Dissertations / Theses on the topic 'GlicoproteinaP'

O desenvolvimento de técnicas complementares a métodos experimentais clássicos, tais como a cristalografia de raios-X e a ressonância magnética nuclear (RMN), capazes de descrever e prever a diversidade estrutural e conformacional de carboidratos e glicoconjugados, consiste em um potencial impacto no entendimento dos processos biológicos em que estas moléculas estão envolvidas. Neste sentido, o presente trabalho tem por objetivo: 1) a validação de um conjunto de parâmetros, desenvolvidos no nosso grupo de pesquisas, na reprodução de dados de RMN descrevendo a conformação de uma série de glicoproteínas em solução aquosa, e 2) a avaliação do emprego de geometrias de dissacarídeos em solução como modelo para a construção de glicanas complexas, na ausência de dados experimentais. Através do emprego de técnicas de modelagem molecular como cálculos ab initio, construção de mapas de contorno para dissacarídeos e simulações de dinâmica molecular (DM) em escalas de tempo de até 0.1 ms, os resultados obtidos confirmam a adequação dos parâmetros gerados na descrição da conformação de carboidratos e glicoproteínas. Adicionalmente, sugerem que o emprego de populações de confôrmeros de dissacarídos em solução, obtidos através de simulações de DM, constitui-se em uma estratégia promissora na obtenção de modelos de glicanas condizentes com condições biológicas. Esperamos, a partir destas observações, que os resultados obtidos na presente dissertação possam contribuir no crescimento do número de trabalhos de DM abordando carboidratos e glicoproteínas biológicas e, assim, no crescimento do entendimento de processos biológicos nos quais estas biomoléculas estejam envolvidas.
The development of novel techniques, capable of describing and predicting the structural and conformational diversity of carbohydrates and glycoconjugates, in complement to experimental methods as X-ray crystallography and nuclear magnetic resonance (NMR), might bring a potential impact in the comprehension of the biological processes in which such molecules are involved. In this context, this work aims to: 1) validate a set of parameters, developed by our research group, to reproduce NMR data describing the conformation of a series of glycoproteins in aqueous solutions; and 2) evaluate the use of solution geometries of disaccharides to assemble complex glycans, in the absence of experimental data. Employing molecular modelling techniques as ab initio calculations, construction of energy contour plots for disaccharides and molecular dynamics (MD) simulations with time scales up to 0.1 ms, the obtained results confirm the adequacy of the studied parameters to describe the conformation of carbohydrates and glycoproteins. Additionaly, such data suggest that the use of solution conformations of disaccharides, as obtained through MD simulations, consists in a promissing strategy to obtain glycans representation in accordance to biological conditions. We expect, with such observations, that the obtained results contribute to increase the number of works employing MD simulations of biological carbohydrates and glycoproteins and, thus, to raise the comprehension of the biological processes in which such molecules are involved.

Background. Antiphospholipid (aPL) antibodies are a heterogeneous group of autoantibodies directed against plasma protein-phospholipid complexes or single plasma proteins. Their presence in patients with thrombosis and/or pregnancy morbidity defines antiphospholipid syndrome (APS). APS is considered as primary (PAPS) if present alone, or secondary if associated with other systemic autoimmune diseases, particularly with systemic lupus erythematosus (SLE). Laboratory criteria for APS classification include lupus anticoagulant (LA) and/or medium-high levels of IgG/IgM anticardiolipin (aCL) and/or medium-high levels of IgG/IgM anti-Beta2glycoprotein I (anti-Beta2GPI) antibodies, all confirmed no earlier than 12 weeks later. Currently, ELISA assay for detection of aCL and anti-Beta2GPI antibodies, despite several attempts, is not a standardized technique. Recently, few studies have compared the performance of ELISA with that of other technologies also fully automated including the fluorescence enzyme immunoassay (FEIA) and the chemiluminescence immunoassays (CLIA), but they have produced debatable results. The search for new markers of APS through the use of laboratory techniques alternatives to ELISA, such as FEIA and CLIA methods is currently under interest. IgA aCL and IgA anti-Beta2GPI antibodies are not considered one of the recommended laboratory criteria for APS classification, and their clinical relevance is as yet controversial. Moreover, aPL are not only considered as a tool for APS classification, but they could be useful parameters to stratify the risk for developing clinical manifestations of the disease. In particular, anti-anti-Beta2GPI antibodies directed against the Domain I (anti-DI) of the molecule, were reported to be associated to thrombotic risk in antiphospholipid syndrome (APS), so correlating them with a more severe clinical picture. Objectives. The aim of the study was to compare the performance of a home-made ELISA with that of FEIA and CLIA assays in detecting aCL and anti-Beta2GPI antibodies in a large, homogeneous cohort of PAPS patients and in a group of subjects with clinical criteria for APS classification but ELISA negative for laboratory criteria. The results were compared with those obtained in a control group including healthy blood donors and patients with autoimmune diseases different from APS. Subsequently, the clinical relevance of IgA aCL, IgA anti- Beta2GPI antibodies and of IgG anti-DI antibodies was evaluated in a large homogeneous cohort of PAPS patients. Their diagnostic sensitivity was investigated in a group of seronegative patients for conventional aPL but with clinical manifestations of APS. Moreover, prognostic value of these antibodies in APS patients was studied. Methods. IgG/IgM/IgA aCL and IgG/IgM/IgA anti-Beta2GPI antibodies were determined using FEIA, (EliA TM, Phadia AB, Sweden). aCL/anti-Beta2GPI of IgG isotype and IgG anti-DI antibodies were assayed using CLIA (HemosIL AcuStar®, Inova, USA). The manufacturer's recommendations were followed carefully for both techniques. A home-made ELISA performed following the European Forum on aPL recommendations was used for the comparison between methods. All sera were also tested for LA following updated guidelines using diluted Russell viper venom time and diluted activated partial thromboplastin time as screening tests. Results and Conclusions. (1) Comparison between an ELISA home made and FEIA technique. The sensitivities of the ELISA and FEIA tecniques were similar with the exception of IgM aCL which was found to be significantly higher in the PAPS patients using the ELISA method. The two assays had a comparable specificity, a high significant agreement and a significant correlation between the antibody levels. FEIA testing uncovered no significant prevalence of any antiphospholipid antibody in the ELISA negative patients. In conclusion, our results suggest that FEIA tecnique is comparable to a home-made ELISA. If confirmed by large scale studies on PAPS patients, these results could support FEIA's routine use in detecting aCL and anti-Beta2GPI antibodies. Results and Conclusions. (2) Comparison between an ELISA home made and CLIA technique. When compared with the ELISA technique, it came to light that the CLIA method had a significantly lower sensitivity for IgM aCL and IgG/IgM anti-Beta2GPI antibodies; while, its specificity was higher with respect to ELISA for IgM aCL and IgM anti-Beta2GPI antibodies. The two techniques showed a high, significant agreement and a significant antibody titer correlation. CLIA also detected IgG/IgM aCL and IgG anti-Beta2GPI antibodies in the seronegative patients using ELISA method. There was a significantly higher prevalence of IgG aCL and IgG anti- Beta2GPI antibodies in those patients with respect to that in the control population. In conclusion, despite a lower sensitivity, CLIA showed a higher specificity for some aPL and a good level of agreement and correlation with a home made ELISA. CLIA also detected some aCL and anti-Beta2GPI antibodies in the seronegative patients not usually identified by home made ELISA. If confirmed by further studies, CLIA could be considered a valuable method to assess patients with clinical manifestations of APS but testing negative for aPL using a home made ELISA. Results and Conclusions. (3) ACL and anti-Beta2GPI antibodies of IgA isotype. Present respectively in 19% and 50% of the PAPS patients studied, IgA aCL and IgA anti- Beta2GPI antibody frequencies were both statistically significant .The mean titers of both IgA aCL and IgA anti-Beta2GPI antibodies were higher in the thrombotic patients, but only the latter were significantly associated with thrombosis. When analyzed, the patients FEIA negative for conventional IgG/IgM aPL, but with the clinical features of APS, in 10.6% of cases were tested positive for anti-Beta2GPI IgA, this data was found to be significant. In conclusion, positivity to IgA anti-Beta2GPI antibody detected using FEIA was found to be clinically relevant in PAPS patients. Moreover, the prevalence of isolated IgA anti- Beta2GPI antibody positivity was significant in the seronegative patients. These results suggest that patients with clinical signs/symptoms of APS but who do not meet conventional antiphospholipid antibody laboratory criteria could undergo at least of IgA anti-Beta2GPI antibody testing using FEIA technique. Results and Conclusions. (4) IgG anti-DI antibodies. The sensitivity and specificity of IgG anti-DI antibodies were comparable to those of IgG aCL and IgG anti-Beta2GPI antibodies. There was a significant agreement, association and antibody titre correlation between IgG anti-DI and IgG aCL as well as IgG anti-Beta2GPI antibodies. IgG anti-DI antibody showed lesser prevalence and mean titres in the pregnancy morbidity than in thrombotic and PAPS patients with both involvements. Regarding the conventional aPL antibody profiles, the triple positivity group had higher prevalence and mean titres than single and double positivity ones. In conclusion, as regards the anti-DI antibodies this study provides further evidence that these antibodies detected by CLIA, can be considered a promising biomarker for risk assessment particularly in patients having vascular thrombosis and triple conventional aPL positivity, which is considered an antibody profile associated to the most severe features of APS. Thus, anti-DI antibodies might constitute an additional useful tool in clinical and therapeutic decisions.
Introduzione. Gli anticorpi antifosfolipidi (aPL) sono un gruppo eterogeneo di autoanticorpi specifici per complessi fosfolipide-proteina o proteine leganti i fosfolipidi. La loro presenza in pazienti con trombosi e/o complicanze ostetriche definisce la sindrome da anticorpi antifosfolipidi (APS). L'APS viene considerata primaria (PAPS) se presente in forma isolata, altrimenti secondaria se associata ad altra malattia autoimmune sistemica che solitamente e' il lupus eritematosus sistemico (LES). I criteri di laboratorio per la classificazione di APS includono la presenza di tre aPL ed in particolare del lupus anticoagulant (LA) e/o di livelli medio-alti di anticorpi anticardiolipina (aCL) IgG/IgM e/o di livelli medio-alti di anticorpi anti-Beta2glycoproteina I (anti-Beta2GPI) IgG/IgM, tutti confermati non prima di 12 settimane. Attualmente, le metodiche ELISA per la determinazione degli aCL e anti-Beta2GPI di classe IgG/IgM, nonostante svariati tentativi, non sono ancora standardizzate. Di recente, alcuni studi hanno confrontato le performance dei test ELISA con quelle di altre tecnologie anche completamente automatizzate tra le quali rientrano sia il fluorescence enzyme immunoassay (FEIA) che il chemiluminescence immunoassay (CLIA). Questi lavori, tuttavia, hanno prodotto risultati non concordanti. Gli anticorpi aCL e anti-Beta2GPI di classe IgA non sono ancora considerati criterio di laboratorio per la classificazione dell'APS e la loro rilevanza clinica e' al momento oggetto di dibattito. Inoltre gli aPL non sono considerati soltanto strumenti di classificazione dell'APS, ma anche parametri per la stratificazione del rischio di sviluppare le manifestazioni cliniche della malattia. In particolare, gli anticorpi anti-Beta2GPI specifici per un preciso epitopo situato nel Dominio I della molecola sembrano essere associati maggiormente al rischio di trombosi piuttosto che all'impegno ostetrico e di conseguenza sarebbero correlati a un quadro clinico piu' severo dell'APS. Obiettivi. Lo scopo della tesi e' stato di confrontare la performance di un ELISA home made con quella delle tecniche FEIA e CLIA nel rilevamento degli anticorpi aCL IgG/IgM e anti-Beta2GPI IgG/IgM in un'ampia e omogenea coorte di pazienti affetti da sindrome da anticorpi antifosfolipidi primaria (PAPS) e in un gruppo di soggetti con i criteri clinici per la classificazione di APS ma ELISA negativi per i criteri di laboratorio. I risultati sono stati confrontati con quelli ottenuti in un gruppo di controllo comprendente donatori sani e pazienti con malattie autoimmuni diverse dall'APS. Successivamente e' stata valutata la rilevanza clinica degli aCL e anti-Beta2GPI di classe IgA e degli anticorpi anti-Dominio I (anti-DI) di isotipo IgG in un'ampia ed omogenea coorte di pazienti affetti esclusivamente da PAPS. Inoltre, la sensibilita'  diagnostica di questi anticorpi e' stata valutata in un gruppo di pazienti sieronegativi per gli aPL convenzionali, ma con manifestazioni cliniche di APS. Di entrambi gli anticorpi e' stato anche indagato il valore prognostico nell'ambito dell'APS. Metodi. Gli aCL e gli anti-Beta2GPI di classe IgG/IgM/IgA sono stati determinati usando il metodo FEIA (EliA TM, Phadia AB, Sweden). Inoltre gli aCL e anti-Beta2GPI di classe IgG/IgM sono stati anche analizzati assieme gli anticorpi anti-DI IgG utilizzando il metodo CLIA (HemosIL AcuStar®). Le raccomandazioni del produttore sono state seguite scrupolosamente per entrambe le tecniche. Per il confronto dei risultati ottenuti con le diverse metodiche e' stato usato un test ELISA home made, eseguito seguendo le raccomandazioni del Forum europeo sugli aPL. Tutti i sieri sono stati testati anche per LA seguendo le linee guida aggiornate utilizzando il tempo di veleno di vipera Russell ed il tempo di protrombina parziale attivata, entrambi con fosfolipidi diluiti, come tests di screening. Risultati e Conclusioni. (1) Confronto ELISA home made con FEIA. Le sensibilita'  delle tecniche ELISA home made e FEIA sono risultate essere simili ad eccezione degli aCL di classe IgM che sono risultati significativamente piu' frequenti nei pazienti PAPS con il metodo ELISA. I due metodi avevano una specificita' simile, un'elevata concordanza e una correlazione significativa tra i livelli anticorpali. Inoltre il metodo FEIA non ha rilevato alcuna significativa prevalenza degli anticorpi antifosfolipidi nei pazienti ELISA negativi, ma con manifestazioni cliniche di APS. In conclusione, questi risultati suggeriscono che il metodo FEIA e' paragonabile al test ELISA home made. Se confermato da altri studi su ampie casistiche di pazienti affetti da PAPS, questi risultati potrebbero supportare l'uso del FEIA nella determinazione degli aCL e anti-Beta2GPI nell'analisi di routine. Risultati e Conclusioni. (2) Confronto ELISA home made con CLIA. Quando e' stata confrontata la tecnica ELISA home made con la tecnica CLIA, e' emerso che il metodo CLIA aveva una sensibilita' significativamente piu' bassa per gli aCL IgM e gli anti-Beta2GPI IgG/IgM rispetto a quella dell'ELISA; invece la sua specificita' e' risultata significativamente piu' alta per gli anticorpi aCL IgM e anti-Beta2GPI IgM. Le due tecniche hanno mostrato un'alta e significativa concordanza e una significativa correlazione dei titoli anticorpali. Inoltre il CLIA ha rilevato gli anticorpi aCL IgG/IgM e anti-Beta2GPI IgG nei pazienti sieronegativi in ELISA. Vi era infatti una prevalenza di aCL IgG e di anti-Beta2GPI IgG significativamente maggiore nei pazienti sieronegativi con i criteri clinici di APS che nella popolazione sana di controllo. In conclusione, il metodo CLIA, nonostante una minore sensibilita', ha mostrato una specificita' piu' alta per alcuni aPL e un buon livello di concordanza e di correlazione con la metodica ELISA home made. Il CLIA, inoltre, e' stato in grado di rilevare gli aCL IgG e gli anti-Beta2GPI IgG nei pazienti sieronegativi non identificati dall'ELISA. Se confermato da ulteriori studi, il CLIA potrebbe essere considerato un metodo valido per la valutazione di pazienti con manifestazioni cliniche di APS, ma con gli aPL negativi al test ELISA home made. Risultati e Conclusioni. (3) Gli aCl e gli anti-Beta2GPI di classe IgA: Gli aCL e gli anti-Beta2GPI di classe IgA sono stati testati con il metodo FEIA e sono risultati sgnificativamente presenti rispettivamente nel 19% e nel 50% dei pazienti affetti da PAPS. I loro titoli medi erano piu' elevati nei pazienti con impegno trombotico rispetto alle pazienti con impegno ostetrico. Tuttavia solo gli anti-Beta2GPI IgA erano significativamente associati alla trombosi. Quando sono stati analizzati i pazienti FEIA negativi per aCL IgG/IgM e per anti-Beta2GPI IgG/IgM ma con le caratteristiche cliniche di APS, nel 10,6% di essi sono stati trovati gli anticorpi anti-Beta2GPI IgA. Questo dato e' risultato essere significativo nel confronto con la popolazione sana di controllo. In conclusione, la positivita' per gli anticorpi anti-Beta2GPI IgA definita con il metodo FEIA e' risultata clinicamente rilevante nei pazienti PAPS. Inoltre la presenza di anticorpi anti-Beta2GPI IgA era significativa nei pazienti sieronegativi per gli isotipi IgG e IgM. Questi risultati suggeriscono che nei pazienti con segni/sintomi clinici di APS, ma che non soddisfano i criteri di laboratorio per gli anticorpi antifosfolipidi convenzionali si potrebbero determinare gli anticorpi anti-Beta2GPI di classe IgA al fine di incrementare la sensibilita'  diagnostica per APS. Risultati e Conclusioni. (4) Gli anti-DI IgG: La sensibilita' e la specificita' degli anticorpi anti-DI IgG rilevati con il metodo CLIA erano paragonabili a quelle degli anticorpi aCL IgG e anti-Beta2GPI IgG. Si e' riscontrata una significativa concordanza, un'associazione e una correlazione dei titoli anticorpali degli anti-DI IgG con gli aCL IgG e gli anti-Beta2GPI IgG. Inoltre gli anticorpi anti-DI IgG hanno mostrato una minore prevalenza e titoli medi piu' bassi nelle complicanze ostetriche rispetto ai pazienti con trombosi e ai pazienti con entrambi i coinvolgimenti clinici. Per quanto riguarda i profili anticorpali degli aPL convenzionali, il gruppo con la triplice positivita' antifosfolipidica ha mostrato una maggiore prevalenza e maggior titoli medi degli anticorpi anti-DI, rispetto ai gruppi con singola e duplice positivita'. In conclusione, gli anti-DI, rilevati con la tecnica CLIA, possono essere considerati dei promettenti biomarkers per la valutazione del rischio clinico di trombosi vascolare e di triplice positivita' per gli aPL convenzionali, solitamente associata ai quadri clinici piu' severi di APS. Pertanto, essi possono costituire uno strumento aggiuntivo utile per eventuali decisioni cliniche e terapeutiche.

L'activitat de grup sanguini A en els eritròcits, quan aquesta ha estat referida a substàncies no lipídiques, s'ha assignat de forma concreta a la glicoforina A, la glicoproteïna més gran present en la membrana, i també a l'anomenada banda 3 la principal proteïna de l'eritròcit. En altres casos l'activitat de grup sanguini ha estat relacionada amb altres glicoproteïnes sense especificar-ne els trets més característics.

En base a aixó, l'objectiu de la tesi ha estat la caracterització fisico-química i estructura d'una molècula que químicament tingui naturalesa glicoproteïnica, anant acompanyada aquesta d'activitat de grup sanguini A.

Així, a partir de sang de 18 donants sans s'han obtingut les membranes de l'eritròcit per mitjà de la lisi hipotònica. La presència d'activitat acetilcolinesterasa en les membranes indica que les vesícules s'han tancat amb la mateixa orientació que tenien els eritròcits abans de la lisi. Les membranes, un cop homogenitzades, dialitzades i liofilitzades, s'han sotmes al procés de solublització, és a dir, el procés que converteix l'estat complexe de la membrana intacta en un estat més senzill que permeti l'anàlisi dels components de la membrana per mètodes que no poden aplicar-se a la membrana intacta.

Després de realitzar un estudi comparatiu amb tres tècniques solubilitzadores, s'ha escollit la fonamentada amb l'extracció dels lípids per la mescla cloroform-metanoI (2:1, v/v). A continuació, les glicoproteïnes es precipiten de la fase aquosa per adició d'etanol (concentración final del 60 %) i manteniment durant 48 h a -20°C en presència de clorur sòdic.

Les glicoproteïnes es purifiquen per cromatografia de filtració per gel (Sephadex G-75) i per cromatografia d'afinitat fent passar les glicoproteïnes a través d'un gel que contenia la lectina Helix pomatia (Helix pomatia Lectin - Sepharose 6MB), que específicament uneix les glicoproteïnes que porten com a sucre terminal la N-acetil-D-galactosamina, glúcid característic de les glicoproteïnes amb activitat de grup sanguini A.

La glicoproteïna eluïda de la columna per una concentración 0.1 M de N-acetil-D-galactosamina té una capacitat inhibitòria de l'hemaglutinació de 38.82 micrograms/mL, amb una forquilla de 39.43 i 38.21 micrograms/mL, per un Iímlt de confiança alfa=90. L'anàlisi dels aminoàcids i glúcids corresponents ha proporcionat uns percentatges respectius de proteïna i sucres del 41.05 i 58.95. Cal destacar l'alta presència de serina i treonina (aminoàcids que en una glicoproteïna són els que uneixen la cadena glucídica al nucli peptídic), la molt baixa proporció d'aminoàcids cromòfors (triptofan i tirosina), la qual cosa explica que la molècula no presenti una marcada absorció pels voltants dels 280 nm i també justifica el baix valor del coeficiente d'absorció específica (0.4324 L/g. cm). La molècula no conté cisteïna i, per tant, no poden existir enllaços disulfuro intramoleculars. Pel que fa als glúcids, la meitat d'aquestos corresponen a hexosamines, trobant-s'hi també hexoses neutres i àcid siàlic.

La valoració de la glicoproteïna pel mètode clàssic de Lowry presenta una gran pèrdua de sensibilitat envers la que el mètode presenta quan hom valora una proteïna estàndard, com és ara el cas de I'albúmina sèrica bovina.

Per aixó, s'ha desenvolupat un mètode per a quantificar les glicoproteïnes basat en determinar per espargiment de la llum ("light scattering") la turbidesa produïda per l'adició d'etanol a la solució de glicoproteïna. Aquest mètode per l'afició d'etanol a la solució de glicoproteïna. Aquest mètode, a més de precís, no és destructiu.

El valor de la masa molecular calculat per a la glicoproteïna ha estat de 53500 ±4280 Da (per light scattering), de 41500 Da (per anàlisi d'aminoàcids) i de 76000 la forma dimèrica i 43000 la monomèrica (per PAGE-SDS). La cromatografia de filtració per gel no és adient per a determinar la masa molecular atès que proporciona valors molt superiors als reals a causa de l'efecte distorsionant de l'àcid siàlic i de la possible capacitat d'autoagregació.

Entre les propietats físico-químiques estudiades (absorció a l'espectre U.V., dependència de la turbidesa amb la longitud d'ona, espectroscòpia derivativa, variación de l'espectre d'absorció a l'U.V. en funció del pH, ionització dels grups fenòlics, absorció a l'espectre I.R., dispersió rotatòria òptica (D.R.O.), comportament cromatogràfic, viscositat, punts isoelèctric i isoiònic, volum específic parcial, increment de l'índex de refracció i solubilitat), destaquen aquelles que proporcionen una més gran informació sobre la molècula, cas de la D.R.O. i de la viscositat. L'espectre de D.R.O. de la glicoproteïna presenta una vall negativa de feble magnitud a 234 nm, mentre que els valors de la viscositat intrínseca i de la constant d'Huggins apunten vers una estructura de la molècula en cabdell monoestadístic ("random coil").

