Academic literature on the topic 'Idrogenesi'

Le FeFe idrogenasi sono metalloenzimi che catalizzano l’ossidazione e la produzione di H2. Il ciclo catalitico e vari aspetti di questi enzimi, come l’inattivazione in condizioni aerobiche e anaerobiche, sono tutt’ora oggetto di studio. Per ottenere informazioni sulla struttura elettronica del sito attivo delle FeFe idrogenasi vengono abitualmente impiegate tecniche spettroscopiche, grazie alle quali viene determinato l’assorbimento di luce a diverse lunghezze d’onda da parte dell’enzima. In questa tesi, invece, abbiamo sviluppato una nuova tecnica, detta “fotoelettrochimica diretta”, in cui l’enzima è direttamente collegato ad un elettrodo, che può essere illuminato da una sorgente luminosa, e la frequenza di turnover viene direttamente misurata sotto forma di corrente elettrica. Monitorando le variazioni dell’attività dell’enzima in presenza di irraggiamento, possiamo determinare l’assorbimento del sito attivo in funzione della lunghezza d’onda e della potenza della sorgente luminosa. Concentrandoci sulle variazioni della frequenza di turnover, siamo certi che stiamo indagando l’effetto della luce localizzato sul sito attivo. Abbiamo utilizzato la fotoelettrochimica diretta per studiare l’effetto dell'irraggiamento, per mezzo di laser monocromatici, sulla cinetica di inibizione da CO in tre distinte FeFe idrogenasi. Abbiamo determinato lo spettro d’azione della fotodissociazione del CO inibitore e abbiamo descritto il processo a livello QM per la prima volta, ottenendo un buon accordo tra dati sperimentali e teorici. Ci siamo poi focalizzati sullo studio della fotoinibizione dell’enzima. Tramite esperimenti di fotoelettrochimica, in cui la proteina è stata illuminata per mezzo di laser monocromatici, una lampada alogena o una lampada allo xeno, abbiamo determinato che le FeFe idrogenasi di C. reinhardtii e C. acetobutylicum sono inattivate irreversibilmente dai raggi UVB. Utilizzando DFT e TDDFT, abbiamo concluso che le fasi iniziali della fotoinibizione consistono nella fotodissociazione di uno dei carbonili intrinsecamente legati al sito attivo, seguita dalla formazione di specie stabili inattive. Infine, abbiamo condotti esperimenti preliminari per esaminare l’effetto della luce sull’attività di altri due metalloenzimi: la monossido di carbonio deidrogenasi (CODH) e la NiFe idrogenasi. L’attività catalitica della CODH non viene alterata dall’illuminazione, mentre la riattivazione dell’enzima, in seguito ad esposizione all’ossigeno, è più rapida in presenza di illuminazione con una lampada allo xeno. Inoltre, la NiFe idrogenasi, in una forma inattiva, si riattiva più rapidamente in presenza di irraggiamento con un laser violetto/blu che al buio. I risultati dimostrano la solidità di questo approccio metodologico, che combina elettrochimica diretta e TDDFT, e forniscono nuove informazioni sulle proprietà chimiche e fotochimiche di vari metalloenzimi.
