Dissertations / Theses on the topic 'Hybridation de l'ADN'

L'assemblage d'objets microscopiques est actuellement un verrou majeur au c÷ur de domaines aussi importants et variés que les nanosciences, les MEMs ou la médecine. Le projet européen GOLEM s'inscrit dans une démarche novatrice pour résoudre cette problématique et propose d'utiliser des processus biologiques pour assembler des micro-objets de façon parallèle. Dans le cadre de ce projet, cette thèse aborde l'étude et l'analyse des méthodes d'assemblage bioinspirées pour assembler de façon réversible et contrôlée ces objets. L'approche proposée est multidisciplinaire, puisqu'il s'agit d'exploiter des connaissances issues de la biologie dans un contexte microrobotique. Le rapprochement entre ces deux domaines est une étape importante pour les développements futurs en micro et nanotechnologies et ouvre des perspectives intéressantes. Le choix de processus biologiques pour assurer l'assemblage de façon sélective et contrôlable entre les objets est crucial dans ce travail, et dépendent de deux propriétés fondamentales identitées : la stabilité et la spéci cité de l'interaction biologique. La stabilité concerne la capacité des composants à garder un état assemblé, sur une période de temps donnée et dans un environnement déstructuré. La spécificité concerne la reconnaissance mutuelle entre les composants à assembler. L'intégration de ces propriétés dans un processus d'assemblage rend envisageable la conception d'une méthode d'auto-assemblage, massive et parallèle, où les diférents composants, formant un système complexe, se positionnent et s'assemblent dans un processus stochastique sans intervention individuelle. L'intégration des ces propriétés biologiques sur la matière inorganique est abordée en plusieurs étapes : le choix d'un processus biologique, dont la stabilité et la spéci cité sont intrinsèques et contrôlables, l'étude théorique et expérimentale de la stabilité et la spéci cité de cette adhésion biologique sur des composants fonctionalisés, et la détermination des paramètres des contrôle de l'assemblage et leur optimisation. Ainsi, cette thèse cherche dans un premier temps à analyser les di érents travaux dans le domaine et principalement l'auto-assemblage aux échelles micro et nanoscopiques. Cet état de l'art multidisciplinaire ouvre sur le choix de l'ADN avec ses propriétés particulières, capables de répondre aux besoins de l'auto-assemblage. Les propriétés de stabilité et de spécificité du processus d'hybridation d'ADN sont ensuite étudiées. La stabilité est abordée selon deux angles, l'échelle individuelle et l'échelle populationnelle. L'échelle individuelle s'intéresse à l'interaction entre deux brins d'ADN simple avec une approche empruntée aux travaux en modélisation moléculaire. L'échelle d'étude est ensuite élargie à deux populations de brins complémentaires, fixées sur des surfaces à assembler. Cette configuration géométriquement contrainte est étudiée avec une approche thermodynamique au regard des différents paramètres extrinsèques comme la température et la concentration saline du milieu. Cette thèse aborde aussi la validation expérimentale des modèles développés. Dans un premier temps, un modèle est proposé pour coupler les résultats exprimés en termes d'énergie et les mesures expérimentales en termes de force. La première campagne expérimentale effectuée à Londres au NPL cherche à déterminer la stabilité de l'hybridation. Des outils méthodologiques d'analyse statique et énergétique sont mis en place pour l'appréhender et la quantiffier. La méthode énergétique est originale et couple des outils de simulation, de prédiction et d'analyse. Elle montre ainsi que la stabilité et la spécifficité sont intrinsèquement liées par la composition de la séquence en bases azotées des brins d'ADN. Il apparaît donc que celle-ci peut être optimisée pour produire des configurations plus favorables statistiquement. Un algorithme original de génération de séquences, basé sur le caractère programmable de l'ADN, est alors proposé pour disposer de couples de brin d'ADN dont les propriétés de stabilités et de spécifficités sont optimisées. Une validation expérimentale est ensuite entreprise en collaboration avec le laboratoire AMIR à Oldenburg en Allemagne. Ces expériences valident l'approche de conception de séquences et met en évidence l'inffluence de paramètres clefs comme la vitesse d'approche et le temps d'attente sur l'assemblage. Le premier chapitre est ainsi dédié à un état de l'art en auto-assemblage et couvre plusieurs domaines. Il vise à proposer une approche synthétique des différents thèmes de recherche abordés dans ce travail. Le deuxième chapitre aborde l'étude des propriétés de stabilité et de spécifficité à travers une modélisation multi-échelle et les paramètres de contrôle et environnementaux. Le troisième chapitre s'intéresse à la validation expérimentale et propose des méthodes d'analyse statistique et énergétique originales pour comprendre et classifier les interactions en termes de stabilité et de spécifficité. Le dernier chapitre s'attache à définir l'outil logiciel développé pour concevoir des séquences spéci ques optimisées du point de vue de l'auto-assemblage. Une seconde validation expérimentale est entreprise et montre l'intérêt de cette approche, l'optimisation des propriétés fondamentales de stabilité et de spécifficité pour résoudre le problème de l'auto-assemblage d'objets microscopiques à partir de l'ADN.

