Dissertations / Theses on the topic 'Hydrogels à base de peptides'

I. Tema y objetivos de la tesis Debido a la estrecha relación entre el auto-ensamblaje de péptidos y proteínas con las enfermedades de tipo amiloide,(1) entender los principios que gobiernan este fenómeno resulta de gran interés en la actualidad. El uso de pequeños péptidos como modelos o inhibidores del proceso de fibrilación es considerado una de las mejores aproximaciones debido a su facilidad de síntesis, versatilidad y biocompatibilidad.(2) Se conoce además que la organización jerárquica de estas fibrillas peptídicas da lugar a menudo a redes auto-ensambladas que retienen el disolvente dando lugar a geles supramoleculares.(3) Estos materiales soportados mediante interacciones no covalentes presentan multitud de propiedades incluyendo reversibilidad, auto-reparación o sensibilidad frente a diferentes estímulos físico-químicos que hacen de ellos unos materiales extremadamente útiles en campos tan diferentes como la biomedicina, la catálisis o la ciencia de materiales.(4) Teniendo en cuenta estas consideraciones durante el transcurso de la presente tesis doctoral se han desarrollado nuevos péptidos anfipáticos con tendencia a la formación de hojas-ß para: - Profundizar en los fundamentos del auto-ensamblaje proporcionando un mayor entendimiento del complejo proceso de fibrilación. - Estudiar la habilidad de estos compuestos como hidrogelantes supramoleculares para utilizarlos como catalizadores o materiales que respondan a estímulos. II. Resultados y discusión 1) Diseño y síntesis de los hidrogelantes supramoleculares El primer paso para alcanzar los objetivos previamente mencionados consiste en el diseño y la síntesis de los compuestos que posteriormente van a ser estudiados como hidrogelantes. En nuestro caso se han sintetizado tres familias de compuestos anfipáticos derivados de péptidos cuya estructura general se describe a continuación: - Tetrapéptidos básicos formados por L-fenilalanina (F) y L-aspártico (D) Compuestos por dos fenilalaninas y dos residues de ácido aspártico protegidos por un grupo Cbz y una cadena alifática en el extremo C- y -N terminal respectivemente. La tendencia de dichos péptidos anfipáticos a la formación de hojas ß ha sido previamente demostrada en multitud de ocasiones y en nuestro caso, las variaciones sistemáticas en la secuencia de aminoácidos nos permitirán estudiar el papel que desempeña el balance hidrofóbico/hidrofílico en el proceso de fibrilación. Es necesario mencionar que ambos extremos de la cadena peptídica han sido bloqueados usando una pequeña cadena alifática y un grupo protector de tipo benciloxicarbonilo en el extremo C- y N-terminal respectivamente para evitar ionizaciones adicionales y simplificar de ese modo el análisis del proceso de agregación. - Tetrapéptidos básicos formados por L-fenilalanina (F) y L-lisina (K) De modo semejante a los tetrapéptidos descritos en el párrafo anterior se han diseñado adicionalmente dos tetrapéptidos básicos que contienen lisina para estudiar su habilidad como hidrogelantes y posteriormente estudiar su coagregación con sus análogos tetrapeptídicos que contienen aspártico. - Tripéptidos anfifílicos formados por L-prolina (P), L-fenilalanina (F) y L-ácido glutámico (E) Finalmente una familia de tripéptidos anfifílicos que contienen L-prolina como fragmento funcional ha sido diseñada para su posterior estudio de agregación en agua tamponada y como catalizadores de condensaciones aldólicas. La síntesis de todos ellos ha sido llevada a cabo mediante una metología por pasos en disolución y los compuestos fueron obtenidos sin dificultad y con buenos rendimientos. Además la purificación se realizó de manera sencilla sin necesidad de cromatografía. Sin embargo, debido a la creciente utilización de fase sólida para la síntesis de derivados peptídicos se ha decidido probar también dicha metodología en la síntesis de uno de nuestros compuestos estableciendo finalmente ventajas e inconvenientes de cada metodología para nuestros propósitos en particular. Así pues se ha establecido que la síntesis en fase sólida podría ser de gran utilidad para fabricar pequeñas cantidades de compuesto destinadas a una evaluación inicial de sus propiedades. La síntesis en disolución sin embargo, podría ser utilizada para la obtención a mayor escala de aquellos que resulten más convenientes en función de dicha evaluación inicial. También resulta de interés recalcar que durante la síntesis se ha descubierto una inesperada labilidad del grupo Z (benziloxicarbonilo) en condiciones básicas muy suaves. Dicho fenómeno ha sido estudiado para una familia mucho más amplia de compuestos llegándose a la conclusión de que una asistencia anquimérica adicional proporcionada por un puente de hidrógeno entre el carbamato y una amida adyacente resulta fundamental para la desprotección de este grupo.(5) 2) Tetrapéptidos ácidos formados por D y F Afortunadamente todos los compuestos sintetizados han dado lugar a hidrogeles utilizando el cambio de pH como estímulo externo. Dichos hidrogeles han sido estudiados minuciosamente utilizando técnicas como la resonancia magnética nuclear, dicroísmo circular, microscopía de transmisión y de barrido, espectroscopia de infrarojo, fluorescencia, etc. Mediante este completo estudio se comprobó el efecto que causaba la disposición de los aminoácidos en esta cadena ya que dan lugar a redes fibrilares de morfologías y propiedades muy distintas. La combinación de los resultados experimentales con los modelos teóricos propuestos nos ha permitido observar el papel que tanto las interacciones hidrófobicas como aromáticas desempeñan en el proceso de agregación disponiendo bloques segregados de aminoácidos polares y no polares para los mejores hidrogelantes. Continuando con los hidrogeles tetrapeptídicos se ha llevado a cabo un estudio referente a la termodinámica y cinética del proceso de fibrilación, a menudo aspectos no considerados durante la descripción de nuevos hidrogelantes. Se han determinado para ello constantes de solubilidad y acidez detectándose un aumento general del valor de pKa (en comparación con el pKa del ácido aspártico en disolución) a consecuencia de la agregación que permite la obtención de hidrogeles a valores de pH cercanos a la neutralidad. Estas diferencias de pKa están directamente relacionadas con la termodinámica de agregación. Por otro lado los estudios cinéticos nos han permitido detectar un periodo de inducción previo a la agregación para todos los compuestos aunque con diferencias significativas entre ellos. Dicho periodo contiene el tiempo necesario para alcanzar el valor de pH que da lugar a fibrilación (termodinámica) y además otro período en el cual se encuentran presentes especies metastables. Mediante experimentos de fluorescencia se ha detectado que el paso determinante en el proceso de fibrilación resulta ser la formación de dímeros probablemente debido a la energía de activación asociada a la reorganización estructural. Como consecuencia del conocimiento tanto termodinámico como cinético de estos sistemas se ha conseguido obtener geles metaestables en presencia de otros compuestos que forman agregados termodinámicamente más estables pero que permanecen en disolución (self-sorting cinético). Teniendo en cuenta el papel que los péptidos pequeños desempeñan tanto como modelos o inhibidores de la agregación amiloide se ha decido probar la interacción entre los tetrapéptidos ácidos y el péptido amiloide Ab1-40 obteniendo resultados satisfactorios para al menos dos de los compuestos que parecen funcionar como semillas (núcleos) para la agregación del péptido amiloide. Comparando nuestros resultados con otros previamente publicados resulta importante destacar que nuestros compuestos son de pequeño tamaño (cuatro aminoácidos) y además no poseen ningún fragmento contenido en dicha proteína. 3) Tetrapéptidos básicos formados por K y F Tras el estudio de los tetrapéptidos ácidos se han sintetizado dos análogos tetrapépticos básicos (7-8) que contienen lisina (K) en lugar de ácido aspártico (D). Además de formar geles en agua básica se ha logrado la coagregación a valores de pH neutros con los compuestos 1 y 2 utilizando para ello interacciones no covalentes. La metodología utilizada para ello ha sido mediante la inyección de sus componentes por separado en disolución dando lugar a hidrogeles homogéneos y transparentes con características idóneas para potenciales aplicaciones biológicas. Utilizando el mismo concepto se han desarrollado además geles multi-componente capaces de mantener su estabilidad macroscópica en todo el rango de pH. Dicho comportamiento es debido al intercambio que se establece entre redes co-agregadas de dos componentes a pH neutro y redes formadas por un solo compuesto a valores ácidos o básicos de pH. La singularidad de este sistema ha sido aprovechada para la liberación controlada de algunos colorantes teniendo en cuenta por un lado la estructura molecular de dichos compuestos y por otro lado las características particulares que presentan las diferentes redes co-ensambladas. - 4) Tripéptidos anfifílicos formados por P, F y E Por último, las propiedades catalíticas de la prolina en sitemas autoensamblados han sido ampliamente estudiadas, en colaboración con el profesor Ashkenasy de la Universidad Ben Gurinon (Israel), atendiendo a los precedentes publicados por el grupo.(6) Para ello se han utilizado los compuestos de prolina anteriormente descritos en reacciones de condensación aldólica mostrando una clara influencia de la hidrofobicidad proporcionada por la cadena alifática del extremo C-terminal. Aquellos compuestos que formaron redes fibrilares en agua resultaron activos en la formación de enlaces C-C mientras que los compuestos que permanecieron en disolución resultaron inactivos. Estos sistemas catalíticos demuestran pues la emergencia de propiedades catalíticas debidas al autoensamblaje. Además el orden en la secuencia de aminoácidos influyó en los resultados obtenidos sugiriendo la formación de sitios catalíticos de diferente accesibilidad. Dichos compuestos sirvieron además de modelos para decapéptidos de secuencia semejante que resultaron también ser activos en reacciones aldólicas. Finalmente y tras conocer las propiedades catalíticas des estos compuestos se probó su efectividad en la obtención de productos biológicamente más relevantes de tipo carbohidratos. III. Conclusiones En resumen, durante el transcurso de la presente tesis doctoral se han diseñado y sintetizado con éxito nuevos hidrogelantes basados en péptidos anfipáticos de pequeño tamaño. Ambas metodologías empleadas para ello, tanto en disolución como en fase sólida han dado lugar a resultados satisfactorios pudiendo obtener los productos con elevado grado de pureza y suficiente en cantidad. El estudio del proceso de agregación desarrollado sobre todo para los tetrapéptidos ácidos ha permitido poner de manifiesto lo importante que resulta el balance hidrofóbico/hidrofílico en el modo de agregación y propiedades de los sistemas finales. Profundizar en la termodinámica y cinética de este proceso ha permitido además discernir la etapa limitante del mismo y utilizar dicho conocimiento para la elaboración de sistemas multi-componente más complejos basados en especies termodinámicamente metaestables. Dichos estudios resultan de gran utilidad considerando que los péptidos son considerados buenos modelos de la agregación amiloide y que los fenómenos que aquí se presentan pueden observarse e incluso magnificarse en sistemas proteicos de mayor tamaño. Por otro lado el co-ensamblaje entre dos compuestos opuestamente cargados ha permitido obtener geles cuya estabilidad se extiende a todo el rango de pH. Dichos sistemas resultan de gran utilidad biológica puesto que pueden formarse a pH neutro sin necesidad de calentar o aplicar ningún otro estímulo externo simplemente mediante la mezcla de sus componentes por separado en disoluciones acuosas. Además se ha logrado modular la liberación de ciertos colorantes atendiendo a la estructura del mismo y de la red fibrilar que lo contiene. Finalmente la aparición de propiedades catalíticas debidas al auto-ensamblaje ha sido demostrada para derivados anfifílicos que contienen prolina como fragmento funcional. La aparición de nuevas propiedades a consecuencia del autoensamblaje así como el papel fundamental que él mismo desempeña en la formación de compartimentos aislados confiere relevancia prebiótica a estos pequeños sistemas peptídicos agregados. Los resultados obtenidos contribuyen pues al mejor entendimiento de este complejo proceso que representa la fibrilización. IV. Referencias 1. a) Knowles, T. P. J.; Vendruscolo, M.; Dobson, C. M., The amyloid state and its association with protein misfolding diseases. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2014, 15, 384-396; b) Hamley, I. W., The amyloid ß peptide: A chemist's perspective role in Alzheimer's and fibrillization. Chem. Rev. 2012, 112, 5147-5192. 2. a) Lakshmanan, A.; Cheong, D. W.; Accardo, A.; Di Fabrizio, E.; Riekel, C.; Hauser, C. A. E., Aliphatic peptides show similar self-assembly to amyloid core sequences, challenging the importance of aromatic interactions in amyloidosis. Proc. Natl. Acad. Sci. 2013, 110, 519-524; b) Gazit, E., Self assembly of short aromatic peptides into amyloid fibrils and related nanostructures. Prion 2007, 1, 32-35; c) Hamley, I. W., Peptide fibrillization. Angew. Chem. Int. Ed. 2007, 46, 8128-8147; d) Gazit, E., Mechanisms of amyloid fibril self-assembly and inhibition. FEBS J. 2005, 272, 5971-5978. 3. a) Dasgupta, A.; Mondal, J. H.; Das, D., Peptide hydrogels. Rsc Advances 2013, 3, 9117-9149; b) Jonker, A. M.; Löwik, D. W. P. M.; van Hest, J. C. M., Peptide- and Protein-Based Hydrogels. Chem. Mater. 2012, 24, 759-773. 4. Escuder, B.; Miravet, J.F., Functional Molecular Gels. RSC 2013; pp 001-319. 5. Tena-Solsona, M.; Angulo-Pachón, C. A.; Escuder, B.; Miravet, J. F., Mechanistic insight into the lability of the benzyloxycarbonyl (Z) group in N-protected peptides under mild basic conditions. Eur. J. Org. Chem. 2014, 3372-3378. 6. a) Berdugo, C.; Miravet, J. F.; Escuder, B., Substrate selective catalytic molecular hydrogels: the role of the hydrophobic effect. Chem. Commun. 2013, 49, 10608-10610; b) Rodríguez-Llansola, F.; Miravet, J. F.; Escuder, B., A supramolecular hydrogel as a reusable heterogeneous catalyst for the direct aldol reaction. Chem. Commun. 2009, 7303-7305.

