Dissertations / Theses on the topic 'Homéostasie – génétique'

LAT (Linker for activation of T cells) assembles an essential platform for recruiting multiple proteins after TCR engagement. Mice homozygous for a single mutation in tyrosine residue 136 of the LAT adaptor showed impeded T cell development. However, later in life they accumulated polyclonal Th2 CD4+ effector T cells, which triggered tissue eosinophilia and massive maturation of B cells into plasma cells secreting high level IgG1 and IgE. To investigate the molecular and cellular pathways that might be involved in the triggering of this pathological condition, we used short-term and long-term adoptive transfer into hosts that were specifically deprived of T cells. We found that CD4 T cells from LATY136F mutant mice displayed similar homeostasis to their wild-type counterpart at the beginning of the reconstitution. However, 8 weeks after reconstitution, transfer of the LATY136F derived CD4 T cells gives rise to a condition that fully reproduce the lymphoproliferative disease originally observed in LATY136F mice. Accordingly, the reconstituted mice showed a large accumulation of CD4 T cells and B cells in secondary lymphoid organs, as well as hypergammaglobulinemia IgG1 and IgE in serum, and eosinophilia in multiple tissues. This demonstrated that the LATY136F disorder was T cell autonomous. Further results derived from comparison between CD3 epsilon-deprived hosts that are either MHCII-sufficient or-deficient showed that in the absence of MHCII molecules, LATY136F CD4 T cells were capable, however with a two-fold reduced efficiency, of proliferating and of helping B cells to mature into IgG1 and IgE plasma cells. These results suggested that the lymphopoliferation of CD4 T cells in LATY136F mutant mice and the ensuing T/B cooperation that leads to massive amount of IgE and IgG1 are largely independent on MHC Class II molecules. This almost TCR-independent and thus “autistic” behavior vis-à-vis MHC Class II molecule appears to be a unique property of CD4 T cells harboring the LATY136F mutation. NTAL (non-T cell activation linker, also called LAB), a newly identified transmembrane adaptor protein, shared structural similarity with LAT. It is highly expressed in B cells, NK cells and mast cells. NTAL/LAB is rapidly phosphorylated by 4 Src-family kinases (Lck or Lyn) and Syk- family kinases (ZAP-70 or Syk) after ligation of BCR, FcγRI and FcεRI receptors. The major proteins that associated with NATL/LAB after phosphorylation were identified as Grb2, SOS1, C-Cbl and Gab1 etc. The disruption of NTAL/LAB expression in B cell line can lead to decreased calcium mobilization and Erk activation, which suggested that NTAL/LAB is acting in BCR-mediated calcium flux and Ras-MAPK activation. To delineate the respective roles of NTAL/LAB and LAT in B cell development and function, Ntal-deficient mice were generated and crossed with Lat-deficient mice. B cells developed with same efficiency in Lat-/- Ntal-/- double-deficient mice and in mice lacking either of the two adaptors and in wild-type mice, which demonstrated that NATL/LAB is dispensable in B cell development. Upon B cell antigen receptor cross-linking, Ntal-/- B cells exhibited slightly increased Ca2+ mobilization and proliferation. Analysis of T-dependent and T-independent humoral responses showed that Ntal-deficient mice had increased levels of natural antibodies and slightly increased humoral response to a T-dependent antigen. Specific serum immunoglobulins at normal titers were produced in response to T cell-independent antigens. Although NTAL is also expressed in plasma cells, its absence did not affect the hypergammaglobulinemia E and G1 that developed in mice with a mutation in tyrosine 136 of LAT. Therefore, NTAL does not play in B cells a role symmetric to the role played by LAT in T cells
L’adaptateur transmembranaire LAT (Linker for Activation of T cells) constitue une plateforme moléculaire assurant le recrutement de nombreuses protéines impliquées dans la transduction des signaux médiés par le TCR. Les souris homozygotes pour une mutation ponctuelle de la tyrosine 136 du domaine intracytoplasmique de LAT présentent un défaut dans le développement des lymphocytes T. En outre, elles développent progressivement une lymphoprolifération T CD4+ polyclonale qui est associée à une éosinophilie tissulaire et à une maturation massive des cellules B en plasmocytes sécrétant des niveaux élevés d’IgG1 et d’IgE. Pour disséquer les mécanismes cellulaires et moléculaires associés au développement de cette pathologie, nous avons mis en oeuvre un système de transfert adoptif à court terme et à long terme dans des hôtes présentant une immunodéficience sélective en lymphocytes T. Nous avons montré que les cellules T CD4+ des souris mutantes LATY136F présentent une homéostasie similaire à celle des cellules wt en début de reconstitution. En revanche, 8 semaines après reconstitution, les cellules T CD4+ desLATY136F induisent une pathologie lymphoproliférative qui reproduit en tout point celle observée initialement dans les souris LATY136F. Ainsi, les souris reconstituées présentent-elles une accumulation massive de cellules T CD4+ et de lymphocytes B dans les organes lymphoïdes secondaires, une ypergammaglobulinémie IgG1 et IgE et une éosinophilie marquée dans de nombreux tissus. Ceci démontre que les lymphocytes T sont nécessaires et suffisants pour induire la pathologie LATY136F. Par comparaison des reconstitutions réalisées dans des hôtes déficients en CD3 et exprimant ou non les molécules d’histocompatibilité de classe II, nous avons établi que les lymphocytes T CD4+ LATY136F conservent, en l’absence de molécules d’histocompatibilité de classe II, leur capacité à proliférer et à stimuler la maturation des lymphocytes B en plasmocytes sécrétant des IgG1 et des IgE -avec une efficacité néanmoins deux fois moindre-. Ces résultats suggèrent que la lymphoprolifération des cellules T CD4+ dans les souris mutantes LATY136F et que la coopération T/B associée qui conduit à des concentrations sériques considérables d’IgE et IgG1 sont, pour une large part, indépendants des moléculesd’histocompatibilité de classe II. Ce comportement largement indépendant du TCR et pouvant à ce titre être qualifié de comportement autistique vis-à-vis des molécules de classe II apparaît comme une propriété unique des cellules T CD4+ portant la mutation LATY136F. NTAL (Non T cell Activation Linker, également appelé LAB) est un adaptateur transmembranaire récemment identifié qui possède des similarités structurales avec LAT. NTAL est fortement exprimé dans les cellules B, les cellules NK et les mastocytes. NTAL est rapidement phosphorylé par les kinases de la famille Src (Lck ou Fyn) et de la famille Syk (Zap-70 ou Syk) après engagement du récepteur des cellules B (BCR) ou des récepteurs au fragment Fc des immunoglobulines de type FcγRI et FcεRI. Les principales protéines identifiées comme associées à la molécule NTAL phosphorylée sont Grb2, SOS1, C-Cbl, Gab1. La suppression de l’expression de NTAL dans une lignée B conduit à une diminution des flux calciques et de l’activation des molécules Erk, ce qui suggère que NTAL participe à l’induction des flux calciques et à l’activation de la voie Ras-MAPKassociées à la stimulation du BCR. Pour identifier les rôles respectifs de NTAL et de LAT dans le développement et la fonction des lymphocytes B, des souris déficientes pour Ntal ont été générées et croisées avec des souris déficientes pour LAT. L’ analyse de ces souris a montré que les cellules B se développent avec la même efficacité dans les souris doublement déficientes Lat-/-Ntal-/-, dans les souris déficientes dans l’un de ces deux gènes et dans les souris wild-type, ce qui démontre que NTAL n’est pas indispensable pour le développement des lymphocytes B. L’agrégation des récepteurs des cellules B induit, par ailleurs, des niveaux de prolifération et des niveaux de flux calciques légèrement augmentés dans les souris déficientes pour Ntal. L’analyse des réponses humorales T dépendantes et T indépendantes a montré que les souris déficientes pour Ntal possèdent, en outre, des niveaux augmentés d’anticorps naturels et des réponses humorales légèrement amplifiées en réponse à des antigènes T dépendants. Des titres normaux d’immunoglobulines sériques spécifiques sont observés en réponse à des antigènes T indépendants. Enfin, bien que NTAL soit également exprimé dans les plasmocytes, son absence n’affecte pas l’hypergammaglobulinémie E et G1 sedéveloppant dans les souris porteuses de la mutation LATY136F. NTAL ne constitue donc pas dans les lymphocytes B l’équivalent fonctionnel de LAT dans les lymphocytes T

Les mécanismes associés à l’encodage du signal "ligand" par le TCR, en particulier les mécanismes d’initiation et de clôture ainsi que les mécanismes d’ajustement de ce codage au cours de la "vie lymphocytaire" font l’objet de ce travail. Deux modèles majeurs ont été proposés pour rendre compte de l’initiation des événements d’activation suite à la reconnaissance du ligand pMHC. Dans le premier modèle dit cinétique, les paramètres cinétiques, en particulier le temps de demi‐vie de l’interaction TCR:ligand, constitue le paramètre crucial gouvernant l’activation T. Dans le second modèle, les événements conformationnels sont proposés comme des événements initiateurs de l’activation. En particulier, l’une des observations majeures récemment rapportée en faveur du modèle conformationnel est l’exposition inductible d’une séquence riche en prolines du domaine intracytoplasmique de la sous‐unité CD3ε du complexe récepteur (CD3εPRS) suite à son engagement avec un ligand activateur. Selon cette hypothèse, l’exposition de cette séquence interviendrait avant tout événement de phosphorylation et permettrait le recrutement de l’adaptateur cytosolique NCK. Afin d’évaluer l’importance physiologique de l’exposition inductible de cette séquence pour l’activation T, nous avons développé une souris knock‐in exprimant une sous‐unité CD3ε dépourvue de motif riche en prolines. L’analyse du phénotype de cette souris a mis en évidence que cette séquence n’est pas nécessaire à l’activation des cellules T et a ainsi invalidé un des arguments expérimentaux majeurs en faveur du modèle conformationnel. En outre, de façon inattendue, cette souris a révélé un élément nouveau dans le codage du signal. En effet, l’absence de cette séquence conduit à des défauts partiels lors de la sélection β et de la sélection γδ, à des niveaux de TCR sélectivement augmentés en surface des thymocytes CD4+CD8+ ainsi qu’à des défauts de sélection positive. La dissection génétique et moléculaire de ce phénotype a montré que ces quatre fonctions sont associées à la colocalisation des kinases LCK au voisinage du TCR via le recrutement constitutif de NCK au niveau de la séquence riche en prolines de CD3ε et une interaction NCK:LCK. Bien que cette dernière interaction reste à démontrer directement, la compensation du phénotype par une kinase LCK pré‐activée suggère fortement que les fonctions associées à l’interaction CD3ε:NCK sont médiées par LCK. Ces observations nous ont conduits à proposer un modèle dans lequel l’interaction tripartite CD3ε:NCK:LCK constituerait un co‐récepteur intracellulaire assurant le couplage des sous‐unités du TCR avec la kinase LCK dans les situations où les co‐récepteurs CD4 et CD8 ne sont pas ou peu efficacement couplés au récepteur T, i. E. Lors de la sélection β, de la sélection γδ, dans les thymocytes CD4+CD8+ pré‐sélectionnés et lors des événements de sélection positive au cours desquels le récepteur T reconnaît des ligands de faible affinité, peu efficaces pour médier le recrutement des co‐récepteurs. L’analyse précise de la fonction de la séquence CD3εPRS dans la régulation des niveaux de TCR exprimés par les thymocytes CD4+CD8+ a montré que cette séquence participe, en coopération avec SLAP et c‐CBL, à la dégradation de CD3ζ. Afin d’analyser les mécanismes de clôture des signaux d’activation, nous avons utilisé le modèle murin LatY136F/Y136F qui présente un adaptateur LAT dépourvu de la tyrosine 136 et qui développe une lymphoprolifération T CD4+. Pour élucider les mécanismes associés à cette dérégulation, nous avons développé un système d’expression conditionnelle de la mutation dans les cellules T périphériques. Cette approche a prouvé que la pathologie lymphoproliférative n’est pas de nature auto‐immune et qu’une pathologie similaire se développe en l’absence complète d’adaptateur LAT, démontrant que les signaux générés par l’adaptateur LAT altéré ne constituent pas des événements initiateurs de la pathologie. L’existence d’événements de signalisation alternatifs dans les cellules dépourvues d’adaptateur LAT a mis en évidence de façon directe le rôle de LAT dans la terminaison et la régulation négative des signaux d’activation
The mechanisms by which ligand recognition is encoded and converted into a cytoplasmic signal by the T cell receptor (TCR), in particular how signals are initiated and terminated and how this code is adjusted during T cell differenciation are central themes in T cell immunology and constitute the subject of this work. Two main models have been proposed to account for signal initiation following ligand recognition by the TCR. In one model of T cell activation, the half‐lives of TCR:pMHC complexes constitute the main parameter driving T cell activation. In an alternative model, conformational changes of the receptor have been proposed to rationalize the seminal events leading to biochemical cascades. In particular, in one of the most recently advocated conformational model of T cell activation, a proline‐rich motif (PRS) located in the cytoplasmic tail of CD3ε has been proposed to be inducibly exposed following activation and to recruit the cytosolic adaptor NCK. According to that model, this step would occur even prior to phosphorylation events and would constitute a critical step for T cell activation. To assess this model, we constructed a knock‐in mouse deprived of this sequence. The phenotype of this mouse invalidated the conformational model of T cell activation based on an inducible exposure of this motif. Unexpectedly this mouse also unraveled novel functions for the PRS sequence at the β selection checkpoint, but also during γδ selection events and turned out to be a crucial regulator of TCR levels expressed on DP thymocytes and also required for positive selection events. These four functions were linked to the constitutive interaction between CD3εPRS and NCK and to the recruitment of LCK by NCK. Although this last interaction has to be directly demonstrated, the compensation of the phenotype by a pre‐activated LCK kinase strongly suggests that the functions associated with CD3εPRS:NCK interaction are mediated through LCK. These observations led us to formulate a model in which a tri‐molecular complex composed of CD3εPRS:NCK:LCK constitutes an intracellular coreceptor recruiting LCK in situations where the TCR is not or not efficiently coupled with CD4 and CD8 coreceptors, i. E. During β selection, γδ selection, in pre‐selected CD4+CD8+ thymocytes and during positive selection (where thymocytes recognize low‐affinity ligands that do not recruit efficiently the coreceptors due to the short half‐life of these ligands). Lastly, the function associated with the CD3εPRS in CD4+CD8+ thymocytes was linked to the participation of this sequence to a degradation pathway mediated by SLAP and c‐CBL leading to CD3ζ ubiquitination and degradation. In order to analyze signals that participate to the termination of activatory signals, we used the LatY136F/Y136F mouse genetic model in which the LAT adaptor is deprived of the tyrosine 136 and which develops a CD4 lymphoproliferative disorder. To understand the mechanisms at play in this pathology, we developed a conditional model allowing the expression of the mutation in peripheral T cells. This approach demonstrated that this disorder is not mediated by an auto‐immune mechanism and that a similar pathology occurs in complete absence of LAT adaptor, suggesting that altered LAT signals do not participate to the unfolding of the disease. Interestingly, the absence of LAT molecules led to the exacerbation of some of the biochemical events, unraveling in a direct fashion the negative regulatory function of LAT for T cell homeostasis

