Academic literature on the topic 'Imagerie multiplexé en fluorescence'

BackgroundHematoxylin and eosin (H&E) staining is a traditional and widely used histological stain for elucidating tissue morphology for pathological review. However, H&E staining is not fully removable and prevents or severely limits any further use of the same tissue section. We have developed a method for accurately simulating the H&E staining pattern via removable fluorescent dyes that allows for subsequent re-use of the same tissue section for multiplexed immunofluorescent (mIF) staining methods with no decrease in performance. This workflow allows for the pathological pre-screening, annotation, and triaging of samples to undergo multiplexed IHC.This study demonstrates a novel procedure for creating a realistic and accurate ‘H&E’ view of formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) sections stained with mIF protocols. The novel stain reveals morphological details and can be removed before applying Akoya Biosciences ‘MOTiF’ 6-plex mIF staining.MethodsSerial FFPE lung cancer sections were used in this study. After deparaffinization and rehydration, these slides were divided into 3 groups. The first group was stained with a traditional H&E protocol. The second group was stained using a MOTiF™ PD-1/PD-L1 Panel kit (Akoya Biosciences, Inc.). The third group was stained with H&E simulation staining reagents, imaged and re-stained using a MOTiF™ PD-1/PD-L1 Panel kit (Akoya Biosciences, Inc.) after removal of the H&E simulation reagents. Multispectral fluorescence imagery was acquired on a Vectra Polaris® automated imaging system and analyzed with inForm® and RStudio software. H&E simulation images are manipulated to represent bright-field H&E using Phenochart and inForm® software (Akoya Biosciences, Inc.).ResultsMimic bright-field H&E images from the simulated H&E staining produced results qualitatively indistinguishable from the traditional H&E-stained lung cancer section. Spectral unmixing and staining intensity analysis showed an improvement in signal for all protein targets in the mIF staining from the simulated H&E-stained group (third group) versus the non-simulated H&E-stained group (second group). Background staining analysis showed no significant corresponding increase in background signal across any of the mIF channels.ConclusionsThis new fluorescent morphology staining method for creating a simulated H&E view facilitates the integration of mIF analysis methods into digital pathology workflows by giving pathologists familiar, conventional views of mIF-stained tissue sections. It enables the assessment of tissue quality prior to antigen retrieval treatment and the H&E-based annotation of mIF imagery and supports eventual translation of mIF methods into clinical standards-of-care.

Notre groupe de recherche avait déjà mis au point les protocoles OPIOM pour l’imagerie par fluorescence. En exploitant les sections efficaces de photoswiching de fluorescence, OPIOM permet d’extraire sélectivement la réponse des fluorophores réversiblement photoswitchables (RSFs) en présence de fluorophores interférant spectralement. Cependant, OPIOM nous a permis de ne distinguer que 3 RSFPs spectralement similaires. L’objectif de cette thèse était d’augmenter ce nombre. Pour atteindre cet objectif, un nouvel instrument automatisé appelée photoswichomètre a été mis au point pour cribler la signature photochimique de 22 RSFP en analysant leur réponse de fluorescence aux sauts de lumière dont l’intensité couvre 5 ordres de grandeur. Cette signature a d’abord été exploitée dans un nouveau protocole d’imagerie par fluorescence appelé HIGHLIGHT, qui a capitalisé sur OPIOM et amélioré encore sa sélectivité. Dans HIGHLIGHT, les RSFs sont soumis à une modulation harmonique de la lumière et leur contribution aux signaux d’émission de fluorescence globale est sélectivement récupérée en exploitant leur réponse non linéaire singulière dans des conditions optimisées. HIGHLIGHLIGHT a été implémenté pour l’imagerie des RSFPs dans les cellules sans interférence d’autofluorescence, pour réaliser l’imagerie multiplexée de 3 RSFPs qui ne pouvaient pas être discriminés avec OPIOM, aussi pour améliorer l’effet de sectionnement optique. La signature des RSF a ensuite été utilisée dans un deuxième protocole d’imagerie par fluorescence appelé LIGHTNING. Contrairement à OPIOM et HIGHLIGHT qui exploitent les sections efficaces de la photoswitching en régime permanent de faible intensité lumineuse, LIGHTNING exploite le régime transitoire des RSFs sous de multiples illuminations impliquant diverses gammes d’intensités lumineuses pour la discrimination RSF. Ainsi, LIGHTNING nous a permis d’améliorer le degré de multiplexage du contraste dynamique en imagerie de fluorescence jusqu’à 20 RSFP sur 22 RSFP étudiés
