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Bär, Séverine. "Rôle de l'ectodomaine des glycoprotéines d'enveloppe transmembranaires virales dans les étapes tardives de la fusion membranaire." Paris 7, 2005. http://www.theses.fr/2005PA077005.
Full text
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Minoves, Marie. "Etude fonctionnelle et structurale de la glycoprotéine du virus de la Stomatite Vésiculaire et des Lyssavirus." Electronic Thesis or Diss., université Paris-Saclay, 2024. http://www.theses.fr/2024UPASL068.
Full textAbstract:
Le virus de la stomatite vésiculaire (VSV) est un virus enveloppé appartenant au genre Vésiculovirus et à la famille des Rhabdoviridae. Son unique glycoprotéine G reconnait un récepteur à la surface de la cellule hôte puis, après endocytose du virion, déclenche la fusion membranaire grâce à une transition structurale induite à faible pH depuis la forme pré-fusion de G vers sa forme post-fusion. Par ailleurs, G est la cible des anticorps neutralisant le virus. Les structures cristallographiques des formes pré- et post-fusion de l'ectodomaine soluble de G (i.e. sans sa partie transmembranaire) ont été déterminées par radiocristallographie. Ces structures ont installé G comme étant le prototype des glycoprotéines de fusion de classe III. L'organisation de l'extrémité carboxyterminale de l'ectodomaine et du domaine transmembranaire de G, qui jouent un rôle important durant le processus de fusion, n'est cependant pas connue. Nous avons donc réalisé une étude par cryo-microscopie électronique sur la glycoprotéine complète, purifiée à partir de particules virales, seule ou en complexe avec un anticorps monoclonal. Cette étude nous a permis de compléter les structures de l'ectodomaine dans ses conformations pré et post-fusion. Elle suggère que les domaines transmembranaires sont mobiles au sein de la membrane. Par ailleurs, nous avons résolu deux structures de G en complexe avec un FAb dérivé d'un anticorps neutralisant, reconnaissant à la fois les formes pré- et post-fusion de plusieurs souches de Vésiculovirus. Cette première structure d'un complexe entre G et un anticorps nous a permis de caractériser finement l'épitope, d'identifier les résidus de G clefs dans l'interaction et de proposer un mécanisme de neutralisation. Ce travail augmente de façon significative nos connaissances sur la structure de G qui est la glycoprotéine la plus utilisée en biotechnologie pour délivrer un cargo et en thérapie génique pour le pseudotypage de vecteurs lentiviraux. Nous avons également débuté une étude visant à caractériser les glycoprotéines des Lyssavirus, genre appartenant également à la famille des Rhabdoviridae, et dont le virus de la rage est le prototype. Nous avons produit et purifié les ectodomaines de plusieurs Lyssavirus, et nous avons pu obtenir une structure cristallographique de l'ectodomaine du virus Ikoma (IKOV G) qui correspondrait à un intermédiaire monomérique tardif. Afin de poursuivre le travail de caractérisation de cette structure, plusieurs approches sont en cours. Nous avons notamment réalisé une sélection par phage display de ligands alphaReps dirigés contre IKOV G. Les alphareps sont des protéines artificielles constituées par des répétitions hélicoïdales. 6 des 11 alphareps sélectionnées sont capables de lier IKOV G. La caractérisation des complexes IKOV G est en cours. Nous envisageons i) d'utiliser ces alphareps pour piéger des conformations différentes de G que celle obtenues pour en obtenir la structure par cristallographie ou cryo-EM ii) tester l'activité antivirale des apharep sélectionnéesVesicular stomatitis virus (VSV), an enveloped virus, is the prototype species of the genus Vesiculovirus within the family Rhabdoviridae. Its G glycoprotein is responsible for receptor recognition, on the host cell surface, that triggers clathrin-mediated endocytosis of VSV. Then, within the acidic environment of the endosome, VSV G undergoes a fusogenic conformational change from the pre-fusion form of G to its post-fusion form, leading the fusion of both membranes. G is also the target of virus-neutralizing antibodies. Both structures of the pre- and post-fusion forms of the soluble ectodomain of G (i.e. without its transmembrane part) were determined by radiocrystallography. These structures established G as the prototype of class III fusion glycoproteins. However, the organization of the carboxyterminal part of the ectodomain and the transmembrane domain of G, which play an important role during the fusion process, remains unknown. Therefore, we carried out a cryo-electron microscopy study on the complete glycoprotein, directly purified from viral particles, alone or in complex with a monoclonal antibody. This study led to complete the structures of the ectodomain in its pre- and post-fusion conformations. It also revealed that the transmembrane domains are mobile within the membrane. We have also solved two structures of G in complex with a FAb derived from a neutralizing antibody, recognizing both pre- and post-fusion forms of G from several strains of Vesiculovirus. Based on these first structures of a complex between G and an antibody, we could characterize the epitope, identify the key G residues in the interaction and propose a neutralization mechanism. This work significantly increases our knowledge of the structure of G, which is the most widely used glycoprotein in biotechnology for cargo delivery and in gene therapy (by lentivirus pseudotyping).We also initiated a study aimed at characterizing the glycoproteins of Lyssaviruses, a genus also part of the Rhabdoviridae family, and for which rabies virus is the prototype. We produced and purified the ectodomains of several Lyssaviruses, and we were able to obtain a crystallographic structure of the ectodomain of Ikoma virus (IKOV G), which corresponds to a late monomeric intermediate. Several approaches are underway to further characterize this structure. We also carried out a phage display selection of alphaReps directed against IKOV G. Alphareps are artificial proteins binders consisting of helical repeats. 6 out of 11 alphareps are able to bind IKOVG. Complexes of IKOV G with alphareps are currently being characterized. We plan to i) use these tools as crystallization helpers to trap different conformations of G in crystallography or cryo-EM ii) evaluate the potential antiviral activity of these alphareps
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Mougin, Bruno. "Immunogénicité des glycoprotéines membranaires du virus de la rougeole : influence du vecteur de présentation de l'antigène sur la réponse immunitaire et sur les interactions avec le macrophage." Lyon 1, 1990. http://www.theses.fr/1990LYO1T048.
Full text
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Ciczora, Yann. "Rôles fonctionnels des domaines transmembranaires des glycoprotéines d'enveloppe E1 et E2 du virus de l'hépatite C." Lille 2, 2006. http://www.theses.fr/2006LIL2S064.
Full textAbstract:
Le virus de l’hépatite C (VHC) code pour deux protéines d’enveloppe E1 et E2 associées sous forme d’hétérodimères. Les résidus chargés du domaine transmembranaire (TMD) de E2 (D728 et R730) n’ont pas la même contribution dans les différentes fonctions des TMDs. Bien que ces deux résidus soient nécessaires à la rétention de E2 dans le réticulum endoplasmique, l’acide aspartique est essentiel à la formation des hétérodimères. De plus, la mutation des résidus chargés du TMD de E2 altère l’infectiosité du virus. Nous avons effectué une mutagenèse de substitution tryptophane de chacun des résidus de ces domaines. Nous avons ainsi montré qu’en plus du résidu D728, les glycines 354 et 358 sont en partie responsables de la formation des hétérodimères E1E2. Enfin, nos observations indiquent que les TMDs de E1 et E2 sont impliqués dans l’entrée virale, et notamment dans une étape précoce de la fusion entre les membranes virale et cellulaireHepatitis C virus (HCV) encodes two envelope glycoproteins, E1 and E2 associated as heterodimers. These proteins are essential for virus infectivity. The two charged residues (Asp728 and Arg 730) of transmembrane domain (TMD) of E2 do not contribute equally in the glycoprotein functions. The two charged residues are required for ER retention, but only the aspartic acid is necessary for heterodimerization. Moreover the mutation of this charged residues affects the entry functions of these proteins. We have done a tryptophane scanning mutagenesis of each residue of these segments. The Asp728 and the two glycine residues (Gly354 and Gly358) are required for the formation of the heterodimer. Moreover other residues (Lys370, Leu726, Ala727, Ala729) are also implicated in these interactions. Finally, our observations indicate that the TMDs are also involved in virus entry. Indeed, some mutants of the TMDs of E1 and E2 affected an early step of the fusion between the viral and cell membrane
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Vasiliauskaite, Ieva. "Structural characterization of viral envelope glycoproteins." Electronic Thesis or Diss., Paris 6, 2014. https://accesdistant.sorbonne-universite.fr/login?url=https://theses-intra.sorbonne-universite.fr/2014PA066507.pdf.