Les hydrogels sont des réseaux 3D retenant de grandes quantités d'eau. Biocompatibles, ils sont utilisés pour la délivrance de médicaments. Dans le but de développer des hydrogels antibactériens, cette thèse présente deux études basées sur l'utilisation d'un tripeptide phosphorylé protégé par un fluorénylméthoxycarbonyle (Fmoc), qui peut s'auto-assembler en hydrogel. Dans la première étude, différentes conditions de préparation (pH, sel, présence de polysaccharide) ont été étudiées pour former un hydrogel autocicatrisant et antibactérien libérant un antibiotique, le florfénicol. Dans la seconde étude, des stratégies de synthèse peptidiques et de phosphoramidites en phase solide ont été combinées pour ajouter le florfénicol au phosphate de tyrosine protégé par le Fmoc via un phosphodiester, clivable par des nucléases produites par des bactéries. Des résultats encourageants ont montré la formation du composé ciblé, ouvrant la voie au design d'un peptide antibactérien auto-défensif
Hydrogels are 3D networks of fibers that retain large amounts of water when swollen. Due to their biocompatibility, they are increasingly used for drug delivery. To develop antibacterial peptide-based hydrogels, this dissertation presents two studies based on the use of a fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc)-protected phosphorylated tripeptide that can self-assemble into a hydrogel. In the first study, different preparation conditions (pH, salt, presence of polysaccharide) were investigated to obtain a self-healing and antibacterial hydrogel capable of releasing an antibiotic, florfenicol. In the second study, a solid-phase peptide and phosphoramidite synthesis strategies were combined to add florfenicol to the Fmoc-protected tyrosine phosphate via a phosphodiester, which can be cleaved by nucleases produced by bacteria. Encouraging results showed the formation of the targeted compound, paving the way for the design of a self-defensive antibacterial peptide

The intervertebral disc (IVD), situated between adjoining vertebrae, consists of the gelatinous nucleus pulposus (NP) in the centre surrounded by the tougher annulus fibrosus (AF). Its main roles are to distribute loads and to act as joints. With aging, degenerative disc disease (DDD) occurs due to an imbalance in anabolic and catabolic events in the IVD, which results in a loss of function. Lower back pain (LBP) affects 84% of people at some point in their lifetime and is strongly associated with DDD. Current LBP treatments have limited long term efficacy and are symptomatic rather than curative. Cell-based therapies are regarded to hold great potential for the treatment of DDD as it has been hypothesised that they could regenerate the damaged tissue and alleviate LBP. A number of natural and synthetic biomaterials have been investigated as NP tissue engineering scaffolds with varying results. In this study, a self assembling peptide hydrogel (SAPH) was investigated for its potential as a cell carrier and/or scaffold for NP tissue engineering. SAPHs display the advantages of natural polymer hydrogels such as biocompatibility and biodegradability whilst combining the advantages of synthetic materials such as controlled structural and mechanical propertiesCharacterisation determined that the SAPH nanofibrous architecture had features that were of similar scale to extracellular matrix (ECM) components of the human NP. The mechanical properties of the SAPH could be optimised to closely match the native tissue. The system could shear thin and self-heal making the system ideally suited to delivery via minimally invasive procedure. The three dimensional (3D) culture of bovine NP cells (bNPCs) in the SAPH demonstrated that the NP phenotype could be restored after de-differentiation during monolayer culture. Gene expression results demonstrated that ‘traditional’ and ‘novel’ NP markers were highly expressed throughout in vitro culture. Cell viability was high, cell population remained stable and bNPCs adopted the characteristic rounded morphology of native NPCs. Finally, type II collagen and aggrecan, the main ECM components of the NP, were deposited with increasing production over culture period. Growth differentiation factor 6 (GDF-6) has been identified as the most promising current growth factor for inducing discogenic differentiation from human bone marrow mesenchymal stem cell (h-BMMSCs). After samples were stimulated with GDF-6, gene expression results confirmed that a NP-like phenotype could be induced with high expression of ‘traditional’ and ‘novel’ NP markers. Cell viability was high, cell population remained stable and NP associated ECM components were deposited with cells displaying a rounded morphology. Interestingly, when h-BMMSCs were cultured without GDF-6, it was strongly suggested that spontaneous discogenic differentiation occurred after culture in the SAPHs as ‘traditional’ and ‘novel’ NP markers were highly expressed, morphology was comparable to native NPCs and type II collagen and aggrecan were deposited extracellularly. If these findings were accurate then this is the first study to demonstrate that a NP-like phenotype could be induced from MSCs without use of an exogenous growth factor or a discogenic bioactive motif. Despite exciting and novel results, further work is required to confirm the potential of SAPHs for NP tissue engineering scaffolds.

Several studies exist in the literature which utilise either dendritic (covalent) or self-assembling (non-covalent) strategies to achieve multivalent binding to a biological target, but rarely are the two explored together. Herein, we compare and contrast dendritic and self-assembling approaches to organise a multivalent array of ligands to bind the protein, integrin αvβ3. In the first instance, linear RGD (Arg-Gly-Asp) peptides were covalently attached to first and second generation dendritic frameworks, and a positive (monovalent) and negative control were synthesised. A fluorescence polarisation (FP) competition assay was used to quantify the binding. The first generation dendron (2.16) was the most effective binder, with an EC50 of 125 μM (375 μM per peptide unit); significantly better than the monovalent ligand (2.19), the binding of which could not be quantified in our assay, even at 1 mM concentration; whilst the second generation dendron (2.17) was somewhat less effective, indicating that there is an optimum number of ligands that can be displayed before the multiple ligand array becomes disadvantageous to the binding. To explore the non-covalent approach, the linear RGD peptide was conjugated to either a single hydrophobic C12 aliphatic chain (3.2), an aromatic pyrene (3.4), a C22 aliphatic chain (3.6), or two C12 aliphatic chains (3.18), which gave rise to amphiphilic peptides which were able to self-assemble to differing degrees and into markedly different morphologies, as shown by a Nile Red encapsulation study and TEM imaging. Spherical micelles were formed by amphiphiles 3.2 and 3.4, whereas 3.6 and 3.18 produced cylindrical, rod-like micelles. Compounds 3.2 and 3.4 were the most effective integrin binders at concentrations of 200 μM and 110 μM, respectively, whilst 3.6 and 3.18 failed to produce a quantifiable binding concentration. The results therefore show that not only does the micellar self-assembly approach yield multivalent ligand displays with improved efficiency of binding compared with the dendritic method, but the morphology of the self-assembled system can also be detrimental to the recognition of the protein, at least in our FP assay and using purified integrin in solution. Finally, we report on a family of linear RGD peptide conjugate hydrogelators. Of particular interest was the novel bolaamphiphile C12-[urea-RGD]2 (4.4), comprised of linear RGD peptide head groups connected to either end of a hydrophobic C12 aliphatic chain via urea linkages. The molecule undergoes thermoreversible chiral self-assembly in water and generates a sample-spanning nanofibrous gel network, as determined by circular dichroism spectroscopy and TEM/SEM imaging, respectively. Gels were formed at a minimum gel concentration (MGC) of 0.06 wt % (0.6 mg/ml, 0.5 mM), one of the lowest MGCs reported and represents a “super” hydrogel. We report on its responsiveness (breakdown) towards charge dense basic anions such as phosphate and acetate, but its stability in the presence of more charge diffuse halide and nitrate anions. Furthermore, we demonstrate the passive diffusion of encapsulated low MW additives out of the gel phase, whereas high MW, protein-sized molecules remain trapped within the fibrous network.

Thesis (M.Ch.E.)--University of Delaware, 2008.
Principal faculty advisors: Joel P. Schneider, Dept. of Chemistry & Biochemistry; and Eric M. Furst, Dept. of Chemical Engineering. Includes bibliographical references.

Les matériaux polymères multi stimulables sont d’ores et déjà utilisés dans différents domaines d’applications, tels que le relargage de principes actifs sur commande, l’ingénierie tissulaire, les matériaux auto réparants ou les senseurs. Depuis une vingtaine d’années, la chimie supramoléculaire s’est révélée être un outil de choix pour créer ce type de matériaux dits « intelligents ». Elle permet en effet de moduler voir de programmer les propriétés des matériaux en contrôlant le caractère dynamique des interactions supramoléculaires via l’application de stimuli adaptés. Les travaux réalisés dans le cadre de cette thèse financée par l’ANR (projet STRAPA) avaient pour principal objectif d’exploiter des complexes à base de cyclobis paraquat paraphénylène (CBPQT4+) et d’entités riches en électrons (tétrathiafulvalène, naphtalène) pour concevoir des hydrogels supramoléculaires multi-stimulables. Deux types d’hydrogels ont été développés : des hydrogels physiques (réticulés de manière supramoléculaire) capables de présenter une transition sol-gel sous stimuli (température, ajout de molécules compétitrices) et des hydrogels chimiques (réticulés de manière permanente) dotés de motifs de reconnaissance moléculaire riches en électrons dont les propriétés de gonflement peuvent être finement contrôlées. En particulier, nous avons montré que celles-ci pouvaient être manipulées très facilement via le nombre d’unités riches en électrons présents au sein des hydrogels, en contrôlant le pourcentage de complexes formés, ainsi qu’en appliquant divers stimuli (température, red/ox, macromolécules compétitrices, tensioactifs)
Multistimuli-responsive polymer materials play an important role in various fields of applications, (drug delivery system, tissue engineering, and self-healing materials. In the last past decades, supramolecular chemistry has emerged as a powerful tool to build such smart materials. Indeed, thanks to the inherent and/or induced dynamic behavior of supramolecular interactions, materials properties can be potentially tuned or even programmed. The main objective of this thesis, that have been carried out in the framework of the STRAPA ANR project, was to exploit host-guest interactions formed from the cyclobis paraquat paraphenylene (CBPQT4+) host molecule and electron-rich entities (tetrathiafulvalene, naphthalene) to conceive multi-stimuli responsive hydrogels. Two kind of smart hydrogels have been developed : physical hydrogels in which the sol-gel transition can be controlled upon heating or by adding competitive molecules, and chemical hydrogels with programmable swelling properties. In the last case, we have notably shown that the actuating behavior of hydrogels could be finely triggered by applying various environmental stimuli (T, red/ox, competitive macromolecules and surfactants)

Le but de ma thèse a été de réaliser de nouveaux composés hybrides constitués de nanotubes de carbone (ou fullerènes) et de nanotubes de peptides. L’approche choisie a consisté à greffer sur des nanotubes de carbone, ou dans un premier temps sur des fullerènes, via des bras espaceurs, des cyclopeptides «de type Ghadiri» conduisant aux nanotubes de peptides. Pour se faire, la synthèse de bras espaceurs a été nécessaire ainsi que leur fixation sur les nanotubes de carbones ou fullerènes. Les cyclopeptides sont constitués d’un nombre pair d’acides aminés (8) alternés D et L s’auto-assemblant en feuillets β antiparallèles pour conduire à des nanotubes. Des essais de solubilisation du cyclopeptide diacide révèlent l’impossibilité d’utiliser ces composés en synthèse organique, dans la mesure où ils ne sont pas solubles dans les solvants organiques classiques. Il a fallut ainsi revoir la synthèse en incluant soit le fullerène en cours de synthèse peptidique soit en modifiant les conditions pour permettre une solubilisation du peptide. Les composés synthétisés ont été caractérisés par différentes méthodes notamment en TEM, FT-IR, ATR-FTIR, microscopie optique, diffusion de la lumière. De nouvelles applications aux peptides de Ghadiri ont été cherchées en imagerie (par encapsulation du xénon hyperpolarisé dans les cavités). Il a été mis en évidence de nouvelles organisations cristallines des peptides possibles dans des conditions contrôlées à l’aide de contre ions tels que les éléments de la première colonne du tableau périodique (Li, Na, K, Rb, ou Cs). Ces organisations, différentes en fonction du contre ion choisi, ont un caractère fractal remarquable, une organisation cristalline régulière et on observe un réseau de liaisons hydrogène inattendu dans les conditions utilisées
The purpose of my thesis was to realize new hybrid compounds based on carbon nanotubes (or fullerenes) and peptide nanotubes. The chosen approach consisted first in graftiong on carbon nanotubes, or at first on fullerene, via linkers, « Ghadiri type » cyclopeptides leading to the peptide nanotubes. On the one hand, the grafting was planned to be done via the introduction of linkers on carbon nanotubes or C60. On the other hand, cyclopeptides are obtained by SPPS using an even number of alternated d and l amino acids auto-assembling in antiparallel β sheets affording nanotubes after cleavage. Although, we were successful of the first part of this approach, unsolubility of the cyclopeptides in common organic solvents did not allow us to get the target compound. Introduction of C60 during the solid phase synthesis was not more satisfactory. In a second part, I focused on the characterization of two cyclopeptides, by TEM, ATR-FTIR, optical microscopy and light scattering. During there studies, I also evidenced self-assembly. The self-organization can be drive by the counter-ion on (one or two) Glu. In fact, whereas the free acid yields to nanotubes, salification strongly affects the self-assembly loading after crystallization to fractal aggregates. The shapes of these aggregates are also dependent of the counter-ions used. In addition, I also briefly evaluate the potential of some of these cyclopeptides to encapsulate Xe for MRI

A variety of “clickable” self-assembling peptide-amphiphile hydrogel systems are reported. Covalently linked hydrogels were prepared using alkyne-azide “click” chemistry and thiolene photochemistry, which were used in combination with short self-assembling peptideamphiphile compounds. For alkyne-azide “click” hydrogels, samples were formed from a mixture of two peptideamphiphiles which were separately disubstituted with alkyne or azide functionalised amino acids. This allowed for production of an extensively triazole-linked hydrogel product when gelation was performed in combination with the appropriate “click” pre-catalyst and reductant. For thiol-ene photochemical hydrogels samples were formed from a mixture of two peptideamphiphiles which were separately disubstituted with cysteine or Alloc-protected lysine. UV exposure was used to catalyse the covalent linking of the asembled hydrogel. Michael addition thiol-ene reactions were also investigated as a potential covalent linking method. A number of model reactions were attempted on specially synthesised amino acids. Results were promising, but a number of difficulties were encountered which made them unsuitable for incorporation in a hydrogel system. The hydrogel samples produced were all found to be viscoelastic hydrogels through analysis by rheological methods. A variation in the stiffness of the samples was observed, with samples having Young’s modulus values in the soft to intermediate range when compared to that of various tissues. SEM analysis indicated the hydrogels exhibited a fibrous nanostructure. The biological activity of the hydrogel samples was investigated by 2D seeding of cells on hydrogel samples. A LIVE/DEAD assay was performed which indicated hydrogel samples were able to support cell attachment and growth in vitro.