Etudier l'homogénéité des cellules humaines T régulatrices (Treg) CD4+FOXP3+ et leur potentiel de reprogrammation des lignées est crucial pour appliquer les Treg thérapies dans les études cliniques. Grâce aux techniques d'analyse à l'échelle unicellulaire, nous avons exploré l'hétérogénéité et la diversité fonctionnelle des Treg chez des donneurs sains et chez des patients atteints d'une leucémie, après une transplantation allogénique des cellules souches hématopoiétiques (alloHSCT). Les cellules Treg révèlent un niveau de complexité simillaires aux cellules effectrices T CD4+ concernant l'expression des facteurs de transcription, des récépteurs ainsi que les cytokines inflammatoires. L'analyse unicellulaire des rares Treg qui expriment IL-17A ou IFN-y montre un chevauchement de l'expression des principaux gènes présents dans les cellules Th1, Th17 et les Treg. Afin d'évaluer si l'homéostasie des Treg est affectée par un environnement inflammatoire et lymphopénique, nous avons caractérisé le compartiment des Treg chez les patients après une alloHSCT. Cette analyse suggère une déplétion remarquable des Treg avec un phénotype naïve chez les patients présentant une maladie aigue du greffon contre l'hôte, par rapport aux patients tolérants. Néanmoins, l'analyse unicellulaire a montré que les lymphocytes T CD4+FOXP3+ maintiennent l'expression des gènes de Treg et que ces cellules préservent leur activité suppressive. Notre étude montre que l'hétérogénéité au niveau unicellulaire, plutôt que la reprogrammation des lignées lymphocytaires T CD4+FOXP3+, explique la complexité remarquable et la diversité fonctionnelle des Tregs humains
Understanding the heterogeneity of human CD4+FOXP3+ regulatory T cells (Treg) and their potential for lineage-reprogramming is of critical importance for moving Treg therapy into the clinics. Using multi-parameter single-cell analysis techniques we explored the heterogeneity and functional diversity of human Treg in healthy donors and in patients after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (alloHSCT). Human Treg displayed a level of complexity similar to conventional CD4+ effector T cells with respect to the expression of transcription factors, homing receptors and inflammatory cytokines. Single-cell profiling of the rare Treg producing IL-17A or IFN-y showed an overlap of gene expression signatures of Th17 or TH1 cells and of Treg. To assess if Treg homeostasis is affected by an inflammatory and lymphopenic environment, we characterized the Treg compartment in patients early after alloHSCT. This analysis suggested a marked depletion of Treg with a naive phenotype in patients developing acute graft-versus-host disease, compared to tolerant patients. However, single-cell profiling showed that CD4+FOXP3+ T cells maintain the Treg gene expression signature and Treg suppressive activity was preserved. Our study establishes that heterogeneity at the single-cell level, rather than lineage-reprogramming of CD4+FOXP3+ T cells, explains the remarkable complexity and functional diversity of human Treg

L'hypercholestérolémie est un facteur de risque majeur des maladies cardiovasculaires. La compréhension des mécanismes régissant l'homéostasie du cholestérol est cruciale puisqu'elle peut concourir au développement de nouvelles thérapies hypocholestérolémiantes. Les acides biliaires (AB) sont des dérivés terminaux du métabolisme du cholestérol. Ces molécules, produites dans le foie, jouent un rôle clef dans la digestion et l'absorption intestinale des lipides. Par ailleurs, elles représentent la principale voie d'élimination physiologique du cholestérol. Les résultats obtenus au cours de cette thèse montrent qu'il existe une régulation coordonnée des gènes codant pour les transporteurs d'AB dans l'intestin, le foie et rein. Ce mécanisme assure une élimination efficace des AB par voie fécale et urinaire et contribue à expliquer la résistance de la souris à l'hypercholestérolémie induite par voie alimentaire. Les facteurs de transcription SREBP-2 et HNF-1, et le récepteur nucléaire PPAR, jouent un rôle clef dans ce mécanisme adaptatif puisqu'ils assurent la régulation cholestérol-dépendante de plusieurs transporteurs clefs d'AB, en particulier l'ASBT dans l'iléon et le rein, et la L-FABP dans le foie
Hypercholesterolemia is a major risk factor of cardiovascular diseases. Understanding of mechanisms ensuring the maintenance of body cholesterol homeostasis is crucial, since it can allow the development of new hypocholesterolemiant therapies. Bile Acids (BA) are end-products of cholesterol metabolism. These molecules, produced in the liver, participate to fat digestion and absorption in the intestine. Moreover, BA represent the main pathway of body cholesterol removal. The results presented in this thesis show that genes encoding intestinal, hepatic and renal BA transporters are coordinately regulated. This mechanism ensures efficient BA elimination through faecal and urinary route, and thus contributes to explain the resistance of mice to diet-induced hypercholesterolemia. The transcription factors SREBP-2 and HNF-1, and the nuclear receptor PPAR, play a key role in this adaptative process since they allow cholesterol-dependent regulation of several key BA transporters, particularly ASBT in the ileum and the kidney, and L-FABP in the liver

Les métaux de transition sont des micronutriments essentiels dans le cycle de vie de nombreux organismes vivants, y compris les bactéries. Ils jouent un rôle important à l'interface hôte-pathogène : l'hôte restreint l'accès au fer, au manganèse et au zinc pour les bactéries qui l'infectent, tout en les intoxiquant avec du cuivre ou du zinc pendant la phagocytose. Les bactéries ont donc acquis différents mécanismes d'homéostasie afin de s'adapter à ces conditions. Alors que des systèmes d'importation du fer, du manganèse ou du zinc ont été caractérisés, peu de choses sont connues pour le cuivre, pour lequel les études se sont concentrées sur les mécanismes de défense. Par ailleurs, alors que plusieurs mécanismes de régulation post-transcriptionnels sont connus pour d'autres métaux, seuls des régulateurs transcriptionnels ont été identifiés en réponse au cuivre.Des travaux antérieurs menés sur l'homéostasie du cuivre chez le pathogène humain Bordetella pertussis, responsable de la maladie de la coqueluche, ont montré que cette bactérie a perdu la plupart des mécanismes de défense connus contre l'excès de cuivre. En revanche, nous avons identifié un opéron de trois gènes appelés bp2923-bfrG-bp2921, dans lequel les deux derniers gènes sont régulés négativement par un excès de cuivre. bfrG est prédit pour coder un transporteur TonB-dépendant, une famille de protéines connue pour l'importation de métaux à travers la membrane externe des bactéries à Gram négatif, et bp2921 a un homologue prédit pour coder une sidérophore réductase. Ceci indique que ce système pourrait être impliqué dans l'acquisition du cuivre. Nous avons montré que la protéine codée par le premier gène, membre de la famille de protéines DUF2946, représente un nouveau type d'upstream Open Reading Frame (uORF) impliquée dans la régulation post-transcriptionnelle des gènes en aval. En l'absence de cuivre, l'opéron entier est transcrit et traduit. La perception du cuivre par la protéine naissante codée par bp2923 via un motif conservé CXXC déclenche la terminaison de transcription Rho-dépendante entre le premier et le deuxième gène en libérant le ribosome arrêté sur un motif conservé C-terminal RAPP. Les homologues de bp2923 sont répandus dans les génomes bactériens, dans lesquels ils sont en tête d'opérons prédits pour coder des mécanismes d'importation ou d'utilisation du cuivre. Nous avons donc identifié un nouveau mode de régulation génétique par un métal de transition et identifié une fonction de régulation pour un membre d'une famille de protéines bactériennes non caractérisées que nous avons appelé CruR, pour Copper responsive upstream Regulator. Des travaux supplémentaires sur ce système ont mis en lumière la complexité de la régulation bactérienne, car notre opéron est régulé non seulement par le cuivre, mais est aussi surexprimé par la modulation de la virulence et en phase stationnaire de croissance.Par ailleurs, nous avons commencé à caractériser la fonction de cet opéron. Nous avons montré que BfrG lie du cuivre in vitro, et des analyses phénotypiques ont montré le rôle de l'opéron pour la croissance bactérienne lorsque B. pertussis rencontre des conditions de faible oxygénation. Parmi les protéines à cuivre produites par B. pertussis, on trouve plusieurs cytochrome-oxydases de la chaîne respiratoire, ce qui suggère que BfrG et Bp2921 joueraient un rôle dans l'acquisition du cuivre pour leur assemblage. Combinées aux résultats de régulation, ces données suggère que notre opéron pourrait contribuer à dans la persistance bactérienne dans le tractus respiratoire lors de l'infection. Beaucoup d'aspects de ce système restent méconnus et nécessiteront d'être étudiés
Several transition metals are essential micronutrients for most living beings, including bacteria. In addition, they play important roles at the host-pathogen interface: the host tends to restrict bacterial access to iron, manganese and zinc, while intoxicating invading microorganisms with copper or zinc during phagocytosis. Bacteria have therefore acquired various homeostasis mechanisms in order to adapt to those conditions. Whereas iron, zinc or manganese import systems have been extensively characterized, very little is known for copper, for which studies have mostly focused on defense mechanisms. Besides, while several post-transcriptional regulation mechanisms are known for other metals, only transcriptional regulators have been identified in response to copper.Previous work performed in the laboratory on copper homeostasis in the human-restricted pathogen Bordetella pertussis, responsible for the whooping cough disease, has shown that this bacterium has shed most of its defense mechanisms against excess copper. On the other hand, we have identified a three-gene operon called bp2923-bfrG-bp2921, in which the last two genes are down-regulated by copper excess. bfrG is notably predicted to encode a TonB-dependent transporter, a protein family well-known for metal import across the outer membrane in Gram-negative bacteria, and bp2921 has a characterized homolog encoding a siderophore reductase, which hints at a system involved in copper acquisition. We have shown that the protein encoded by the first gene, a member of the DUF2946 protein family, represents a new type of upstream Open Reading Frame (uORF) involved in post-transcriptional regulation of the downstream genes. In the absence of copper, the entire operon is transcribed and translated. Perception of copper by the nascent bp2923-coded protein via its conserved CXXC motif triggers Rho-dependent transcription termination between the first and second genes by relieving translation arrest on a conserved C-terminal RAPP motif. Homologs of bp2923 are widespread in bacterial genomes, where they head operons predicted to participate in copper importation or utilization. We have thus identified a new mode of genetic regulation by a transition metal and identified a regulatory function for a member of an uncharacterized family of bacterial proteins that we have named CruR, for Copper responsive upstream Regulator. Additional work on this system has shed a light on the complexity of bacterial regulation, as our operon is regulated not only by copper, but is also overexpressed upon virulence modulation or in stationary growth phase.We have also initiated the characterization of the function of this operon. BfrG has been shown to specifically bind copper in vitro, and phenotypic analyses have shown a crucial role for the operon when B. pertussis is placed in low-oxygen conditions. Among the cuproproteins produced by B. pertussis are several cytochrome oxidases in the respiratory chain, which suggests that BfrG and Bp2921 could play a role in delivering copper for their assembly. Combined with results on the regulation, this suggests a possible role for copper and our operon in bacterial persistence in the respiratory tract during infection. Many aspects of this system remain to be further investigated