Our research group had previously developed the OPIOM protocols for fluorescence imaging. By exploiting their cross sections of fluorescence photoswiching, OPIOM can selectively extract the response of reversibly photoswitchable fluorophores (RSFs) in the presence of spectrally interfering fluorophores. However, OPIOM allowed us to discriminate only 3 spectrally similar reversibly photoswitchable fluorescent proteins (RSFPs). The goal of this PhD was to augment this number. To reach this goal, a new automated instrumental setup called photoswichometer was first developed to express and screen the rich photochemical signature of 22 RSFPs by analyzing their fluorescence response to light jumps with intensities covering 5 orders of magnitude. This signature has been first exploited in a new fluorescence imaging protocol called HIGHLIGHT, which capitalized on OPIOM and further improved its selectivity. In HIGHLIGHT, the RSFs are submitted to harmonic light modulation and their contribution to the overall fluorescence emission signals is selectively retrieved from exploiting their singular non-linear response under optimized conditions. HIGHLIGHT has been implemented to image RSFPs in cells without interference of autofluorescence, to perform multiplexed imaging of 3 RSFPs which could not be discriminated with OPIOM, and used for its intrinsic optical sectioning. The RSF signature has been then used in a second fluorescence imaging protocol called LIGHTNING. In contrast to OPIOM and HIGHLIGHT which exploit the cross sections of fluorescence photoswitching in a steady-state regime of low light intensity, LIGHTNING exploits the transient time fluorescence response of RSFs under multiple illuminations involving various ranges of light intensities for RSF discrimination. Thus, LIGHTNING allowed us to improve the multiplexing degree of dynamic contrast in fluorescence imaging up to 20 RSFP among 22 studied RSFPs

Ce travail de thèse a porté sur le développement de réseaux de micro- et nanocapteurs opto-électrochimiques pour la bioanalyse. Ils répondent à la demande grandissante dans le domaine de la recherche et du diagnostic pour des outils permettant de réaliser de multiples analyses simultanément avec des échantillons de faibles volumes. Ces nouvelles biopuces de haute densité sont fabriquées à partir de faisceaux cohérents de fibres optiques. Une des deux faces est micro- ou nanostructurée par une attaque chimique, puis fonctionnalisée avec une sonde biologique. La première biopuce est un réseau de nanocapteurs fluorescents à ADN où les sondes ont été immobilisées grâce aux propriétés d’électropolymérisation du pyrrole. La lecture est réalisée à distance au travers du faisceau d’imagerie. En combinant la technique d’immobilisation avec des microleviers électrochimiques, plusieurs sondes différentes ont pu être adressées sur le même réseau nanostructuré. La seconde biopuce permet d’effectuer des immunodosages multiplexés en utilisant l’imagerie électrochimiluminescente résolue à l’échelle d’une microsphère. Le développement de cette technique permet de combiner les avantages de l’électrochimiluminescence avec des immunodosages multiplexés. L’élaboration de ces réseaux allie différentes techniques physico-chimiques, notamment électrochimiques, pour obtenir des biopuces avec un fort potentiel, grâce à une densité et un degré de multiplexage importants
This work presents the development of optoelectrochemical micro- and nanosensor arrays for bioanalytical applications. These platforms respond to the growing need in research and diagnostic for tools allowing multiple and simultaneous analysis in small-volume samples. These new high density biochips are made from coherent optical fiber bundles: one face is micro- or nanostructured by chemical etching and then functionnalized with biological probes. The first biochip is a fluorescent DNA nanosensor array where probes have been immobilized by electrodeposition of a polypyrrole thin film. The detection of the hybridization is remotely performed through the imaging fiber. Different probes were succesfully addressed onto the same nanostructured array thanks to electrochemical cantilevers. The second biochip allows multiplexed sandwich immunoassays using electrochimiluminescent imaging resolved at the single bead level. In particular, the development of this new readout mechanism allows extending electrochemiluminescent detection for multiplexed immunoassays. Design and implementations of both platforms take advantages of different physical and chemical techniques, especially electrochemical, to obtain biochips with a great potential through high density and high multiplexing level