Full textAbstract:
Les glycoprotéines virales sont impliquées dans les deux principales étapes d’entrée des virus enveloppés dans leurs cellules hôtes : l’attachement des virus aux récepteurs cellulaires et la fusion des membranes virale et cellulaire. Je me suis d’abord attachée à l’étude structurale de la principale glycoprotéine, E2, de deux hépacivirus : la forme B du virus GB (GBV-B) et le virus de l’hépatite C (HCV). Mes tentatives de cristallisation de l’ectodomaine de la protéine E2 du GBV-B sont restées vaines, mais l’analyse des propriétés de ses fragments a suggéré un rôle de son extrémité C-terminale dans la liaison à son récepteur. En parallèle, j’ai co-cristallisé un peptide synthétique correspondant à la principale boucle de liaison de E2 à son récepteur, avec un fragment d’anticorps dirigé contre cette boucle. Etonnament, le peptide forme une hélice , en nette contradiction avec la conformation étendue adoptée dans un fragment du cœur de E2. Associé à des données biochimiques, cela suggère une flexibilité inattendue de cette région de l’ectodomaine d’E2. Dans un second temps, je me suis intéressée à la glycoprotéine F des baculovirus. J’ai résolu la structure du trimère d’un fragment tryptique de F dans sa conformation post-fusion. Cette structure a validé une prédiction selon laquelle la protéine F était une protéine de fusion de classe I homologue à celle des paramyxovirus. La protéine F des baculovirus est ainsi le premier exemple d’une protéine de fusion de classe I encodée par un virus à ADN. Mes résultats confortent donc l’hypothèse que toutes les protéines F ont un ancêtre commun et suggèrent un lien évolutif intéressant entre les virus à ADN, à ARN et leurs hôtesViral glycoproteins are responsible for the two major steps in entry into host cells by enveloped viruses: 1) attachment to cellular receptor/s and 2) fusion of the viral and cellular membranes. My thesis concentrated first on the structural analysis of the major envelope glycoprotein E2 of two hepaciviruses: GB virus B (GBV-B) and hepatitis C virus (HCV). Crystallization of the GBV-B E2 ectodomain remained unsuccessful, but the characterization of truncated versions of E2 suggested an important role of its C-terminal moiety in receptor binding. In parallel, I co-crystallized a synthetic peptide mimicking HCV E2 with an antibody fragment directed against the major receptor-binding loop of E2 that is targeted by broadly neutralizing antibodies. The structure unexpectedly revealed an α-helical peptide conformation, which is in stark contrast to the extended conformation of this region observed in the structure of an E2 core fragment. Together with further biochemical evidence this suggests an unanticipated structural flexibility within this region in the context of the soluble E2 ectodomain. Secondly, I focused on the structural analysis of the baculovirus glycoprotein F. I determined the crystal structure of the post-fusion trimer of a trypsin-truncated F fragment. This structure confirmed previous predictions that baculovirus F protein adopts a class I fusion protein fold and is homologous to the paramyxovirus F protein. Baculovirus F is therefore the first class I fusion protein encoded by a DNA virus. My results support the hypothesis that F proteins may have a common ancestor and imply interesting evolutionary links between DNA and RNA viruses and their hosts
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Vasiliauskaite, Ieva. "Structural characterization of viral envelope glycoproteins." Thesis, Paris 6, 2014. http://www.theses.fr/2014PA066507/document.
Full textAbstract:
Les glycoprotéines virales sont impliquées dans les deux principales étapes d’entrée des virus enveloppés dans leurs cellules hôtes : l’attachement des virus aux récepteurs cellulaires et la fusion des membranes virale et cellulaire. Je me suis d’abord attachée à l’étude structurale de la principale glycoprotéine, E2, de deux hépacivirus : la forme B du virus GB (GBV-B) et le virus de l’hépatite C (HCV). Mes tentatives de cristallisation de l’ectodomaine de la protéine E2 du GBV-B sont restées vaines, mais l’analyse des propriétés de ses fragments a suggéré un rôle de son extrémité C-terminale dans la liaison à son récepteur. En parallèle, j’ai co-cristallisé un peptide synthétique correspondant à la principale boucle de liaison de E2 à son récepteur, avec un fragment d’anticorps dirigé contre cette boucle. Etonnament, le peptide forme une hélice , en nette contradiction avec la conformation étendue adoptée dans un fragment du cœur de E2. Associé à des données biochimiques, cela suggère une flexibilité inattendue de cette région de l’ectodomaine d’E2. Dans un second temps, je me suis intéressée à la glycoprotéine F des baculovirus. J’ai résolu la structure du trimère d’un fragment tryptique de F dans sa conformation post-fusion. Cette structure a validé une prédiction selon laquelle la protéine F était une protéine de fusion de classe I homologue à celle des paramyxovirus. La protéine F des baculovirus est ainsi le premier exemple d’une protéine de fusion de classe I encodée par un virus à ADN. Mes résultats confortent donc l’hypothèse que toutes les protéines F ont un ancêtre commun et suggèrent un lien évolutif intéressant entre les virus à ADN, à ARN et leurs hôtesViral glycoproteins are responsible for the two major steps in entry into host cells by enveloped viruses: 1) attachment to cellular receptor/s and 2) fusion of the viral and cellular membranes. My thesis concentrated first on the structural analysis of the major envelope glycoprotein E2 of two hepaciviruses: GB virus B (GBV-B) and hepatitis C virus (HCV). Crystallization of the GBV-B E2 ectodomain remained unsuccessful, but the characterization of truncated versions of E2 suggested an important role of its C-terminal moiety in receptor binding. In parallel, I co-crystallized a synthetic peptide mimicking HCV E2 with an antibody fragment directed against the major receptor-binding loop of E2 that is targeted by broadly neutralizing antibodies. The structure unexpectedly revealed an α-helical peptide conformation, which is in stark contrast to the extended conformation of this region observed in the structure of an E2 core fragment. Together with further biochemical evidence this suggests an unanticipated structural flexibility within this region in the context of the soluble E2 ectodomain. Secondly, I focused on the structural analysis of the baculovirus glycoprotein F. I determined the crystal structure of the post-fusion trimer of a trypsin-truncated F fragment. This structure confirmed previous predictions that baculovirus F protein adopts a class I fusion protein fold and is homologous to the paramyxovirus F protein. Baculovirus F is therefore the first class I fusion protein encoded by a DNA virus. My results support the hypothesis that F proteins may have a common ancestor and imply interesting evolutionary links between DNA and RNA viruses and their hosts
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Voss, James. "Chikungunya envelope glycoprotein structure at neutral PH determined by X-ray crystallography." Paris 7, 2011. http://www.theses.fr/2011PA077021.
Full textAbstract:
Le virus de Chikungunya (CHIKV) est un alphavirus émergent, transmis par les moustiques, qui a provoqué des épidémies de maladies débilitantes chez homme pendant les dernières cinq années. L'invasion de CHIKV dans les cellules sensibles est médiée par deux glycoprotéines virales, E1 et E2, qui portent respectivement les boucles de fusion à la membrane et les déterminants antigéniques principaux, et forment une couche protéinique icosaédrique à la surface du virion. La glycoprotéine E2, provenant du clivage par la furine du précurseur p62 (en E3 et E2), est responsable de la liaison au récepteur, tandis que E1 est impliqué dans la fusion membranaire. Dans le cadre d'un effort multidisciplinaire pour comprendre la biologie de CHIKV, nous avons déterminé les structures cristallines de l'hétérodimère précurseur immature (p62-E1; 2. 17 A de résolution) et du complexe mature (E3-E2-E1; 2. 6 A de résolution). Les structures atomiques nous ont permis de faire la synthèse d'une multitude de données génétiques, biochimiques, immunologiques et de microscopie électronique accumulées pendant plusieurs années sur les arbovirus en général. Cette analyse donne une image détaillée de l'architecture fonctionnelle de la couche de surface (25 MDa) des alphavirus. Les structures des complexes matures et immatures de CHIKV a aussi permis de décrire les causes et les mécanismes du changement de conformation des protéines d'enveloppe du virion lors du passage de celui-ci dans l'endosome à pH acide et précédant la fusion membranaireChikungunya is an emerging mosquito-bome alphavirus that has caused widespread outbreaks of debilitating human disease in the past five years. CHIKV invasion of susceptible cells is mediated by two viral glycoproteins, E1 and E2, which carry the main antigenic determinants and form an icosahedral shell at the virion surface. Glycoprotein E2, derived from furin cleavage of the p62 precursor to E3 and E2 is responsible for receptor binding and is the major viral antigen. The E1 protein is responsible for inducing the fusion of viral and cellular membranes in the target cell endosome which is required for release of the viral nucleocapsid into the cytoplasm to initiale infection of a cell. While the structure of E1 has been determined, the structure of E2"has remained elusive over the years. This thesis reports the atomic structures of the mature (E3/E2/E1) and immature (P62/E1) envelope glycoprotein complexes from Chikungunya virus determined by X-ray crystallography using a recombinant protein construct. This construct contained the covalently linked ectodomains of p62 and E1. Diffracting crystals of the purified complexes were obtained at neutral pH when the linker joining the ectodomains was cleaved. The glycoprotein structures were fit into reconstructions of the alphavirus virion obtained from cryo-electron microscopy (cryoEM). This analysis resulted in an inferred atomic model of the entire 25MDa surface of the highly conserved alphavirus virion and allowed for the synthesis of a wealth of genetic, biochemical, immunological and electron microscopy data accumulated over the years on alphaviruses in general
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Lopez, Sandra. "Rôle du cofacteur cellulaire TIP47 dans l'incorporation de la glycoprotéine d'enveloppe dans les particules virales du VIH-1." Paris 7, 2007. http://www.theses.fr/2007PA077170.