FeFe hydrogenases are metalloenzymes that catalyze the oxidation and production of H2. The catalytic cycle and many aspects of the reactivity of these enzymes, including their aerobic and anaerobic inactivation, are still the subjects of intense investigations. Spectroscopy is commonly used to obtain information on the electronic structure of the active site of FeFe hydrogenases, by determining the absorption of the enzyme at different wavelengths. In contrast, in this thesis, I propose to use in this context a new technique which we have called "direct photoelectrochemistry", whereby the enzyme is directly wired to an electrode which can be irradiated with a light source, and the turnover frequency is measured as a current. We can detect the absorption of the active site as a function of light wavelength and power by monitoring changes in reactivity upon irradiation. Focusing on the variations of turnover rate, we are sure that we are studying the effect of light on catalytic intermediates. I used direct photo-electrochemistry to study the effect of monochromatic irradiation in the visible range on the kinetics of inhibition by CO of three distinct FeFe hydrogenases. I determined the action spectrum of the photo-dissociation of the inhibitor CO and I described the process at the QM level for the first time, obtaining good agreement between experiments and theory. I also studied the photoinhibition of the enzyme. I carried out photoelectrochemistry experiments irradiating the protein with monochromatic visible light laser diodes, a halogen lamp or a xenon lamp, and I observed that the FeFe hydrogenases from C. reinhardtii and C. acetobutylicum are irreversibly inactivated by UVB light. Using DFT and TDDFT, I concluded that the initial steps of photoinhibition consist in the photodissociation of one carbonyl intrinsic ligand of the active site, followed by the formation of a stable inactive species. I also performed preliminary experiments to examine the effect of light on the activity of two other metalloenzymes: Carbon monoxide dehydrogenase (CODH) and NiFe-hydrogenase. I observed that the turnover rate of CODH is not affected by light, but the reactivation of the enzyme after exposure to oxygen is faster upon irradiation with white light. I also showed that the oxidized, inactive form of NiFe-hydrogenase reactivates more quickly upon irradiation with violet/blue light than in the dark. My results illustrate the strength of the methodological approach that combines direct electrochemistry and TDDFT, and reveal new insights in the chemical and photochemical properties of several metalloenzymes.

Hydrogenases, a family of metalloenzymes that produce molecular hydrogen (H2) from protons and electrons according to the equation 2H+ + 2e- ? H2, seem to be very promising in terms of bio-hydrogen production as non-polluting fuel. At present, two major difficulties slow the progress and the achievements of a bio-H2-based biotechnology in the field of renewable energies: i) the low efficiency of conversion, in term of energy employed to produce molecular hydrogen and ii) the extreme sensitivity to molecular oxygen, a key feature of most hydrogenases that remains yet misunderstood and imposes to these processes a condition of strict anaerobiosis. In this context, only an extensive study on the molecular mechanisms of both catalytic activity and oxygen intolerance of hyrogenases could overcome these obstacles. My PhD project focused on the preliminary biochemical and fuctional characterization of [FeFe]-hydrogenases from Enterobacter cloacae and Thermotoga neapolitana. The first hydrogenase I studied was the one from E. cloacae IIT-BT 08, a high yield H2 producing bacterial strain. This protein is much smaller than previously known [FeFe]-hydrogenases, yet retaining a high catalytic activity, and could represent a good model to study the mechanism of catalysis of more complex hydrogenases. In this work I obtained, in conditions of strict anaerobiosis, a partially pure recombinant StrepII-tagged [FeFe] hydrogenase from E. cloacae, which has been analyzed by preliminar biochemical studies, including iron content determination, EPR analysis and activity assay. Based on the results of these analysis, I concluded that this protein shows no evidence for an hydrogenase, thus supporting the general skepticism of the scientific community about the E. cloacae enzyme. In the second part of my work I studied the T. neapolitana hydrogenase. T. neapolitana is a hyperthermophilic microorganism which is able to grow and produce hydrogen gas even in microaerobic conditions; for this reason, its enzyme, one of most complex [FeFe]-hydrogenases, never charaterized before, could be a best model to describe the oxygen tolerance of this class of enzymes. In order to investigate on the potential oxygen tolerance of this protein, I expressed it in a E. coli based heterologous system and I obtained a functional enzyme. With this set up, I would investigate the oxygen tolerance of T. neapolitana hydrogenase by means of a site-directed mutagenesis based structure-function relationship study. The last part of my work was dedicated to the study of one interesting [FeFe]-hydrogenase maturase, the HydF protein, from T. neapolitana. Because all [FeFe]-hydrogenases share a very uncommon and complex active site, they requires a special set of maturase proteins for their biosynthesis. Three of these maturases, HydE, HydF and HydG, recently discovered, are present in all organisms containing [FeFe]-hydrogenases and are extremely important for the functionality of this enzymes. In order to elucidate the structure and function of this HydF protein, which are still unknown, I overexpressed it in E. coli cells, purified it and crystallized it. Furthermore, in this study I discovered a new feature of this protein, which is present in solution only in two oligomeric forms (dimer and tetramer), which have been isolated and subjected to crystallization and X-ray analysis.