A partir de les característiques estructurals determinades s'ha pogut obtenir que la glicoproteïna té una estructura molt expandida (37.70 nm de radi de gir), que presenta un 50 % de cabdell monoestadístic, un 30 % d'alfa-helix i un 20 % de beta-fulla (segons els valors obtinguts entre 220 i 250 nm, aplicant els tractaments de Greenfield et al. i Chen et al.), i que els aminoàcids cromòfors es troben tant en l'interior com en l'exterior de la molècula (estudi de l'acció dels agents pertorbants no polars: urea, d,ioxà i polietilenglicol).

Finalment, s'ha estudiat per diferents tècniques l'estabilitat estructural de la glicoproteïna enfront del clorhidrato de guanidina, la urea i la calor. Amb els resultats obtinguts pot arribar-se a la conclussió que la glicoproteïna és molt estable; que, a més, l'acció desnaturalitzant és reversible i que el procés de desnaturalització és complexe, no podent ésser identificat amb un procés en dos estats, natiu i desnaturalitzant, com succeeix en moltes proteïnes.
"DETERMINATION OF ESTRUCTURAL PARAMETERS FROM A GLYCOPROTEIN BEARING BLOOD GROUP A ACTIVITY"

TEXT:
A physicochemical, structural study about a human blood group-A glycoprotein (GP) has been carried out. GP was purified through an affinity column, which contains the lectin Helix pomatia. The main chemical characteristics are: low content of chromophores aminoacids, Jack of cysteine, high content of serine and threonine, and of hexosamines, too.

Owing to the chemical properties of the GP, the Lowry's method valoration is not suitable, and for this reason, it has been developed a new method based on quantifying by light scattering the turbidity that is produced by the addition of absolute ethanol.

The molecular mass of GP is 53500 (determined by light scattering), or 41500 (amino acid analysis), while it presents a 76000 Da dimer form and a 43000 Da monomer form by PAGE-SDS.

The following physicochemical parameters have been determined: absorption in the U.V. spectrum, derivative spectroscopy, variation of spectrum as pH function, ionization of phenolic groups, absorption in the I.R. spectrum, optical rotatory dispersion, viscosity, isoionic and isoelectric points, partial specific volume, solubility and increase of index refraction. Beyond that, the gyration radius, conformation and the action of disturbing agents (urea, dioxane and polyethyleneglycol) have been studied.

Eventually, the structural stability of GP has been determined in front of guanidine hydrochloride, urea and heat.

The results show the GP has a mainly random coil structure, and in this fact, there is a great concordance among the values obtained with O.R.D., viscosity... On the other hand, the molecule is very stable and the denaturalization process is reversible and not involves a mechanism in two steps.

Antitrombina (AT), uma proteína membro da família dos inibidores de serino proteases, é uma glicoproteína que co-existe em duas isoformas, a e b, que se diferenciam pelo conteúdo de glicosilação e pela afinidade por glicosaminoglicanos (GAG), um grupo de polissacarídeos polisulfatados, dentre as quais se destaca a heparina. AT é ativada quando ligada a GAGs, tornando-se assim capaz de inibir, com alta eficiência, proteases da cascata de coagulação como trombina e fXa. Essas enzimas formam complexos ternários com heparina e AT, sendo cada uma subsequentemente inibidas preferencialmente por um mecanismo de ação distinto: [1] baseado em mudanças conformacionais (fXa), ou pelo [2] mecanismo de ponte (trombina). Adicionalmente, já foi observado que heparina isoladamente pode modular a atividade catalítica de fIIa e fXa. Considerando a falta de dados estruturais a respeito dos efeitos da glicosilação sobre a estrutura e flexibilidade de AT, bem como sobre o reconhecimento heparina-AT, e que as bases moleculares da inibição alostérica de fIIa e fXa por GAGs não é bem compreendida, o presente trabalho visa caracterizar o reconhecimento molecular de heparina por essas proteínas, através de dinâmica molecular (DM). Os resultados obtidos indicam que a heparina interage de forma diferente nas glicoformas de AT devido a uma interferência da glicana ligada à Asn135. Da mesma forma, diferentes arranjos do GAG na superfície de trombina e fXa podem estar relacionadas às suas diferentes susceptibilidades aos mecanismos de ação de heparina, uma vez que sua orientação na superfície de fIIa, mas não fXa, permite uma interação adequada com AT em complexos ternários. Nesse contexto, foi observado, durante as simulações, que heparina inibiu alostericamente trombina e fXa, promovendo mudanças na conformação da tríade catalítica das proteases, e ativou AT, promovendo rearranjos intramoleculares entre seus elementos de estrutura secundária. Em ambos os casos, as vias de transmissão de sinal associadas a essas mudanças de atividade foram traçadas pela primeira vez nesse trabalho. De forma geral, os resultados obtidos conferem novas evidências de que a glicosilação tem um papel crucial na ativação diferencial de a- e b-AT por heparina, e que a orientação de GAGs na superfície de trombina e fXa é o que determina o mecanismo de sua modulação por heparina.
Antithrombin (AT), a member of the serpin protease inhibitors family, is a glycoprotein that co-exists in two isoforms, a and b, which differ in their amount of glycosylation and affinity for glycosaminoglycans (GAG), a group of sulphated polysaccharides, as heparin. AT is activated when bound to GAGs, becoming capable to inhibit coagulation cascade serine proteases like thrombin and fXa. Such enzymes form ternary complexes with heparin and AT, being subsequently inhibited by two distinct mechanisms of action: [1] the conformational change-based mechanism or the [2] bridge mechanism. In addition, heparin binding itself was also observed to modulate the catalytic activity of both fIIa and fXa. Considering the lack of structural information regarding the effect of glycosylation over the structure and flexibility of AT, as well as in heparin-AT recognition, and that the molecular basis of the allosteric inhibition of fIIa and fXa, promoted by such GAG, is not fully understood, the current work intends to characterize the molecular recognition of heparin by such proteins through molecular dynamics (MD) simulations. The obtained results indicate that heparin binds differently on AT glycoforms due to an interference of Asn135-linked glycan. As well, distinct arrangements of the polysaccharide on the surface of thrombin and fXa may be related to their diverse susceptibilities to heparin mechanisms of action, as heparin orientation observed on the surface of fIIa, but not fXa, allows for an adequate long chain heparin binding to AT in ternary complexes. In this context, heparin was observed to allosterically inhibit thrombin and fXa by promoting changes in the proteases catalytic triad conformation, but to activate AT by promoting intramolecular rearrangements on its secondary structure elements. In both cases, the signal transmission pathways associated with such activity changes were traced by the present work for the first time. Altogether, the obtained results provide new evidences that glycosylation play a central role on the differential activation of a- and b-AT by heparin, and that GAGs orientation on the surface of thrombin and fXa determine the mechanism of their modulation by heparin.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Florianópolis, 2009.
Made available in DSpace on 2012-10-24T10:34:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 267109.pdf: 2512191 bytes, checksum: e295f900d947bb3205275b90dad59fb5 (MD5)
A proteína prion celular (PrPC) é uma glicoproteína ancorada aos neurônios que tem sido associada a diversas funções no sistema nervoso central (SNC) como: neuroplasticidade, formação de placas senis e controle de mecanismos de estresse oxidativo. O processo de envelhecimento é um estado frequentemente acompanhado por um declínio em diversos aspectos sensorimotores e cognitivos. No presente estudo, investigamos o envolvimento da PrPC em alterações comportamentais e neuroquímicas relacionadas ao envelhecimento em camundongos selvagens (wild-type) (Prnp+/+), nocautes para PrPC (Prnp0/0) e camundongos que apresentam expressão aumentada de PrPC (Tg-20). Os animais destas linhagens com 3 ou 11 meses de idade foram submetidos a uma bateria de testes comportamentais incluindo os testes do campo aberto, caixa de atividade, labirinto em cruz elevado, memória social e a esquiva inibitória do tipo step-down. Camundongos Prnp+/+ e Prnp0/0 de 11 meses de idade exibiram prejuízos na atividade locomotora e na capacidade de reconhecer um camundongo jovem após um curto período de tempo assim como aumento nas respostas relacionadas à ansiedade. De forma interessante, camundongos Tg-20 não apresentaram os mesmos prejuízos comportamentais relacionados à idade e a infusão intracerebroventricular do peptídeo 230-245 da STI1, que inclue a porção de ligação a PrPC, reverteu estes distúrbios de memória de curto prazo relacionados a idade em camundongos Prnp+/+. Camundongos Tg-20 também exibiram níveis reduzidos de acetilcolinesterase sérica em comparação com os outros dois genótipos. Análises de imunohistoquímica revelaram expressão aumentada de proteínas hipocampais associadas à morte celular apoptótica e de plasticidade neuronal, respectivamente, caspase-3 e sinaptofisina, em camundongos Tg-20. Os resultados do presente estudo reforçam a hipótese da PrPC apresentar papel neuroprotetor e sugerem o seu envolvimento em algumas alterações comportamentais e neuroquímicas relacionadas ao xvi envelhecimento via sistema colinérgico e modulação da sinaptogênese e morte celular apoptótica.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Florianópolis, 2015.
Made available in DSpace on 2016-03-15T04:05:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 337678.pdf: 8258436 bytes, checksum: 67a6ef5115efff20ad348e0c04dc547b (MD5) Previous issue date: 2015
A chegada dos neutrófilos até o foco da inflamação desenvolve papelessencial na resposta inflamatória. Além de serem uma populaçãocelular fundamental para conter e eliminar o patógeno, seu acúmulo levaao dano tecidual uma vez que essas células não são capazes dediscriminar entre as células do hospedeiro e o agente causador dainflamação Neutrófilos se acumulam no local da inflamação através deuma série de eventos sequenciais, entre eles a quimiotaxia. Aquimiotaxia é responsável por guiar os neutrófilos até o foco exato dainflamação. Estudos experimentais demonstram que a proteína de faseaguda Alfa-1-glicoproteína ácida (AGP) é capaz de interferir nesseprocesso, pois inibe o rolamento, a adesão e a migração dos neutrófilosin vivo, assim como a quimiotaxia in vitro. Altamente glicosilada,aproximadamente 12% dos carboidratos da AGP são de ácido siálico.Dentre os receptores que reconhecem os ácidos siálicos estão as lectinasdo tipo Siglecs (Sialic acid binding Ig-like lectins). Siglecs apresentamem sua estrutura um domínio inibitório capaz de interferir na respostaintracelular ativada por outros receptores. Assim, a hipótese deste estudoé de que os resíduos de ácido siálico presentes na estrutura da AGPseriam responsáveis pela ativação de Siglec-5 e/ou 9, inibindo aquimiotaxia dos neutrófilos. Para investigar essa hipótese, foi geradauma AGP desialilada sem a presença desse carboidrato. Neutrófilostratados com essa proteína foram submetidos a um ensaio dequimiotaxia em câmara de Boyden. Esse ensaio revelou que a retiradado ácido siálico reverteu o perfil inibitório induzido pela proteínasialilada. Ainda mais, os resultados demonstram que o ácido siálico emsua forma livre também foi capaz de inibir a quimiotaxia de maneiraequivalente à AGP. Sabendo que a AGP é capaz de ligar-se à superfíciedos neutrófilos, procurou-se investigar se essa interação ocorre atravésda ligação do ácido siálico à Siglec-5 ou 9. Para isso foi feita umacitometria de fluxo e avaliada a intensidade de fluorescência emitidapela AGP ou por anticorpos fluorescentes anti-hSiglec-5 e 9, quando napresença de anticorpos neutralizantes hSiglec-5 e 9 ou da AGP nãomarcada, respectivamente. No entanto nenhuma diferença na média deintensidade de fluorescência foi observada. Em conjunto nossoresultados sugerem que o reconhecimento do ácido siálico é necessáriona inibição da quimiotaxia induzida pela AGP.

Abstract : Neutrophil recruitment has a central role in host response and inresolution of inflammation, but if uncontrolled can lead to severe tissuedamage. Overwhelming activation of neutrophils result in aninappropriate infiltration of neutrophils known to elicit cell and tissuedamage that can lead to an organ dysfunction. The acute phase proteinAlpha-1-acid glycoprotein (AGP) was shown to inhibit neutrophilmigration, rolling and adhesion in vivo. AGP also inhibits neutrophilchemotaxis in vitro, and evidence suggests that AGP terminal sialic acidresidues interact with an inhibitory receptor known as Siglec (Sialicacid-binding immunoglobulin-like). However, how AGP affectsneutrophil-response is not completely understood. In this study, weexamine mechanisms related to the effect of AGP on neutrophilchemotaxis responses, and we hypothesized that Alpha-1-acidglycoprotein inhibits neutrophil chemotaxis in vitro by Siglec-5 e/or 9activation. AGP 6µM inhibits neutrophil migration in vitro, as does6µM of sialic acid, when compared with control neutrophils.Neuraminidase treatment of AGP reversed the suppressive effect of theprotein. To investigate how AGP interacts with neutrophils, flowcytometry analyses using AGP labeled with Alexa Fluor 488 andhSiglec-5 and 9 neutralizing antibodies, or AGP and hSiglec-5 and 9fluorescent antibodies were used. Although no difference in the MFIwas observed. Taken together these results suggest that sialic acidrecognition is required for its inhibitory function, and that the interactionof AGP with neutrophils depend on this carbohydrate. However, thisstudy was not able to determine if this interaction was due to the ligationof AGP sialic acid to the receptor Siglec-5 and/or -9.

O conhecimento da glicobiologia estrutural se mantém como a parte menos explorada do estudo de estrutras tridimensionais. Considerando que a glicosilação pode estar envolvida em processos biológicos como crescimento celular e inflamação o descrever das bases moleculares da interação proteína-carboidrato pode auxiliar na compreensão destes eventos. Neste sentido considerando o pequeno número de trabalhos avaliando o perfil conformacional de glicoproteínas por simulação de dinâmica molecular e RMN este trabalho demonstrou que o campo de força GROMOS43a1 é capaz de representar adequadamente um conjunto de glicoproteínas tendo como conformação inicial as estrutras determinadas por RMN. O próximo desafio foi simular dissacarídeos isolados em solução e comparar o seu perfil aos estudos anteriores, o que demonstrou que o conjunto de conformações de cada dissacarídeo representa as conformações obtidas em ambos os métodos. Para validar o uso de conformações de dissacarídeos como unidades de construção de glicanas em glicoproteínas foi descrita a forma glicosilada das enzimas Cox-1 e Cox-2, que não possuíam a estrutura da glicosilação, e as conformações das glicanas nestas simulações foram similares as dos dissacarídeos, comprovando que as conformações de dissacarídeos podem ser extrapoláveis para construção de glicoproteínas. Finalmente foi construída a forma glicosilada da AGP humana, uma proteína que possui diferenças funcionais associadas ao perfil das glicanas ligadas. Sabe-se que em casos de resposta inflamatória a concentração plasmática da AGP pode ser aumentada em até cinco vezes a concentração normal e durante este aumento há uma diferença no número de ramificações das glicanas e presença de resíduos de fucose. Foram simuladas três estrutras AGP, sem glicosilação e glicosilada com a presença e ausência de fucoses,. A flexibilidade da estrutura não glicosilada é muito maior que das glicoproteínas, mostrando o papel estrutural da glicosilação. Adicionalmente foi estudada a interação que a AGP com selectinas, proteínas envolvidas nos processos inflamatórios, fornecendo dados preeliminares do papel molecular da interação AGP-selectina.
The knowning of strucutural glycobiology still the less explored area in threedimensional structures. Considering the envolviment of glycosylation in biological process such cellular grown and inflammation describe the molecular basis interactions of protein-carbohidrate may facilitate understanding of these events. In this way considering the small number of works evaluated the conformational profile of glycoproteins by molecular dynamics simulations and NMR this work demonstrate that the GROMOS96 43a1 force field adequately represent a glycoprotein’s conformational ensemble taking as the starting geometries, the NMR determined structures. The next step is simulate isolated disaccharides in solution and compare these proflite with previous work, which demonstrate that the conformational ensamble of disaccharides represents the conformations obtain in both methods. To validate the use of disaccharides conformations such construct units of glycans in glycoproteins, the glycosylated form of Cox-1 and Cox-2 with no previous structure were simulated, and the conformations of glycans were similar to disaccharides, proving that disaccharides conformations can be extrapolated to construct glycoproteins. Finaly it was construct the glycosylated form of human AGP, a protein with functional differentces associated to glycan linked profile. In cases of inflammatory response the the plasma concentration can rise up to fivefold and in this case the glycans differ in the branching and presence of fucose residues. Three structures of AGP were construct, unglycosylated and glycosylated with and without fucoses. The structural flexibility of unglycosylated form was higher than the glycosylated forms, demonstrated the structural role of glycans. Additionally it was study the interaction of AGP with selectins, proteins envolved in inflammatory process, supply preliminary data to molecular role of AGP-selectin interaction.

Aim of this work is to clarify the human herpervirus 8 vOX2 activity in monocytes-macrophages in order to define its funtional role in Kaposi Sarcoma pathogenesis. Kaposi’s Sarcoma (KS) is an inflammatory cytokines-mediated angioproliferative disease triggered by human herpesvirus 8 (HHV-8) infection. This virus is unique because of its extensive molecular piracy of host critical cell regulatory and immune modulatory genes encoding proteins that could contribute to viral immune evasion and tumorigenesis. Among them we can find the vOX2 glycoprotein. Cellular homologous OX2 is a member of the immunoglobulin superfamily. This glycoprotein is expressed by several cell types in vivo and it down-modulates inflammatory response through the interaction with a specific receptor of the myeloid cells, the CD200R. By this mechanism, cellular OX2 prevents autoimmune disease, displaying immune modulatory functions. This latter feature is also present in the HHV-8 vOX2. Indeed, several reports suggest that the vOX2 has an anti-inflammatory and immunosuppressive activity in basophil and neutrophil cells, but its effect on monocytes-macrophages is still controversial. The aim of our work is to clarify the vOX2 activity in monocytes-macrophages in order to define its functional role in KS pathogenesis. The relevance of monocytesmacrophages relies on the fact that this cell type is infected by HHV-8 in vivo, it is present in KS lesions and it expresses CD200R that functions as a receptor for vOX2 exactly like it does for cellular OX2. We decided to express the viral glycoprotein into two different monocyticmacrophagic cell lines (U937 and THP1) and/or into PBMC-derived macrophages (primary MØ) for our study. Compared to chemical and physical methods, the viral transduction has resulted the most efficient system to transfer transgenes into the target cells; based on this finding, the HHV-8 orf K14 encoding vOX2 has been cloned into HIV-1 based lentiviral vector that has been used to transduce the cells. After verifying the vOX2 expression in the transduced target cells, we evaluated the glycoprotein effect on the transcription level and secretion of two inflammatory cytokines involved in the KS development, TNF? and IL-1?. Our data show that the vOX2 up-regulates both TNF? and IL-1? in U937 and THP1 cell lines and in primary MØ kept in basal conditions. In addition, the TNF? and IL-1? up-regulation was observed in the IFN?-activated U937 cell line. By contrast, in the IFN?-activated THP1 cell line and primary MØ the viral glycoprotein inhibits TNF? and IL-1? gene expression. Taking into account these controversial data in the different cell types, in order to carry on our research in a model more representative of the physiological condition, we checked the expression of vOX2 receptor on U937 and THP1 cell line and on primary MØ. Since the primary MØ resulted to be the only cell type expressing CD200R, we decided to evaluate the vOX2 activity employing this cellular system. However, being the level of viral protein expression in primary MØ low compared to the one obtained in the cell lines, we performed coculture between THP1 CD200R¯ cell line expressing vOX2 and primary MØ CD200R+ in order to confirm the results on inflammatory-cytokines modulation by vOX2. Our data show that the vOX2 promotes TNF? secretion in the primary MØ in basal conditions; on the contrary, in the IFN?-activated cells the viral glycoprotein induces a significant reduction of cytokine production as we observed in monoculture of primary MØ expressing vOX2. Starting from these data, we next evaluated the vOX2 effect on the transcription level of IL-10, an inhibitory cytokine of the TNF? and IL-1?-mediated inflammatory responses. Our data show that IL-10 expression profile is the opposite with respect to TNF? and IL-1?, as we expected. Moreover, these results are in agreement with the CD200R mRNA down-modulation that we observed in basal conditions and with its up-regulation in the IFN?-activated cells. In addition, we were able to show that vOX2 promotes the phagocytosis of the primary MØ in basal conditions while it inhibits this activity in the IFN?-activated cells. Our results suggest that the immune modulatory activity of vOX2 is tightly dependent on the activation state of the cells. This conclusion is also supported by the analysis of vOX2 effect on the global gene expression profile in the primary MØ. Finally, we observed that the antigen presentation to T cells by primary MØ is compromised by vOX2 expression regardless of the activation state of the cells. This effect seems to be related to the down-modulation of HLA expression on cell surface. Overall, our results lead to the conclusion that vOX2 may be involved in viral immune evasion because of its anti-inflammatory and immunosuppressive effect in the activated monocytes-macrophages. At the same time, in basal conditions, vOX2 can also stimulate monocytes-macrophages contributing to the inflammatory state that is important for the KS development. This finding would imply the presence of at least one unknown receptor that would compete with the “inhibitory receptor” CD200R for the binding to vOX2. An immune modulatory activity of vOX2, linked to cell activation state, could explain the contradictory results reported in literature.

