Academic literature on the topic 'Identificazione di geni malattia'

Le cosidette facomatosi accomunano malattie diverse fra loro che hanno in comune il coinvolgimento del distretto neuroectodermico, con quindi interessamento contemporanea della cute e del sistema nervosa. Ad esclusione della malattia di Sturge-Weber le facomatosi hanno in comune il disordine genetico di ordine eterocromosomiale a carattere dominante o recessivo, di penetranza variabile anche se in taluni casi l'insorgenza spontanea delle sindromi o la loro comparsa tardiva suggerisce la possibilità di mutazioni genetiche ad insorgenza recente. Le Neurofibromatosi sono le facomatosi a maggior incidenza nella popolazione. Ne sono riconosciute otto tipi diversi, ma la più frequente in assoluto è la NF 1 (1 su 2000–3000 nati) seguita con un rapporto di circa 1/ 10 dalla NF 2. Da un punto di vista neuroradiologico la Risonanza Magnetica (RM) ha largamente contribuito in questi ultimi anni all'approfondimento delle conoscenze sulla NF 1 con la identificazione dei foci di alterato segnale a carico prevalentemente dei nuclei della base e/o di alter strutture della sostanza bianca, variamente denominati e classificati come aree amartomatose o focalai eteroplasici a bassa evolutività, ritenuti pressoché patognomonici di questa malattia. Anche nelle altre principali facomatosi la RM ha, in questi ultimi anni, largamente contribuito al miglioramento della sensibilità diagnostica e all'approfondimento delle conoscenze. In particolare nella malattia di Stuge-Weber la RM unitamente all'utilizzo del mezzo di contrasto è risultata estremamente efficace nella identificazione della angiomatosi leptomeningea, anche se la Tomografia Computerizzata (TC) mantiene un ruolo di particolare importanza per la identificazione delle calcificazioni piali. Nella Slerosi Tuberosa ha dimostrato una più elevata sensibilita nei confronti della TC nella identificazione dei tuberi in particolare a livello sottocorticale, anche se pure in questo caso la TC mantiene un ruolo diagnostico di rilievo per la possibilityà di identificare i tuberi calcifici in particolare subependimali. Infine nella Sindrome di van Hippel Lindau è senza dubbio la tecnica di prima scelta non solo nella definizione dell'emangioblastoma nella sua sede più tipica cerebellare, ma in particolare nelle sue non infrequenti localizzazioni midollari.

Il rene policistico autosomico dominante (ADPKD) è una malattia genetica molto comune, caratterizzata dalla formazione di cisti in entrambi i reni. Diverse considerazioni circa i meccanismi genetici e molecolari che stanno alla base della formazione delle cisti in questa malattia sono ancora controverse, ma c'è oggi un ampio consenso sul fatto che la ADPKD sia dovuta alla perdita di funzionalità di uno dei due geni mutati nella malattia, PKD1 o PKD2. In questo breve articolo parleremo in particolare di due aspetti: 1) cercheremo di dare una panoramica sullo stato dell'arte di quanto a oggi compreso sulle basi genetiche e molecolari della malattia, cercando di fornire una visione integrata dei diversi modelli di cistogenesi proposti; 2) forniremo una descrizione dettagliata e un'ampia discussione sui recenti risultati riportati dal nostro laboratorio su un difetto a livello del metabolismo del glucosio nella ADPKD e sulle sue potenziali implicazioni terapeutiche, evidenziando anche la necessità di un'ulteriore validazione dei nostri risultati in altri modelli animali di malattia a esordio tardivo e a progressione lenta.

In un nutrito numero di pazienti donne sembra esistere un'identificazione primaria con un'imago materna che viene vissuta solo in termini estremi. L'imago materna rappresenta una figura onnipotente, totipotente, sublime, che ispira paura, protettiva e sacra, personificando al tempo stesso una figura vulnerabile e patetica, dominata dalla tristezza, malattia e inibizione. Il ricordo inconscio del legame e delle lotte del soggetto con questa imago primaria di una madre/seno costituisce il background (mitico) contro il quale si svilupperanno in seguito le relazioni oggettuali. Queste verranno rievocate, rivisitate e ri-vissute nella situazione del transfert. Conformemente con la visione di Freud nel, ciň costituisce un trauma che viene ri-creato, sviluppato e compreso solo nell'attraverso il lavoro di analisi.

SommarioLe tecniche di sequenziamento di nuova generazione hanno rivoluzionato l’identificazione dei geni-malattia, accelerando la scoperta di nuove mutazioni e nuovi geni candidati per le malattie della tiroide. Per far fronte a questo flusso di nuove informazioni genetiche è importante disporre di modelli animali adeguati per studiare i meccanismi che regolano lo sviluppo della tiroide, la biodisponibilità e l’azione degli ormoni tiroidei. Zebrafish (Danio rerio), con il suo rapido sviluppo embrionale esterno, è stato ampiamente utilizzato in biologia dello sviluppo. Ad oggi, quasi tutti i componenti dell’asse tiroideo zebrafish sono stati caratterizzati e sono strutturalmente e funzionalmente paragonabili a quelli dei vertebrati superiori. La disponibilità di linee transgeniche di zebrafish fluorescenti consente l’analisi in tempo reale dell’organogenesi tiroidea e delle sue alterazioni. Il knockdown transitorio ottenuto con l’uso del morfolino permette di silenziare l’espressione di un gene di interesse e ottenere prontamente informazioni sul suo contributo durante lo sviluppo dell’asse tiroideo in zebrafish. Gli strumenti recentemente disponibili per il knockout genico stabile (es. CRISPR/Cas9) hanno ulteriormente aumentato il valore di zebrafish nello studio della patologia tiroidea. Entrambi i modelli di malattia possono essere inoltre utili per lo screening di nuovi farmaci e molecole che potranno essere utili per pianificare i successivi studi clinici.

