sialiques membranaires in vitro après incorporation métabolique de mannosamines modifiées a finalement permis de valider le concept en conditions biologiques
This work describes the development of biocompatible functionalisation methods of wide interest in the field of biomedical applications. A new water-compatible coupling method between nitrones and strained-cycloalkynes is here developed, by analogy with the [3+2] cycloaddition between azides and strained-cycloalkynes described in the literature. The efficiency of the coupling is evaluated by fluorescence imaging. Two fluorescent probes bearing cyclooctyne groups are synthesized, an organic dye-based probe and a quantum dotbased probe. Contrary to Cu(I)-catalyzed click chemistry, the developped methodology enables quantum dots’ functionalization while maintaining their high fluorescence quantum yield. Glass slides have also been coated with azides or nitrones, surfaces on which can be subsequently grafted cyclooctyne-probes. Fluorescent labelling of cell membrane’s sialic acids after metabolic incorporation of modified mannosamines has also been carried out in vitro to confirm the potential interest of strained-alkyne chemistry in biological conditions

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Maréchal, Xavier. "Mise en oeuvre d'une technique de cartographie du pH tissulaire par imagerie fluorescence." Compiègne, 2000. http://www.theses.fr/2000COMP1274.

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Abstract:

En dépit des traitements thérapeutiques complexes et coûteux, la mortalité des états infectieux graves et notamment de l'état de choc septique reste élevée. Des travaux de la littérature, il apparaît que la détection précoce des évènements induits par l'hypoxie tissulaire, complication directe de ces états, pourrait être une alternative à l'établissement de l'état de choc et à ses complications les plus graves. Ces mêmes travaux ont permis d'identifier le territoire gastro-intestinal comme le canari de l'organisme et le pH intra muqueux (pHim) comme un paramètre clef d'appréciation de la souffrance tissulaire. Cependant, les techniques conventionnelles, tonométrie et microélectrodes ne permettent guère ce genre d'investigations en raison de résolutions spatiales et temporelles inadaptées. Parallèlement, les techniques optiques de fluorescence, techniques permettant la quantification de nombreux paramètres de manière non traumatique avec une sensibilité élevée ont connu un essor important dans le domaine biomédical. Ainsi, de nombreuses études présentent des techniques de détermination du pH par fluorescence et ce, dans une multitude de configurations. Ainsi et par rapport à la problématique posée et à l'avènement de ces techniques de fluorescence, l'idée du travail était de mettre en œuvre une technique de cartographie in vivo du pHim par imagerie de fluorescence. La mise en œuvre d'une technique nouvelle passe par deux étapes fondamentales : la caractérisation de la chaîne de mesure et la validation de cette technique par rapport à La réalisation de ces deux étapes nous a permis d'une part de mettre en œuvre cette technique de cartographie in vivo du pHim sur un modèle animal de rat, et d'autres par de valider cette technique par rapport à notre méthode de référence. Nous avons dès lors montré que la technique d'imagerie de fluorescence présentait des caractéristiques métrologiques très nettement supérieures aux techniques conventionnelles en terme de résolution spatiale, de résolution temporelle, de reproductibilité et de précision. De plus, par la facilité de transposition de cette méthode à d'autres organes, d'autres paramètres et d'autres configurations (endoscopie), cette technique d'imagerie de fluorescence apparaît infectieux comme un atout majeur pour la détection des événements précoce induits par les états infectieux
Actually, the mortality rate of septic shock stays important and tissue hypoxia is the major complication of this pathology. Referring literature, measurement of gastro intestinal intramucosal pH (pHim) has been recognized as an important factor in the detection of hypoxia induced dysfonctions. However, current pH measurements techniques are limited in terms of time and spatial resolutions. A major advance in accurate pH measurement was the development of the ratiometric fluorescent indicator dye, 2',7'-bis(carboxyethyl)-5,6-carboxyfluorescein (BCECF). Then, the aim of this study was to setup an in vivo pH measurement technique using BCECF fluorescence imaging. The setup of a new measurement technique is pertormed with two steps: the characterization of the instrumentation and the validation referring a gold standard. These two steps have allowed the setup of the in vivo cartography of pHim using fluorescence imaging and have allowed the validation referring a pH microelectrode. We have then show the feasibility of the intestinal pHim determination and that it is sensitive for in vivo pH determination. Moreover, this fluorescence technique presents a considerable improvement in resolutions compared to current pH measurements techniques. At last, easily transposable to endoscopic measurement, this technique is really interesting for clinical investigations and can be a great advance for early diagnosis of hypoxia induced dysfunction's

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Bsaibess, Talia. "Nanoparticules organiques ultra-brillantes pour l'imagerie biologique." Thesis, Bordeaux, 2015. http://www.theses.fr/2015BORD0055/document.

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Abstract:

Les nanoparticules inorganiques luminescentes ont suscité un intérêt croissant au cours des dernières décennies, notamment pour leur application en imagerie biologique. Un certain nombre d’entre elles présentent toutefois des limitations telles que toxicité, absence de biodégradabilité, faible brillance, clignotements…. Dans cette optique, les nanoparticules fluorescentes à base de petites molécules organiques (FONs) offrent une solution alternative prometteuse aux nanoparticules inorganiques pour l'imagerie biologique. Le principal défi réside dans l'élaboration des nanoparticules organiques possédant une brillance élevée, une bonne stabilité dans l'eau (y compris en milieu biologique), une bonne biocompatibilité ainsi qu'une émission accordable dans le visible et au-delà dans le proche infrarouge (pour une détection plus aisée en milieu diffusant). Dans cette optique, nous avons utilisé une stratégie basée sur l’utilisation de chromophores dipolaires de type "push pull" « adaptés ». Au cours du travail, la synthèse de séries de chromophores homologues bâtis sur le même système conjugué et ayant en commun un groupe donneur de type triphénylamine (destiné à préserver les propriétés de luminescence) présentant ou non des motifs encombrants positionnés a été réalisée. Les nanoparticules correspondantes ont été préparées selon un protocole classique, simple et rapide à mettre en oeuvre (précipitation). L’étude des propriétés photophysiques des nanoparticules organiques fluorescentes ainsi obtenues a été réalisée et mise en perspective avec celles des chromophores en solution dans des solvants organiques de polarité variable. Une étude systématique de l’évolution dans le temps des propriétés optiques des nanoparticules organiques a été réalisée permettant de mettre en lumière des relations entre la structure des sous-unités chromophoriques et la stabilité colloïdale et « optique » des nanoparticules. Ces études ont permis d’identifier des nanoparticules émettant dans le proche infrarouge extrêmement brillantes et présentant une stabilité colloïdale remarquable dans l’eau, une photostabilité accrue et une très bonne biocompatibilité. De ce fait, ces nanoparticules ont pu être utilisées avec succès dans l'imagerie biologique des cellules et le suivi (tracking) à l'échelle de la particule unique, démontrant l'intérêt de la démarche d'ingénierie mise en oeuvre
During the last decades, luminescent inorganic nanoparticles have attracted a large interest in different fields including biological imaging. However, a number of them have drawbacks such as toxicity and absence of biodegradability. Recently, molecular-based fluorescent organic nanoparticles (FONs) have emerged as a promising alternative to inorganic nanoparticles for bioimaging. The main challenge lies in the elaboration of organic nanoparticles that combine large brightness, good colloidal stability in biological environments) and biocompatibility as well as NIR emission (to allow improved detection in thick tissues). To achieve this objective, we have implemented a molecular engineering strategy based on dedicated polar and polarizable "push pull" chromophore built from a triphenylamine donor moiety and a specific pi-conjugated system. The corresponding nanoparticles were readily prepared by the reprecipitation method. In the present manuscript, the synthesis of the chromophores and the preparation and characterization of the organic fluorescent nanoparticles is described. A comprehensive investigation of their photophysical properties and study of their colloidal stability is presented allowing to derive structure-property relationships. The implemented study led to innovative NIR-emitting nanoparticles combining large brightness (superior to those of QDs and NIR-emitting organic dyes), remarkable colloid stability and suitable photostability. These nanoparticles have been successfully used for single particle tracking and imaging in cells, while no toxic effect was observed

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PAGNOT, THIERRY. "Etude temporelle de l'extinction de fluorescence induite par transfert d'energie interloleculaire imagerie en champ proche du temps de declin de fluorescence." Besançon, 1997. http://www.theses.fr/1997BESA2020.

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Abstract:

Lorsqu'un centre fluorescent (molecule, ion, atome,. . . ) dit donneur, est place a quelques nanometres de distance d'un accepteur (souvent metallique), on observe un phenomene d'extinction de fluorescence induit par un processus de transfert d'energie intermoleculaire de telle sorte que les caracteristiques intrinseques de fluorescence du centre emetteur (temps de declin, efficacite quantique) sont modifiees. La mesure du temps de declin de fluorescence permet alors d'obtenir des informations precises sur la nature du chromophore, sur son environnement mais egalement sur les distances intermoleculaires qui le separent de ses voisins. Ce manuscrit decrit la physique des phenomenes observes et presente des applications experimentales originales en microscopie champ proche. Les problemes inherents aux etudes locales sont traites tels que le phenomene de photoblanchiment et les methodes de detection et de mesure du signal. On s'attache a la realisation et la caracterisation d'un banc d'analyse permettant l'etude, en microscopie champ proche, d'echantillons fluorescents (couches minces polystyrene dopees par des chelates d'europium). Ces derniers, realises par la methode dite de spin coating, font l'objet d'une etude particuliere permettant de les caracteriser optiquement et mecaniquement. Des premiers resultats originaux sont obtenus en champ proche, avec une configuration en reflexion (la meme sonde excite et capture le signal de fluorescence), avec une mesure temporelle : mise en evidence de l'extinction de fluorescence induite par une sonde semi-metallisee approchee de la surface d'un echantillon fluorescent. Images rendant comptes du transfert d'energie local d'une couche mince fluorescente au substrat metallique non uniforme sur lequel elle est deposee.

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Faucon, Adrien. "Nanomatériaux moléculaires fluorescents et magnétiques pour la bio-imagerie multi-échelle." Nantes, 2014. http://archive.bu.univ-nantes.fr/pollux/show.action?id=19e2fb12-75a7-4527-a030-3b8b6c2acd4a.

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Abstract:

L’objectif de ces travaux de thèse repose sur l’élaboration, les études structurales et physico-chimiques de nanomatériaux combinant propriétés d’émission sous excitation à un ou deux photons, et magnétisme. L’association de ces deux propriétés distinctes, fluorescence et magnétisme, permettent d’aboutir à des objets bimodaux, très sollicités pour des applications autant en bio-imagerie, dans le traitement par hyperthermie de cellules cancéreuses que dans celui du stockage optique. Ces objets bimodaux sont réalisés par auto-assemblage de nanoparticules superparamagnétiques d’oxyde de fer avec des composés organiques fluorescents aptes à former des nanosphères par nano-précipitation, conduisant à des nano-assemblages de type coeur-coquille. Le développement et les études de nano-objets organiques, composés de petites molécules, est en pleine expansion grâce à leur forte densité en unités actives. Toutefois, à notre connaissance, ce type d’association non covalente entre un coeur organique fluorescent non dopé et une coquille de nanoparticules d’oxyde de fer n’a été que rarement étudié. Avant d’utiliser ces nano-objets magnéto-fluorescents, il est nécessaire de mener au préalable une analyse complète des propriétés photophysiques des composés émissifs en solution comme à l’état solide. Une fois obtenus et stabilisés en milieu physiologique, ces nano-assemblages seront utilisés pour des études en imagerie biologique, tant in vitro qu’in vivo, en portant une attention toute particulière au devenir des objets ainsi qu’à leur bio-distribution
The aim of this PhD work deals with the development, the structural and physico-chemical characterizations of nanomaterials which can combine emission properties after excitation using one or two photons, and magnetism. The association of these two distinct properties, fluorescence and magnetism, allowed us to obtain bimodal functional materials. Over the past years, this kind of nano-objet has raised a large interest in bio-imaging, cancer treatment using hyperthermia, as well as in optical data storage. The bimodal nanomaterials are elaborated by self-assembling iron oxide nanoparticles with small organic fluorophores able to form nanospheres upon nano-precipitation, yielding core-shell nanoassemblies. The development and studies of organic nano-objects, based on small molecules, represent an expanding field, mainly due to the high density of active units. To the best of our knowledge, this tight non-covalent association between a non-doped fluorescent core and a shell composed of iron oxide nanoparticles has never been studied. Before using such magneto-fluorescent nanoassemblies, several studies have to be performed in order to fully understand and characterize the photophysical properties of the fluorophores in solution as well as in the solid state. After a stabilization process compatible with physiological conditions, the resulting nanoassemblies will be used for in vitro and in vivo bioimaging studies. The studies of the biodistribution and the possible degradation of the assemblies will also be performed

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Tian, Yayang. "Elaboration of New Layer by Layer (LbL) Fluorescent thin films and their functionalization for the sensitive detection of bacteria." Thesis, Université Paris-Saclay (ComUE), 2018. http://www.theses.fr/2018SACLN029/document.