Le zinc est un oligo-élément essentiel pour la vie. Le zinc n'est pas seulement un nutriment important, ou un cofacteur de nombreuses enzymes et de facteurs de transcription, il est désormais considéré comme un médiateur intracellulaire. L'homéostasie du zinc résulte de la coordination de diverses protéines: les ZIP, les métallothionéines et les ZnT appartenant à la famille CDF. Le récent décryptage du génome humain a permis d'identifier de nouveaux gènes, ainsi nous avons pu caractériser deux nouveaux gènes de la famille SLC30, nommés SLC30A8 et SLC30A JO. L 'homéostasie du zinc est maintenue par l'action de ces protéines dont la transcription est ellemême dépendante en partie de la concentration en zinc extracellulaire. En cas de carence, les taux de transcription de ZnT -S,-Sc et 7 sont augmentés. Ces transporteurs, que nous avons localisés au niveau de l'appareil de Golgi, pourraient permettre aux protéines néo-synthétisées l'apport en zinc nécessaire à leur fonctionnalité. Nous avons également montré que la protéine ZnT-8 est un transporteur du zinc spécifique des cellules sécrétrices d'insuline, localisé au niveau même des vésicules contenant l'insuline, et dont la régulation de la transcription, tout comme l'insuline, est dépendante du taux de glucose extracellulaire. Le zinc est impliqué dans tous les aspects métaboliques et structuraux des différents compartiments cellulaires. C'est pourquoi la connaissance de ce contrôle cellulaire du zinc est indispensable à une modélisation et à une compréhension du fonctionnement de la cellule
Zinc is an essential trace element. It is involved in many cellular processes because it is a cofactor of enzymes, nuc1ear factors and hormones. Therefore, is a very important component of cell viability Zinc homeostasis results from a coordinated regulation of different proteins: ZIP (uptake), metallothioneins (intracellular storage/trafficking), and ZnT (excretion). Using genomic databanks, we have analyzed and identified two novel SLC30 genes: SLC30A8 and SLC30A10. Zinc homeostasis is maintained by the action of these proteins, and their transcription is partly dependent of extra cellular zinc concentration. Ln case of zinc deficiency, ZnT-5, -5c and -7 genes are over-expressed. These transporters that we have localized in the Golgi apparatus could provide essential zinc to neo-synthesised proteins for their functionality. Furthermore, we showed that ZnT-8 is a zinc transporter specifie of pancreas and expressed in beta cells. ZnT -8 facilitates the accumulation of zinc from the cytoplasm into insulin vesic1es, and its transcription regulation is dependent, like insulin, of extra cellular glucose concentration. Zinc is implicated in all metabolic and structural aspects of the different cellular compartments. Therefore the cellular control of Zinc requires to be understood and is essential tot fear the cellular working

La recherche de mutations rares ou de remaniements chromosomiques, a permis récemment de formuler de nouvelles hypothèses concernant les mécanismes génétiques en cause dans l'autisme. De précédents travaux du laboratoire ont permis de mettre en évidence des mutations des Neuroligines 3 et 4, qui codent des molécules d'adhérence cellulaire neuronales. Mon travail de thèse s'est situé dans la continuité de ces travaux, poursuivant une stratégie de recherche de mutations rares, dans des gènes candidats. J'ai d'une part étudié le gène MAGI2, qui code un partenaire des Neuroligines, chez 96 sujets autistes. D'autre part, j'ai étudié les gènes de la voie de signalisation de la mélatonine chez des sujets autistes, et des sujets hyperactifs, afin de préciser les mécanismes et la spécificité de l'atteinte de la voie mélatoninergique. Par ailleurs mon travail a comporté une partie clinique de réévaluation de patients, qui portaient des mutations de SHANK3. L'étude des gènes MAGI2 et SHANK3 a montré que des mutations des partenaires des neuroligines peuvent avoir un rôle prépondérant dans l'apparition d'un syndrome autistique « isolé ». Néanmoins, le gène MAGI2 ne semble pas être particulièrement impliqué dans l'autisme, et pourrait être associé à un phenotype plus sévère. L'étude de la voie mélatoninergique confirme la probable prépondérance d'un défaut de synthèse de la mélatonine comme mécanisme d'atteinte de cette voie dans l'autisme, et que la voie mélatoninergique n'est pas spécifique à l'autisme. Enfin, les deux processus explorés dans ce travail de thèse pourraient jouer un rôle dans un processus commun: le maintien de l'homéostasie synaptique
The search for rare mutations or chromosomal rearrangements, has recently allowed new hypotheses regarding the genetic mechanisms involved in autism. Previous studies in the laboratory have allowed to show mutations of neuroligins 3 and 4, which encode neuronal cell adhesion molecules. My thesis was in the continuity of this work, pursuing a strategy of search of rare mutations in candidate genes. I studied the one hand MAGI2 gene, which encodes a partner of neuroligins, in 96 subjects with autism. On the other hand, I studied genes of the melatonin pathway in patients with autism, and ADHD subjects, to clarify the mechanisms and specificity of alterations of this pathway. Also my work has included clinical reevaluation of patients who carried mutations of SHANK3. The study of MAGI2 and SHANK3 genes showed that mutations in neuroligins partners may have a role in the emergence of an "isolated" autistic syndrome. However, the gene MAGI2 does not seem particularly involved in autism, and may be associated with a more severe phenotype. The study of the melatonin pathway confïrms the likely preponderance of a deficit of melatonin synthesis as a mechanism for alteration of this pathway in autism and that alteration of this pathway is not specific to autism. Finally, the two processes explored in this thesis could play a role in a common process; the maintenance of synaptic homeostasis

L’homéostasie de la taille des cellules implique l’existence de mécanismes capables de coordonner la croissance (l’augmentation du volume) avec la prolifération (l’augmentation du nombre de cellules). Il est clairement établi que la taille des cellules est affectée par la disponibilité en nutriment du milieu de culture et par la ploïdie, mais les mécanismes sous-jacents demeurent inconnus. Une étude à l’échelle du génome réalisée chez la levure par l’équipe de M. Tyers a révélée que l’inactivation d’environ 400 gènes conduisait à un volume cellulaire moyen significativement différent de celui de la souche sauvage isogénique. Le contrôle de la taille des cellules est ainsi une situation intéressante dans laquelle de nombreux loci contribuent à un caractère quantitatif complexe. La plupart de ces loci demeurant orphelin de voie de signalisation distincte, leur influence respective reste à élucider. Nous avons commencé cette étude en partant de l’observation qu’un mutant sir2 présentait un volume cellulaire augmenté. De manière cohérente, un traitement au nicotinamide (Nam), un inhibiteur de Sir2, reproduit le défaut de taille de sir2 par un mécanisme dépendant de Sir2p. Nous avons alors pu, par une approche d’épistasie chimique, identifier 22 mutants non affectés par le traitement de la Nam, parmi ~200 mutants de petite taille. De manière surprenante, 16 de ces 22 mutants de taille insensibles à la NAM, sont affectés dans la biogenèse de la grande sous unité du ribosome (60S). Une drogue capable de bloquer spécifiquement la biogenèse tardive de la 60S, la diazaborine, mime le phénotype de taille des mutants de la 60S, produisant des cellules sauvages plus petites. Un ensemble de ~200 mutants de grande taille a été traité à la diazaborine et leur volume mesuré. Cette approche chimiogénétique nous a permis d’identifier 31 mutants insensibles à la diazaborine, incluant swi4 et swi6, deux régulateurs majeurs du cycle cellulaire, critiques pour le contrôle de la taille des cellules. Ces résultats furent confirmés par la construction de double mutants. Ce travail montre qu’il est possible d’organiser des mutants de taille au sein de voies spécifiques et de définir des relations d’épistasie claires entre eux. Nos données indiquent que le contrôle de la taille par cette voie “Sir2-60S” est indépendant des effets de la ploïdie et du contrôle nutritionnel sur la taille des cellules
Cell size homeostasis implies that specific mechanisms are devoted to coordinating growth and proliferation. It is well established that cell size is affected by nutrient availability and ploidy but the underlying mechanisms are not elucidated. A genome wide search for yeast mutants affected for cell volume homeostasis, conducted in the Tyers’lab, revealed that the inactivation of about 400 genes leads to a median cell volume diverging from the isogenic wild-type. The cell size control process is thus a very interesting situation where multiple loci contributing to a complex quantitative trait have been identified but their organisation into distinct pathways and their respective influence remain largely to be elucidated. To address this issue, we started from the observation that a sir2 mutant shows an increased cell size. Consistently, nicotinamide (NAM), a Sir2 inhibitor, mimics the sir2 size defect in a Sir2p-dependent manner. This allowed us to identify among ~200 small size mutants, 22 mutants that were clearly not affected by NAM treatment. Strikingly, 16 out of the 22 NAM unresponsive mutants affected biogenesis of the large ribosomal subunit (named 60S below). Consistently, diazaborine, a drug that blocks the large ribosomal subunit assembly and therefore mimics 60S mutants, rendered wild-type yeast cells smaller. A set of ~200 large mutants were treated with diazaborine and their cell volume was measured. This chemogenetics approach allowed us to identify 31 diazaborine-unresponsive mutants, including swi4 and swi6, two major cell cycle regulators that are critical for cell size control. These results were confirmed by constructing double mutants. This work shows that it is possible to organize cell size mutants in specific pathways and to define clear epistasis relationships between them. Our data indicate that the control of cell size by the “Sir2-60S” pathway is independent of both the ploidy and the nutritional control of cell size