La malattia autosomica dominante policistica renale (ADPKD) è la malattia genetica più comune in nefrologia. Due geni sono stati implicati nello sviluppo della malattia: PKD1 sul cromosoma 16 (85%) e PKD2 sul cromosoma 4 (15%). La ADPKD è clinicamente caratterizzata da coinvolgimento renale ed extrarenale espresso con la comparsa di manifestazioni cistiche e non cistiche. Dal momento che le complicanze cardiovascolari sono la principale causa di morbilità e mortalità, questa revisione si propone di analizzare il coinvolgimento cardiaco e vascolare in ADPKD. L'ipertensione è uno dei sintomi più frequenti e comune e si verifica in circa il 60% dei pazienti prima della comparsa di disfunzione renale. L'effetto dell'ipertensione sulla progressione verso stadi terminali della malattia renale, rende tale fattore di rischio uno dei più importanti e potenzialmente trattabili in ADPKD. L'ipertrofia ventricolare sinistra, spesso rilevata in questi pazienti, rappresenta un altro importante fattore di rischio indipendente per morbilità e mortalità cardiovascolare nella ADPKD. Altre anomalie come la disfunzione diastolica biventricolare, la disfunzione endoteliale e l'aumento dello spessore intima-media carotideo sono presenti anche in giovani pazienti con ADPKD con normale pressione sanguigna e la funzione renale ben conservata. Gli aneurismi intracranici, quelli extracranici e i difetti valvolari cardiaci sono altre manifestazioni cardiovascolari di comune riscontro nei pazienti con ADPKD. Il trattamento precoce dell'ipertensione mediante l'uso di agenti bloccanti del sistema renina-angiotensina-aldosterone potrebbe svolgere un effetto nefroprotettivo e ridurre l'insorgenza di complicanze cardiovascolari nei pazienti con ADPKD.

RIASSUNTOScopo – Presentare una rassegna sui progressi attuali e sulle prospettive future della psichiatria genetica. Metodi – Revisione degli studi che hanno dimostrato una influenza genetica su un'ampia gamma di disturbi psicopatologici, utilizzando ricerche sulle famiglie, sui gemelli e sulle adozioni, ed approfondimento dei metodi e dei limiti degli studi di genetica molecolare. Risultati – I disturbi relativi ad un singolo gene hanno costituito il settore più semplice per ottenere significativi progressi nelle conoscenze su disturbi quali la malattia di Huntington e la malattia familiare di Alzheimer in fase iniziale. Fenotipi complessi, quali la schizofrenia e il disturbo affettivo, hanno invece presentato maggiori difficolta, ma la malattia di Alzheimer e la dislessia sono esempi nei quali scoperte replicate di genetica molecolare suggeriscono ora che l'identificazione genetica e realizzabile anche per disturbi multifattoriali. Conclusioni – La combinazione della disponibilita di un maggior numero di informazioni sui genoma, insieme all'accessibilita ad esse attraverso Internet, fornisce gli strumenti essenziali per le ricerche sulla predisposizione genetica. Un altro requisito fondamentale per tentare di identificare i geni che provocano piccoli effetti e una ben caratterizzata raccolta, su larga scala, di casi. Cid richiede l'interazione tra epidemiologi e clinici. I progressi negli studi di genetica consentiranno anche di individualizzare la terapia farmacologica, tenendo conto della risposta terapeutica e degli effetti collaterali. Si spera che l'insieme di queste prospettive migliorera le nostre conoscenze sulla patogenesi neurobiologica di malattie come la schizofrenia, la depressione ed il disturbo bipolare, ‘legittimando’ queste malattie agli occhi del grande pubblico.

Nei Paesi anglo-americani la tradizionale concezione antropologica ed ontologica della corporeità, proveniente dall’eredità classica del continente europeo, sta gradualmente subendo una profonda e radicale trasformazione, che si sta manifestando nell’approvazione sociale di pratiche bio-mediche di intervento e manipolazione della capacità riproduttiva dell’uomo e della vita prenatale, come la fecondazione artificiale, la clonazione, la diagnosi e la terapia genica. Tali pratiche, lungi dal condurre a risultati efficaci per la cura delle innumerevoli patologie che ancora affliggono l’umanità, contribuiscono piuttosto a modificare il rapporto dell’uomo moderno con la propria corporeità, con i concetti di salute, di malattia, di procreazione e genitorialità. In particolare, tra le svariate possibilità bio-mediche che la genetica offre alle coppie che desiderano un figlio, la diagnosi genetica prenatale di malformazioni congenite nel concepito è diventata negli ultimi decenni una pratica “di routine”, che sta radicalmente modificando il rapporto della donna con la propria maternità e con il figlio desiderato. Le conseguenze di questa trasformazione non sono sempre positive: essa si colloca, infatti, nell’ambito di un contesto socio-culturale dominato dall’immagine antropologica di una corporeità biologicamente e geneticamente perfetta, funzionale e pienamente rispondente ai bisogni indotti dalla società produttivistica del nostro tempo. La letteratura scientifica anglo-americana evidenzia in maniera peculiare questo fenomeno, che in termini epistemologici e culturali incide sui concetti di “normalità”, di malattia, di qualità della vita, aprendo facilmente la strada ad una medicina “eugenetica” e selettiva nei confronti degli individui geneticamente imperfetti. La genetica diviene così, sempre più, la lente attraverso la quale osservare l’uomo, lo strumento potente che riduce l’individuo ai suoi geni e ai suoi tratti genetici difettosi. In questo contesto, diventa allora fondamentale far riemergere la coscienza di una dimensione etica della conoscenza diagnostica, che possa guidare lo scienziato e il medico nel lungo e difficile cammino per scoprire e combattere le malattie genetiche che affliggono l’umanità, nella piena consapevolezza del valore inestimabile di ogni esistenza umana, per quanto colpita dalla sofferenza e dalla malattia.