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Abstract:

Les antibiotiques ont été utilisés pour le traitement des infections bactériennes depuis plus de 70 ans, sauvant des millions de vies. Cependant, leur mauvaise et sur-utilisation ont conduit à l’émergence de la résistance bactérienne. Outre le développement de nouvelles familles d'antibiotiques, la détection rapide et sensible de bactéries est très importante pour le diagnostic médical. Les polymères fluorescents représentent un grand potentiel, car ils sont faciles à fonctionnaliser, synthétiser et greffer. Les films sont plus pratiques, faciles à manipuler et peuvent être réutilisés, ce qui n'est pas le cas des méthodes de détection en solution. L’objectif de ce travail est de développer un film de polymère nanostructuré fluorescent et sensible sur des surfaces de verre pour la détection bactérienne. Sur la base de la méthode de polymérisation radicalaire par transfert de chaîne réversible par addition-fragmentation (RAFT), trois types de polyélectrolytes fluorescents à base de BODIPY (FPC) ont été synthétisés : des chaînes relativement courtes à caractère polyélectrolyte faible (SW FPC), des chaînes courtes à caractère polyélectrolyte fort (SS FPC) et enfin des chaînes longues à caractère polyélectrolyte faible (FPC LW). Les films FPC LbL ont été élaborés sur des lames en verre par interaction électrostatique. Les propriétés photophysiques et de surface des FPC LbL ont été contrôlées en ajustant les conditions de dépôt. Les films FPC LbL à base de BODIPY ont été utilisés comme dispositif de première génération pour la détection de E. coli. Dans l'étape suivante, la sensibilité des films a été augmentée en utilisant le principe de fluorescence exaltée par plasmon (Metal Enhanced Fluorescence MEF). Un film LbL -MEF a été préparé et testé pour la détection de bactéries. Des nanoparticules d'or sphériques (Au NPs) ont été synthétisées et recouvertes de poly(chlorhydrate d'allylamine) (PAH). Le FPC LW a été sélectionné comme couche fluorescente. Différents films contenant des Au NPs et LW FPC- ont été fabriqués. La distance entre les NPs Au et LW FPC- a été ajustée par l'ajout de deux polymères de charge opposée (PC + et PC-). Les deux surfaces de AuNP / 4 couches PC / LWFPC- et Au NPs / 8 couches PC / LWFPC- ont montré que E. coli peut être ciblée par LW FPC-.La sélectivité des films LbL a été ajoutée en introduisant un anticorps comme site de reconnaissance spécifique. Le polyanion et le polycation avec le groupe fonctionnel 4-dibenzocyclooctynol (DIBO) ont été assemblés sur des lames de verre activées. L'anticorps anti-E. coli a ensuite été introduit sur la surface en une seule étape via la réaction de cycloaddition azide-alcyne (SPAAC). Le nombre d'E. coli capturées dépend de la concentration d’anticorps sur la surface. La surface a montré une sélectivité significative pour E. coli, comparée à B. subtilis.La croissance bactérienne peut être détectée sur un film mince LbL en introduisant un fluorophore sensible au pH (fluorescéine). En effet, la croissance des bactéries est souvent associée à une diminution du pH du milieu due à une libération de métabolites acides. Nous avons préparé avec succès différents types de films LbL sensibles au pH. Dans un premier temps, la synthèse de différents polyanions fonctionnalisés (chaîne courte et longue de DIBO-PC et polymère fluorescent rouge) a été achevée. Ensuite, trois types de surfaces sensibles au pH contenant de la fluorescéine (DIBO-SWPC- / fluorescéine, DIBO-LW PC- / fluorescéine et ratiométrique RFPC- / fluorescéine) ont été préparés sur la base d'assemblage LbL et de chimie click. Enfin, trois surfaces sensibles au pH ont été étudiées pour la détection de la croissance des bactéries. Toutes les surfaces étaient biocompatibles, le nombre de E. coli augmentait même après plusieurs heures d'incubation sur chaque surface. La détection par le changement de fluorescence est en cours de développement
Antibiotics have been used for the treatment of bacterial infections for over 70 years, saving millions of lives. The current antibiotic resistance crisis has been attributed to the overuse and misuse of these medications. Therefore, the prevention of infection transmission by the rapid and sensitive detection of antibiotic resistant strains is needed in managing this crisis. Fluorescent polymers show great potential for bacteria detection, because they are easy to functionalize, reproduce and graft. Compared with the methods used for bacterial detection in liquid, bacterial detection on a film surface is more convenient, easier to handle and is applied in devices that can be easily reused. The goal of my PhD work is to develop fluorescent and sensitive nanostructured polymer films on surfaces for bacterial detection. Three types of BODIPY-based fluorescent polyelectrolytes (FPC) with different features were synthetized based on reversible addition-fragmentation transfer (RAFT) polymerization: relatively Short chains and Weak polyelectrolytes (SW FPC), Short chains and Strong polyelectrolytes (SS FPCs) and Long chains and Weak polyelectrolytes (LW FPCs). FPC LbL films were fabricated on activated glass slides by means of electrostatic attraction. The photophysical and surface properties of FPC LbL fims were easily controlled by adjusting the deposition conditions.The following step aimed at increasing the films’ sensitivity by using the metal-enhanced fluorescence (MEF) principle. A MEF based LbL film was prepared and tested for bacteria detection. Spherical gold nanoparticles (Au NPs) were synthesized and coated with poly(allylamine hydrochloride) (PAH). The LW FPC- was selected as the fluorescent layer. Different films containing Au NPs and LW FPC- were fabricated and the distance between the Au NPs and LW FPC- was adjusted by changing the numbers of layers with two oppositely charged polymers (PC+ and PC-). Both Au NPs/4 layers PCs/LWFPC- and Au NPs/8 layers PCs/LWFPC- surfaces indicated that E. coli can be detected by LW FPC-.The selectivity of LbL films was added by introducing an antibody on the surface of the film to provide specific recognition of a chosen bacterial strain. This LbL surface achieved a rapid, effective and specific detection of E. coli bacteria. The polyanion and polycation with a 4-dibenzocyclooctynol (DIBO) functional group were assembled on the activated glass slides and an anti-E. coli antibody containing an azide group was efficiently introduced on the surface in a single step based on the azide-alkyne cycloadditions (SPAAC) reaction. The number of E. coli captured on the surface was shown to be dependent on the amount of antibody on the surface. The anti-E. coli antibody surface showed significant selectivity for E. coli, compared with B. subtilis. An alternative approach is to detect bacterial growth on thin LbL film by introducing pH sensitive fluorophore (fluorescein). The growth of bacteria is often associated with a decrease in pH of the growth medium due to a release of acidic metabolites. Different types of pH sensitive LbL film were prepared and tested for the detection of bacterial growth. Firstly, the synthesis of different functionalized polyanions (short and long chain of DIBO-PC- and red fluorescent polymer) was carried out. Three types of pH sensitive surfaces containing fluorescein (DIBO-SWPC-/fluorescein, DIBO-LW PC-/fluorescein and ratiometric RFPC-/fluorescein surfaces) were prepared based on the combination of LbL assembly and copper-free click chemistry. Finally, three pH sensitive surfaces were studied for bacteria growth detection. All the surfaces were shown to be biocompatible, the number of E. coli increased after several hours of incubation on each surface, as detected by brightfield microscopy imaging. The application for the fluorophore-dependent detection of bacterial growth remains to be developed

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Hernandez, Mier Yahir Wolf Didier Blondel Walter. "Construction rapide d'images panoramiques applicables à l'exploration cystoscopique et à l'endoscopie de fluorescence en cancérologie." S. l. : INPL, 2007.

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Dorval, Paul. "Miniaturisation des technologies d'imagerie de fluorescence pour assister la chirurgie mini-invasive." Thesis, Strasbourg, 2015. http://www.theses.fr/2015STRAD005/document.

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Abstract:

L’imagerie de fluorescence est une technique d’imagerie médicale permettant de visualiser l’émission d’un traceur, ou fluorophore, à l’aide d’une excitation de type Laser ou LED. Les domaines d’application de la technologie sont la chirurgie oncologique, la chirurgie reconstructive ou encore la chirurgie cardiaque. Bien que les besoins en chirurgie ouverte soient importants, l’évolution des pratiques tend à démocratiser la chirurgie dite minimalement invasive. La chirurgie endoscopique va dans ce sens, le but étant de limiter les traumatismes opératoires rencontrés en chirurgie ouverte. Parmi les avantages de cette techniques on note une diminution des saignements et de la douleur, ou encore une réduction de la durée d’hospitalisation.Lors d’une intervention de type chirurgie ouverte, le praticien peur se contenter de la seuls information de fluorescence fournie par le système d’imagerie. Cependant, tout l’enjeu de l’imagerie de fluorescence pour la chirurgie mini-invasive est de venir greffer ne information relative au fluorophore sur une image couleur de très bonne qualité, essentielle au chirurgien. Pour une première évaluation, un système deux caméras a été réalisé. Un capteur est dédié à l’acquisition de l’image couleur et un autre à l’information de fluorescence. Cependant, notamment pour conserver pour conserver un système compact et proposer la meilleure ergonomie possible au chirurgien, l’endoscope final ne devra comporter qu’un seul imageur. Le principe de base est d’utiliser des impulsions de lumière d’excitation et de lumière blanche afin de séquentiellement acquérir les données de fluorescence et les images couleur. Il convient ensuite de traiter les informations recueillies pour reconstruire l’image désirée en temps réel
Fluorescence image-guided surgery is a medical imaging modality which allows the surgeon to visualize a fluorescent probe previously injected to the patient. The probe could be specific or not and the technology is useful in a wide range of application from oncologic procedures to reconstructive surgeries or cardiac procedures. Despite the important needs of this technology in open-procedures, the surgery in general is more and more minimally invasive. The goal of mini-invasive surgery is to limit patient's per and post operation trauma. The advantages of the technique are a decrease of bleeding and pain and a decreasing hospitalization time.During an open surgery, the B&W fluorescence information given by the fluorescence image-guided surgery system is enough for the surgeon. For mini-invasive procedures, the in-game is to overlay the fluorescence information to high quality color image, compulsory for the surgeon to perform his procedure. As a first evaluation, a 2-sensors system has been rapidly developed. One sensor is dedicated to the acquisition of the color image and the other to the fluorescence information. In order to make the system more compact and improve the quality of the color image furnished to the surgeon, the final system should be composed of only one sensor. To create the color image and collect the fluorescence information with one sensor, the technique involved pulsed white light and excitation light in a sequential acquisition mode. The two information are combined and a real-time color plus fluorescence video is displayed to the surgeon

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Rémond, Maxime. "Développement de nouveaux chromophores dipolaires pour l'imagerie de fluorescence et l'imagerie photoacoustique." Thesis, Lyon, 2018. http://www.theses.fr/2018LYSEN062.