Le idrogenasi, una famiglia di metallo enzimi che catalizzano la produzione di idrogeno molecolare (H2) da protoni ed elettroni secondo l'equazione 2H+ + 2e- ? H2, sembrano essere molto promettenti in termini di bioproduzione di idrogeno come processo per l’ottenimento di energia pulita e rinnovabile. In questo contesto, tuttavia, esistono due limiti molto importanti che ostacolano lo sviluppo di applicazioni biotecnologiche per la bioproduzione di idrogeno su larga scala: i) una bassa efficienza di conversione, in termini di energia impiegata per l’ottenimento di idrogeno molecolare e ii) una severa inibizione, in molti casi irreversibile, da parte dell’ossigeno molecolare, che impone un ambiente strettamente anaerobico per la produzione di idrogeno. Tali limiti possono essere superati chiarendo a livello molecolare i meccanismi alla base sia della catalisi enzimatica che porta alla produzione di idrogeno che dell’inibizione di questi enzimi da parte dell’ossigeno, non ancora del tutto compresi. Il mio lavoro di dottorato è stato focalizzato sullo studio biochimico e funzionale di due [FeFe]-idrogenasi, gli enzimi di Enterobacter cloacae e di Thermotoga neapolitana. In particolare, nella prima parte del lavoro mi sono occupata dell’espressione dell’enzima di E. cloacae nel sistema eterologo E. coli e della sua parziale caratterizzazione biochimica e funzionale; tale enzima, che era stata proposta come la più piccola idrogenasi ad oggi isolata, poteva infatti offrire un ottimo modello per lo studio dell’organizzazione molecolare e funzionale di [FeFe]-idrogenasi più complesse. Tuttavia, i dati ottenuti da diverse studi biochimici, tra cui analisi del sito attivo mediante EPR e verifica dell’attività idrogenasica, portano a concludere che non esiste alcuna evidenza strutturale e funzionale che la proteina ricombinante di E. cloacae sua effettivamente una [FeFe]-idrogenasi e confermano il diffuso scetticismo della comunità scientifica intorno a questo enzima. La seconda parte del lavoro è stata dedicata allo studio della [FeFe]-idrogenasi di T. neapolitana, un enzima trimerico molto cmplesso che non è mai stato isolato e caratterizzato. Il batterio ipertermofilico T. neapolitana è capace di produrre idrogeno anche in presenza di micro-concentrazioni di ossigeno molecolare; pertanto, la sua idrogenasi potrebbe rappresentare un buon modello per la comprensione dei meccanismi molecolari alla base della sensibilità all’ossigeno di questa classe di enzimi. L’espressione della [FeFe]-idrogenasi di T. neapolitana in E. coli in forma funzionale ha consentito di ottenere un sistema di studio utile per approfondire la diversa sensibilità di tale proteina all’ossigeno. Con questo sistema sarà possibile valutare in vitro la massima percentuale di ossigeno compatibile con la sua attività catalitica e condurre un approccio di mutagenesi sito-specifica volta a comprendere il meccanismo molecolare alla base dell’inibizione. L’ultima parte del mio lavoro è stata focalizzata sull’analisi strutturale della proteina HydF di T. neapolitana, coinvolta nel complesso meccanismo di maturazione della [FeFe]-idrogenasi, ancora oggi largamente sconosciuto. In particolare, tutte le [FeFe]-idrogenasi presentano un sito attivo complesso ed insolito e necessitano pertanto di diverse proteine per la loro maturazione; tre di queste maturasi, denominate