L'imagerie médicale sur petits animaux est d'une grande utilité en recherche préclinique, car elle permet d'imager in vivo et en 3D l'intérieur de l'animal. Ceci sert au développement de nouveaux médicaments et au suivi de l'évolution de certaines pathologies. En effet, les techniques d'imagerie éliminent la nécessité de sacrifier les animaux, ce qui permet le suivi de processus biomoléculaires sur un même individu et l'obtention de données statistiquement plus significatives. Cependant, l'information moléculaire recueillie s'avère généralement de faible résolution spatiale, notamment en imagerie optique à cause de la diffusion de la lumière, et donc difficile à localiser dans le corps de l'animal. Le jumelage de modalités d'imagerie complémentaires permet donc d'obtenir des images anatomiques et moléculaires superposées, mais cela s'avère toutefois relativement coûteux. Le projet présenté vise à améliorer une technique d'imagerie 2D toute optique à faible coût permettant d'obtenir une carte approximative 3D des organes internes d'une souris. Cette technique devrait permettre le recalage spatial automatique d'informations moléculaires obtenues sur le même appareil, bien que cela n'ait pas encore été démontré. L'amélioration apportée par le projet consiste à obtenir des images anatomiques 3D, plutôt que 2D, en utilisant une caméra tournante et des techniques de vision numérique stéréo. Pour ce faire, la technique existante est d'abord reproduite. Celle-ci consiste à injecter de l'ICG , un marqueur fluorescent non spécifique qui demeure confiné au réseau vasculaire une fois injecté, à une souris anesthésiée. De par leurs métabolismes distincts et le temps que met l'ICG à atteindre chacun d'eux, la dynamique de fluorescence varie entre les organes, mais demeure relativement uniforme à l'intérieur d'un même organe. Certains organes peuvent donc être segmentés par des techniques appropriées de traitement de signal, telles l'analyse en composantes principales et la régression par moindres carrés non négative. Un système d'imagerie à caméra rotative comme le QOS® de Quidd permet d'obtenir des images 2D segmentées de l'anatomie. interne de l'animal selon plusieurs plans de vue. Ces plans de vue servent à reconstruire l'information anatomique en 3D par des techniques de vision numérique. La procédure pourrait être répétée avec un ou plusieurs marqueurs fluorescents fonctionnalisés dans le but d'obtenir des images moléculaires 3D du même animal et de les superposer aux images anatomiques 3D. La technique développée devrait ainsi permettre d'obtenir à faible coût et de manière toute optique des images 3D anatomiques et moléculaires recalées spatialement automatiquement.

Le phytoplancton joue un rôle fondamental dans le monde du vivant. C’est un générateur de dioxygène et le plus important fixateur de dioxyde de carbone sur Terre. Cependant, sous certaines conditions, son développement peut devenir envahissant et il peut être néfaste pour la santé des autres végétaux et animaux aquatiques. Il s’agit du phénomène d’hyper eutrophisation. Ce phénomène peut mener à des conséquences dramatiques pour l’environnement, car il limite les échanges de gaz et le processus de photosynthèse des autres espèces végétales. Dans un cas extrême, ce processus peut causer la mort de tout l’écosystème aquatique. Il apparait donc essentiel de renforcer la vigilance et le contrôle de la prolifération du phytoplancton et notamment de leur toxicité. Dans une première approche la reconnaissance et l’identification des organismes aquatiques, nécessaires pour la surveillance, sont réalisés par des systématiciens par observations microscopiques. Néanmoins, dans certaines circonstances, il peut être utile d’avoir un système automatique de reconnaissance pour améliorer la surveillance et optimiser l’intervention de l’homme. Le développement d’un tel système de reconnaissance des organismes aquatiques est de plus en plus envisagé.Dans l’objectif d’identifier les organismes aquatiques, un système microscopique original a été développé au cours de cette thèse dans lequel les faisceaux incident et émis sont filtrés par bande sélective de longueur d’onde. Ce double système de filtration permet l’acquisition d’images microscopiques classiques et d’images de fluorescence de la matière organique végétale sous différente illumination. Ensuite, les différentes images obtenues sont analysées et traitées par deux algorithmes de segmentation pour extraire des caractéristiques morphologiques et la composition des pigments, utilisées par la suite pour la reconnaissance automatique. Finalement, toutes les caractéristiques associant la morphologie et les données de fluorescence des espèces du phytoplancton, sont réunies dans une base de données permettant la reconnaissance optique et automatique du phytoplancton