Des hydrogels chimiques à base de xanthane ont été élaborés en jouant sur les conditions de synthèse pour se placer dans des milieux favorables aux deux conformations possibles du xanthane : ordonnée (double hélice) et désordonnée (pelote statistique). Une grande partie du travail a été consacrée à la détermination des paramètres contrôlant la transition conformationnelle hélice - pelote du xanthane en solutions concentrées. Ceux-ci ont été optimisés en vue de la synthèse des hydrogels à base de xanthane en milieu acide par l'acide adipique dihydrazide (ADH) et basique par le trisodium trimetaphosphate (STMP). Les systèmes sont caractérisés par analyse élémentaire, taux de gonflement et comportement dans différentes conditions du milieu. Quelques molécules modèles ont été testées afin de connaître leur potentiel de retenir et de libérer les principes actifs dans des milieux qui imitent les fluides humains
Chemical hydrogels based on xanthan have been synthesized with different conditions that are favorable to the two possible xanthan conformation : ordered (double helix) disordered (statistic coil). A great part has been devoted the determination of parameters which controlled the conformation transition in xanthan concentrated solutions. Theses parameters have been optimized in view to synthetize xanthan hydrogels in acidic medium by adipic acid dihydrazid (ADH) and in alkaline medium by trisodium trimetaphosphate (STMP). The systems are characterized by elemental analysis, kinetic swelling degree and behavior in different environnmental conditions. Some model molecules have been tested in order to assess the entrapping and releasing properties in environments that are mimicking human fluids

L'objectif de ce travail a été d'étudier l'activité hydrolytique d'une enzyme, la pullulanase, vis à vis du pullulane dans des hydrogels fonctionnalisés ou non à base d'alginate de calcium. L'alginate a été modifié chimiquement par une polyéther amine de la famille Jeffamine® qui présente un caractère LCST "Low Critical Solubility Temperature". L'enzyme immobilisée à hauteur de 30% dans des billes d'alginate de calcium hydrolyse lentement le pullulane en raison de la pénétration de celui ci dans les billes et libère du maltotriose et ses premiers multiples alors que l'enzyme libre donne un mélange d'oligosaccharides très polydispersé. La proximité entre enzyme et substrat au sein de l'hydrogel explique ce comportement. L'activité de l'enzyme au sein des hydrogels est très peu affectée par le pH. L'enzyme est même active à pH 4 contrairement à l'enzyme libre ce qui montre la protection de l'enzyme dans ceshydrogels. Avec l'alginate fonctionnalisé, le taux d'immobilisation de l'enzyme est de 100% en raison d'interactions préférentielles entre la pullulanase et les greffons Jeffamine®. L'enzyme immobilisée dans ces matrices ne présente pas une activité enzymatique différente
The aim of this project has been to study the hydrolytic activity of the enzyme, pullulanase, toward its substrate pullulan into functionalized or non-functionalized hydrogels based on calcium alginate. Alginate has been chemically modified with a polyether amine, Jeffamine®, with LCST "Low Critical Solubility Temperature" property. The immobilized enzyme amounted to 30% within calcium alginate beads hydrolyses pullulan slowly owing to its penetration into beads and releases maltotriose and its multiples compared to free enzyme which a large distribution of pullulan fragments is observed during the treatment. The close relationship between enzyme and its substrate into these hydrolgels is only marginally affected by pH. The enzyme is even active at pH 4 contrary to the free enzyme indicating an enzyme protection within these hydrogels. In the case of functionalized alginate, the enzyme immobilisation amount is about 100% because of the preferential interactions between pullulanase and Jeffamines-grafted. The immobilized enzyme does not show a different enzyme activity

Regenerative medicine is a vastly expanding subject area, with a number of different strategies and substrates being studied to ultimately create a model for repairing diseased and injured tissue. Stem cells are a promising cell type in this field as they are known to differentiate into a number of cell types and contribute to normal cell repair. However, despite their potential as a useful cell choice in the field of regenerative medicine, stem cell based therapies have limited potential due to their ability to form tumours when implanted in the human body, problems arising with immunogenicity and the difficulty in obtaining adequate cell numbers for transplantation. To overcome these problems, many research groups are interested in using biomimetic substrates and scaffolds to mimic the architecture, chemical composition and stiffness properties of the in vivo cell niche and various human tissues, but in an in vitro setting. By doing so, the MSC behaviour can be studied and the differential lineages examined allowing the desired substrate to be tuned to obtain the desired cellular outcome. In this work, hydrogels composed of Fmoc diphenylalanine and Fmoc Serine have been characterised and used to study changes in Mesenchymal stem cell (MSC) responses in a two and three dimensional state. The results obtained from this work demonstrate that such hydrogels support MSC growth and produce a mixed phenotype population which differentiates over time. A further hydrogel paired with collagen has shown promise in promoting MSC differentiation down the osteogenic lineage and has potential for the future study in maxillofacial reconstruction models.

Les biofilms ont un impact négatif important tant d’un point de vue médical qu’économique. Diverses approches basées sur l’immobilisation de substances bactéricides ont été développées pour empêcher la formation de biofilms sur la surface des matériaux. Cependant, elles ne donnent pas entière satisfaction (efficacité limitée, toxicité, émergence de multirésistance). A côté de ces approches synthétiques, certains organismes vivants ont développé des stratégies efficaces et largement éprouvées pour contrer l’adhésion microbienne. Ainsi, les amphibiens sécrètent un mucus épidermique à base de peptides antibactériens. Nous nous sommes inspirés de cet exemple pour réaliser différents revêtements basés sur des macromolécules hydrophiles et flexibles greffées par des peptides antibactériens. Tout d’abord, des brosses copolymères à base de méthacrylates d’oligo(éthylène glycol) ont été polymérisées par ATRP à partir de supports plans puis greffées par des dérivés de temporine‐1Va ou de magainine‐1. Cette stratégie a été ensuite adaptée avec succès sur des supports particulaires et sur des brosses thermo‐répondantes conduisant à des films montrant une variation de leur caractère bactéricide avec la température. Par ailleurs, des couches de polysaccharides ont été immobilisées sur des surfaces d’or puis greffées par la magainine‐1. La microstructure de ces couches a été optimisée afin de garantir l’accessibilité du peptide. La plupart de ces revêtements se sont montrés très efficaces contre diverses espèces bactériennes. Ce travail ouvre la voie au développement de nouveaux revêtements pour lutter contre la formation des biofilms, notamment dans le cas de dispositifs (bio)médicaux
From a medical and economical point of view, biofilms have important negative impacts. Various approaches based on the immobilization of bactericidal substances have been developed to prevent biofilm formation on materials surfaces. However, they are not fully satisfying due to limited efficiency, toxicity, or emergence of multiresisting bacteria. Compared to these synthetic approaches, some living organisms have developed highly efficient strategies tested over eons to eliminate the microbial adhesion. For instance, amphibians excrete an epidermal mucus containing antibacterial peptides. Considering this last example, we synthesized various coatings based on hydrophilic and flexible macromolecules grafted by antibacterial peptides. First of all, copolymer brushes based on oligo(ethylene glycol) methacrylates were polymerized by ATRP from planar substrates and afterwards grafted by temporin‐1Va or magainin‐1 derivatives. This strategy was subsequently successfully adapted on microparticles and on thermoresponsive polymer rushes leading to thin films showing a modulation of their bactericidal properties with emperature. Moreover, polysaccharide layers were immobilized on gold surfaces, then rafted by magainin‐1. The microstructure of these layers was tuned to optimize the accessibility of the grafted peptide. The resulting coatings showed a high activity against various bacterial strains. This work paves the way to the development of new coatings fighting biofilms, notably for (bio)medical devices

Dans un contexte de démarche écoresponsable et pour répondre aux exigences de biocompatibilité notamment dans les applications cosmétiques et biomédicales, nous avons développé de nouveaux hydrogels à base de polysaccharides neutres et anioniques en utilisant deux voies originales. La 1ère approche est biomimétique et a consisté à mimer un phénomène d’élaboration naturelle d’hydrogels que l’on retrouve chez certains végétaux pour lesquels une enzyme, la laccase, permet de créer des liens de réticulation par dimérisation des composés phénoliques (en l’occurrence de l’acide férulique FA) présents sur les arabinoxylanes des mucilages des graines de céréales par exemple. Notre travail a ainsi consisté à greffer de l’acide férulique via deux chimies différentes de type imidazole et carbodiimide respectivement pour des polysaccharides neutres ou anioniques. Nous avons ainsi fonctionnalisé trois polysaccharides : le pullulane ou PUL (neutre modèle), le carboxyméthylpullulane ou CMP (anionique modèle) et l’acide hyaluronique ou HA (anionique d’intérêt). Des taux de greffage compris entre 2 et 25% ont été obtenus. L’étude physicochimique en régimes dilué et semi-dilué a permis de mettre en évidence un comportement associatif lié au caractère amphiphile des polysaccharides fonctionnalisés. La réticulation en présence de laccase, suivie in situ en rhéologie, a été réalisée avec succès sur les différents systèmes envisagés avec des contrôles possibles de la cinétique, des propriétés mécaniques finales ou encore du gonflement des hydrogels en fonction du caractère neutre ou chargé des polysaccharides, du degré de substitution en acide férulique, de la concentration en polymère ou de l’activité enzymatique fixée. Les dérivés synthétisés ont globalement démontré des activités biologiques (antioxydante et cytocompatible) intéressantes. La deuxième approche repose sur la photoréticulation possible de polysaccharides (PUL, CMP et HA) fonctionnalisés par le greffage d’amine/acide gras mono ou polyinsaturé (oleylamine, acide oléique et linoléique) via la chimie des imidazoles. Si le pullulane modifié par l’acide linoléique à 2% s’est avéré non hydrosoluble en raison de son caractère neutre, tous les autres dérivés avec des taux de greffages de 3 et 10% ont démontré une bonne solubilité dans l’eau. Les études physicochimiques mettent en évidence un très fort caractère associatif de ces dérivés amphiphiles avec la formation de gels physiques en régime semi-dilué. La photoréticulation a été démontrée en rhéologie sous irradiation UV in situ en présence d’un photoamorceur de type Darocur 1173®. Les résultats préliminaires obtenus selon cette approche en photoréticulation ouvrent ainsi des perspectives intéressantes
In the framework of an eco-responsible context and to take advantage of biocompatibility, notably in cosmetic and biomedical applications, we have developed new hydrogels based on neutral and anionic polysaccharides using two original routes. The first approach is biomimetic and consists of mimicking a natural development of hydrogels that is found in certain plants for which an enzyme, laccase, allows to create crosslinks by dimerization of phenolic compounds, in occurrence of ferulic acid (FA) present on arabinoxylans mucilage of cereal seeds for example. Thus, our work consisted in grafting ferulic acid via two different chemical ways that means imidazole and carbodiimide respectively for neutral or anionic polysaccharides. We functionalized three polysaccharides: pullulan or PUL (neutral model), carboxymethylpullulane or CMP (model anionic) and hyaluronic acid or HA (anionic of interest) with grafting rates of between 2 and 25%. The physicochemical study in diluted and semi-diluted regimes evidenced an associative behavior due to the amphiphilic character of the functionalized polysaccharides. The crosslinking in the presence of laccase, followed in situ thanks to rheology, has been successfully performed on the various envisaged systems with possible controls of kinetics, the final mechanical properties or the swelling of the hydrogels as a function of the neutral or charged nature of the polysaccharides, the degree of substitution in FA, the polymer concentration or the enzymatic activity. The synthesized derivatives have generally demonstrated interesting biological activities (antioxidant and cytocompatibility). The second approach is based on the possible photocrosslinking of polysaccharides (PUL, CMP and HA) functionalized by the grafting of mono or polyunsaturated fatty amine/acid (oleylamine, oleic acid and linoleic acid) via imidazole chemistry. If pullulan grafted with 2% of linoleic acid was found to be water-insoluble due to its neutral character, all other derivatives (i.e. anionic ones) with grafting rates of 3 and 10% showed good solubility in water. The physicochemical studies show a very strong associative character of these amphiphilic derivatives with the formation of physical gels in semi-diluted regime. Photocrosslinking has been demonstrated in situ thanks to rheology/UV irradiation in the presence of a Darocur 1173® photoinitiator. The preliminary results according to this photocrosslinking approach thus open interesting perspectives