La sclerosi tuberosa è una facomatosi trasmessa come carattere autosomico dominante, tramite i geni TSC1 e TSC2. La malattia è caratterizzata da una iperplasia delle cellule ectodermiche e mesodermiche, che conduce alla formazione di lesioni amartomatose. Le sedi più frequentemente coinvolte sono rappresentate dal sistema nervoso centrale, dal cuore, dai reni, dalla cute, dagli occhi e dai polmoni. Una percentuale di pazienti compresa tra il 50 e l'80% presenta lesioni renali, che comprendono angiomiolipomi, cisti renali ed oncocitomi. Questi pazienti, hanno un rischio maggiore di sviluppare carcinoma a cellule renali rispetto ad individui con angiomiolipomi non affetti da ST. Il riscontro ecografico di una qualsiasi neoformazione tra quelle appena elencate può correttamente condurre alla diagnosi di sospetto di ST, solo se “incrociata” col dato clinico, obiettivo. Da ciò il ruolo, potenzialmente cruciale, del nefrologo ecografista nella prima diagnosi di ST. Presentiamo di seguito tre casi di ST, con diagnosi clinica di certezza, con lesioni ecografiche renali molto differenti tra loro. In un primo caso la paziente mostra voluminosi angiomiolipomi renali. Un secondo paziente mostra un quadro ecografico renale sovrapponibile ad un ADPKD. Il terzo caso mostra invece una paziente con un quadro ecografico evolutivo che, da un iniziale “scarring”, evolve verso una trasformazione micro cistica. Questo report, nella nostra opinione, rappresenta un esempio di come reperti ecografici di comune riscontro, se inquadrati correttamente nel contesto clinico, possano invece essere lo spunto per una diagnosi infrequente di ST.

La neurofibromatosi tipo 2 [NF2] è una malattia genetica a trasmissione autosomica dominante [MIM # 101000]. Clinicamente è caratterizzata da: (1) schwannomi bilaterali del (VIII) nervo acustico/vestibolare; (2) cataratta giovanile o amartomi retinici; (3) schwannomi a carico dei nervi periferici e dei nervi cranici; (4) tumori multipli del sistema nervoso centrale (es., meningiomi, astrocitomi, ependimomi); (5) lesioni cutanee: (a) placche NF2 (schwannomi cutanei); (b) (poche) macchie caffellatte; (6) “malformazioni dello sviluppo corticale cerebrale”. La prevalenza della (forma sintomatica di) NF2 nella popolazione generale è di 1 su 100.000-200.000 individui con un’incidenza di 1 su 33.000 nati. La forma classica a esordio nel giovane adulto è conosciuta come forma di Gardner, (esordio intorno ai 20-30 anni d’età) con manifestazioni legate agli schwannomi bilaterali del nervo acustico/vestibolare (diminuzione/perdita progressiva dell’udito, tinnito, vertigini) e/o più raramente con manifestazioni da (altri) tumori del sistema nervoso centrale e/o periferico. In età pediatrica il fenotipo è diverso (forma di Wishart): per primi compaiono abitualmente i tumori del sistema nervoso centrale in assenza di schwannomi vestibolari; si possono avere macchie caffellatte e placche NF2 e solo dopo anni i tumori del nervo cranico VIII e di altri nervi cranici. Il quadro è più grave. Esiste anche una forma “congenita” ad esordio nei primi giorni/mesi di vita, con schwannomi vestibolari di piccole dimensioni (stabili nel tempo: anche per anni/decenni ma con improvvisa e rapida progressione) e numerose placche NF2; in questa forma le altre manifestazioni (es. meningiomi, altri tumori, altri schwannomi) sono spesso più gravi e progressive delle altre forme. Il gene responsabile della NF2 è localizzato sul cromosoma 22q12.1. Il prodotto genico della NF2 è conosciuto con il nome di schwannomina o merlina [dalla famiglia di proteine 4.1 del tipo moesina-ezrina-radixina/ERM alla quale appartiene il gene della NF2) e ha funzioni di regolazione della crescita e del rimodellamento cellulare (soppressione della crescita cellulare e della tumorigenesi)]. Alcune persone possono presentare tutte le (o parte delle) manifestazioni della NF2 in un emilato o in segmenti corporei circoscritti [NF2 a mosaico]. Altre persone presentano schwannomi (confermati istologicamente) dei nervi periferici (non intradermici) e/o delle radici gangliari in assenza di tumori del nervo vestibolare (o di altri nervi cranici: anche se in alcuni casi vi possono essere anche tumori unilaterali o bilaterali del nervo acustico/vestibolare e/o dei nervi cranici misti) o di altri segni diagnostici per la NF2 [Schwannomatosi, SWNTS]. L’esordio in questa forma è intorno ai 30 anni d’età (sono conosciuti casi in età pediatrica) con tumori in svariate sedi (abitualmente tronco e arti). Si conoscono due forme principali: (1) SWNTS1 [MIM # 162091] causata da alterazioni del gene SMARCB1 [regolatore della cromatina actina-dipendente associato alla matrice e correlato alle proteina SWI/SBF, sub-famiglia B, membro di tipo 1; MIM # 601607], sul cromosoma 22q11.23 (posizione centromerica rispetto al gene della NF2); (2) SWNTS2 [MIM # 615670] causata da alterazioni del gene LZTR1 [regolatore della trascrizione di tipo 1 legato alla Leucina; MIM # 600574], cromosoma 22q11.21 (posizione centromerica rispetto al gene SMARCB1) che codifica per una proteina, membro della super-famiglia BTB-kelch. Il meccanismo molecolare della Schwannomatosi comprende: (1) mutazione germinale del gene SMARCB1 o del gene LZTR1; (2) ampia delezione all’interno del cromosoma 22 (con perdita del gene NF2 e dell’allele intatto SMARCB1 o LZTR1); e (3) mutazione somatica dell’allele intatto del gene NF2 [meccanismo conosciuto come “four hits”: “Quadrupla alterazione” (su entrambi gli alleli dei due geni SWNTS/NF2), con tre passaggi consecutivi]. Negli ultimi anni, accanto alle tradizionali terapie chirurgiche e/o radioterapiche sono stati anche impiegati diversi farmaci “biologici” (es., Lapatinib e Bevacizumab) con effetti di riduzione/arresto della crescita dei tipici tumori NF2.