Ce travail porte sur la réalisation et l’optimisation de transistors à grille suspendue (SGFET : Suspended Gate Field Effect Transistor) en vue d’applications dans le domaine du diagnostic clinique. Ce projet pluridisciplinaire regroupe des domaines de compétences variés tels que : l’électronique, la biologie et la chimie. Le transistor à grille suspendue est basé sur la structure d’un MOSFET. La principale différence réside dans la configuration de la grille : celle-ci est suspendue. Afin de permettre l’utilisation électrique du SGFET en milieu aqueux, une couche de nitrure de silicium recouvre les surfaces supérieure et inférieure de la grille de polysilicium dopé. Grâce à un procédé chimique de fonctionnalisation de surface, les molécules d’ADN à détecter sont fixées sur le nitrure de silicium entre la grille suspendue et le canal du transistor. Ainsi, l’apport de charges négatives dues à l’ADN à proximité du canal du SGFET, influe sur sa caractéristique de transfert. Par conséquent, la détection de l’ADN s’effectue par mesure du décalage entre les caractéristiques de transfert avant et après ajout du matériel génétique. Grâce au matériel biologique fourni par les généticiens du CHU (Centre Hospitalier Universitaire) de Nantes nous avons pu effectuer le diagnostic clinique de patients porteurs de la mucoviscidose et de patients prédisposés au cancer du sein. Nous avons effectué une étude statistique montrant la faisabilité du diagnostic des patients homozygotes mutés et normaux. Les résultats obtenus à l’issue de ce travail de thèse ouvrent de nombreuses perspectives et notamment celle d’intégrer le biocapteur réalisé par l’IETR dans un « lab on chip »
This works deals with the fabrication and the optimization of Suspended Gate Field Effect Transistors (SGFET) for applications in the field of clinical diagnosis. This multidisciplinary project links several knowledge in electronics, biology and chemistry. SGFET is based on the MOSFET structure. The main difference between these two devices concerns the structure of the gate (this one is suspended). In order to use SGFET in aqueous solutions, the doped gate is coated with silicon nitride thin film layer. Thanks to chemical functionalization of silicon nitride surface, DNA probes can be grafted between the gate and the channel. As a consequence, the negative charges brought by DNA involve a shift of the transfer characteristics. Hybridization signal is obtained by measuring the shift before and after addition of DNA targets. Thanks to DNA provided by genetic lab of CHU (Centre Hospitalier Universitaire) of Nantes we made clinical diagnosis of patients suffering from cystic fibrosis or predisposed to breast cancer. Statistical studies were achieved and demonstrated the ability to diagnose healthy and mutated homozygote patients. Future works will focus on the integration of the SGFET into a lab on chip

Ce manuscrit présente l'étude d'une nouvelle méthode de détection électronique différentielle de l'hybridation entre nucléotides, utilisant des réseaux de transistors à effet de champ et une fixation des ADN sondes de type polylysine. Les structures employées sont des réseaux d'EOSFETs, possédant une interface du type électrolyte/oxyde/semi-conducteur (EOS), qui peuvent être immergés dans un électrolyte de mesure dans lequel est plongée une électrode de référence.