Orientador: Jaime Aparecido Cury
Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba
Made available in DSpace on 2018-07-14T07:59:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Costa_CelsoPaulinoda_D.pdf: 4369740 bytes, checksum: cd49f02fe75b95d94f51aac52e00a458 (MD5) Previous issue date: 1989
Resumo: Lectinas são prot.einas que se ligam a açúcares especifiicos de macromoléculas. Foram descritas inicialmente em plantas, porém de outras fontes já foram isolados como bactérias, animais e até mesmo mamíferos. As lectinas apresentam várias propriedades como hemaglutinação, aglutinação, de bactérias, protozoários, leucocitos, estímulo mitogênico para linfócitos e entre outras a reação e precipitação de glicoproteinas, incluindo imunoglobulinas. As glicoproteinas constituem um grande grupo de substâncias presentes na saliva e soro, dentre elas a imunoglobulina A. Tem sido descrito que lectina de semente de jaca reage com IgA presente no soro e secreções humanas. Neste t.rabalho procuramos verificar se a lectina de semente de jaca, específica para galactose, reagia com imunoglobulina A, salivar, e se era especlfica para esta glicoproteina, comparando as reações com as glicoproteinas do soro. Através de técnicas de dupla difusão em gel de agarose, eletroforese em gel de agarose e poliacrilamida, com saliva e soro deficiente em imunoglobulina A, verificamos que esta lectina reage com outras glicoproteinas da saliva e do soro além da imunoglobulina A. Após o fracionamento do extrato bruto de semente de jaca, por cromatografia de afinidade em agarose-D-galactose, verificamos a existência de outra lectina neste extrato, não específica para galactose, com atividade precipitante para várias proteinas do soro humano. As proteinas da saliva e soro separadas eletroforeticamente em géis de poliacriamida ragem com soluções de lectina. A reação é especifica, pois as proteinas que apresentam afinidad para as lectinas ficam imobilizadas, enquanto que outras se difundem do gel quando em soluções tampões. Est.a t.écnica mostrou-se adequada para o estudo de glicoproteinas da saliva e soro humano normal e patologico
Abstract: Interaction of lectins of jack seeds Artocarpus integrifolia, with salivay and human serum glycoproteins. Lectins are proteins which bind to specific saccharides in polysacharides, glycoproteins or glycolipds. Although originally described in plants, they have been isolated from many diverse sources like bacterias and animal including smails, sponges, fish and others. The lectins have many biological activities like erythrocyte bacterial, protozoal, leukocytes aglutination, produce mitogenic effect on lymphocyte culture, and precipitate glycoproteins, as the immunoglobulins. The gycoproteins are important group in t.he salivary and serum components, included immunoglobulin A. Our aim was determine if the lectin of jack seed (galactose specific) reacts specifically with salivary immunoglobin A when compared with serum glycoprotelns. Through double agar diffusion and electrophoretic separation in agarose and polyacrylamide gels of Ig-A deficient saliva and serrum, we observed that other glycoproteins present in saliva and serum react with this lectin. The fractioned crude extracts of jack seeds by affinty chromatography with agarose-D-ga!actose resulted in a lectin specific to galactose. The other proteins that didn't bind to galactose, also react and precipitate various serum proteins. The salivary and serum proteins separated in disc polyacrylamide gels react with lectins solutions. The reaction is specific because only some proteins are retained into gel after repeated wash in buffer. This procedure was shown to be useful for study normal and pathological human salivary and serum glycoproteins
Doutorado
Biologia e Patologia Buco-Dental
Doutor em Odontologia

Made available in DSpace on 2014-11-10T11:09:39Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-04-04Bitstream added on 2014-11-10T11:58:06Z : No. of bitstreams: 1 000785503_20150404.pdf: 497224 bytes, checksum: a459a5b949a60edee526c57ea3fc8d80 (MD5) Bitstreams deleted on 2015-04-13T18:26:26Z: 000785503_20150404.pdf,Bitstream added on 2015-04-13T18:27:06Z : No. of bitstreams: 1 000785503.pdf: 1639502 bytes, checksum: 2fca464d3fcaa51a719adf9dfb1cd8d2 (MD5)
Interferons (IFNs) são pequenas proteínas conhecidas por suas atividades antiproliferativa e imunorregulatória e por seu envolvimento crucial na ação antiviral celular. Os IFNs do tipo I incluem os IFN-α, β e ω e são utilizados terapeuticamente no tratamento de diversos tipos de cânceres e hepatites B e C. Sabe-se que dentre os efeitos adversos causados pelo IFN-α estão as disfunções endócrinas. Pouco se sabe sobre os efeitos dos IFNs na reprodução. Assim, o presente estudo objetivou investigar, em ratos adultos, os efeitos da exposição subcrônica a diferentes doses de IFN-α sobre parâmetros reprodutivos masculinos. No experimento 1, ratos Wistar adultos (90 dias/350-470g) foram distribuídos em três grupos experimentais (n=10), sendo um controle, cujos animais receberam o veículo, e dois tratados, subcutaneamente, com as doses de 5x104 unidades/Kg e 10x104 unidades/Kg, diluídas em salina. Após 30 dias de tratamento os animais foram pesados e eutanasiados para coleta dos órgãos do sistema genital. Testículo e epidídimo direitos, próstata ventral e glândula seminal (sem a glândula coaguladora) de cada animal foram retirados e pesados. Testículos e epidídimos direitos foram utilizados para determinação do número de células germinativas e os epidídimos esquerdos para a coleta de espermatozoides para avaliação da motilidade e morfologia espermática e para serem usados nas inseminações artificiais intrauterinas. Os níveis séricos de testosterona também foram mensurados. No experimento 2, outro lote de animais, seguindo o mesmo design experimental, foi utilizado para a coleta dos testículos e epidídimos esquerdos para avaliações histopatológica e morfométrica. Os pesos corpóreos e dos órgãos reprodutores foram semelhantes entre os grupos, bem como a produção espermática diária, tempo de trânsito espermático através do epidídimo, motilidade e morfologia ...
Interferons (IFNs) are small proteins known their antiproliferative and immunoregulatory activities and their crucial involvement in the cellular antiviral. Type I IFNs include the IFN-α, β e ω and are used therapeutically in the treatment of several kinds of cancers and hepatitis B and C. Endocrine dysfunction is among the adverse side effects of IFN-α. Little is know about the effects of IFNs on reproduction. Therefore, the present study aimed to investigated, in adult rats, the effects of subchronic exposure to different doses of IFN-α on male reproductive parameters. In the experiment 1, adult male Wistar rats (90 days/350-470g) were distributed in three experimental groups (n=10), one control, which received the vehicle, and two treated, subcutaneously, with 5x104 units/Kg e 10x104 units/Kg of IFN-α, diluted in saline. After 30 days of treatment the animals were weighed and euthanized for collection of reproductive organs. Right testis and epididymis, ventral prostate and seminal gland (without coagulating gland) of each animal were removed and weighed. Right testis and epididymis were used for the determination of sperm number and left epididymis for collection of sperm to evaluate of sperm motility and morphology and for intrauterine artificial insemination. The serum testosterone levels were also measured. In the experiment 2, another lot of animals, following the same experimental design, were used for collection of left testis and epididymis for to histopathological and morphometric evaluation. The body and reproductive organ weights were unchanged, as well as the daily sperm production, sperm transit time through the epididymis, sperm motility and morphology and fertility potential of animals. The histopathological and morphometric evaluation did not reveal injuries related to treatment. Thus, our results show that subchronic exposure to IFN-α did not interfere with levels of serum testosterone ...

Orientador: Wilma De Gravas Kempinas
Banca: Raquel Fantin Domeniconi
Banca: Estela Saao Cerri
Resumo: Interferons (IFNs) são pequenas proteínas conhecidas por suas atividades antiproliferativa e imunorregulatória e por seu envolvimento crucial na ação antiviral celular. Os IFNs do tipo I incluem os IFN-α, β e ω e são utilizados terapeuticamente no tratamento de diversos tipos de cânceres e hepatites B e C. Sabe-se que dentre os efeitos adversos causados pelo IFN-α estão as disfunções endócrinas. Pouco se sabe sobre os efeitos dos IFNs na reprodução. Assim, o presente estudo objetivou investigar, em ratos adultos, os efeitos da exposição subcrônica a diferentes doses de IFN-α sobre parâmetros reprodutivos masculinos. No experimento 1, ratos Wistar adultos (90 dias/350-470g) foram distribuídos em três grupos experimentais (n=10), sendo um controle, cujos animais receberam o veículo, e dois tratados, subcutaneamente, com as doses de 5x104 unidades/Kg e 10x104 unidades/Kg, diluídas em salina. Após 30 dias de tratamento os animais foram pesados e eutanasiados para coleta dos órgãos do sistema genital. Testículo e epidídimo direitos, próstata ventral e glândula seminal (sem a glândula coaguladora) de cada animal foram retirados e pesados. Testículos e epidídimos direitos foram utilizados para determinação do número de células germinativas e os epidídimos esquerdos para a coleta de espermatozoides para avaliação da motilidade e morfologia espermática e para serem usados nas inseminações artificiais intrauterinas. Os níveis séricos de testosterona também foram mensurados. No experimento 2, outro lote de animais, seguindo o mesmo design experimental, foi utilizado para a coleta dos testículos e epidídimos esquerdos para avaliações histopatológica e morfométrica. Os pesos corpóreos e dos órgãos reprodutores foram semelhantes entre os grupos, bem como a produção espermática diária, tempo de trânsito espermático através do epidídimo, motilidade e morfologia ...
Abstract: Interferons (IFNs) are small proteins known their antiproliferative and immunoregulatory activities and their crucial involvement in the cellular antiviral. Type I IFNs include the IFN-α, β e ω and are used therapeutically in the treatment of several kinds of cancers and hepatitis B and C. Endocrine dysfunction is among the adverse side effects of IFN-α. Little is know about the effects of IFNs on reproduction. Therefore, the present study aimed to investigated, in adult rats, the effects of subchronic exposure to different doses of IFN-α on male reproductive parameters. In the experiment 1, adult male Wistar rats (90 days/350-470g) were distributed in three experimental groups (n=10), one control, which received the vehicle, and two treated, subcutaneously, with 5x104 units/Kg e 10x104 units/Kg of IFN-α, diluted in saline. After 30 days of treatment the animals were weighed and euthanized for collection of reproductive organs. Right testis and epididymis, ventral prostate and seminal gland (without coagulating gland) of each animal were removed and weighed. Right testis and epididymis were used for the determination of sperm number and left epididymis for collection of sperm to evaluate of sperm motility and morphology and for intrauterine artificial insemination. The serum testosterone levels were also measured. In the experiment 2, another lot of animals, following the same experimental design, were used for collection of left testis and epididymis for to histopathological and morphometric evaluation. The body and reproductive organ weights were unchanged, as well as the daily sperm production, sperm transit time through the epididymis, sperm motility and morphology and fertility potential of animals. The histopathological and morphometric evaluation did not reveal injuries related to treatment. Thus, our results show that subchronic exposure to IFN-α did not interfere with levels of serum testosterone ...
Mestre

Sabe-se há algum tempo que a expressão de glicanas muda de acordo com a condição celular. A alteração do processo de glicosilação de proteínas é um processo comum em vários estados fisiopatológicos, sendo observado como um evento frequente em processos alérgicos e em células tumorais. O principal alérgeno do gato, a proteína Fel d 1, é um dímero composto de duas subunidades, sendo cada subunidade composta por uma cadeia α e β. A proteína possui um sítio de N-glicosilação em cada uma de suas subunidades, sendo preenchidos por diferentes glicoformas. Além disso, estudos cristalográficos detectaram três possíveis sítios de ligação a Ca2+ em sua estrutura. Diversos tipos de tumores apresentam expressão aumentada de GTs, dentre estas a FUT8 e a C2GnT-L. A FUT8 é uma β-1,6-fucosiltransferase, que transfere uma Fuc do substrato doador (GDP-β-L-fucose) à primeira GlcNAc do núcleo pentassacarídico de uma N-glicana. Esta enzima apresenta expressão aumentada em câncer de pulmão, gástrico e de cólon, além de estar envolvida em outros processos patológicos. A C2GnT-L transfere um resíduo de GlcNAc, em ligação β-1,6, ao núcleo 2 (Core 2) de glicanas O-ligadas, sendo superexpressa em câncer de pulmão, próstata e colorretal e relacionada com progressão tumoral e metástase. Considerando o papel da glicosilação e dos sítios ligadores de Ca2+ nos processos alérgicos, assim como a presença das GTs mencionadas em alta quantidade em processos tumorais, bem como a inexistência de dados estruturais e conformacionais destas proteínas e das estruturas sacarídicas em solução, o trabalho tem como objetivo contribuir na caracterização da glicobiologia estrutural destas proteínas. Para tal, foram estudados diversos sistemas da proteína Fel d 1 (PDBID 2ejn) e das enzimas FUT8 (PDBID 2de0) e C2GnT-L (PDBIDs 2gak e 2gam) por DM em solução aquosa em diferentes condições. Após os experimentos, pode-se observar que, para Fel d 1, apenas o íon Ca2+ central está ligado à proteína, enquanto os laterais ficam livres. A Fel d 1 com glicosilação reduzida apresentou um aumento de flexibilidade em duas hélices em uma das subunidades da Fel d 1, devido a desenovelamento das mesmas. Já a proteína completamente glicosilada apresentou uma redução no tamanho da cavidade de uma das subunidades. No estudo da FUT8, observou-se que o domínio N-terminal é o principal componente da flexibilidade proteica desta proteína. Ainda, foi possível caracterizar, através de atracamento molecular, a região de interação da FUT8 com sua glicana-alvo e com uma de suas proteínas-alvo, a integrina α5β1. Os resultados para C2GnT-L demonstraram que o sítio caracterizado para o substrato aceptor pode na verdade estar ocupado pelo substrato doador desta enzima, já que este permanece no local durante a DM, ao contrário do substrato aceptor. Espera-se que este trabalho contribua na compreensão do funcionamento destas proteínas, possibilitando futuros estudos acerca de seus papéis em enfermidades e, consequentemente, para novas estratégias terapêuticas.
We know for a while that glycan expression varies according to the cellular condition. Alterations in protein glycosylation is a common process in several physical and pathological processes, and are frequently observed in allergy and tumorous cells. The major cat allergen, Fel d 1, is a dimer composed by two subunits, each subunit containing one α and β chain. This protein contains one N-glycosylation site in each subunit, which are filled by different glycoforms. In addition, crystallographic studies detected three possible Ca2+ binding sites in its structure. Several types of tumors have higher expression of GTs, like FUT8 and C2GnT-L. FUT8 is an β-1,6-fucosyltransferase, transferring one Fuc from GDP-b-L-fucose to the inner most GlcNAc in the pentassaccharidic core of an N-glycan. This enzyme is highly expressed in lung, gastric and colon cancer and is involved in other pathological processes. C2GnT-L transfers a GlcNAc residue, in a β-1,6 linkage, to the Core 2 of O-linked glycans and is overexpressed in lung, prostate and colon-rectal cancer, related to tumoral progression and metastasis. Considering the role of glycosylation and Ca2+ binding sites in allergy, and considering the presence of the GTs mentioned above in high amounts in tumoral processes, as well as the inexistence of structural data concerning these proteins in solution, this study intents to contribute in characterizing the structural glycobiology of these proteins. In this matter, we studied several systems containing Fel d 1 (PDBID 2ejn), FUT8 (PDBID 2de0) and C2GnT-L (PDBID 2gak and 2gam) by MD in aqueous solution, under different conditions. We were able to observe, after the experiments, that in Fel d 1, only the central Ca2+ ion is bound to the protein, while the lateral ions are free. Fel d 1 containing reduced glycosylation form presented larger flexibility in two helices, in one of the subunits, due to their unfolding. Fully glycosylated Fel d 1 presented reduced cavity size in one of the subunits. In FUT8 study, we observed that the N-terminal domain is the principal component of protein flexibility. We were also able to characterize, using molecular docking, the sites of interaction of FUT8 with its target glycan and one of its target protein, integrin α5β1. Results for C2GnT-L showed that the characterized acceptor substrate site might, in fact, be occupied by the donor substrate, since the donor substrate remains in the site during MD, and the acceptor substrate does not. We expect that the refinement of these crystallographic structures, by introducing the saccharidic information, will contribute in comprehending the proteins functioning, and will further possibilitate studies into its roles in infirmities and, in this matter, to new therapeutic strategies.

LOBO, Marina Duarte Pinto. Análise proteômica de plasma de pacientes com câncer de mama utilizando lectinas vegetais e label-free LC-MSE. 2016. 158 f. Tese (doutorado em bioquímica)- Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2016.
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The breast cancer presents one of the most commonly diagnosed types of cancer among women worldwide and in Brazil, after nonmelanoma skin cancer. It’s a clinically and biologically heterogeneous disease. Therefore, early detection of breast cancer, a reliable characterization of the disease and an accurate diagnosis are crucial to reducing mortality. The aim of this work was perform a qualitative and quantitative analyzes of plasma proteins from healthy women and from women with ductal breast cancer in different stages. For this, initially, plasma samples were depleted of IgG and albumin and then pooled into samples representative for each study group. The pools were then fractionated by immobilized plant lectins (frutalin and DAL)-affinity chromatography. Subsequently, the pools and chromatographic fractions were digested and submited to and data-independent label-free mass spectrometric analysis. The use of affinity chromatography with plant lectins prior to analysis by mass spectrometry was essential to reduce sample complexity and extend the dynamic range of proteins, and frutalin showed the best results from fractionation. A sum of all analyzes performed revealed the identification of about 445,000 peptides and more than 30,000 proteins, with redundancy between isoforms of the same group and between groups. Furthermore, in addition to fractionation, the chromatography of affinity with plant lectins were effective in isolating specific glycoforms that reflect an altered glycosylation pattern associated with the disease. Several differentially expressed proteins, some of which changes in glycosylation were identified, such as apolipoprotein A2, apolipoprotein C3, complement factors (C3, C4b and C4A), clusterin, 1-2-α-acid glycoprotein, haptoglobin, hemopexin, serum paraoxonase arylesterase, plasma retinol binding protein, plasminogen and vitronectin. Among the proteins identified, some are related to the breakdown of the extracellular matrix, lipid metabolism, oxidative stress and other characterized as acute phase proteins. Finally, the data of differential expression and possible changes in the glycosylation patterns of proteins contributes to the development of a protein profile, subject to later validation, presenting an association with the development and characterization of breast cancer in its different stages.
O câncer de mama representa o tipo de câncer mais comum entre as mulheres no mundo e no Brasil, depois do câncer de pele não melanoma. Caracterizando-se como uma doença clínica e biologicamente heterogênea, a detecção precoce do câncer de mama, uma caracterização fidedigna da doença e um diagnóstico preciso são de fundamental importância para redução da mortalidade. Assim, o objetivo do presente trabalho foi realizar análises qualitativas e quantitativas de proteínas plasmáticas de mulheres saudáveis e mulheres com câncer de mama tipo ductal, em diferentes estágios. Para isso, inicialmente, as amostras de plasma foram depletadas de albumina e IgG e depois reunidas em pools representativos para cada grupo em estudo. Os pools foram então fracionados por meio de cromatografias de afinidade em matrizes de Sepharose 4B imobilizadas com as lectinas vegetais α-galactose-ligante de Artocarpus incisa - Frutalina e glucose/manose-ligante de Dioclea altíssima – DAL. Posteriormente, tantos os pools como as frações cromatográficas obtidas foram digeridas e submetidas à análise independente de dados (MSE) e quantificadas (label-free) por espectrometria de massas. A utilização das cromatografias de afinidade com lectinas vegetais a priori da análise por espectrometria de massas foi fundamental para reduzir a complexidade das amostras e estender o intervalo dinâmico de proteínas, e frutalina apresentou os melhores resultados de fracionamento. Um somatório de todas as análises realizadas revelou a identificação de cerca de 445.000 peptídeos e mais de 30.000 proteínas, com redundância entre isoformas do mesmo grupo e entre grupos. Ademais, além de fracionar, as cromatografias de afinidade com lectinas vegetais foram eficientes em isolar glicoformas específicas que refletem um padrão de glicosilação alterado associado à doença. Diversas proteínas diferencialmente expressas, algumas delas com mudanças na glicosilação, foram identificadas, tais como apolipoproteína A2, apolipoproteína C3, fatores do sistema complemento (C3, C4b e C4A), clusterina, α-1-2-ácido glicoproteína, haptoglobina, hemopexina, paraoxonase arilesterase sérica, proteína plasmática de ligação ao retinol, plasminogênio e vitronectina. Dentre as proteínas identificadas, algumas estão relacionadas com a decomposição da matriz extracelular, metabolismo lipídico, estresse oxidativo e outras caracterizam-se como proteínas de fase aguda. Finalmente, os dados de expressão diferencial e possíveis alterações de glicosilação das proteínas contribuem para o desenvolvimento de um perfil protéico, alvo para posterior validação, que apresenta uma associação com o desenvolvimento e a caracterização do câncer de mama em seus diferentes estágios.

Orientador: Celso Paulino da Costa
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba
Made available in DSpace on 2018-07-19T01:11:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Goncalves_ReginaldoBruno_M.pdf: 2628424 bytes, checksum: 6fdd5a85280fafadc8642743268342aa (MD5) Previous issue date: 1993
Resumo: Lectinas são proteínas ou glicoproteínas capazes de ligação reversível a carboidratos e compostos contendo açúcares e de aglutinar células ou glicoconjugados sem induzir mudanças químicas nos mesmos. Estão presentes em plantas, bactérias, fungos, vírus, algumas células de mamíferos e outras fontes naturais. São úteis em estudos de superfície celular, imunohistoquímicas de condições normais e patológicas e estão envolvidas no mecanismo de adesão bacteriana. Uma propriedade importante nas lectinas de Phaseolus vulgaris é a estimulação da proliferação de linfócitos e esta propriedade prevalece na isolectina rica em subunidade L (L4). A lectina de germe de trigo aglutina preferencialmente célula tumorais, reage e neutraliza aglutininas não imunes presentes na saliva e aglutinam s. mutans. Neste trabalho desenvolvemos uma técnica de cromatografia de afinidade, para o isolamento de lectinas que apresentem especificidade por uma estrutura oligossacarídica. Para isto transformamos uma proteína rica em oligossacárideos, o ovomucóide, em um gel insolúvel e estável e o depositamos numa coluna. Com esta técnica foi possível o isolamento purificação das lectina de germe de trigo, lectina de Phaseolus e sua isolectina L4. Após eluídas da coluna estas proteínas foram submetidas a eletroforeses em gel de poliacrilamida e em agarose, que demonstraram sua pureza. Com finalidade de estudar as possíveis interações entre estas lectinas purificadas e glicoproteinas salivares, realizamos dupla difusão em gel de agarose, onde encontramos precipitações proteicas entre as lectinas testadas e as glicoproteinas salivares e séricas
Abstract: Isolation of lectin of beans and wheat germ and theirs precipitations with salivary and serum glycoproteins. Lectins are proteins or glycoproteins capable of reversible linking to carbohydrate and sugars compounds, and of celular or glycoconjugated aglutination without inducing chemistry changes. They are present in plants, bacteria, fungus, virus, some mammaliam cells and others nature sources. They are useful on the study of celular surface, imunohistochemistry of normal and pathologycal condition, studies of stimulation of lyrophocyte proliferation and are involved in bacteria adherence. One important property of Phaseolus vulgaris lectins is lyrophocyte proliferation and this property dominate in the isolectin rich in L subunit (L4). Lectin of wheat germ causes tumor cell aglutination, react and neutralize aglutinins of non imune origin that are present in saliva and promote S. mutans aglutination. In this work a technique of affinity chromatography, for the isolation of lectins with oligosaccharide specificity was developed. A protein rich in oligosaccharide, the ovomucoid, was transformed in a insoluble and stable gel that was deposited in a columm. With this technique lectin isolation of wheat germ and Phaseolus vulgaris and L4 isolectin was possible. After eluted from the ovomucoid columm, these proteins were submited to polyacrylamide gel, and agarose electrophoresis, and demonstrated being pure. To study the possible interaction of these lectins with salivary and serum glycoproteins, we used double difusion on agarose gel, and we found precipitations
Mestrado
Biologia e Patologia Buco-Dental
Mestre em Ciências