Connus pour leur capacité à retenir de grandes quantités de solvant, qu’il soit organique ou aqueux, les gels sont des matériaux mous présentant de nombreuses applications tant dans l’industrie que dans notre vie quotidienne. En particulier, les hydrogels sont largement utilisés dans les domaines de la santé, principalement formulés à partir de polymères. Toutefois, depuis une vingtaine d’années, nous observons l’émergence d’un nouveau type d’hydrogels conçus à partir de molécules bio-inspirées : les peptides. En effet, en fonction de leur séquence et de leur nature, les peptides sont capables de s’auto-organiser de manière hiérarchique pour former de premiers assemblages supramoléculaires qui évoluent en structures de plus grandes tailles, à savoir des fibrilles, des fibres, puis un réseau fibrillaire tridimensionnel complexe. Un des avantages de ces hydrogels réside dans la nature intrinsèque des peptides qui offrent d’indéniables atouts en termes de biocompatibilité et biodégradabilité. Ainsi, ces matériaux s’avèrent prometteurs dans le domaine biomédical avec de nombreuses applications déjà reportées, et l’arrivée de premiers composés commerciaux développés en tant que milieux de culture cellulaire. Toutefois, le développement raisonné de tels hydrogels se heurte à un manque de compréhension des liens entre structure primaire des peptides, auto-assemblage, objets supramoléculaires formés et propriétés mécaniques, c’est-à-dire la relation structure/propriétés, restreignant la mise au point de nouveaux hydrogels aux propriétés contrôlées. C’est dans ce contexte que notre travail se situe, par l’exploration de nouvelles structures bio-inspirées et par l’analyse multi-échelle des hydrogels formés, allant d’études aux échelles moléculaires et supramoléculaires jusqu’aux caractérisations physico-chimiques et mécaniques.Nous avons ainsi développé, dans un premier temps, une série de nucléopeptides originaux, molécules hybrides peptides/acides nucléiques, constitués d'un heptapeptide fonctionnalisé par un dérivé de base nucléique. En fonction de la nature de cette dernière (à savoir : adénine, thymine, guanine ou cytosine), les hydrogels formés présentent de grandes disparités en termes de propriétés rhéologiques, avec notamment l’augmentation du module élastique et de la résistance à la contrainte, et l’émergence de propriétés de thermoréversibilité. Afin de comprendre l’origine de telles différences, des études à l’échelle mésoscopique, puis à plus petite échelle, ont été conduites, rendant compte des modulations structurales induites par la présence d’une base nucléique.Dans un second temps, nous avons cherché à générer de nouveaux hydrogels aux propriétés nouvelles et contrôlables par une approche multi-composés. Cette stratégie, qui consiste en l’association de plusieurs composés dont chacun participe à la structure des gels, a déjà montré son intérêt dans le cadre de la formulation de matériaux et d’hydrogels supramoléculaires. Ainsi, nous avons mis en évidence que l’utilisation de mélanges de peptides et/ou de nucléopeptides permettait une modulation fine des propriétés physico-chimiques et mécaniques des hydrogels, notamment par le choix des constituants, leur ratio respectif, ou la présence de bases nucléiques complémentaires. Les études multi-échelles menées sur ces systèmes multi-composés ont permis de comprendre les modalités d’interaction des composés entre eux et leurs conséquences sur l’assemblage supramoléculaire ainsi que sur les propriétés des hydrogels obtenus.Ainsi, par notre approche multi-échelle offrant une meilleure compréhension des liens entre modes d’assemblages supramoléculaires, structures et propriétés, ce travail de thèse montre l’intérêt de l’utilisation de composés nucléopeptidiques originaux, aux designs rationnels, pour la formulation d’hydrogels supramoléculaires, ouvrant ainsi une nouvelle voie vers la mise au point de matériaux mous aux propriétés optimisées et contrôlées
At the tenuous frontier between the solid and the liquid states, soft matter is focusing intense research interest. In particular, gels draw scientists’ attention due to their ability to fix a large amount of solvent either organic (organogels) or aqueous (hydrogels). The latter are predominantly made of polymers and find dozens of applications from industry to daily life. However, over the last twenty years, a new kind of hydrogels has appeared: the peptide-based hydrogels. Indeed, depending on their amino acid sequences, peptides can self-assemble to form supramolecular assemblies which give rise to higher-level structures, namely fibrils, fibres and eventually complex tridimensional networks. Thanks to their inherent advantages in terms of biocompatibility and biodegradability, peptides are highly relevant to develop hydrogel materials for numerous applications, mainly in the biomedical domain. However, the rational design of such hydrogels remains difficult because of a lack of understanding of the relationships between the primary structure of peptides and the resulting properties. This limitation prevents researchers to develop new hydrogels with finely controlled physicochemical and mechanical properties.In this context, we report herein on the development of new series of bio-inspired peptide-based structures forming hydrogels and their multiscale analyses from the supramolecular scale to the mechanical characterisations. Thus, we first discuss the rational design, synthesis and characterisation of hybrid DNA-nucleobase-incorporating peptide derivatives, also termed nucleopeptides, comprised of an heptapeptide functionalized with one of the four DNA nucleobases (i.e., adenine, thymine, guanine or cytosine). Interestingly, the incorporation of a nucleobase induces significant modulations of their physical and structural gel properties, self-assembling kinetics and mechanical properties (e.g., with drastic enhancements of the elastic moduli or resistances to stress, and remarkable thermal reversibilities), depending on the nature of the nucleobase. To further understand the origins of such differences, all the mono-component hydrogels have been subsequently studied at the mesoscopic and then at lower scales, highlighting the impact of nucleic acids on the supramolecular organization.Then, to develop new hydrogel materials with more tuneable properties, we have focused our attention on the development of multicomponent nucleopeptide-based hydrogels. The multicomponent approach consists of the association of several constituents, which can interact in different ways, to obtain new hydrogels for which, in some instances, the resulting properties are greater than the sum of their parts. Thus, taking advantage of the presence of nucleobases and their inherent ability to self-assemble, we discuss the use of nucleopeptides to formulate multicomponent hydrogels and the impact of such mixtures on the structural, physicochemical and mechanical properties compared to the monocomponent approach. We show that mixing peptides and/or nucleopeptides bearing complementary nucleobases allows a control of the mechanical properties of the hydrogels. A multiscale analysis based on a large panel of techniques has provided new knowledge on the interaction behaviour of nucleopeptides and their subsequent consequences on the supramolecular assemblies, on the nanoobjects formed and on the physicochemical and mechanical properties of the resulting hydrogels.Thus, through a multiscale analysis approach of original series of nucleopeptide-based hydrogels, this work provides a better understanding of the relationships between structures and properties, highlighting the high potential of nucleopeptides to develop mono or multicomponent supramolecular hydrogels with optimized and well-controlled properties, thanks to a rational design

La vaccination, particulièrement chez les espèces animales, demeure toujours un outil efficace de préventions des maladies infectieuses. Les adjuvants sont des composants généralement indispensables dans la formulation des vaccins de par leurs rôles de vecteurs de l'antigène ainsi que de stimulateurs du système immunitaire. En effet, les antigènes seuls, pour la plupart, ne permette pas d'induire une protection satisfaisantes. Les propriétés uniques du chitosane, polymère naturel biocompatible et biodégradable, offrent un matériau de choix pour l'élaboration de nouvelles générations d'adjuvant tel que des nanoparticules ou des hydrogels.Les travaux de cette thèse ont portés sur l'élaboration d'adjuvants à base de chitosane chez l'animal. La préparation de solutions visqueuses de chitosane (0, 2 = Cp = 0,75 % (w/v)) en association avec différents types d'antigènes à savoir une souche atténuée de bactéries vivantes atténuées, de virus vivants atténués ou inactivités ainsi qu'une protéine recombinante purifié ont permis d'obtenir une réponse immunitaire chez les différentes espèces animales étudiées. Par ailleurs, le chitosane, par l'inspection des animaux durant les essais ainsi que post-mortem, a démontré une bonne innocuité ainsi qu'une résorbabilité satisfaisante. Dans le cadre du développement d'un système de relargage retardé d'antigènes, nous avons débuté l'élaboration d'un système permettant de prélever et d'injecter, via un système classique seringue/aiguille, une solution visqueuse gélifiante en conditions physiologiques (150 mM, 37°C). La diffusion plus lente d'un antigène associé à ce matériau a pour objectif d'améliorer la protection des animaux en stimulant de manière prolongée les différents acteurs du système immunitaire
Vaccination, especially in animal species, remains already an efficient tool in the prevention of infectious diseases. The carrier and immunostimulant properties of adjuvant allow increasing the action of antigen which, alone, is not enough capable to induce a long and strong immune response in host. The unique properties of chitosan, a biocompatible and biodegradable natural polymer, offer a choice material to elaborate new generations of adjuvant such as nanoparticles or hydrogels.This PhD works was focus on the development of chitosan-based adjuvant for animal species. The preparation of chitosan-based viscous solutions, with a polymer concentration from 0.2 to 0.75 % (w/v) mixed with different kind of antigens such as live attenuated bacteria, live attenuated or inactivated virus and a recombinant protein allowed obtaining an immune response in the studied animals. Moreover, the observation of animals during the protocol or in post-mortem inspections indicated a satisfying safety and resorbability. In vitro experiments were also conducted developing a syringeable and injectable in situ gelling chitosan-based hydrogel containing a model protein, destined to standard injection system. The slow release of antigen in the host should interact with the immune system longer increasing the final protection against diseases

Les polymères intrinsèquement conducteurs (PIC) sont une catégorie de matériaux qui connaissent actuellement un important essor. Cependant, leur principal inconvénient est leur insolubilité dans les solvants usuels. C’est pour cela que de nombreuses études les associent avec des matrices polymère pour former des composites. Lors de cette étude, nous avons synthétisé des copolymères à blocs conducteurs dont la structure chimique est contrôlée. Ces copolymères sont composés d’un bloc "matrice" et d’un second bloc conducteur. La première partie, polystyrène ou polyacrylate, est synthétisée par polymérisation radicalaire contrôlée (ATRP) afin de maîtriser les masses molaires (entre 5 000 et 15 000 g/mol) et la polymolécularité (Ip). La partie conductrice est un oligomère d’aniline. Puis, les deux blocs sont couplés pour former un copolymère dibloc. Cette synthèse est réalisée par voie conventionnelle (chauffage bain d’huile) et sous irradiation micro-onde. Une autre architecture de copolymère est réalisée, il s’agit du greffage de polyaniline sur un polymère naturel, le chitosane. En effet, celui-ci apporte des propriétés filmogène, mais également la possibilité de réaliser des hydrogels par réticulation du copolymère greffé. Ainsi un réseau dans lequel la PANI est répartie de façon homogène est obtenu
Intrinsically conducting polymers (ICPs) are a recent category of materials which currently make strong great strides. However, their main inconvenience is their insolubility in the usual solvents. That’s why lots of studies associate them with polymer matrices to make composites. During this study, conductive blocks copolymers with controlled architecture were obtained. These copolymers consist of a "matrix" block and a second conductive block. The first part, polystyrene or polyacrylate, is synthesized by controlled radical polymerization (ATRP) to control the molecular weight (between 5 000 and 15 000 g / mol) and the polydispersity (Ip). The conductive part is an oligomer of aniline. Then, both blocks are coupled to obtain a diblock copolymer. This synthesis is realized by conventional heating (bath of oil) and under microwave irradiation. Other architecture of copolymer is realized, it consists on the graft of polyaniline onto a natural polymer, the chitosane which brings coating properties, and the possibility of realizing hydrogels by crosslinking of grafting copolymer. So a network in which the PANI is distributed in a homogeneously is obtained

Objectifs. Les substituts vasculaires synthétiques sont à l’origine de nombreux échecs pour le remplacement des vaisseaux de petit calibre. L'émergence de l'ingénierie vasculaire ouvre des perspectives face à ce problème de santé publique. Le chitosane, polymère naturel, peut être utilisé comme matrice en ingénierie vasculaire. L'objectif de cette thèse était de produire des hydrogels de chitosane et d’étudier les propriétés mécaniques, biologiques et la biointégration. Matériel et Méthodes. Les hydrogels ont été caractérisés mécaniquement in vitro. En augmentant la concentration en chitosane, la résistance à la suture, à l’éclatement et les modules élastiques augmentaient de manière significative. Une série d'expériences, allant de l’évaluation in vitro à l’analyse in vivo de la biocompatibilité a été réalisée. In vitro, les hydrogels permettaient la prolifération des progéniteurs endothéliaux (EPCs) et étaient hémocompatibles. In vivo, les hydrogels n’étaient pas résorbés après 60 jours, dans un modèle d'implantation hétérotopique chez le rat. De plus, la biointégration du chitosane a été étudiée. In vitro, l’endothélium à la surface des hydrogels se comportait comme celui d’un vaisseau natif. In vivo, les hydrogels de chitosane étaient capables de moduler la réponse inflammatoire, dans un modèle d'implantation ectopique chez le rat, en favorisant la polarisation des macrophages vers le phénotype M2. Enfin, 2 tubes de chitosane ont été implantés avec succès pour des pontages carotidiens pendant 3 jours chez le mouton. Conclusion. En modulant la concentration de chitosane, nous avons produit des matrices avec des propriétés adaptées pour l’ingénierie vasculaire
Aims. Vascular grafts made of synthetic polymers perform poorly in small-diameter applications. Consequently, there is strong clinical to produce small caliber vessels with better patency. The emergence of vascular engineering opens new possibilities. Chitosan, a natural polymer, can provide a scaffold for vascular engineering. The goal of this thesis was to produce chitosan-based hydrogels and to assess their biological and mechanical properties and their biointegration. Methods and Results. Hydrogels were mechanically characterized in vitro. By increasing chitosan concentration, suture retention value, average burst strength and elastic moduli increased significantly. A series of experiments ranging from in vitro biocompatibility tests to in vivo studies was performed. In vitro, chitosan supported human endothelial progenitor cells (EPCs) proliferation and was hemocompatible. In vivo, no resorption of chitosan was observed in a rat heterotopic implantation model. In addition biointegration of chitosan hydrogels were investigated. In vitro, chitosan endothelialized with EPCs behave as a native endothelium. In vivo, chitosan hydrogels were able of modulating the inflammatory response of injured host tissue by favouring polarization of macrophages towards the beneficial M2 phenotype in a rat ectopic implantation model. Finally, as a proof of concept, 2 chitosan tubes were implanted successfully as carotid interposition grafts for 3 days in sheep. Conclusion. By modulating chitosan concentration, we produced scaffolds with suitable properties to be implanted in vivo

Craniofacial tissue loss due to traumatic injuries and congenital defects is a major clinical problem around the world. Cleft palate is the second most common congenital malformation in the United States occurring with an incidence of 1 in 700. Some of the problems associated with this defect are feeding difficulties, speech abnormalities and dentofacial anomalies. Current treatment protocol offers repeated surgeries with extended healing time. Our long-term goal is to regenerate bone in the palatal region using tissue-engineering approaches. Bone tissue engineering utilizes osteogenic cells, osteoconductive scaffolds and osteoinductive signals. Mesenchymal stem cells derived from human umbilical cord (HUMSCs) are highly proliferative with the ability to differentiate into osteogenic precursor cells. The primary objective of the study was to characterize HUMSCs and culture them in a 3D hydrogel scaffold and investigate their osteogenic potential. PuraMatrixTM is an injectable 3D nanofiber scaffold capable of self-assembly when exposed to physiologic conditions. Our second objective was to investigate the effect of Bone Morphogenic Protein 2 (BMP2) in enhancing the osteogenic differentiation of HUMSCs encapsulated in PuraMatrixTM. We isolated cells isolated from Wharton's Jelly region of the umbilical cord obtained from NDRI (New York, NY). Isolated cells satisfied the minimal criteria for mesenchymal stem cells (MSCs) as defined by International Society of Cell Therapy in terms of plastic adherence, fibroblastic phenotype, surface marker expression and osteogenic differentiation. Flow Cytometry analysis showed that cells were positive for CD73, CD90 and CD105 while negative for hematopoietic marker CD34. Alkaline phosphatase activity (ALP) of HUMSCs showed peak activity at 2 weeks (p