La première partie de ce travail détaille les expériences nous ayant permis de montrer le faisabilité d'une détection électronique d'abord de polylysine, puis d'ADN sur une réseau d'EOSFETs. Des micro- ou macro-gouttelettes de solutions contenant ces bio-polymères chargés ont été déposées en des endroits prédéfinis sur les réseaux de capteurs. Ces dépots locaux induisent des variations des caractéristiques courant-tension des transistors exposés, pouvant être corrélées à un apport de charges soit positives dans le cas de la polylysine, soit négatives en ce qui concerne l'ADN. Le signal électronique est proportionnel au nombre moyen d'oligonucléotides de 20 bases par unité de surface, tant que celui-ci reste inférieur à 1000-10000 molécules par µm², avec une variation de 10 mV pour 100 à 1000 molécules déposées par µm². Une saturation du signal électronique est observée au delà. La détection de micro-dépots de faibles concentrations en bio-polymères est limitée par l'existence de signaux électroniques parasites observés avec des solutions servant aux dilutions. La variations des signaux électroniques en fonction de la concentration en sel a également été caractérisée.
L'utilisation d'un protocole d'hybridation sur fixation polylysine, sans étape de blocage visant à limiter l'adsorption non spécifique de cibles a conduit à la mise en évidence d'un signal différentiel de l'ordre de 5 mV lors d'hybridations et de mesures dans un électrolyte de KCl 20 mM. L'hybridation à haut sel et la détection à bas sel permettent d'obtenir des différences d'environ 15 mV. Aucun signal électronique significatif d'appariement n'a été observé en utilisant un bloqueur. La sensibilité de détection électronique de l'hybridation, estimée à 100-1000 double-brins de 20 paires de bases par µm² est proche de celle associée à la technique classique de fluorescence (0,5 à 80 double-brins par µm²).

Discrimination des genomes des sous especes m. M. Domesticus et m. M. Musculus etudie a l'aide de differents marqueurs genetiques, locus autosomaux, chromosome y et adn mitochondiral; mise en evidence d'une zone d'hybridations entre ces especes

La famille ets est une famille de facteurs de transcription presente chez tous les metazoaires. La signature de ces proteines est un domaine de liaison a l'adn hautement conserve appele domaine ets qui est capable de reconnaitre une sequence d'adn cible dont le noyau est 5 ggaa/t 3. En fonction du degre de similitude au sein du domaine ets, les etudes cladistiques ont permis de definir 13 groupes de proteines, dont les groupes ets et erg. Nous nous sommes interesses a l'etude de cette famille de genes chez l'annelide polychete hediste (nereis) diversicolor ou deux membres appeles nd ets et nd erg et classes respectivement dans les groupes ets et erg, ont ete precedemment identifies. Notre etude a permis de definir dans un premier temps les patrons d'expression de ces deux genes. Nd ets est exprime au niveau de l'intestin d'h. Diversicolor ainsi que dans les ovocytes. Nd erg est exprime dans des massifs mesodermiques presents dans la cavite clomique pouvant etre a l'origine de certaines cellules du systeme immunitaire. Nd erg est aussi exprime au niveau d'une zone de proliferation cellulaire situee entre le pygidium et le dernier metamere et enfin ce gene partage le territoire d'expression de nd ets au niveau des ovocytes. Par la technique de race p. C. R. , nous avons isole une partie des adnc issus de ces deux genes. Ainsi, par l'etude des sequences predites en acides amines, nous pouvons discuter de la position phylogenique de nd ets, proche de la sequence proteique d ets-2/pointed de drosophile. La conformation dans l'espace du domaine ets des proteines de mammiferes presente un motif helice-tour-helice de type aile constitue de trois helices et d'un feuillet a quatre brins. Il existe une grande identite dans la sequence primaire des differents domaines ets connus. Dans ce travail, des etudes de modelisations moleculaires ont montre que le domaine ets est egalement tres bien conserve au cours de l'evolution du point de vue de la structure tridimensionnelle.