HydE, HydF, ed HydG, precedentemente identificate e riscontrate in tutti gli organismi contenenti [FeFe]-idrogenasi, sembrano essere necessarie e sufficienti per l’ottenimento di un enzima attivo. L’espressione eterologa della proteina di maturazione HydF di T. neapolitana in E. coli ha evidenziato per la prima volta che la proteina in soluzione si presenta come oligomero, in forma dimerica e tetramerica. Sono stati ottenuti diversi cristalli della proteina, la cui analisi mediante diffrazione a raggi X potrà fornire numerose informazioni sul suo meccanismo d’azione nel folding delle[FeFe]-idrogenasi, un soggetto di ricerca che sta ricevendo oggi una crescente attenzione

Hydrogenases, key enzymes in hydrogen metabolism in several microorganisms, are considered as a possible future energy source. In particular, the ability of the green alga C. reinhardtii to reduce protons and release hydrogen gas (H2) upon illumination by means of a [FeFe]-hydrogenase represents a phenomenon of great scientific interest, because it holds the promise of generating energy from nature’s most plentiful resources: solar energy and water. However, the catalytic activity is strongly and irreversibly inhibited by the molecular oxygen produced during photosynthesis; furthermore, the algal hydrogenase is expressed at very low levels and only in conditions of strict anaerobiosis. This mutually exclusive nature of O2 and H2 photoproduction cannot be easily overcome and represents an important problem in the development of H2 production biotechnology. The study of the structure-function relationship of [FeFe] hydrogenases, which would help to clarify the molecular mechanisms underlying both H2 production and O2 sensitivity, requires the characterization of purified native and modified proteins. The 3D structure of the [FeFe]-hydrogenase from C. reinhardtii has not been solved, mainly because of the very low levels of protein which can be directly purified from the algae. I overexpressed this enzyme in homologous and heterologous systems to obtain enough protein for biochemical studies. The cyanobacterium Synechococcus PCC 7942, which holds a bidirectional [NiFe]-hydrogenase, is able to produce the [FeFe]-hydrogenase from C. pasteurianum in a catalytically active form, thus suggesting that the [NiFe]-hydrogenase maturation pathway of cyanobacteria may be flexible enough to allow the biosynthesis of functional Fe-only enzyme. I obtained two constructs to stably transform the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 and to enable it to express the C. reinhardtii [FeFe]-hydrogenase. The recombinant strains expressing the algal [FeFe]-hydrogenase were able to release H2 gas amounts 4 to 5 times higher than that of wild type strain (which has only a [NiFe]-hydrogenase). These data open new perspectives about the indispensable presence of HydE, HydF and HydG auxiliary proteins to obtain a correctly folded [FeFe]-hydrogenase. At the same time, I proceeded with the homologous overexpression of the [FeFe]-hydrogenase in C. reinhardtii. Since serious limits of this system are the low amount of protein expressed and the instability of mutant algal strain, I am defining new strategies to solve this problem. I will operate site-direct mutations in critical residues to understand the catalytic mechanism and to improve the hydrogen productivity of the enzyme.