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Abstract:

Cette thèse traite de la conception, la synthèse et la caractérisation de chromophores dipolaires D-π-A pour l’imagerie de fluorescence et l’imagerie photoacoustique.La première partie est consacrée à la synthèse et à l’étude de nouveaux fluorophores émettant à l’état solide dans le proche infrarouge, pour l’imagerie de fluorescence biphotonique. Afin d’améliorer les propriétés optiques à l’état solide, nous avons exploré différentes pistes en modifiant d’abord le groupement D donneur d’électron, puis le groupement A accepteur et enfin le pont π conjugué de nos structures dipolaires.La seconde partie concerne l’imagerie photoacoustique. Cette imagerie, basée sur une excitation optique et une détection acoustique, nécessite une forte absorption dans le proche infrarouge. Une des stratégies pour effectuer ce décalage bathochrome de l’absorption a été incorporation de groupements thiophènes à faible aromaticité, afin d’augmenter la délocalisation du système π. Parallèlement, nous avons aussi étudiés des hémicyanines, présentant de fortes absorptions au-delà de 650 nm.Enfin, les colorants ont été formulés en nanoparticules organiques afin d’acquérir une solubilité aqueuse pour leur application en imagerie. Deux types de nanoparticules ont été étudiés : la nanoprécipitation des colorants en présence d’un agent tensioactif, ainsi que l’encapsulation des colorants dans une matrice polymérique amphiphile stabilisée par une couche de silice. Les meilleurs chromophores ont permis l’acquisition d’images de cellules par microscopie biphotonique ainsi que d’images photoacoustiques de circuits microfluidiques et de la microvascularisation de souris in vivo
This thesis is focused on the conception, synthesis and characterization of dipolar dyes D-π-A for fluorescence imaging and photoacoustic imaging.The first part aim to synthesize and to study new fluorophores emitting in the solid-state in the near-infrared for fluorescence imaging with two-photon excitation. In order to improve the optical properties in the solid-state, we first explored various electron donating groups D, then acceptors A and finally we modified the π bridge. In a second part, we focused on dyes for photoacoustic imaging. This technique is based on an optical excitation and an acoustic detection. It requires a strong absorption in the biological window. To red shift the absorption we incorporated a thiophene bridge with low aromaticity to increase the delocalization. We also studied several hemicyanines with strong absorption above 650 nm.Finally, dyes were formulated as water-soluble nanoparticles for their final application for imaging. Two types of nanoparticles were studied: nanoprecipitated dyes stabilized by a surfactant to increase the colloidal stability or encapsulated dyes in a amphiphilic polymer matrix stabilized with a silica shell. Those nanoparticles enabled cells imaging with biphotonic florescence imaging as well as photoacoustic imaging of a microfluidic chip and of the microvascularisation of mice ears in vivo

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Pichette, Julien. "Imagerie de fluorescence et intrinsèque de milieux diffusants par temps d’arrivée des premiers photons." Thèse, Université de Sherbrooke, 2014. http://savoirs.usherbrooke.ca/handle/11143/387.

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Abstract:

La tomographie optique diffuse (DOT) se caractérise par l’utilisation de la lumière dans un régime de propagation diffusif pour sonder les tissus biologiques. L’utilisation de marqueurs fluorescents permet de cibler des processus biologiques précis (tomographie optique diffuse en fluorescence - FDOT) et d’améliorer le contraste dans les images obtenues. Les applications typiques de la DOT/FDOT sont la mammographie laser, l’imagerie cérébrale de nouveau-nés et les investigations non-invasives sur petits animaux, notamment pour l’imagerie moléculaire. Le présent projet fait partie du programme de recherche TomOptUS dirigé par le professeur Yves Bérubé-Lauzière. Un scanner optique pour petits animaux y est en cours de développement. Ce scanner possède la particularité de fonctionner avec une prise de mesures sans contact dans le domaine temporel. La première partie du projet a pour point de départ l’algorithme développé en FDOT par Vincent Robichaud qui permet la localisation spatiale d’une seule inclusion fluorescente ponctuelle immergée dans un milieu diffusant homogène ayant une géométrie cylindrique. Une nouvelle approche de localisation pour une pluralité d’inclusions discrètes est ici introduite. Cette dernière exploite l’information contenue dans le temps de vol des premiers photons provenant d’une émission de fluorescence. Chaque mesure permet de définir un lieu géométrique où une inclusion peut se trouver : ces lieux prennent la forme d’ovales en 2D ou d’ovoïdes en 3D. À partir de ces lieux, une carte de probabilité de présence des inclusions est construite : les maxima de la carte correspondent à la position des inclusions. Cette approche géométrique est soutenue par des simulations Monte Carlo en fluorescence dans des milieux reproduisant les propriétés optiques des tissus biologiques. Plusieurs expériences sont ensuite effectuées sur une mire optique homogène répliquant les propriétés optiques des tissus dans lequel des inclusions remplies de vert d’indocyanine (ICG) sont placées. L’approche permet la localisation avec une erreur positionnelle de l’ordre du millimètre. Les résultats démontrent que l’approche est précise, rapide et efficace pour localisation des inclusions fluorescentes dans un milieu hautement diffusant mimant les tissus biologiques. Des simulations Monte Carlo sur un modèle réaliste de souris montrent la faisabilité de la technique pour l’imagerie sur petits animaux. Le second volet de la thèse s’intéresse aux mesures intrinsèques par le développement d’une approche de reconstruction d’une carte des vitesses de propagation des ondes lumineuses diffuses dans un milieu diffusant hétérogène. De telles vitesses constituent un nouveau contraste pour de l’imagerie DOT. La méthode utilise une configuration en faisceaux lumineux analogue aux méthodes utilisées en tomographie par rayons X. Ici, toutefois, les temps d’arrivée des premiers photons sont utilisés plutôt que l’amplitude du signal. Des résultats sont présentés en 2D pour différentes configurations d’inclusions démontrant la validité de l’approche. Des simulations Monte Carlo sont utilisées pour simuler la propagation intrinsèque dans des milieux hétérogènes et pour venir appuyer la démarche.

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Paganin-Gioanni, Aurélie. "Imagerie de fluorescence d'événements moléculaires et cellulaires associés au cancer au sein d'animaux vivants." Toulouse 3, 2009. http://thesesups.ups-tlse.fr/644/.

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Abstract:

L'imagerie de fluorescence permet de réaliser le suivi spatiotemporel d'événements fluorescents définis dans le temps et l'espace à l'échelle de la cellule, du tissu ou de l'animal vivant. Le développement de son utilisation pour la détection de cellules cancéreuses repose en partie sur la définition de sondes permettant à la fois le ciblage et la détection. Le premier axe de mon travail de thèse concerne donc le développement de sondes fluorescentes pour le diagnostique de cellules cancéreuses in vivo. Ensuite, le second axe repose sur l'étude du transfert de molécules thérapeutiques in vitro et in vivo dans des cellules tumorales par électroperméabilisation. Dans un premier temps, l'objectif est de développer une molécule " intelligente " pour la détection de cellules cancéreuses dans un organisme vivant par imagerie de fluorescence non invasive. Notre stratégie repose sur l'utilisation de molécules organiques branchées appelées dendrimères, qui peuvent porter plusieurs fonctions permettant le ciblage et la détection. En collaboration avec l'équipe du Dr Majoral, nous avons donc tenté de greffer plusieurs marqueurs tumoraux et plusieurs fluorochromes afin d'augmenter respectivement sa spécificité pour les cellules cancéreuses B16F10 et le rapport signal/bruit pour leur détection in vivo. Malheureusement, la nature chimique des dendrimères n'a pas permis d'obtenir une molécule fonctionnelle. En effet, ceux ci n'étant solubles qu'en présence d'une quantité élevée de solvant organique, nous avons rencontré des problèmes de dénaturation des sondes biologiques (anticorps) que nous tentions de greffer. En parallèle, différents dendrimères (cationiques, anioniques, neutres, fluorescents) non fonctionnels ont été testés sur nos cellules afin de déterminer le meilleur candidat utilisable in vivo. Des problèmes de stabilité de la fluorescence et de toxicité ont été mis en évidence. Pour résoudre ces problèmes, nous avons enfin élaboré avec l'équipe de chimistes, des dendrimères portant des polyéthylènes glycol pour les solubiliser en milieu aqueux et les rendre biocompatibles. Ces derniers n'étant pas cytotoxiques, cette approche permettra d'élaborer un dendrimère fonctionnalisable en milieu aqueux. .
Fluorescent imaging allows one to monitor spatio-temporal fluorescent events occurring in cells, tissue or living animals and defined in time and space. The development of its use for detecting cancerous cells lies in part in the advancement of probes designed to target and detect. The first axis of my thesis work therefore concerns the evolution of fluorescent probes for the diagnosis of cancer cells in vivo. The second axis will evolve around the study of the transfer of therapeutic molecules in vitro and in vivo to tumoral cells via electropermeabilization. Firstly, the main objective is to develop a "smart molecule" for detecting cancer cells in living organisms by non-invasive fluorescent imaging. Our strategy is based on the use of branched organic molecules called dendrimers, which among their multiple functions allow targeting and detection. In collaboration with Dr. Majoral's team, we attempted to bind several tumour markers to various fluorescent dyes, in order to increase their specificity for B16F10 cancer cells and their signal to noise ratio for detection in vivo. Unfortunately, the chemical nature of dendrimers did not allow us to obtain a functional molecule. Indeed, as they are only soluble in the presence of a high quantity of organic solvent, we encountered a number of problems, due to the denaturing of the biological probes (antibodies) during the binding reaction. In parallel, a variety of non functional dendrimers (cationic, anionic, neutral and fluorescent) were tested on cells in order to determine the most viable candidate for use in vivo. However, we identified problems with the stability of the fluorescence and the toxicity. To solve these issues, with the assistance of a team of chemists, we developed dendrimers bearing polyethylene glycol to enable their dissolution in aqueous environments and make them biocompatible. As these are not cytotoxic, this approach will allow us to elaborate a dendrimer that is functional in an aqueous environment. .

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Charonov, Serguei. "Imagerie spectrale en microspectroscopie de diffusion raman et d'emission de fluorescence (doctorat : ingenierie biologique)." Reims, 1999. http://www.theses.fr/1999REIMP207.

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Jamette, Pascal. "Imagerie de NO par fluorescence induite par laser dans un moteur à allumage commandé." Lille 1, 2001. https://pepite-depot.univ-lille.fr/RESTREINT/Th_Num/2001/50376-2001-273.pdf.

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Labouesse, Simon. "Imagerie à éclairements structurés inconnus." Thesis, Aix-Marseille, 2017. http://www.theses.fr/2017AIXM0335.

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Abstract:

La microscopie à éclairements structurés (SIM) permet théoriquement de doubler la résolution d’un microscope optique standard. Pour atteindre cette limite théorique, le SIM requière un contrôle très précis des illuminations, ce qui le rend coûteux et difficile à calibrer. Cette thèse cherche à simplifier drastiquement le principe du SIM en proposant une approche « aveugle » qui reconstruit une image de l’échantillon à partir d’éclairements aléatoires, i.e., très facile à générer. Cette stratégie permet en théorie l’imagerie super-résolue tout en réduisant fortement le coût de l’instrument. Nous avons étudié du point de vu théorique et algorithmique les performances et les limitations d’un estimateur joint de l’objet et des illuminations (estimateur Blind-SIM joint). Notamment, une reformulation mathématique du problème d’estimation jointe a été proposée qui permet d’analyser l'origine de la super-résolution mais également de proposer des nouvelles stratégies de mises en œuvre très rapides. Une étude empirique a mis en lumière l’impact de la parcimonie et du contenue fréquentielles des illuminations sur le niveau de super-résolution obtenu. L’estimateur joint étant asymptotiquement inconsistant, nous nous sommes également intéressé à définir un « critère de contraste » pour ce problème permettant d’estimer uniquement l’objet d’intérêt. Une étude mathématique de la capacité de super-résolution de ce type d'estimateur a été conduite. Enfin, on a observé un effet de super-résolution en condition réelles sur de nombreux objets, 2 ou 3D, fixe ou mobile, biologique ou non tel que des billes, des podosomes, de l’actine
Structured illumination microscopy (SIM) allow theoretically to double the super-resolution of a standard optical microscope. However, to reach this theoretical limit, SIM require a precise knowledge of the illuminations, making it costly and difficult to calibrate. The aim of this thesis is to simplify the use of SIM by using a blind approach who allow the use of random illuminations to reconstruct a super-resolved image of the object. This strategy theoretically allow the super-resolution, while maintaining a low cost instrumentation. During those three years of thesis, we have studied theoretically and algorithmically the performances and the limitations of a joint estimator of the objet and the illuminations (joint Blind-SIM estimator). A mathematically equivalent reformulation of the joint problem was proposed allowing us to study the super-resolution origin and to propose a fast and parallelizable new approach. An empirical study has highlighted the impact of parsimony and of the frequency content of the illuminations on the reached super-resolution level. Because the joint estimator is asymptotically not consistent, we also studied a contrast criterion for our problem (typically a marginal likelihood), here only the object of interest is estimated. We have mathematically studied the super-resolution capacity of this kind of estimators. Finally, real data using random illuminations where acquired and we have observed a super-resolution effect using our algorithms on multiples real objects of different kind, 2 or 3D, fix or mobile, biological or not, like beads, podosomes, actines

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Boucard, Joanna. "Nanomatériaux magnéto-fluorescents pour la bio-imagerie multimodale et la libération contrôlée de principes actifs." Thesis, Nantes, 2018. http://www.theses.fr/2018NANT4051/document.