Orientadores: Aureo Tatsumi Yamada, Wirla Maria da Silva Cunha Tamashiro
Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia
Made available in DSpace on 2018-08-07T04:32:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bizinotto-Assuncao_MarciaCristina_D.pdf: 17669234 bytes, checksum: 7623e53be29f1a69dba9c95b19066e0e (MD5) Previous issue date: 2006
Resumo: O fenômeno da gestação em mamíferos de placentação hemocorial, onde o feto alogênico, apresentando metade dos genes de origem paterna, desenvolve um íntimo contato com o tecido materno sem desencadear uma resposta de rejeição pelo sistema imune materno, é ainda uma questão da imunologia da reprodução não esclarecida completamente. O diálogo na interface materno-fetal do útero gestante envolve uma gama de citocinas da categoria Th1fTh2, bem como de várias populações celulares, onde se destacam as células Natural KiUer uterinas (uNK). As uNK são populações linfocitárias transitórias que migram a partir de progenitores localizados em órgãos linfóides secundários como linfonodo e baço para o útero gestante e, neste proliferam e diferenciam ao longo da gestação. A presença destas células no útero gestante tem sido relacionada com o reconhecimento dos antígenos HLA-G e HLA-E expressos pelos trofoblastos, resultando na inibição tanto da resposta imune inata quanto da adaptativa. Esta atuação peculiar das uNK sugere que a modulação destas células no útero gestante esteja relacionada com a expressão de receptores específicos não compartilhada com células NK circulantes (eNK). Em uNK de camundongos, a lectina DBA (Doliehos biflorus agglutin) identifica glicoconjugados contendo N-acetil D-galactosamina presentes na superfície destas células e que não são expressos por outros linfócitos, corroborando com a hipótese de que as uNK expressam receptores específicos não comuns às eNK Neste trabalho, nós propusemos avaliar a possível expressão de moléculas específicas na superfície das células uNK de camundongos e identificar as proteínas candidatas através de técnicas proteômicas. Para tanto foram inicialmente utilizadas células uNK isoladas e purificadas de úteros de camundongos prenhes como in6culos antigênicos em machos da mesma espécie, para avaliar a capacidade de indução de uma resposta imune com produção de anticorpos reativos a esses antígenos. Outra estratégia utilizada foi o isolamento de proteínas de homogenados uterinos, de células uNK e da membrana destas células, na tentativa de isolar e identificar aquelas reativas à lectina DBA. Como resultado das inoculaçães de células uNK, os camundongos receptores produziram anticorpos séricos que reconheciam células uNK através de reações imunocitoquímicas. Este resultado confirma a expressão de moléculas específicas em células uNK, que por sua vez as caracteriza como uma subpopulação de NK específica da gestação. Dos dois animais com maior nível de anticorpos séricos foram coletados os baços para o preparo das células empregadas em experimentos de fusão celular para a obtenção de hibridomas secretores de anticorpos monoclonais. Um dos anticorpos monoclonais obtidos reconheceu moléculas presentes na superfície e no citoplasma das células uNK de várias linhagens de camundongos, assim como moléculas em células presentes no endométrio de ratas prenhes e no endométrio gestacional de humanos, sugerindo que moléculas homólogas são expressas em uNK de outras espécies. No entanto, este anticorpo monoclonal anti-uNK de camundongo (mamuNK1) apresentou reação cruzada com componentes citoplasmáticos de outras células, sugerindo não serem específicos para uNK Em relação ao isolamento dos glicoconjugados lectina DBA reativos observouse que através da cromatografia de gel filtração o isolamento mostrou-se pouco eficiente para o "pool" de proteínas contidas no homogenado uterino, ou mesmo de homogenado de células uNK, em decorrência da existência de múltiplas frações de proteínas capazes de ligar à lectina DBA. Restringindo-se o "pool" de proteínas àquelas obtidas apenas da membrana de células uNK e, através da eletroforese de duas dimensões pode-se delimitar as proteínas de interesse, as quais foram submetidas à análise proteomica. A identificação das proteínas isoladas das membranas de células uNK através de técnicas proteomicas sugeriram as proteínas Conserved oligomeric Golgí complex component 4 (COG4) e Heat shock 70-líke proteín 1 (Hsp 70 L1) como potenciais candidatas relacionadas com as atividades das células natural kíller no útero gestante
Abstract: The phenomenon of pregnancy in mammalians with hemochorial type placenta ions where the allogeneic fetus presenting the half of gene from paternal origins growth in tight contact with maternal tissues, without triggering the rejections responses of maternal immune system is still a non-solved question of immunology of reproduction. The cross-talk at maternal-fetal interface in the pregnant uterus involves a range of Th1rrh2 cytokines, as well as, several cell populations with accentuated participation of uterine Natural Killer (uNK) Iymphocytes. The uNK .are transient leukocyte population that migrate from precursor cells localized at secondary Iymphoid organs such as Iymph nodes and spleen into the pregnant uterus and proliferate and differentiate during the gestation. The presence of these cells in the pregnant uterus has been related to recognition of the HLAG and HLA-E antigen present in the trophoblast, which results in inhibition of both innate and adaptive immune response. This peculiar activity of uNK suggests that the modulation of such cells in the pregnant uterus should be related with the expression of specific receptors not shared with peripheral blood circulating NK (cNK) cell. In the mouse uNK, the DBA (Dolichos biflorus agglutin) lectin identify n-acetyl D-galactosamine containing glycoconjugates present on the surface of these cells not expressed by other Iymphocytes, which corroborate the hypothesis of uNK expressing specific receptors not shared by cNK. The present work aimed to evaluate the presumed expression of specific molecules on mouse uNK cell surface and identify the candidate proteins by proteomic methods. Initially were used uNK cells isolated and purified from pregnant mice uteri as antigen to be inoculated in the male mice and evaluate the capacity of induction of immune response with production of antibodies reactive to these antigens. Other strategy was to realize procedures of protein isolation from uterine homogenates, uNK cells and the membrane of these cells, in the attempt to isolate and identify those reactive to DBA lectin. As results of inoculation of uNK cells were verified responses in the inoculated males by presence of serum antibodies that recognized uNK with immunocytochemistry. These results confinn the expression of specific molecules in uNK cells which characterize these cells as specific NK subset of pregnancy. From two animaIs with highest levei of antibodies in 1he serum were collected the spleen to isolate the Iymphocytes clones for monoclonal antibodies obtantion. One of these antibodies recognized antigen molecules found on the surface and cytoplasm of the uNK cells of several mice strains, as well as, molecules in cells present in the pregnant rats and human beings endometrium, which suggests the expression of homologous molecules in uNK of other species. However, this mouse anti-mouse uterine NK (mamuNK1) was reactive with citoplasmatic components the other cells, suggesting not be specific to uNK. About the isolation of DBA lectin reactive glycoconjugates by purification in gel filtration chromatography revealed low efficiency to the pool of proteins contained in the uterine homogenate, or even in the homogenate of isolated uNK cells due to the multiple DBA lectin positive protein fractions. By restriction of protein pool to those obtained from the uNK cells membrane and by two dimension electrophoresis was delimited the target proteins that were submitted to the proteomic analysis. The identification of isolated proteins of the membranes of uNK cells with proteomics methods suggested the Conserved proteins oligomeric Golgi complex Component (4 COG4) and Heat shock 7D-like protein 1 (Hsp 70 L1) as potential candidates related to the activity of the natural to killer cells in the pregnant uterus
Doutorado
Histologia
Doutor em Biologia Celular e Estrutural

La glycoprotéine du virus de la rage (RVGP) doit adopter une forme oligomérique et exige des modifications post-traductionnelles afin de présenter sa conformation antigénique correcte et exprimer sa fonction biologique. L’utilisation de cellules eucaryotes supérieures comme hôte d'expression est donc recommandée. Nous avons étudié les cinétiques d’expression de la RVPG et de son ARN messager (RVGPARNm) dans les cellules S2 de D. Melanogaster transfectées de manière stable (rS2) et dans les cellules BHK-21 infectées par un Semliki Forest Virus recombinant (SFV-RVGP). Pour ce faire, nous avons utilisé un ELISA pour le dosage de la RVPG et une RT-PCR quantitative (qRT-PCR) pour le dosage de RVGPARNm. Nous avons démontré que la concentration maximale de RVGPARNm sous contrôle d’un promoteur constitutif (actine) dans les cellules rS2 a été coïncidant avec la concentration maximale de protéine RVGP par cellule. Quand l’expression du RVGPARNm est contrôlée par un promoteur inductible (metallotionein), la concentration maximale est atteinte 48 heures après l’induction et la production de RVGP est elevé. Dans les cellules BHK-21 infectées par le SFV-RVGP nous avons observé une correspondance directe entre taux d’infection (ROI) utilisée et les concentrations de RVGPARNm et RVPG. Pour le calcul des ROI, nous avons mis au point une méthode de titration des particules SFV par qRT-PCR, qui peut être appliquée à d’autres constructions de SFV recombinant. Dans des essais préliminaires d’immunisation de souris, les préparations de RVPG utilisées ont induit la formation d’anticorps neutralisants et ont donné une bonne protection contre une infection expérimentale par le virus de la rage
The rabies virus glycoprotein (RVGP) has to be oligomerized and undergo post-translational modifications in order to show its antigenic conformation and biologic function. Therefore, the recombinant RVGP expression in higher eukaryotic cells is mandatory. We have studied the kinetic expression of RVGP and its messenger RNA (RVGPmRNA) in stably transfected D. Melanogaster cells (rS2) and BHK-21 cells infected with a recombinant Semliki Forest Virus (SFV-RVGP). For this purpose RVGP was quantified by ELISA and RVGPmRNA by quantitative RT-PCR (qRT-PCR). In rS2 cells, we demonstrated that the RVGPmRNA regulated by a constitutive promoter (actin) presented a concentration peak coincident with the highest concentration of RVGP/cell. When the RVGPmRNA expression was regulated by an inducible promoter (metallotionein), its level was maximum 48 h after induction and the RVGP production was high. In the expression using BHK-21 cells infected with SFV-RVGP we observed a direct correspondence, between the ratio of infection (ROI) and the amount of RVGPmRNA and RVGP produced. For the calculations of the ROI used, we have developed a new method of SFV particles titration by qRT-PCR, which we have shown to be applicable to other recombinant SFV constructions. The samples of RVGP used in preliminary experimental mouse immunization assays were able to induce neutralizing antibodies and to lead to protection against the experimental intracerabral rabies virus challenge

Nell’80% dei casi di infezione, il virus dell’epatite C (HCV) supera le difese dell’ospite e stabilisce un’infezione persistente, che espone il paziente al rischio di sviluppare cirrosi e epatocarcinoma. La terapia basata su ribavirina e interferone è costosa, poco efficace e gravata da effetti collaterali. Nonostante la grande variabilità genetica del virus, concentrata soprattutto a livello delle glicoproteine E1E2 dell’envelope, sono state descritte alcune regioni di E2 conservate tra i diversi genotipi, suggerendo che la scarsa variabilità di tali regioni è necessaria per mantenere alcune funzioni cruciali della glicoproteina nel ciclo virale. Pertanto l’identificazione e la caratterizzazione di anticorpi diretti contro queste porzioni conservate di E2 potrebbe fornire un contributo per lo sviluppo di una valida immunoterapia passiva e per la realizzazione di un vaccino efficace. In questa tesi sono stati caratterizzati due frammenti anticorpali monoclonali umani (Fab e20 e Fab e137) diretti contro la glicoproteina E2. e20 ed e137 sono stati clonati dal repertorio linfocitario di una paziente infetta in modo cronico da HCV genotipo 1b. Per selezionare dei cloni potenzialmente cross-reattivi, la library anticorpale ottenuta dalla paziente è stata screenata contro una glicoproteina E2 ricombinante derivata da un sottotipo diverso: 1a. Tramite studi di binding, e20 ed e137 sono risultati in grado di legare E2 di tutti i genotipi (tranne il genotipo 5 per il Fab e137). Esperimenti condotti con peptidi lineari, saggi di competizione con anticorpi diretti contro epitopi noti e la generazione di mutanti sito-specifici di E2 hanno dimostrato che e20 ed e137 sono diretti contro un epitopo conformazionale. In particolar modo, l’epitopo del Fab e20 coinvolge i residui aminoacidici: W437, F442, W529, G530 e D535; mentre quello del Fab e137 coinvolge: T416, W420, W437, L438, L441, F442, W529, G530 e D535. I residui W529, G530, D535 risultano essere conservati fra i vari genotipi e coinvolti nel legame di E2 al CD81. Saggi di competizione fra il Fab e20 o il Fab e137 e CD81 confermano che i Fab sono diretti contro una regione di E2 importante per il legame del virus al recettore cellulare. Si è osservato che i Fab riconoscono dei residui contenuti della porzione della glicoproteina E2 che va dall’aminoacido 436 al 447, regione descritta in letteratura come quella riconosciuta dagli anticorpi non neutralizzati in grado di interferire con l’attività dei cloni neutralizzanti. I nostri dati sembrerebbero contrastare questa affermazione, infatti i Fab e20 ed e137 non solo sono in grado di riconoscere alcuni residui contenuti in questa regione, ma possiedono anche un’attività neutralizzante rilevante. Inoltre il legame del Fab e137 viene abrogato anche da due mutazioni a livello dell’epitopo riconosciuto dall’anticorpo murino AP33, descritto in letteratura come il clone con un ampia cross-reattività ed un’elevata attività neutralizzante. I Fab e20 ed e137 possiedono una potente attività cross-neutralizzante. Nel saggio di neutralizzazione con pseudovirus, e20 ed e137 neutralizzano i genotipi 1a, 2a e 4 (IC50 intorno ai 7 μg/mL) e meno efficientemente i genotipi 1b e 2b. L’attività neutralizzante è stata confermata in un saggio di neutralizzazione basato sull’uso di un particolare isolato virale in grado di replicare in vitro (IC50 intorno ai 2 μg/mL). Grazie agli studi di cinetica di neutralizzazione è emersa la capacità dei Fab e20 ed e137 di inibire l’infettività virale agendo dopo il binding del virus alle cellule bersaglio; in particolare interferiscono con gli eventi immediatamente successivi al legame tra virus e recettori a bassa affinità. Analizzando questi dati, possiamo concludere che abbiamo identificato e caratterizzato due frammenti anticorpali con un ampia cross-reattività ed una potente attività crossneutralizzante, in quanto sono in grado di legare dei residui aminoacidici sulla glicoproteina E2 che svolgono un ruolo chiave nel ciclo virale e che risultano essere conservati tra i vari genotipi. Per cui questi Fab risultano essere fondamentali per lo sviluppo di una immunoterapia passiva efficace e per lo studio dell’interazione virus-ospite.
In approximately 80% of the cases of infection, hepatitis C virus (HCV) overcomes the host immune response, leading to a chronic infection associated with an increased risk of severe liver diseases. Current therapy (ribavirin and interferon) is expensive, can have adverse side effects and is ineffective for approximately 50% of patients. Despite the genetic variability of the virus at the level of E1E2 envelope glycoproteins, some regions conserved among different E2 genotypes have been described, suggesting that no variability at this level is required to maintain critical functions of the glycoprotein in the life cycle of the virus. Therefore, the identification and characterization of antibodies directed against these regions can theoretically provide a valuable contribution to the creation of an effective vaccine and to the development of passive immunotherapy. In this thesis, two human monoclonal antibody fragments (Fab e20 and Fab e137) directed against the HCV E2 glycoprotein, have been characterized. The antibodies were cloned from lymphocytes of a patient chronically infected with HCV genotype 1b. In order to select crossreactive clones, the library obtained from the patient was screened against a recombinant glycoprotein E2 derived from a different subtype: 1a. In binding experiment, e20 and e137 are capable of binding E2 of all genotypes (e137 is not able to bind genotype 5). Several studies with linear peptides representing different portions of E2, competition assays with antibodies directed against known epitopes and the generation of site-specific mutants of E2 showed that e20 and e137 are directed against a conformational epitope. In particular, the epitope of Fab e20 includes the amino acids: W437, F442, W529, G530 e D535; whereas the epitope of Fab e137 includes the amino acids: T416, W420, W437, L438, L441, F442, W529, G530 e D535.The residues W529, G530, D535 are conserved between different genotypes and involved in the binding of E2 to CD81. Additional tests of competition, between e20 or e137 and CD81, confirmed that the Fabs are directed against a region of E2 important for the binding of virus to cellular receptor. Fab e20 and e137 are able to recognize amino acids within the region 436-447, that is described to bind unneutralizing antibodies, that interfere with the neutralizing antibodies. Furthermore, the data highlight that the epitope of e137 includes two conserved residues (aa 416 and 420) that were described to be within the epitope recognized by mouse monoclonal antibody AP33. The Fab e20 and Fab e137 have a potent cross-neutralizing activity. In the neutralization assay with pseudovirus e20 and e137 neutralize genotypes 1a, 2a and 4 (IC50 approximately 7 μg/mL) and less efficiently genotypes 1b and 2b. The neutralizing activity was also confirmed in a different neutralization assay based on a particular virus isolate that can replicate in vitro (IC50 approximately 2 μg/mL). Finally, the kinetic of neutralization study has shown the ability of the Fab e20 and Fab e137 to inhibit viral infectivity by acting after viral binding to target cells, in particular they are capable of interfering with the events immediately after the binding between virus and low affinity receptor.The data highlight that we identified and characterized two different broadly cross-reacting and neutralizing human monoclonal antibody fragments direct against highly conserved residues of E2 glycoprotein, that are crucial for CD81 binding and HCVpp infectivity. Overall, the availability of cross-reactive monoclonal antibodies with strong neutralizing activity (i) allows a better understanding of the virus-host interplay, (ii) provides new opportunities to develop antigens potentially able to elicit a broadly neutralizing immune response, and (iii) may assist in the development of an effective passive immunotherapy for HCV infection.

Orientador: Roberto da Silva
Banca: Maria de Lourdes T.M. Polizeli
Banca: Adalberto Pessoa Júnior
Banca: Rubens Monti
Banca: Mauricio Boscolo
Resumo: Neste trabalho as ß-glicosidases produzidas pelos microrganismos Thermoascus aurantiacus e Aureobasidium pullulans foram purificadas, caracterizadas termodinamicamente, físico-quimicamente e aplicadas em terpenos e isoflavonas. O processo de purificação da enzima do T. aurantiacus apresentou rendimento final de 63,6% e fator de purificação de 46,3 vezes. Após a purificação da enzima do A. pullulans, esta apresentou fator de purificação de 35,5 vezes e rendimento de 19%. A ß-glicosidase do T. aurantiacus apresentou atividade ótima em pH 4,5 a temperatura de 75ºC. Esta manteve-se estável na faixa de pH 4,5 a 6,5 e reteve sua atividade original após 1 hora a 70ºC. A enzima purificada do A. pullulans apresentou maior atividade catalítica nos valores de pH 4,0-4,5 a temperatura de 80ºC. A mesma foi estável em ampla faixa de pH 4,0 a 9,5, e, reteve sua atividade original após 1 hora a 75ºC. A maior termoestabilidade, da enzima produzida pelo microrganismo mesofílico, A. pullulans, foi comprovada pela análise dos parâmetros termodinâmicos. A ß-glicosidase do T. aurantiacus apresentou valores menores de t(1/2), ∆G, ∆H e Ea em todas as temperaturas analisadas. As duas enzimas foram fortemente inibidas por Hg+2 e Ag+, sugerindo que o grupo tiol (SH) é essencial para atividade das mesmas. O pNPßG foi utilizado para a determinação dos parâmetros cinéticos, os valores de Km e Vmax obtidos foram 0,53 mM e 590,8 μmol/ min/mg de proteína para a enzima do T. aurantiacus, e, 0,93 mM e 29,9 μmol/ min/mg de proteína para a enzima do A. pullulans. A presença de etanol no meio de reação ativou a ß-glicosidase do T. aurantiacus, indicando atividade glicosil transferase, o mesmo não foi observado para enzima do A. pullulans. As duas ß-glicosidases atuaram em diferentes substratos glicosídicos, inclusive sobre terpenos e isoflavonas, o que confirma a ampla especificidade das enzimas.
Abstract: In this work, ß-glucosidases produced by the microorganisms Thermoascus aurantiacus and Aureobasidium pullulans were purified, thermodynamically and physical-chemically characterized and applied on terpenes and isoflavones. Purification process of the enzyme from T. aurantiacus exhibited final yield of 63.6% and purification factor of 46.3 -fold. Purification process of the enzyme from A. pullulans resulted in 19% yield and purification factor of 35.5-fold. ßglucosidase from T. aurantiacus exhibited optimum activity at pH 4.5 and at temperature of 75ºC. It remained stable at pH range of 4.5 to 6.5 and maintained its original activity after 1 hour at 70ºC. Purified enzyme from A. pullulans exhibited a higher catalytic activity in pH values of 4.0-4.5 at an optimum temperature of 80ºC. It was stable over a wide pH range, from 4.0 to 9.5, and, maintained its original activity after 1 hour at 75ºC. The higher thermal stability of the enzyme produced by the mesophilic microorganism, A. pullulans, was confirmed by analysis of the thermodynamic parameters. ß-glucosidase from T. aurantiacus exhibited lower values for t(1/2), ∆G, ∆H and Ea in all temperatures tested. Both enzymes were strongly inhibited by Hg+2 and Ag+, suggesting that a thiol group (SH) is essential for their activities. pNPßG was used for the kinetic parameters determination and the values for Km and Vmax were 0.53 mM and 590.8 μmol/ min/mg of protein for the enzyme from T. aurantiacus, and, 0.93 mM and 29.9 μmol/ min/mg of protein for the enzyme from A. pullulans. The presence of ethanol in the reaction mixture activated the ß-glucosidase from T. aurantiacus, indicating glucosil transferase activity, which was not observed for the enzyme from A. pullulans. Both ß-glucosidases exhibited activity on different glucosidic substrates, including terpenes and isoflavones, confirming the broad specificity of the enzymes.
Doutor

Orientador: Celso Paulino da Costa
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba
Made available in DSpace on 2018-07-19T21:34:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Moral_NilsonJose_M.pdf: 1599288 bytes, checksum: fa3c278a73cf06a6c0bba35d083871fe (MD5) Previous issue date: 1993
Resumo: A interaçao entre lectina de jaca e glicoproteinas que compoem a pelicula adquirida in vitro foi estudada através de ele troforese em acrilamida, dupla difusão em agarose e imunoeletrofo rese em agarose. Saliva humana inicial foi incubada com hidroxiapatita por duas horas à temperatura ambiente e sob agitação constante, sendo, em seguida, elulda primeiramente em tampão fosfato O,2M pH 6,8 e em seguida em tampão fosfato 1,OM pH 6,8. O sobrenadante e os eluatos foram analizados eletroforéticamente e testados em dupla difusao contra lectina de jaca e soro de cabra anti-IgA humana. Paralelamente a estes experimentos foi conduzida a imunoeletroforese das proteinas salivares contra lectina de jaca e soro anti-IgA humana. Os resultados mostraram que a IgA está presente na composição da pellcula adquirida in vitro e que a lectina de jaca reage com as glicoprote1nas sal ivares que possuem afinidade pela hidroxiapatita in vitro
Abstract: The interaction between lectin from jackfruit and glycoproteins that compose the acquired pellicle in vitro lllas studied by poliacrilamide gel electrophoresis, double-difusion in . agarose and immunoelectrophoresis. Human sa 1 i va was incubated with hydroxyapatite for 2 hours at room temperature under continous agitation and then eluted in O,2M phosphate buffer pH 6,8 and in the same buffer at 1,OM. The supernatant and the eluted proeins were analysed electrophoretically and tested by double difusion against lectin from jackfruit and anti-IgA goat serum. At the same time immunoeletectrophoresis of human saliva anti-IgA I serum and lectin from jackfruit (IJere performed. The' results Ishowed that IgA is present in the proteins that comp.ose the acquired pellicle in vitro and that the lectin from jackfrui t . reacts with salivary glycoproteins that have affinity for the hydroxiapatite in vitro
Mestrado
Biologia e Patologia Buco-Dental
Mestre em Odontologia