Le idrogenasi, enzimi chiave nel metabolismo dell’idrogeno di molti microrganismi, sono considerate una possibile futura fonte di energia. In particolare, la capacità dell’alga verde C. reinhardtii di ridurre protoni e rilasciare idrogeno gassoso dopo illuminazione per mezzo di una [FeFe]-idrogenasi rappresenta un fenomeno di grande interesse scientifico, poiché permetterebbe di ottenere energia dalle due risorse naturali più diffuse: acqua ed energia solare. Tuttavia, l’attività catalitica è fortemente ed irreversibilmente inibita dall’ossigeno prodotto durante la fotosintesi; inoltre, l’idrogenasi algale è espressa a livelli molto bassi e solo in stretta anaerobiosi. Questa natura mutualmente esclusiva della fotoproduzione di idrogeno ed ossigeno rappresenta un importante ostacolo nello sviluppo della produzione biotecnologica di idrogeno. Lo studio della relazione struttura-fuzione della [FeFe]-idrogenasi, che permetterebbe di chiarire i meccanismi molecolari alla base della produzione di H2 e della sesibilità all’O2, richiede la caratterizzazione della proteina nativa e modificata. La struttura 3D della [FeFe]-idrogenasi di C. reinhardtii non è ancora stata ottenuta, principalmente perché le quantità di proteina purificata direttamente dall’alga sono molto basse. Quindi, ho sovraespresso tale enzima in un sistema omologo ed in uno eterologo per ottenere una quantità di proteina sufficiente per condurre studi biochimici. Il cianobatterio Synechococcus PCC 7942, che possiede una [NiFe]-idrogenasi, è in grado di sintetizzare la [FeFe]-idrogenasi di C. pasteurianum in forma attiva, suggerendo che il sistema di maturazione dei cianobatteri sia suffientemente flessibile da permettere la biosintesi di una [FeFe]-idrogenasi funzionale. Nel corso del dottorato ho ottenuto due costrutti per trasformare il cianobatterio Synechocystis sp. PCC 6803 e permettere l’espressione della [FeFe]-idrogenasi algale. I ceppi ricombinanti esprimenti l’enzima di C. reinhardtii sono in grado produrre idrogeno in quantità da 4 a 5 volte superiori rispetto al ceppo wild type (che ha solo una [NiFe]-idrogenasi). Questi dati aprono nuove prospettive circa l’indispensabile presenza delle proteine accessorie HydE, HydF e HydG per ottenere una [FeFe]-idrogenasi correttamente ripiegata. Contemporaneamente, ho condotto l’espressione omologa dell’enzima direttamente in C. reinhardtii. Dal momento che importanti limiti di questo sistema sono dati dal basso quantitativo di proteina espressa e dall’instabilità del ceppo mutante dell’alga, sto attualmente mettendo a punto nuove strategie per risolvere questi problemi. Inoltre, saranno condotte delle mutagenesi sito-specifiche per chiarire i meccanismi catalitici e migliorare la produttività dell’enzima

In recent years the problem of energy crisis has assumed such importance to promote research into sources of energy different from fossil fuels. In this context, molecular hydrogen represents a valid alternative because it is a renewable and clean energy resource since water is the only by-product of its combustion. The hydrogen production techniques currently used, however, require improvement in terms of performance and costs. A promising approach is to exploit biological photosynthetic microorganisms which, under suitable conditions, provide hydrogen from water and sunlight only. There are two main classes of enzymes involved in the metabolism of hydrogen: the [FeFe]- and [NiFe]-hydrogenases, both catalyze the reversible reaction 2H+ + 2e- ↔ H2, however [FeFe]-hydrogenases are more interesting for hydrogen bioproduction since they have a specific activity greater than [NiFe]-hydrogenases. Despite these two classes have different three-dimensional structures, different sequences and are phylogenetically distinct, they represent a clear example of convergent evolution since they catalyze the same reaction and have a similar catalytic site. In both cases, the assembly of the latter is a complex process: in the case of the [NiFe]-hydrogenases is driven by six proteins (HypA-F) and has been extensively studied and characterized. The maturation mechanism of [FeFe]-hydrogenases, instead, involves three maturases, HydE, HydF, HydG, and is less known. In particular, HydF, whose 3D structure