Full textAbstract:
La formation de nouveaux virus VIH-1 infectieux requiert la rencontre de trois composants majeurs viraux : la glycoprotéine d'enveloppe (Env), le précurseur Gag et l'ARN génomique. L'incorporation de Env dans la particule virale Gag est une étape cruciale puisqu'elle confère aux virions néoformés la capacité d'infecter de nouvelles cellules cibles. Pourtant les mécanismes qui la président sont largement méconnus. La première partie de mon travail de thèse a permis d'identifier le premier cofacteur cellulaire, TIP47, requis pour l'incorporation de Env. TIP47 permet l'association entre Gag et Env en interagissant simultanément avec le domaine matrice de Gag et avec le domaine cytoplasmique de la sous-unité transmembranaire TMgp41 de Env. L'incorporation de Env VIH-1 est régulée par un mécanisme actif, dans lequel l'interaction entre Gag, TIP47 et Env joue un rôle central. TIP47 est essentiel pour l'incorporation de Env dans des virions produits par divers types cellulaires cibles du VIH-1 comme les lymphocytaires T CD4+ ou les macrophages primaires. La seconde partie de ma thèse a permis la caractérisation d'un nouveau groupe de partenaires du domaine cytoplasmique de la TMgp41 de Env VIH-1 : des facteurs de transcription ancrés dans le réticulum endoplasmique. Env peut ainsi participer à la régulation de diverses voies cellulaires. L'interaction de Env avec l'un de ces facteurs, Luman, inhibe son activation. Luman inhibe l'activité de transactivation des gènes du VIH-1 et Env semble contrecarrer cette inhibition. A l'inverse, ATF6 et SREBP, les deux autres facteurs, qui sont nécessaires pour la replication du virus, seraient quan à eux activés lors de l'infection du VIH-1The formation of new infectious HIV-1 viruses requires the encounter between three major viral components: the envelope glycoprotein (Env), the Gag precursor and the genomic RNA. Env incorporation into the viral Gag particles is a crucial step since it confers to the newly formed virions the capacity to infect new target cells. Yet the mechanisms of Env incorporation are not well known. The first part of my thesis allowed us to identify the first cellular cofactor, TIP47, required for Env incorporation. TIP47 permits the association between Gag and Env by interacting simultaneously with the matrix domain of Gag and with the cytoplasmic domain of the transmembrane subunit TMgp41 of Env. HIV-1 Env incorporation is an active mechanism, in which the interaction between Gag, TIP47 and Env plays a central role. TIP47 is essential for Env incorporation into virions produced by différent target cells of HIV-1, as T CD4+ lymphocytes and primary macrophages. The second part of my thesis allowed the characterization of a new group of partners of the cytoplasmic domain of TMgp41 of HIV-1 Env: transcription factors anchored in the endoplasmic reticulum. Thus, Env can participate in the regulation of different cellular pathways. The interaction between Env and one of these factors, Luman, inhibits its activation. Luman inhibits the transcriptional activity of HIV-1 genes, and Env seems to counteract this inhibition. On the other hand, ATF6 and SREBP, the other factors we identified, are necessary for viral replication and might be activated during HIV-1 infection
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Baquero, Salazar Eduard. "Etude structurale de la glycoprotéine G du virus Chandipura : identification d'intermédiaires fonctionnels durant la transition structurale associée à la fusion." Paris 7, 2013. http://www.theses.fr/2013PA077046.
Full textAbstract:
Les virus enveloppés pénètrent dans les cellules par la fusion membranaire catalysée par des glycoprotéines virales. Les structures cristallines ont fourni, des images statiques des conformation pré- et post-fusion de ces glycoprotéines mais les états intermédiaires restent inconnus. Les glycoprotéines (G) des vésiculovirus forment des assemblages trimériques dans leurs conformations pré- et post-fusion. Ici nous décrivons un unique cristal contenant simultanément un intermédiaire précoce et tardif durant le changement de conformation de la glycoprotéine (G) du virus Chandipura, un vésiculovirus responsable d'encéphalites mortelles. Les deux intermédiaires de G forment un hétérotétramètre (un dimère d'hétérodimère) plat exposant les boucles de fusion à sa surface. La microscopie électronique et la tomographie montrent deux intermédiaires différents à la surface du virus : une structure plate qui induit l'agrégation des virions et une structure allongée monomérique correspondant à l'intermédiaire tardif. Ces résultats ainsi que des données précédemment obtenues sur des mutants de G de plusieurs rhabdovirus, nous permettent de proposeer que le tétramère ou le dimer sont le complexe qui attaque la membrane cible. Dans ce modèle, la transition structurale depuis la forme pré-fusion de G démarre par une étape de monomérisation et se poursuit par une série d'événements au cours de laquelle les monomères sont en mesure de former d'une part le tétramère, au niveau de la zone de contact avec la membrane cible, et d'autre part un réseau de spicules dans leur état post-fusion en dehors de cette zone de contact. Ce dernier réseau serait impliqué dans l'élargissement des pores de fusionEnveloped viruses enter cells through a membrane fusion reaction driven by conformational changes of viral fusion glycoproteins. Crystal structures have provided static pictures of pre- and post-fusion conformations for several of these glycoproteins but structures of intermediates are unknown. Vesiculovirus glycoproteins (G) form trimeric assemblies both in their pre- and post- fusion conformation. We report here a single crystal structure containing two different states of G which correspond to an early and a late intermediate during the conformational change of the glycoprotein G of Chandipura virus, a vesiculovirus responsible for deadly encephalopathies. In the crystal, the two intermediates are associated to form a fusion loop-exposing flat tetramer with twofold symmetry. Consistent with these data, electron microscopy and tomography show two different intermediates at the viral surface depending on experimental conditions : a flat assembly leading to viral aggregation and a monomeric elongated structure which resembles the late intermediate. All this information and previous rhabdoviruses mutants with so far unexplained phenotypes, allowed us to propose that G dimer or tetramer have a role during membrane fusion. We propose a model for G structural transition that is depicted as a series of events in which, after dissociation of the trimeric prefusion state, the resulting monomers are able to form, on the one hand, a tetrameric assembly in the contact zone with the target membrane, and on the other, outside this contact zone, a helical network of spikes in their post-fusion state. This helical network would be involved in fusion pore enlargement
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Vautherot, Jean-François. "Coronavirus entérique bovin : identification des protéines structurales et analyse antigénique des glycoprotéines externes." Lyon 1, 1994. http://www.theses.fr/1994LYO1T273.
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Moulard, Maxime. "Caractérisation de la protéase cellulaire responsable de la maturation des glycoprotéines d'enveloppes virales." Aix-Marseille 2, 1992. http://www.theses.fr/1992AIX22066.
Full textAbstract:
La glycoproteine externe (gp120) et la glycoproteine transmembranaire (gp41) du virus de l'immunodeficience humaine de type 1 (hiv-1) proviennent d'un precurseur commun (gp160) de poids moleculaire 160 kda. Comme c'est le cas de nombreux autres virus, le precurseur gp160 est clive par une endoprotease cellulaire a l'extremite c-terminale de la sequence arg#5#0#8-glu#5#0#9-lys#5#1#0-arg#5#1#1. Ce travail rapporte la mise en evidence et la mise au point d'un modele d'etude de la proteolyse enzymatique de la gp160, utilisant l'endoprotease kex2 de la levure saccharomyces cerevisiae. Nous avons montre que l'enzyme kex2 coupe specifiquement la gp160 pour generer les glycoproteines matures gp120 et gp41. Le mecanisme et la specificite du clivage ont ete apprecies a l'aide des glycoproteines recombinantes et des peptides synthetiques couvrant le site de clivage des precurseurs des glycoproteines des virus hiv-1l, hiv-2 et siv. Finalement, nous avons montre que l'endoprotease kex2 coupe la liaison peptidique du cote c-terminal des paires d'acides amines basiques, probablement au niveau de l'arg#5#1#1
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Vachot, Laurence. "Caractérisation des mécanismes de capture de glycoprotéines d'enveloppe de VIH-1 par le DC-SIGN : application aux glycoprotéines d'isolats primaires de primo-infection." Lyon 1, 2003. http://www.theses.fr/2003LYO10185.
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Denesvre, Caroline. "Étude fonctionnelle des glycoprotéines d'enveloppe des rétrovirus HTLV-I et F-MuLV." Lyon 1, 1995. http://www.theses.fr/1995LYO1T200.
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Bonnafous, Pierre. "Fusion membranaire induite par l'hémagglutinine du virus de la grippe." Toulouse 3, 2000. http://www.theses.fr/2000TOU30196.