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:55Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-12-07Bitstream added on 2014-06-13T18:44:32Z : No. of bitstreams: 1 leite_rsr_dr_rcla.pdf: 371019 bytes, checksum: 830cbb582aca2919cbcad799c2e9420b (MD5)
Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)
Neste trabalho as ß-glicosidases produzidas pelos microrganismos Thermoascus aurantiacus e Aureobasidium pullulans foram purificadas, caracterizadas termodinamicamente, físico-quimicamente e aplicadas em terpenos e isoflavonas. O processo de purificação da enzima do T. aurantiacus apresentou rendimento final de 63,6% e fator de purificação de 46,3 vezes. Após a purificação da enzima do A. pullulans, esta apresentou fator de purificação de 35,5 vezes e rendimento de 19%. A ß-glicosidase do T. aurantiacus apresentou atividade ótima em pH 4,5 a temperatura de 75ºC. Esta manteve-se estável na faixa de pH 4,5 a 6,5 e reteve sua atividade original após 1 hora a 70ºC. A enzima purificada do A. pullulans apresentou maior atividade catalítica nos valores de pH 4,0-4,5 a temperatura de 80ºC. A mesma foi estável em ampla faixa de pH 4,0 a 9,5, e, reteve sua atividade original após 1 hora a 75ºC. A maior termoestabilidade, da enzima produzida pelo microrganismo mesofílico, A. pullulans, foi comprovada pela análise dos parâmetros termodinâmicos. A ß-glicosidase do T. aurantiacus apresentou valores menores de t(1/2), ∆G, ∆H e Ea em todas as temperaturas analisadas. As duas enzimas foram fortemente inibidas por Hg+2 e Ag+, sugerindo que o grupo tiol (SH) é essencial para atividade das mesmas. O pNPßG foi utilizado para a determinação dos parâmetros cinéticos, os valores de Km e Vmax obtidos foram 0,53 mM e 590,8 μmol/ min/mg de proteína para a enzima do T. aurantiacus, e, 0,93 mM e 29,9 μmol/ min/mg de proteína para a enzima do A. pullulans. A presença de etanol no meio de reação ativou a ß-glicosidase do T. aurantiacus, indicando atividade glicosil transferase, o mesmo não foi observado para enzima do A. pullulans. As duas ß-glicosidases atuaram em diferentes substratos glicosídicos, inclusive sobre terpenos e isoflavonas, o que confirma a ampla especificidade das enzimas.
In this work, ß-glucosidases produced by the microorganisms Thermoascus aurantiacus and Aureobasidium pullulans were purified, thermodynamically and physical-chemically characterized and applied on terpenes and isoflavones. Purification process of the enzyme from T. aurantiacus exhibited final yield of 63.6% and purification factor of 46.3 -fold. Purification process of the enzyme from A. pullulans resulted in 19% yield and purification factor of 35.5-fold. ßglucosidase from T. aurantiacus exhibited optimum activity at pH 4.5 and at temperature of 75ºC. It remained stable at pH range of 4.5 to 6.5 and maintained its original activity after 1 hour at 70ºC. Purified enzyme from A. pullulans exhibited a higher catalytic activity in pH values of 4.0-4.5 at an optimum temperature of 80ºC. It was stable over a wide pH range, from 4.0 to 9.5, and, maintained its original activity after 1 hour at 75ºC. The higher thermal stability of the enzyme produced by the mesophilic microorganism, A. pullulans, was confirmed by analysis of the thermodynamic parameters. ß-glucosidase from T. aurantiacus exhibited lower values for t(1/2), ∆G, ∆H and Ea in all temperatures tested. Both enzymes were strongly inhibited by Hg+2 and Ag+, suggesting that a thiol group (SH) is essential for their activities. pNPßG was used for the kinetic parameters determination and the values for Km and Vmax were 0.53 mM and 590.8 μmol/ min/mg of protein for the enzyme from T. aurantiacus, and, 0.93 mM and 29.9 μmol/ min/mg of protein for the enzyme from A. pullulans. The presence of ethanol in the reaction mixture activated the ß-glucosidase from T. aurantiacus, indicating glucosil transferase activity, which was not observed for the enzyme from A. pullulans. Both ß-glucosidases exhibited activity on different glucosidic substrates, including terpenes and isoflavones, confirming the broad specificity of the enzymes.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:33:28Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-11-30Bitstream added on 2014-06-13T20:45:01Z : No. of bitstreams: 1 kim_yj_dr_arafo.pdf: 1176074 bytes, checksum: 46110c11d5e206c41d176d1fef40ea28 (MD5)
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)
Artin M é uma lectina purificada de sementes de Artocarpus heterophyllus que, recentemente, mostrou-se capaz depromover aceleração da cicatrização de lesões por queimadura de pele ou por abrasão da córnea em ratos e coelhos. O objetivo desta tese foi avaliar os efeitos da Artin M no processo de reparação da mucosa mastigatória bucal, por meio de modelos de estudo in vivo. Primeiro estudo: Três feridas cirúrgicas circulares de 6 mm de diâmetro foram criadas na mucosa palatina de 20 cães, e divididas aleatoriamente em 3 grupos de acordo com os tratamentos: C – controle (não tratados), A - Artin M, V - veículo. Quatro animais de cada grupo foram sacrificados após 2, 4, 7, 14 e 21 dias póstratamento e suas maxilas analisadas clinicamente quanto ao padrão de cicatrização, seguido de análise histológica, imuno-histoquímica para antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA) e atividade de mieloperoxidase. Clinicamente, o grupo A demonstrou melhor cicatrização em todos os períodos quando comparada aos outros grupos (p<0,05). A análise histológica mostrou ter havido no grupo A maior estimulação na produção de fibras colágenas, maturação do tecido de granulação e organização do epitélio. A imunolocalização de PCNA mostrou uma maior tendência na proliferação celular em lesões do grupo A principalmente nos dias iniciais (p<0,05). O influxo de neutrófilos mostrou-se estatisticamente aumentado no grupo A quando comparado aos outros grupos nos dias 2 e 4 (p<0,05). Conclui-se que a Artin M promoveu aceleração na reparação das feridas na mucosa mastigatória em cães, via recrutamento de neutrófilos e indução da proliferação celular. É bem conhecido o envolvimento de mediadores biológicos como citocinas...
Artin M, lectin from Artocarpus heterophyllus seeds, has been demonstrated to stimulate recruitment and activation of neutrophil and mast cells. Furthermore, it has been shown to accelerate the process of wound healing on burn injuries and corneal epithelial lesions in rats and rabbits, respectively. The aim of this study was to evaluate the effects of Artin M on wound healing in palatal mucosa in two animal models. Study 1: Three wounds of 6 mm full thickness were surgically created in the hard palate mucosa of twenty dogs. The wounds of each animal were randomly divided into three groups according to one of the treatment assigned: C– Control (nontreated), A- Artin M gel, and V– Vehicle (carboxymethylcellulose 3% gel). Four animals per group were sacrificed at 2, 4, 7, 14 and 21 days post-surgery. Before sacrifice, wounded areas were photographed and scored for macroscopic healing evaluation. Afterwards, maxillary tissue were harvested and divided to perform histological analysis, immunohistochemical staining against Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA) and measurement of myeloperoxidase activity. Clinical analysis showed that wound closure was accelerated in group A in comparison to other groups in all periods. Histological features showed enhanced reepithelization and collagen fiber formation resulting in faster maturation of granular tissue in group A compared to the other groups, by day 14. Artin M treatment significantly induced cells proliferation at day 2 and 4 (p<0.05). Neutrophils infiltration in the group A was significantly higher than in the other groups at days 2 and 4 (p<0.05). The results suggest that Artin M gel may potentially facilitate wound healing on palatal mucosa via the recruitment of neutrophils and promotion of cells proliferation. It is well known that cytokines and growth... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2015-04-09T12:28:08Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-07-02Bitstream added on 2015-04-09T12:48:09Z : No. of bitstreams: 1 000814106.pdf: 732963 bytes, checksum: 8b7a4ecacee61c02ff2c4e104577f4d9 (MD5)
O tratamento de cães com leishmaniose visceral no Brasil tem gerado polêmicas discussões entre os diversos segmentos de profissionais da saúde. De um lado os Médicos Veterinários pressionados pelos proprietários dos cães que querem ter o direito de decidir por um tratamento ou pela eutanásia de seus animais; de outro os Ministérios da Saúde e da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA) que se mostram contrários a qualquer tratamento, motivados pelo risco de se criar cepas do parasita resistentes aos fármacos, os quais também podem ser empregados em pacientes humanos. Argumentos científicos que possam embasar essa polêmica devem ser explorados. Uma das possibilidades de se avaliar o desenvolvimento de resistência a fármacos pode ser conseguida por meio da pesquisa da expressão da glicoproteína-P (gp-P) e proteína de resistência a múltiplas drogas (MRP1), que atuam como bombas de efluxo expulsando xenobióticos de células, responsáveis pelo fenótipo MDR (resistência a múltiplas drogas). Avaliamos, pela técnica de imuno-histoquímica, a reatividade da gp-P e MRP1, clone C494 e ABCC1, respectivamente, na pele de 11 cães naturalmente infectados por Leishmania (L.) infantum chagasi antes e após serem submetidos a dois protocolos de tratamento: Alopurinol e vacina inativada (n=4) e Alopurinol, vacina inativada e domperidona (n=7) e quantificamos formas amastigotas na pele pela mesma técnica. Todos os animais após 3 e 6 meses de tratamento tiveram melhora clínica evidente e tiveram contagem negativa de formas amastigotas do parasita. Pele de cães com LV expressaram gp-P e MRP1, antes e após o tratamento, no entanto, este experimento permitiu concluir que a gp-P e MRP1 não foram bons marcadores para avaliar a eficácia terapêutica da LVC e para prever possíveis estados de resistência a fármacos. Todavia, o entendimento sobre a participação de marcadores de resistência a múltiplas drogas na pele de ...
The treatment of dogs with visceral leishmaniasis in Brazil has generated controversial debate among various segments of health professionals. On one side, veterinarians pressured by dog owners want to have the right to decide between treatment and euthanasia of their animals. On the other hand, the Ministry of Health and the Ministry of Agriculture, Livestock, and Supply (MAPA) are opposed to treatment because of the risk of creating strains of the parasite resistant to drugs that are also used for human patients. Scientific arguments that can support this controversy should be explored. One possibility for assessing the development of drug resistance can be achieved through research of the expression of Pglycoprotein (P-gp) and multidrug resistance-associated protein (MRP1). These proteins, which are responsible for the MDR phenotype (multiple drug resistance), act as efflux pumps which expel xenobiotics from cells. Using immunohistochemistry, the reactivity of P-gp (clone C494) and MRP1 (clone ABCC1) in the skin of 11 dogs naturally infected by Leishmania (L.) infantum chagasi was analyzed before and after undergoing two treatment protocols: Allopurinol and inactivated vaccine (n=4) and Allopurinol, inactivated vaccine, and domperidone (n=7). Quantification of Leishmania amastigotes in the skin was also achieved via immunohistochemistry. All of the animals after 3 and 6 months of treatment had clinical improvement and tested negative for amastigote forms of the parasite. Yet, the skin of dogs positive for CVL (canine visceral leishmaniasis) expressed P-gp and MRP1 before and after treatment, illustrating that P-gp and MRP1 were neither good markers for evaluating the therapeutic efficacy of CVL nor for predicting the possible states of drug resistance. However, an understanding of the participation of markers for multiple drug resistance in the skin of dogs under treatment for CVL can be of great importance for the development of an ...

Orientador: Mirela Tinucci Costa
Banca: Aleksandro Schafer da Silva
Banca: Leucio Câmara Alves
Banca: Aureo Evangelista Santana
Banca: Annelise Carla Camplesi
Resumo: O tratamento de cães com leishmaniose visceral no Brasil tem gerado polêmicas discussões entre os diversos segmentos de profissionais da saúde. De um lado os Médicos Veterinários pressionados pelos proprietários dos cães que querem ter o direito de decidir por um tratamento ou pela eutanásia de seus animais; de outro os Ministérios da Saúde e da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA) que se mostram contrários a qualquer tratamento, motivados pelo risco de se criar cepas do parasita resistentes aos fármacos, os quais também podem ser empregados em pacientes humanos. Argumentos científicos que possam embasar essa polêmica devem ser explorados. Uma das possibilidades de se avaliar o desenvolvimento de resistência a fármacos pode ser conseguida por meio da pesquisa da expressão da glicoproteína-P (gp-P) e proteína de resistência a múltiplas drogas (MRP1), que atuam como bombas de efluxo expulsando xenobióticos de células, responsáveis pelo fenótipo MDR (resistência a múltiplas drogas). Avaliamos, pela técnica de imuno-histoquímica, a reatividade da gp-P e MRP1, clone C494 e ABCC1, respectivamente, na pele de 11 cães naturalmente infectados por Leishmania (L.) infantum chagasi antes e após serem submetidos a dois protocolos de tratamento: Alopurinol e vacina inativada (n=4) e Alopurinol, vacina inativada e domperidona (n=7) e quantificamos formas amastigotas na pele pela mesma técnica. Todos os animais após 3 e 6 meses de tratamento tiveram melhora clínica evidente e tiveram contagem negativa de formas amastigotas do parasita. Pele de cães com LV expressaram gp-P e MRP1, antes e após o tratamento, no entanto, este experimento permitiu concluir que a gp-P e MRP1 não foram bons marcadores para avaliar a eficácia terapêutica da LVC e para prever possíveis estados de resistência a fármacos. Todavia, o entendimento sobre a participação de marcadores de resistência a múltiplas drogas na pele de ...
Abstract: The treatment of dogs with visceral leishmaniasis in Brazil has generated controversial debate among various segments of health professionals. On one side, veterinarians pressured by dog owners want to have the right to decide between treatment and euthanasia of their animals. On the other hand, the Ministry of Health and the Ministry of Agriculture, Livestock, and Supply (MAPA) are opposed to treatment because of the risk of creating strains of the parasite resistant to drugs that are also used for human patients. Scientific arguments that can support this controversy should be explored. One possibility for assessing the development of drug resistance can be achieved through research of the expression of Pglycoprotein (P-gp) and multidrug resistance-associated protein (MRP1). These proteins, which are responsible for the MDR phenotype (multiple drug resistance), act as efflux pumps which expel xenobiotics from cells. Using immunohistochemistry, the reactivity of P-gp (clone C494) and MRP1 (clone ABCC1) in the skin of 11 dogs naturally infected by Leishmania (L.) infantum chagasi was analyzed before and after undergoing two treatment protocols: Allopurinol and inactivated vaccine (n=4) and Allopurinol, inactivated vaccine, and domperidone (n=7). Quantification of Leishmania amastigotes in the skin was also achieved via immunohistochemistry. All of the animals after 3 and 6 months of treatment had clinical improvement and tested negative for amastigote forms of the parasite. Yet, the skin of dogs positive for CVL (canine visceral leishmaniasis) expressed P-gp and MRP1 before and after treatment, illustrating that P-gp and MRP1 were neither good markers for evaluating the therapeutic efficacy of CVL nor for predicting the possible states of drug resistance. However, an understanding of the participation of markers for multiple drug resistance in the skin of dogs under treatment for CVL can be of great importance for the development of an ...
Doutor

Memoria para optar al Titulo Profesional de Médico Veterinario
Existe una amplia variedad de patologías que afectan a los gatos domésticos, generando gastos económicos por parte de sus dueños en busca de soluciones y la eventual mejoría de sus mascotas. Dentro de todas éstas, el virus herpes felino tipo 1 (VHF-1) uno de los agentes etiológicos del llamado complejo respiratorio felino, genera múltiples problemas en los gatos domésticos, dejando incluso secuelas importantes que afectan posteriormente su calidad de vida. Además, por ser un patógeno altamente distribuido alrededor del mundo y de fácil transmisión, existe un gran porcentaje de animales infectados y por su característica de patógeno latente, continúa distribuyéndose sin control a través de las poblaciones de gatos. En la clínica de animales pequeños su diagnóstico es en base a los signos clínicos presentados por los gatos afectados, existiendo hasta la fecha en Chile sólo una forma de diagnóstico de laboratorio específico para identificar el agente que no se utiliza rutinariamente en clínica. Por lo anterior, el tratamiento generalmente se basa en el conocimiento y experiencia del médico veterinario tratante, sin confirmación real del agente que está actuando. Por esta razón, en esta memoria de título se propuso implementar un método de diagnóstico molecular alternativo en gatos menores de un año de edad con signología clínica correspondiente a infección con VHF-1. Para ello se realizó la detección del gen de la glicoproteína B del virus a través de la técnica de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) y se determinó el porcentaje de identidad nucleotídica (PIN) del segmento obtenido, comparándolo con datos de la base genómica online Genbank®. De los once gatos analizados, en solo uno de ellos se logró amplificar un segmento correspondiente al gen de la glicoproteína B. El valor de PIN obtenido (96%) validaría que el segmento obtenido corresponde al gen de la glicoproteína B del VHF-1. Se discute la eficiencia del método implementado
PROGRAMA AUCAI 2011

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico
O cÃncer de mama representa o tipo de cÃncer mais comum entre as mulheres no mundo e no Brasil, depois do cÃncer de pele nÃo melanoma. Caracterizando-se como uma doenÃa clÃnica e biologicamente heterogÃnea, a detecÃÃo precoce do cÃncer de mama, uma caracterizaÃÃo fidedigna da doenÃa e um diagnÃstico preciso sÃo de fundamental importÃncia para reduÃÃo da mortalidade. Assim, o objetivo do presente trabalho foi realizar anÃlises qualitativas e quantitativas de proteÃnas plasmÃticas de mulheres saudÃveis e mulheres com cÃncer de mama tipo ductal, em diferentes estÃgios. Para isso, inicialmente, as amostras de plasma foram depletadas de albumina e IgG e depois reunidas em pools representativos para cada grupo em estudo. Os pools foram entÃo fracionados por meio de cromatografias de afinidade em matrizes de Sepharose 4B imobilizadas com as lectinas vegetais α-galactose-ligante de Artocarpus incisa - Frutalina e glucose/manose-ligante de Dioclea altÃssima â DAL. Posteriormente, tantos os pools como as fraÃÃes cromatogrÃficas obtidas foram digeridas e submetidas à anÃlise independente de dados (MSE) e quantificadas (label-free) por espectrometria de massas. A utilizaÃÃo das cromatografias de afinidade com lectinas vegetais a priori da anÃlise por espectrometria de massas foi fundamental para reduzir a complexidade das amostras e estender o intervalo dinÃmico de proteÃnas, e frutalina apresentou os melhores resultados de fracionamento. Um somatÃrio de todas as anÃlises realizadas revelou a identificaÃÃo de cerca de 445.000 peptÃdeos e mais de 30.000 proteÃnas, com redundÃncia entre isoformas do mesmo grupo e entre grupos. Ademais, alÃm de fracionar, as cromatografias de afinidade com lectinas vegetais foram eficientes em isolar glicoformas especÃficas que refletem um padrÃo de glicosilaÃÃo alterado associado à doenÃa. Diversas proteÃnas diferencialmente expressas, algumas delas com mudanÃas na glicosilaÃÃo, foram identificadas, tais como apolipoproteÃna A2, apolipoproteÃna C3, fatores do sistema complemento (C3, C4b e C4A), clusterina, α-1-2-Ãcido glicoproteÃna, haptoglobina, hemopexina, paraoxonase arilesterase sÃrica, proteÃna plasmÃtica de ligaÃÃo ao retinol, plasminogÃnio e vitronectina. Dentre as proteÃnas identificadas, algumas estÃo relacionadas com a decomposiÃÃo da matriz extracelular, metabolismo lipÃdico, estresse oxidativo e outras caracterizam-se como proteÃnas de fase aguda. Finalmente, os dados de expressÃo diferencial e possÃveis alteraÃÃes de glicosilaÃÃo das proteÃnas contribuem para o desenvolvimento de um perfil protÃico, alvo para posterior validaÃÃo, que apresenta uma associaÃÃo com o desenvolvimento e a caracterizaÃÃo do cÃncer de mama em seus diferentes estÃgios.
The breast cancer presents one of the most commonly diagnosed types of cancer among women worldwide and in Brazil, after nonmelanoma skin cancer. Itâs a clinically and biologically heterogeneous disease. Therefore, early detection of breast cancer, a reliable characterization of the disease and an accurate diagnosis are crucial to reducing mortality. The aim of this work was perform a qualitative and quantitative analyzes of plasma proteins from healthy women and from women with ductal breast cancer in different stages. For this, initially, plasma samples were depleted of IgG and albumin and then pooled into samples representative for each study group. The pools were then fractionated by immobilized plant lectins (frutalin and DAL)-affinity chromatography. Subsequently, the pools and chromatographic fractions were digested and submited to and data-independent label-free mass spectrometric analysis. The use of affinity chromatography with plant lectins prior to analysis by mass spectrometry was essential to reduce sample complexity and extend the dynamic range of proteins, and frutalin showed the best results from fractionation. A sum of all analyzes performed revealed the identification of about 445,000 peptides and more than 30,000 proteins, with redundancy between isoforms of the same group and between groups. Furthermore, in addition to fractionation, the chromatography of affinity with plant lectins were effective in isolating specific glycoforms that reflect an altered glycosylation pattern associated with the disease. Several differentially expressed proteins, some of which changes in glycosylation were identified, such as apolipoprotein A2, apolipoprotein C3, complement factors (C3, C4b and C4A), clusterin, 1-2-α-acid glycoprotein, haptoglobin, hemopexin, serum paraoxonase arylesterase, plasma retinol binding protein, plasminogen and vitronectin. Among the proteins identified, some are related to the breakdown of the extracellular matrix, lipid metabolism, oxidative stress and other characterized as acute phase proteins. Finally, the data of differential expression and possible changes in the glycosylation patterns of proteins contributes to the development of a protein profile, subject to later validation, presenting an association with the development and characterization of breast cancer in its different stages.

Orientador: Paulo Inácio da Costa
Banca: Márcia Aparecida Silva Graminha
Banca: Fernanda de Freitas Aníbal
Resumo: O vírus da Hepatite C (VHC) é o principal agente etiológico das hepatites não-A e não-B, infectando aproximadamente 170 milhões de pessoas no mundo (3% da população mundial). O vírus da hepatite C (HCV; hepatitis C-virus) é envelopado tem de 50 a 70nm de diâmetro, possui uma única fita positiva de RNA e pertence ao gênero do Hepacivirus e à família Flaviridae. Seu genoma é constituído por cerca de 9.500 nucleotídeos com regiões curtas não codificadoras e hiperconservadas nas extremidades 5' e 3'UTR, flanqueando uma única ORF. A região estrutural do vírus é constituída por 3 genes: core, E1 e E2. As proteínas do envelope, E1 e E2 do VHC, são altamente glicosiladas e apresentam 30 e 70 kDa, respectivamente. Estudos demonstram que ambas apresentam funções específicas em diferentes etapas do ciclo de replicação do vírus, atuando de forma essencial para entrada, ligação ao receptor e fusão com a membrana da célula hospedeira. A glicoproteína E2 do VHC liga-se com alta afinidade a uma alça do receptor CD81, também denominado de TAPA-1, uma tetraespanina encontrada na superfície de muitas células, incluindo hepatócitos. No entanto, o CD81 isoladamente não é suficiente para mediar a entrada celular do vírus, e vários outros co-fatores podem atuar nessa interação. Os receptores de lipoproteína de baixa densidade (LDL-r) e receptor scavenger tipo B classe I apresentam grande importância nessa relação com o VHC. Estudos sobre as glicoproteínas E1 e E2 têm mostrado que estas se associam com os LDL-r, sugerindo que o VHC use estes receptores para invadir a célula hospedeira. Além disso, estudos anteriores relatam o fato de que, as lipoproteínas poderiam proporcionar acréscimos da infectividade ao VHC. Desta forma, neste trabalho foram desenvolvidas estratégias de clonagem e expressão heteróloga da proteína E2, e avaliou-se sua imunogenicidade... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo)
Abstract: Hepatitis C is currently recognized as the primary cause of hepatitis " non A - non B " associated to the blood transfusion. The hepatitis C virus (HCV) is enveloped in about 50 to 70nm in diameter, presenting a positive single strand RNA and belongs to the genus Hepacivirus and the family Flaviridae. Its genome consists of 9,500 nucleotides with short non-coding regions and hiperconservadas ends 5' and 3'UTR flanking a single ORF. The virus structural region is based on three core genes, E1 and E2. HCV E1 and E2 are highly glycosylated and have 30 and 70 kDa, respectively. Studies show that both have key role in different stages of the cycle of virus replication, acting as essential for entry, receptor binding and fusion with host cell membrane. Glycoprotein E2 of HCV binds with high affinity to a loop of CD81, a tetraspanin, also named TAPA-1, found on the surface of many cells, including hepatocytes. However, the CD81 alone is not sufficient to mediate the cellular entry of the virus, and several other co-factors may be operating in this interaction. Recipients of low density lipoprotein (LDL-r) and scavenger receptor class B type I (SR-BI) would present great importance in relation to HCV. The LDL-r plays an important role in infection for virus of the hepatitis C. Studies on the glycoproteins E1 and E2 have shown that these are associated with the LDL-r suggesting that HCV uses the LDL-r to invade the host cell. Besides, previous studies showed that lipoprotein could improve HCV infectivity. Thus, in this work the capacity of recognition of the antibodies present anti-HCV was evaluated in the positive human serum for HCV of recognizing the protein E2 recombinant produced in bacteria of the lineage Rosetta and also the capacity of connection of the protein E2 of HCV in bind LDL-r present in the surface of human cells with characteristics endoteliais (ECV 304), and such capacity was... (Complete abstract click electronic access below)
Mestre

Four glycoproteins (gD, gB, gH, and gL) are required for herpes simplex virus (HSV) entry into the cell and for cell-cell fusion in transfected cells. gD serves as the receptor-binding glycoprotein and as the trigger of fusion; the other three glycoproteins execute fusion between the viral envelope and the plasma or endocytic membranes. Little is known on the interaction of gD with gB, gH, and gL. Here, the interactions between herpes simplex virus gD and its nectin1 receptor or between gD, gB, and gH were analyzed by complementation of the N and C portions of split enhanced green fluorescent protein (EGFP) fused to the glycoproteins. Split EGFP complementation was detected between proteins designated gDN + gHC, gDN + gBC, and gHN + gBC + wtgD, both in cells transfected with two or tree glycoproteins and in cells transfected with the four glycoproteins, commited to form syncytia. The in situ assay provides evidence that gD interacts with gH and gB independently one of the other. We further document the interaction between gH and gB. To elucidate which portions of the glycoproteins interact with each other we generated mutants of gD and gB. gD triggers fusion through a specialised domain, named pro-fusion domain (PFD), located C-terminally in the ectodomain. Here, we show that PFD is made of subdomains 1 and 2 (amino acids 260–285 and 285–310) and that each one partially contributed to herpes simplex virus infectivity. Chimeric gB molecules composed of HSV and human herpesvirus 8 (HHV8) sequences failed to reach the cell surface and to complement a gB defective virus. By means of pull down experiments we analyzed the interactions of HSV-HHV8 gB chimeras with gH or gD fused to the strep-tag. The gB sequence between aa residues 219-360 was identified as putative region of interaction with gH or critical to the interaction.