Le MGDG (monogalactosyldiacylglycerol) et le DGDG (digalactosyldiacylglycerol) sont les lipides les plus abondants des membranes du chloroplaste. Ils sont synthétisés exclusivement dans l'enveloppe plastidiale par l'action des MGDG synthases (MGD1, MGD2 et MGD3) et des DGDG synthases (DGD1 et DGD2). Les galactolipides sont essentiels pour la structuration des photosystèmes et la biogenèse des thylacoïdes. En carence de phosphate, les galactolipides deviennent une source de lipides pour composer certaines membranes en dehors du chloroplaste. Suivant une stratégie de criblage pharmacologique à haut débit, une nouvelle molécule appelée galvestine-1 a pu être identifiée et caractérisée comme un inhibiteur des MGDG synthases. La galvestine-1 agit par compétition avec le diacylglycérol. Cet outil moléculaire permet donc de perturber le système complet constitué par l'ensemble des réactions de synthèses, de conversions et de trafics lipidiques, aboutissant à cet état stable que nous appelons homéostasie des lipides. Le but de cette thèse est de mettre en évidence, à l'aide de la galvestine-1, de nouveaux acteurs ou nouvelles voies permettant l'établissement de l'homéostasie lipidique à l'échelle de la cellule végétale. Pour cela, j'ai réalisé un criblage de mutants EMS (ethyl methanesulfonate) dans le but d'isoler des mutants résistants à la galvestine-1 et d'identifier les gènes mutés conférant cette résistance. Des données transcriptomiques (Affymetrix genome array genechip, ATH1) d'Arabidopsis thaliana traité en présence de galvestine-1 ont par ailleurs été obtenues avant le début des travaux de thèse. Ces données ont permis de cibler des gènes dont l'expression variait et possiblement impliqués dans l'homéostasie lipidique. En parallèle de l'approche sans a priori, j'ai donc réalisé une étude suivant une stratégie de gènes candidats sur ALA10, un gène codant pour une flippase putative, sur-exprimé après traitement à la galvestine-1 et en carence de phosphate. Le second volet de cette thèse vise donc à comprendre la relation entre l'expression d'ALA10 et les gènes impliqués dans la synthèse des galactolipides chez la plante.

Le cholestérol est le principal stérol présent dans la rétine. Dans sa forme libre, le cholestérol est distribué dans toutes les couches cellulaires de la rétine, alors que le cholestérol estérifié s'accumule essentiellement à la base de l'épithélium pigmentaire rétinien. La capacité intrinsèque de la rétine à synthétiser le cholestérol paraît limitée, ce qui implique nécessairement que des voies extra-rétiniennes participent activement à suppléer la rétine en cholestérol. Les cellules gliales de Müller contribueraient à l'apport de cholestérol aux neurones de la rétine, en particulier pour la formation des synapses. Les conséquences délétères d'une accumulation ou à l'inverse d'un déficit en cholestérol dans les neurones sur leur survie souligne l'importance de maintenir l'équilibre entre l'apport et la néosynthèse du cholestérol d'une part et son élimination d'autre part. Pour cela, la rétine neurale a en particulier la capacité de convertir, pour l'éliminer, le cholestérol en 24S-hydroxycholestérol. En effet, le transport du 24S-hydroxycholestérol au travers des membranes est facilité par la présence d'un groupe hydroxyle supplémentaire, lui conférant une polarité plus importante par rapport au cholestérol. L'enzyme qui catalyse cette réaction est la cholestérol-24S-hydroxylase (CYP46A1). Des liens ont été établis entre CYP46A1, 24S-hydroxycholestérol et processus neurodégénératifs dans le cerveau, suggérant un rôle potentiel dans certaines pathologies comme la maladie d'Alzheimer. CYP46A1 est exprimée dans la rétine neurale, et plus particulièrement dans les cellules ganglionnaires de la rétine. Le rôle de CYP46A1 dans la rétine reste pour l'instant inconnu. Cependant, par analogie avec le cerveau, nous pouvons supposer une fonction dans le contrôle de l'homéostasie du cholestérol dans les neurones et envisager une association avec des pathologies dégénératives de la rétine comme la Dégénérescence Maculaire Liée à l'Âge (DMLA) ou le glaucome. Dans ce contexte, l'objectif de nos travaux a consisté à évaluer le rôle de la cholestérol-24S-hydroxylase dans la rétine en conditions physiologiques et pathologiques. Par une approche clinique, nous avons trouvé qu'un polymorphisme génétique dans CYP46A1 était un facteur de risque de glaucome (Risque relatif=1,26, intervalle de confiance à 95%=1,006-1,574, p<0,05) (Fourgeux et al. 2009, Invest Ophthalmol Vis Sci 50:5712-7). Par contre, ce polymorphisme génétique n'a pas été retrouvé, en tant que tel, comme facteur de risque chez des patients DMLA, mais pourrait l'être chez les patients non porteurs d'allèles à risque dans les gènes CFH et LOC388715 (Fourgeux et al. 2012, Invest Ophthalmol Vis Sci 53:7026-33). Deux approches expérimentales nous ont permis de suggérer qu'il existe un lien entre le stress des cellules de la rétine et le 24S-hydroxycholestérol. En effet, dans une étude in vivo faite chez le rat, après avoir reproduit une caractéristique principale du glaucome par l'augmentation de la pression intraoculaire, nous avons suggéré le rôle crucial de la glie dans le maintien de l'expression de CYP46A1 au cours de la neurodégénérescence de la rétine (Fourgeux et al. 2012, Acta Ophthalmol, Sep 23 ; doi: 10.1111/j.1755-3768.2012.02490.x.). Enfin, l'inhibition pharmacologique de l'activité CYP46A1 dans la rétine par le voriconazole injecté in vivo chez le rat nous a permis de mettre en évidence que la diminution du contenu en 24S-hydroxycholestérol de la rétine était associée à une dysfonction des cellules ganglionnaires, évaluée par électrorétinographie. En parallèle, nous avons observé une activation gliale, dont l'amplitude était amplifiée par l'inhibition de l'activation microgliale induite par la minocycline [...]

Résumé : Chez la levure Saccharomyces cerevisiae, la régulation de la longueur des télomères témoigne de la compensation entre mécanismes d'érosion (exonucléases, réplication semi-conservative et résection), facteurs d’élongation (la télomérase, transcriptase inverse à l'action retrouvée dans 90% des cancers humains) et actions de diverses protéines de régulation télomérique spécifiques, conférant aux télomères leur caractère de « capuchon » protégeant les extrémités des chromosomes eucaryotes. Afin de savoir si les gènes impossibles à déléter, car essentiels à la survie cellulaire, jouent aussi un rôle sur l’homéostasie télomérique, j'ai réalisé un criblage génétique utilisant des mutants tet-off de la levure pour lesquels la sous-expression considérable d'un gène essentiel a été induite de façon conditionnelle. Ceci permet d’étudier les effets qui en résultent sur l’homéostasie des télomères. Au total, mon travail a traité plus de 662 gènes essentiels pour lesquels j'ai analysé le phénotype de longueur des télomères de manière qualitative par comparaison des télomères de souches mutées par rapport à ceux de souches de type sauvage. Puis, grâce à l’amélioration technique que j'ai mise au point, la quantification de la taille des répétitions télomériques de 300 de ces souches a déjà pu être précisément analysée. Il est notable que tous les gènes essentiels étudiés ici ont des effets très différents qui résultent en des chromosomes possédant des télomères de longueur très inégale. Pour près de 40% des mutants analysés, les tailles de télomères sont apparues critiquement différentes de celles normalement présentées par la levure, beaucoup de ces gènes essentiels étant impliqués dans des mécanismes affectant le cycle cellulaire, la réparation, etc. La majorité des gènes criblés apporte un important complément d’information dans une littérature presque inexistante sur les effets de gènes essentiels de la levure au niveau de la biologie des télomères. C’est le cas des mutations de YHR122W (montrant des télomères long) et YOR262W (télomères courts), deux gènes qui sont apparus d'après mes résultats nécessaires au maintien de l'homéostasie télomérique (prenant place dans un grand ensemble de gènes que j’ai dénommé gènes ETL pour Essential for Telomere Length Maintenance).
Abstract : In the yeast Saccharomyces cerevisiae, the regulation of telomere length reflects the offset between erosion mechanisms (exonucleases, semi-conservative replication and resection), elongating factors (via the telomerase reverse transcriptase, which is found in 90 % of human cancers) and actions of various specific telomeric regulatory proteins, which collectively confer telomeres their property of being a "Cap" that protects the ends of eukaryotic chromosomes. To determine whether essential genes that can not be suppressed also play a role in telomere homeostasis, I realized a genetic screen with yeast tet-off mut ants in which a significant under-expression of an essential gene was induced. This allows to study the resulting effects on telomere homeostasis. Overall, my work dealt with more than 662 essential genes for which I analyzed the telomere length phenotypes qualitatively by comparing telomere lengths in mutant strains to those in wild-type strains. Furthermore, via technical improvements that I developed, a quantification of the sizes of telomeric repeats from 300 of these strains was determined. It is notable that all essential genes studied here have very different effects resulting in chromosomes with very unequal lengths of telomeres. For nearly 40% of the analyzed mutants, telomeres sizes appeared to be critically different from those in wt yeast. Many of these essential genes are involved in mechanisms affecting the cell cycle, DNA replication, DNA repair, etc. The majority of genes revealed in our screen provide important additional information to an almost non-existing literature on the effects of essential genes on yeast telomere biology. This is particularly the case for underexpressing the gene YHR122W (yielding long telomeres) and YOR262W (yielding short telomeres). Both genes hence emerged from my results as necessary to maintain telomere homeostasis and collectively they are part of a large set of genes I called ETL genes for Essential for Telomere Length.

SUMO est un peptide modificateur apparenté à l'ubiquitine et impliqué dans de nombreux processus cellulaires. Pour étudier le rôle de la modification par SUMO ou (sumoylation) chez les mammifères, nous avons choisi de cibler Ubc9, l'unique enzyme de conjugaison de SUMO. Afin de contourner la létalité embryonnaire due à l'inactivation constitutive d'Ubc95 j'ai généré des lignées de souris présentant une inactivation partielle ou conditionnelle d'Ubc9. Notre étude met en évidence l'implication de la sumoylation dans les processus de prolifération cellulaire et de croissance d'embryons murins ou de souris adultes. Nous montrons également que l'atténuation de la sumoylation réduit les capacités de transformation de cellules en culture ou greffées sur des souris Nude. L'étude de souris dont l'invalidation d'Ubc9 est induite à l'âge adulte révèle de plus un rôle pour la sumoylation dans le maintien de l'homéostasie intestinale
SUMO is a modifier peptide related to ubiquitin and involved in numerous cellular processes. To investigate the role of the SUMO modification (or sumoylation) in mammals, we chose to target Ubc9, the unique SUMO E2 conjugating enzyme for SUMO. To circumvent the embryonic lethality encountered with the constitutive inactivation of Ubc9,1 generated several mice lines displaying a partial or conditional inactivation of Ubc9. Our study reveals a crosstalk between sumoylation, cellular proliferation and mouse embryonic or adult growth. We also show that partial inactivation of sumoylation impairs the transformation capacities of cells in culture or in xenograft into Nude mice. The study of inducible knock-out mice for Ubc9 reveals an additional role for sumoylation in maintaining the intestinal homeostasis