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Bouard, David. "La glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale : trafic intracellulaire et recrutement lors de l'assemblage viral." Lyon, École normale supérieure (sciences), 2008. http://www.theses.fr/2008ENSL0471.
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Aslan, Hamide. "Étude moléculaire des glycoprotéines d'attachement des Henipavirus : identification et caractérisation des domaines responsables de l'interaction avec les récepteurs cellulaires, éphrineB2 et éphrineB3." Lyon 1, 2007. http://www.theses.fr/2007LYO10195.
Full textAbstract:
Les Henipavirus, le virus Nipah (VN) et le virus Hendra (VH), sont des virus zoonotiques émergents, responsables de pathologies chez l’homme et les animaux. Leur virulence élevée et l’absence de traitements disponibles ont conduit à leur classification en pathogène de niveau 4. L’entrée de ces virus dans la cellule hôte est sous contrôle de deux glycoprotéines virales, la protéine d’attachement (G) et la protéine de fusion (F). Nous avons identifié plusieurs résidus de la protéine G du VN, importants pour la liaison au récepteur cellulaire, l’éphrine B2. Ces résidus forment un site contigu, localisé à la surface sur le haut de la tête globulaire de la protéine d’attachement du VN. Nous avons également montré que le site de liaison à l’éphrine B2 sur la protéine G du VH se trouvait dans une localisation similaire et impliquait en grande majorité les mêmes résidus. Nous avons également étudié le rôle potentiel de ces résidus dans la liaison à l’éphrine B3, un récepteur alternatif du VN. Nos résultats indiquent que le VH pourrait utiliser l’éphrine B3 comme récepteurThe Henipaviruses - Nipah (NiV) and Hendra (HeV) - are recently emergent zoonotic paramyxoviruses, responsible for pathologies in the man and the animals. Their high virulence and the absence of available treatments led to their classification into P4 pathogens. The entry of these viruses in the host cell is under control of two glycoproteins, the attachment glycoprotein (G) and the fusion protein (F). We identified several residues of the attachment glycoprotein of the NiV (NiV-G), potentially participating in receptor-binding, the ephrinB2. Ours results suggest that a receptor-binding site localizes on the top surface of the NiV-G globular head. We also showed that the site responsible for ephrinB2 interaction on the globular head of the HeV attachment glycoprotein (HeV-G) is in an identical location to that predicted for NiV-G. We also tested the attachment glycoprotein residues of the HeV and NiV for ephrinB3 interaction, an alternate receptor of the NiV. Our results indicate that the HeV could use ephrinB3 as receptor
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Garnier, Florence. "Contribution à l'étude de la réponse du système immunitaire au virus de la rougeole." Lyon 1, 1993. http://www.theses.fr/1993LYO1T212.
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Chanel, Vos Chantal. "Etude du rôle de l' acide aminé histidine 230 dans la boucle ij de la protéine E1 du virus de la Forêt de Semliki dans la fusion membranaire virale." Paris 7, 2005. http://www.theses.fr/2005PA077060.
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Girerd-Chambaz, Yves. "Approche moléculaire des fonctions de l'enveloppe du virus HTLV-I : régulation du gène env et expression des glycoprotéines virales dans des cellules humaines exprimant le récepteur cellulaire du virus." Lyon 1, 1993. http://www.theses.fr/1993LYO1T297.
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Brandler, Samantha. "Etude du mécanisme d'inhibition de la fusion des flavivirus par les anticorps et mise au point d'un candidat vaccin contre la dengue basé sur l'expression d'un antigène d'enveloppe par un vecteur dérivé du vaccin contre la rougeole." Aix-Marseille 1, 2008. http://theses.univ-amu.fr.lama.univ-amu.fr/2008AIX11003.pdf.
Full textAbstract:
La dengue est une maladie ré-émergente qui menace le tiers de la population mondiale, et pour laquelle aucun vaccin n'est disponible. Dans ce travail, nous avons évalué une nouvelle stratégie de vaccination basée sur l'expression d'un antigène combiné du virus de la dengue par un vecteur dérivé du vaccin vivant atténué pédiatrique contre la rougeole. La compréhension des mécanismes de neutralisation des flavivirus par les anticorps est essentielle pour la conception d’approches vaccinales innovantes contre la dengue. C’est pourquoi, dans un premier temps, nous avons étudié le mécanisme de l’inhibition de fusion par des anticorps neutralisants dirigés contre les trois domaines de la protéine d’enveloppe (E). Le virus de l’encéphalite à tiques (TBEV) a été utilisé comme modèle dans des tests de fusion, de neutralisation et d’association aux membranes lipidiques. Les résultats montrent, que les anticorps peuvent interférer avec les étapes précoces ou tardives du processus de fusion. Cette étude montre aussi que les anticorps dirigés contre le domaine III de la protéine E peuvent bloquer à la fois l’entrée et la fusion virale. Pour faire la preuve de concept de notre stratégie de vaccination, nous avons donc inséré dans le vecteur rougeole le domaine III de la glycoprotéine E (EDIII) qui contient le site de liaison au récepteur ainsi que des épitopes neutralisants sérotype-spécifiques. Pour renforcer son immunogénicité, le EDIII a été fusionné à l'ectodomaine pro-apoptotique de la protéine de membrane (ectoM) du VDEN-1. Testé chez des souris sensibles à la rougeole, ce candidat vaccin s’est montré immunogène et capable d'induire des anticorps neutralisants sérotype-spécifiques à long terme. La présence de l'ectoM a été déterminante pour l'immunogénicité du EDIII. Sa capacité adjuvante a été corrélée avec sa capacité à induire la maturation des cellules dendritiques et à favoriser la sécrétion de cytokines pro inflammatoires et antivirales ainsi que des chimiokines impliquées dans l'établissement de l'immunité adaptative. Un candidat rougeole-dengue tétravalent a été ensuite construit dans le but d’induire la même immunité contre les 4 sérotypes du virus de la dengue. Cette stratégie de vaccination combinée rougeole-dengue permettrait d’offrir des vaccins pédiatriques accessibles particulièrement attrayants pour immuniser les enfants simultanément contre la rougeole et la dengue dans des régions du monde où les deux maladies coexistentDengue fever is a reemerging disease that threatens one third of the world's population, for which no vaccine is available. In this work, we evaluated a new vaccination strategy based on the expression of a combined dengue antigen by a vector derived from the pediatric live attenuated measles vaccine. Understanding the mechanisms of flavivirus neutralization by antibodies is essential for the design of innovative vaccine approaches against dengue. Therefore, as a first step, we studied the mechanism of inhibition of fusion by neutralizing antibodies directed against the three domains of the envelope protein (E). The Tick-borne encephalitis virus (TBEV) was used as a model in in vitro fusion tests, and coflottation assays with lipid membranes. The results showed that the neutralizing antibodies can interfere with the early or late stages of the fusion process. This study also shows that antibodies against domain III of the E protein can block both the viral entry and fusion. As a proof-of-concept of our vaccination strategy, we inserted into measles vector the domain III of the glycoprotein E of dengue virus (EDIII), which contains the putative receptor binding site and serotype-specific neutralizing epitopes. To strengthen its immunogenicity, EDIII was fused with the pro-apoptotic ectodomain of the membrane protein (ectoM) of VDEN-1. Tested in mice susceptible to measles, this vaccine candidate was immunogenic and able to induce long term serotype-specific neutralizing antibodies. The presence of the ectoM proved crucial for the immunogenicity of EDIII. Its adjuvant capacity correlated with its ability to mature dendritic cells and to enhance the secretion of proinflammatory and antiviral cytokines, as well as chemokines involved in the development of adaptive immunity. A tetravalent measles-dengue candidate was then generated in order to induce the same immunity against the 4 serotypes of dengue virus. This vaccination strategy combining measles and dengue might offer an affordable pediatric vaccine particularly attractive to immunize children both against measles and dengue fever in areas of the world where the two diseases co-exist
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Roche, Stéphane. "Caractérisation du complexe de fusion des rhabdovirus." Phd thesis, Palaiseau, École polytechnique, 2004. http://www.theses.fr/2004EPXX0050.