Phytoplankton plays a fundamental role in the living world. It is a dioxygen generator and the most important carbon dioxide fixer on Earth. However, under certain conditions, its development may become so excessive that it could be harmful to other vegetal and animal aquatic life in the water ponds in which it grows: it is the “hyper eutrophication” phenomenon. Such a situation leads to dramatic consequences on environment due to the difficulties that arise for photosynthesis and gas exchanges of other plant species. At the extreme limit, this can cause the death of the whole aquatic ecosystem. It appears therefore essential to strengthen the vigilance on controlling the proliferation of plankton and toxins with the necessity of risk evaluation. In a first approach, the recognition and the identification of aquatic organisms, necessary for such a control, are usually performed only by specialists algologists from microscopic observations. Nevertheless, in certain circumstances, it may be useful to dispose of an automatic recognition system to improve the monitoring of high-risk water ponds and optimize human intervention of specialists algologists. The development of such an automatic system of recognition of aquatics organism is more and more considered.In order to identify aquatic organisms, an original optical microscopy set up was developed in which the incident and emitted light beams are filtered in wavelengths. Such a set up enables the acquisition of classical microscopic images and microscopic images of fluorescence emission of the vegetal material under different illumination. These different images are then analyzed and processed by two algorithms of segmentation to collect characteristics data of the vegetals morphology and pigments compositions useful thereafter for their automatic recognition. Finally, all these different characteristic parameters linked to morphology and fluorescence emission of the vegetal species are collected to build a database useful for automatic optical recognition

En raison de leurs propriétés magnétiques, les nanoparticules d'oxyde de fer sont de plus en plus utilisées pour le diagnostic et le traitement du cancer. L'un des principaux défis des nanoparticules magnétiques en nanomédecine est leur ciblage efficace, c'est-à-dire leur administration rapide et spécifique directement dans les cellules visées. La transferrine est une des deux protéines impliquées dans la principale voie d'acquisition du fer. En effet, la transferrine interagit avec son récepteur spécifique et le couple transferrine-récepteur traverse la membrane plasmique par endocytose en quelques minutes. De plus, la surexpression du récepteur 1 dans les cellules cancéreuses favorise l'internalisation de la transferrine, ce qui en fait un cheval de Troie idéal pour le transport des nanoparticules. Dans cette thèse, des nanoparticules de maghémite de taille 5, 10 et 15 nm ont été synthétisées par le procédé polyol, fonctionnalisées avec du 3-aminopropyltriéthoxysilane et couplées à la transferrine. Pour chaque taille, le taux de greffage a été déterminé et l'interaction in vitro avec le récepteur a été étudiée. Ensuite l'étude in cellulo a été réalisée en comparant l'internalisation des nanoparticules nues ou greffées à la transferrine. L'efficacité du ciblage a été étudiée par magnétophorèse et par microscopie confocale de fluorescence. Les nanoparticules vectorisées sont rapidement internalisées dans les cellules HeLa. Ainsi une relation entre la taille des nanoparticules et leur efficacité pour la vectorisation a été. La comparaison de nos résultats avec ceux de la littérature a mis en évidence un modèle prometteur à base de nanoparticules pour des applications théraneustiques