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Abstract:

Ce travail de thèse consiste en l’élaboration et en la caractérisation de nano-outils théranostiques pour deux objectifs. Le premier objectif concerne le diagnostic cellulaire ciblé (cellules cancéreuses et musculaires, bactéries, macrophages) grâce à des nanomatériaux détectables par microscopie de fluorescence et IRM. Le second est lié à la thérapie par libération contrôlée de principes actifs, notamment anti-cancéreux, encapsulés dans des nanomatériaux. En effet, la taille nanométrique de ces objets leur confère des potentialités de ciblage de tissus (cellules) tumoraux, diminuant ainsi les effets secondaires. Ces objets sont des nanoassemblages supramoléculaires constitués d’un coeur de molécules fluorescentes solvatochromes et d’une coquille de nanoparticules magnétiques d’oxyde de fer. Le coeur émissif, appelé FON pour nanoparticule organique fluorescente, émet un signal brillant dans le rouge compatible avec la première fenêtre de transparence des tissus biologiques. Les FONs se révèlent non cytotoxiques et peu sensibles au photoblanchiment. L’aptitude des FONs à se déliter une fois internalisées in cellulo et leur hydrophobicité permettent la vectorisation de médicaments hydrophobes. La libération de ces derniers est alors suivie in cellulo par microscopie de fluorescence. Cette libération peut être contrôlée par hyperthermie grâce à l’échauffement des nanoparticules magnétiques lors de l’application d’un champ magnétique alternatif. Ces dernières pourront aussi être exploitées pour suivre l’évolution in vivo de tumeurs par IRM. Toutes ces propriétés combinées ouvrent la voie vers des potentialités théranostiques où la nanomédecine personnalisée est très recherchée
These PhD studies consist in the design and characterizations of theranostic nano-tools to meet two requirements. The first one is cell-targeted diagnostics (cancer and muscle cells, bacteria, macrophages) using nanomaterials detectable by fluorescence microscopy and MRI. The second aims at controlling the release of drugs, including anticancerous ones, encapsulated in nanomaterials. The nanometric size of these objects enables enhanced accumulation in tumor tissue (cells), thereby decreasing toxicity side-effects. These objects are supramolecular nanoassemblies composed of a fluorescent solvatochrom organic core coated by a shell of magnetic iron oxide nanoparticles. The emissive core, named FON for fluorescent organic nanoparticle, shows a bright redshifted emission signal compatible with the first biological tissue transparency window. FONs exhibit no cytotoxicity and little photobleaching. The ability of FONs to disassemble once internalized in cellulo and their hydrophobicity enable hydrophobic drugs vectorization. In this way, in cellulo drug delivery can be followed-up by fluorescence microscopy. Drug delivery can be controlled with magnetic hyperthermia thanks to the heating properties due to an alternative magnetic field applied to magnetic nanoparticles. Furthermore, magnetic nanoparticles allow tumor evolution to be monitored in vivo using MRI. All these combined properties pave the way toward theranostic potentialities where personalized nanomedicine is highly requested

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Raes, Florian. "Imagerie photoacoustique couplée à l’échographie haute résolution et à la fluorescence infrarouge en oncologie préclinique translationnelle." Thesis, Orléans, 2016. http://www.theses.fr/2016ORLE2082/document.

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Abstract:

L’imagerie préclinique est devenue une ressource incontournable pour l’évaluation de paramètres physiopathologiques, pour le suivi du développement tumoral ainsi que pour le développement de thérapies anticancéreuses. Les évolutions technologiques apparues ces dernières années ont conduit au développement de nouvelles modalités d’imagerie ayant un fort potentiel de translation vers la clinique. Ce manuscrit présente diverses approches par imagerie échographique, photoacoustique et de fluorescence dans le proche infrarouge pour le suivi de la pathologie cancéreuse. Dans un premier temps, nous nous sommes intéressés à la caractérisation de l’hypoxie et son suivi au cours du temps dans différents modèles de cancers humains. Différentes stratégies d’imagerie multimodale ont ensuite été mises en oeuvre pour évaluer l’efficacité d’une nouvelle prodrogue thérapeutique permettant la libération d’une molécule active dans le proche environnement tumoral sur des modèles humains de tumeurs pancréatiques, mammaires, pulmonaires. Enfin, dans un contexte de recherche translationnelle, nous avons exploré le potentiel de l’imagerie photoacoustique et de la fluorescence infrarouge pour la mise en évidence de l’invasion ganglionnaire tumorale en mettant en oeuvre des modèles de ganglions sentinelles minimalement envahis. Au cours de ce travail, nous avons montré l’intérêt du suivi de l’hypoxie tumorale en onco-pharmacologie et mis en évidence le fort potentiel de l’imagerie PA pour les approches translationnelles en oncologie. La principale limitation correspond à la profondeur relativement faible des régions explorables, mais ce point suscite actuellement de nombreux développements technologiques. Les études de faisabilité réalisées ainsi que la validation de protocoles de preuves de concept permettront l’exploitation en routine de ces nouvelles modalités d’imagerie
Preclinical imaging has become an unavoidable step for pathophysiological parameters assessments, for the follow up of tumor growth and for the anticancer therapies development. Technological improvements have emerged in recent years, allowing the emergence of new imaging modalities with a high potential for translation into clinical practice. This manuscript presents several approaches by ultrasound imaging, photoacoustics and near infrared fluorescence in order to monitor the cancer pathology. Initially, we focused on the characterization of hypoxia and its longitudinal assessment in various preclinical models of human cancers. Various multimodal imaging strategies were implemented to assess the efficacy of a new therapeutic prodrug allowing the release of an active molecule in the tumor microenvironment on human models of pancreatic, breast and lung tumors. Finally, in a context of translational research, we explored the potential of photoacoustic and near infrared fluorescence imaging to highlight the lymph node invasion by cancer cells implementing minimally invaded sentinel lymph node models. In this work, we have shown the interest in monitoring the tumor hypoxia in onco-pharmacology and highlighted the high potential of photoacoustic imaging for oncology translational approaches. The main limitation is the relatively shallow depth of regions that we can explore, but this point is currently subject to many technological developments. Feasibility studies performed and validation of proof of concept protocols will enable routine exploitation of these new imaging modalities

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Zhang, Ruikang. "Implementations and applications of Out of Phase Imaging after Optical Modulation (OPIOM) in fluorescence macro-imaging and fluorescence endomicroscopy." Thesis, Sorbonne université, 2018. http://www.theses.fr/2018SORUS541.

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Abstract:

L'analyse de l'émission de fluorescence sur un modèle foliaire a permis de mettre au point un premier dispositif optique pour la macro-imagerie par fluorescence qui met en œuvre le protocole Speed OPIOM (Out of Phase Imaging after Optical Modulation) pour observer la fluorescence de plantes vivantes marquées avec des protéines fluorescentes réversiblement photo-commutables génétiquement encodées. Ce système optique a été conçu pour obtenir une image de bonne qualité des canaux d'émission rouge et vert sur une surface d'environ 4 × 4 mm2. Il a permis aux biologistes de mesurer le niveau d'expression des sondes fluorescentes dans les plantes vivantes, sans interférence de l'autofluorescence et de la lumière ambiante, même en plein soleil. Ce macroscope de fluorescence a également trouvé d'autres applications en macro-imagerie de fluorescence, par exemple l'analyse de Western blots et la sélection bactérienne sur des supports fortement autofluorescents. Un endoscope à faisceau de fibres optiques intégrant Speed OPIOM a également été construit. Ce second dispositif optique a également amélioré le contraste de l'image sur un fond autofluorescent. De plus, il a été utilisé pour mettre en évidence un phénomène de sectionnement optique à l'aide d'une série de simulations numériques et de mesures expérimentales
Based on an analysis of the fluorescent emission on a leaf model, a first optical setup has been built for macro-scale fluorescence imaging, which implements the Speed OPIOM (Out of Phase Imaging after Optical Modulation) protocol to observe the fluorescence of living plants labeled with genetically-encoded reversibly photoswitchable fluorescent proteins. The optical system was designed to image both the red and green emission channels with good quality over an area of about 4 × 4 mm2. This setup allowed biologists to measure the level of expression of fluorescent probes in living plants, without interference from autofluorescence and ambient light, even under sunlight. This fluorescence macroscope also found other applications in fluorescence macro-imaging, e.g. western blot analysis & bacterial selection, against the autofluorescence of the substrate. A fiber bundle-based endoscope incorporating Speed OPIOM has also been built. This second optical setup improved as well the contrast of the image against an autofluorescent background. In addition, it has been used to evidence optical sectioning by a series of numerical simulations and experimental measurements

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Khemis, Kamila. "Imagerie de fluorescence en cancérologie : spectroscopie, traitement du signal et gestion automatisée pour l'optimisation du diagnostic des tumeurs précoces." Vandoeuvre-les-Nancy, INPL, 1998. http://docnum.univ-lorraine.fr/public/INPL_T_1998_KHEMIS_K.pdf.

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Abstract:

Un système d'imagerie de fluorescence a été développé pour permettre le diagnostic des tumeurs superficielles ou endoscopiques en autofluorescence ou en fluorescence induite. Ce système comprend une source laser et une lumière blanche, focalisées sur une fibre optique. Leurs rôles respectifs sont de générer les images de fluorescence et de lumière blanche qui sont acquises de façon séquentielle par une camera couleur (adaptée à l'outil endoscopique), puis digitalisées et visualisées sur le moniteur. Le passage d'une source à l'autre se fait par un obturateur mécanique contrôlé par un moteur pas à pas, lequel est commandé par un microcontrôleur. Deux algorithmes sont développés en Windows C++ (Globa et Globi) et permettent respectivement un diagnostic en autofluorescence ou en fluorescence induite. Le deuxième algorithme comporte une étape supplémentaire par rapport au premier : il s'agit de la suppression du signal d'autofluorescence qui est effectuée après l'étude de la séparation fréquentielle de la camera. Les étapes communes du traitement d'image sont le filtrage de l'image globale, suivi de la correction de l'image de fluorescence par rapport à la distribution du faisceau d'excitation en exploitant l'image en lumière blanche, puis le rehaussement de contraste ou la segmentation de l'image de fluorescence selon le choix de l'operateur. Les algorithmes ont été testés sur des fantômes, sur des souris et des rates avec et sans photosensibilisant (HpD, mTHPC et ALA). De bons résultats (applications endoscopiques) sont obtenus avec les fantômes : identification correcte des régions simulant la tumeur et le tissu sain avec des niveaux de gris qui permettent de retrouver la concentration du photosensibilisant de chaque zone. Dans le cas des applications superficielles in-vivo, l'identification des tumeurs n'est pas toujours possible à cause de l'hétérogénéité de la fluorescence dans une région donnée. Les mesures spectrales effectuées sur ces sites confirment la non sélectivité du signal de fluorescence entre tissus sain et pathologique. Cette étude suggère une association de la spectroscopie à l'imagerie de fluorescence en temps réel pour optimiser le choix des points de mesure en spectroscopie, ainsi que l'amélioration de l'instrumentation pour aboutir à des applications endoscopiques in-vivo.

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Lescure, Robin. "Développement d’azaBODIPYs fonctionnalisables pour la conception de sondes d’imagerie bimodale et d’agents théranostiques." Thesis, Bourgogne Franche-Comté, 2020. https://nuxeo.u-bourgogne.fr/nuxeo/site/esupversions/21e2771a-9c75-46d7-9377-50e8f2536c32.