Full textAbstract:
La fusion membranaire est un processus biologique courant que l'on retrouve notamment lors de l'exocytose, du trafic intracellulaire ou de l'entrée des virus dans les cellules. Dans le cas des rhabdovirus, une famille où l'on retrouve notamment le virus de la rage (RV) et le virus de la stomatite vésiculaire (VSV),cette fonction est assurée à pH légèrement acide par la glycoprotéine G. Cette protéine existe sous au moins trois conformations distinctes : à pH neutre, elle est présente sous une conformation native (N). Après une brève incubation à pH acide, elle est présente sous une conformation activée (A), sous laquelle elle est capable d'interagir avec une membrane cible par l'intermédiaire d'un peptide hydrophobe. Enfin, après une incubation prolongée à pH acide, elle apparaît sous une conformation inactivée (I) et est alors incapable d'induire la fusion membranaire. Contrairement à toutes les autres familles virales étudiées à ce jour, il existe un équilibre dépendant du pH entre ces conformations. De nombreuses données dans divers systèmes suggèrent qu'une protéine unique ne serait pas suffisante pour catalyser les processus de fusion membranaire, mais qu'au contraire une machinerie constituée d'un nombre plus ou moins important de protéines fusogènes serait nécessaire. Au cours de ce travail, nous avons étudié certaines propriétés du complexe de fusion des rhabdovirus. Nous avons ainsi montré qu'il était de grande taille et qu il était probablement plus grand que ce qui avait été proposé pour d autres familles virales. De plus, il est apparu que le complexe de fusion du virus rabique n avait pas une unique architecture possible, mais qu il existait au contraire divers types de complexe. Ensuite, l'observation par microscopie électronique de particules virales en train de fusionner avec des liposomes nous a montré que le processus de fusion induit par VSV se produisait toujours par la base et qu il s accompagnait d une redisposition complète des glycoprotéines à la surface du virus suivant un réseau hélicoïdal. Enfin, nous sommes parvenu à isoler l ectodomaine de G et à en obtenir des cristaux diffractant à 3,5 Å, ce qui permet d envisager à terme une résolution de la structure de G. L étude de l interaction entre l ectodomaine de G et des liposomes nous a permis de reproduire les réseaux hélicoïdaux observés à la surface du virus et d étudier leurs propriétés. L ensemble de ces données nous a permis de proposer un nouveau modèle pour le processus de fusion chez les rhabdovirus, mais il pourrait également être pertinent pour d autres familles virales.
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Roche, Stéphane. "Caractérisation du complexe de fusion des rhabdovirus." Phd thesis, Palaiseau, Ecole polytechnique, 2004. http://pastel.archives-ouvertes.fr/pastel-00504172/en/.
Full textAbstract:
La fusion membranaire est un processus biologique courant que l'on retrouve notamment lors de l'exocytose, du trafic intracellulaire ou de l'entrée des virus dans les cellules. Dans le cas des rhabdovirus, une famille où l'on retrouve notamment le virus de la rage (RV) et le virus de la stomatite vésiculaire (VSV),cette fonction est assurée à pH légèrement acide par la glycoprotéine G. Cette protéine existe sous au moins trois conformations distinctes : à pH neutre, elle est présente sous une conformation native (N). Après une brève incubation à pH acide, elle est présente sous une conformation activée (A), sous laquelle elle est capable d'interagir avec une membrane cible par l'intermédiaire d'un peptide hydrophobe. Enfin, après une incubation prolongée à pH acide, elle apparaît sous une conformation inactivée (I) et est alors incapable d'induire la fusion membranaire. Contrairement à toutes les autres familles virales étudiées à ce jour, il existe un équilibre dépendant du pH entre ces conformations. De nombreuses données dans divers systèmes suggèrent qu'une protéine unique ne serait pas suffisante pour catalyser les processus de fusion membranaire, mais qu'au contraire une machinerie constituée d'un nombre plus ou moins important de protéines fusogènes serait nécessaire. Au cours de ce travail, nous avons étudié certaines propriétés du complexe de fusion des rhabdovirus. Nous avons ainsi montré qu'il était de grande taille et qu il était probablement plus grand que ce qui avait été proposé pour d autres familles virales. De plus, il est apparu que le complexe de fusion du virus rabique n avait pas une unique architecture possible, mais qu il existait au contraire divers types de complexe. Ensuite, l'observation par microscopie électronique de particules virales en train de fusionner avec des liposomes nous a montré que le processus de fusion induit par VSV se produisait toujours par la base et qu il s accompagnait d une redisposition complète des glycoprotéines à la surface du virus suivant un réseau hélicoïdal. Enfin, nous sommes parvenu à isoler l ectodomaine de G et à en obtenir des cristaux diffractant à 3,5 Å, ce qui permet d envisager à terme une résolution de la structure de G. L étude de l interaction entre l ectodomaine de G et des liposomes nous a permis de reproduire les réseaux hélicoïdaux observés à la surface du virus et d étudier leurs propriétés. L ensemble de ces données nous a permis de proposer un nouveau modèle pour le processus de fusion chez les rhabdovirus, mais il pourrait également être pertinent pour d autres familles virales.
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Nominé, Yves. "Caractérisation biophysique de la qualité des protéines de fusion : application à l'étude structurale et fonctionnelle de l'oncoprotéine virale E6." Strasbourg 1, 2002. https://publication-theses.unistra.fr/public/theses_doctorat/2002/NOMINE_Yves_2002.pdf.
Full textAbstract:
"L'oncoprotéine E6 des papillomavirus humains (HPV) à " haut-risque " est à l'origine du cancer du col de l'utérus. Elle participe à l'oncogénèse notamment en dégradant p53, la protéine cellulaire suppresseur de tumeurs. Le but de la thèse était d'obtenir la structure tridimensionnelle par Résonance Magnétique Nucléaire (RMN) de la protéine E6. Le manuscrit revient d'abord sur les différents états (micro- et macroscopique) d'une protéine globulaire en solution, et sur des notions telles que repliement et stabilité. Il rappelle ensuite les principes et limites de différentes techniques biophysiques appliquées à l'étude de protéines. Enfin, il décrit brièvement le contexte biologique de E6. Bien que sa séquence primaire soit connue depuis 1985, la protéine E6 n'avait pas encore été purifiée. Nous décrivons ici un protocole d'expression et de purification de cette molécule, en montrant tout d'abord que l'expression bactérienne de fusions MBP-E6 (Maltose Binding Protein) génère des " corps d'inclusion solubles ". Ces particules, engendrés par l'agrégation de protéines E6 mal repliées, restent toutefois en solution grâce à la haute solubilité de MBP. Grâce à ces observations, nous avons pu produire des échantillons de la protéine E6 entière soluble et repliée, puis de ses deux domaines à zinc. Nous avons finalement obtenu la détermination de la structure tridimensionnelle par RMN du domaine C-terminal de E6. L'amélioration de la qualité de E6 recombinante a permis également de démontrer l'interaction de E6 avec un motif structural d'ADN présent dans l'ADN cruciforme, puis de déterminer les paramètres cinétiques de cette interaction par BIAcore. Ce travail ouvre donc la voie à une meilleure compréhension moléculaire des modes d'actions de E6, et donc à de nouvelles stratégies de thérapie du cancer du col de l'utérus. De plus, nos méthodologies de contrôle et d'optimisation de la qualité des protéines de fusion sont généralisables à l'étude de toute protéine récalcitrante. "E6 is an oncoprotein produced by "high risk" Human Papillomaviruses (HPVs) involved in cervical cancers. E6 participates oncogenesis through different pathways, in particular by degrading the cellular tumor suppressor protein p53. The aim of this thesis was to solve the solution structure of E6 by Nuclear Magnetic Resonance (NMR). The introduction chapter first focuses on the different states (micro- and macroscopic) adopted by globular proteins in solution, including notions such as folding and stability. Then we record the principles, applications and limits of various biophysical techniques for the study of proteins. Finally, we briefly introduce the biological context of E6 protein. At the start of this work, E6 had never been purified although its sequence was known since 1985. In the results section, we first demonstrate that bacterial expression of E6 fused to the C-terminus of MBP (Maltose Binding Protein) generates " soluble inclusion bodies ". These particles, which originate from agregation of misfolded E6 moieties, remain soluble thanks to the high solubility of MBP moities. These observations have allowed us to produce soluble and folded samples of full-length E6 as well as its two zinc-binding domains. Finally, we have managed to solve the NMR structure of the C-terminal zinc-binding domain. On another hand, the optimized quality of our E6 samples have allowed us to demonstrate E6 binding to a particular DNA structural motif found in four-way DNA junctions. The kinetic parameters of this interaction have been determined by BIAcore. This work will provide a better understanding of the molecular pathways of E6 action and opens the way for new therapeutic strategies against cervical cancers. Furthermore, our methods for control and optimization of protein fusion quality can be generalized for future studies of other recalcitrant proteins
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D'Arienzo, Valentina. "Caractérisation des glycoprotéines d'enveloppe des variants viraux impliqués dans la transmission du virus de l'hépatite C." Thesis, Tours, 2013. http://www.theses.fr/2013TOUR3803/document.