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a lethal childhood muscular disorder characterized clinically by progressive muscle wasting. The onset of the muscular weakness is usually between 3-5 years of age leading to loss ambulation by a mean age of 10.5 years [Allsop & Ziter, 1981] and death is usually due to respiratory or cardiac insufficiency in the early twenties [Dubowitz, 1995]. To date, the only effective pharmacological therapy shown to delay progression of disease is treatment with steroids, that may prolongs ambulation by up to 18 months. Even if the steroids efficacy in DMD is proved, interpatient variability in pharmacological response and a broad variation in the age at which loss of ambulation occurs among steroid-treated DMD patients are also reported. Several analysis of the standard deviation shown that this parameter is often greater than the mean, suggesting a wide distribution of values presumably due to the existence of patients that loss the ambulation either extremely early or late [Silva et al, 1987]. The molecular basis of this phenotypic variability has to be cleared. The long term goal of this work is the dissection of the molecular mechanisms underlying steroid response in DMD patients to identify the predisposing factors to a more favourable disease course. The study relied upon the DMD database maintained by the Neuromuscular Center of the University of Padua and 8 patients with a molecular diagnosis of DMD were selected to enrol in the analysis. All of them have been treated with steroids (deflazacort and prednisolone) until the loss of ambulation. Based upon an arbitrary criteria, these patients were classified as “responder” (R) (n=5) when the loss of ambulation occurs after 13 years of age and as “no-responder” (NR) (n=3) when it occurs before 10 years of age [Bonifati et al, 2000]. To identify the transcripts significantly dysregulated in the two groups of patients, muscle biopsies of the selected patients are used for the expression profiling, performing a microarray analysis using a genome-wide platform (Operon; Huntsville, AL, USA) and a following statistical analysis. After valuation of differentially expressed genes, the study proceeds with the identification of discriminant genes belonging to different groups, responder and no-responder. The analysis led to the identification of 47 deregulated genes in the steroids-responder patients group matched up to no-responder patients group: 10 genes down-regulated, among which several structural genes expressed during development, immune response signals and extracellular matrix genes and 37 genes up-regulated, many of which encoding transcription factors. Subsequently, each of these genes was investigated in order to individuate the molecular pathways involved. Evaluating the interaction networks between the identified genes, two pathways were recognized: the interferon (IFN)-signaling pathway and the NF-kappaB transduction signal cascade. The Nuclear Factor kappa-B (NF-kB) is an ubiquitary transcriptional factor implicated in the regulation of expression of a number of cellular genes involved in immune, inflammatory and anti-apoptotic responses, and found to be increased in mdx (modello murino di DMD) muscle. Several reports suggest that inhibition of NF-kB is a valuable strategy for the treatment of DMD [Acharyya et al, 2007; Mozzetta et al, 2008]. Almost 4 genes among those considerate (IFIT3, IFIT1, STAT1, TFF3) are involved in the NF-kB activation pathway. In order to validate the differential expression of these genes a quantitative real time-PCR test was performed; the analysis has spotlighted expression variability between the patients of the single groups and the existence of an outlier patient. To counter this trouble, a second statistical analysis was carried out comparing each single responder patient with a control patient and the differentially expressed genes were evaluated considering function, physiological expression and gene interaction characteristics. In this list of genes we identified the presence of many members of TNF superfamily (TNF, TNFSF10, LTA, LTB) and a gene coding a putative NF-kB inhibitor, as well as other 5 genes (USMG5, SPP1, S100A9, ICOSLG, LILRA2) selected because of their homogeneous expression profiling. After Real Time-PCR analysis, the gene that survives the test is USMG5 (Up-regulated during Skeletal Muscle Growth 5), subsequently investigated in order to perform a SNP association studies with other two genes chosen through the literature: ACTN3 that encodes the protein ?-actinin 3, a fast-twitch-specific isoform expressed only in type II myofibers, and AKT1 that encodes the serine-threonine protein kinase, involved in the growth factor-I (IGF-1) transduction signal cascade and the NF-kB activation pathway. 110 DMD patients were genotyped for different SNPs, sought out in the existing SNP database, one in each of the candidate gene: R577X in ACTN3, +G205T in AKT1 and S49P in USMG5. The genotype distribution was analysed for the association with the muscle strength using chi squared methods, but statistical significance was not observed. In conclusion, our study has demonstrated the possibility of a priori clustering patients with different clinical progression. The results of this study provides therapeutic alternatives to correct the single gene defect with gene therapy. Further studies are needed to better define the molecular mechanisms underlying the modulation of the phenotype in DMD.
La distrofia muscolare di Duchenne (DMD) e’ una malattia neuromuscolare dell’eta’ infantile invariabilmente letale caratterizzata da un deficit di forza progressivo. L’esordio della debolezza muscolare e’ usualmente verso i 3-5 anni e progredisce fino alla perdita della deambulazione in media intorno ai 10 anni e mezzo. L’exitus, nella seconda-terza decade, e’ dovuta alla comparsa di insufficienza respiratoria e/o cardiaca. La sola terapia palliativa efficace nel rallentare la progressione di malattia e’ la terapia steroidea. La somministrazione di steroidi nella DMD risulta nel prolungamento della deambulazione di circa 18 mesi nei pazienti trattati rispetto ai non trattati. Tuttavia l’eta’ alla perdita della deambulazione presenta una ampia deviazione standard dovuta alla presenza sia di pazienti che perdono la deambulazione molto precocemente ed altri molto tardivamente sia nei pazienti trattati che non trattati. Le basi molecolari di questa variabilita’ fenotipica non sono. Nel tentativo di identificare i fattori modulanti favorevolmente il fenotipo clinico, abbiamo studiato 8 pazienti con diagnosi molecolare di DMD. Tutti i pazienti erano stati trattati con steroidi a dosaggio standard fino alla perdita della deambulazione. I pazienti sono stati arbitrariamente classificati come responsivi (R) (n=5) se la perdita della deambulazione e’ avvenuta dopo i 13 anni e non-responsivi (NR) (n=3) se la perdita della deambulazione e’ avvenuta prima dei 10 anni di età. Allo scopo di identificare gruppi di trascritti genici differenzialmente espressi tra i due gruppi di pazienti è stata eseguita un’analisi dei profili d’espressione (Microarray) utilizzando una piattaforma di oligonucleotidi genome-wide (Operon), seguita da un’elaborazione statistica dei dati. Una volta identificati i geni regolati in modo differenziale, lo studio ha mirato all’identificazione di un sottogruppo di geni differenzialmente espressi nei pazienti R e NR. Con tale criterio sono stati individuati nel pool dei pazienti R 47 geni significativamente deregolati rispetto ai pazienti NR: 37 geni sovraespressi, molti dei quali codificanti per fattori di trascrizione, e 10 geni sottoespressi, tra cui geni strutturali normalmente espressi durante lo sviluppo, geni coinvolti nella risposta immunologica e altri che codificano per proteine presenti nella matrice extracellulare. I geni differenzialmente espressi identificati sono stati sottoposti ad analisi funzionale allo scopo di individuare cascate biochimiche in cui essi fossero coinvolti. Valutando l’interazione tra i geni identificati, sono risultati particolarmente significativi la cascata di signaling dell’interferone (IFN) e la cascata di trasduzione del segnale del Fattore Nucleare kappa B (NF-kB), un fattore di trascrizione ubiquitario che regola l’espressione di geni coinvolti nei processi infiammatori e nella risposta acuta allo stress. Dati sperimentali suggeriscono che la regolazione dell’attività di NF-kB possa favorevolmente modulare la progressione della distrofia muscolare nel modello animale di DMD (topo mdx). Almeno 4 tra i geni considerati (IFIT3, IFIT1, STAT1, TFF3) hanno un ruolo nel processo di attivazione di NF-kappaB. Al fine di validare la significativa sovraespressione di questi trascritti nel pool di pazienti “steroido-responsivi” rispetto al pool di pazienti “steroido non-responsivi”, sono stati condotti degli esperimenti di Real Time-PCR. Dall’analisi è emersa una variabilità all’interno dei singoli gruppi. Per ovviare a tale problema, una seconda analisi statistica dei dati è stata eseguita confrontando singolarmente ogni paziente con un controllo scelto in base all’età alla perdita della deambulazione. I geni differenzialmente espressi identificati sono stati valutati in base alle loro caratteristiche di funzione, espressione fisiologica ed interazioni. In questa seconda analisi, si è evidenziato in particolare un coinvolgimento di alcuni membri della superfamiglia del TNF (TNF, TNFS10, LTA, LTB) ed un gene codificante per un putativo inibitore di NF-kappaB (NFKBIL1). Sono stati presi in considerazione anche altri 5 geni (USMG5, SPP1, S100A9, ICOSLG, LILRA2), selezionati perché la loro espressione risultava uniforme all’interno dei due gruppi di pazienti, così da poter eliminare la variabilità intergruppo. Anche in questo caso i dati sono stati necessariamente validati con esperimenti di Real Time-PCR. Il gene che, superato il controllo di validazione, è risultato significativo è USMG5 (Up-regulated during the skeletal muscle growth 5), successivamente studiato allo scopo di identificare polimorfismi di singolo nucleotide (SNP). È stata valutata l’esistenza di SNP noti, consultando il database di SNP, nel gene USMG5 ed in altri 2 geni scelti dalla letteratura: ACTN3 che codifica per la proteina alpha-actinina 3, espressa esclusivamente nel disco Z delle fibre di tipo II del muscolo scheletrico, e AKT1 che codifica per la serina-treonina protein chinase, coinvolta nella trasduzione del segnale dei fattori di crescita come IGF1, oltre ad avere un ruolo nello sviluppo e nella sopravvivenza cellulare e nell’attivare NF-kB. I pazienti sono stati analizzati per il polimorfismo R577X nel gene ACTN3, +G205T nel gene AKT1 e S49P nel gene USMG5. La distribuzione genotipica è stata messa a confronto con la forza muscolare, ma i test non hanno evidenziato differenze statisticamente significative. In conclusione, il nostro studio dei profili di espressione nei pazienti affetti da DMD ha dimostrato la possibilita’ di clusterizzare a priori pazienti con progressione clinica diversa. Questo risultato e’ rilevante considerando che implica la possibilita’ che alla base della progressione di malattia nella DMD vi sia una regolazione genica differenziale. Questo dato offre strategie terapeutiche alternative alla sola correzione del difetto genico con terapia genica o cellulare. Ulteriori studi sono necessari per definire meglio i meccanismi molecolari alla base della modulazione del fenotipo nella DMD.