Les chromodomaines sont présents dans de nombreux régulateurs de la structure chromatinienne. Ils sont très conservés et reconnaissent spécifiquement certaines lysines méthylées sur les histones. Chez la drosophile, l'Enhancer de Trithorax et Polycomb Corto, impliqué dans la répression et dans l'activation transcriptionnelle de nombreux gènes, contient un chromodomaine (CortoCD). La surexpression de CortoCD dans des drosophiles transgéniques montre que c'est un module d'adressage à la chromatine. L'identification par spectrométrie de masse des polypeptides retenus par CortoCD in vitro révèle qu'ils correspondent à des protéines ribosomiques nucléaires (RPs). Je me suis concentrée sur l'une d'entre elle, RPL12, car les homologues de cette dernière dans d'autres espèces possèdent de nombreux résidus lysines méthylés. J'ai montré que CortoCD reconnaît spécifiquement la lysine 3 de RPL12 triméthylée (RPL12K3me3). De plus, Corto et RPL12 co-localisent avec des marques épigénétiques activatrices sur les chromosomes polytènes. L'analyse par ChIP (immunoprécipitation de la chromatine), de deux cibles transcriptionnelles de Corto et RPL12, révèle que ces deux protéines sont localisées dans le corps des gènes et ne sont pas enrichies sur les promoteurs, suggèrant un rôle dans l'élongation de la transcription. Des analyses transcriptomiques (RNAseq) montrent que Corto et RPL12 régulent majoritairement des gènes impliqués dans la biogenèse des ribosomes. Nos résultats mettent en évidence pour la première fois une coopération entre une protéine ribosomique et un facteur de maintien de la mémoire épigénétique dans la régulation transcriptionnelle. Les chromodomaines sont présents dans de nombreux régulateurs de la structure chromatinienne. Ils sont très conservés et reconnaissent spécifiquement certaines lysines méthylées sur les histones. Chez la drosophile, l'Enhancer de Trithorax et Polycomb Corto, impliqué dans la répression et dans l'activation transcriptionnelle de nombreux gènes, contient un chromodomaine (CortoCD). La surexpression de CortoCD dans des drosophiles transgéniques montre que c'est un module d'adressage à la chromatine. L'identification par spectrométrie de masse des polypeptides retenus par CortoCD in vitro révèle qu'ils correspondent à des protéines ribosomiques nucléaires (RPs). Je me suis concentrée sur l'une d'entre elle, RPL12, car les homologues de cette dernière dans d'autres espèces possèdent de nombreux résidus lysines méthylés. J'ai montré que CortoCD reconnaît spécifiquement la lysine 3 de RPL12 triméthylée (RPL12K3me3). De plus, Corto et RPL12 co-localisent avec des marques épigénétiques activatrices sur les chromosomes polytènes. L'analyse par ChIP (immunoprécipitation de la chromatine), de deux cibles transcriptionnelles de Corto et RPL12, révèle que ces deux protéines sont localisées dans le corps des gènes et ne sont pas enrichies sur les promoteurs, suggèrant un rôle dans l'élongation de la transcription. Des analyses transcriptomiques (RNAseq) montrent que Corto et RPL12 régulent majoritairement des gènes impliqués dans la biogenèse des ribosomes. Nos résultats mettent en évidence pour la première fois une coopération entre une protéine ribosomique et un facteur de maintien de la mémoire épigénétique dans la régulation transcriptionnelle.

L’hepcidine est une hormone hépatique qui joue un rôle central dans la régulation de l’homéostasie du fer. Son expression diminue en réponse à la déficience en fer et l’hypoxie, conditions où l’absorption intestinale du fer est augmentée. Les facteurs HIF (Hypoxia Inducible Factors), HIF-1 et HIF-2, sont de facteurs de transcription régulés par le fer et l’hypoxie et sont les régulateurs centraux de l’homéostasie de l’oxygène chez les mammifères. Durant ma thèse, j’ai produit des modèles murins invalidés pour HIF dans le foie ou l’intestin afin d’explorer dans des conditions physiopathologiques le lien entre la signalisation HIF et i) la régulation de l’expression hépatique de l’hepcidine et ii) la régulation de l’absorption intestinale du fer. J’ai montré que, HIF-2 dans le foie n’est pas nécessaire à la répression de l’hépcidine par la déficience en fer ou l’hypoxie. En revanche, j’ai mis en évidence le rôle crucial joué par ce facteur qui, stabilisé en conditions physiopathologiques, peut induire indirectement la repression de l’hepcidine via la production de l’erythropoietine (EPO. Au niveau de l’intestin, j’ai montré que HIF-2, et non HIF-1, contrôle l’absorption intéstinale du fer en régulant l’expression de protéines DMT1 (Divalent Metal Transporter 1) et DCYTB (Duodenal cytochrome b) qui permettent le transport du fer dans les entérocytes. J’ai finalement montré que HIF-2 est impliqué dans la régulation de l’hyperabsorption du fer dans un modèle de souris génétiquement modifiées qui présentent des symptômes d’hémochromatose héréditaire (HH). HH est une maladie génétique caractérisée par un faible taux d’hepcidine et une accumulation excessive de fer dans le foie et d’autres organes. Ainsi, ces résultats suggèrent un rôle prédominant de HIF-2 dans la régulation physiopathologique de l’absorption intestinale du fer et ouvre la perspective de nouveaux traitements thérapeutiques de l’anémie et des maladies reliées à une surcharge en fer
Hepcidin, a liver expressed hormone, is the central regulator of iron homeostasis and is decreased in response to hypoxia and iron deficiency. In contrast, intestinal iron absorption is upregulated during these conditions. Hypoxia Inducible Factors, HIF-1 and HIF-2, are ironand hypoxia-regulated transcription factors, and the central regulators of mammalian oxygen homeostasis. During my thesis, I generated intestinal-specific and liver-specific HIF knockout mouse models in order to investigate in physiopathological conditions the links between HIF signaling and i) the regulation of hepatic hepcidin expression, and ii) the regulation of intestinal iron absorption. I demonstrated that HIF-2 is dispensable for the regulation of hepcidin in conditions of iron deficiency or hypoxia. However, I showed that HIF-2, upon stabilized in physiopathological conditions, induces hepcidin repression, indirectly through increased Erythropoietin (EPO) production and the regulation of erythropoiesis. In the intestine, I showed that HIF-2, but not HIF-1, controls iron absorption by regulating the expression of DMT1 (Divalent Metal Transporter-1) and DCYTB (Duodenal cytochrome b) proteins which import iron in the enterocytes. Finally, I demonstrated that HIF-2 is involved in the regulation of iron hyper-absorption in a genetic mouse model of hereditary hemochromatosis (HH). HH is a genetic disorder characterized by abnormally low hepcidin expression and excessive iron accumulation in the liver and parenchyma. These findings suggest a prominent role of HIF-2 in the physiopathological regulation of intestinal iron absorption and may provide new therapeutical perspectives for the treatment of anemias and iron overload-associated disorders

Les télomères sont des structures nucléoprotéiques spécialisées dont l'un des rôles est d'empêcher le raccourcissement progressif de l'extrémité des chromosomes suite à la réplication et à l'instabilité génomique due à la recombinaison de l'extrémité de chromosomes. Malgré le rôle des télomères dans la protection de l'extrémité des chromosomes contre les mécanismes de réparation de l'ADN et de recombinaison, de nombreuses protéines de ces voies jouent des rôles essentiels dans l'homéostasie télomérique et la stabilité des chromosomes. Parmi elles, la protéine RAD50 appartenant au complexe MRE11/RAD50/XRS25(NBS1) et l'endonucléase structure spécifique XPF/ERCC1 sont localisées aux télomères ; ces deux complexes connus pour leur rôle dans les voies de réparation de l'ADN ainsi que dans les études sur la recombinaison. Nous avons identifié deux rôles différents pour la protéine RAD50 dans la maintenance télomérique et dans la protection des extrémités des chromosomes, en contexte de présence et absence de la télomérase. L'absence d'AtRAD50 augmente significativement le nombre de fusions chromosomiques impliquant des télomères raccourcis. Nous proposons que ce rôle protecteur des télomères raccourcis de RAD50 est le résultat de sa fonction de contraindre la recombinaison entre chromatides soeurs et ainsi d'éviter les évènements de fusions par les extrémités. Nous avons recherché le ou des mécanismes impliqué(s) dans ces évènements de fusions chromosomiques chez les mutants atrad50 en réalisant des croisements entre les plantes déficientes pour ATRAD50 et des plantes déficientes pour des gènes codant des protéines des voies de réparation par recombinaison non-homologue et homologue. Au contraire de la situation en cellules de mammifères, nous n'avons pas observé d'instabilité chromosomique chez les plantes mutantes correspondantes pour XPF (AtRAD1) or ERCC1 (AtERCC1). Cependant, en absence de la télomérase, la mutation de l'un de ces deux gènes entraîne une augmentation précose et significative de l'instabilité chromosomique sans accélération générale de la perte des répétitions télomériques, mais associée à la présence de fragments ADN extrachromatiques visibles en cytologie. Une analyse intensive par FISH a permis d'identifier ces ADN comme des bras entiers spécifiques de deux chromosomes. Nos données indiquent un rôle protecteur de RAD1/ERCC1 comme l'invasion de l'ADN simple brin télométrique dans des séquences télomériques interstitielles. Le fait que les mutations de rad1 (ou ercc1) augmentent dramatiquement l'instabilité chromosomique des mutants télomérase a des implications très importantes pour les modèles des rôles de la recombinaison aux télomères.

Bcl11b est un facteur impliqué à la fois dans la répression et l’activation de la transcription. Une étude génétique chez l’Homme a montré une association entre les variations de séquence dans le locus du gène Bcl11b et un risque accrue aux maladies cardiovasculaires. Ceci suggère que l’étude de la fonction de Bcl11b dans le cœur peut présenter un intérêt majeur. Pour cela, nous avons inactivé Bcl11b spécifiquement dans les cardiomyocytes de souris adultes (Bcl11b-HKO) et analysé leur phénotype à plusieurs temps. L’inactivation de Bcl11b chez les souris adultes modifie l’homéostasie des cardiomyocytes 7 jours après le KO et induit une mort cellulaire. Ceci provoque l’activation des mécanismes de réparation et de remodelage cardiaque: inflammation, fibrose, hypertrophie, suivie par une diminution de la fonction contractile deux mois après le KO de Bcl11b. La mort cellulaire a été aussi observée dans des cultures primaires de cardiomyocytes Bcl11b-KO. D’autre part, nous avons observé une perturbation de l’expression des gènes du rythme circadien, et surtout dans la période pré-sommeil chez les souris Bcl11b-HKO. Parallèlement, la fixation de Bcl11b sur la région proximale du promoteur des gènes βMHC, skActin et cActin a été montré dans un contexte hypertrophique grâce à des expériences de ChIP-qPCR. Nous pensons que Bcl11b participera à la régulation de l’expression des gènes impliqués dans l’hypertrophie cardiaque. En conclusion, mes travaux de thèse soulignent l’importance de Bcl11b pour l’homéostasie cardiaque à travers le rôle qu’elle pourrait jouer dans la régulation du rythme circadien cardiaque et son rôle éventuel dans la régulation des mécanismes hypertrophiques
Bcl11b is a transcription factor that acts both as a transcriptional repressor and activator in a context dependent way. A genetic study in humans revealed the association between common genetic variations in the Bcl11b locus and increased risk for cardiovascular disease. Microarray data comparisons showed that Bcl11b could modulate the expression of genes during cardiac hypertrophy. This suggests that studying Bcl11b in the heart may be of major interest. For this, we generated cardiac-specific Bcl11b KO mice (Bcl11b-HKO) and analyzed them at several time points. We observed that the inactivation of Bcl11b in adult mice altered cardiomyocytes’ homeostasis 7 days after Bcl11b’s KO and induced cell death. This causes the activation of repair mechanisms and cardiac remodeling: inflammation, fibrosis, hypertrophy, followed by a decrease in contractile function two months after Bcl11b’s inactivation. Cell death is also observed in Bcl11b-KO primary cardiomyocytes cultures. On the other hand, we observed a disturbance of circadian rhythm gene expression, especially in the pre-sleep period in Bcl11b-HKO mice. In parallel, we characterized the binding of Bcl11b on the proximal promoter region of the βMHC, skActin and cActin genes in a hypertrophic context using ChIP-qPCR experiments. We believe that Bcl11b participates in the regulation of genes involved in cardiac hypertrophy. In conclusion, my thesis work highlights the importance of Bcl11b to cardiac homeostasis through the role it could play in the regulation of cardiac circadian rhythm and its possible role in the regulation of hypertrophic mechanisms