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Abstract:

L’utilisation in vivo de l’imagerie optique est encore aujourd’hui principalement limitée par le manque de sondes capables d’émettre dans le proche infrarouge, où les tissus biologiques sont plus transparents à la lumière. Les travaux présentés dans ce manuscrit abordent l’optimisation et la valorisation d’une plateforme fluorescente hydrosoluble dont les propriétés optiques peuvent permettre une utilisation in vivo. Deux applications distinctes ont été envisagées pour cette plateforme WazaBY (Water-soluble azaBODIPY) : une utilisation comme sonde bimodale TEP (ou TEMP) et optique, et une utilisation en tant qu’agent théranostique. Lors du premier projet issu de ces travaux de thèse, nous avons pu développer une sonde bimodale TEMP/optique radiométallée par l’indium-111 et vectorisée par un anticorps (trastuzumab). Sur modèles murins porteurs de tumeurs xénogreffées, il a été possible de réaliser une imagerie bimodale optique/TEMP, témoignant d’une très nette accumulation au sein de la tumeur dès 24 heures après injection. La sonde a également été validée pour la réalisation de chirurgie assistée par fluorescence. Dans le cadre du second projet de cette thèse, une première génération d’agents théranostiques, porteurs de complexes d’or pour la thérapie, ont été synthétisées. L’objectif de ce projet a été de développer une nouvelle entité thérapeutique traçable in vitro et in vivo par imagerie optique. Les résultats préliminaires in vitro ont indiqué une activité antiproliférative des théranostiques sur lignées cellulaires cancéreuses (4T1, MDA MB 231, CT26 et SW480) voisine de celle de l’auranofine. Dans une seconde partie, nous nous sommes focalisés sur le développement de sondes théranostiques dites « intelligentes », pour lesquelles une modification des propriétés photophysiques est attendu lors du relargage éventuel du centre métallique. Deux molécules ont ainsi pu être synthétisées, chacune présentant un comportement de type on/off
The in vivo use of optical imaging is still limited by the lack of near infrared emitting probes. This thesis work focuses on the optimization and valorization of a water-soluble fluorescent platform whose optical properties enable an in vivo use. Two distinct applications were investigated for this WazaBY (Water-soluble azaBODIPY) platform: use as a PET (or SPECT) / optical bimodal probe, and as a theranostic agent. Concerning the first project, we were able to develop a targetted SPECT/optical bimodal probe, which was radiometallated with indium 111. Using xenografted murine models, we were able to show a clear accumulation of the probe in the tumor 24 hours after injection. Moreover, the probe was validated as a contrast agent for fluorescence guided surgery experiment. The second project of this thesis began by the synthesis of a first generation of gold based theranostic agents. The goal was to develop a new therapeutic complex, which can be tracked in vitro and in vivo thanks to optical imaging. In vitro preliminary results showed that the theranostics displayed a cytotoxicity comparable to auranofin on the tested cell lines (4T1, MDA MB 231, CT26 and SW480). A second part of this project focused on the develoment of « smart » probes for a theranostic use. Those probes are designed to undergo photophysical properties changes, when their metallic centre, responsible for the therapeutic role, is released. Two molecules were synthesized, both displaying an on/off behavior

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Barilero, Thomas. "Imagerie de la cinétique chimique par modulation de température : conception, validation et mise en oeuvre." Paris 6, 2009. http://www.theses.fr/2009PA066613.

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Abstract:

Nous avons conçu un microdispositif qui permet de faire osciller la température d'un mélange réactionnel à des fréquences variant entre 0,01 Hz et 100 Hz, avec une amplitude de 1 K. Par ailleurs, la chambre microfluidique a été imagée avec un microscope à épifluorescence fonctionnant à deux couleurs. Tout d'abord, pour contrôler les transferts thermiques à l'intérieur du dispositif, nous avons développé des système chimiques permettant une mesure ratiométrique de la température. Deux types de sondes thermométriques fluorescentes ont ainsi été étudiées: des balises moléculaires utilisant le phénomène de transfert d'énergie résonnant de type Förster (FRET), et une sonde de nature acido-basique. Ces molécules, qui peuvent être utilisées entre 5 °C et 35 °C sont caractérisées par une sensibilité relative de mesure d'environ 5 %. K-1 et un temps de réponse allant de la milliseconde à la microseconde. Enfin, nous avons analysé dans la chambre microfluidique la dépendance en fréquence de l'amplitude de la réponse d'un mélange réactionnel à des oscillations basses fréquences de la température. Nous avons ainsi mesuré sélectivement les constantes cinétiques de l'hybridation de deux oligonucléotides: kouverture=0,35 s-1 et kfermeture=4,7. 10^5 L. Mol-1. S-1.

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BARANGER, Philippe. "Détection du kérosène par imagerie de fluorescence induite par laser, pour application sur foyer aéronautique." Phd thesis, Université Paris Sud - Paris XI, 2004. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00009189.

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Abstract:

Les nouveaux concepts de foyers aéronautiques, développés pour répondre aux évolutions des normes européennes de pollution, sont généralement basés sur une amélioration des procédés d'injection de carburant liquide et de mélange dans la chambre de combustion. Il n'existe pas actuellement d'outil de modélisation suffisamment élaboré pour pouvoir se passer de validation expérimentale. Le but de cette thèse est de déterminer les possibilités d'une mesure par PLIF (fluorescence induite par laser en nappe) de la répartition de vapeur de kérosène (Jet A1) permettant de visualiser quantitativement les champs de concentrations instantanées du carburant vaporisé en sortie d'injecteur. Pour permettre la mise en place d'une telle technique, il a été réalisé une analyse spectroscopique expérimentale sur la vapeur de kérosène. Cette analyse a permis, en premier lieu de déterminer les propriétés du spectre de fluorescence du kérosène en fonction de paramètres physiques tels que la température, la pression ou la composition du mélange gazeux, en particulier en présence d'oxygène. Ensuite, il a été montré que l'étude de la fluorescence du kérosène peut se faire en considérant uniquement un mélange de quatre aromatiques dont les propriétés photophysiques ont également été analysées. Suite à cette analyse spectroscopique, un modèle phénoménologique de fluorescence du kérosène gazeux a été mis en place. Ce modèle a permis de définir une métrologie optique sur ce carburant. Une expérience pilote a été réalisée en laboratoire afin de déterminer les potentialités réelles de cette méthode de diagnostic. Les résultats obtenus prouvent que cette technique est prometteuse pour réaliser des mesures sur la vapeur de kérosène dans un foyer aéronautique.

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Even, Pascale. "Élaboration de sondes fluorescentes pour des applications en biologie et imagerie par microscopie de fluorescence." Vandoeuvre-les-Nancy, INPL, 2001. http://www.theses.fr/2001INPL567N.

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Abstract:

Les travaux réalisés ont eu comme objectif de développer les méthodes optiques pour des études en biologie avec comme point de départ la synthèse chimique de sondes fluorescentes pour deux applications visant d'une part, les interactions biopolymères - cellules et d'autre part, la thérapie photo dynamique (PDT). La première partie est consacrée à la synthèse et à l'étude de polymères bioactifs de type polysaccharide, marqués par des rotors moléculaires fluorescents. Le travail a porté sur la synthèse et l'étude photophysique des dérivés coumarine associés à des dextranes bioactifs (CMDB) et à l'héparine. Les tests biologiques confirment la potentialité de la méthode: les CMDB fluorescents conservent l'action proliférative sur les cellules endothéliales; l'internalisation des CMDB et de l'héparine fluorescents, respectivement dans des cellules endothéliales et musculaires lisses a pu être visualisée par microscopie de fluorescence. La deuxième partie est consacrée au développement de nouveaux photosensibilisants pour la PDT. La PDT est un traitement médical de lutte contre certains types de cancer basé sur l'utilisation combinée d'un photosensibilisant (souvent des dérivés de porphyrine), de l'oxygène et de la lumière. Les effets secondaires et les domaines d'absorption des composés existants, de même qu'une fonctionnalisation spécifique permettant de cibler préférentiellement les cellules tumorales, justifient les travaux qui se poursuivent dans la recherche de nouvelles molécules. Avec l'objectif de vectorisation, nous avons développé la synthèse de porphyrines portant un nombre variable de cycles glucosamine. Différentes approches méthodologiques ont été réalisées, les protocoles de synthèse sont maintenant bien maîtrisés. L'étude photophysique met en évidence la formation d'agrégats, même à faibles concentrations. Les tests biologiques, en cours, devraient orienter les modifications à apporter
Researchs are done with the aim to develop optical methods for biological studies, with the starting point, the fluorescent trac ers chemical synthesis for two biological applications, namely for biopolymer - cells interactions studies and in photodynamic therapy, respectively. In the first part are described the synthesis and the study of bioactive polysaccharides polymers, labeled with fluorescent molecular rotors. The aim was to synthesise and to study the photophysical properties of coumarin derivatives associated with bioactive dextran (carboxymethyldextranbenzylamide (CMDB)) and heparin. The results of the biological tests prove the interest of the study : fluorescent CMBD polymers keep their stimulation effect on endothelial ceUs growth ; moreover, labeling of endothelial and smooth muscle cells with derivatized fluorescent dextran and heparin respectively, has been demonstrated by fluorescence microscopy. The second part is devoted to the development of new photosensitizers for photodynamic therapy (PDT). PDT is a medical treatment against sorne cancers, based on the combined use of a photosensitizer (often porphyrin compound), oxygen and light. Nowadays, compounds used suffer from sorne drawbacks, especially secondary effects and no specificity. This explains the extend of research in this field, to discover more efficient molecules. Our main objective being the targeting, we developed sorne new porphyrins linked with a variable number of glucosamine rings. Different synthetic routes have been explored and now, the synthese protocols are well known. The photophysical properties of compounds have been studied and aggregate formation, even at low concentration has been observed. Biological tests in course, will orientated the further chemical modifications for a good selectivity

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Baranger, Philippe. "Détection du kérozène par imagerie de fluorescence induite par laser, pour application sur foyer aéronautique." Paris 11, 2004. https://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00009189.

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Abstract:

Les nouveaux concepts de foyers aeronautiques, developpes pour repondre aux evolutions des normes europeennes de pollution, sont generalement bases sur une amelioration des procedes d'injection de carburant liquide et de melange dans la chambre de combustion. Il n'existe pas actuellement modele suffisamment elabore pour pouvoir se passer de validation experimentale. Le but de cette these est de determiner les possibilites d'une mesure par plif (fluorescence induite par laser en nappe) de la repartition de vapeur de kerosene (jet a1), permettant de visualiser quantitativement les champs de concentrations instantanees du carburant vaporise en sortie d'injecteur. La mise en place d'une telle technique a necessite une analyse spectroscopique experimentale sur la vapeur de kerosene. Cette analyse a permis de determiner les proprietes du spectre de fluorescence du kerosene en fonction de parametres physiques tels que la temperature, la pression ou la composition du melange, en particulier en presence d'oxygene. Ensuite, il a ete montre que l'etude de la fluorescence du kerosene peut se faire en considerant uniquement un melange de quatre aromatiques dont les proprietes photophysiques ont egalement ete analysees. Suite a cette analyse spectroscopique, un modele phenomenologique de fluorescence du kerosene gazeux a ete mis en place. Ce modele a permis de definir une metrologie optique sur ce carburant. Une experience pilote a ete realisee en laboratoire afin de determiner les potentialites reelles de cette methode de diagnostic. Les resultats obtenus prouvent que cette technique est prometteuse pour realiser des mesures sur la vapeur de kerosene dans un foyer aeronautique
The new concepts of aeronautical engines, developed to follow the evolution of the european standards of pollution, are generally based on an improvement of the processes of liquid fuel injection and mixture in the combustion chamber. There is currently no model mature enough to work without experimental validation. The purpose of this thesis is to assess the possibility of measuring the kerosene (jet a1) vapour distribution by plif (planar laser induced fluorescence). That measurement technique must quantitatively image the instantaneous concentrations fields of the vaporized fuel in a spray. The implementation of such a technique needs an experimental spectroscopic study, which was realized on the vapour of fuel. First of all, this study allowed us to determine the properties of the kerosene fluorescence spectrum versus physical parameters such as temperature, pressure or gas mixture composition, especially in presence of oxygen molecules. Then, it was shown that the fluorescence spectrum of the fuel could be reproduce in all physical conditions by a single mixture of four aromatics. Their photophysical properties were also analyzed. Following this spectroscopic study, a phenomenological model for the fluorescence of the gaseous fuel was set up. This model led us to a protocol for an optical diagnostic on this fuel vapour. An experiment was set up to test the implementation and the limits of this technique in simple laboratory conditions. This experiment confirmed that this is indeed a promising technique for the diagnostic of the fuel vapour in aeronautical engine

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Detraz, Morgane. "Développement d'outils bimodaux pour l'imagerie oncologique in vivo exploitant les modalités optique et nucléaire." Thesis, Normandie, 2019. http://www.theses.fr/2019NORMR138.