has been solved in our laboratory (Cendron L. et al., 2011), is a GTPase protein and plays a central role in the maturation process. However, many functional details remain to be clarified, mainly due to the fact that its structure has been obtained in the apo form, completely lacking the cofactors. This gap is a limit for the development of biotechnologies that allow to express in vitro recombinant catalytically active [FeFe]-hydrogenases. Another unsolved issue concerns the biological role of hydrogenases, since these enzymes are inhibited by oxygen, but curiously they are expressed by microorganisms that live mainly in aerobic conditions. During the PhD I focused my experimental work mainly on two topics: first, the physiological role of the [NiFe]-hydrogenase in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803; secondly, the biochemical characterization of the GTPase domain of HydF. Synechocystis sp PCC 6803, unlike other cyanobacteria strains, holds only a bidirectional [NiFe]-hydrogenase. This enzyme has five subunits combined into two functional units: the hydrogenase portion, called HoxYH, that harbours the active site, and the diaphorase portion, called HoxEFU, which probably acts as a redox partner for the catalytic subcomplex. The physiological function of this enzyme is still under discussion: the general consensus is that it can play a role only under transient and/or specific growth conditions. It is interesting to note that, while being completely inactive in the presence of oxygen, the Hox protein is constitutively expressed in Synechocystis both in anaerobiosis and in aerobiosis, suggesting an additional function, besides hydrogen metabolism, at least in selected conditions. I generated several Synechocystis mutant strains, deleting individual or combinations of hox and hyp genes, encoding respectively for the hydrogenase subunits and for the proteins involved in the assembly of the active site, and analyzed their phenotype during prolonged, complete darkness in aerobiosis, a growth condition to which cyanobacteria are frequently exposed in nature. I found that the ΔHoxEFUYH knock out mutant strain, lacking the entire hox operon, has a notable reduction of growth when compared to the wild type strain. Since the hydrogenase function of the Hox protein is promptly inactivated by oxygen, we have assumed that the observed phenotype is not associated to its YH portion. This hypothesis has been explored by deleting genes coding for i) the HypA and HypB proteins, involved in the last steps of the hydrogenase maturation and for ii) the HoxYH portion, and evaluated their behavior under this environmental stress condition. We found that a correctly folded, functional [NiFe]-hydrogenase active site is indeed not essential to confer to Synechocystis the capability to face a prolonged darkness. To further characterize the wild type and the ΔHoxEFUYH mutant strain grown under these conditions we performed a quantitative proteomic analysis. The examination of the identified proteins showed that almost all the hydrophilic subunits of the respiratory chain complex I are downregulated in their expression. These results are consistent with previous independent studies in which [NiFe]-hydrogenase has been proposed to be functionally associated with the complex I (Cournac L. et al., 2004), and indicate that the entire electrons flow is altered when Synechocystis is grown under prolonged darkness, a condition in which both photosynthesis and respiration are affected. Therefore, the outcome of our research could provide a molecular evidence in support of the hypothesis that the [NiFe]-hydrogenase is functionally linked to respiratory chain, and more generally shed light on the expression and function of this enzyme under aerobic conditions. HydF is composed of three domains: the first is involved in the binding and hydrolysis of GTP, the second is the dimerization domain and the third is the FeS center binding domain. In the second part of this work, we have investigated the possible conformational changes induced by the binding of GTP, by expressing in Escherichia coli only the GTP binding domain of a recombinant HydF protein from Thermotoga neapolitana. In this domain we inserted, by site-specific