Full textAbstract:
Les variants viraux impliqués dans la transmission du VHC ont rarement été étudiés en raison des difficultés rencontrées pour recruter des patients au stade de la primo-infection. Pour mener cette étude, nous avons analysé le goulot d’étranglement génétique subit par les quasi-espèces virales au cours de 3 accidents d’exposition au sang impliquant des représentants du personnel soignant contaminés par piqûre d’aiguille. En utilisant la technique d’amplification de génomes uniques nous avons obtenu les gènes codant les glycoprotéines d’enveloppe virales E1E2 des variants viraux présents dans ces quasi-espèces. Ces gènes ont été séquencés et soumis à une analyse phylogénétique. Nous avons ensuite pu étudier les propriétés phénotypiques des glycoprotéines d’enveloppe dérivées de variants qui apparaissent au stade très précoce de l’infection. Pendant cette période, le VHC pourrait être plus vulnérable à l’élimination par des vaccins préventifs ou par des immunothérapiesLittle is known about the transmitted variants responsible for the spread of HCV infection, principally because of the difficulties to recruit patients early enough in infection. To address this issue, we proposed to track the genetic bottleneck event in HCV quasispecies, leading to productive clinical infection in three health care workers accidentally contaminated through needlestick accidents. By using a single genome amplification (SGA) approach we identified genes coding the viral envelope glycoprotein E1E2 which composed these quasispecies. The E1E2 sequences were then directly sequenced and subjected to a phylogenetic analysis. By cloning these full-length E1E2 sequences, we investigated the phenotypic properties of the envelope glycoproteins potentially involved in selective HCV transmission and early stage of infection, a period during which the virus might be most vulnerable to elimination by preventive vaccines or immunotherapies
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Rifi, Omar. "Production des polypeptides issus des glycoprotéines d'enveloppe du VIH-1 pour des études biophysique et structurale par RMN et DC." Thesis, Strasbourg, 2014. http://www.theses.fr/2014STRAF026.
Full textAbstract:
Quelques régions stables ont été découvertes sur les gp d’env du VIH-1 contre lesquelles des patients produisent des anticorps neutralisants. Les épitopes les plus prometteurs se trouvent dans la MPER et sont probablement exposés durant la fusion. Alors que les peptides isolés à partir de cette région ne sont pas parvenus à induire une réaction immunogène neutralisante, des études antérieures suggèrent que la membrane lipidique joue un rôle dans la structuration des antigènes et dans la réponse immunogénique.C’est pourquoi nous étudions la structure de ces épitopes. Cela nécessite leur surexpression, leur purification et leur reconstitution dans des liposomes. Une étude de CD montre qu’ils pourraient changer de conformation, cela sera confirmé par RMN. En outre, leur immunogénicité sera vérifiée par vaccination des souris. En plus, nous trouvons que le cholestérol peut modifier l’orientation des peptides englobant le motif CRAC de la gp41A few stable regions have been discovered on the HIV-1 env gp against which some patients produce neutralizing antibodies. The most promising ones are located in the MPER and are probably exposed transiently during the fusion. Whereas the peptides isolated from this region failed to induce immunogenic response, previous studies suggest the lipid membrane plays a role in antigens structure and in the immunogenic response.That is why we investigate the structure of these épitopes in membrane models. This requires the production of these épitopes by bacterial overexpression, their purification and their reconstitution in liposomes. A CD study shows that they could undergo a conformational change; this will be confirmed by NMR. Also their immunogenicity will be checked by mice immunization. In addition, we find that cholesterol could change the orientation of peptides encompassing a gp41 CRAC motif
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Albecka, Anna. "Étude de l’entrée cellulaire du virus de l’hépatite C : rôle du récepteur aux LDL et identification de régions fonctionnelles des protéines de l’enveloppe virale." Thesis, Lille 1, 2010. http://www.theses.fr/2010LIL10143/document.
Full textAbstract:
L’initiation du cycle infectieux du virus de l’hépatite C (HCV) nécessite la traversée de la membrane cellulaire. Cette étape d’entrée met en jeu les protéines d’enveloppe du virus ainsi que les récepteurs à la surface cellulaire. Au cours de cette thèse, nous nous sommes intéressés à ces deux aspects. Partant de l’hypothèse que les protéines d’enveloppe du HCV, E1 et E2, ont co-évolué au sein de chaque génotype, nous avons mis en évidence des incompatibilités fonctionnelles intergénotypiques entre ces protéines. Nous avons ensuite construit plusieurs séries de chimères intergénotypiques de E2 en nous basant sur un modèle structural. Ces chimères ont été étudiées d’un point de vue fonctionnel dans un système infectieux ainsi qu’à l’aide de pseudotypes rétroviraux. Ces travaux nous ont permis d’identifier plusieurs déterminants de E2 impliqués dans l’assemblage de la particule virale ainsi qu’une région juxtamembranaire prenant part au processus d’entrée virale. Cette dernière a été caractérisée d’un point de vue structural. Du fait de l’association potentielle entre le virus HCV et des lipoprotéines de faible densité, le LDLR a été proposé comme facteur d’entrée pour ce virus. Cependant, son rôle précis dans l’entrée du virus HCV reste mal compris. Nous avons étudié l’implication de ce récepteur en comparant les mécanismes d’internalisation du virus HCV et des lipoprotéines. Nous avons montré que la particule virale interagit avec le LDLR. Cependant, cette interaction ne semble pas conduire à une infection productive. De plus, nos données suggèrent que par ses fonctions de transport lipidique, le LDLR module la réplication génomique du virus HCVTo initiate its life cycle, hepatitis C virus (HCV) needs to cross the cellular membrane. This process involves the viral envelope proteins and cellular receptor(s). During this thesis, we studied these two aspects. Our objectives were to identify new functional determinants in HCV glycoprotein E2 and to investigate the role of the LDL receptor (LDLR) during the HCV life cycle. With the hypothesis that E1 and E2 glycoproteins have co-evolved within the different genotypes, we identified functional intergenotypic incompatibilities between these two proteins. Based on a structural model, we then constructed several series of intergenotypic E2 chimeras. The functionality of these chimeras was analyzed in an infectious system and with the help of retroviral pseudotypes. This work led us to identify several E2 determinants involved in viral particle assembly as well as a juxtamembrane region taking part in virus entry. This latter has also been characterized at a structural level to better understand its role. Due to the potential interaction between HCV particle and low-density lipoproteins, the LDLR has been proposed as an entry factor for this virus. However, its exact role in HCV entry remains poorly understood. In this thesis, we investigated the role of this receptor in the HCV life cycle by comparing virus entry to the mechanism of lipoprotein uptake. We showed that the viral particle interacts with the LDLR. However, this interaction does not seem to lead to a productive infection. Furthermore, our data are in favour for a role of the LDLR as a lipid providing receptor which modules viral RNA replication
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Belot, Laura. "Etude structurale et fonctionnelle de la glycoprotéine des Rhabdovirus Structural basis for the recognition of LDL-receptor family members by VSV glycoprotein Structural and cellular biology of rhabdovirus entry Monomeric Intermediates Formed by Vesiculovirus Glycoprotein during Its Low-pH-induced Structural Transition." Thesis, Université Paris-Saclay (ComUE), 2019. http://www.theses.fr/2019SACLS522.