The genetics of most common single-gene neurological disorders has been dissected in the last twenty years. However, the aetiology of several rare Mendelian neurological conditions is still unknown, with significant implications for diagnosis, genetic counselling and therapy. So far the identification of genes for these rare conditions have been constrained by methodological issues, such as the shortage of informative families for linkage analysis, the lack of very dense maps of polymorphic markers and the availability of efficient and low-cost platforms for genotyping and sequencing. Recently, the high-throughput sequencing of the coding DNA (i.e. exome) has been successfully applied to identify causative mutations by comparing the genome-wide profile of non-synonymous variants among unrelated patients affected by the same disease. Thus, exome sequencing may not be readily applicable to patients affected by rare unclassified conditions who cannot be grouped into genetically homogenous pools. To dissect the heterogenous genetic etiology of rare neurological phenotypes, we decided to combine exome sequencing with homozygosity mapping, a robust approach to localize disease genes involved in autosomal recessive (AR) Mendelian disorders in discrete genomic regions. We focused our attention on 7 phenotypic heterogeneity families that they have not been genetically diagnosed of the our Pediatric Neurological Unit. We analyzed variants with standard bioinformatic pipeline and databases of populations as ExAC, GnomaAD, and in-house database (200 normal controls). We confirmed the selected variants by Sanger Sequencing in probands and parents. We excluded the negative variants by Sanger sequencing in affected subjects and parents. In more cases, we demonstrated the pathogenetic role for these variants with functional studies as WesternBlot, staning of tissue and immunofluorescence of the patients’ cells. We generated the Zebrafish model to evaluate the pathogenetic role of some variants. We highlighted the importance of the bioinformatic analysis, which selected the effective genetic causes of pathology in these families. We identified different genes, adding important genotype-phenotype correlations to literature data. In conclusion, this study highlighted a powerful approach for clarify the genetic basis of rare neurological recessive diseases. Furthermore, this genome-wide approach allowed to highlight new genotype-phenotype correlations and expanded the clinical phenotypic spectrum in specificgenetic conditions.