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Abstract:

La qualité du diagnostic oncologique, déterminant la thérapie et le pronostic du patient, repose sur différentes techniques d’imagerie ou modalités, associées à des molécules de contraste afin de générer une image représentative de la situation tumorale et analysable par le praticien. L’imagerie moléculaire, incluant l’imagerie optique de fluorescence et l’imagerie nucléaire, est couramment utilisée pour la prise en charge oncologique des patients. Récemment, une classe hybride de molécules de contraste appelée MOMIA (MOnomolecular Multimodal Imaging Agent) a émergé, associant plusieurs modalités au sein d’une structure moléculaire unique. Cette combinaison performante cumule les forces de chacune des modalités combinées en palliant leur limitation respective. Dans ce cadre, ces travaux de thèse portent sur le développement et l’exploitation d’une plateforme polyvalente bimodale (fluorescente et radioactive) composée d’un synthon peptidique, radiomarquable par chélation du 99mTc, couplé à fluorophore présentant des propriétés spectroscopiques d’émission dans le proche infra-rouge, gamme spectrale privilégiée pour l’imagerie in vivo. Cette plateforme est finalement clickable à toute (bio)molécule d’intérêt, générant à façon des sondes bimodales en une étape de couplage. L’exploitation de cette plateforme bimodale clickable a été explorée dans le contexte du diagnostic oncologique via deux cibles enzymatiques principales : la caspase-3 et les tyrosine-kinases. Les étapes de conception, synthèse, optimisation, développement et validation biologique préliminaire in vitro de la plateforme et des sondes dérivées bimodales sont présentés
Oncologic healthcare and remission prognosis rely on a reliable and accurate diagnosis. Molecular imaging, including optical and nuclear imaging, is currently used for the management cancer therapy. Recently, a new class of bio-imaging agent called MOMIA (MOnomolecular Multimodal Imaging Agent) emerged by combining the synergistic strengths of several modalities on the same molecular structure. We envisioned to merge optical and nuclear imaging in order to develop a molecular tool offering a non-invasive, highly resolutive and sensitive detection. Our approach relies on a universal bimodal clickable scaffold with a selected targeting ligand. Two distinct enzymatic targets have been explored in the oncologic context: caspase-3 as a key component in an apoptotic program and tyrosine kinase inhibitors involved in lung cancer therapy. These multimodal sensors have a promising potential in translational clinical applications

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Grichine, Alexeï. "Imagerie spectrale confocale : développement et applications à l'étude des mécanismes d'action photodynamique de nouveaux sensibilisateurs." Orléans, 2002. http://www.theses.fr/2002ORLE2003.

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Abstract:

Un traitement local des tumeurs exige le développement de médicaments sélectifs et efficaces. C'est dans cette perspective que ce travail s'appuie sur la puissance de nouvelles méthodes optiques et notamment la technique d'imagerie spectrale confocale (ISC) de fluorescence et de diffusion Raman qui est ici présentée et développée. Cette technique permet de préciser la distribution et les propriétés d'une drogue en milieu cellulaire, à partir de ses spectres mesurés à l'aide d'un microscope confocal. De nouvelles approches d'étude de substances à potentiel anti-tumoral sont expérimentées in situ dans des cellules maintenues en survie et des coupes de tissus. Il est montré que cette même approche à base d'ISC peut être utilisée pour étudier les interactions et les mécanismes d'action biologique de médicaments fluorescents et même non-fluorescents, aux différents niveaux d'organisation du milieu vivant. Dans la deuxième partie de ce travail, une étude approfondie de nouveaux agents prometteurs pour les thérapies photodynamique (PDT) et catalytique binaire a été effectuée. Ces produits, notamment les sulfonates de phthalocyanine d'aluminium ; l'octacarboxyphthalocyanine de cobalt ; les sulfonates de phtalocyanine sans métal ; la 3-formyl-3-devinylchlorine p6 et la 131,151-N-(3-hydroxypropyl) cycloimide chlorine p6, ont été successivement analysés et optimisés afin d'établir les structures correspondant aux modes d'action les plus efficaces. Ainsi, une véritable stratégie de mise au point de médicament est proposée. Elle a permis, en particulier, de révéler une forte activité photodynamique des sulfonates de phthalocyanine sans métal, considérées jusqu'à présent sans intérêt thérapeutique et de développer de nouveaux photosensibilisateurs à base de chlorine p6 optimisés pour une absorption dans le rouge lointain et proche IR, fenêtre de transparence des tissus biologiques.

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Dupont-Therrien, Olivier. "Développement d'outils pour l'imagerie de l'activité neuronale - des épines au comportement." Doctoral thesis, Université Laval, 2017. http://hdl.handle.net/20.500.11794/27491.

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Abstract:

Dû à l'échelle des structures et des comportements observés, les neurosciences et la microscopie ont toujours été intimement liées. Que ce soit pour observer les différentes morphologies cellulaires en lumière blanche transmise, ou pour suivre des dynamiques complexes grâce à des sondes fluorescentes, la lumière est l'outil de choix pour étudier le cerveau et sa composition. Plus particulièrement, la lumière possède la bonne résolution spatiale et temporelle pour sonder autant localement que globalement toutes les échelles de l'activité neuronale. De plus, les techniques de mesure utilisant la lumière sont généralement peu invasives. Cette thèse de doctorat montre trois techniques d'imagerie de fluorescence, développées pour des échelles d'organisation distinctes. Le but de la thèse est de fournir de nouveaux outils technologiques visant à repousser les limites des questions biologiques aujourd'hui disponibles aux neuroscientifiques. Afin de pouvoir sonder efficacement les mécanismes internes aux petites structures comme les épines dendritiques et les dendrites, nous avons développé un protocole de marquage unicellulaire du fluorophore sensible au potentiel ANNINE-6plus. La méthode se base sur le chargement intracellulaire de la sonde fluorescente dans des échantillons autant en cultures cellulaires dissociées, qu'en préparations de tranches aigues et organotypiques. Le deuxième projet adresse les défis liés à l'imagerie rapide de l'activité de réseaux. Typiquement, il y a un choix à faire entre la résolution temporelle et la surface d'imagerie. Ce choix vient du fait que les techniques d'imagerie rapides sont habituellement à champs larges et ne fournissent pas de sectionnement optique, ce qui rend leur utilisation dans des échantillons épais difficile. En couplant une technique à champ large multiphotonique, la focalisation temporelle, avec l'illumination structurée ainsi qu'un laser amplifié, nous avons développé un système à champ large doté d'un sectionnement optique en-deçà de 10 um. Le troisième chapitre décrit le développement de deux logiciels distribués avec un produit commercialisé par Doric Lenses Inc., soit un microscope miniature implantable pour l'imagerie de structures profondes du cerveau pour des animaux se déplaçant librement. Les logiciels permettent le traitement des images en temps réel et à posteriori. Ce produit offre finalement un lien entre l'activité neuronale locale, et les comportements animaux observés.
Due to the scale of the observed structures and behaviours, neurosciences and microscopy have always been intertwined. Whether it is to observe the different cell morphologies in transmitted white light, or to follow complex dynamics using fluorescent probes, light is the tool of choice to study the brain and its composition. Specifically, the light has the proper spatial and temporal resolution to probe both locally and globally all levels of neuronal activity, while remaining minimally invasive. This thesis shows three techniques developed for different scales, in order to push the limits of the currently addressable biological questions by neuroscientists. In order to effectively probe the internal mechanisms for small structures like dendritic spines and dendrites, we have created a single-cell labeling protocol of the voltage-sensitive fluorophore ANNINE-6plus. The method is based on the intracellular loading of the fluorescent probe in samples both in dissociated cell cultures, than in preparations of acute and organotypic slices. The second project addresses the challenges of rapid imaging of the cellular network activity. Typically, there is a choice between the temporal resolution and the imaging surface. This choice is that the fast imaging techniques are usually widefield and do not provide optical sectioning, making their use in thick samples difficult. By combining a widefield multiphoton technique, the temporal focusing, with the structured illumination and an amplified laser, we have developed a widefield system with an optical sectioning below 10um. The third chapter describes the development of two software distributed with a product created by Doric Lenses Inc., an implantable miniature microscope for imaging of deep brain structures of freely moving animals. This product finally provides a link between the local neuronal activity, and the observed animal behaviours.

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Fredj, Asma. "Élaboration de protéines fluorescentes ayant un fort potentiel en imagerie." Phd thesis, Université Paris Sud - Paris XI, 2012. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00785092.

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La Enhanced Cyan Fluorescent Protein (ECFP) est un variant spectral de la Green Fluorescent Protein extraite de la méduse Aequaria Victoria (GFPav). La ECFP, émettant dans le cyan, est un des donneurs les plus utilisés dans les études de transfert résonnant d'énergie d'excitation et est integré dans de nombreuses constructions de biosenseurs. Pourtant, elle souffre de nombreux inconvenients. Notamment elle pésente des propriétés photophysiques complexes et une forte sensibilité environnementale qui sont des freins à une interprétation quantitative de ses signaux de fluorescence en imagerie cellulaire. Notre objectif vise à mettre au point, grâce à l'introduction d'un minimum de mutations, un dérivé de la ECFP présentant des propriétés d'émission simplifiées et performantes ainsi qu'une faible sensibilité environementale. Des mutations ont été introduites, par mutagenèse dirigée, à deux positions clefs de la séquence peptidique de la ECFP ce qui a permis de générer des dérivés présentant des propriétés photophysiques et une sensibilité au pH modulées. En particulier, nous avons réussit à générer une protéine fluorescente, l'Aquamarine, aux propriétés photophysiques quasi-idéales caractérisée par un rendement quantique de l'ordre de 0,9 et des déclins d'émission de fluorescence quasi-monexponentiels. Elle présente également une sensibilité au pH fortement réduite avec un pH de demi-transition acide de 3,3.Ce manuscrit présente l'étude détaillée des propriétés d'émission de fluorescence des diverses protéines générées. Plusieurs paramètres présentant un intérêt particulièrement important pour une utilisation adéquate en imagerie de fluorescence ont été évalués. Outre la sensibilité au pH établie sur une large gamme de pH (2,5-11), une attention particulière a été portée sur les performances photophysiques (monoexponentialité du déclin d'émission de fluorescence, durée de vie moyenne, rendement quantique, brillance,...) de ces dérivés. De plus, grâce à des expériences de dichroïsme circulaire, des informations sur les changements structuraux, dont ces dérivés sont le siège à pH très acide, ont été obtenues. Enfin, l'examen détaillé des données spectroscopiques stationnaires et résolues en temps a permis de mettre en lumière l'existence de plusieurs espèces émissives contribuant à la photophysique de ces protéines et à l'origine de leur transition acide. L'ensemble de ces résultats constitue une première approche pour une meilleure compréhension de la relation structure-photophysique-dynamique de la ECFP et de ces dérivés.

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Canovas, Coline. "Développement de stratégies de bioconjugaison innovantes : Application à l’élaboration d’agents d’imagerie moléculaire." Thesis, Bourgogne Franche-Comté, 2018. http://www.theses.fr/2018UBFCK058.