Les travaux de recherche réalisés, dans le cadre de la préparation de cette thèse ont pour objectif l’élaboration de nouveaux réseaux thermoréversibles biodégradables à base de polyglycolide (PGA) et d’hydrogels à base de polylactide (PLA) modifiés chimiquement au moyen du noyau furanique et du cycle maléimide. La réticulation du PGA, en suivant deux stratégies, en vue d’élaborer des réseaux thermoréversibles et biodégradables via la réaction de Diels-Alder a fait l’objet de la première partie de ce travail. Le but était entre autres de valoriser le PGA en conduisant à des structures réticulées avec des propriétés mécaniques requises tout en améliorant ses propriétés de stabilité. Des réseaux hybrides de PLA/PEG et PLA/PHEMA ont été ensuite synthétisés en phase fondu en adoptant la réaction de Diels-Alder comme mécanisme de réticulation. Une fois obtenus, leur mise au contact de l’eau conduit à la formation d’hydrogels. Les analyses structurales menées par RMN ont permis de confirmer la formation des structures attendues. La thermoréversibilité des réseaux obtenus a été montrée par des analyses rhéologiques. La morphologie des gels avant et après gonflement a été analysée par Microscopie Electronique à balayage. La dégradabilité des réseaux préparés a été examinée selon deux modes : hydrolytique et par les microorganismes en milieu aérobie
The research conducted for the preparation of this thesis aims to develop new thermoreversible and biodegradable polyglycolic-acid (PGA) based networks and polylactic-acid (PLA) based hydrogels, from polymers chemically modified by means of furanic, and maleimide cycle. The cross-linking of PGA to develop thermoreversible and biodegradable networks via the Diels-Alder reaction has been done by following two strategies and was the first part of this work. The aim was, among other things, to enhance the PGA by leading to reticulated structures with required mechanical properties while improving its stability properties. Hybrid networks of PLA / PEG and PLA / PHEMA were then synthesized in the melt by adopting the Diels-Alder reaction as a crosslinking mechanism. Once obtained, their contact with water leads to the formation of hydrogels. NMR structural analyzes confirmed the formation of expected structures. The thermoreversibility of the obtained networks has been shown by rheological analyzes. The morphology of the gels before and after swelling was analyzed by Scanning Electron Microscopy. The degradability of prepared networks was examined in two modes: hydrolytic and aerobic by microorganisms

La synthèse et la caractérisation d’hydrogels amphiphiles à base de carboxyméthylpullulane et d’un agent réticulent hydrophobe, le dibromohexane, ont fait l’objet de ce travail. La cinétique de gélification est rapide et chaque dibromohexane donne un lien de réticulation. Ces hydrogels possèdent deux fractions : une fraction gel et une fraction sol dont les proportions varient avec les paramètres de synthèse. Ces systèmes présentent un caractère métastable en étant très sensibles au temps et à la température pour donner des objets dont les tailles varient de quelques nanomètres à quelques microns. Leur structure est complexe et provient de la création de liens chimiques (irréversibles) mais aussi d’associations hydrophobes (réversibles). Une étude préliminaire de séquestration de colorants hydrophobes montre un potentiel intéressant
The aim of this work is the synthesis and the characterization of amphiphilic hydrogels based on carboxymethylpullulan and on a hydrophobic cross-linking agent : the dibromohexan. The kinetics of gelification is fast and every incorporated dibromohexan molecule gives a cross-link. These hydrogels possess two fractions : a gel fraction and a sol fraction whose proportions vary with the synthesis parameters. These systems present a metastable character and are very sensitive to time and temperature to give objects with a size from some nanometers to some micrometers. Their structure is complex and is constituted from chemical crosslinks (irreversible) and hydrophobic associations (reversible). The preliminary study of the entrapment of hydrophobic dyes shows an interesting potential

Au cours de ce travail, nous avons cherché à obtenir une librairie de copolymères à base d'ADN, en utilisant différentes stratégies de synthèse visant à coupler un oligonucléotise à des polymères (hydrophobes, diblocs). Différentes techniques d'analyse (DDL, MET, DNPA, Cryo-MET. . . ) ont permis d'étudier et de caractériser les structures auto-assemblées en solution aqueuse de ces biohybrides. Nous avons montré que les nano-objets formés à partir de polymères tribloc pouvaient encapsuler les molécules hydrophobes. Nous avons également montré qu'en utilisant les propriétés de reconnaissance de l'oligonucléotide, il était possible d'adsorber les nanoparticules de copolymères d'ADN sur une surface et de décorer celles-ci de nanoparticules d'or. Ces différents résultats ouvrent la voie à diverses applications des nanohybrides
In this workk, we built a library of copolymers based on DNA. For that purpose, we used various strategies of synthesis to link polymers (hydrophobic, diblocs) with oligonucleotides. Different techniques (DLS, TEM, SANS, Cryo-TEM. . . ) allowed us to study and characterize the self-assembled structures in aqueous solution of these biohybrids. We worked out the potential applications of these biohybrids. We have shown that tribloc nanoparticles can encapsulate hydrophobic molecules. Using oligonucleotide recognition, it was possible to adsorb DNA copolymers nanoparticles on a surface and decorate these of golden nanoparticles. These results pave the way to new applications of nanohybrids

The development of monoclonal anti-cytokine antibodies constituted a revolution in the management of chronic inflammatory diseases. Despite their commercial and medical success these therapies, said of passive anti-cytokine immuno-modulation, are associated with several problems. A developed by a few teams in the world is to use the active immunisation against immunogens derived from cytokines, allowing the patient to develop by himself the neutralising anti-cytokine antibodies. Several types of immunogens can be used. Our laboratory has based its project on peptides derived from cytokines, selected by bioinformatics, and coupled to a carrier protein. During my PhD, I have confirmed and extended the results previously obtained in the laboratory by showing that a peptide located in a specific loop of TNF can protect against two models of inflammatory diseases in mice. I also demonstrated for the first time that the active immunisation against the p19 subunit of IL-23 can provide protection in the collagen-induced arthritis model. Based on these results a patent has been deposited for the use of IL-23p19 peptides-based immunogens in the treatment of chronic inflammatory disorders and a manuscript describing these findings is currently in preparation. I also have developed peptides derived from other cytokines (VEGF, IFN), but at a less advanced stage than the two previous ones. These results show that the active anti-cytokine immune therapy, particularly when immunogens are based on peptides of cytokines, can constitute an efficient alternative to the passive immune therapy used in clinics today
Le développement des anticorps monoclonaux anti-cytokine a constitué une révolution dans le traitement des maladies inflammatoires chroniques. Malgré leur succès commercial et médical évident, ces thérapies dites d’immuno-modulation passive anti-cytokine posent quelques problèmes. Une idée originale développée par quelques équipes dans le monde, dont la nôtre, est d'utiliser l’immunisation active contre des immunogènes dérivés des cytokines, afin que les anticorps anti-cytokine soient produits par l'organisme du patient lui-même. Plusieurs types d’immunogènes peuvent être utilisés. Le projet développé dans notre équipe se base sur des peptides dérivés de cytokine, sélectionnés grâce à l’outil bioinformatique et couplés à une protéine porteuse. Durant ma thèse, j'ai confirmé et étendu les résultats obtenus précédemment par mon équipe en montrant qu’une boucle spécifique du TNFα ciblée par immunisation active pouvait conférer une protection clinique dans les modèles murins de maladies inflammatoires. J’ai également démontré pour la première fois que l’immunisation active avec un peptide dérivé de la sous-unité p19 de l’IL-23 est protectrice dans le modèle murin d’arthrite au collagène. Suite à ces résultats, un brevet a été déposé pour l’application de peptides de l’IL-23p19 dans les maladies inflammatoires chroniques et un article décrivant ces résultats innovants est en préparation. J'ai aussi développé des peptides d’autres cytokines (VEGF, l’IFN mais à un stade moins avancé que les deux précédents. Ces résultats montrent que la stratégie d'immunisation active anti-cytokine peut constituer une alternative efficace à l’immunisation passive en usage aujourd’hui

Les hydrogels injectables et auto-réparants suscitent un intérêt particulier dans les domaines de l'ingénierie tissulaire et de la médecine régénératrice. En raison de la nature dynamique de leurs réticulations, ces gels peuvent être pré-formés dans des seringues, extrudés sous cisaillement et s’auto-réparer spontanément après arrêt de la déformation mécanique. Au vu du potentiel que peuvent offrir les polymères fonctionnalisés par des acides boroniques pour la fabrication de gels covalents réversibles, nous avons développé des hydrogels injectables d’acide hyaluronique (HA) réticulés par des liaisons esters boronates pour des applications esthétiques et biomédicales. Pour élaborer de tels gels avec des propriétés optimisées, nous avons exploré l’effet de la nature du dérivé d’acide boronique ainsi que du motif saccharidique greffés sur le HA sur les propriétés rhéologiques dynamiques des gels. Parmi les différents dérivés d'acide boronique, le benzoboroxole (BOR) a été choisi en plus de l'acide phénylboronique (PBA) pour complexer différents motifs saccharidiques greffés sur le HA. Comparé au PBA, le dérivé BOR est, en effet, capable de se complexer de manière plus efficace à pH neutre et avec une plus grande variété de composés saccharidiques, en particulier les glycopyranosides. Cette étude a démontré que les propriétés rhéologiques dynamiques des assemblages de HA formés par complexation des unités de BOR ou PBA avec les différents sucres sont étroitement liées à la dynamique des échanges moléculaires et à la thermodynamique des pontages. En outre, nous avons également établi pour la première fois la possibilité d’obtenir des hydrogels de HA auto-réticulants à pH physiologique via des interactions multivalentes entre les unités de BOR greffées sur le HA et des groupements diols se répétant sur la chaîne polysaccharidique. Outre le BOR, la capacité de son homologue cyclique à six chaînons, la benzoxaborine, et d’un nouveau dérivé original similaire à ce composé a été explorée en tant que nouveaux sites de complexation de saccharides pour la formation de réseaux de HA réversibles. Compte-tenu des propriétés injectables, d'auto-réparation et de réponse à différents stimuli démontrées par ces nouveaux hydrogels de HA, ces biomatériaux apparaissent comme des candidats prometteurs pour de nombreuses applications innovantes dans le domaine biomédical, notamment pour l'ingénierie tissulaire et la thérapie cellulaire
Injectable and self-healing hydrogels have recently drawn great attention in the fields of tissue engineering and regenerative medicine. Such gels can be pre-formed into syringes, be extruded under shear stress and show rapid recovery when the applied stress is removed due to the dynamic nature of their crosslinks. Given the exciting potential benefit of using boronic acid-containing polymers to construct dynamic covalent hydrogels, we explored this attractive strategy to design injectable boronate-crosslinked hydrogels based on hyaluronic acid (HA) for aesthetic and other biomedical applications. To design hydrogels with optimized properties, we investigated the effect of the nature of the boronic acid moiety as well as the sugar molecule grafted onto the HA backbone on the gel properties. Among arylboronic acid derivatives, benzoboroxole (BOR) was selected in addition to phenylboronic acid (PBA) as the binding site for sugar moieties grafted on HA. This choice was based on the efficient binding capability of BOR at neutral pH compared to PBA, and on its ability to complex glycopyranosides. With this study, we demonstrated that the dynamic rheological properties of the HA networks based on BOR- or PBA-saccharide complexation are closely linked to the molecular exchange dynamics and thermodynamics of the small molecule crosslinkers. Besides, we also established for the first time the feasibility of self-crosslinking HA hydrogels with extremely slow dynamics at physiological pH through multivalent interactions between BOR derivatives grafted on HA and diols from the polysaccharide chains. Finally, in addition to BOR, we demonstrated the unprecedented capacity of its six-membered ring homologue, benzoxaborin, and a new original benzoxaborin-like derivative as new carbohydrate binding sites for the formation of reversible HA networks. Taking into account the injectable, self-healing and stimuli-responsive properties showed by these new HA hydrogels, these biomaterials appear as promising injectable scaffolds for many innovative applications in the biomedical field, including in tissue engineering and cell therapy

L'utilisation de peptides natifs en tant que medicaments se heurte a des inconvenients inherents a leur metabolisme et a leur manque de specificite. C'est dans le but de resoudre ces problemes que l'axe de recherche concernant les peptidomimetiques contraints a ete developpe. Nous avons synthetise des perhydrodiazepinones dont la structure s'apparente a celle des coudes presents dans certains peptides. Dans ce manuscrit, nous avons decrit differentes voies de synthese dont la principale implique une reaction de mitsunobu afin de realiser l'etape-clef de cyclisation. Cette strategie de synthese a ete adaptee sur supports (polyethylene glycol et resine de wang) dans le but d'obtenir un maximum d'outils utilisables en chimie combinatoire pour construire des librairies de ce type de molecules. Dans la derniere partie, nous avons augmente la diversite moleculaire de la structure en effectuant une synthese a partir d'un pool chiral permettant le controle de la chiralite de l'ensemble des carbones asymetriques.