Four glycoproteins (gD, gB, gH, and gL) are required for herpes simplex virus (HSV) entry into the cell and for cell-cell fusion in transfected cells. gD serves as the receptor-binding glycoprotein and as the trigger of fusion; the other three glycoproteins execute fusion between the viral envelope and the plasma or endocytic membranes. Little is known on the interaction of gD with gB, gH, and gL. Here, the interactions between herpes simplex virus gD and its nectin1 receptor or between gD, gB, and gH were analyzed by complementation of the N and C portions of split enhanced green fluorescent protein (EGFP) fused to the glycoproteins. Split EGFP complementation was detected between proteins designated gDN + gHC, gDN + gBC, and gHN + gBC + wtgD, both in cells transfected with two or tree glycoproteins and in cells transfected with the four glycoproteins, commited to form syncytia. The in situ assay provides evidence that gD interacts with gH and gB independently one of the other. We further document the interaction between gH and gB. To elucidate which portions of the glycoproteins interact with each other we generated mutants of gD and gB. gD triggers fusion through a specialised domain, named pro-fusion domain (PFD), located C-terminally in the ectodomain. Here, we show that PFD is made of subdomains 1 and 2 (amino acids 260–285 and 285–310) and that each one partially contributed to herpes simplex virus infectivity. Chimeric gB molecules composed of HSV and human herpesvirus 8 (HHV8) sequences failed to reach the cell surface and to complement a gB defective virus. By means of pull down experiments we analyzed the interactions of HSV-HHV8 gB chimeras with gH or gD fused to the strep-tag. The gB sequence between aa residues 219-360 was identified as putative region of interaction with gH or critical to the interaction.

Orientadores: Luiz Carlos Teixeira, Marcelo Alvarenga
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas
Made available in DSpace on 2018-08-06T06:39:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Campos_GraceImaculadaPereira_M.pdf: 240494 bytes, checksum: cd5e0f3dc3493ba406e12d65609a451f (MD5) Previous issue date: 2006
Resumo: Objetivo: Avaliar a expressão imunoistoquímica da P-glicoproteína e sua correlação com a resposta à quimioterapia com esquemas contendo antraciclina em mulheres portadoras de carcinoma de mama estádio III. Sujeitos e Métodos: Estudo de coorte retrospectivo, em que foram analisados 88 prontuários de pacientes matriculadas no período de Junho de 1996 a novembro de 2003 no Ambulatório de Oncologia Clinica do CAISM-Unicamp, e portadoras de carcinoma ductal infiltrativo localmente avançado, que receberam quimioterapia neo-adjuvante com esquemas contendo antraciclina, excluindo as portadoras de carcinoma inflamatório. O tumor foi biopsiado antes do tratamento (core biopsy ou incisional) e submetido a exame imunoistoquímico pelo sistema envision peroxidase, utilizando-se anticorpos monoclonais anti-P-glicoproteína (P-gp), C494 (Signet) trans-menbrana e C219 (Signet) intra-citoplásmatico. Considerou-se positivo coloração citoplasmática ou trans-membrana em 10% ou mais das células. O controle externo positivo usado foi tecido normal de rim humano. A resposta clínica foi avaliada antes da cirurgia, após no mínimo dois ciclos de quimioterapia e os dados correlacionados com a expressão da p-glicoproteína. Empregou-se o teste exato de Fisher ou qui-quadrado para avaliar as possíveis associações. Resultados: A freqüência da positividade da P-glicoproteína na amostra foi de 23,86%. A resposta clínica objetiva à quimioterapia foi semelhante nos casos com e sem expressão da p-glicoproteína, considerando o tumor primário (57,1% vs 58,2%), axila (67,8% vs 78,8%) e resposta total (57,2% vs 65,7 %, p = 0,851). Conclusão: Não encontramos relação entre a expressão da P-glicoproteína e a resposta clínica à quimioterapia neo-adjuvante, sugerindo que este marcador não deve ser considerado como fator preditivo de resposta à quimioterapia com antraciclina
Abstract: Objective: Evaluate the immunohistochemical expression of P-glycoprotein and its correlation to the response to chemotherapy with schemes containing antraciclin in women who are carriers of stage III breast carcinoma. Subjects and Methods: In the study of retrospective cohort, 88 files of patients who are carriers of locally advanced infiltrative ductal carcinoma were analyzed, and received neoadjuvant chemotherapy containing antraciclin, excluding the inflammatory cases, from June 1996 to November 2003, in the Oncology Clinic of CAISM-Unicamp. The tumor was biopsized before treatment (core biopsy or incisional biopsy) and subjected to the immunohistochemical exam by using the envision peroxidase system and utilizing anti-P-glycoprotein monoclonal antibodies (P-gp), C494 (Signet) trans-menbrane and C219 (Signet) intra-cytoplasmatic. The cytoplasmatic coloring or trans-membrane was considered positive in a rate of 10% or more of the cells. The external positive control which was used was human kidney normal tissue. Clinical response was evaluated before surgery, after a minimum of two cycles of chemotherapy and the data was correlated to the expression of P-glycoprotein. The exact Fisher test or Qui-square test was used to evaluate any possible associations. Results: The frequency of the positivity of P-glycoprotein in the samples was 23.86%. The objective clinical response to chemotherapy was similar in the cases with and without the expression of P-glycoprotein, considering the primary tumor (57.1% vs 58.2%), arm pit (67.8% vs 78.8%) and total response (57.2% vs 65.7%, p = 0.851). Conclusion: The relation between the expression of P-glycoprotein and the clinical response to to neoadjuvant chemotherapy was not found, what suggests that this marker should not be considered as a response predictive factor to chemotherapy with anthracyclin
Mestrado
Ciencias Biomedicas
Mestre em Tocoginecologia

Orientadores: Angela Maria Moraes, Ronaldo Zucatelli Mendonça, Thomas Noll
Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica
Made available in DSpace on 2018-08-09T05:00:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Batista_FabianaReginaXavier_D.pdf: 3826216 bytes, checksum: 4aa1d7076a6bcbd23c7d0dcbd794541c (MD5) Previous issue date: 2007
Resumo: Células embrionárias de dípteros como as de Drosophila melanogaster S2 estão sendo utilizadas com sucesso na expressão de diversas proteínas recombinantes. Em comparação a células de mamíferos, este sistema de expressão mostra-se capaz de realizar modificações pós-tradução na complexidade requerida, apresentando maior facilidade de cultivo. O objetivo deste trabalho foi formular um meio de cultura livre de soro e de outras fontes de proteínas de origem animal, que proporcionasse o crescimento de células S2, aplicável a linhagens transfectadas (S2AcGPV2) produtoras da glicoproteína G do vírus da raiva (GPV). Para tal, foi empregado o meio basal IPL-41 e avaliados os efeitos das concentrações de glicose, frutose, lactose, glutamina, metionina e tirosina, do hidrolisado de leveduras yeastolate, do agente Pluronic F68, assim como de uma emulsão lipídica, sobre a concentração de células viáveis e a viabilidade celular. Em adição, foram avaliadas a velocidade específica de crescimento, a produtividade celular e a produção de GPV nas formulações testadas. Os ensaios foram realizados primeiramente em frascos do tipo schott, e, após a obtenção da formulação do meio de cultura mais adequada, realizaram-se ensaios cinéticos, em maior escala, em frascos do tipo spinner, nos quais se pode estudar a influência da concentração de oxigênio dissolvido e do pH no cultivo. Durante o estudo foram empregados dois modos de operação de cultivo, batelada e batelada alimentada. Nos estudos enfocando a formulação do meio de cultura, verificou-se que o meio IPL-41 suplementado com 10 g/L de glicose, 0,5 g/L de frutose, 2 g/L de lactose, 3,5 g/L de glutamina, 0,6 g/L de tirosina, 1,48 g/L de metionina, 6 g/L de yeastolate, 1 % de emulsão lipídica e 0,05 % de Pluronic F68 mostrou-se como o mais adequado para a obtenção de elevadas concentrações celulares (superiores a 300 x 105 células/mL). Com esta formulação, foram realizados os ensaios em frascos spinner, no sistema Cellferm-pro®. Neste sistema as células S2AcGPV2 atingiram a maior concentração (368 x105 células/mL) e o maior teor de GPV (9,39 ng/106 células) quando mantidas na concentração de 40 % de oxigênio dissolvido e pH 6,3. A avaliação do metabolismo celular mostrou que asparagina, serina, prolina, glutamina, glicose e a maltose foram os principais nutrientes consumidos e que alanina, lactato e amônia foram os principais metabólitos produzidos
Abstract: Drosophila melanogaster Schneider 2 cells have been used with success to produce several recombinant proteins. This expression system presents several advantages when compared with mammalian cells expression system, and usually provide an adequate postradutional protein processing, being easier to culture. The aim of this work was to produce an animal component-free medium for S2 cells growth, and also for transfected cells (S2AcGPV2) producing the G glycoprotein from rabies virus (GPV). The basal IPL-41 medium was used and the effects of supplements glucose, fructose, lactose, glutamine, methionine, tyrosine, yeastolate ultrafiltrate, Pluronic F68 and lipid emulsion on viable cell concentration and cellular viability were evaluated. In addition, the cell specific growth rate, cellular productivity and GPV production were analyzed in the formulations studied. The experiments were carried out in schott flasks, as well as in spinner flasks. The effects of dissolved oxygen concentration and pH were evaluated in spinner flasks. During the study, batch and fed- batch mode operation were used. In the studies focusing media formulation developed, IPL-41 supplemented with 10 g/L of glucose, 0.5 g/L of fructose, 2 g/L of lactose, 3.5 g/L of glutamine, 0.6 g/L of tyrosine, 1.48 g/L of methionine, 6 g/L of yeastolate, 1 % of lipid emulsion and 0.05 % of Pluronic F68 provided high cell density (above 300 x105 cells/mL). In the experiments performed in spinner flasks, using the Cellferm-pro® system, S2AcGPV2 cells reached the highest cell concentration (368 x105 cells/mL) and protein content (9.39 ng/106 cells), at 40 % of dissolved oxygen concentration and pH of 6.3. The cell metabolism shown that, amino acids as asparagine, serine, proline, glutamine, and carbohydrates as glucose and maltose were consumed. The main metabolities produced were alanine, ammonia and lactate
Doutorado
Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos
Doutor em Engenharia Química

Herpes simplex virus entry into cells requires a multipartite fusion apparatus made of gD, gB and heterodimer gH/gL. gD serves as receptor-binding glycoprotein and trigger of fusion; its ectodomain is organized in a N-terminal domain carrying the receptor-binding sites, and a C-terminal domain carrying the profusion domain, required for fusion but not receptor-binding. gB and gH/gL execute fusion. To understand how the four glycoproteins cross-talk to each other we searched for biochemical defined complexes in infected and transfected cells, and in virions. We report that gD formed complexes with gB in absence of gH/gL, and with gH/gL in absence of gB. Complexes with similar composition were formed in infected and transfected cells. They were also present in virions prior to entry, and did not increase at virus fusion with cell. A panel of gD mutants enabled the preliminary location of part of the binding site in gD to gB to the aa 240-260 portion and downstream, with T306P307 as critical residues, and of the binding site to gH/gL at aa 260-310 portion, with P291P292 as critical residues. The results indicate that gD carries composite independent binding sites for gB and gH/gL, both of which partly located in the profusion domain. The second part of the project dealt with rational design of peptides inhibiting virus entry has been performed. Considering gB and gD, the crystal structure is known, so we designed peptides that dock in the structure or prevent the adoption of the final conformation of target molecule. Considering the other glycoproteins, of which the structure is not known, peptide libraries were analyzed. Among several peptides, some were identified as active, designed on glycoprotein B. Two of them were further analyzed. We identified peptide residues fundamental for the inhibiting activity, suggesting a possible mechanism of action. Furthermore, changing the flexibility of peptides, an increased activity was observed,with an EC50 under 10μM. New approaches will try to demonstrate the direct interaction between these peptides and the target glycoprotein B.

Herpes simplex virus entry into cells requires a multipartite fusion apparatus made of gD, gB and heterodimer gH/gL. gD serves as receptor-binding glycoprotein and trigger of fusion; its ectodomain is organized in a N-terminal domain carrying the receptor-binding sites, and a C-terminal domain carrying the profusion domain, required for fusion but not receptor-binding. gB and gH/gL execute fusion. To understand how the four glycoproteins cross-talk to each other we searched for biochemical defined complexes in infected and transfected cells, and in virions. We report that gD formed complexes with gB in absence of gH/gL, and with gH/gL in absence of gB. Complexes with similar composition were formed in infected and transfected cells. They were also present in virions prior to entry, and did not increase at virus fusion with cell. A panel of gD mutants enabled the preliminary location of part of the binding site in gD to gB to the aa 240-260 portion and downstream, with T306P307 as critical residues, and of the binding site to gH/gL at aa 260-310 portion, with P291P292 as critical residues. The results indicate that gD carries composite independent binding sites for gB and gH/gL, both of which partly located in the profusion domain. The second part of the project dealt with rational design of peptides inhibiting virus entry has been performed. Considering gB and gD, the crystal structure is known, so we designed peptides that dock in the structure or prevent the adoption of the final conformation of target molecule. Considering the other glycoproteins, of which the structure is not known, peptide libraries were analyzed. Among several peptides, some were identified as active, designed on glycoprotein B. Two of them were further analyzed. We identified peptide residues fundamental for the inhibiting activity, suggesting a possible mechanism of action. Furthermore, changing the flexibility of peptides, an increased activity was observed,with an EC50 under 10μM. New approaches will try to demonstrate the direct interaction between these peptides and the target glycoprotein B.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:01Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-08-30Bitstream added on 2014-06-13T18:50:11Z : No. of bitstreams: 1 neo_ta_me_arafcf.pdf: 1125295 bytes, checksum: 23377b72364333a1ac1bf48473dfab17 (MD5)
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)
O vírus da Hepatite C (VHC) é o principal agente etiológico das hepatites não-A e não-B, infectando aproximadamente 170 milhões de pessoas no mundo (3% da população mundial). O vírus da hepatite C (HCV; hepatitis C-virus) é envelopado tem de 50 a 70nm de diâmetro, possui uma única fita positiva de RNA e pertence ao gênero do Hepacivirus e à família Flaviridae. Seu genoma é constituído por cerca de 9.500 nucleotídeos com regiões curtas não codificadoras e hiperconservadas nas extremidades 5’ e 3’UTR, flanqueando uma única ORF. A região estrutural do vírus é constituída por 3 genes: core, E1 e E2. As proteínas do envelope, E1 e E2 do VHC, são altamente glicosiladas e apresentam 30 e 70 kDa, respectivamente. Estudos demonstram que ambas apresentam funções específicas em diferentes etapas do ciclo de replicação do vírus, atuando de forma essencial para entrada, ligação ao receptor e fusão com a membrana da célula hospedeira. A glicoproteína E2 do VHC liga-se com alta afinidade a uma alça do receptor CD81, também denominado de TAPA-1, uma tetraespanina encontrada na superfície de muitas células, incluindo hepatócitos. No entanto, o CD81 isoladamente não é suficiente para mediar a entrada celular do vírus, e vários outros co-fatores podem atuar nessa interação. Os receptores de lipoproteína de baixa densidade (LDL-r) e receptor scavenger tipo B classe I apresentam grande importância nessa relação com o VHC. Estudos sobre as glicoproteínas E1 e E2 têm mostrado que estas se associam com os LDL-r, sugerindo que o VHC use estes receptores para invadir a célula hospedeira. Além disso, estudos anteriores relatam o fato de que, as lipoproteínas poderiam proporcionar acréscimos da infectividade ao VHC. Desta forma, neste trabalho foram desenvolvidas estratégias de clonagem e expressão heteróloga da proteína E2, e avaliou-se sua imunogenicidade...
Hepatitis C is currently recognized as the primary cause of hepatitis non A - non B associated to the blood transfusion. The hepatitis C virus (HCV) is enveloped in about 50 to 70nm in diameter, presenting a positive single strand RNA and belongs to the genus Hepacivirus and the family Flaviridae. Its genome consists of 9,500 nucleotides with short non-coding regions and hiperconservadas ends 5´ and 3'UTR flanking a single ORF. The virus structural region is based on three core genes, E1 and E2. HCV E1 and E2 are highly glycosylated and have 30 and 70 kDa, respectively. Studies show that both have key role in different stages of the cycle of virus replication, acting as essential for entry, receptor binding and fusion with host cell membrane. Glycoprotein E2 of HCV binds with high affinity to a loop of CD81, a tetraspanin, also named TAPA-1, found on the surface of many cells, including hepatocytes. However, the CD81 alone is not sufficient to mediate the cellular entry of the virus, and several other co-factors may be operating in this interaction. Recipients of low density lipoprotein (LDL-r) and scavenger receptor class B type I (SR-BI) would present great importance in relation to HCV. The LDL-r plays an important role in infection for virus of the hepatitis C. Studies on the glycoproteins E1 and E2 have shown that these are associated with the LDL-r suggesting that HCV uses the LDL-r to invade the host cell. Besides, previous studies showed that lipoprotein could improve HCV infectivity. Thus, in this work the capacity of recognition of the antibodies present anti-HCV was evaluated in the positive human serum for HCV of recognizing the protein E2 recombinant produced in bacteria of the lineage Rosetta and also the capacity of connection of the protein E2 of HCV in bind LDL-r present in the surface of human cells with characteristics endoteliais (ECV 304), and such capacity was... (Complete abstract click electronic access below)

Orientador: Alexandrina Sartori
Coorientador: Fernanda Chiuso Minicussi
Banca: Alessandro dos Santos Farias
Banca: Naria Terezinha Serrão Peraçoli
Resumo: A esclerose múltipla (EM) é uma doença inflamatória, crônica e desmielinizante do Sistema Nervoso Central (SNC). A caracterização de estratégias profiláticas ou terapêuticas na EM é necessária já que não há cura para a doença. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi avaliar o potencial profilático da associação de MOG (glicoproteína da mielina do oligodendrócito) com vitamina D3 (VitD) na encefalomielite autoimune experimental (EAE). Para isto, camundongos C57BL/6 foram imunizados com MOG na presença de VitD e posteriormente submetidos à indução da EAE. Os animais foram então eutanasiados nos dias 7 e 19 após indução da EAE os quais correspondem às fases pré-clinica e clínica da doença, respectivamente. Os seguintes parâmetros foram avaliados: peso corporal, escore clínico, processo inflamatório no SNC, quantidade de células dendríticas (DCs) e de T reguladoras (Tregs) no baço e produção de citocinas por células esplênicas e células mononucleares eluídas do SNC. A imunização com MOG associada com VitD impediu o desenvolvimento da EAE. O efeito profilático observado reduziu a maturação das DCs e a produção de citocinas encefalitogênicas, mas não aumentou a quantidade de Tregs no baço. Já no SNC a imunização determinou redução acentuada no processo inflamatório e na produção de citocinas encefalitogênicas. Os dados obtidos indicam que a associação do antígeno específico (MOG) com VitD foi suficientemente tolerogênica para evitar o desenvolvimento da EAE. Efeito similar em outras patologias autoimunes é esperado e merece investigação
Abstract: Multiple sclerosis is a chronic, inflammatory and demyelinating disease of the central nervous system (CNS). As there is no cure for this disease, new prophylactic or therapeutic strategies are necessary. The main objective of this work was to evaluate the prophylactic potential of the association of myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) with vitamin D3 in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). C57BL/6 mice were immunized with MOG associated with vitamin D3 and then submitted to EAE induction. Animals were euthanized 7 and 19 days after, during the preclinical and acute disease phases, respectively. The following parameters were evaluated: body weight, clinical score, inflammatory process in the CNS, amount of dendritic and regulatory T cells in the spleen and cytokine production by spleen and CNS cell cultures. Immunization with MOG associated with vitamin D3 blocked clinical EAE development. This prophylactic effect was associated with a drastic reduction in clinical score, body weight loss, CNS inflammation, dendritic cells maturation and also in the production of cytokines by CNS and spleen cell cultures. This association was therefore highly tolerogenic, being able to avoid EAE development. A similar effect from vitamin D3 association with other specific self-antigens is expected in other autoimmune conditions and deserves future evaluation
Mestre

Orientador: Rosangela Zacarias Machado
Banca: Marta Maria Geraldes Teixeira
Banca: Cláudio Lisias Mafra de Siqueira
Banca: Marcos Rogério André
Banca: Jesus Aparecido Ferro
Resumo: A babesiose é uma doença infecciosa economicamente importante que afeta o gado bovino em todo o mundo, endêmica e importante causa de morbidade e mortalidade em bovinos no Brasil. A doença é causada por Babesia bigemina e B. bovis, protozoários parasitas intraeritrocíticos do filo Apicomplexa, agentes de enorme importância econômica em regiões tropicais e subtropicais. Merozoitos de B. bovis possuem em sua superfície, pelo menos, cinco glico-proteínas, que pertencem à família de antígenos variáveis de superfície do merozoíto (VMSA). A família VMSA de B. bovis inclui os genes msa-1, msa-2a1, msa-2a2, msa-2b e msa-2c. Estes antígenos são altamente imunogênicos e contêm epítopos sensíveis à neutralização e, por conseguinte, têm sido considerados como antígenos candidatos para o desenvolvimento de vacinas de subunidades contra B. bovis. No entanto, estes antígenos de superfície são geneticamente diversificados entre diferentes isolados de B. bovis, O que resulta em diferenças antigénicas entre vários isolados de B. bovis. A fim de avaliar a resposta imune humoral contra B. bovis e a diversidade genética de antígenos de superfície de merozoítos de B. bovis, amostras de soro e DNA de sangue de 30 bezerras, sendo 15 da Fazenda Pesagro, Seropédica, Rio de Janeiro, e outras 15 da Fazenda Germânia, Taiaçu, São Paulo, foram obtidas trimestralmente, desde o nascimento até aos 12 meses de idade. Os Anticorpos IgG para B. bovis foram detectados pelos testes de Imunofluorescência Indireta (... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo)
Abstract: Babesiosis, an economically important infectious disease that affects cattle worldwide, is endemic and important cause of morbidity and mortality of cattle in Brazil. The disease is caused by Babesia bigemina and B. bovis, apicomplexan intraerythrocytic protozoa parasites, which are agents of huge economic importance in tropical and subtropical regions. B. bovis merozoites present at least five (glyco-) proteins on their surfaces, which belong to a family of variable merozoite surface antigens (VMSA). The members of the VMSA family consist of merozoite surface antigen msa-1, msa-2a1, msa-2a2, msa-2b, and msa-2c. These antigens are highly immunogenic and contain neutralization-sensitive epitopes, and therefore have been considered as candidate antigens for developing subunit vaccines against B. bovis. However, these surface antigens are genetically diverse among different isolates of B. bovis, which results in antigenic differences among various B. bovis isolates. In order to evaluate the humoral immune response against B. bovis and genetic diversity of merozoite surface antigens of B. bovis, serum and DNA blood samples of 30 dairy calves, 15 from Seropedica, state of Rio de Janeiro, and the other 15 from a herd located in Taiaçu, state of São Paulo were obtained quarterly, since the birth up to 12 months of age. IgG antibodies to B. bovis were detected by Indirect Fluorescent Antibody Test (IFAT) and Enzyme-Linked Immunoadsorbent Assay (ELISA) tests. Polymerase Chain Reaction... (Complete abstract click electronic access below)
Mestre