Le polymorphisme de l'adn et les distorsions induites par la fixation d'un agent antitumoral: le cis-ddp sont etudies a l'aide de reactifs specifiques de la nature et de la conformation des bases. Le bromo ou chloroacetaldehyde permet de cartographier les adenines et les cytosines d'une sequence en conformation z et des jonctions adn-b-adn-z. La caracterisation des distorsions induites par le cis-ddp sur des oligonucleotides et sur les fragments d'adn a ete realisee a l'aide de sondes chimiques. L'accessibilite de la thymine complementaire de l'adenine d'un adduit d(apg) depend de la sequence environnante, la cytosine complementaire n'est pas accessible

L'objectif de ce travail est de detecter l'hybridation de sequences d'adn par differentes techniques autres que la fluorescence. Le principe recherche est de traduire directement le phenomene d'hybridation, en un signal exploitable physiquement en utilisant les proprietes d'un polymere conducteur electronique, le polypyrrole. Les copolymeres composes de monomeres pyrroles et de pyrroles fonctionnalises par des oligonucleotides (odn) sont synthetises a partir d'un protocole developpe au laboratoire. L'appariement des brins d'odn a ete suivi en temps reel et/ou une fois la reaction achevee, par diverses techniques de caracterisation electrochimiques, gravimetrique et optique. Des reponses peu specifiques ont ete obtenues par voltamperometrie cyclique et conductivite in situ, car ces dernieres n'ont pas permis de differencier categoriquement les processus d'hybridation et d'adsorption. Cependant, grace a ces etudes, nous pouvons proposer une explication sur les phenomenes ayant lieu a l'interface polymere solution lors de l'hybridation et de l'adsorption. Les mesures d'admittance, sur reseau de microelectrodes, ont montre la possibilite de detecter l'association entre deux brins complementaires, mais avec une faible sensibilite. En revanche la microbalance a quartz (mbq) et la spectroscopie de photocourant se sont averees etre des outils interessants pour caracteriser l'appariement des sequences d'adn. Nous avons mis au point une mbq tres sensible qui peut detecter une masse d'odn complementaires de l'ordre de quelques nanogrammes, ce qui a permis de realiser un biocapteur reproductible et reversible. Les mesures de spectroscopie de photocourant ont ete faites en fin de cinetique et en temps reel. De plus, ces deux techniques

L'auto-assemblage colloïdal représente une stratégie importante pour la conception de matériaux, en s'appuyant généralement sur des briques élémentaires sphériques capable de former des structures ordonnées telles que les réseaux cubique à faces centrées et hexagonal compact. Cependant, l’emploi de briques de base isotropes limite la formation de structures plus complexes. En revanche, l'utilisation de particules à patch permet de contrôler la directionnalité des interactions et la valence des particules, ouvrant ainsi la voie à l'assemblage de structures plus sophistiquées. Dans ce travail, nous avons développé deux méthodes robustes pour produire des particules colloïdales à deux patchs capables de s'auto-assembler par hybridation de l'ADN. La première approche repose sur la synthèse de particules de silice/polystyrène de type monopode, de taille micrométrique, par polymérisation en dispersion ensemencée. Ces particules sont constituées d’un nodule de PS, associé à une particule de silice, qui joue le rôle de masque pendant le greffage des brins d'ADN sur la surface de la silice. Après la dissolution des chaînes de polystyrène physiquement enchevêtrées du nodule de polymère, les chaînes de PS restantes qui sont greffées à la surface ont à leur tour été fonctionnalisées avec des brins d'ADN différents, ce qui a conduit à la formation de particules de silice bi-patchs. Cette fonctionnalisation asymétrique et sélective, cruciale pour le contrôle des interactions entre nanoparticules nous a permis de les assembler sous la forme de dimères et d’agrégats de type framboise. La deuxième stratégie est basée sur l’utilisation de bipodes de silice/polystyrène, synthétisés par polymérisation en émulsion ensemencée. Ces bipodes sont composés d'une nanoparticule de silice attachée à deux nodules de PS positionnés à 180° l’un de l’autre. Les bipodes ont été convertis en particules bi-patchs par dissolution des chaînes physiquement enchevêtrées des nodules de PS, suivie d'une fonctionnalisation sélective de l'ADN des chaînes de PS restantes en surface. L'analyse morphologique des nanoparticules par microscopie à force atomique a révélé des changements structurels avant et après fonctionnalisation. Le mélange de deux lots de nanoparticules bi-patchs fonctionnalisées avec des brins d'ADN complémentaires nous a permis de contrôler la formation d'assemblages unidimensionnels, appelés « polymères colloïdaux ». La longueur de ces polymères colloïdaux a pu être ajustée en faisant varier le temps d'incubation