Full textAbstract:
Les Rhabdovirus sont des virus enveloppés à ARN simple brin de polarité négative. Ils possèdent une unique protéine transmembranaire à leur surface, la glycoprotéine G. G est impliquée dans les étapes précoces du cycle viral. G lie dans un premier temps un récepteur cellulaire, menant à l’endocytose du virus. Ensuite, G orchestre la fusion membranaire entre les membranes virale et endosomale. Cette fusion membranaire permet la libération du génome viral dans le cytoplasme de la cellule infectée.Le récepteur des lipoprotéines de basse densité (LDLR) est le récepteur principal du VSV. L’ectodomaine du LDLR est composé d’un grand site de liaison au ligand constitué de domaines riches en cystéines (CR1 à CR7).Afin de comprendre les bases moléculaires de l’interaction entre G et son récepteur, nous avons réalisé des tests de fixation de G aux différents domaines CR du LDLR. Cela a révélé que seuls les domaines CR2 et CR3 pouvaient lier G. Lorsque CR2 et CR3 sont incubés avec VSV dans l’inoculum, ils protègent les cellules de l’infection par VSV. Nous avons cristallisé G en complexe avec chacun de ces domaines CR. Les structures révèlent que le site de liaison de CR2 et de CR3 sur G sont identiques, et que les mêmes résidus sur G sont impliqués dans la liaison des deux domaines CR. Des cellules HAP-1 dans lesquelles le gène codant pour le LDLR a été invalidé, sont toujours sensibles à l’infection par VSV. Ceci confirme que VSV peut utiliser d’autres récepteurs que le LDLR pour entrer dans les cellules. Cependant la mutation des résidus de G qui sont clefs dans l’interaction avec les domaines CR du LDLR abolissent l’infectiosité de VSV aussi bien dans les cellules de mammifères que dans les cellules d’insectes. Ceci indique que les seuls récepteurs de VSV dans ces cellules sont des membres de la famille du LDLR et que VSV G a spécifiquement évolué pour interagir avec leur domaines CR. Par ailleurs nous avons montré que les G dont les résidus clef pour l’interaction avec les domaines CR sont mutés, ont conservé leur activité de fusion. Ces travaux montrent que les activités de reconnaissance du récepteur et de fusion de G peuvent être découplées. Ceci ouvre la possibilité de développer des glycoprotéines dérivées de G au tropisme modifié.Chez les Rhabdovirus, G est la seule cible des anticorps neutralisants. A ce jour il n’existe aucune structure de G de Rhabdovirus en complexe avec un anticorps. L’anticorps 8G5F11 neutralise plusieurs génotypes du genre Vésiculovirus dont VSV. Nous avons montré que les FAB 8G5F11 empêchent l’infection des cellules par VSV Indiana d’une part et qu’ils reconnaissent la forme pré- et post-fusion de VSV G avec une stœchiométrie G : FAB de 1 : 1 d’autre part. Nous avons mis au point les conditions d’observation du complexe G-FAB en cryo-microscopie électronique, ce qui permet d’envisager à terme une résolution de la structure du complexe G-FAB.Enfin, nous avons débuté une étude visant à caractériser les glycoprotéines d’autres Rhabdovirus du genre Lyssavirus. Pour cela, nous avons produit et purifié les ectodomaines de G du virus de la rage (RABV), du virus Mokola (MOKV) et du virus de la chauve-souris ouest-caucasienne (WCBV). Ces G ont été caractérisées par microscopie électronique à différents pH. Les mesures effectuées sur G à pH 8 sont compatibles avec celles attendues pour un monomère de G pré-fusion. A pH 6, les ectodomaines observés pourraient correspondre à un intermédiaire monomérique allongé apparaissant tardivement lors de la transition structurale. Ces résultats pourraient être prochainement validés par l’obtention de la structure cristallographique de l’ectodomaine de G MOKVRhabdoviruses are single stranded RNA enveloped viruses. They own a unique glycoprotein G anchored on the viral membrane. G is involved in the early stages of the viral cycle. At first G binds a cellular receptor, leading to the virus endocytosis. Then G orchestrates the membrane fusion between the viral and endosomal membranes. Membrane fusion allows the release of the viral genome into the cytoplasm of the infected cell.The low-density lipoprotein receptor (LDLR) is the main receptor of VSV. The ectodomain of the LDLR is composed of a large ligand binding domain constituted of cysteine-rich domains (CR1 to CR7).In order to understand the molecular basis of the interaction between G and its receptor, we performed binding test of G with all the CR domains of the LDLR. This revealed that only CR2 and CR3 domains could bind G. When CR2 and CR3 are present in the VSV inoculum, they protect the cells from VSV infection. We crystallized G in complex with each of these CR domains. The structures reveal that CR2 and CR3 binding sites on G are identical, and that the same residues on G are involved in the binding of the two CR domains. HAP-1 cells in which the gene encoding the LDLR has been invalidated are still susceptible to VSV infection. This confirms that VSV can use other receptors than the LDLR itself to enter the cells. However, mutation of G residues that are key in the interaction with the CR domains of the LDLR abolish the infectivity of VSV in mammalian and insect cells. This indicates that the only VSV receptors in these cells are members of the LDLR family and that VSV G has specifically evolved to interact with their CR domains. Moreover, we have shown that G mutated for key residues involved in the interaction with CR domains, are still able to induce fusion. This work shows that receptor recognition and G fusion activities can be decoupled. This paves the way to develop glycoproteins derived from G with modified tropism.In Rhabdoviruses, G is the only target of neutralizing antibodies. There is no structure of a Rhabdovirus G in complex with an antibody. The 8G5F11 antibody neutralizes several genotypes of the genus Vesiculovirus including VSV. We have shown that FAB 8G5F11 prevents infection of cells by VSV Indiana on the one hand and that they recognize the pre- and post-fusion form of VSV G with a 1: 1 G: FAB stoichiometry on the other hand. We have developed the observation conditions of the G-FAB complex in cryo-electron microscopy, which could be useful to obtain the structure of the G-FAB complex.We also started a study to characterize the glycoproteins of other Rhabdoviruses of the Lyssavirus genus. We produced and purified G ectodomains of rabies virus (RABV), Mokola virus (MOKV) and West Caucasian bat virus (WCBV). We characterize these G by electron microscopy at different pHs. The measurements made on G at pH 8 are compatible with those expected for a pre-fusion monomer of G. At pH 6, these ectodomains could correspond to a monomeric late intermediate in the structural transition. Obtaining the crystallographic structure of the G ectodomain of MOKV could validate these results
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Dubois, Julia. "Étude de l'infection par le métapneumovirus humain : facteurs de virulence et développement de vaccins vivants atténués." Thesis, Université Laval, 2018. http://www.theses.fr/2018LYSE1018/document.
Full textAbstract:
Le métapneumovirus humain (hMPV) est un virus responsable d'infections aiguës des voies respiratoires telles que des bronchiolites, des bronchites ou des pneumonies, principalement chez les populations à risques que sont les jeunes enfants de moins de 5 ans, ainsi que les personnes âgées ou immunodéprimées. Découvert en 2001, ce virus et sa pathogénèse ne restent encore aujourd'hui que partiellement caractérisés. De ce fait et malgré les besoins, il n'y a aucun vaccin ou traitement thérapeutique spécifique et efficace contre le HMPV disponible sur le marché. Dans ce contexte, mon projet de thèse s'est articulé autour de deux axes principaux : (i) L'étude de la protéine de fusion F du virus hMPV, protéine majeure antigénique de surface et responsable de l'entrée du virus dans la cellule cible. Elle a pour particularité d'induire de manière autonome la fusion membranaire in vitro et d'être associée à des effets cytopathiques variable selon les souches virales. De par son rôle clé pour le virus hMPV, la protéine F a déjà fait l'objet de plusieurs études structurales et fonctionnelles mais les déterminants de cette activité fusogénique ne sont pas encore entièrement caractérisés. Nous nous sommes donc intéressés à l'identification de déterminants du phénotype viral hyperfusogénique, localisés dans les domaines heptad repeats de la protéine F du hMPV. (ii) L'atténuation de deux souches virales cliniques (CAN98-75 et C-85473) par délétion de gènes accessoires dans le but de développer des candidats vaccinaux adaptés aux enfants en bas âge. Différents virus ont été générés par génétique inverse et les délétions des gènes accessoires SH et G dans les deux fonds génétiques viraux ont été étudiées pour leur impact sur l'infectivité, la réplication et la pathogénèse virale in vitro et in vivo ainsi que leur contribution pour le développement de virus atténués candidats vaccinauxHuman metapneumovirus (hMPV) is a major pathogen responsible of acute respiratory tract infections, such as bronchiolitis or pneumonia, affecting especially infants, under five years old, elderly individuals and immunocompromised adults. Identified since 2001, this virus and its pathogenesis still remain largely unknown and no licensed vaccines or specific antivirals against hMPV are currently available. In this context, my research project was built over two main subjects: (i) The study of the fusion F glycoprotein which is the major antigenic protein of hMPV and is responsible of viral entry into host cell. By its crucial role for the virus, the F protein has already been characterized in several structural and/or functional studies. Thus, it has been described that the hMPV F protein induces membrane fusion autonomously, resulting in variable cytopathic effects in vitro, in a strain-dependent manner. However, as the determinants of the hMPV fusogenic activity are not well characterized yet, we focused on identification of some of these, located in heptad repeats domains of the protein. (ii) The evaluation of hMPV SH and G gene deletion for viral attenuation. Liveattenuated hMPV vaccine candidates for infants’ immunization has been constructed thank to this deletion approach at the beginning of hMPV vaccine development efforts. Despite encouraging results, these candidates have not been further characterized and the importance of the viral background has not been evaluated
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Guinoiseau, Thibault. "Etude des propriétés génétiques et fonctionnelles des variants du virus de l'hépatite C lors d'évènements de transmission." Thesis, Tours, 2018. http://www.theses.fr/2018TOUR3301.