Nous avons étudié en détail la photodynamique VUV et le PECD (un effet chiroptique intense) de l'acide aminé Proline (Pro) en phase gaz, seul acide aminé naturel contenant un cycle pyrrolidine. Plusieurs températures ont été utilisées pour faire varier la population de conformères de Pro native, afin d'effectuer une analyse complète des conformères à l'aide des calculs PECD CMS Xα, et ce faisant de raffiner le paysage conformationnel. Le signe des asymétries, similaire au cas de l’alanine, renforce le scenario astrophysique en lien avec l’homochiralité, sans contraintes de température. De plus, nous avons étudié, le PECD sur des acides aminés aromatiques (tryptophane & tyrosine), des chromophores importants des protéines. Nous avons également étendu la portée de nos études de PECD vers de grands édifices moléculaires tels que des dipeptides à base d’acides aminés (c-Pro-Pro, Gly-Pro et Pro-Gly), jusqu’à des systèmes beaucoup plus complexes comme des nanoparticules homochirales (Pro, Trp et Tyr), pour tester, phénoménologiquement, les limites de sensibilité du PECD par rapport à la complexité moléculaire. Enfin, nous présentons pour la première fois l'étude d'une famille de 3 molécules à chiralité axiale (dérivées de binaphtyles), dont nous avons notamment étudié l'influence de l'angle diédral sur le PECD
We studied in great details, the VUV photodynamics and PECD (an intense chiroptical effect) of the gas phase amino acid Proline (Pro), the only naturally occurring amino acid containing a pyrrolidine ring. Several temperatures were used to vary the conformer population of the nascent Pro in order to perform a comprehensive conformer analysis of the PECD with the help of CMS-Xα PECD calculations allowing to refine the conformational landscape. The sign of the chiral asymmetry, similar to the one of alanine, strengthen the astrophysical scenario in link to the origin of homochirality, without any temperature constraints. We studied also, the PECD of two aromatic amino-acids (tryptophan & tyrosine), which are important chromophores of proteins. We extended the scope of our PECD studies to larger amino-acids-based systems, such as dipeptides (c-Pro-Pro, Gly-Pro and Pro-Gly), up to much more complex systems like homochiral nanoparticles (Pro, Trp and Tyr), to test, phenomenologically, the limits of sensitivity of PECD with respect to molecular complexity. Finally, we present for the first time the study of a family of 3 molecules with axial chirality (binaphthyls derivatives), of which we studied in particular the influence of the dihedral angle on the PECD

L’association de la science des polymères et de la chimie supramoléculaire a conduit au développement de matériaux polymères supramoléculaires dotés de propriétés structurelles, mécaniques et fonctionnelles atypiques. Ces matériaux sont d’ores et déjà exploités dans divers domaines d’applications, tels que les matériaux auto réparants,l’ingénieur tissulaire ou encore la libération contrôlée de principes actifs. Ainsi, la chimie supramoléculaire s’est avérée être un outil puissant pour moduler les propriétés des matériaux en contrôlant le caractère dynamique des interactions supramoléculaires via l’application de stimuli adaptés. Les travaux réalisés dans le cadre de cette thèse s’inscrivent dans ce contexte et avaient pour principal objectif de développer de nouveaux assemblages (macro)moléculaires à base de complexes intra- et inter-moléculaires de CBPQT4+. Pour ce faire, un nouveau dérivé CBPQT4+-Fu intégrant une unité furane connectée de manière covalente à la partie hôte CBPQT4+ a été développé.Ce dérivé se présente en milieu aqueux sous une conformation auto-incluse dans laquelle l’unité furane au sein de la cavité témoigne d’une extrêmement faible réactivité(Diels-Alder) vis-à-vis de diènophiles. Néanmoins, celle-ci peut être libérée en ajoutant une molécule invitée (Naphtalène) présentant une forte affinité pour le macrocycle.Cette synergie, mise en évidence à l’échelle moléculaire, permettant de déclencher la réaction de Diels-Alder par la formation d’un complexe intramoléculaire a ensuite été exploitée pour concevoir divers hydrogels physiques ou réticulés physiquement et chimiquement
The combination of polymer science and supramolecular chemistry has led to thedevelopment of supramolecular polymer materials with unusual structural, mechanical,and functional properties. These materials have already been exploited in manyapplications, including self-repairing materials, tissue engineering, and the controlledrelease of active ingredients. Supramolecular chemistry has proved to be a powerful toolfor modulating the properties of materials by controlling the dynamic nature ofsupramolecular interactions using appropriate stimuli. The work carried out within theframework of this thesis falls within this context, and its main objective was to developnew (macro)molecular assemblies based on intra- and inter-molecular CBPQT4+complexes. To this end, a new CBPQT4+-Fu derivative was developed, integrating a furanunit covalently connected to the CBPQT4+ host moiety. This derivative presents itself inaqueous media a self-included conformation in which the furan unit within the cavityexhibits extremely low reactivity (Diels-Alder) towards dienophiles. However, this can bereleased by adding a guest molecule (naphthalene) with a strong affinity for themacrocycle. This synergy, demonstrated at the molecular scale, enabling the Diels-Alderreaction to be triggered by forming an intramolecular complex, was then exploited to design various physical and chemically cross-linked hydrogels

De nos jours, la moitié des infections nosocomiales sont liées à la pose de dispositifs médicaux. Dans ce contexte, nous avons développé deux types de revêtements antimicrobiens adaptés au domaine biomédical. Le premier s'appuie sur le greffage d’un peptide comprenant une séquence d’accroche, une séquence antimicrobienne et un site de clivage spécifique d'un pathogène. La séquence antimicrobienne sera alors libérée uniquement en présence du pathogène. Malgré la réussite de l’accroche du peptide, certains paramètres restent encore à optimiser afin d’obtenir un effet antimicrobien. Le deuxième revêtement s’appuie sur la conception d’un film antimicrobien « couche-par-couche » avec l’utilisation de poly(L-arginine) (PAR) et d’acide hyaluronique (HA). L’influence de la taille des chaînes de PAR a été étudiée et seul le film construit à partir de PAR de 30 résidus possède un effet antibactérien. Avec cette PAR, nous avons démontré que HA est le seul polyanion conduisant à des propriétés antibactériennes. Ces propriétés antimicrobiennes sont maintenues lorsque d’autres homopolypeptides cationiques sont associés à HA
Nowadays, about half of hospital-acquired infections are due to medical devices implantation. In this context, we have developed two types of antimicrobial coatings adapted to the biomedical field. The first one is based on peptide composed of an anchoring sequence, an antimicrobial sequence and a pathogen-specific cleavage site and grafted on the substrate. The antimicrobial site will be released only in the presence of the pathogen through the use of the cleavage site. Despite of the success of peptide grafting, some parameters must be optimized in order to obtain an antimicrobial effect. The second antimicrobial coating concept is based on the layer-by-layer technique by using poly(L-arginine) (PAR) and hyaluronic acid (HA). The effect of the size of PAR chains on the antimicrobial character of the coating was investigated and it is proven that only films composed with PAR of 30 residues present an antibacterial effect. Moreover HA is the only polyanion leading to such antimicrobial multilayer. It is also demonstrated that this antimicrobial properties is maintained when other cationic homopolypeptides are used in association with HA in layer-by-layer films

The ubiquitin-proteasome pathway represents an attractive target in the development of new drug therapies. In particular, the proteasome 26S, a multicatalytic threonine protease complex, is involved in intracellular ubiquitinated-protein degradation and many biological processes, such as cell cycle control and differentiation, apoptosis and generation of antigenic peptides presented by major histocompatibility complex class I (MHC I) molecules. The activity of 26S proteasome is located in a central 20S core, the proteoliytic chamber is composed of four stacked rings capped by two 19S regulatory complexes. Each ring is composed for seven b subunits with three different active sites: in particular, the b1 subunit contains a peptidyl-glutamyl peptide hydrolizing active site (PGPH), the b2 subunit expresses tryptic-like (T-L) activity, and b5 contains a chimotryptic-like (ChT-L) activity. Modulation of the proteasome activity by specific inhibitors may represent an useful tool for the treatment of tumors, metabolic and autoimmune disorders. The aim of this PhD work is the design, sythesis and evaluation of the biological activity of several classes peptide-based proteasome inhibitors, containing different pharmacophoric moieties at the C-terminal position as a potential substrate for Michael addiction by the catalytic threonine through a mechanism similar to that of the well-known inhibitors. Herein we reported studies of the molecules bearing as pharmacophoric Cterminal function: N-allyl vinil ester, a,b-unsaturated N-acylpyrrole, vinyl ketone, butadienyl vinyl ester, divinyl ketone and isoxazolin vinyl ester groups. In accordance with the results obtained in previous series, the pharmacophoric units are linked to oligopeptidic sequences functionalized at the N-terminal by appropriated groups. Biological evaluation of the all new compounds was carried out to assess their inhibition of the trypsin-like, chymotrypsin-like and post-acidic activities of proteasome using the isolated enzyme purified from lymphoblastoid cell lines. Some compounds as a,b-unsaturated N-acylpyrrole and vinyl ketone analogs showed selective inhibition of the proteasome subunits in a mM range, while other derivatives bearing different pharmacophoric units don’t provide a favorable biological response.

La reparation de defauts osseux par les techniques de l’ingenierie tissulaire osseuse (ITO) est consideree comme une alternative aux greffes conventionnelles. L’objectif de ce projet de these fut de developper des materiaux destines a servir de scaffolds pour le comblement et la regeneration osseuse, ces derniers etant sous la forme d’hydrogels injectables d’une part, et d’eponges, d’autre part. Ces deux types de materiaux ont ete obtenus par melange de chitosane (CHT, cationique), et de polymere de cyclodextrine reticule par l’acide citrique (PCD, anionique), interagissant via des liaisons ioniques et formant des complexes polyélectrolytes. La premiere partie de la these a ete consacree au developpement et caracterisation d’une eponge CHT/PCDs qui a ete chargee avec le facteur de croissance de l’endothelium vasculaire (VEFG) dans le but de favoriser sa vascularisation. Le second volet de la these a eu pour objectif d’optimiser la formulation d’un hydrogel injectable destine a la chirurgie mini-invasive, compose de CHT et de PCD sous sa forme soluble (PCDs) et insoluble (PCDi) [CHT/PCDi/PCDs]. L'etude a ete concentree sur l’optimisation et la caracterisation des proprietes rheologiques de l’hydrogel. Enfin, une etude prospective sur le developpement de l'hydrogel/eponge composite en ajoutant une phase minerale - l'hydroxyapatite (HAp) dans la formulation a ete realisee afin d'ameliorer les proprietes mecaniques et osteoconductrices.L’eponges CHT/PCDs a ratio 3 :3 a ete obtenue par lyophilisation des hydrogels et a subi un traitement thermique (TT) afin d’ameliorer leur stabilite par la formation des liaisons covalentes. L’eponge CHT/PCDs avec un TT a 160°C a montre des proprietes de gonflement eleve (~600%) et une biodegradation ralenti induite par le lysozyme (~12% perte masse dans un mois). Sa microstructure, ses proprietes mecaniques de compression et sa cytocompatibilite avec deux types de cellules (pre-osteoblastes (MC3T3-E1) et endotheliales primaires (HUVECs) ont ete etudiees. Une porosite elevee (~87%) avec des pores interconnectes a ete observee par microtomographie de rayons X, ainsi qu’une bonne adhesion et colonisation cellulaire au sein de l’eponge par microscopie electronique a balayage (MEB). Le VEGF a ete incorpore dans l’eponge, et son profil de liberation a ete suivi, ainsi que la bio-activite du VEGF libere. La liberation du VEGF a ete rapide pendant les trois premiers jours, puis ralenti jusqu'a devenir non-detectable par la methode ELISA jusqu’a 7 jours. Le VEGF libere pendant les deux premiers jours a montre un effet pro-proliferation et pro-migration significatif sur les HUVECs.Les hydrogels injectables de CHT/PCDi/PCDs a differents ratios ont ete optimises et caracterises en fonction de leurs proprietes rheologiques, leur injectabilite, et leur cytotoxicite. L’impact de l’ajoute du PCDi dans l’hydrogel a ete clairement observe par analyses rheologiques Ainsi, l'hydrogel CHT/PCD, compose a parts egales de PCDi et de PCDs, a demontre le meilleur compromis entre stabilite structurelle, proprietes rheofluidifiantes et autoreparantes, et injectabilite. En plus, l’hydrogel a montre une excellente cytocompatibilite vis-avis les cellules pre-osteoblastes MC3T3-E1.Bases sur la formulation optimisee, l’HAp a ete incorporee a differentes concentrations dans l’hydrogel. L’ajout de la phase minerale n’a pas perturbe la formation ni la stabilite structurelle des hydrogels, mais a ameliore les proprietes viscoelastiques. Les eponges composites, elaborees par lyophilisation de ces hydrogels, ont montre que les particules de HAp etaient dispersees de maniere homogene dans la structure macroporeuse de l'eponge. Ces resultats encourageants ont montre qu'il etait possible de fournir un hydrogel injectable ou une eponge composite comme scaffold pour l’ITO [...]
Repair of bone defects by bone tissue engineering (BTE) methods is considered as an alternative to conventional grafts. The aim of this PhD project was to develop two types of BTE scaffolds for bone regeneration: one is in the form of injectable hydrogel, and the other is in the form of sponge. Both scaffolds based on the formation of polyelectrolyte complexes by mixing chitosan (CHT, cationic) and polymer of cyclodextrin (PCD, anionic). Besides developing the sponge scaffold, the vascularization of 3D scaffold (a challenge of BTE) was specially investigated in the first part of the work, for which vascular endothelial growth factor (VEFG) was loaded on the CHT/PCDs sponge to promote the vascularization. The second part of the thesis was dedicated to the elaboration of an injectable CHT/PCD hydrogel, which was intended for minimally invasive surgery. The formulation optimization of hydrogel was performed by tuning the composition ratios of two PCD components: soluble-form PCD (PCDs) and insoluble-form PCD (PCDi), in order to better reach the specific requirement (e.g. rheological properties) of injectable hydrogel for regenerative medicine. Finally, a prospective study on developing the composite hydrogel/sponge by adding a mineral phase - hydroxyapatite (HAp) in the formulation was realized to improve the mechanical and osteoconductive properties.CHT/PCDs sponges were obtained by freeze-drying the hydrogels CHT/PCDs 3:3. The thermal treatment (TT) at different temperatures was further applied on the sponge to improve the mechanical stability. The CHT/PCDs sponge treated at 160°C was opted for further study thanks to high swelling capacity (~ 600%) and moderate lysozyme-induced biodegradation rate in vitro (~ 12% mass loss 21 days). This sponge of choice was further evaluated for the microstructure, the mechanical property (compressive strength) and the cytocompatibility with pre-osteoblasts (MC3T3-E1) and endothelial cells (HUVEC). Results of X-ray microtomography showed a high porosity (~87%) in the sponge with interconnected pores. Good cell adhesion and in-growth (colonization) in the sponge were observed by scanning electron microscopy (SEM). After loading VEGF on the sponge, the release profile of VEGF and the bioactivity of released VEGF were thoroughly studied. It showed that the release of VEGF was rapid (burst) during the first two days, then slowed down up to non-detectable by ELISA method after 7 days. The released VEGF during the first two days showed a significant pro-proliferation and pro-migration effect on HUVECs.For the injectable CHT/PCDi/PCDs hydrogels, optimization of composition ratio was based on evaluating their rheological properties, injectability, and cytotoxicity. The beneficial effect of combining both PCDi and PCDs in the formula of the hydrogel was clearly observed on the properties of hydrogel. Namely, the CHT/PCD hydrogel, composed of equal quantity of PCDi and PCDs, demonstrated the best compromise between structural stability, shearthinning and self-healing properties, and injectability. An excellent cytocompatibility with preosteoblast cells (MC3T3-E1) was also confirmed for the hydrogel with this composition.Based on the optimized formulation, HAp was incorporated at different concentrations, which didn’t disturb the formation or the structural stability of the hydrogels, but improved the viscoelastic properties. The composite sponges, elaborated by lyophilization of these hydrogels, showed that the HAp particles homogeneously dispersed within the macroporous structure of the sponge. These encouraging results showed the feasibility of providing an injectable hydrogel or a composite sponge for BTE scaffold [...]