Genome wide association studies have identified two quantitative trait loci outside of the β-globin cluster associated with fetal hemoglobin (HbF) levels, number of F cell and β-thalassemia severity: the HBS1L-MYB intergenic region and the BCL11A gene. In order to understand the functional role of the associated variants at these loci we applied “Genome Wide Chromosome Conformation Capture” (Hi-C), followed by a novel technique for a selective enrichment at these target regions, to characterize whether they are involved in long range physical interactions able to modulate HBS1L-MYB and BCL11A expression. As a first step we optimized a Hi-C protocol in the K562 fetal erythroid cell line and we set up the conditions for the new method based on the selective enrichment of target regions. We were able to validate the new capture system analyzing the β-globin locus, as a control model, detecting all the interactions found by other “3C-like” technologies with a higher resolution. We then analyzed the data at the HBS1L-MYB and BCL11A loci; the most significant detected interactions involved four HBS1L-MYB intergenic regions, three of which contain the GWAS SNPs, the HBS1L and MYB genes. We hypothesized a contact model where the associated variants could exert their regulatory role likely altering transcription factors binding sites and thus DNA long-range interactions resulting in different levels of MYB expression. Indeed, although we can not exclude the implication of HBS1L gene in this mechanism, MYB represents the best candidate in modulating HbF levels given its role in the erythropoiesis kinetics. Our results highlighted the power of the new capture system, able to identify chromatin interactions with very high resolution simultaneously at different loci. Finally, we discovered new chromatin interactions that support the transcription factor MYB as a potential good candidate to develop new targeted therapeutic strategies to treat β-thalassemia patients.

I disturbi dello spettro autistico (DSA) ed il ritardo mentale (RM) sono caratterizzati da un’eziologia genetica complessa ed eterogenea. Grazie ai recenti sviluppi nella ricerca genomica, è stato possibile dimostrare il ruolo di numerose copy number variants (CNVs) nella patogenesi di questi disturbi, anche se nella maggior parte dei casi l’eziologia rimane ancora sconosciuta. Questo lavoro riguarda l’identificazione e la caratterizzazione dei CNVs in famiglie con DSA e RM. E’ stata studiata una microdelezione in 7q31 che coinvolge i geni IMMP2L e DOCK4, trasmessa dalla madre con dislessia a due figli con autismo ed una figlia con dislessia. Nella stessa famiglia segrega una seconda microdelezione in 2q14 che inattiva il gene CNTNAP5 ed è trasmessa dal padre (con tratti autistici) ai due figli con autismo. Abbiamo quindi ipotizzato che i geni DOCK4 e CNTNAP5 potessero essere implicati, rispettivamente, nella suscettibilità a dislessia e DSA. Lo screening di numerosi individui affetti ha supportato la nostra ipotesi, con l’identificazione di una nuova microdelezione di DOCK4 che segrega con la dislessia, e 3 nuove varianti missenso in CNTNAP5 in individui con autismo. Dall’analisi genomica comparativa su array (aCGH) di individui con RM, è stata identificata una delezione nella regione 7q31.32, che coinvolge il gene CADPS2, in due fratelli con RM e tratti autistici, probabilmente ereditata dalla madre. Lo screening di mutazione di questo gene in individui con autismo o RM, ha portato all’identificazione di 3 varianti non sinonime, assenti nei controlli, ed ereditate per via materna. Poiché CADPS2 risiede in una regione genomica che contiene loci soggetti ad imprinting, abbiamo ipotizzato che il gene CADPS2 possa essere anch’esso caratterizzato da imprinting, con espressione monoallelica materna. Lo studio di espressione di CADPS2 in cellule del sangue ha avvalorato questa ipotesi, implicando perciò CADPS2 come un nuovo gene di suscettibilità per il RM e DSA.
Autism spectrum disorders (ASD) and intellectual disability (ID) are characterized by a complex and heterogeneous genetic etiology. Recent developments in genomic research have enabled the discovery of numerous copy number variants (CNVs) in the pathogenesis of these disorders, although their etiology remains unknown in the majority of cases. This work concerns the identification and characterization of specific CNVs in families with ASD and ID. I studied a microdeletion in 7q31 encompassing the two genes DOCK4 and IMMP2L, transmitted from the mother (who has dylsexia) to two children with autism and to a daughter with dyslexia. In the same family we identified a second microdeletion in 2q14, that inactivates CNTNAP5, and is transmitted by the father (with ASD) to the two children with autism. We therefore hypothesized that DOCK4 and CNTNAP5 could be implicated in susceptibility to dyslexia and ASD, respectively. Screening of numerous affected individuals supported our hypothesis, leading to the identification of a new DOCK4 microdeletion segregating with dyslexia, and 3 new missense variants in CNTNAP5 in individuals with autism.Through array comparative genomic hybridization (aCGH) of individuals with ID, we also identified a 7q31.32 microdeletion involving the CADPS2 gene in two brothers with ID and autistic features, probably inherited from the mother. Screening for mutations in this gene in individuals with autism or ID, has led to the identification of 3 maternally inherited nonsynonymous variants, absent in controls. Since CADPS2 is located in a genomic region containing imprinted loci, we hypothesized that CADPS2 itself could be subjected to imprinting, with maternal monoallelic expression. Expression analysis of CADPS2 in blood cells supported this hypothesis, therefore suggesting CADPS2 as a new susceptibility gene for ID and ASD, and as possible new imprinted gene .