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Abstract:

L’élaboration d’agents de ciblage pour le diagnostic du cancer repose sur le couplage d’une molécule imageante à un vecteur, souvent une protéine, capable de cibler spécifiquement les tissus cancéreux. Cette étape de bioconjugaison peut se révéler complexe et très délicate à contrôler. En effet, les protéines vectrices sont constituées d’un grand nombre de fonctions chimiques, potentiellement réactives, qui peuvent interférer lors du greffage. Ces travaux de thèse ont pour finalité l’élaboration de stratégies de bioconjugaison sélective innovantes afin de faciliter la préparation des agents d’imagerie moléculaire.Nos efforts ont notamment abouti à la mise au point d’une approche simple et efficace permettant la modification d’une protéine par un fluorophore, au moyen d’une réaction de bioconjugaison site-spécifique. Grâce à cette technique, il est possible d’obtenir des agents fluorescents proche infrarouge en une seule étape.Nous nous sommes également intéressés à la conception d’agents imageants bimodaux nucléaires/fluorescents vectorisés. Cette génération de traceurs possède un fort potentiel dans le domaine de l’imagerie médicale. Cependant, leur synthèse requiert le couplage de deux molécules imageantes à la protéine, ce qui rend l’étape de bioconjugaison particulièrement critique. Nous avons répondu à cette problématique par la mise au point de stratégies permettant la double modification site-spécifique de protéines. Les approches développées sont basées sur l’utilisation d’une plateforme trifonctionnelle, la dichlorotétrazine, et sont ainsi très versatiles. Nous avons pu obtenir et tester en préclinique, plusieurs agents imageants bimodaux nucléaires/optiques.Ce mémoire présente également l’élaboration d’un radiotraceur capable de détecter le cancer de la prostate par ciblage spécifique de la PSMA. Les résultats prometteurs obtenus lors de l’évaluation préclinique de ce composé, métallé au cuivre-64, en font un candidat intéressant pour le diagnostic du cancer de la prostate par tomographie par émission de positons chez l’homme
The preparation of targeted imaging agents suitable for cancer diagnostic involves the coupling of an imaging probe to a vector, generally a protein, able to specifically target cancerous tissues. Unfortunately, this bioconjugation step is often problematic. Indeed, proteins present a large variety of reactive functions that can potentially interfere with the coupling reaction. The purpose of this work is the design of innovative selective bioconjugation strategies that can facilitate the synthesis of molecular imaging agents.Our research led to the development of a simple and efficient approach allowing the modification of a protein with a fluorophore by using a site-specific bioconjugation reaction. Thanks to this technique, it is possible to obtain near infrared fluorescent agents in a single step.We also focused our work on the design of bimodal nuclear/fluorescent imaging tracers based on protein vectors. These bimodal imaging agents show high potential for numerous medical applications. However, their synthesis requires the coupling of two distinct imaging molecules to the protein, which makes the bioconjugation step even more challenging. In this context, we developed different strategies suitable for the site-specific dual-modification of proteins. These approaches are based on a highly modular trifunctional platform, dichlorotetrazine. Several bimodal nuclear/optical imaging agents were obtained and shown convenient in vivo diagnostic properties.This thesis also presents the elaboration of a new PSMA-specific radiotracer able to detect prostate cancer. The promising results obtained during the preclinical evaluation of this compound labeled with copper-64, make it an interesting candidate for the diagnosis of prostate cancer by positron emission tomography in human

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Gavoille, André. "Application de l'analyse d'images à une classe d'images biologiques particulière : les images de tâches." Paris 12, 1989. http://www.theses.fr/1989PA120047.

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Abstract:

Les images observables en imagerie biologique sont tres variees. Ce travail concerne une classe particuliere de ces images: les images de taches. Ces images biologiques peuvent etre modelisees par un ensemble de zones connexes dispersees sur un fond plus ou moins homogene. Les etalements cytologiques, les cultures de cellules, les gels d'electrophorese, les antibiogrammes, et meme certains tissus fournissent ce type d'images. La methodologie mise en place prend en compte les principaux types de problematiques rencontres, a savoir: le comptage, la mesure, et la classification des objets presents dans l'echantillon. Cette methodologie repose sur la modelisation des elements de l'image par une structure de donnees (enregistrement conditionnel) et un protocole fixe (acquisition, masquage, mesure, classification) pour effectuer l'analyse. Cette methodologie a ete appliquee a la resolution d'un certain nombre d'applications biologiques: la quantification d'agents pharmacologiques fluorescents, l'analyse des microcalcifications dans les mammographies, le comptage de grains d'argent sur coupes histologiques, la mesure du contenu en adn sur lames cytologiques et le comptage de colonies extensives. L'interet de cette demarche est double. D'un point de vue methodologique, elle contribue a mieux definir les problemes poses par une classe d'images donnee, ici les images de taches dans le contexte de l'imagerie biologique. D'un point de vue pratique, elle a permis la mise en place d'un environnement logiciel capable de resoudre les problemes poses par cette classe d'images

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Conrath, John. "Caractérisation de la zone avasculaire centrale chez le diabétique en angiofluorographie rétinienne : corrélations quantitatives et qualitatives, influence des facteurs métaboliques et essai de détection semi-automatisée." Aix-Marseille 2, 2004. http://www.theses.fr/2004AIX20671.

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La rétinopathie diabétique est la deuxième cause de cécité légale en France tous âges confondus, la première chez les moins de 50 ans. L'atteinte rétinienne est une des trois manifestations de la microangiopathie avec la néphropathie et la neuropathie. L'ischémie rétinienne dans le diabète concerne aussi bien les vaisseaux rétiniens périphériques que la vascularisation maculaire. Si la première atteinte est bien connue et comporte un traitement efficace, la panphotocoagulation rétinienne au laser, l'atteinte de la vascularisation maculaire reste moins bien étudiée, peut-être car on ne connaît pas de traitement efficace à l'heure actuelle. Le centre de la rétine maculaire est avasculaire de manière physiologique. Cette Zone Avasculaire Centrale (ZAC) s'élargit au cours du diabète. Nous avons utilisé la banque d'imagerie numérique des services d'ophtalmologie du CHU de Marseille ainsi que les données des services d'endocrinologie, dans une étude rétrospective de 110 patients diabétiques, afin de caractériser la ZAC. 1)-Nous avons trouvé une corrélation entre l'évaluation qualitative de la ZAC (en utilisant le système de grading de l'ETDRS) et la taille de la ZAC (p=0. 03), cette dernière étant plus grande lorsque le grade, c'est à dire le niveau de destruction, est plus élevé. 2)-Nous avons retrouvé un index de masse corporelle significativement plus élevé chez les patients présentant une ZAC normale (p=0. 033) peut-être car certains patients diabétiques de type 2 non-insulinonécessitants, plus obèses, présentent une forme moins grave de la maladie. Nous avons aussi trouvé un effet " protecteur " de la fraction Apo A1 du cholestérol sur la ZAC chez la sous population ayant bénéficié du dosage des apolipoprotéines (p=0. 004). 3)-La ZAC peut être mesurée avec un logiciel d'analyse d'images (ENVI), mais avec une forte dépendance de la qualité des images, et il s'agit d'une sous-estimation par rapport à une étude manuelle par expert
Diabetic retinopathy is the second cause of legal blindness in France and the first cause in the less than 50 years old age group. Retinopathy is one of the three manifestations of diabetic microangiopathy along with nephropathy and neuropathy. Retinal ischemia in diabetes affects peripheral retinal vessels as well as macular vessels. Peripheral ischemia is well known and an effective treatment exists, panretinal photocoagulation. Macular ischemia has been less studied perhaps because there exists no effective treatment for it. The center of the retina is physiologically avascular. This Foveal Avascular Zone enlarges during diabetes. We used our digital image bank of the University Hospital Center of Marseille's ophthalmology departments in a retrospective study of 110 diabetic patients to caracterise the FAZ. We found a correlation between quantitative and qualitative analysis of the FAZ (using the ETDRS grading system) (p=0. 03), with the FAZ enlarging as the grade of macular vessel destruction increased. We found a significantly higher body mass index in patients presenting a normal FAZ (p=0. 033) perhaps because certain type 2 diabetics not requiring insulin present a less severe form of the disease. We also found a protective effect of the Apo A1 fraction of serum cholesterol on the FAZ in the sub-group having undergone that measure (p=0. 004). The FAZ may be measured with an image analysis software programme (ENVI), but it strongly depends upon image quality, and underestimates FAZ surface compared to manual measurement

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Nouizi, Farouk. "Tomographie optique diffuse et de fluorescence préclinique : instrumentation sans contact, modélisation et reconstruction 3D résolue en temps." Phd thesis, Université Louis Pasteur - Strasbourg I, 2011. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00658285.

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Abstract:

La Tomographie Optique Diffuse Résolue en Temps (TOD-RT) est une technique d'imagerie clinique et préclinique en pleine croissance. Elle fournit les cartes d'absorption et de diffusion optique des organes explorés, et les paramètres physiologiques associés. La Tomographie Optique Diffuse de Fluorescence Résolue en Temps (TODF-RT) est basée sur la détection de photons de fluorescence. Elle permet de déterminer les cartes de la concentration et du temps de vie de sondes fluorescentes et d'accéder à une imagerie métabolique et moléculaire très importante pour le diagnostic et le suivi thérapeutique, en particulier en cancérologie. L'objectif de cette thèse était de réaliser des images 3D de TOD/TODF-RT sur des rongeurs en utilisant une technologie optique résolue en temps, les acquisitions étant réalisées à l'aide de fibres optiques disposées autour de l'animal et sans contact avec sa surface. Le travail a été mené en quatre étapes : 1- mise en place d'un dispositif d'imagerie de la surface de l'animal et reconstruction de son contour 3D, 2- modélisation de l'approche sans contact pour la résolution du problème direct, 3- traitement des mesures prenant en compte la réponse impulsionnelle de l'appareil, 4- établissement d'une méthode de reconstruction des images basée sur une sélection de points judicieusement choisis sur les profils temporels. Ces travaux ont permis d'obtenir des images optiques 3D de bonne qualité en réduisant la diaphonie entre l'absorption et la diffusion. Ces améliorations ont été obtenues tout en diminuant le temps de calcul, par comparaison avec les méthodes utilisant la totalité des profils temporels.

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Chomik, Alain. "Déconvolution 3D orientée vers la reconstruction d'objets biologiques observés en microscopie optique de fluorescence." Mulhouse, 1997. http://www.theses.fr/1997MULH0470.

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Ce travail de thèse a porté sur l'étude des algorithmes de déconvolution 3D appliqués à la microscopie optique de fluorescence, où des progrès sensibles ont été réalisés ces dernières années. Ces progrès sont liés au désir des biologistes de faire du microscope non plus un instrument d'observation mais un appareil d'analyse et de quantification 3D des spécimens biologiques fluorescents. Mais le microscope optique conventionnel possède des caractéristiques particulières au niveau de sa fonction de transfert optique dont il faut tenir compte avant l'exploitation des données brutes. Ces particularités vont donner des images dites dégradées par la fonction d'appareil ou réponse impulsionnelle optique que l'on appelle PSF pour Point Spread Function. La déconvolution étant alors incontournable, nous montrons dans le premier chapitre les modèles généraux de formation d'image et les solutions qui en découlent. Nous développons les modèles déterministes et les modèles statistiques, plus particulièrement, les modèles Bayesiens. Dans le chapitre II, nous avons effectué une comparaison des algorithmes issus de ces modèles afin de déterminer lequel d'entre eux s'adapterait le mieux à notre problématique. Dans le chapitre III, nous avons étudié l'influence de différents paramètres d'acquisition d'image sur la déconvolution. Dans le chapitre IV nous proposons une application biologique de la déconvolution. Dans le chapitre V, nous introduisons le modèle de Gibson & Lanni et montrons comment nous l'avons adapté à notre système. Nous insistons sur les particularités du microscope au niveau de sa fonction de transfert optique et proposons une explication simplifiée de la formation d'une image dans le microscope. Dans le chapitre VI, nous évoquons les conditions expérimentales d'analyse des spécimens fluorescents en imagerie puis présentons notre système d'acquisition d'images 3D. Nous discutons des avantages et des inconvénients d'utiliser soit une PSF expérimentale, soit une PSF théorique. Nous proposerons une comparaison en 3D de 4 algorithmes de reconstruction d'images de fluorescence en vue de faire de la quantification volumique. De cette comparaison, il ressort que la méthode du maximum de vraisemblance présente toutes les qualités si l'on ne tient pas compte du temps de calcul nécessaire à la reconstruction. Enfin, nous concluons et présentons les perspectives qu'a entraîné ce travail.

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Manandhar, Sandeep. "3D motion estimation and assessment in fluorescence microscopy volume sequences." Thesis, Rennes 1, 2019. http://www.theses.fr/2019REN1S096.