Colloidal self-assembly is a powerful strategy for materials design. For example, spherical building blocks can form ordered structures such as face-centered cubic and hexagonal close-packed lattices. However, the use of isotropic building units limits the assembly of more complex structures. In contrast, the use of patchy particles allows to achieve control over the directionality of the interaction and the valence of the particles, allowing access to more sophisticated structures through self-assembly strategies. In this work, we have developed two routes to reliably produce two-patch colloidal particles that can self-assemble driven by DNA hybridization. Our first approach focused on the synthesis of silica/polystyrene monopod-like micron-sized particles via seeded dispersion polymerization. The particles consisted of a PS nodule attached to a single silica core and acted as a mask onto the silica surface for the grafting of DNA strands. Then, the physically entangled polystyrene chains were subsequently dissolved. The remaining PS chains grafted at the silica surface were in turn functionalized with different DNA strands, leading to the formation of bi-patch silica particles. This selective and asymmetric functionalization was crucial for controlling the interactions between particles and enabled us to assemble them into dimers and raspberry-like clusters. The second strategy started with bipod-like silica/polystyrene nanoparticles, synthesized via seeded emulsion polymerization. These bipods were composed of a single silica nanoparticle attached to two PS nodules positioned opposite to each other. The bipods were converted into bi-patch particles by dissolving the PS nodules, followed by selective DNA functionalization of the remaining surface PS chains. Morphological analysis by transmission electron microscopy and atomic force microscopy revealed structural changes before and after functionalization. Mixtures of two batches of bi-patch nanoparticles functionalized with complementary DNA strands allowed us to control the formation of one-dimensional assemblies, referred to as “colloidal polymers”. The chain length of these colloidal polymers can be modulated by varying the incubation time

En dépit de leur importance, la caractérisation des communautés bactériennes dans l’environnement reste encore très incomplète. Les principales raisons sont, d’une part, la difficulté d’appréhender la totalité de la communauté bactérienne quand plus de 99% des bactéries demeurent récalcitrantes à la culture in vitro et ne peuvent donc être étudiées par les approches classiques de microbiologie. D’autre part, la métagénomique, censée contourner cette méthode de culture en s’intéressant à l’ensemble des génomes extraits des milieux d’études, demeure elle aussi imparfaite du fait de limitations techniques (biais d’extraction de l'ADN, de clonage, de PCR, de séquençage et d’assemblage des génomes etc.) et conceptuelles, inhérentes à la complexité et l’hétérogénéité des environnements. Pour compenser les limites de chacune de ces techniques, des méthodes de tri cellulaire appliquées en conjonction avec les deux premières pourraient aider à un meilleur décryptage de la diversité microbienne. Basée sur la sélection spécifique (taxonomique et/ou fonctionnelle) et l’isolement direct des cellules bactériennes ciblées à partir d’un échantillon environnemental complexe, l’étude est restreinte à une population spécifique, voire à une cellule isolée. Pourront alors être appliquées les approches classiques de mise en culture ou d’extraction de l’ADN pour une étude restreinte à l’ADN ou l’ARN, leur répétition sur les différentes populations devant à terme (lointain) approcher l’exhaustivité. C’est dans ce contexte que s’est positionné ce travail de thèse visant dans un premier temps à mettre au point un nouvel outil de tri cellulaire basé sur l’intégration de micro-aimants permanents dans un canal microfluidique. A partir de ce système de tri magnétique miniaturisé, offrant de nombreux avantages (dispositif portable, peu coûteux, nécessitant de faibles volumes réactionnels et potentiellement intégrable en « laboratoire sur puce »), une technique d’isolement sélectif de cellules bactériennes marquées magnétiquement a alors été développée. Ciblées sur des critères taxonomiques après hybridation in situ avec des sondes d’acides nucléiques biotinylés complémentaires d’une région spécifique du gène 23S rRNA, des cellules bactériennes ont été marquées magnétiquement après réaction de la sonde avec des nanoparticules magnétiques fonctionnalisées par des molécules de streptavidine. Les premiers résultats montrent l’établissement d’une méthode de tri suffisamment spécifique et sensible pour piéger les cellules marquées diluées (0,04%) au sein d’une suspension, à des niveaux compatibles avec l’isolement futur de populations d’intérêt à partir de communautés d’environnements complexes. Sur un principe comparable, l’approche a été adaptée à l’étude des transferts horizontaux de gènes in situ. Les applications d’un tri cellulaire grâce au marquage par des nanoparticules magnétiques et l’emploi de micro-aimants intégrés dans des microsystèmes fluidiques semblent donc très prometteuses pour le développement de la microbiologie environnementale