Due to their magnetic properties, iron oxide nanoparticles are widely used for their significant role in the diagnostic and treatment of cancer. One of the main challenges of magnetic nanoparticles in nanomedicine is their effective targeting, which consists of their fast and precis( delivery directly into destination cells. Transferrin is one of the two proteins involved in the major iron acquisition pathway. Indeed, via its interaction with Receptor 1, transferrin crosses the plasma membrane within few minutes by receptor-mediated endocytosis. Furthermore, the overexpression of transferrin-receptor 1 in cancer tells enhances transferrin internalization making it a perfect Trojan horse for nanoparticles delivery. In this work, 3 different sizes of maghemite nanoparticles (5, 10 and 15 nm) were synthetized by the polyol method, coated with 3-aminopropyltriethoxysilane and coupled to transferrin. For each size, the ratio of transferrin per nanoparticle was determined and the interaction in vitro with the receptor was investigated. Then a comparative study of internalization was conducted in cellulo between raw and grafted to transferrin nanoparticles. The efficiency of the targeting was analyzed by magnetophoresis and confocal fluorescence microscopy. All grafted nanoparticles were rapidly internalized in HeLa cells. Thus a relationship between the size of th( constructs and their efficacy in nanoparticles delivery was established. A comparison of our resuits with those of the literature shows a promising model for theragnostic devices

Les techniques classiques qui donnent les cartographies des macroalgues émergées ne permettent pas de diagnostic lorsque les algues sont immergées. Une méthodologie pour l'identification des groupes (rouge, vert, brun) de macroalgues immergées est proposée. Dans un premier temps, grâce à un spectrofluoromètre, l'enregistrement des spectres de fluorescence sous forme de matrice d'excitation-émission (eem) révèle le comportement spectral des trois groupes de macroalgues et fixe les paramètres spectraux de la technique d'imagerie. Ensuite, l'imagerie de la fluorescence émise par les macroalgues, induite par laser, ajoute la dimension spatiale aux informations spectrales pour le diagnostic. Une étude systématique est effectuée en laboratoire sur des macroalgues immergées dans un aquarium et excitées par un laser accordable de type opo (oscillateur paramétrique optique) de 400 à 640 nm. Une caméra ccd intensifiée précédée d'un filtre visualise la fluorescence émise par les algues à 680 nm. L’étude précise de la série d'images de fluorescence induite est réalisée et il est démontré que seul un rapport de deux de ces images correspondant à deux longueurs d'onde d'excitation différentes permet de définir des seuillages peu sensibles à la profondeur d'eau traversée par les faisceaux lumineux. Les performances de la méthode sont validées sur plusieurs macroalgues démontrant ainsi son potentiel pour une adaptation in situ. En conclusion, nous présentons une évaluation des paramètres physiques du système d'imagerie adaptés à un diagnostic in situ.

L’analyse de populations cellulaires sanguines permet de détecter de nombreuses pathologies cliniques. Un grand nombre de cellules doit être pris en compte de manière à obtenir un résultat statistiquement répétable, et donc un diagnostic fiable. Les systèmes équipant les laboratoires spécialisés utilisent la cytométrie de flux, les mesures sont séquentielles pour chaque paramètre et cellule. Afin d’accélérer le processus d’analyse et minimiser la complexité et le coût des dispositifs, l’enjeu est de maximiser le contenu informationnel des acquisitions, afin d’en réduire le nombre. Dans cette thèse nous étudions l’imagerie grand champ comme alternative à la cytométrie de flux. L’objectif est de développer un système optique permettant l’étude de populations cellulaires tout en préservant une résolution subcellulaire. Nous suivons une approche multi-échelle et multimodale pour détecter, caractériser et classifier les cellules sanguines. Pour évaluer la faisabilité et la pertinence clinique de la méthode, nous avons mis au point deux systèmes. Le mésoscope, basé sur des développements optiques, couple les contrastes de phase et de fluorescence. La complémentarité des critères morphologiques et de l’expression spécifique d’un fluorophore permet une classification cellulaire, afin par exemple d’évaluer le taux d’érythrocytes infectés par le parasite P. falciparum. Les résultats sont systématiquement comparés aux méthodes de références. Afin de répondre aux enjeux posés par les analyses délocalisées, nous proposons également un imageur bimodal miniaturisé, basé sur la technologie d'imagerie sans lentilles, le miniscope