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Cuidar de feridas é um processo dinâmico e complexo que requer atenção especial principalmente quando se refere a uma lesão crônica. A lesão por pressão (LPP) é uma ferida crônica localizada na pele ou no tecido subjacente, geralmente sobre uma proeminência óssea, resultante de pressão isolada ou pressão combinada com fricção ou cisalhamento. O objetivo foi avaliar a aplicabilidade das membranas de hidrogel com nanopartículas de prata no tratamento de lesões por pressão (LPPs) em usuários do SUS, por meio de protocolo clínico. O projeto da pesquisa foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da UFT/TO sob nº 161/2013, e foram seguidos todos os preceitos éticos conforme Resolução 466/12 do CNS do Ministério da Saúde. Trata-se de um estudo de intervenção terapêutica, do tipo ensaio clínico não controlado, sobre a avaliação do uso da membrana de hidrogel com nanopartículas de prata (NPAg) produzida pelo Instituto de Pesquisa em Energia Nuclear (IPEN). A população do estudo foi composta por 19 pacientes, que por critérios de inclusão e exclusão foi constituída por uma amostra de 6 (seis) pacientes de ambos os gêneros, internados no Hospital de Referência de Porto Nacional, no período de janeiro de 2014 a dezembro de 2015, acometidos por lesões por pressão categoria 3, 4 e não classificável. O estudo apresentou como limitações o restrito número de pacientes por amostra, por se tratar de pesquisa clínica experimental, com um grupo investigado altamente selecionado pelos critérios de exclusão e inclusão. Os hidogéis com NPAg, produzidos pelo IPEN, mostraram-se eficazes no tratamento das LPPs, pois proporcionaram a ferida condições para a epitelização. Houve diminuição do odor, dos tecidos desvitalizados e da dor, itens estes que quando presentes retardam a cicatrização. Porém são necessários novos estudos, envolvendo estes curativos com um número maior de pacientes.
Dissertação (Mestrado em Tecnologia Nuclear)
IPEN/D
Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP

DNA damage can cause genome instability, which may lead to human cancer. The most common form of DNA damage is DNA base damage, which is efficiently repaired by DNA base excision repair (BER). Thus BER is the major DNA repair pathway that maintains the stability of the genome. On the other hand, BER mediates DNA demethylation that can occur on the promoter region of important tumor suppressor genes such as Breast Cancer 1 (BRCA1) gene that is also involved in prevention and development of cancer. In this study, employing cell-based and in vitro biochemical approaches along with bisulfite DNA sequencing, we initially discovered that an oxidized nucleotide, 5’,2-cyclo-2-deoxyadenosine in DNA duplex can either cause misinsertion by DNA polymerase β (pol β) during pol β-mediated BER or inhibit lesion bypass of pol β resulting in DNA strand breaks. We then explored how a T/G mismatch resulting from active DNA demethylation can affect genome integrity during BER and found that pol β can extend the mismatched T to cause mutation. We found that AP endonuclease 1 (APE1) can use its 3'-5' exonuclease to remove the mismatched T before pol β can extend the nucleotide preventing a C to T mutation. The results demonstrate that the 3'-5' exonuclease activity of APE1 can serve as a proofreader for pol β to prevent mutation. We further explored the effects of exposure of environmental toxicants, bromate and chromate on the DNA methylation pattern on the promoter region of BRCA1 gene with bisulfite DNA sequencing. We found that bromate and chromate induced demethylation of 5-methylcytosines (5mC) at the CpG sites as well as created additional methylation at several unmethylated CpG sites at BRCA1 gene in human embryonic kidney (HEK) 293 cells. We further demonstrated that the demethylation was mediated by pol β nucleotide misinsertion and an interaction between pol β and DNA methyltransferase 1 (DNMT1) suggesting a cross-talk between BER and DNA methyltransferases. We suggest that DNA base damage and BER govern the interactions among the environment, the genome and epigenome, modulating the stability of the genome and epigenome and disease development.

Les complexes polyazaaromatiques de RuII sont conçus et étudiés pour être exploités dans

de nombreux domaines. Dans, le présent travail, nous avons combiné l’utilisation conjointe de ces

complexes et de biomolécules en vue de leur utilisation dans différents domaines liés à la biologie.

Les trois premiers chapitres sont consacrés à l’étude de la photoréaction entre les complexes

[Ru(TAP)3]2+ et [Ru(TAP)2(phen)]2+ en présence des acides aminés tryptophane et tyrosine. Ces

études ont permis d’améliorer la compréhension des processus photo-induits entre le complexe

de RuII et le tryptophane, menant notamment à la mise en évidence d’une réaction de fuite au

transfert d’électron en retour entre les deux espèce radicalaires photo-produites. Cette réaction a

pu être identifiée comme étant le processus de dimérisation de deux unités tryptophanes. Cette

dimérisation ainsi que la formation de double photo-adduit impliquant deux tryptophanes et un

complexe de RuII ont été mises en évidence et étudiées en utilisant un support oligonucléotidique

double brin sur lequel sont attachées les espèces réactives.

Le quatrième chapitre concerne l’étude d’un conjugué formé entre le complexe de RuII ,

[Ru(TAP)2(phen)]2+, et le peptide de transfection TAT. La photoréactivité de cette entité a

été examinée et confirmée en présence de l’acide aminé tryptophane et de la base guanine. Pour

cette dernière, une étude plus poussée a été réalisée afin de caratériser au mieux l’interaction

existant entre le conjugué Ru-TAT et un oligonucléotide comportant une guanine. Cette étude

rassemble des observations expérimentales et une approche théorique par modélisation moléculaire.

Le cinquième chapitre consiste en l’étude du comportement photophysique du complexe

[Ru(TAP)2(pytz)]2+ sous illumination en présence de la base guanine. Cette étude vise à déterminer

si ce complexe possède les qualités d’agent photo-oxydant satisfaisantes pour envisager

son ancrage sur diverses biomolécules. L’étude a permis de montrer que l’utilisation du ligand pytz

comme point d’ancrage du complexe de RuII est partiellement compromise à cause de l’instabilité

du complexe sous illumination.

Le sixième et dernier chapitre résume les efforts effectués dans le cadre de la synthèse d’un

complexe de RuII ,le [RuII(phen”-ODN)3] devant mener à la formation de réseaux tridimensionnels

mixtes ADN-complexes. Bien qu’une caractérisation complète de ce produit n’ait pu être réalisée,

certaines mesures indiquent que ce complexe pourrait avoir été obtenu.
Doctorat en Sciences
info:eu-repo/semantics/nonPublished

RésuméLes lésions du cerveau sont un problème médical majeur, celui-ci possédant des ressources limitées pour la guérison. Les patients souffrent souvent des déficiences graves et durables, dégradant leur qualité de vie et imposant des couts importants. Des thérapies qui visent l'implantation des cellules souches neurales supportées par un biomatériau qui imite la matrice extracellulaire du cerveau sont en développement. L’ECM du cerveau a une teneur élevée en acide hyaluronique (HA). Ce glycosaminoglycane possède la biocompatibilité et l'activité biologique requises par les applications avec des cellules souches neurales.Nous avons développé des hydrogels à base de HA, possédant des propriétés mécaniques et des densités en peptide d’adhésion cellulaire (GRGDS) contrôlées, pour l'étude in vitro de la différenciation de cellules souches neurales en neurones. L'analyse de neurites en 3-D par microscopie biphotonique a montré une excroissance accrue et une densité élevée des neurites dans les hydrogels les plus élastiques (G '= 400 Pa), combinées avec l'existence d'un optimum dans l'extension des neurites en fonction de la densité des ligands dans le cas des hydrogels contenant des GRGDS. La croissance des neurites relève vraisemblablement d’une combinaison d’interactions adhésives cellule-HA, cellule-GRGDS, et cellule-molécules extracellulaires secrétées.Par la suite la dégradabilité enzymatique des hydrogels de HA a été étudiée. Les hydrogels de HA se dégradent sous l'effet de l'enzyme hyaluronidase suivant un modèle mono-exponentiel, ce qui correspond à une population homogène de chaînes de HA clivables. Les hydrogels avec des modules d'élasticité plus élevés, montrent des vitesses de dégradation enzymatique plus faibles. Le remplacement de l'agent de réticulation PEG-bis(thiol) pour un polymère HA-(SH)3 clivable par voie enzymatique conduit à une réduction du temps nécessaire à la dégradation complète des hydrogels.Dans un troisième temps, nous avons développé des gels de héparosane sans activité biologique qui pourraient révéler une meilleure compréhension du rôle joué par le HA dans la différentiation des NSCs et dans l’extension des neurites. Nous avons montré que le CD44 joue un rôle mesurable dans le processus d'adhésion des cellules MEF. Il existe d'autres procédés par lesquels ces cellules peuvent adhérer sur les hydrogels d’héparosane, cependant la force de ces interactions est plus faible
AbstractDamage caused to the central nervous system (CNS) is a major medical concern. As the CNS has limited ability to regenerate its damaged cells, patients can suffer from serious and long-term disabilities and impairments, which put strains on public healthcare systems. Therapies that aim to implant neural stem cells together scaffolds that mimic the extracellular matrix of the brain are being developed. Hyaluronic acid is an important component of the brain ECM. This glycosaminoglycan possesses the required biocompatibility and bioactivity for use in neural stem cells applications.We have developed HA-based hydrogels with controlled mechanical properties and cell adhesion peptide (GRGDS) densities for the in vitro study of neural precursor cells’ differentiation into neurons. The analysis of neurite outgrowth in 3-D by two-photon microscopy showed an increased outgrowth and density of neurites in the softest hydrogels (G’ = 400 Pa), combined with the existence of an optimum in neurite outgrowth as a function of ligand density in the case of hydrogels containing GRGDS. Neurite outgrowth in these hydrogels most likely involves a combination of adhesive interactions between cell-HA, cell-GRGDS moieties, and cell-secreted extracellular molecules.The enzymatic degradability of HA hydrogels was then investigated. The HA hydrogels degrade under the effect of the Hyaluronidase enzyme following a mono-exponential model, corresponding to a homogenous population of cleavable HA polymer chains. Hydrogels with higher elastic moduli have progressively lower enzymatic degradation rates. The substitution of the PEG-bis(thiol) crosslinker by an enzymatically cleavable HA-(SH)3 polymer led to a reduction in the time required for the complete degradation of the hydrogels.Finally we developed heparosan hydrogels that are devoid of biological functions and thus provide better insight into the role of HA in NSCs differentiation and neurite outgrowth. We showed that CD44 plays a measurable role in the adhesion process of MEF cells. There are alternative processes through which cells can attach to the heparosan hydrogels however the strength of these adhesions is weaker. Heparosan is a viable biomaterial for hydrogel synthesis that does not interact with the CD44 receptor, resulting in lower cellular adhesions

Les poly(thio-1-(n,n-diethylaminomethyl)ethylene) partiellement quaternises ou q-p(tdae),x sont des polybases qui peuvent etre utilisees comme microreacteurs macromoleculaires en milieu aqueux a ph neutre. Apres une etude bibliographique des principaux polymeres possedant une activite catalytique, celle des polybases a ete testee et etendue a une plus grande famille de produits. L'activite catalytique des q-p(tdae),x a d'abord ete verifiee sur l'hydrolyse d'esters para nitrophenyle afin de mesurer la constante de vitesse de la reaction obtenue qui se place parmi les plus elevees decrites dans la litterature. La stereospecificite de la reaction d'hydrolyse d'esters a ete evaluee en etudiant la deracemisation d'un melange racemique de composes tels que l'acetate d'alpha methyl-benzyle, a l'aide de l'insertion d'un mobilier chiral (la cinchonidine) a l'interieur des globules de q-p(tdae),x. La deracemisation n'ayant pu etre demontree sur les esters, le systeme a ete applique a la deprotection de peptides racemiques. La deprotection des principaux groupes protecteurs utilises en chimie des peptides se fait rapidement dans des conditions douces (ph 7,4 dans l'eau) mais aucun exces enantiomerique n'a pu etre mis en evidence. Enfin, la deprotection de peptides supportes sur differents types de resines a ete realisee. Les resultats obtenus avec la resine de merrifield classique ont ete negatifs mais les deprotections de peptides supportes sur des resines possedant un bras espaceur de type peg et proteges par des fmoc ou des z se font tres rapidement. Enfin, selon que le peptide est lie a la resine par une liaison ester ou amide, la deprotection s'accompagne ou non de la liberation du peptide. Les divers parametres experimentaux de ces reactions sont discutes.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
Dithranol is very effective drug for the topical treatment of psoriasis. However, it has some adverse effects, such as irritation and stain in the skin that difficult its application and patient adherence to treatment. Its instability to light, high pH values, metals and the presence of oxygen, configure as a limiting step for use. So, the inclusion of drug in nanocarriers was the main objective of this work. Lipid core nanocapsules and nanoemulsions containing 0.5 mg/mL of dithranol and 0.05% of EDTA or 0.02% of ascorbic acid were prepared by interfacial deposition of preformed polymer and spontaneous emulsification methods, respectively, and evaluated in relation to its physicochemical characteristics (drug content, encapsulation efficiency, pH, mean size, polydispersity index and zeta potential). The nanocapsules, after preparation, showed satisfactory characteristics: drug content near to the theoretical concentration, encapsulation efficiency about 100%, nanometric mean size (220- 250 nm), polydispersity index below 0.25, negative zeta potential, and pH values from 5.6 to 4.4. Instead, low drug content was verified for the nanoemulsions (approximately 80%) after preparation. In photodegradation study against UVA light it was observed a higher stability of the dithranol-loaded nanocapsules comparing to solution containing the free drug (t1/2 = 4 and 1 h for nanocapsule and free drug solution containing EDTA, respectively; t1/2 = 17 and 7,5 h for nanocapsule and free drug solution containing ascorbic acid, respectively). Irritation test by HET-CAM method was conducted to evaluate the safety of the formulations. From the results it was found that nanoencapsulation of the drug decreased its toxicity compared to the effects observed for free drug. Subsequently, hydrogels containing nanocapsules were prepared employing Carbopol® 940 and Aristoflex® AVC as gel-forming polymers. The semisolid formulations showed suitable properties for topical application and higher stability when compared to nanocapsules suspensions and the hydrogel containing the free drug. Furthermore, a higher stability of dithranol was verified for hydrogels prepared with Aristoflex® AVC.
O ditranol é um fármaco muito eficaz no tratamento tópico da psoríase. Entretanto, apresenta alguns efeitos adversos, como irritação e manchas na pele que dificultam sua utilização e adesão dos pacientes ao tratamento. Sua instabilidade frente à luz, altos valores de pH, metais e a presença de oxigênio, configuram, também, um passo limitante para o seu uso. Desta forma, a inclusão do fármaco em nanocarreadores constituiu o principal objetivo deste trabalho. Nanocápsulas de núcleo lipídico e nanoemulsões contendo 0,5 mg/mL de ditranol e 0,05% de EDTA ou 0,02% de ácido ascórbico foram preparadas pelos métodos de deposição interfacial do polímero pré-formado e emulsificação espontânea, respectivamente, e avaliadas em relação as suas características físico-químicas (teor de fármaco, eficiência de encapsulamento, pH, diâmetro médio de partícula, polidispersão e potencial zeta). As nanocápsulas, após preparação, apresentaram características satisfatórias: teor de fármaco próximo ao teórico, eficiência de encapsulamento de, aproximadamente, 100%, diâmetro de partícula na faixa nanométrica (220-250 nm), índice de polidispersão abaixo de 0,25, potencial zeta negativo e valores de pH de 5,6 a 4,4. Ao contrário, um baixo teor de fármaco foi verificado para as nanoemulsões (aproximadamente, 80%) após preparação. No estudo de fotodegradação frente à luz UVA se observou uma maior estabilidade do fármaco nas nanocápsulas em comparação à solução do fármaco livre (t1/2 = 4 e 1 hora para a nanocápsula e solução do fármaco livre contendo EDTA, respectivamente; t1/2 = 17 e 7,5 horas para a nanocápsula e solução do fármaco livre contendo ácido ascórbico, respectivamente). O ensaio de irritação pelo método de HET-CAM foi realizado para a avaliação da segurança das formulações. A partir dos resultados verificou-se que a encapsulação do fármaco diminuiu sua toxicidade em relação aos efeitos observados para o fármaco livre. Posteriormente, hidrogéis contendo as nanocápsulas foram preparados empregando-se Carbopol® 940 e Aristoflex® AVC como polímeros formadores de gel. As formulações semissólidas desenvolvidas apresentaram propriedades adequadas para a aplicação tópica e maior estabilidade quando comparadas às suspensões de nanocápsulas e ao hidrogel contendo o fármaco livre. Além disso, uma maior estabilidade do ditranol foi verificada para os hidrogéis preparados com Aristoflex® AVC.