mutagenesis, cysteine residues in positions useful for spectroscopic analysis. These residues were subsequently labeled with the thiol-selective spin-label MTSSL nitroxide. This probe, largely used in EPR spectroscopy, has allowed us first to study the local mobility of nitroxides at each mutated site, and then, by PELDOR spectroscopy, to analyze couple of residues labeled with the same technique. We found that the binding of the nucleotide does not induce large conformational effects within the isolated GTP domain. However, small variations were observed in the distances between the couple of labeled residues that could have diffused effect reflecting in the conformation of HydF. The results may add new insights into the role of GTP binding to HydF and its implications in the interaction of this protein with the other two maturases. With these studies we wanted to broaden the knowledge on the structure and function of hydrogenases, to gain a greater understanding of the mechanisms underlying their catalytic activity. This could in turn contribute to the development of biomimetic systems wherein optimize hydrogen production exploiting this class of enzymes
Negli ultimi anni il problema della crisi energetica ha assunto un’importanza tale da spingere la ricerca verso fonti di energia diverse dai combustibili fossili. In questo ambito l’idrogeno molecolare rappresenta una valida alternativa in quanto è una risorsa di energia rinnovabile e pulita dal momento che l’acqua è l’unico sottoprodotto della sua combustione. Le attuali tecniche di produzione dell’idrogeno, tuttavia, necessitano di miglioramenti in termini di rendimento e di costo. Una via promettente è quella biologica, che sfrutta microorganismi fotosintetici dai quali, in opportune condizioni, producono idrogeno solo con acqua e luce solare. Esistono due principali classi di enzimi coinvolti nel metabolismo dell’idrogeno: le [FeFe]- e le [NiFe]-idrogenasi, entrambe catalizzano la reazione reversibile 2H+ + 2e- ↔ H2, ma le [FeFe]-idrogenasi risultano più interessanti perchè presentano un’attività specifica superiore a quella delle [NiFe]-idrogenasi. Nonostante queste due idrogenasi abbiano sia strutture tridimensionali che sequenze differenti, e siano filogeneticamente distinte, rappresentano un chiaro esempio di evoluzione convergente in quanto, oltre a catalizzare la stessa reazione, hanno un sito attivo molto simile. L’assemblaggio di quest’ultimo è in entrambi i casi un processo complesso: nel caso delle [NiFe]-idrogenasi è regolato da sei proteine (HypA-F) ed è stato ampiamente studiato e caratterizzato. Il meccanismo di maturazione delle [FeFe]-idrogenasi, invece, coinvolge tre maturasi, HydE, HydF, HydG e non è ancora stato chiarito completamente. In particolare HydF, la cui struttura 3D è stata risolta nel nostro laboratorio (Cendron L. et al., 2011), è una proteina ad attività GTPasica e svolge un ruolo centrale in questo processo. Tuttavia, molti dettagli mancano ancora per definire con precisione la sua funzione, anche a causa del fatto che la sua struttura è stata risolta in forma apo, completamente priva di cofattori. Questa lacuna rappresenta un limite per lo sviluppo di biotecnologie che permetterebbero di esprimere in vitro [FeFe]-idrogenasi ricombinanti in forma cataliticamente attiva. Un altro tema irrisolto riguarda il ruolo biologico delle idrogenasi, dal momento che questi enzimi vengono inibiti dall’ossigeno, ma curiosamente sono espressi da microrganismi che vivono prevalentemente in condizioni aerobiche. Nel corso del Dottorato ho concentrato il mio lavoro sperimentale principalmente su due argomenti: il ruolo fisiologico della [NiFe]-idrogenasi nel cianobatterio Synechocystis sp. PCC 6803; la caratterizzazione biochimica del dominio GTPasico di HydF. Synechocystis sp PCC 6803, diversamente da altri ceppi di cianobatteri, possiede solamente una [NiFe]-idrogenasi bidirezionale. Questo enzima è composto da cinque subunità combinate in due unità funzionali: la porzione idrogenasica, chiamata HoxYH, che ospita il sito attivo, e la porzione diaforasica, chiamata HoxEFU, che probabilmente agisce come partner redox per il subcomplesso catalitico. La funzione fisiologica di questo enzima è ancora oggetto di discussione: il consenso generale è che può giocare un ruolo soltanto in condizioni di crescita specifiche e/o transitorie. È interessante notare che, pur essendo completamente inattiva in presenza di ossigeno, la proteina Hox è costitutivamente espressa in Synechocystis sia in anaerobiosi che in aerobiosi, suggerendo una sua funzione aggiuntiva, oltre al coinvolgimento nel metabolismo dell'idrogeno, perlomeno in condizioni selettive. Ho generato diversi ceppi mutanti di Synechocystis, eliminando singoli geni hox e hyp o combinazioni di essi, codificanti rispettivamente per la subunità idrogenasica e per le proteine coinvolte nell'assemblaggio del sito attivo, e ho analizzato il loro fenotipo in condizioni di crescita al buio completo e prolungato in aerobiosi e anaerobiosi, alle quali i cianobatteri sono spesso esposti in natura. Abbiamo riscontrato che il ceppo mutante knock out ΔHoxEFUYH, privo dell'intero operone hox, ha una notevole riduzione della crescita se confrontato con il ceppo wild type. Poiché la funzione idrogenasica della proteina Hox è immediatamente inattivata dall'ossigeno, abbiamo supposto che il fenotipo osservato non fosse collegato alla sua porzione YH. Questa ipotesi è stata esplorata eliminando i geni codificanti i) per le proteine HypA e HypB, coinvolte nell’ultima fase della maturazione idrogenasi e ii) per la porzione HoxYH, e valutando il loro comportamento in queste condizioni di stress ambientale. Abbiamo evidenziato che un sito attivo funzionale e correttamente assemblato non è indispensabile per conferire a Synechocystis la capacità di affrontare l’oscurità prolungata. Per caratterizzare ulteriormente il ceppo wild type e il mutante ΔHoxEFUYH cresciuti in queste condizioni abbiamo effettuato un’analisi proteomica quantitativa. L’esame delle proteine identificate ha dimostrato che quasi tutte le subunità idrofiliche del complesso I della catena respiratoria hanno ridotti livelli di espressione. Questi risultati sono coerenti con precedenti studi indipendenti in cui la [NiFe]-idrogenasi è stata funzionalmente associata al complesso I (Cournac L. et al., 2004) e indicherebbero che l'intero flusso di elettroni è alterato quando Synechocystis cresce in buio prolungato, una condizione in cui sia la fotosintesi che la respirazione risultano compromesse. Pertanto, l’esito delle nostre ricerche potrebbe fornire una prova molecolare a supporto dell’ipotesi che la [NiFe]-idrogenasi sia funzionalmente correlata alla catena respiratoria, e più in generale far luce sull'espressione e sulla funzione dell’enzima in condizioni aerobiche. La proteina HydF possiede tre diversi domini: uno coinvolto nel legame e idrolisi del GTP, uno di dimerizzazione e uno per il legame del centro FeS. Nella seconda parte del mio progetto abbiamo studiato le possibili variazioni conformazionali indotte dal legame del GTP, esprimendo in Escherichia coli il solo dominio di legame del GTP della proteina ricombinante HydF di Thermotoga neapolitana. In questo dominio abbiamo mutato dei siti ritenuti interessanti per la nostra analisi inserendo delle cisteine, che successivamente sono state marcate con lo spin-label MTSSL nitrossido, selettivo per i tioli. Questa sonda, ampiamente utilizzata in spettroscopia EPR, ci ha permesso in primo luogo di studiare la mobilità locale dei nitrossidi in ogni singolo sito mutato; in seguito, mediante spettroscopia PELDOR, abbiamo analizzato delle coppie di residui marcati con la stessa tecnica. Abbiamo scoperto che il legame del nucleotide non induce grandi effetti conformazionali all'interno del dominio isolato. Tuttavia, sono state osservate piccole variazioni nelle distanze tra i doppi residui marcati che potrebbero avere effetti diffusi e riflettersi nella conformazione di HydF. I risultati ottenuti potrebbero far chiarezza sul ruolo del legame del GTP a HydF e sulle sue implicazioni nelle interazioni di questa proteina con le altre due maturasi. Con questo studio abbiamo cercato di ampliare le conoscenze sulla struttura e sulla funzione delle idrogenasi per acquisire una maggiore comprensione dei meccanismi alla base della loro attività catalitica e dare un contributo per la messa a punto di sistemi biomimetici basati su questi enzimi, in cui massimizzare la produzione di H2