Les galectines forment une famille de lectines solubles impliquées dans de multiples processus. Elles sont caractérisées par la présence d’un domaine de liaison aux carbohydrates conservé au cours de l’évolution et une affinité particulière pour les β-galactosides. Au cours de ce projet doctoral, nous nous sommes intéressés à galectine-7, une lectine exprimée spécifiquement dans les épithéliums pluristratifiés, comme l’épiderme. Grâce aux modèles de souris invalidées pour galectine-7 ou surexprimant galectine-7, notre équipe a précédemment montré que cette protéine était impliquée dans l’adhérence entre les cellules de l’épiderme et dans la migration collective, deux processus clés de la progression tumorale et de la cicatrisation épidermique. Cependant, les mécanismes moléculaires sous-jacents restent à élucider.En combinant différentes approches, nous avons pu déterminer que le retard de migration observé en absence de galectine-7 pouvait s’expliquer, du moins en partie, par une diminution de la coordination et du comportement collectif des kératinocytes en migration. De plus, nos données montrent que galectine-7 interagit directement avec le domaine extracellulaire de la E-cadhérine, un des composants majeurs des jonctions adhérentes et une protéine clé dans la migration collective. De façon surprenante, cette interaction ne fait pas intervenir de groupements carbohydrates. Tentant de préciser le rôle de galectine-7 au niveau des jonctions adhérentes, nous avons identifié une nouvelle fonction de galectine-7 dans la stabilisation de la E-cadhérine à la membrane plasmique. De manière intéressante, l’augmentation du renouvellement de la E-cadhérine à la membrane plasmique causée par l’extinction de galectine-7 est également couplée à une baisse de la force de l’adhérence intercellulaire. Enfin, nos expériences indiquent que cette nouvelle fonction de galectine-7 requiert une activité lectine fonctionnelle, suggérant l’implication d’un autre acteur glycosylé dans ce mécanisme de régulation de la E-cadhérine par galectine-7.En conclusion, ce doctorat a permis de préciser le rôle de galectine-7 dans la migration collective et de découvrir une fonction non-décrite auparavant de galectine-7 dans la régulation de la dynamique de la E-cadhérine. Cette modulation de la E-cadhérine par galectine-7 pourrait permettre à la cellule de s’adapter aux perturbations de l’environnement, comme c’est le cas au cours de la migration collective. En effet, les galectines étant des molécules avec une capacité de redistribution rapide, ce sont de bons candidats pour créer des réponses adaptatives
Galectins composed a family of soluble lectins implicated in multiple processes. They are characterized by the presence of a carbohydrate recognition domain evolutionary conserved and an affinity for β-galactosides containing sugars. During this thesis, we focused on a protein called galectine-7 whose expression is restricted to stratified epithelia such as the epidermis. Using mouse models with altered expression of galectin-7, our team previously showed that this protein participates in intercellular adhesion and collective cell migration, two key processes in tumour progression and epidermal wound healing. However, the underlying mechanisms remain to be elucidated. Combining different approaches, we discovered that the migration delay observed in the absence of galectin-7 during wound healing could be explained, at least in part, by a reduction of cell coordination and collective cell behaviour of migrating keratinocytes. Moreover, our data showed that galectin-7 directly interact with E-cadherin, a key component of adherent junctions and a major player in collective migration. Surprisingly, this binding did not involve carbohydrate groups. Aiming to precise the role of galectin-7 at adherent junctions, we identified a new function of galectin-7 in the stabilisation of E-cadherin at the plasma membrane. Interestingly, the increased of E-cadherin turnover caused by galectin-7 extinction is also associated to a decreased of the strength of adherent junctions-based intercellular adhesion. Eventually, our experiments indicated that this previously unknown function of galectin-7 required a functional lectin activity, suggesting the involvement of an additional glycosylated actor in this regulation mechanism of E-cadherin dynamics by galectin-7.In conclusion, this thesis allowed to precise the role of galectin-7 in collective cell migration and revealed a novel function of galectin-7 in the regulation of the E-cadherin stability at the plasma membrane. This modulatory effect of galectin-7 on E-cadherin could provide the cell a possible adaptive response to environmental perturbations, as during collective cell migration. Indeed, galectins, because they exhibit rapid redistribution capacities, are good candidates to create adaptive responses

L'hématopoïèse est le processus de formation des cellules sanguines. Une régulation fine de ce processus permet d'assurer le remplacement de ces cellules et d'adapter leur production aux conditions environnementales. Chez la Drosophile, comme chez les vertébrés, l'hématopoïèse s'effectue en deux vagues. La première, qui prend place pendant l'embryogenèse, permet la genèse de cellules qui vont persister dans la circulation pendant tout le développement de l'animal jusqu'au stade adulte. La deuxième vague a lieu durant les stades larvaires dans un organe spécialisé, la glande lymphatique. Les cellules hématopoïétiques, nommées hémocytes, assurent des fonctions développementales et défensives. Les hémocytes sont donc des acteurs de l'immunité qui est uniquement de type innée chez cet insecte. Les deux principaux types d'hémocytes sont les plasmatocytes qui sont des macrophages et les cellules à cristaux qui participent à la mélanisation. Le troisième type cellulaire, les lamellocytes, sont uniquement générés durant la vie larvaire en réponse à certaines situations de stress telle que l'infection des larves par des oeufs de guêpe parasitoïde. Cette infection va induire une réponse immunitaire coordonnée impliquant à la fois les cellules sanguines circulantes et celles de la glande lymphatique pour aboutir à l'encapsulation du parasite par les lamellocytes. D'autre part, des mutations génétiques sont connues pour induire la différentiation massive de ces cellules en absence d'infection. La production inappropriée de ces cellules s'accompagne alors fréquemment d'une réaction d'encapsulation détectable par la formation d'amas d'hémocytes mélanisés, historiquement appelés " tumeurs mélanotiques ". Le contrôle de l'homéostasie du système hématopoïétique larvaire est donc primordial pour éviter l'apparition de tels désordres et d'assurer un système de défense efficace. L'objectif de mon travail de thèse était de découvrir de nouveaux gènes contrôlant l'homéostasie du système hématopoïétique et de mieux comprendre comment la différenciation des lamellocytes est régulée. Pour cela, Nous avons réalisé un crible génétique visant à découvrir de nouveaux gènes " suppresseurs de tumeurs mélanotiques" en exprimant spécifiquement dans les cellules sanguines des dsRNA permettant d'inhiber la fonction du gène ciblé par interférence à l'ARN. Nous avons criblé avec deux pilotes GAL4 spécifique des hémocytes plus de 1300 lignées UAS-dsRNA, ciblant ainsi environ 10% de l'ensemble gènes de la Drosophile codant pour des protéines. Après une phase de validation, cinquante-neuf gènes dont la perte de fonction conduit à la formation de capsules mélanotiques ont été identifiés, dont 55 n'avaient pas été associés au développement des cellules sanguines auparavant. La majorité des candidats se répartissent en 7 groupes fonctionnels (protéines chaperonnes, protéasome, trafic vésiculaire, protéines ribosomales, métabolisme des mitochondries, réparation de l'ADN, transcription). Grâce à l'utilisation de pilotes GAL4 ciblant différents tissus et sous population d'hémocytes avons montré que la formation de tumeur mélanotiques peut être provoquée par un défaut soit des hémocytes circulant soit de la glande lymphatique mais aussi par un défaut du corps gras, un acteur majeur de réponse immunitaire humorale. Cette stratégie couplée à une analyse de lignage nous a aussi permis de mettre en évidence que des plasmatocytes circulants d'origine embryonnaire peuvent se différencier en lamellocyte. Cette plasticité étonnante est notamment régulée par le cofacteur de transcription de la famille FOG U-shaped, qui est requis de manière cellulaire autonome pour empêcher la transformation des plasmatocytes en lamellocytes
In metazoans, the hematopoietic system plays a key role both in normal development and in defense of the organism. In Drosophila, the cellular immune response involves three types of blood cells: plasmatocytes, crystal cells and lamellocytes. This last cell type is barely present in healthy larvae, but its production is strongly induced upon wasp parasitization or in mutant contexts affecting larval blood cell homeostasis. Notably, several zygotic mutations leading to melanotic mass (or "tumor") formation in larvae have been associated to the deregulated differentiation of lamellocytes. To gain further insights into the gene regulatory network and the mechanisms controlling larval blood cell homeostasis, we conducted a tissue-specific loss of function screen using hemocyte-specific Gal4 drivers and UASdsRNA transgenic lines. By targeting around 10% of the Drosophila genes, this in vivo RNA interference screen allowed us to recover 59 melanotic tumor suppressor genes. In line with previous studies, we show that melanotic tumor formation is associated with the precocious differentiation of stem-cell like blood progenitors in the larval hematopoietic organ (the lymph gland) and the spurious differentiation of lamellocytes. We also find that melanotic tumor formation can be elicited by defects either in the fat body, the embryo-derived hemocytes or the lymph gland. In addition, we provide a definitive confirmation that lymph gland is not the only source of lamellocytes as embryo-derived plasmatocytes can differentiate into lamellocytes either upon wasp infection or upon loss of function of the Friend of GATA cofactor Ushaped. In this study, we identify 55 genes whose function had not been linked to blood cell development or function before in Drosophila. Moreover our analyses reveal an unanticipated plasticity of embryo-derived plasmatocytes, thereby shedding new light on blood cell lineage relationship, and pinpoint the Friend of GATA transcription cofactor U-shaped as a key regulator of the plasmatocyte to lamellocyte transformation

Les plantes produisent une grande diversité de produits naturels parmi lesquels les isoprénoïdes prédominent. Ces molécules ont des fonctions essentielles pour la croissance et le développement : hormones végétales, régulateurs de croissance comme les brassinostéroïdes, pigments photosynthétiques, tous agissant sur des processus biologiques majeurs. Ainsi, la germination, la floraison, la tolérance aux stress thermiques et hydriques, ou la production de semences, sont contrôlées par l’action d’isoprénoïdes. Le but de mon projet est d’identifier par une sélection génétique les éléments régulateurs de l’homéostasie des isoprénoïdes. Pour cela, j’ai réalisé le criblage de suppresseurs de défaut de croissance dans deux mutants de biosynthèse d’isoprénoïdes chez Arabidopsis thaliana et un mutant de signalisation de brassinostéroïdes chez Hordeum vulgare. J’ai par ailleurs étudié la voie de biosynthèse de stérols spécifique ayant lieu dans un type cellulaire particulier, le tube pollinique en croissance
Plants produce a great diversity of natural compounds, among which isoprenoids prevail. These molecules have essential functions for growth and development: plant hormones, growth regulators as brassinosteroids, photosynthetic pigments, acting on major biological processes. Thus, germination, flowering, heat and draught stress tolerance, or seed production are controlled by the action of isoprenoids. The aim of my project is to identify by genetic selection the regulators of isoprenoid homeostasis. For this, I carried out genetic screens for suppressors of growth defects in two isoprenoid biosynthesis deficient Arabidopsis thaliana mutants and a brassinosteroid signaling Hordeum vulgare mutant. The second part of my project was focused on the specific sterol biosynthetic pathway occurring in a specialized cell type, the germinating pollen tube