Hidrogéis são membranas formadas pela reticulação de cadeias poliméricas, empregados na área farmacêutica como produtos biomédicos. Dentre os principais polímeros selecionados para a síntese de hidrogéis, destaca-se a poliacrilamida (PAAM) devido às suas propriedades como hidrofilicidade e alto grau de intumescimento. Proteínas terapêuticas e enzimas são veiculadas em hidrogéis como carreadores de fármaco ou como dispositivos para tratamento de feridas e escaras na pele. Este trabalho teve como objetivo a síntese de uma membrana à base de PAAM favorável para veiculação de proteínas. As proteínas empregadas foram papaína e albumina de soro bovino (BSA) e as etapas do processo englobaram síntese da membrana, adição das proteínas no sistema, irradiação em condições específicas e caracterização da membrana. Ao utilizar temperaturas criogênicas na síntese e na irradiação das amostras, houve predomínio de reticulação da cadeia polimérica, fato que não ocorria em temperatura ambiente. As membranas foram obtidas com incorporação dos ativos na concentração de 0,2 a 1% (p/p), obtendo-se concentração de PAAM entre 4% a 10% (p/p), as quais receberam irradiação com raios gama provenientes de uma fonte 60Co, na dose de 25 kGy. Nas condições realizadas, as membranas não apresentaram citotoxicidade nem adesão celular, o perfil de liberação das proteínas foi adequado, a papaína manteve sua bioatividade preservada apesar do decaimento biológico e, segundo estudos de carga das moléculas, a membrana possui maior afinidade com a papaína, liberando-a mais lentamente. Desta forma, o método proposto e as membranas obtidas foram apropriados para a obtenção de um biomaterial.
The use of hydrogels for biomedical purposes has been extensively investigated. Polyacrylamide (PAAM) is widely used due to properties such as hydrophilicity and swelling degree. Pharmaceutical proteins correspond to highly active substances which may be applied for distinct purposes. This work concerns the development of radio-synthesized hydrogel for protein release using papain and bovine serum albumin (BSA) as model proteins. The polymer was solubilized (1% w/v) in water and lyophilized. The proteins were incorporated into the lyophilized polymer and the hydrogels were produced by simultaneous crosslinking and sterilization using gamma radiation at 25 kGy under frozen conditions. The produced systems were characterized in terms of swelling degree, gel fraction, crosslinking density, fluid handling capacity, determination pH at point of polymer zero charge and evaluated according to protein release, bioactivity, cytotoxicity and cell adhesion. The hydrogels developed presented different properties as a function of polymer concentration and the optimized results were found for the samples containing 4-10% polyacrylamide. Protein release was controlled by the electrostatic affinity of acrylic moieties of polymer and proteins. This selection was based on the release of the proteins during the experiment period (up to 50 hours), maintenance of enzyme activity and the nanostructure developed. The system was suitable for protein loading and release and according to the cytotoxic assay and cell adhesion it was also adequate for biomedical purposes and this method was able to generate a matrix to protein release.

Les travaux décrits dans ce mémoire sont consacrés au développement de nouveaux dérivés amphiphiles de l'acide hyaluronique (HA) obtenus par greffage de chaînes alkyle hydrophobes le long de la chaîne macromoléculaire hydrophile. La stratégie de greffage présentée a été optimisée afin de pouvoir transposer la synthèse à l'échelle industrielle. Le comportement en milieu aqueux des polymères natifs et les propriétés viscoélastiques des systèmes associatifs ont été étudiés par des mesures rhéologiques en écoulement et en régime dynamique. Une modulation des propriétés physico-chimiques est obtenue par la variation de la longueur de la chaîne du HA, de l'hydrophobicité des greffons et/ou de l'introduction dans le système associatif des molécules hôtes (alpha et beta cyclodextrines) ou des tensioactifs. Des expériences de titration calorimétrique couplées à de la RMN bidimensionnelle (ROESY), à des mesures de viscosités et à la modélisation moléculaire ont permis, suite à une analyse détaillée, d'élucider les interactions entre des HA alkylés et des cyclodextrines. Au cours de ce travail, nous avons présenté différents types de produits industriels développés par des sociétés européennes et américaines en tant que viscosupplément, la viscosupplémentation étant l'application visée pour nos dérivés développés dans le cadre de cette thèse.

The growing incidences of coronary artery bypass graft surgeries have triggered a need to engineer a viable small diameter blood vessel substitute. An ideal tissue engineered vascular graft should mimic the microenvironment of a native blood vessel, while providing the adequate compliance post-implantation. Current vascular graft technologies lack the ability to promote vascular ECM deposition, leading to a compliance mismatch and ultimately, graft failure. Hence, in order to engineer suitable vascular grafts, this thesis describes the synthesis and characterization of novel elastin mimetic peptides, EM-19 and EM-23, capable of promoting vascular ECM deposition within a poly(ethylene glycol) diacrylate (PEG-DA) hydrogel. By combining the material properties of a synthetic and bio-inspired polymer, a suitable microenvironment for cell growth and ECM deposition can be engineered, leading to improved compliance. As such, characterization of EM-19 and EM-23 was conducted in human vascular smooth muscle cell (SMC) cultures, and the peptides self-assembled with a growing elastic matrix. After grafting the peptides onto the surface of PEG-DA hydrogels, EM-23 increased SMC adhesion by 6000% over PEG-RGDS hydrogels, which have been the gold standard of cell adhesive PEG scaffolds. Moreover, EM-23 grafted surfaces were able to promote elastin deposition that was comparable to tissue cultured polystyrene (TCPS) surface even though TCPS had roughly 4.5 times more SMCs adhered. Once translated to a 3D model, EM-23 also stimulated increased elastin deposition and improved the mechanical strength of the scaffold over time. Moreover, degradation studies suggested that EM-23 may serve as a template that not only promotes ECM deposition, but also allows ECM remodeling over time. The characterization studies in this thesis suggest that this peptide is an extremely promising candidate for improving vascular ECM deposition within a synthetic substrate, and that it may be beneficial to incorporate EM-23 within polymeric scaffolds to engineer compliant vascular grafts.

Les insuffisances des traitements actuels des infections à Virus de l’Hépatite B (VHB), orientent la recherche vers le développement de nouvelles stratégies antivirales. Ainsi, nous avons étudié à l’aide du modèle du VHB du canard, la capacité des PNAs (Peptide Nucleic Acids), une nouvelle classe de molécules antisens, à inhiber la réplication virale. Nous avons amélioré la pénétration intracellulaire des PNAs par leur couplage à des peptides perméabilisants (CPPs) et optimisé leur voie d’administration. Nous montrons que la voie intraveineuse est plus efficace que la voie intrapéritonéale. Aussi, nous démontrons pour la première fois que le PNA anti-epsilon couplé aux CPPs est capable d’inhiber la réplication virale in vitro et in vivo. Cependant, la spécificité de cette inhibition peut être affectée par l’activité antivirale de certains CPPs. Ces molécules pourraient représenter ainsi de nouveaux agents potentiellement intéressants pour les traitements des hépatites B chroniques
Giving the partial efficacy of nucleoside analogues, novel approaches against chronic hepatitis B virus (HBV) infection need to be developed. Thus, Peptide Nucleic Acid (PNAs), a novel generation of antisense agents, appears of particular value for HBV therapy. We have evaluated the capacity of the PNA to inhibit viral replication in vitro and in vivo in DHBV-infected duck model. Because the major problem of their therapeutic application is their poor intracellular penetration, we have used the PNA coupled to cell penetrating peptide (CPP). First, we have optimized the administration route and show that intravenous route led to a better liver delivery of PNA that intraperitoneal route. We provided here the first evidence that CPP-PNA conjugate and CPPs themselves inhibit viral replication suggesting their usefulness for HBV therapy. Our results also demonstrate that the choice of CPPs used as a vehicle for delivery plays an important role in the specificity and inhibition of viral replication

L’utilisation de peptides pour des applications biomédicales reste limitée, en raison de leur courte demi-vie biologique. Le greffage de polymères aux peptides a conduit à l’amélioration des propriétés du peptide. Les conjugués peptide-polymère peuvent être synthétisés par méthode convergente ou divergente. Alors que la première approche conduit à de faibles rendements, la deuxième est limitée à la polymérisation de monomères vinyliques. Nous proposons une méthode de synthèse divergente des conjugués, basée sur la fonctionnalisation des liaisons peptidiques, via le greffage de polyéthers. En effet, la polymérisation anionique par ouverture de cycle (AROP) des epoxides, à partir d’amorceurs amide, à été démontrée. Cette méthode polyvalente donne accès à des chaines de type PEG sans activation préalable. Les fonctions NH des amides de peptides ont été déprotonnées par une base phosphazène pour générer un amorceur de l’AROP. Des dipeptides cycliques (DKP) ont d’abord été utilisés pour démontrer la fonctionnalisation des fonctions NH. Des conditions de polymérisation ont été identifiées pour synthétiser de manière contrôlée des chaînes de polymères fonctionnalisées par une DKP. Le même système d’amorçage a été appliqué à un dipeptide, et des conjugués ont pu être synthétisés. Des essais ont été menés sur un tripeptide protégé et non protégé, mais se sont révélés peu concluants
Peptides as drugs are facing drawbacks such as short in-vivo half life and low resistance to enzymes, which limits a larger scale use. To overcome these shortcomings, conjugation of polymers to peptides leads to improvements of pharmacokinetic properties of the peptide. Peptide-polymers conjugates are synthesized either by convergent or divergent synthesis. While the first strategy faces low yields, the second one is limited to vinyl-based polymers. We aim to functionalize peptides on amide bonds by divergent synthesis of polyether from the peptide. Anionic Ring-Opening Polymerization (AROP) of epoxides has already proven to be feasible, from amide-based initiators. The approach is polyvalent and gives access to PEG-like polymers without activation of peptides prior synthesis. In this project, NH amide functions from small peptides were deprotonated by phosphazene base to generate an AROP initiator. First, cyclic dipeptides, were used to demonstrate the possible functionalization on NH functions. Polymerization conditions were identified for a controlled AROP, to afford polymers end-capped by a DKP. Initiator’s complexity was increased to protected linear dipeptide. Similar initiating system was used as previously, and conjugates could actually be synthesized. Initiating capacities of tri-peptides and protected tri-peptides were also investigated but were found to be inefficient

Les anticorps monoclonaux anti-cytokine ont constitué une révolution dans le traitement des maladies inflammatoires chroniques, mais leur utilisation présente des inconvénients (non réponse, résistance, effets secondaires, coûts élevés).Notre équipe développe une stratégie alternative originale, l’immunisation active à base de peptides de cytokines. Elle a pour but de faire synthétiser, par l’organisme même du patient, des anticorps neutralisant les effets pathogènes dus à l’excès de cytokines.Durant ma thèse, j’ai montré que l’immunisation active contre un peptide dérivé de l’IL-6 murine est protectrice dans un modèle murin de sclérodermie systémique. L’immunisation de singes avec l’équivalent humain entraîne une réduction significative des réactions inflammatoires locales suite à l’induction d’une réaction d’HSR. De plus, l’immunisation active contre deux peptides dérivés de l’IL-1β et de l’IL-23 conduit à la réduction de la sévérité de l’EAE.Ces résultats confortent l’intérêt de cibler les cytokines par l’approche d’immunisation active à base de peptides, qui pourra permettre de diversifier l’offre thérapeutique actuellement disponible
Monoclonal antibodies have been a revolution for the treatment of chronic inflammatory diseases, but their use shows major drawbacks (non-response, resistance, side effects and prohibitive costs).Our team develops an original alternative strategy: anti-cytokine peptide-based active immunization.The aim of the approach is to make the patient’s own organism produce antibodies capable of neutralizing the pathogenic effects of cytokine overproduction.During my PhD, I have demonstrated that active immunization against an IL-6 murine peptide confers clinical protection in a murine model of systemic sclerosis. Monkeys immunized against the human peptide also showed a significant decrease of local inflammatory reactions following a delayed-type hypersensitivity reaction. Moreover, active immunization against an IL-1β and an IL-23 murinepeptide led to a reduction of the severity of the EAE in mice.These results comfort the interest of anti-cytokine peptide-based active immunization, which should eventually widen the choice of therapeutics available for the patients