Despite their importance, bacterial communities in the environment remain poorly characterized. On the one hand, it is difficult to gain knowledge of the community as a whole because over 99% of bacteria are recalcitrant to in vitro culture, rendering classic microbiological approaches imposible to carry out. On the other hand, metagenomics, which can be used to circumvent culture-based approaches by extracting all the genomes from a given environment, is also problematic given the associated technical limitations (biases related to DNA extraction, cloning, PCR, genome sequencing and assembling etc.), and conceptual difficulties related to the complexity and the homogeneity of the environments. In order to overcome some of the limitations of these approaches, bacterial cell selection methods have been developed and can be used to improve our understanding of microbial diversity. Based on taxonomic and/or functional selection and the direct isolation of bacterial cells from an environmental sample, bacterial cell selection can be used to reduce microbial community complexity by targeting specific populations, or even an isolated cell. A variety of classic approaches such as cultivation or DNA/RNA extraction can then be carried out. This cycle can theoretically be repeated until all members of the community are characterized. The aim of this doctoral thesis was to design a novel cell selection tool based on the permanent integration of micro-magnets into a microfluidic canal. In conjunction with a new miniaturized magnetic selection system that provides several advantages over larger systems (portable, low cost, requiring smaller reaction volumes and can be potentially integrated on “laboratory on a chip” systems), a method for selective bacterial cell isolation using magnetic labeling was developed. The bacterial cells were targeted based on taxonomic criteria; biotin-labeled probes were developed for a specific region of the 23S rRNA gene. Following in situ hybridization with the probes, baceterial cells were labeled with streptavidin-functionalized magnetic nanoparticles. First results showed that the tool was specific and sensitive enough to trap labeled and diluted (0,04%) cells from a suspension at levels that are comparible to populations of interest found in complex environmental communities. This tool has also been adapted to study in situ horizontal gene transfer as well. The application of a cellular selection tool that labels targets with magnetic nanoparticles coupled to fluidic microsystems with integrated nano-magnets looks very promising for future studiesin environmental microbiology

Grâce à l'hybridation moléculaire et à la polymerase chain réaction nous avons analysé la présence de l'ARN du VHD dans le sérum de patients ou de marmottes infectées par le VHD où sous thérapie antivirale. Nous avons démontré que la détection de l'ARN du VHD dans le sérum est un marqueur utile et sensible pour le diagnostic précoce et le suivi de l'infection par le VHD. Elle permet d'évaluer la réponse à une thérapie antivirale chez les patients infectés. Dans un deuxième temps, nous avons pu mettre en évidence l'existence dans le sérum de patients infectés par le VHD de deux ARNs, l'un codant pour le petit AgHD (27 Kd) et l'autre pour le grand AgHD (29 Kd). En effet lorsque la quantité d'ARN totale du VHD dans le sérum augmente, le rapport entre les deux génomes d'ARN diminue. Néanmoins ce rapport n'a pas de correction spécifique avec les différents stades cliniques de l'infection. Enfin, dans notre dernière étude concernant un isolat du VHD provenant de Bangui en République de Centre Afrique, nous avons pu déterminer que cette souche possède une mutation jamais identifiée auparavant au nucléotide 1013. Celle-ci convertit un codon de terminaison (TAG) et un codon lysine (AAG). Toutes les observations tant chez les patients de Bangui en République de Centre Afrique que chez les marmottes infectées expérimentalement par cette souche, nous ont permis de conclure que sur le plan immunologique et génétique, l'antigènes de ce VHD isolat joue un rôle dans l'inhibition de la réplication virale.