Blood cell population analyses allow detecting a wide scope of clinical disorders, ranging from anemias to malaria. A very large number of cells ought to be considered so as to ensure the statistical significance of the result, and in turn, yield a reliable diagnosis. Currently, hematology analyses are based on flow cytometry techniques. High throughput is obtained at the expense of the information content of each acquisition. To reduce the time-to-result, and to minimize the complexity and cost of the systems dedicated to analyzing cell populations, the current need is to reduce the number of acquisitions and optimize the information content. This thesis focuses on single-shot image cytometry as an alternative to flow-based cytometry. It aims at obtaining a set-up based on optical contrasts for the study of large cell populations while preserving the ability to resolve individual cells. We investigate a multi-scale and multi-modal approach to detect, characterize, and classify blood cells. To evaluate the feasibility and clinical relevance of the method, we developed two proof-of-concept set-ups, respectively called the mesoscope and the miniscope. The mesoscope, based on optical developments, combines phase contrast with fluorescence. The complementarity of morphological features and the expression of specific fluorophores enables us to accurately classify blood cells, and for example assess Plasmodium falciparum parasitemia in whole blood samples. The results are benchmarked to reference techniques. However, to address the need for point of care analyses, the system should be miniaturized. Hence, we designed the miniscope, a chip-based bimodal imager

Cette thèse s’inscrit dans le développement et l’évaluation de nouvelles plateformesmoléculaires pour une application en imagerie optique par fluorescence. Nous avons cherché àdévelopper de nouveaux outils multifonctionnels et modifiables à façon. Cette approche estnécessaire car l’introduction d’un fluorophore peut fortement influencer les propriétés ducomposé final. Cela signifie que l’introduction du fluorophore sur l’agent sélectionné doit avoirêtre réalisé dès le départ. Pour cela deux axes principaux ont été étudiés; le premier consiste àutiliser des BODIPY pour le développement d’agents thérapeutiques traçables pour uneapplication principalement in vitro; le deuxième cible sur la conception de plateformes à based’AzaBODIPY compatibles avec l’imagerie in vivo.Dans la première partie deux fluorophores à base de 3,5-dichloro-BODIPY ont été identifiéscomme plateformes prometteurs. Ils ont été fonctionnalisés sélectivement par un agent or(I)-phosphine, un thiosucre et un phosphonium afin de pouvoir étudier l’influence du positionnementde chaque substituant sur les propriétés finales. Nous avons pu démontrer qu’unefonctionnalisation sélective et spécifique est possible avec ces substituants fragiles ; cela nous apermis de développer 12 agents théranostiques à base d’or(I). Les propriétés photophysiques etbiologiques ont ensuite été évaluées; pour cela nous avons déterminé leurs propriétés antiprolifératives (3 lignés cellulaires), la balance hydrophile, l’accumulation d’or dans les cellules etla localisation des composés des composés par microscopie confocale. Cette stratégie deplateforme multifonctionnelle nous a permis de développer un panel de composés traçables ayantdes activités mixtes ainsi que des distributions cellulaires distinctes. Cette étude a permisl’identification et la sélection de trois ou quatre composés qui feront l’objet d’une étudeapprofondie.Dans la deuxième partie de cette thèse nous avons développé des plateformes multifonctionnellescompatibles avec l’imagerie in vivo; pour cela nous avons poursuivi deux approches différentes.La première était l’utilisation de 1,7-di(phenol)3,5-di(phenyl)-azaBODIPY, suivi par safonctionnalisation sur les groupements OH afin de développer un traceur bioconjugablefluorescent dans le proche infrarouge (NIR-I). Malheureusement ce traceur possède despropriétés optiques très défavorables. Nous avons alors développé une approche innovante baséesur la fonctionnalisation de l’atome de bore. En s’appuyant sur cette approche deux traceursfortement fluorescents dans le proche infrarouge et solubles dans l’eau ont été développés. Cesfluorophores ont été conjugués sur un anticorps innovateur afin de permettre l’imagerie optiquedu ligand PD-L1. Les traceurs se sont montrés stables pour au moins 48h dans le plasma murin etpossèdent de très bonnes propriétés optiques. Comme preuve de concept nous avons conduitune étude préclinique in vivo. Cette étude a montré que les traceurs sont fortement fluorescents(NIR-I) et ne possèdent pas de toxicité imminente.La méthodologie développée pendant cette thèse présente un grand potentiel pour des étudesallant plus loin et des futures applications ; il est possible d’appliquer les principes et outilsdéveloppés sur d’autre fluorophores ; la méthodologie permet une fonctionnalisation très richeavec une grande variété de substituants d’intérêt. Son utilisation n’est pas limitée aux applicationsbiologiques, biochimiques et médicinales