L'élucidation des propriétés du réseau métabolique est fondamentale pour la compréhension du fonctionnement cellulaire et pour l'élaboration de stratégies d'ingénierie métabolique. L'objectif de cette thèse était de mieux comprendre la régulation du métabolisme du NADPH, un métabolite "hub" qui joue un rôle central dans de nombreux processus cellulaires, chez Saccharomyces cerevisiae en fermentation. Nous avons utilisé une démarche systématique couplant modélisation et approches multi-“omics” pour étudier de façon quantitative la réponse à une perturbation de la demande en NADPH. Un système expérimental original, basé sur l'expression d'une butanediol déshydrogénase modifiée NADPH-dépendante a été utilisé pour augmenter de façon contrôlée la demande en NADPH. L'utilisation de ce dispositif, le développement et l'utilisation d'un modèle stœchiométrique de la levure dédié à la fermentation ont permis de prédire la répartition des flux pour différents niveaux de perturbation. Ces analyses ont montré, en premier lieu, la très grande capacité de la levure à faire face à des demandes très importantes de NADPH représentant jusqu'à 40 fois la demande anabolique. Pour des demandes modérées (allant jusqu'à 20 fois la demande anabolique), la perturbation est principalement compensée par une augmentation du flux à travers la voie des pentoses phosphate (VPP) et à moindre titre à travers la voie acétate (Ald6p). Pour une forte demande en NADPH, correspondant à 40 fois la demande anabolique, le modèle prédit la saturation de la VPP ainsi que la mise en place du cycle glycérol-DHA, qui permet l'échange du NADH en NADPH. Des analyses fluxomique (13C), métabolomique et transcriptomique, ont permis de valider ces hypothèses et de les compléter. Nous avons mis en évidence différents niveaux de régulation selon l'intensité de la perturbation : pour les demandes modérées, les flux sont réajustés par un contrôle au niveau enzymatique ; pour de fortes demandes, un contrôle transcriptionnel de plusieurs gènes de la VPP ainsi que de certains gènes des voies de biosynthèse des acides aminés est observé, cet effet résultant probablement de la moindre disponibilité en NADPH. Dans l'ensemble, ce travail a apporté un nouvel éclairage sur les mécanismes impliqués dans l'homéostasie du NADPH et plus généralement dans l'équilibre redox intracellulaire
The elucidation of the properties of metabolic network is essential to increase our understanding of cellular function and to design metabolic engineering strategies. The objective of this thesis was to better understand the regulation of the metabolism of NADPH, a “hub” metabolite which plays a central role in many cellular processes in Saccharomyces cerevisiae during fermentation. We used a systematic approach combining modeling and multi-“omics” analyses to study quantitatively the response to a perturbation of the NADPH demand. An original experimental system, based on the expression of a modified NADPH-dependent butanediol dehydrogenase was used to increase the demand for NADPH in a controlled manner. Through the use of this device and the development and use of a stoichiometric model of yeast dedicated to the fermentation, we predicted the flux distribution for different levels of perturbation. These experiments showed, first, the overwhelming ability of yeast to cope with very high NADPH demand, up to 40 times the anabolic demand. For a moderate level (up to 20 times the anabolic demand), the perturbation is mainly compensated by increased flux through the pentose phosphate pathway (PPP) and to a lesser extent through the acetate pathway (Ald6p). For a high NADPH demand, corresponding to 40 times the anabolic demand, the model predicts the saturation of the PPP as well as the operation of the glycerol-DHA cycle, which allows the exchange of NADH to NADPH. Fluxomics (13C), metabolomics and transcriptomics data were used to validate and to complement these hypotheses. We showed different levels of control depending on the intensity of the perturbation: for moderate demands, flux remodeling is mainly achieved by enzymatic control; for a high demand, a transcriptional control is observed for several genes of the PPP as well as some genes of the amino acids biosynthetic pathways, this latter effect being likely due to the low NADPH availability. Overall, this work has shed new light on the mechanisms governing NADPH homeostasis and more generally the intracellular redox balance

La réponse au stress oxydatif joue un rôle important dans de nombreux processus d’adaptation biologique. Les sélénoprotéines jouent un rôle clef dans le contrôle du stress oxydatif. Des mutations du gène codant pour la sélénoproteine N (SelN) sont la cause de différentes formes de dystrophies musculaires chez l’Homme mais la fonction moléculaire de SelN reste inconnue. Au cours de ma thèse j’ai cherché à déterminer la fonction moléculaire de SelN, et son rôle dans les mécanismes de régulation Rédox. Le modèle de souris Sepn1-/- a constitué l’outil central permettant de répondre à ces objectifs.Les principaux résultats ont révélé une sensibilité particulière des souris Sepn1-/- à certains agents inducteurs de stress oxydatif ou réticulaire. J’ai également caractérisé le modèle Sepn1-/- par séquençage haut débit, en comparant les muscles paravertébraux d’animaux Sepn1-/- et sauvages. Les résultats montrent que malgré l’absence de phénotype musculaire, il y a activation de 580 gènes codant pour des protéines secrétées et mettent en avant l’activation d’un certain nombre de voies métaboliques. Ces résultats participent à une meilleure caractérisation du rôle de la sélénoprotéine N dans le réticulum endoplasmique
Oxidative stress response plays a major function in the adaptation of biological systems. Selenoproteins have a main role in oxidative stress control. Mutations in the gene coding for the selenoprotein N (SelN) cause different muscular dystrophies in Humans but the molecular function of SelN is still unknown. The main objective of my PhD was to determine the molecular function of SelN, and its role in Redox regulation mechanisms. The Sepn1-/- mouse model was a central tool to reach those objectives.The key results revealed a higher sensibility of Sepn1-/- mice to specific oxidative or reticular stress inducers. Moreover, the Sepn1-/- mouse model was characterized by high throughput sequencing, comparing gene expression of paravertebral muscle of Sepn1-/- and wild type animals. Results showed activation of 580 genes in Sepn1-/- mice despite the absence of muscular phenotype in those conditions. Activated genes are coding for secreted proteins and indicated the activation of several metabolic pathways. Those results participated to Sel N function determination in the endoplasmic reticulum

Sox9 est un facteur de transcription exprimé au cours du développement de l'intestin et son expression est maintenue à l'âge adulte dans trois populations cellulaires : les cellules souches, les cellules de Paneth, et les cellules tuft. L'inactivation de Sox9 dans l'épithélium intestinal embryonnaire entraîne, chez l'adulte, une hyperplasie des cryptes ainsi que l'absence de cellules de Paneth. Ce projet de thèse vise à déterminer le rôle de Sox9 dans les cellules de Paneth (dont la fonction est altérée chez les patients atteints de la maladie de Crohn), à identifier les mécanismes par lesquels Sox9 régule la prolifération et à proposer des cibles de Sox9 dans les cellules tuft. À l'aide de modèles murins d'inactivation de Sox9 au niveau de l'épithélium intestinal adulte, nous avons montré que la perte de ce facteur conduit à une augmentation de la prolifération dans les cryptes, confirmant ainsi que Sox9 régule négativement ce processus. Nos résultats indiquent que Sox9 est essentiel au maintien de l'identité des cellules de Paneth et nous proposons qu'il assure cette fonction en réprimant des gènes requis pour la différenciation des cellules de Goblet : Muc2 et Klf4. La perte de Sox9 dans les cellules de Paneth s'accompagne d'une réduction importante des molécules antimicrobiennes, ce qui entraîne une dysbiose intestinale. Dans un environnement spécifique (en présence du « mouse norovirus »), les souris déficientes en Sox9 présentent une perméabilité intestinale augmentée et une susceptibilité à l'inflammation accrue. Les dysfonctionnements des réponses antimicrobiennes et immunitaires dans notre modèle sont comparables à ceux observés chez les patients atteints de la maladie de Crohn, suggérant une implication potentielle de Sox9 dans cette pathologie. De plus, ces altérations pourraient expliquer l'augmentation de l'apparition des tumeurs observée chez les souris dont l'épithélium intestinal est déficient en Sox9, dans le contexte d'une mutation du gène suppresseur de tumeur Apc. Enfin, nous avons identifié des gènes potentiellement régulés par Sox9 qui pourraient expliquer son rôle dans le contrôle de la prolifération. Ces découvertes seront importantes pour mieux comprendre le processus du renouvellement de l'épithélium intestinal et identifier précisément le rôle de Sox9 dans le maintien de l'homéostasie et au cours du processus de la tumorigenèse intestinale
Sox9 is a transcription factor expressed during the intestinal development and its expression is maintained throughout adult age in at least three populations of cells: stem cells, Paneth cells and tuft cells. Sox9 inactivation in the embryonic intestinal epithelium leads to crypts hyperplasia and to the loss of the Paneth cell lineage. The aim of this project is to determine Sox9 function in the adult intestinal epithelium, especially its role in Paneth cells (which function is altered in patients affected by inflammatory diseases such as Crohn disease), to identify how Sox9 controls proliferation and to propose molecular targets of Sox9 in tuft cells. Using mice models to inactivate Sox9 in adult intestinal epithelium, we could show that Sox9 is required to limit proliferation in the crypts, thus validating the hypothesis that Sox9 regulates negatively proliferation. Our results indicate that Sox9 is essential to maintain Paneth cells identity and we proposed that it ensures this function by repressing genes specific for Goblet cells differentiation: Muc2 and Klf4. Loss of Sox9 in Paneth cells is associated with a reduction of antimicrobial molecules which causes intestinal dysbiosis. In a specific environment (in presence of the « mouse norovirus »), Sox9-deficient mice have a defective intestinal permeability and are more susceptible to inflammation. The dysfunctions of the mucosal defences and of immunity responses in our model resemble those observed in Crohn patients, thus suggesting a potential implication of Sox9 in this pathology. In addition, these alterations could be responsible for the increased susceptibility of our deficient model to develop tumors in the context of a mutation of the tumor suppressor gene Apc. We started to unravel potential molecular targets of Sox9 that are involved in the control of proliferation, that will be important to better understand Sox9 function in the intestinal epithelium self-renewal and to identify precisely Sox9 function to maintain homeostasis and during intestinal tumorigenesis

L’apport de fer est essentiel pour la plupart des organismes vivants, incluant la majorité des bactéries pathogènes. Cependant, le fer libre est toxique : il est lié à des protéines de stockage et de transport (e.g. ferritine, hémoprotéines…) et voit son homéostasie finement régulée. Afin d’extraire le fer de ces protéines, les bactéries utilisent divers systèmes tels que des protéines de surface ou encore des sidérophores. Bacillus cereus est une bactérie Gram-positive sporulante, pathogène opportuniste chez l’homme, 2ème cause en France de toxi-infection alimentaire collective. Chez B. cereus, la protéine de surface IlsA et le sidérophore bacillibactine (BB) sont impliqués dans l’acquisition du fer de la ferritine exogène et elles sont importantes pour l’infection de l’insecte modèle Galleria mellonella. Mes travaux présentaient deux parties : tout d’abord, l’étude de l’import du complexe BB-Fe3+ dans la cellule par FeuA, protéine de liaison de ce complexe à la surface de la bactérie, souligne le rôle central du couple BB-FeuA. La délétion des gènes codants pour ces deux molécules limite l’acquisition par B. cereus du fer de la ferritine, de l’hème, de l’hémoglobine et du fer inorganique in vitro. En revanche, elle présente un phénotype de virulence in vivo comparable à la souche de référence dans le cas d’injection intra-hémocœlique de larves de G. mellonella. Ce résultat surprenant suggère un probable rétrocontrôle sur l’expression de facteurs de virulence lorsque B. cereus ne produit ni BB ni FeuA, et se trouve par conséquent fortement carencé en fer. Le second volet de mes travaux s’intéresse à l’expression des gènes liés à l’homéostasie du fer in vivo, au cours de l’infection de l’intestin de larves de G. mellonella axéniques. Nous avons choisi une approche de type microgénomique, en prélevant les échantillons par microdissection laser, sur de façon à prélever de petits échantillons dans une zone définie, puis en analysant l’expression de quelques gènes ciblés par RT-qPCR et ddPCR à 3h et 16h post ingestion. Nos résultats montrent que : i) la colonisation intestinale de G. mellonella est impactée lorsque B. cereus est dépourvu du couple BB-FeuA ; ii) ilsA est exprimé lors de l’infection intestinale ; iii) les gènes ciblés impliqués dans l’homéostasie du fer sont activés dès le début de l’infection, suggérant un rôle dans l’adaptation et la pathogénicité ; iv) une faible modulation de l’expression est observée entre les deux temps. Ces travaux ouvrent de nouvelles connaissances fondamentales sur l’homéostasie du fer et des perspectives quant à l’utilisation de nouvelles techniques pour l’étude in situ des interactions hôte-pathogène
Iron acquisition is essential for most living organisms, including many pathogenic bacteria. However, free iron is toxic: it is bound into storage or transport proteins (e.g. ferritin, hemoproteins…) and iron homeostasis is tightly regulated. To scavenge iron from these sources, bacteria possess several systems to acquire the bound iron, by surface proteins or siderophores. Bacillus cereus is a sporeforming Gram-positive bacterium, opportunistic human pathogen, 2nd cause of food-borne disease in France. It has been demonstrated that the B. cereus surface protein IlsA and the siderophore bacillibactin (BB) are involved in iron acquisition from ferritin and that these two molecules are important for infection of the insect model G. mellonella. My thesis project focused on two parts: first the study of the BB-Fe3+ complex import into the cell by the siderophore binding protein FeuA highlights the central role of both BB and FeuA. The deletion of the genes encoding for these two molecules limits iron acquisition by B. cereus from ferritin, heme, hemoglobin and inorganic iron in vitro. On the other hand, the virulence phenotype during intra-haemocelic infection of G. mellonella is similar to the Wild-type strain. These results suggest a possible feedback on the expression of virulence factor genes when B. cereus is unable to synthetize both BB and FeuA, and therefore are under high stress. The second part of my work focused on the expression of genes involved in iron homeostasis in vivo, during gut infection of germ-free larvae of G. mellonella. We chose to perform a microgenomic approach, using laser-capture microdissection to get small samples in targeted areas, and then analysing the expression of chosen genes by RT-qPCR and ddPCR at two time points post ingestion The results show that : i) the colonisation of G. mellonella gut is impacted when B. cereus is deprived of both BB and FeuA ; ii) ilsA is expressed during gut infection ; iii) iron homeostasis is involved in adaptation and pathogenicity from the early step of infection of the insect gut ; iv) only weak gene expression modulation occured between the two timepoints This work gives new fundamental knowledge about B. cereus iron homeostasis, and highlights the use of new techniques regarding the in situ study of host-pathogen interactions