Membros da família Herpesviridae, subfamília Alphaherpesvirinae, herpesvírus bovino tipos 1 (BoHV-1) e 5 (BoHV-5) tem sido associados a diferentes condições clínicas em bovinos. Assim, diferenciação entre BoHV-1 e BoHV-5 é uma valiosa informação objetivando um melhor entendimento da patogenia e epidemiologia destes vírus no rebanho bovino. Contudo, métodos para diferenciação são escassos devido às reações cruzadas originadas da alta homologia genômica e antigênica entre estes vírus. O presente estudo concentrou-se na análise da região carboxi-terminal da glicoproteína C (nucleotídeos 16763 - 17337 em BoVH-1 e 17671 - 18242 em BoHV-5), uma vez que tal região apresentou características potenciais que permitissem a diferenciação entre estes vírus. Assim, no primeiro capítulo do presente trabalho a região carboxi-terminal da gC foi utilizada como alvo para o desenvolvimento de uma Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) seguida da Análise da Restrição Enzimática (REA) do fragmento amplificado, capaz de diferenciar entre isolados de BoHV-1 ou BoHV-5, gerando fragmentos com tamanhos de 575 pares de base (pb) frente a BoHV-1 e 572 pb frente a BoHV-5. A diferenciação entre BoHV-1 e BoHV-5 foi obtida após a digestão dos amplicons com a enzima de restrição Bgl I. No segundo capítulo, a região carboxi-terminal de 23 amostras Sul-Americanas de BoHV-1 ou BoHV-5 foram amplificadas e sequenciadas. A análise filogenética realizada com as sequências de nucleotídeos revelou identidade variando entre 98,7 a 99,8% (BoHV-1/ BoHV-1), 88,3 a 92% (BoHV-1/ BoHV-5) e 96 to 99,7% (BoHV-5/ BoHV-5). Alinhamentos realizados com sequências de aminoácidos revelaram identidade variando entre 97,5 a 99,5% (BoHV-1/ BoHV-1), 77,5 a 84,4% (BoHV-1/ BoHV-5) e 92,1 a 99,5% (BoHV-5/ BoHV-5). Análises filogenéticas revelaram, ainda, que: i) alguns isolados de BoHV-5 apresentaram um padrão diferente daqueles até o presente reconhecidos; ii) uma amostra isolada no Uruguai (BoHV-1.2) apresentou um padrão de agrupamento distinto quando comparado com as outra amostras de BoHV-1.2. O terceiro capítulo apresenta o primeiro relato de detecção de BoHV-5 de sêmen bovino através da análise antigênica, amplificação diferencial da região amino-terminal do gene da gC de BoHV-1 e 5, seguida da caracterização por REA do isolado em estudo. Em síntese, através da utilização da gC foi possível avaliar a homologia entre as amostras Sul- Americanas estudadas; desenvolver uma PCR/REA diferencial entre estes vírus e relatar a detecção de uma amostra de BoHV-5 isolada à partir de sêmen contaminado.
Members of the Herpesviridae family, Alphaherpesvirinae subfamily bovine herpesvirus types 1 (BoHV-1) and 5 (BoHV-5) have been associated to different clinical conditions of cattle. Thus, differentiation has become an important tool for a better understanding of the pathogenesis and epidemiology of BoHV infections in cattle. However, currently available methods for such differentiation are hampered by cross-reactions from high genomic and antigenic homology between these viruses. The present work focused on the analysis of the carboxy-terminal portion of glycoprotein C (gC), corresponding to nucleotides 16763 - 17337 on BoHV-1 and 17671 - 18242 on BoHV-5 once such region showed characteristics that would allow a clear distinction between BoHV-1 and 5. In view of that, in the first chapter, the carboxy-terminal region of gC was the target for the development of a Polymerase Chain Reaction followed by a Restriction Enzyme Analysis (PCR/REA) for differentiation between BoHV-1 and 5. The PCR/REA was designed to amplify a segment on the carboxy-terminal portion of the glycoprotein C (gC) gene, giving rise to amplicons of 575 base pairs (bp) for BoHV- 1, and 572 bp for BoHV-5. The amplicons were digested with the Bgl I for differentiation between BoHV-1 and 5. In the second chapter the region previously described of 23 South American isolates of BoHV-1 and BoHV-5 were amplified and sequenced. Nucleotide sequence alignments revealed identity ranged from 98,7 to 99,8% (BoHV-1/ BoHV-1), 88,3 to 92% (BoHV-1/ BoHV-5) and 96 to 99,7% (BoHV-5/ BoHV-5). The identity deduced from amino acid sequences ranged from 97,5 to 99,5% (BoHV-1/ BoHV-1), 77,5 to 84,4% (BoHV-1/ BoHV-5) and 92,1 to 99,5% (BoHV-5/ BoHV- 5) . Phylogenetic analyses and deduced amino acid sequences revealed that: i) some BoHV-5 isolates seem to be “non a non b” subtype and ii) there is a Uruguayan BoHV-1.2 strain that has a distinct nucleotide and amino acid sequence when compared to others BoHV-1.2 strains. The third chapter of the present work contains the first report of a BoHV-5 strain isolated from the bovine semen by antigenic characterization, differential amplification of the N-terminal region of gC gene from BoHV-1 and 5 followed by genomic characterization by REA and antigenic characterization of the isolate analyzed.

A hemostasia envolve diversos eventos fisiológicos desencadeados após a ruptura da integridade vascular. Durante estes processos, os glicosaminoglicanos, incluindo a heparina e o heparan sulfato, desempenham funções fisiológicas fundamentais. Particularmente a heparina, isolada no início do século XX, permanece até os dias atuais como um dos mais eficientes agentes terapêuticos de ação antitrombótica. As cadeias polissacarídicas destes glicosaminoglicanos são clivadas por liases, denominadas heparinases, através de um mecanismo de eliminação. As heparinases, identificadas inicialmente na bactéria do solo Flavobacterium heparinum (sinonímia: Pedobacter heparinus), diferem em tamanho, carga e grau de especificidade pela sequência dissacarídica do substrato. Possuem importantes aplicações na terapêutica, diagnóstico e também na produção de heparinas de baixo peso molecular (HBPM). Dentre as heparinases já descritas para F. heparinum a enzima do tipo II é a menos específica, sendo capaz de clivar ligações glicosídicas do tipo 1-4 entre a glicosamina e ácido urônico (idurônico ou glicurônico), presentes na heparina e no heparan sulfato. Entretanto, o processo de reconhecimento enzima-substrato neste sistema é ainda pouco conhecido. Particularmente com relação à dependência por metais, esta enzima tem sua atividade inibida pela presença do íon cálcio que, em contrapartida, é importante para a atividade das heparinases dos tipos I e III. A heparinase II é uma glicoproteína e apresenta um sítio de ligação ao íon zinco, o qual exerce uma importante função de manutenção da integridade da estrutura protéica. Desta forma, o presente trabalho tem por objetivo a caracterização estrutural e conformacional da enzima heparinase II e, a partir destas informações, subsidiar o entendimento do reconhecimento e especificidade da interação enzima-substrato, fundamentando um planejamento racional de novos ligantes. Empregando-se a Dinâmica Molecular (MD), quatro sistemas envolvendo a enzima foram estudados, considerando-se a presença ou ausência de íons Ca+² e Zn+² e da estrutura de glicosilação. Os dados obtidos indicam que a presença do íon Zn+² pode estar envolvida no controle da flexibilidade da estrutura protéica em regiões específicas da heparinase II. Em contrapartida, a presença do íon Ca+² promove um acréscimo significativo na flexibilidade em regiões equivalentes àquelas do Zn+², relacionada à influência do íon no sítio catalítico da enzima. Adicionalmente, a presença da O-glicosilação parece ser capaz de promover uma estabilização adicional da estrutura secundária da proteína, sugerindo um papel na estabilidade conformacional da mesma. Globalmente, os resultados indicam que simulações de MD podem ser utilizadas para representar adequadamente a conformação de glicoproteínas como a heparinase II, permitindo a caracterização de diversas propriedades, como a quantificação de suas interações com cofatores metálicos e o papel de seu sítio de glicosilação. Cria-se, portanto, uma sólida base para o estudo das demais heparinases, de suas respectivas especificidades e, por fim, para o planejamento racional de novos candidatos a agentes moduladores dos processos hemostáticos.
The hemostasis comprises important physiologic events following the rupture of vascular integrity. During these processes, heparin and heparan sulfate glycosaminoglycans (HSGAG) presents important physiological functions. In particular heparin, isolated in the beginning of the XX century, remains until today as one of the most efficient antithrombotic therapeutic agents. The polysaccharide chains of these HSGAGs are cleaved by lyases, named heparinases, through an elimination mechanism. The heparinases, first identified in the soil bacterium Flavobacterium heparinum (also named Pedobacter heparinus), differ in size, charge and substrate specificity. They have important applications, such as therapeutic, diagnostic and production of low molecular weight heparins (LMWH). Within the heparinases from F. heparinum, the type II enzyme has the broadest substrate specificity, being capable of cleavage upon the (1-4) glycosidic linkages between glucosamine and uronic acid (either glucuronic or iduronic) residues contained by heparin and heparan sulfate. However, the enzyme-substrate recognition process is poorly structurally described. Mainly in relation of the metals dependence, this enzyme has its activity inhibited by the presence of the calcium ion which, in opposite, is important for heparinanses I and III activities. The heparinase II is a glycoprotein and shows a zinc ion binding site, which plays an important role in the protein structure maintenance. Thus, the current work aims to characterize the structure and conformation of heparinase II enzyme and, based on this information, support the understanding of the recognition and specificity of the enzyme-substrate interaction, and further the rational design of new ligands of the enzyme. Using molecular dynamics (MD) calculations, four systems were studied, considering the presence or absence of Ca+² and Zn+² ions and the glycosylation structure. The obtained data indicates that the presence of a Zn+² ion may be involved in the control of the protein flexibility at some specific regions of the heparinase II. In opposite, the Ca+² presence promotes a significant increase of the flexibility on the same regions, related to the influence of this ion in the enzyme active site. Additionally, the O-glycosylation seems to be capable to promote an additional stabilization of the protein secondary structure, what may indicate its role as an element that contributes to the conformational stability of the protein. Altogether the results show that MD simulations can be used to correctly represent the glycoprotein conformations, such as heparinase II, allowing characterizing its properties, as well as quantifying its interactions with metallic cofators and the role of the glycosylation site. Thus, is generated a solid basis to the study of the other heparinases, their respective specificities, and finally to the design of new candidates to hemostatic process modulating agents.

Made available in DSpace on 2015-12-10T14:22:50Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-02-23. Added 1 bitstream(s) on 2015-12-10T14:29:03Z : No. of bitstreams: 1 000850466.pdf: 1900778 bytes, checksum: 98b60125277348e8653d4a5f575c0ab2 (MD5)
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)
A esclerose múltipla (EM) é uma doença inflamatória, crônica e desmielinizante do Sistema Nervoso Central (SNC). A caracterização de estratégias profiláticas ou terapêuticas na EM é necessária já que não há cura para a doença. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi avaliar o potencial profilático da associação de MOG (glicoproteína da mielina do oligodendrócito) com vitamina D3 (VitD) na encefalomielite autoimune experimental (EAE). Para isto, camundongos C57BL/6 foram imunizados com MOG na presença de VitD e posteriormente submetidos à indução da EAE. Os animais foram então eutanasiados nos dias 7 e 19 após indução da EAE os quais correspondem às fases pré-clinica e clínica da doença, respectivamente. Os seguintes parâmetros foram avaliados: peso corporal, escore clínico, processo inflamatório no SNC, quantidade de células dendríticas (DCs) e de T reguladoras (Tregs) no baço e produção de citocinas por células esplênicas e células mononucleares eluídas do SNC. A imunização com MOG associada com VitD impediu o desenvolvimento da EAE. O efeito profilático observado reduziu a maturação das DCs e a produção de citocinas encefalitogênicas, mas não aumentou a quantidade de Tregs no baço. Já no SNC a imunização determinou redução acentuada no processo inflamatório e na produção de citocinas encefalitogênicas. Os dados obtidos indicam que a associação do antígeno específico (MOG) com VitD foi suficientemente tolerogênica para evitar o desenvolvimento da EAE. Efeito similar em outras patologias autoimunes é esperado e merece investigação
Multiple sclerosis is a chronic, inflammatory and demyelinating disease of the central nervous system (CNS). As there is no cure for this disease, new prophylactic or therapeutic strategies are necessary. The main objective of this work was to evaluate the prophylactic potential of the association of myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) with vitamin D3 in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). C57BL/6 mice were immunized with MOG associated with vitamin D3 and then submitted to EAE induction. Animals were euthanized 7 and 19 days after, during the preclinical and acute disease phases, respectively. The following parameters were evaluated: body weight, clinical score, inflammatory process in the CNS, amount of dendritic and regulatory T cells in the spleen and cytokine production by spleen and CNS cell cultures. Immunization with MOG associated with vitamin D3 blocked clinical EAE development. This prophylactic effect was associated with a drastic reduction in clinical score, body weight loss, CNS inflammation, dendritic cells maturation and also in the production of cytokines by CNS and spleen cell cultures. This association was therefore highly tolerogenic, being able to avoid EAE development. A similar effect from vitamin D3 association with other specific self-antigens is expected in other autoimmune conditions and deserves future evaluation

Orientador: Helio José Montassier
Banca: Cintia Hiromi Okino
Banca: Manoel Victor Franco Lemos
Resumo: Em plantéis avícolas, é frequente a ocorrência de doenças infecciosas respiratórias e dentre estas, destaca-se a Bronquite Infecciosa (BI), uma doença aguda e altamente contagiosa de aves. A BI é causada pelo vírus da bronquite infecciosa (VBI), cujo processo infeccioso geralmente provoca perdas econômicas significativas para as criações avícolas. A extensa variação genética, especialmente nas regiões hipervariáveis (HVRs) do gene S1, é uma das principais características da evolução do VBI, e resulta no surgimento de diversas variantes, que requerem um diagnóstico molecular que inclua a detecção dessas novas estirpes, como o genótipo brasileiro (BR-VBI), pois a detecção e identificação do agente etiológico são essenciais para o controle dessa enfermidade. Para tanto, é necessário que os métodos de diagnóstico empregados sejam sensíveis, específicos e de baixo custo. Foi então desenvolvida e avaliada neste estudo uma técnica de Nested-RT-PCR (BR-Nested-RT-PCR) utilizando um conjunto de oligonucleotídeos iniciadores desenvolvido dentro da região HVR3 do gene S1 de estirpes variantes brasileiras do VBI para a detecção e identificação de linhagens do genótipo brasileiro do VBI presentes em amostras biológicas de aves e comparada com a Nested-RT-PCR universal, utilizando oligonucleotídeos iniciadores universais para a mesma região do gene S1. Os resultados demonstraram que a técnica BR-Nested-RT-PCR apresentou uma elevada sensibilidade na detecção de estirpes do genótipo BR-I do V... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo)
Abstract: Infectious bronchitis (IB) is an acute and highly contagious disease of birds. IB is caused by infectious bronchitis virus (IBV), which usually results in significant economic losses for poultry farms. The extensive genetic variation, especially in the hypervariable regions (HVRs) of the S1 gene, is one of the main characteristics of the evolution of IBV, and results in the appearance of several variants that require a molecular diagnosis which includes the detection of these new strains, such as Brazilian I genotype (BR-I), since the detection and identification of the causative agent are essential for the control of the disease. Therefore, the diagnostic methods used must be sensitive, specific and inexpensive. A Nested-RT-PCR (BR-Nested-RT-PCR) technique was developed and evaluated in this study using a set of primers designed for the HVR3 region of the S1 gene for the detection and identification of Brazilian genotype strains of IBV present in biological samples from birds and compared with universal Nested-RT-PCR using universal primers for the same region of the S1 gene. The results demonstrated that the BR-Nested-RT-PCR technique had a high sensitivity to detect IBV strains from BR-I genotype and did not generate amplified products from heterologous virus samples tested (Newcastle disease virus, avian metapneumovirus, Reovirus and Gumboro disease virus), neither from IBV strains of other genotypes. In addition, the comparison between BR-Nested-RT-PCR techniques with th... (Complete abstract click electronic access below)
Mestre

Orientadores: Angela Maria Moraes, Carlos Augusto Pereira
Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica
Made available in DSpace on 2018-08-09T04:29:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Galesi_AdrianaLagesLima_D.pdf: 1381119 bytes, checksum: 756e8fc5c7c30b40f7e2ebe60c293b63 (MD5) Previous issue date: 2007
Resumo: Células de inseto têm sido freqüentemente empregadas na obtenção de proteínas recombinantes devido a algumas vantagens em relação às células de mamíferos, e a linhagem Drosophila melanogaster Schneider 2 é um dos sistemas de expressão utilizados para este propósito. Entretanto, a literatura é escassa em relação ao metabolismo e ao cultivo destas células, o que motivou o desenvolvimento deste trabalho. O objetivo deste estudo foi determinar, através da técnica estatística de planejamento fatorial de experimentos, um meio de cultura adequado ao crescimento da linhagem Drosophila melanogaster Schneider 2 transfectada para expressão da glicoproteína do vírus da raiva (GPV) e avaliar seu comportamento nos diferentes meios formulados. Para tal, no meio basal TC100, foram estudados os efeitos dos suplementos glicose, glutamina, concentrado protéico de soro de leite, yeastolate (extrato de levedura), hidrolisado de soja, lactoalbumina hidrolisada, emulsão lipídica e Pluronic F68 sobre o crescimento e a viabilidade celular, na tentativa de reduzir o percentual de soro fetal bovino do meio de cultura. A combinação de diferentes suplementos permitiu que o soro fetal bovino fosse eliminado do meio de cultura, principalmente em decorrência da adição de yeastolate, e, em várias das formulações desenvolvidas, a densidade de células foi bastante superior àquela obtida empregando o meio basal TC100 suplementado com 10% de soro fetal bovino. O meio de cultura que resultou no melhor desempenho celular foi formulado com o meio TC100 suplementado com 10 g/L de glicose e 3,5 g/L de glutamina (concentrações finais), 3 g/L de yeastolate, 1% (v/v) de emulsão lipídica e 0,1 % (m/v) de Pluronic F68. Inicialmente, os ensaios realizados em biorreator não reproduziram o crescimento celular obtido em menor escala. Porém, com o aumento da concentração de Pluronic F68 para 0,6%, tal limitação foi contornada. Glicose não foi o substrato limitante nos meios formulados e lactato foi produzido em pequenas quantidades. Apesar de produzido em elevadas concentrações, o amônio não influenciou o crescimento celular. A dosagem da glicoproteína mostrou que as células não perderam sua capacidade de expressão após a adaptação em diferentes meios de cultura e que a produção de GPV no meio formulado é superior à verificada com os meios comerciais SF900 II e TC100 suplementado com 10% de soro fetal bovino
Abstract: Insect cells have been intensively employed to obtain recombinant proteins due to some advantages over mammalian cells, and the Drosophila melanogaster Schneider 2 cell line is one of the expression systems used for this purpose. Nevertheless, literature is scarce with regard to metabolism and culture of these cells, what motivated the development of this work. The aim of this study was to establish an adequate culture medium to cultivate Drosophila melanogaster Schneider 2 cells transfected for the expression of the rabies virus glycoprotein (GPV), and to evaluate their behaviour in different formulated media. For this, the factorial design strategy was employed. The effects of glucose, glutamine, whey protein concentrate, yeastolate, soy hydrolysate, lactoalbumin hydrolysate, lipid emulsion and Pluronic F68 were studied over cell growth and viability, aiming to reduce the fetal bovine serum percentage from the culture medium. Adjusting the concentration of these distinct compounds, serum was eliminated, mainly due to the addition of yeastolate, and cell concentration was higher in several of the developed formulations than that achieved with basal TC100 medium supplemented with 10% of serum. The formulated medium which resulted in best cell performance was composed by TC100 containing 10 g/L of glucose, 3.5 g/L of glutamine, 3 g/L of yeastolate, 1% (v/v) of lipid emulsion and 0.1% (w/v) of Pluronic F68. When in bioreactor, initially the cells did not reproduce the growth behavior observed in smaller scale. However, increasing Pluronic F68 percentage to 0.6%, this limitation was circunvended. Glucose was not the limiting substrate in formulated culture media and lactate was produced in low quantities. Despite ammonium was produced in high concentrations, this compound did not influence cell growth. Glycoprotein quantification shows that cells did not loose their expression capacity after adaptation in the different media, and that glycoprotein production in the formulated medium was higher than that obtained in SF900 II medium and TC100 medium containing 10% of fetal bovine serum
Doutorado
Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos
Doutor em Engenharia Química

Orientador: Joni Augusto Cirelli
Banca: Rosemary Adriana Chiérici Marcantonio
Banca: Maria Cristina Roque Antunes Barreira
Banca: Rodrigo Otávio Citó César Rêgo
Banca: Sérgio Luis Scombatti de Souza
Resumo: Artin M é uma lectina purificada de sementes de Artocarpus heterophyllus que, recentemente, mostrou-se capaz depromover aceleração da cicatrização de lesões por queimadura de pele ou por abrasão da córnea em ratos e coelhos. O objetivo desta tese foi avaliar os efeitos da Artin M no processo de reparação da mucosa mastigatória bucal, por meio de modelos de estudo in vivo. Primeiro estudo: Três feridas cirúrgicas circulares de 6 mm de diâmetro foram criadas na mucosa palatina de 20 cães, e divididas aleatoriamente em 3 grupos de acordo com os tratamentos: C - controle (não tratados), A - Artin M, V - veículo. Quatro animais de cada grupo foram sacrificados após 2, 4, 7, 14 e 21 dias póstratamento e suas maxilas analisadas clinicamente quanto ao padrão de cicatrização, seguido de análise histológica, imuno-histoquímica para antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA) e atividade de mieloperoxidase. Clinicamente, o grupo A demonstrou melhor cicatrização em todos os períodos quando comparada aos outros grupos (p<0,05). A análise histológica mostrou ter havido no grupo A maior estimulação na produção de fibras colágenas, maturação do tecido de granulação e organização do epitélio. A imunolocalização de PCNA mostrou uma maior tendência na proliferação celular em lesões do grupo A principalmente nos dias iniciais (p<0,05). O influxo de neutrófilos mostrou-se estatisticamente aumentado no grupo A quando comparado aos outros grupos nos dias 2 e 4 (p<0,05). Conclui-se que a Artin M promoveu aceleração na reparação das feridas na mucosa mastigatória em cães, via recrutamento de neutrófilos e indução da proliferação celular. É bem conhecido o envolvimento de mediadores biológicos como citocinas... (Resumo completo, clicar aesso eletrônico abaixo)
Abstract: Artin M, lectin from Artocarpus heterophyllus seeds, has been demonstrated to stimulate recruitment and activation of neutrophil and mast cells. Furthermore, it has been shown to accelerate the process of wound healing on burn injuries and corneal epithelial lesions in rats and rabbits, respectively. The aim of this study was to evaluate the effects of Artin M on wound healing in palatal mucosa in two animal models. Study 1: Three wounds of 6 mm full thickness were surgically created in the hard palate mucosa of twenty dogs. The wounds of each animal were randomly divided into three groups according to one of the treatment assigned: C- Control (nontreated), A- Artin M gel, and V- Vehicle (carboxymethylcellulose 3% gel). Four animals per group were sacrificed at 2, 4, 7, 14 and 21 days post-surgery. Before sacrifice, wounded areas were photographed and scored for macroscopic healing evaluation. Afterwards, maxillary tissue were harvested and divided to perform histological analysis, immunohistochemical staining against Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA) and measurement of myeloperoxidase activity. Clinical analysis showed that wound closure was accelerated in group A in comparison to other groups in all periods. Histological features showed enhanced reepithelization and collagen fiber formation resulting in faster maturation of granular tissue in group A compared to the other groups, by day 14. Artin M treatment significantly induced cells proliferation at day 2 and 4 (p<0.05). Neutrophils infiltration in the group A was significantly higher than in the other groups at days 2 and 4 (p<0.05). The results suggest that Artin M gel may potentially facilitate wound healing on palatal mucosa via the recruitment of neutrophils and promotion of cells proliferation. It is well known that cytokines and growth... (Complete abstract click electronic access below)
Doutor