I disturbi dello spettro autistico (DSA) ed il ritardo mentale (RM) sono caratterizzati da un’eziologia genetica complessa ed eterogenea. Grazie ai recenti sviluppi nella ricerca genomica, è stato possibile dimostrare il ruolo di numerose copy number variants (CNVs) nella patogenesi di questi disturbi, anche se nella maggior parte dei casi l’eziologia rimane ancora sconosciuta. Questo lavoro riguarda l’identificazione e la caratterizzazione dei CNVs in famiglie con DSA e RM. E’ stata studiata una microdelezione in 7q31 che coinvolge i geni IMMP2L e DOCK4, trasmessa dalla madre con dislessia a due figli con autismo ed una figlia con dislessia. Nella stessa famiglia segrega una seconda microdelezione in 2q14 che inattiva il gene CNTNAP5 ed è trasmessa dal padre (con tratti autistici) ai due figli con autismo. Abbiamo quindi ipotizzato che i geni DOCK4 e CNTNAP5 potessero essere implicati, rispettivamente, nella suscettibilità a dislessia e DSA. Lo screening di numerosi individui affetti ha supportato la nostra ipotesi, con l’identificazione di una nuova microdelezione di DOCK4 che segrega con la dislessia, e 3 nuove varianti missenso in CNTNAP5 in individui con autismo. Dall’analisi genomica comparativa su array (aCGH) di individui con RM, è stata identificata una delezione nella regione 7q31.32, che coinvolge il gene CADPS2, in due fratelli con RM e tratti autistici, probabilmente ereditata dalla madre. Lo screening di mutazione di questo gene in individui con autismo o RM, ha portato all’identificazione di 3 varianti non sinonime, assenti nei controlli, ed ereditate per via materna. Poiché CADPS2 risiede in una regione genomica che contiene loci soggetti ad imprinting, abbiamo ipotizzato che il gene CADPS2 possa essere anch’esso caratterizzato da imprinting, con espressione monoallelica materna. Lo studio di espressione di CADPS2 in cellule del sangue ha avvalorato questa ipotesi, implicando perciò CADPS2 come un nuovo gene di suscettibilità per il RM e DSA.
Autism spectrum disorders (ASD) and intellectual disability (ID) are characterized by a complex and heterogeneous genetic etiology. Recent developments in genomic research have enabled the discovery of numerous copy number variants (CNVs) in the pathogenesis of these disorders, although their etiology remains unknown in the majority of cases. This work concerns the identification and characterization of specific CNVs in families with ASD and ID. I studied a microdeletion in 7q31 encompassing the two genes DOCK4 and IMMP2L, transmitted from the mother (who has dylsexia) to two children with autism and to a daughter with dyslexia. In the same family we identified a second microdeletion in 2q14, that inactivates CNTNAP5, and is transmitted by the father (with ASD) to the two children with autism. We therefore hypothesized that DOCK4 and CNTNAP5 could be implicated in susceptibility to dyslexia and ASD, respectively. Screening of numerous affected individuals supported our hypothesis, leading to the identification of a new DOCK4 microdeletion segregating with dyslexia, and 3 new missense variants in CNTNAP5 in individuals with autism.Through array comparative genomic hybridization (aCGH) of individuals with ID, we also identified a 7q31.32 microdeletion involving the CADPS2 gene in two brothers with ID and autistic features, probably inherited from the mother. Screening for mutations in this gene in individuals with autism or ID, has led to the identification of 3 maternally inherited nonsynonymous variants, absent in controls. Since CADPS2 is located in a genomic region containing imprinted loci, we hypothesized that CADPS2 itself could be subjected to imprinting, with maternal monoallelic expression. Expression analysis of CADPS2 in blood cells supported this hypothesis, therefore suggesting CADPS2 as a new susceptibility gene for ID and ASD, and as possible new imprinted gene .

Many fruit species bear an abundance of flowers producing a surplus of fruits that the tree is unable to support. In anticipation of this, the major fruit species developed an immature fruit (fruitlet) physiological drop as a self-regulatory mechanism. This process is, at least in part, a consequence of the competition among fruits and between fruits and shoots for carbon assimilates. The self-regulatory mechanism responsible for the immature apple fruit shedding may be magnified by chemicals such as naphthaleneacetic acid (NAA) and its amide (NAD), and benzylaminopurine (BA) sprayed within 5-6 weeks after full bloom. The thinning action of bioregulators is quite variable and depends on environmental conditions and genotypes. In apple, there are varieties easy to thin and others difficult even though different chemicals or combinations of them are used. Understanding the molecular mechanisms and processes involved in abscission might help in finding new approaches and new chemical thinners to control abscission in fruit, or new self-thinning varieties. The described research was aimed to elucidate the molecular events underlying the in planta fruitlet abscission, taking into account the characteristics of this system and the practical importance of thinning in apple. Fruit drop is due to the activation of specific abscission zones (AZs). It is accepted that abscission is a highly regulated developmental process that is both influenced and activated in response to internal cues and/or environmental conditions. Nevertheless, the identity of the signals responsible for the activation of the AZ is as yet unknown. Among phytohormones, ethylene enhances abscission in several species and systems as well as in apple, while auxins produced by seeds are thought to desensitize AZs to ethylene and prevent abscission. In apple trees, the fruitlet physiological drop is due to the activation of the AZ located at the junction of the peduncle into the twig. In this region four lateral (LF) and one central (CF) fruitlets and the shoot are inserted. The CF comes from the pollinated king flower (KF) that, since it blooms earlier within the cluster, originates a fruitlet larger than the lateral ones. During the physiological drop, the shoot at cluster side, is thought to be a sink in competition with fruitlets for assimilate supply. Considering that seeds and/or fruits are involved in determining the shedding signal while the morphogenetic response occurs always at the AZ level, it is crucial to analyse the whole fruitlet system involved in abscission that should include concurrently seed, cortex, peduncle, and AZ. It is generally believed that the interaction between ethylene and auxin plays a major regulatory role in abscission. Starting from this, a mass gene approach was used in this work to identify genes regulating or involved in abscission. The cDNA-AFLP technique was adopted for transcriptional profiling of differentially expressed genes during apple fruitlet abscission. This allowed the isolation of 278 differential clones by comparing expression profiles of abscising (AF) versus non-abscising (NAF) fruitlet populations. AFs were obtained from lateral fruitlets of trees sprayed with benzylaminopurine (BA) at 200 ppm, 17 days after petal fall (APF) when the fruit cross diameter was about 10-12 mm. NAF originated from central flowers grown in clusters where all the lateral flowers had been removed at bloom. All ESTs (expressed sequence tags) obtained have been annotated with the Gene Ontology vocabulary and grouped according to cellular components, biological processes and molecular functions. Considering the cellular components, the most affected genes in the cortex were related to mitochondrion, plastid and membranes. Concerning the molecular functions, the mostly affected ones were the binding and the transferase activities in the cortex, the hydrolase and transport activities in the seed, and the binding activity in the peduncle. Considering the biological process, in the cortex the most abundant genes were those controlling transport, protein and carbohydrate metabolism. As a general remark, taking into account all the three ontology criteria, it appeared that a prominent up-regulation occurred in the seed. This might be consistent with the determinant role attributed to the seed in the regulation of fruit abscission. The expression and functional analyses of the most interesting clones were carried out by semiquantitative RT-PCR on agarose gel on cDNA obtained from seeds, cortex, peduncles and AZs of AFs and NAFs. Expression analyses confirmed the efficacy of the cDNA-AFLP approach to find a large amount of differentially expressed ESTs and the involvement of the studied genes in regulating the abscission and senescence processes. In particular the differential expression of sugar-metabolism and signalling related genes confirmed the importance of carbohydrates, together with hormones, in controlling the induction of AZs. Since functional studies through silencing or overexpression approaches cannot be easily performed on trees, additional experiments were carried out in Arabidopsis thaliana to investigate the participation of these and other genes in abscission. To this end, Arabidopsis genes putatively homologous to those differentially expressed in relation to fruitlet abscission in apple were identified. A dual approach was chosen to study their function in abscission. In a first attempt, insertional (T-DNA) homozygous mutants were obtained and scored for the presence of abscission-related phenotypes. Probably due to gene redundancy, no phenotypes were detected. Therefore, expression analyses were carried out on the same genes with real time RT-PCR on abscission zones of known Arabidopsis mutants with delayed (dab4-1, dab5-1) or no petal abscission (ida). The results showed a different pattern of expression in comparison to that found in wild type and confirmed an involvement of these genes in abscission. Current work is devoted to further characterise the putative role played by these genes in regulating the abscission of flower organs in Arabidopsis. In addition, a "systematic" approach for the analysis of the whole apple fruitlet abscission transcriptome is needed. To this end an apple microarray is being developed from the large number of already available ESTs, to be used for screening of new chemical thinners and for marker assisted selection of self thinning genotypes.