The objective of this thesis was the development and evaluation of new molecular platformsfor optical fluorescence imaging applications. This work sought to develop new tools that caneasily be modified and adapted to the specific needs of the intended use. This is required asthe fluorophore will influence the final properties and should thus be incorporated beforestructural optimization of the selected agent rather than at the very end. Two main axes wereexplored; the use of BODIPYs for the development of trackable therapeutic agents that areprimarily intended for in vitro applications and the use of azaBODIPYs for the design of an invivo compatible fluorescent platform.In the first part two fluorophores on the basis of a 3,5-dichloro-BODIPY were identified aspromising platforms. These platform molecules were selectively functionalized using a gold(I)-phosphine moiety, a thiosugar and a phosphonium to explore their selective functionalizationand investigate the influence of each substitutents position on the final properties. Weshowed that a site-specific, selective functionalization with these fragile substituents ispossible and developed 12 gold(I)-bearing therapeutic agents. We evaluated thephotophysical properties of all obtained compounds which was followed by a characterizationof their biological properties (antiproliferative properties on 3 cancer cell lines, lipophilicbalance and cellular gold accumulation as well as fluorescence imaging on 3 cell lines for upto 24h). We succeeded in developing a panel of closely related trackable compounds thatdisplay mixed activity in cells and distinct cellular localization. This investigation permitted theselection of three to four hits that will be studied further.In the second part we developed an in vivo-compatible multifunctional platform following twostrategies: the first was the use of 1,7-di(phenol)-3,5-di(phenyl)-azaBODIPY and thefunctionalization of the hydroxy groups for the development of a bioconjugable NIR-I probe.Unfortunately the developed probe displayed very unfavourable optical properties; wetherefore developed a new strategy that is entirely based on the functionalization of the boronatom. Using this approach we successfully synthesized 2 watersoluble, strongly fluorescent(NIR-I) molecular platforms that were conjugated to an innovative antibody to image the PD-L1 ligand. The developed probes displayed excellent optical properties, are stable for at least48h in mice plasma and were validated in a preclinical study on mice. The developed probesdisplayed strong fluorescence in vivo and showed no acute toxicity.The developed methodology shows great potential for further investigations and futurestudies; it can be transposed onto other closely related fluorophores and permits versatilefunctionalization with a large variety of compounds of interest. Its use is thus not limited tobiological, biochemical and medical applications

Obtenir des informations sur la matière à des échelles micrométriques, de manière non destructive et sans utiliser aucun marquage reste un défi méthodologique et technologique. Les techniques établies de microscopie de fluorescence ont permis de réelles avancées dans la compréhension des phénomènes biologiques mais le marquage utilisant des fluorophores limite considérablement cette technique, en particulier dans le domaine biomédical. Depuis une quinzaine d’année, la microscopie Raman cohérente a connu un important essor. Basée sur les propriétés vibrationnelles des molécules, cette technique permet aujourd’hui une imagerie tridimensionnelle des liaisons chimiques à cadence vidéo. De nombreux développements ont permis, à partir des concepts de la diffusion Raman et de l’optique non linéaire, d’élaborer des outils technologiques puissants permettant d’imager les échantillons biologiques en utilisant les contrastes de diffusion Raman anti-Stokes et de diffusion Raman stimulée. Dans ce chapitre, nous développons tout d’abord, grâce à des modèles simples, ces processus clés permettant d’appréhender la physique sous-jacente à l’imagerie Raman cohérente. Ensuite, nous illustrons ces techniques d’imagerie au travers de travaux menés récemment sur des échantillons biologiques et cristallins. Nous discutons enfin les perspectives actuelles concernant l’évolution des technologies et leurs domaines applicatifs.