Full textAbstract:
Chez un individu infecté, le VHC circule sous la forme d’une population de variants viraux appelés quasi-espèce. Lors d’un évènement de transmission, certains variants viraux sont préférentiellement transmis et un effondrement de la diversité virale chez l’individu nouvellement infecté est souvent observé. Les propriétés électives de ces variants ainsi que leur rôle dans l’évolution clinique sont méconnus. L’objectif de cette étude est d’identifier si des déterminants moléculaires situés au niveau des glycoprotéines d’enveloppe du VHC sont associés à une plus grande capacité de transmission. Les propriétés fonctionnelles des variants transmis et non transmis seront étudiées, en particulier la sensibilité à la neutralisation autologue. Les échantillons étudiés proviennent de couples mère-enfant infectés chroniquement par le VHC issus de d’un essai clinique réalisé en Thaïlande. La composition des populations virales au sein de 3 paires a été étudiée à l’aide d’une technique d’amplification après dilution limite (SGA) suivie d’un séquençage profond (Illumina). Le variant majoritaire chez la mère était retrouvé majoritaire chez l’enfant pour les paires 1 et 3. Pour 2 paires (2 et 3), une moindre diversité génétique a été observée chez l’enfant par rapport à la mère témoignant d’un goulot d’étranglement génétique lors de la transmission. Après clonage des gènes E1E2, des tests d’infectivité sur cellules hépatocytaires ainsi que des tests de neutralisation par le sérum maternel sont réalisés avec le modèle de rétrovirus pseudotypés (VHCpp). Pour la 1ère paire, le variant majoritaire chez la mère (variant transmis à l’enfant) est infectieux et résistant au sérum autologue. Pour la deuxième paire, le variant minoritaire (transmis) est légèrement résistant à la neutralisation autologue. Un variant majoritaire non transmis apparait sensible à la neutralisation autologue. Des études complémentaires en système de virus réplicatifs issus de la culture cellulaire (VHCcc) sont en cours. Au final, les résultats de cette étude contribuent à comprendre les étapes précoces de l’infection par le VHC, afin de mieux appréhender de futures approches immunoprophylactiques ou vaccinalesIn infected individuals, HCV circulates as a complex mixture of genetically different, but closely related viral variants named quasispecies. In a transmission event, some viral variants are preferentially transmitted. The genetic and functional properties of these variants are still unknown. The aim of our work was to identify molecular determinants of E1E2 associates with a greater capacity of transmission. We also intend to study the functional properties of transmitted and no transmitted variants, as for example sensibility to autologous neutralization. Studied sera samples were obtained from three women and their child infected by the HCV, who were participating in HIV prevention clinical trial for the prevention of perinatal transmission of HIV in Thailand. Quasispecies were studied with single genome amplification (SGA) followed by deep sequencing (Illumina). A decrease in intra-host diversity (genetic bottleneck) was observed in the viral population of child near birth (week 6) compared with that observed in the mother (just before delivery). For 2 pairs, the major variant observed in the mother was the same as the major one identified in the child. Retroviral pseudotypes (HCVpp), bearing each transmitted and non-transmitted envelope glycoproteins were produced. For each one, the level of infectivity on HuH7 cells was measured as well as the neutralizing activity of the autologous sera. For the first pair, the major variant (transmitted) appears resistant to autologous neutralization. For the second pair, the transmitted minor variant appears slightly resistant to autologous neutralization. A non-transmitted major variant is sensitive to autologous neutralization. Complementary studies with HCV derived from cell culture (HCVcc) are in progress We hope that the results of this study may be helpful to better understand early steps of HCV infection, which is of great interest for the development of immunoprophylaxis and vaccine strategies
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Welman, Mélanie. "Étude du rôle des domaines structuraux et du motif de ciblage YXXO dans le transport intracellulaire et de l'activité fusogénique de la gp41 du VIH-1." Thèse, 2006. http://hdl.handle.net/1866/15818.
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El, Kasmi Imane. "L’étude de la glycoprotéine gM du virus Herpès simplex de type 1 (HSV-l) : identification de ses partenaires viraux et cellulaires et leur rôle dans la régulation de l’infection virale." Thèse, 2017. http://hdl.handle.net/1866/20239.
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Veillette, Maxime. "Rôle de la conformation des glycoprotéines de l’enveloppe du VIH-1 dans la réponse cytotoxique cellulaire dépendante des anticorps et impact des protéines virales Nef et Vpu." Thèse, 2016. http://hdl.handle.net/1866/15993.
Full textAbstract:
Alors que d’énormes efforts sont mis de l’avant pour mettre en place des stratégies thérapeutiques contre l’infection au VIH-1, il est nécessaire de mieux cerner les déterminants viraux qui aideront à l’efficacité de celles-ci. En ce sens, une volumineuse littérature scientifique suggère que les anticorps contre le VIH-1 possédant une capacité à induire une réponse effectrice dépendante de leur portion Fc puissent jouer un rôle important dans la prévention de l’infection et dans la progression de la maladie. Cependant, peu d’information est disponible concernant les déterminants reconnus par ces anticorps et comment le virus s’en protège. Le but des travaux présentés dans cette thèse est donc d’élucider les mécanismes viraux contrôlant la reconnaissance des cellules infectées par ces anticorps capables d’induire une réponse effectrice. De par les corrélats de protection identifiés au cours de l’essai vaccinal RV144, les travaux présentés ici se concentrent sur la réponse cytotoxique dépendante des anticorps (ADCC), puisqu’il s’agit d’une réponse effectrice suggérée pour avoir joué un rôle dans la protection observée dans le RV144, seul essai vaccinal anti-VIH à avoir démontré un certain degré de protection. De plus, plusieurs anticorps capables d’induire cette réponse contre le VIH sont connus pour reconnaître les glycoprotéines de surface du virus (Env) dans une conformation dite ouverte, c’est-à-dire la conformation adoptée lors de la liaison d’Env avec son récepteur CD4 (épitopes CD4i). Nous avons mis au point deux techniques in vitro permettant d’étudier ces changements de conformation ainsi que leur impact sur la réponse ADCC.
Les techniques mises au point, un ÉLISA sur base cellulaire pour mesurer les changements de conformation d’Env ainsi que la mesure de la réponse ADCC par cytométrie en flux, nous ont permis de démontrer comment le virus empêche l’exposition des épitopes d’Env CD4i. L’activité simultanée des protéines accessoires virales Nef et Vpu sur le retrait du récepteur CD4 de la surface des cellules infectées et l’inhibition du facteur de restriction Tétherine / BST-2 par Vpu contrôlent à la fois les niveaux d’Env et de CD4 à la surface cellulaire et donc modulent l’interaction Env-CD4 et ultimement la susceptibilité à la réponse ADCC contre les épitopes CD4i reconnus par des anticorps hautement prévalents lors de l’infection au VIH. Également, nous démontrons comment de petits composés mimant la liaison de CD4 sur Env sont capables de forcer l’exposition des épitopes CD4i, même en présence des protéines Nef et Vpu, et donc d’augmenter la susceptibilité des cellules infectées à la réponse ADCC. Une autre découverte présentée ici est la démonstration que la portion soluble d’Env produite par les cellules infectées peut interagir avec le récepteur CD4 des cellules non-infectées avoisinantes et induire leur reconnaissance et élimination par la réponse ADCC contre Env.
Somme toute, la modulation de la réponse ADCC par l’interaction Env–CD4 représente un important pilier de la relation hôte – pathogène du VIH-1 de la perspective des réponses Fc-dépendantes. Les travaux présentés dans cette thèse ont le potentiel d’être utilisés dans l’élaboration de nouvelles stratégies antivirales tout en élargissant les connaissances fondamentales de cette interaction hôte – pathogène.While huge efforts are put forth to develop therapeutic strategies against HIV-1 infection, it is necessary to better understand the viral determinants that will help the effectiveness of these approaches. Moreover, a voluminous scientific literature suggests that antibodies against HIV-1 that have the ability to induce an Fc-mediated effector response can play an important role in the prevention and control of the disease. However, little information is available regarding the determinants recognized by these antibodies and how the virus protects itself from this response. The aim of the work presented in this thesis is therefore to better elucidate the viral mechanisms controlling recognition of infected cells by antibodies capable of inducing effector responses. In regards to the correlates of protection identified in the RV144 vaccine trial, the work presented here focuses on antibody-dependant cellular cytotoxicity (ADCC), since this effector response was suggested to have played a role in the protection observed in the RV144 trial. In addition, many antibodies that induce this response against HIV are known to recognize the virus surface glycoprotein (Env) in an open conformation, that is to say, the conformation adopted by the binding of Env with the CD4 receptor (CD4i epitopes). We have developed two in vitro techniques to study these conformational changes and their impact on ADCC responses. The techniques developed, a cell-based ELISA to measure Env conformational changes and the measure of ADCC responses by flow cytometry, allowed us to demonstrate how the virus prevents exposure of Env CD4i epitopes. The simultaneous activity of viral accessory proteins Vpu and Nef on the removal of CD4 from the surface of infected cells and the Vpu-mediated inhibition of the restriction factor Tetherin / BST-2 control both Env and CD4 levels at the cell surface, thus modulating Env-CD4 interaction. This ultimately results in a decrease in the susceptibility of infected cells to ADCC responses against CD4i epitopes recognized by antibodies that are highly prevalent during HIV infection. Also, we demonstrate how using small compounds mimicking the CD4 binding of Env forces the exposure of CD4i epitopes, even in the presence of Nef and Vpu proteins, and therefore increases the susceptibility to ADCC responses against infected cells. Another discovery is presented here that demonstrates how the soluble portion of Env produced by infected cells can interact with the CD4 receptor on the bystanders non-infected cells and induce their recognition and elimination by ADCC responses against Env. Overall, the modulation of ADCC responses by Env-CD4 interaction is an important pillar of HIV-1 host – pathogen interaction from the perspective of Fc effector functions. The work presented in this thesis has the potential to be used in the development of new antiviral strategies while expanding the fundamental understanding of HIV-1 host - pathogen interactions.