Le mélèze d'Europe (Larix decidua) est traditionnellement exploité pour son bois de qualité. Malheureusement, la culture de cette essence hors de son aire de distribution a été un échec. L'hybridation avec le mélèze du Japon (L. kaempferi) est une voie prometteuse, en particulier grâce à l'hétérosis manifesté par cet hybride. Au cours de cette dissertation, nous valorisons les données d'un diallèle multi-site intra- et inter-spécifique d'âge avancé. Le 1er chapitre présente l'analyse de traits de production et de qualité du bois. Nous confirmons ainsi l'hétérosis pour les traits liés au volume. Cet hétérosis n’entraîne pas de contrepartie en termes de qualité, et se montre stable d'un site à l'autre.Au contraire, d'autres traits ne présentent pas d'hétérosis, mais davantage d'héritabilité.Les performances additives pour ces traits sont stables d'un site à l'autre, et en espèce pure vs. en hybridation. Au cours du 2ème chapitre, nous nous intéressons au rôle de la plasticité phénotypique de traits de formation du bois dans la construction de l'hétérosis.Le mélèze hybride apparaît comme le taxon le plus plastique : tout comme ses espèces parentes, il produit un cerne de croissance étroit en conditions hydriques limitantes, mais sa croissance radiale surpasse celle de ses parents quand l'eau est abondante. Ce 2èmechapitre est également un premier pas vers la compréhension du rôle de la plasticité phénotypique dans la construction de l'architecture de la variance génétique entre la circonférence et la densité des troncs. Cette thèse se termine sur une synthèse, au cours de laquelle nous discutons les retombées de nos résultats pour l'amélioration du mélèze hybride
European larch (Larix decidua) has been historically exploited within its natural rangefor its high quality wood, but the attempt to grow this species outside its native range was a failure. Hybridization with Japanese larch (L. kaempferi) is a promising path, in particular because of the heterosis this hybrid manifests. In this dissertation, we took advantage ofan old-enough, multi-site experiment with an inter-/intra-specific mating design. The first chapter presents the analysis of several traits involved in wood quality and productivity. We confirmed heterosis for volume related traits. The heterosis came with no counter part inwood quality, and it was stable across sites. Contrarily, some other traits showed no heterosis but higher heritabilities, and the additive performances for these traits were stable across sites and in pure species vs. in hybridization. In the second chapter, we investigated the role of phenotypic plasticity of some wood formation traits in the construction of the heterosis. Hybrid larch appeared as the most plastic taxon: it equaled the parental controls in producing narrow growth increments under drought, but it produced the largest rings in favorable water availability conditions. This second chapter was also a first step towards a better understanding of the role of phenotypic plasticity on the construction of the genetic variance architecture between larch stem circumference and density. The dissertation ends with a synthesis in which we discussed the implicationof our findings for the breeding of hybrid larch

Le tabagisme est reconnu comme une dépendance comparable aux autres dépendances : alcool, opiacées et autres psycho-stimulants. Les mécanismes responsables de l'initiation et du maintien de l'addiction sont également impliqués dans les déviations comportementales en général, comme les déviations nutritionnelles, les compulsions.... La nicotine de la feuille de tabac est très toxique, dès son absorption, elle atteint le cerveau et tout l'organisme, active ses récepteurs et produit des effets toxiques et des adaptations homéostatiques. L'importance de ses effets va dépendre de la dose, du mode d'administration, de la chronicité, de l'effet considéré, du génome considéré et des interactions avec son principal dérivé, la cotinine. La cotinine résulte de l'addition d'un atome d'oxygène en position α du noyau pyrrolidine. Les conséquences de cette métabolisation ont été évaluées, dans l'étude présente, en partant des structures chimiques de ces deux alcaloïdes jusqu'à l'isolement des mécanismes biochimiques, neurochimiques, moléculaires et comportementaux de leurs actions. Ces différents mécanismes ont été validés par une étude intégrative en pointant le monoxyde d'azote NO comme un médiateur de la dépendance tabagique, en accord avec les données de l'étude bibliographique qui impliquent ce même médiateur dans toutes les dépendances. Les mécanismes à la base des prédispositions, le début et les raisons de l'évolution vers un état dépendant et les raisons des rechutes font l'objet d'intenses investigations. Les travaux dans ce domaine suggèrent que certaines modifications des protéines transmettent un signal de longue durée et que les espèces réactives de l'oxygène et du nitrogène sont à la base des mécanismes de potentialisation et de dépression à long terme. Notre travail montre une absence de toxicité pour la cotinine [422,423], une activité psychostimulante pure [414], une pharmacologie nouvelle non nicotinique [416,417,419,422,423], un passage actif [415] dans le cerveau régulé par le système nicotinique périphérique [412,421], la forme endogène et exogène de la cotinine [424], la médiation d'activité anti stress du récepteur p40 de la cotinine [420] et son homologie avec les protéines humaines impliquées dans les réactions inflammatoires [36,161], stimulatrice paracrine de la croissance cellulaire [55], un rôle dans la libération de dopamine, la production d'un stress oxydant par l'administration de la cotinine [418], un renforcement dans le contexte des approches flexibles, la participation forte des états émotionnels et d'anxiété à l'action anxiolytique de l'administration et anxiogène du retrait de la cotinine. Ils permettent de proposer que la nicotine agit directement et indirectement par sa conversion en cotinine. Cette dernière agit par ses récepteurs, au niveau central par la p40, pour moduler les taux de dopamine avec des conséquences sur l'apprentissage, la récompense, le stress oxydatif, l'anxiété et les réponses potentialisées et déprimées à long terme. Comme conclusion, nos travaux permettent de proposer de nouvelles cibles pharmacologiques, méthodes et concepts permettant de comprendre à l'échelle biochimique, neurochimique, moléculaire et comportemental l'addiction tabagique. L'espoir est d'utiliser ces connaissances pour différencier les susceptibilités et développer de nouvelles approches préventives et thérapeutiques.

Les protéines sont responsables de pratiquement toutes les fonctions performées au sein du corps cellulaire et de ses alentours. Le contrôle de l’expression génique détermine l’abondance, la localisation et le moment de la production de protéines dans la cellule. Il s’agit de l’un des processus centraux à la régulation de la physiologie et du fonctionnement cellulaire. La moindre perte de balance dans ce complexe système engendre des conséquences majeures sur l’intégrité cellulaire, menant au développement de plusieurs maladies parfois incurables. La traduction de l’ARN messager en produit protéique constitue la dernière étape de l’expression génique. Elle est régulée de plusieurs façons, intrinsèques et extrinsèques à la séquence. Il s’agit également du processus cellulaire le plus coûteux en termes d’énergie. Le profilage des ribosomes (Ribo-Seq) figure parmi les récentes et prometteuses technologies ayant permis une meilleure étude des mécanismes de régulation de la traduction. Ces résultats contiennent toutefois la présence de variabilité et de bruits de nature infondée. Ce travail présente la mise en place d’une stratégie permettant la dissociation de signaux d’origine biologique de ceux ayant une origine technique. Ceci est effectué au travers de la mise en place de profiles consensus de densité ribosomale extrait d’une analyse comparative de plusieurs expériences de Ribo-Seq chez la levure (Saccharomyces cerevisiae). Les signaux biologiques dérivés par les profils consensus correspondent avec les signatures de pauses ribosomales connues, telles que les scores de repliements de l’ARNm et la charge des acides aminés. Épatamment, notre stratégie a également permis l’identification de séquences différentiellement transcrites (DT). Ces dernières jouent un rôle sur la cinétique de la phase d’élongation de la traduction, elles comportent notamment une surreprésentation de codons associés aux modifications des ARNs de transfert (tRNAs). Elles se retrouvent d’ailleurs impliquées dans le maintien de l’homéostase cellulaire, ayant une présence marquée chez des gènes prenants part aux mécanismes de biosynthèse de la macromolécule ribosomale ainsi que chez les ARNms aux sublocalisations cellulaires précises, notamment chez les mitochondries et le réticulum endoplasmique (ER). En plus de démontrer les possibilités de découvertes offertes par la technique du Ribo-Seq, cette étude présente une évidence de la nature dynamique et hétérogène du processus de traduction chez la cellule eucaryote. Elle démontre également le rôle de l’information directement encodée dans la séquence dans l’optimisation générale de l’homéostasie cellulaire.
Proteins are responsible for virtually all functions performed within and in the surroundings of a cell. The control of gene expression, which determines the amount, localisation and timing of protein production in the cell, is the central processes in the regulation of cellular physiology and function. Any disturbance in this complex system can generate important consequences on cellular integrity, sometimes leading to incurable diseases. The translation of messenger RNA into a protein product is the last step of the gene expression mechanism. It can be regulated in manifold ways, both intrinsically and extrinsically to the transcript sequence. It is also the costliest cellular process in terms of energy. Ribosome profiling (Ribo-Seq) is one of the recent and promising technologies making it possible to better study the mechanisms of translation regulation. Its results have however been shown to display variability in reproducibility and to contain noise of uncharted sources. This work presents the implementation of a strategy for dissociating signals of biological origin from those of technical origin. This is performed by the computation of a consensus profile of ribosomal density derived from a comparative analysis of several Ribo-Seq experiments in yeast (Saccharomyces cerevisiae). The biological signals derived by the consensus profiles correspond with signatures of known ribosomal pauses, such as mRNA folding strength and amino acid charges. Amazingly, our strategy also enabled the identification of differentially transcribed (DT) sequences. The latter have shown an over-representation of codons associated with modifications of transfer RNAs (tRNAs). They are also involved in the control of cellular homeostasis, exhibiting a marked presence in genes involved in ribosome biosynthesis as well as in mRNAs with precise translation sub-localization, particularly in mitochondria and the endoplasmic reticulum (ER). In addition to demonstrating the possibilities of discovery offered by the Ribo-Seq technique, this study also presents evidence of the dynamic and heterogeneous nature of the translation process in the eukaryotic cell. It also showcases its diverse regulatory mechanisms and the role of information directly encoded in the sequence in the general optimization of cellular homeostasis.