Introduction. Cardiovascular disease (CVD) represents the main cause of morbidity and mortality in kidney recipients. This study was undertaken to assess the impact of functional polymorphisms located in cytokine and apoptosis genes on CVD after kidney transplantation. Cytokine polymorphisms, generally located in gene regulatory regions, are associated with high and low cytokine production and are likely to modulate the magnitude of inflammatory responses following transplantation, depending on the balance between the levels of pro-inflammatory and antiinflammatory cytokines. The role of apoptosis in atherosclerosis has not been completely elucidated, and here we explored the hypothesis that the heterogeneity in cardiovascular risk in kidney recipients may also be linked to functional polymorphisms involved in apoptosis induction. Purpose. In the search for relevant genetic markers of predisposition to CVD after renal transplant, the present investigation was undertaken to identify the clinical impact of polymorphisms of cytokines TNF-α, TGF-β, IL-10, IL-6, IFN-γ and IL-8 and of apoptosis genes Fas and Caspase 9 in a population of kidney transplant recipients. Materials and methods. The study involved 167 patients who received cadaveric kidney transplantation at our centre between 1997 and 2005 (minimum follow-up of 12 months); 35 of them had experienced cardiovascular events (CVD group) and 132 had no cardiovascular complications (non-CVD group). Genotyping was performed using RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) for RFLP per IL-8/T-251A, Fas/G-670A e Casp9/R221Q polymorphism and SSP (Sequence Specific Primer) for TNF-α/G-308A, TGF-β/L10P, TGF-β/R25P, IL-10/G-1082A, IL- 10/C-819T, IL-10/C-592A, IL-6/G-174C, IFN-γ/T+874A polymorphisms.Results. We found a significant difference in TNF-α and IL-10 genotype frequencies between the patients who had suffered cardiovascular events and those with no CVD history. The high producer genotype for proflogistic cytokine TNF-α appeared to have a significantly superior prevalence in the CVD group compared to the non-CVD group (40.0% vs 21.2%) and it resulted in a 2.4-fold increased cardiovascular risk (OR=2.361; p=0.0289). On the other hand, the high producer genotype for the antiinflammatory cytokine IL-10 was found in 2.8% of the CVD group and in 16.7% of non-CVD group; logistic regression showed a 0.3-fold reduced risk of CVD associated with genetically determined high IL-10 production (OR=0.278; p<0.0001). The other polymorphisms did not prove to have any impact on CVD. Conclusions. TNF-α and IL-10 gene polymorphisms might represent cardiovascular risk markers in renal transplant recipients.

Introduction. Cardiovascular disease (CVD) represents the main cause of morbidity and mortality in kidney recipients. This study was undertaken to assess the impact of functional polymorphisms located in cytokine and apoptosis genes on CVD after kidney transplantation. Cytokine polymorphisms, generally located in gene regulatory regions, are associated with high and low cytokine production and are likely to modulate the magnitude of inflammatory responses following transplantation, depending on the balance between the levels of pro-inflammatory and antiinflammatory cytokines. The role of apoptosis in atherosclerosis has not been completely elucidated, and here we explored the hypothesis that the heterogeneity in cardiovascular risk in kidney recipients may also be linked to functional polymorphisms involved in apoptosis induction. Purpose. In the search for relevant genetic markers of predisposition to CVD after renal transplant, the present investigation was undertaken to identify the clinical impact of polymorphisms of cytokines TNF-α, TGF-β, IL-10, IL-6, IFN-γ and IL-8 and of apoptosis genes Fas and Caspase 9 in a population of kidney transplant recipients. Materials and methods. The study involved 167 patients who received cadaveric kidney transplantation at our centre between 1997 and 2005 (minimum follow-up of 12 months); 35 of them had experienced cardiovascular events (CVD group) and 132 had no cardiovascular complications (non-CVD group). Genotyping was performed using RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) for RFLP per IL-8/T-251A, Fas/G-670A e Casp9/R221Q polymorphism and SSP (Sequence Specific Primer) for TNF-α/G-308A, TGF-β/L10P, TGF-β/R25P, IL-10/G-1082A, IL- 10/C-819T, IL-10/C-592A, IL-6/G-174C, IFN-γ/T+874A polymorphisms.Results. We found a significant difference in TNF-α and IL-10 genotype frequencies between the patients who had suffered cardiovascular events and those with no CVD history. The high producer genotype for proflogistic cytokine TNF-α appeared to have a significantly superior prevalence in the CVD group compared to the non-CVD group (40.0% vs 21.2%) and it resulted in a 2.4-fold increased cardiovascular risk (OR=2.361; p=0.0289). On the other hand, the high producer genotype for the antiinflammatory cytokine IL-10 was found in 2.8% of the CVD group and in 16.7% of non-CVD group; logistic regression showed a 0.3-fold reduced risk of CVD associated with genetically determined high IL-10 production (OR=0.278; p<0.0001). The other polymorphisms did not prove to have any impact on CVD. Conclusions. TNF-α and IL-10 gene polymorphisms might represent cardiovascular risk markers in renal transplant recipients.