L'approche de sequencage systematique a ete utilisee a partir d'une banque d'adnc de cochlee de rat pour identifier des genes importants pour le fonctionnement cochleaire. Une selection rigoureuse nous permettant de reconnaitre les clones dont l'expression tissulaire etait restrainte a ete ensuite effectuee par rt-pcr. Parmi les nouvelles sequences, nous avons isole un clone, pco8, exprime preferentiellement dans la cochlee. Une analyse extensive en hybridation in situ en utilisant des ribosondes marquees a la dioxygenine, dans la cochlee, ainsi que dans d'autres tissus du systeme nerveux central et peripherique a montre que son expression etait restreinte aux neurones auditifs primaires du ganglion spiral ainsi qu'a des motoneurones de la moelle epiniere. La sequence complete de l'arnm contient une phase ouverte de lecture unique qui code pour une proteine, nommee sg6, de 89 acides amines, d'un poids moleculaire calcule de 7,8 kda et ayant un point isoelectrique a 4,52. La proteine ne presente pas d'homologies significatives avec d'autres proteines ou familles de proteines connues. Elle presente a son extremite n-terminale un peptide signal de 21 acides amines et son profil d'hybrophobicite est majoritairement hydrophile ; ce qui implique qu'elle pourrait etre secretee. Nos resultats immunohistochimiques utilisant des anticorps polyclonaux anti-sg6 montrent que la proteine est localisee dans la lame spirale osseuse ; ce qui suggere que sg6 pourrait etre transportee apres sa synthese. La localisation restreinte de sg6 dans les neurones cochleaires et les motoneurones de la moelle epiniere ainsi que son absence d'homologie avec d'autres proteines connues encouragent a initier des recherches concernant sa fonction et sa localisation chromosomique

L’objectif de cette thèse est de déterminer l’étendue de la variabilité épigénétique, plus particulièrement du polymorphisme de méthylation de l’ADN, non liée à la variabilité génétique dans les populations asexuées en milieu naturel. Cette évaluation nous a permis de mieux cerner l’importance que peuvent avoir les processus épigénétiques en écologie et en évolution. Le modèle biologique utilisé est l’hybride clonal du complexe gynogénétique Chrosomus eos-neogaeus. Malgré une homogénéité génétique, une importante variabilité phénotypique est observée entre les hybrides d’une même lignée clonale mais retrouvés dans des environnements différents. L’influence des processus épigénétiques apporte une explication sur ce paradoxe. L’épigénétique se définit comme une modification de l’expression des gènes sans changement de la séquence d’ADN. La diversité des phénotypes peut entre autre s’expliquer par des patrons de méthylation différentiels des gènes et/ou des allèles des gènes entre les hybrides génétiquement identiques. La diversité des lignées épiclonales peut quant à elle s’expliquer par la colonisation de plusieurs lignées épiclonales, s’établir en réponse à l’environnement ou de façon aléatoire. Plusieurs méthodes seront utilisées afin de survoler le génome des hybrides clonaux pour mettre en évidence le polymorphisme de méthylation de l’ADN à l’échelle de l’individu et entre les individus de différentes populations.
The aim of the thesis is to determine the extent of epigenetic variation, more specifically DNA methylation polymorphism, not linked to genetic variation in natural populations of an asexual vertebrate. This evaluation enables to better understand the importance that plays epigenetics processes in ecology and evolution. The biological model used is the clonal hybrid of the gynogenetic Chrosomus eos-neogaeus complex. Even in absence of genetic difference, an important phenotypic variability is observed among hybrids of the same clonal lineage living in different environments. Epigenetics, a modification of genes expression without a change at the DNA sequence, provides an explanation to this paradox. The diversity of phenotypes may be explained by differential methylation patterns of genes and/or alleles among genetically identical hybrids. The diversity of epiclonal lineages may be explained by the colonisation of many epiclonal lineages, established in response to the environment or stochastically. Many methods were used for screening the genome of clonal hybrids in order to highlight DNA methylation polymophism at the scale of an individual and among individuals of different populations.