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Abstract:

Ce travail de thèse porte sur l’estimation et l'évaluation de champs de vitesse 3D dans des séquences d'images 3D de microscopie à fluorescence. Nous nous sommes intéressés aux méthodes de mise en correspondance et aux méthodes variationnelles pour l'estimation du mouvement entre volumes 3D de la séquence. Pour l'appariement, nous avons développé deux extensions 3D originales de PatchMatch, les deux incorporant une mesure de similarité exploitant la signature de Census discrète : une méthode exploitant les super-pixels et qui procède couche par couche dans le volume, et une méthode multi-résolution s’appliquant directement aux volumes. Nous avons par ailleurs conçu une méthode de segmentation des protubérances sur la surface de la cellule et une étape d'appariement des éléments segmentés reposant sur une représentation en mailles triangulaires. En ce qui concerne l'estimation dense des flots 3D, nous avons élaboré plusieurs méthodes variationnelles. Si toutes exploitent la signature Census continue des voxels dans le terme d’attache aux données, elles se distinguent par la nature du terme de régularisation : L2, L1 ou TV. Nous avons également combiné la méthode 3D PatchMatch avec la méthode variationnelle pour appréhender à la fois des mouvements de grande et de petite amplitude. Pour l'évaluation visuelle, nous avons proposé trois techniques différentes de visualisation des flots 3D par code couleur. Elles offrent des vues synthétiques 2D pertinentes du flot 3D calculé, respectivement couche par couche dans le volume, selon des projections tri-planaires, ou par affichage sur l’image obtenue par projection d'intensité maximale. De plus, nous avons défini une nouvelle mesure d’erreur quantitative pour évaluer la précision du flot 3D estimé, lorsqu'aucune vérité-terrain n’est disponible. Elle s'exprime comme la différence angulaire entre l'orientation principale locale dans le volume source et celle correspondante dans le volume rétro-reconstruit à partir du flot 3D calculé. Nous avons testé nos méthodes sur des séquences d'images microscopiques réelles contenant des cellules de mélanome MV3 dans un environnement de collagène. En comparant avec la méthode d'Amat et al. et notre extension 3D de la méthode classique de Horn-et-Schunck, nous avons pu en déduire que nos méthodes sont les plus performantes
The thesis work deals with the computation and the assessment of 3D motion fields in 3D fluorescence microscopy image sequences. We have investigated 3D matching and variational methods for 3D flow field estimation between two consecutive volumes. For matching, we have developed two original 3D extensions of PatchMatch both involving the discrete Census similarity measure: a super-pixel based method that proceeds slice by slice, and a coarse-to-fine method directly applied to the volumes. We have also designed a protrusion segmentation method on the cell surface along with a matching stage relying on a triangular mesh-based representation. Regarding the dense estimation of 3D flow fields, we have adopted a variational approach, while exploiting the continuous Census signature of voxels in the data term. We have tested three regularization terms: L2, L1, and TV-based regularization. We have also combined the 3D PatchMatch method with the variational method to be able to handle simultaneously large and small motion magnitude. For visual assessment, we have proposed three different color-coded visualization techniques of 3D flow fields. They offer 2D summaries of the 3D flow field, respectively, slice-by-slice, with tri-planar projections, and after maximum intensity point projection. In addition, we have defined a new quantitative error measure for assessing the accuracy of the estimated flow field when no ground truth is available. It involves the angular difference between the local principal orientation of the original source volume and the corresponding one in the volume backward-warped with the 3D computed flow field. We have tested our methods on real microscopy image sequences containing MV3 melanoma cells in collagen environment. When comparing with the state-of-the-art method of Amat et al., and our 3D extension of the classical Horn-and-Schunck method, we found our proposed methods to be the best performing ones

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Sivankutty, Siddharth. "Imaging beyond the diffraction limit STED and SAF microscopy." Thesis, Paris 11, 2014. http://www.theses.fr/2014PA112108.

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Abstract:

La compréhension des processus cellulaires au niveau membranaire est un domaine d’étude important en recherche biomédicale. Contourner la limite de diffraction en microscopie de fluorescence est maintenant devenu possible en exploitant les transitions moléculaires du fluorophore. Ce travail présente le développement instrumental de deux techniques complémentaires permettant d’atteindre une résolution nanométrique, grâce à l'émission stimulée (STimulated Emission Depletion - STED) d’une part, et la microscopie de fluorescence aux angles supercritiques (Supercritical Angle Fluorescence, SAF) d’autre part. La microscopie STED est une méthode permettant de surpasser la barrière de diffraction et d’atteindre des résolutions latérales de l'ordre de 40 nm dans des échantillons biologiques. Ce dispositif de microscopie exploite les transitions moléculaires des marqueurs fluorescents pour surmonter la limite de résolution due à la diffraction. L'amélioration de la résolution est obtenue par déplétion de l'état excité du fluorophores dans les régions périphériques de l'espace du volume focal. Cependant, malgré l'amélioration importante de la résolution latérale avec la technique STED, cette dernière présente une réelle complexité de mise en œuvre qui a par conséquence un impact important sur le cout des instruments STED commerciaux. Dans ce contexte, la réalisation instrumentale et la performance en imagerie d'un dispositif STED sont présentées dans ce manuscrit. Bien que les microscopes STED classiques offrent une meilleure résolution latérale, la résolution axiale est toujours limitée par la diffraction. L’amélioration de la résolution dans cette direction implique une certaine complexité instrumentale. Dans ce cadre, nous démontrons une nouvelle approche utilisant l’imagerie SAF permettant d'obtenir un sectionnement axial de l'ordre de 150 nm. L’approche se base sur la propriété d'une molécule à émettre dans les angles supercritiques uniquement lorsqu’elle se rapproche de l'interface verre-eau. Le sectionnement axial est obtenu dans une configuration simple en détectant uniquement les composantes de l’émission supercritique. La combinaison de ces techniques d'imagerie donne un outil puissant pour étudier les phénomènes moléculaires sur les membranes biologiques
Understanding cellular processes on membranes has been a key area of biomedical research. Circumventing the diffraction limit in fluorescence microscopy has now become possible by exploiting the molecular transitions of the fluorophore. In this context, this work presents the instrumental development of two complementary techniques for realizing nanometric all-optical resolution and axial sectioning, namely STimulated Emission Depletion (STED) and Supercritical Angle Fluorescence (SAF) microscopy. STED microscopy is an elegant method that has allowed us to break the diffraction barrier with light microscopes and has achieved resolutions of the order of 40 nm (transverse) in biological samples. In this technique, we exploit the molecular transitions of the fluorescent marker to overcome the resolution limit due to diffraction. Resolution enhancement is achieved by efficient depletion of the excited state of the marker in the peripheral spatial regions of the focal volume by using depletion beams in addition to the excitation beam. Despite the major resolution improvement demonstrated, the technique is not well spread out, mainly due to its apparent complexity; and the cost and limited tunability of the commercial system. In this context, the instrumental realization and the imaging performance of a cost-effective home-built STED microscope is presented in this manuscript. While conventional STED microscopes offer improved lateral resolution, an isotropic gain in resolution usually comes at the cost of complex instrumentation. In this regard, we demonstrate SAF microscopy as a powerful tool that achieves an axial sectioning of the order of 150 nm. This is done by exploiting the property of a molecule to emit into the supercritical anglesonly when near the glass-water interface. Axial sectioning is obtained in a simple configuration by detecting solely the supercritical components of radiation. A combination of these imaging techniques offer a powerful tool to study molecular phenomena on the biological membranes

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Maurice, Vincent. "Fonctionnalisation de nanoparticules de silicium pour l’imagerie biomédicale." Paris 11, 2010. http://www.theses.fr/2010PA112355.

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Abstract:

Nous avons étudié et modifié les propriétés de nanoparticules de silicium produites par pyrolyse laser, en vue de leur utilisation comme marqueurs pour l’imagerie biologique en fluorescence. Dans un premier temps, les propriétés de surface des particules ont été étudiées, en particulier leurs mécanismes d’oxydation. Les particules de silicium sont en effet facilement oxydées en milieu aqueux, entrainant leur destruction si ce phénomène n’est pas contrôlé. La connaissance des facteurs provoquant la dégradation des propriétés des particules en milieu biologique nous a permis de définir la stratégie de fonctionnalisation adoptée pour cette étude. Nous avons choisi de protéger les particules par une couche de silice, formée par sol-gel en phase homogène ou en microémulsion, d’épaisseur allant de 1 à 30 nm environ. Les particules encapsulées ont été caractérisées, en particulier, leur vitesse d’oxydation à pH neutre a été mesurée. Puis elles ont été couvertes d’amines afin de les coupler à des molécules organiques. Des chaînes de PEG ont été greffées sur les amines pour améliorer la stabilité colloïdale des particules ainsi que leur résistance à l’oxydation. Ensuite, nous avons réalisé le greffage d’une protéine, afin d’apporter une fonctionnalité biologique aux particules. Les différentes fonctions greffées ont été dosées par différentes méthodes. Les particules ont également été utilisées pour réaliser des essais d’imagerie biologique ainsi que des mesures de toxicité
We studied and modified the properties of silicon nanoparticles produced by laser pyrolysis, to use them as fluorescent probes for biological imaging. At first, the surface properties of the particles have been studied, especially their oxidation mechanisms. The silicon particles are indeed easily oxidized in aqueous medium, leading to their destruction if this phenomenon is not controlled. Knowledge of factors causing the deterioration of the properties of particles in biological media has allowed us to define the functionalization strategy adopted for this study. We chose to protect the particles with a layer of silica formed by sol-gel process in homogeneous phase or microemulsion, its thickness ranging from 1 to 30 nm. The encapsulated particles have been characterized, in particular, their rate of oxidation at neutral ph was measured. They were then covered with amines in order to graft organic molecules to their surface. PEG chains were grafted onto the amines to improve the colloidal stability of the particles and their resistance to oxidation. Then we performed the grafting of a protein, to provide biological functionality to the particles. The various functions grafted were assayed by different methods. The particles were also used for biological imaging tests as well as measures of toxicity

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Tramier, Marc. "Imagerie des déclins de fluorescence pour l'étude de la dynamique et des interactions de macromolécules en cellules vivantes." Phd thesis, Université Pierre et Marie Curie - Paris VI, 2001. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00003477.

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Abstract:

Le but de notre travail est de développer une imagerie des déclins de fluorescence et d'en démontrer les potentialités pour l'étude de la dynamique macromoléculaire et des interactions entre macromolécules en cellules vivantes. Notre approche repose sur la mesure de la corrélation temporelle de photons uniques de fluorescence (TCSPC) simultanément à la détermination de la localisation spatiale (le long d'une ligne) de la région d'émission. Des images monodirectionnelles de déclins de fluorescence ont ainsi été obtenues représentant la cinétique de fluorescence en différentes régions subcellulaires. Nous avons également mis au point la mesure de déclins d'anisotropie de fluorescence provenant d'un petit volume subcellulaire (1 µm3) sous microscope en mode confocal. Les résultats présentés dans ce mémoire démontrent l'intérêt de cette approche technologique pour des problématiques de biologie cellulaire. Le marquage fluorescent endogène de protéines a été réalisé en les fusionant à la GFP ou un de ses variants spectraux. Les interactions protéine-protéine ont été étudiées soit par hétéroFRET en mesurant la diminution de la durée de vie de fluorescence du chromophore donneur, soit par homoFRET en mesurant la cinétique de dépolarisation de la fluorescence. Nous avons mis en évidence (i) la formation d'hétérodimères de p45 du facteur de transcription NF-E2 avec deux partenaires dans différents compartiments subcellulaires par hétéroFRET, et (ii) l'homodimérisation de la thymidine kinase du virus de l'herpès simplex type 1 de façon plus concluante par homoFRET que par hétéroFRET. Par ailleurs, la mesure des déclins d'anisotropie de fluorescence de l'éthidium comme sonde de la dynamique torsionnelle de l'ADN a révélé l'existence d'une très forte restriction de cette dynamique dans la chromatine non perturbée. Les développements supplémentaires de notre système pour une imagerie bi-dimensionnelle puis tri-dimensionnelle sont prometteurs.

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Dissertations / Theses on the topic 'Imagerie multiplexé en fluorescence'

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