Orientador: Sonia Maria Alves Bueno
Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química
Made available in DSpace on 2018-08-09T16:21:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_PaulaTimoteoda_D.pdf: 1311022 bytes, checksum: 1652a409f13e2bb4e1a18a9dcb28d2fa (MD5) Previous issue date: 2007
Resumo: Raiva ou hidrofobia é uma infecção viral que atinge o sistema nervoso central, ocorrendo em animais e humanos. As proteínas principais encontradas no vírus da raiva que atuam ativando o sistema imune são a nucleoproteína N (NPV) e a glicoproteína G, uma proteína transmembrana que forma o envelope viral e induz a produção de anticorpos neutralizantes que protegem contra o ataque viral. Este trabalho visou a purificação da glicoproteína G do vírus da raiva com cauda de polihistidina (GPV) a partir do lisado e do sobrenadante da cultura de células de inseto Drosophila melanogaster Schneider 2 (S2AcGPV2), transfectadas com o vetor pAc 5.1/V5-His A contendo o gene da GPV, empregando cromatografia de afinidade por íons metálicos imobilizados (IMAC). Os aspectos abordados neste trabalho foram a derivatização do gel de agarose com o agente quelante ácido iminodiacético (agarose-IDA) e a avaliação da seletividade, capacidade e reprodutibilidade do gel de agarose-IDA-Ni2+ na adsorção da GPV em função de diferentes sistemas tamponantes e de diferentes estratégias de dessorção de GPV (abaixamento de pH ou aumento da concentração de agente competitivo). A seletividade em cada sistema tamponante foi determinada por eletroforese SDSPAGE das frações dos picos de proteína obtidos nas cromatografias e a quantificação de GPV presente nas frações cromatográficas foi realizada através de ensaios do tipo ELISA. A melhor condição utilizada para a purificação da glicoproteína G foi a alimentação de lisado de células em coluna contendo agarose-IDA-Ni2+ equilibrada com tampão fosfato de sódio 20 mM, cloreto de sódio 500 mM, imidazol 2 mM pH 7,0. A lavagem foi realizada com tampão fosfato de sódio 20 mM, cloreto de sódio 500 mM, imidazol 2 mM pH 6,0 e a eluição por aumento de concentração de imidazol para 200 e 500 mM. Os resultados demonstraram a potencialidade de utilização do método de IMAC para a purificação da glicoproteína G do vírus da raiva
Abstract: Rabies or hydrophobia is a viral infection that affects the central nervous system, occuring in animals and humans. The main proteins found in rabies virus that activates the immunological system are the N nucleoprotein (NPV) and the G glycoprotein, a transmembrane protein that forms the spikes of the virus and induces virus-neutralizing antibodies that protect against infection. This research aimed at the purification of the rabies virus glycoprotein containing a polyhistidine tag (GPV) from lisate and supernatant of Drosophila melanogaster Schneider 2 (S2AcGPV2) cells culture, transfected with the vector pAc 5.1/V5-His A containing the GPV gene, using immobilized metal íon affinity chromatography (IMAC). The aspects developed in this project were the agarose gel derivatization with the chelating agent iminodiacetic acid (IDA) and the evaluation of the agarose-IDA-Ni2+ gel seletivity, capacity and reproductibility at the GPV adsorption, regarding different buffer systems and different GPV's desorption strategies (lowering the pH of the buffer or increasing the concentration of a competitive agent in the buffer). The seletivity in each buffer system was determined by performing SDS-PAGE electrophoresis on the chromatographic samples with the larger concentration of proteins, and the GPV quantification in these samples was determined by ELISA assays. The best results of purification were found when lisate was fed into an agarose-IDA-Ni2+ column equilibrated with 20 mM sodium phosphate buffer containing 500 mM sodium chloride and 2 mM imidazole pH 7,0. The washing step was proceeded with 20 mM sodium phosphate buffer containing 500 mM sodium chloride and 2 mM imidazole pH 6,0 and the elution proceeded by raising the imidazole concentration at the wash buffer to 200 e 500 mM. The results demonstrated the potencial of using IMAC to purify rabies virus G glycoprotein
Doutorado
Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos
Mestre em Engenharia Química

Orientador: Jose Merzel
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba
Made available in DSpace on 2018-08-03T22:57:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Duarte_MonicaMachado_M.pdf: 1989817 bytes, checksum: 5a5900a55bbb2d95070f23c019f2fc91 (MD5) Previous issue date: 2004
Resumo: Para analisar se o aumento da quantidade de proteínas não colágenas no ligamento periodontal de incisivos de ratos desimpedidos (hipofuncionais) está relacionado com o aumento da velocidade de erupção que ocorre nestes dentes, utilizamos a [3H]-fucose, precursor específico para glicoproteínas, e, através da radioautografia, observamos sua incorporação nos tecidos periodontais de incisivos de camundongos. Camundongos fêmeas foram divididos em três grupos com 4 animais cada. Em dois grupos o incisivo inferior esquerdo foi cortado à altura da papila gengival,tornando-o hipofuncional enquanto o contralateral direito tornou-se hiperfuncional. No terceiro grupo os incisivos foram mantidos intactos e portanto normofuncionais. A [3H]-fucose foi injetada na veia caudal no seguinte esquema: 1) no primeiro grupo, 1 dia após a instalação da alteração funcional; 2) no 2o grupo 7 dias após a desoclusão do incisivo esquerdo (assim mantida com cortes a cada 48 horas) e 3) no grupo normofuncional no mesmo tempo que no grupo 2. Os camundongos foram perfundidos com fixador de Karnovsky, em grupos de dois, 8 e 96 horas após a injeção do precursor radioativo. As hemimandíbulas foram removidas, descalcificadas, divididas em segmentos transversais e incluídas em araldite. Cortes de 1mm das regiões relacionadas à crista alveolar, primeiro molar e região odontogênica, foram cobertos com emulsão nuclear Ilford K-5 e expostos durante 14 dias. As radiografias foram analisadas quantitativamente utilizando um sistema de análise de imagens, determinando-se a densidade de área de grãos de prata nos tecidos periodontais. O exame microscópico das radioautografias mostrou que todos os tecidos dentais e periodontais do incisivo de camundongo apresentaram incorporação de [3H]-fucose, em graus variados de intensidade. Nos tecidos periodontais houve um aumento da biossíntese de glicoproteínas fucosiladas nos dentes desimpedidos por 7 dias, comparado aos normofuncionais, hiperfuncionais e hipofuncionais de 1 dia, particularmente no periodonto relacionado ao esmalte e no ligamento periodontal relacionado ao osso alveolar. Estes resultados sugerem que o aumento da quantidade de glicoproteínas fucosiladas (entre as quais fibronectina, integrinas, receptor de EGF) nos tecidos periodontais, não está diretamente relacionado a erupção acelerada que se estabelece nos dentes hipofuncionais no 10 dia de desoclusão. Como este aumento foi mais expressivo no tecido conjuntivo perivascular dos tecidos periodontais e ocorreu também na polpa, é possível que parte desta maior quantidade seja devida ao aumento dos receptores de EGF
Abstract: The periodontal ligament of unimpeded rat incisors show an increase in the amount of non-collagens proteins. To analyse if such increase is related to the higher eruption rate shown by those hipofunctional teeth we visualized through radiautography the uptake of 3H-fucose by periodontal tissues. Female mice were divided in three groups of four animals each. In two of these groups the left mandibular incisor was cut at the level of the gingival papila rendering the tooth hipofunctional while the contralateral incisor became hiperfunctional. In the third group the incisors were kept normofunctional. [3H]-fucose was injected throug the caudal vein: 1) in the first group, 1 day after the shortening of the left incisor; 2) in the second group, 7 days after the left incisor became unimpeded (and so maintained by repeating the shortening every 48h); and 3) in the normofunctional group at same time of the second group. Two animals of each group were killed by intracardiac perfusion of Karnovsky¿s fixative at 8 and 96h after injection. The hemimandibules were removed, decalcified, divided in transversal segments and embedded in araldite. 1mm-thick sections of the regions related to the alveolar crest, first lower molar and odontogenic organ were covered with Ilford K-5 nuclear emultion and exposed for 14 days. The area density of silver grains, over periodontal tissues was determined using an image analyzing system. In different degrees of intensity all dental and periodontal tissues were labeled by 3H-fucose. At 8h after the injection the silver grain density was markedly higher in the periodontal ligament related to the alveolar bone and in the enamel related periodontium of incisors kept unimpeded for 7 days as compared with all other groups. These results suggest that the increase of fucosileted glycoproteins (among them fibronectin, integrins and EGF-receptor) in the periodontal tissues of unimpeded incisors is not related to the accelerated rate of the eruption which begins 1 day after their crown is shortened. The uptake of 3H-fucose was conspicuously increased in the perivascular regions of the periodontal tissues and also in the pulp of 7 days hipofunctional incisors, indicating that the higher content of glycoproteins in these tissues may be related to the increase of EGF-receptors
Mestrado
Histologia e Embriologia
Mestre em Biologia Buco-Dental

Made available in DSpace on 2014-08-13T14:50:40Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-02-28Bitstream added on 2014-08-13T18:01:28Z : No. of bitstreams: 1 000747172.pdf: 1681381 bytes, checksum: 9f87febf4316cf995b9569ba52b73b6b (MD5)
A osteopontina (OPN) é uma glicofosfoproteína secretável que tem sido relacionada com diferentes processos fisiológicos e de doença nos seres humanos. Sabe-se que a OPN está relacionada com a progressão neoplásica e metástase em diversos cânceres humanos, porém esta relação ainda é pouco explorada na literatura veterinária. O objetivo do presente estudo foi avaliar a expressão de osteopontina nos carcinomas mamários caninos e sua relação com biomarcadores tumorais bem estabelecidos nessas neoplasias. Para isso, a expressão de OPN, EGFR, HER2 e c-Kit foi avaliada em conjunto com a análise da taxa de Ki67 em 43 carcinomas mamários provenientes de cadelas diferentes. Demonstrou-se que a expressão acentuada de OPN está relacionada com a expressão de EGFR (P < 0.001) e com a superexpressão de HER2 (P = 0.012). Em conclusão, a osteopontina aparenta estar relacionada com prognóstico ruim e ativação da via MAPK, este ultimo fato podendo implicar na futura utilização de tratamentos baseados em drogas direcionadas para esta via de sinalização particular nas neoplasias mamárias de cadelas com expressão acentuada de osteopontina
Osteopontin (OPN) is a secreted glycophosphoprotein that has been implicated in a number of different normal physiologic and pathologic processes in humans. OPN is known to be involved in the progression and metastasis of various humans cancers, but this relation is still little explored in the veterinary literature. The aim of this study was to evaluate the expression of osteopontin in canine mammary carcinomas and its relation with well established canine mammary tumor biomarkers. For that, the expression of OPN, EGFR, HER2, and c-Kit were evaluated along with Ki67 rate in 43 mammary carcinomas from different female dogs. OPN was demonstrated to be expressed by neoplastic epithelial cells in all carcinomas as well as in stromal cells from the tumor microenvironment. Relation between OPN high expression and EGFR positivity (P < 0.001) and high HER2 expression (P = 0.012) was demonstrated. In conclusion, osteopontin seems to be related to poor prognosis and MAPK pathway activation, the latter a feature that could imply in the future use of treatments with drugs directed against this particular signaling pathway in highly OPN expressing canine mammary tumors

Orientador: Noeme Sousa Rocha
Coorientador: Deilson Elgui de Oliveira
Banca: Rafael Malagoli Rocha
Banca: Renée Lufer Amorim
Resumo: A osteopontina (OPN) é uma glicofosfoproteína secretável que tem sido relacionada com diferentes processos fisiológicos e de doença nos seres humanos. Sabe-se que a OPN está relacionada com a progressão neoplásica e metástase em diversos cânceres humanos, porém esta relação ainda é pouco explorada na literatura veterinária. O objetivo do presente estudo foi avaliar a expressão de osteopontina nos carcinomas mamários caninos e sua relação com biomarcadores tumorais bem estabelecidos nessas neoplasias. Para isso, a expressão de OPN, EGFR, HER2 e c-Kit foi avaliada em conjunto com a análise da taxa de Ki67 em 43 carcinomas mamários provenientes de cadelas diferentes. Demonstrou-se que a expressão acentuada de OPN está relacionada com a expressão de EGFR (P < 0.001) e com a superexpressão de HER2 (P = 0.012). Em conclusão, a osteopontina aparenta estar relacionada com prognóstico ruim e ativação da via MAPK, este ultimo fato podendo implicar na futura utilização de tratamentos baseados em drogas direcionadas para esta via de sinalização particular nas neoplasias mamárias de cadelas com expressão acentuada de osteopontina
Abstract: Osteopontin (OPN) is a secreted glycophosphoprotein that has been implicated in a number of different normal physiologic and pathologic processes in humans. OPN is known to be involved in the progression and metastasis of various humans cancers, but this relation is still little explored in the veterinary literature. The aim of this study was to evaluate the expression of osteopontin in canine mammary carcinomas and its relation with well established canine mammary tumor biomarkers. For that, the expression of OPN, EGFR, HER2, and c-Kit were evaluated along with Ki67 rate in 43 mammary carcinomas from different female dogs. OPN was demonstrated to be expressed by neoplastic epithelial cells in all carcinomas as well as in stromal cells from the tumor microenvironment. Relation between OPN high expression and EGFR positivity (P < 0.001) and high HER2 expression (P = 0.012) was demonstrated. In conclusion, osteopontin seems to be related to poor prognosis and MAPK pathway activation, the latter a feature that could imply in the future use of treatments with drugs directed against this particular signaling pathway in highly OPN expressing canine mammary tumors
Mestre

Submitted by Geyciane Santos (geyciane_thamires@hotmail.com) on 2015-07-09T13:57:35Z No. of bitstreams: 1 Tese - Sandra Lúcia Euzébio Ribeiro.pdf: 2096473 bytes, checksum: f91d4ac32c47ec6b75b46a090c06dd46 (MD5)
Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2015-07-09T14:19:30Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese - Sandra Lúcia Euzébio Ribeiro.pdf: 2096473 bytes, checksum: f91d4ac32c47ec6b75b46a090c06dd46 (MD5)
Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2015-07-09T14:22:48Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese - Sandra Lúcia Euzébio Ribeiro.pdf: 2096473 bytes, checksum: f91d4ac32c47ec6b75b46a090c06dd46 (MD5)
Made available in DSpace on 2015-07-09T14:22:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese - Sandra Lúcia Euzébio Ribeiro.pdf: 2096473 bytes, checksum: f91d4ac32c47ec6b75b46a090c06dd46 (MD5) Previous issue date: 2014-09-02
SUFRAMA - Superintendência da Zona Franca de Manaus
Antiphospholipid (aPL) antibodies may be detected during the course of many infections, but are usually transient. In leprosy, however, these antibodies are found to linger for longer periods. The aim of this study was to evaluate the persistence of anticardiolipin (aCL) and anti-β2 glycoprotein I (anti-β2GPI) antibodies in leprosy patients, and disclose epidemiologic, immunologic and clinical features associated with it. Thirty-eight APL antibody positive leprosy patients completed polychemotherapy and were followed for an average of 66,9 months, when a second sample was drawn for a new aPL testing. Enzima -linked immunosorbent assay (ELISA) was used to measure aCL and anti-β2GPI antibodies. Epidemiologic and clinical data were analyzed with logistic regression. Persistence of aPL antibodies was demonstrated in 32 out of 38 leprosy patients thoroughly treated and considered cured, studied after an average of 66,9 months of follow up. All of these sera were IgM isotype. Sixteen of these patients (50%) presented lepromatous clinical form. Reactional state was present in three patients (9,4%). Seventeen (53,1%) were in use of prednisone and/or thalidomide. Observed median values of aPL antibodies were rather high (64U/mL for aCL and 62U/mL for aβ2GP). Occurrence of vascular thrombosis, gestational morbidity, diabetes, tobacco use and alcoholism were not different in positive and negative aPL patients. Logistic regression showed significant association of aPL antibodies persistence and age (p=0,045, OR=0,91 e IC 95% 0,82 - 1,00), lepromatous clinical form (p=0,034; OR=0,02 e IC 95% = 0,0 - 0,76) and bacillary index (p=0,044; OR=2,74 e IC 95% = 1,03 – 7,33). aPL antibodies in leprosy patients do persist many years after treatment. Patients’ age, lepromatous clinical form and bacillary index were factors that influence persistence. No thromboembolic events were registred.
Anticorpos antifosfolipídeos (aFL) podem ser detectados no curso de diversas infecções, mas costumam ser transitórios. Entretanto, na hanseníase tem-se observado que esses autoanticorpos persistem por mais tempo. Os objetivos do presente estudo foram verificar a persistência de anticorpos anticardiolipina (aCL) e anti-β2glicoproteína  (anti-β2GP) em pacientes com hanseníase, e avaliar as características epidemiológicas, clínicas e imunológicas associadas. Trinta e oito pacientes com diagnóstico de hanseníase e positivos para anticorpos aFL completaram o tratamento de poliquimioterapia (PQT) e foram acompanhados por um tempo médio de 66,9 meses, quando coletou-se outra amostra para nova pesquisa da anticorpos aFL. A detecção de anticorpos aCL e anti-β2GP foi feita pela a técnica de ELISA. A análise dos dados epidemiológicos e clínicos foi feita por regressão logística binária multivariada. Persistência de anticorpos aFL foi demonstrada em 32 (84%) dos 38 pacientes com hanseníase, tratados com PQT e em alta do tratamento PQT, seguidos por um tempo médio de 66,9 meses. Todos os soros positivos eram do isotipo IgM, sendo que 16 desses pacientes (50%) apresentavam a forma virchowiana (VV). Episódios reacionais estavam presentes em três pacientes (9,4%). Dezessete (53,1%) continuavam usando medicação (prednisona e/ou talidomida). Os valores médios de IgM foram altos, 64U/mL para aCL e 62U/mL para anti-β2GP. Em relação às variáveis trombose vascular, morbidade gestacional, diabetes, tabagismo e etilismo não foram observadas diferenças significativas entre os pacientes positivos e negativos para aFL. Na regressão logística demonstrou-se significância estatística para as variáveis idade: (p=0,045, OR=0,91 e IC 95% 0,82-1,00), forma clínica VV (p=0,034; OR=0,02 e IC 95% = 0,0-0,76) e índice baciloscópico (p=0,044; OR=2,74 e IC 95% = 1,03 - 7,33). Portanto, anticorpos aFL na hanseníase, diferentemente de outras infecções, persistem anos após o tratamento em pacientes considerados “curados”. Essa persistência foi influenciada pela idade, forma clínica VV e índice baciloscópico. Não houve associação com fenômenos trombóticos.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:22Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-02-26Bitstream added on 2014-06-13T20:16:38Z : No. of bitstreams: 1 goncalves_mcm_me_jabo.pdf: 755871 bytes, checksum: 00a7ca290b99eaeb7742fdd22cdc3c6c (MD5)
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)
A glicoproteína S1 do vírus da broquite infecciosa (VBI) além de ser altamente variável é responsável pela adsorção com os receptores das células hospedeiras e pela indução de anticorpos vírus-neutralizantes e inibidores da hemaglutinação em galinhas. A disponibilidade desse tipo de proteína pode contribuir com o imunodiagnóstico e com a imunoprofilaxia da bronquite infecciosa aviária. O presente estudo foi conduzido com a finalidade de fazer a clonagem e a expressão do gene da glicoproteína S1 derivada da estirpe M41 do VBI no sistema constituído pelo vetor pFLDa – Picchia pastoris. O cDNA completo do gene S1 foi preparado a partir do RNA extraído do líquido alantóide infectado com a estirpe M41 do VBI e o amplicon obtido pela PCR foi clonado no vetor de expressão pFLDa. O plasmídeo foi linearizado e usado na transformação da linhagem GS115 de Picchia pastoris por eletroporação. Foi avaliada a influência da composição do meio de cultura sobre a produção de biomassa e a expressão da proteína recombinante S1 durante a fase de indução. A produção da proteína S1 recombinante foi detectada somente no compartimento intracelular, embora o vetor pFLDa seja capaz de direcionar a síntese de uma proteína heteróloga para a via secretora. A proteína recombinante foi caracterizada imunoquimicamente como uma banda de aproximadamente 90 kDa e com reatividade específica para os anticorpos monoclonais anti-polihistidina. Concluindo, o sistema hospedeiro de células da levedura P. pastoris com o vetor pFLDa usado nesse estudo comprovou ser um método eficaz para a produção no compartimento intracelular da proteína recombinante S1 da estirpe M41 do VBI, com potencial para futura utilização em técnicas de imuno-diagnóstico da bronquite infecciosa aviária.
The glycoprotein (S1) of infectious bronchitis virus (IBV) has been shown to be highly variable and responsible for attachment to the receptor in host cellular membrane, induction of neutralizing and haemagglutination-inhibiting antibodies in chickens. Thus, the availability of such protein can contribute to the immuno-diagnosis and immunoprofilaxis of avian infectious bronchitis. The present study was carried out aiming to clone and to express the gene of S1 glycoprotein from M41 strain fo IBV in the system constituted by pFLDa vector – Picchia pastoris. Full length cDNA of IBV S1 glycoprotein was prepared from RNA extracted from infected allantoic fluid and the amplicon generated by PCR was cloned into yeast expression vector pFLDa to construct the plasmid of pFLDa - S1 - IBV. This plasmid was linearized and then transformed in Picchia pastoris GS115 by electroporation. The recombinant yeast clones were cultivated and selected. The influence of media composition on biomass and in the production of recombinant S1 during induction phase was studied. The production of recombinant S1 protein was detected only in the intra-cellular compartment, though the pFLDa vector would direct the synthesis for the secretor pathway. The recombinant protein was characterized by SDS-PAGE and Western-Blotting as a band of a molecular weight of approximately 90 kDa with specific reactivity against anti-Histidina monoclonal antibodies. The use of complex media promotes an increase in biomass, but no soluble S1 recombinant protein was produced. Concluding, the yeast system composed by pFLDa - P. pastoris was efficient to express intra-cellularly the recombinant S1 protein of M41 strain of IBV which has a potential to be used in the immuno-diagnosis of avian infectious bronchitis.

Orientadores: Fernando Ferreira Costa, Valder Roberval Arruda
Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas
Made available in DSpace on 2018-08-04T04:25:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ozelo_MargarethCastro_D.pdf: 10683645 bytes, checksum: d3f023c228cd390367aaa3992b5e629d (MD5) Previous issue date: 2004
Resumo: As plaquetas estão associadas não só às atividades hemostáticas, como também à resposta inflamatória. O comprometimento funcional das plaquetas está relacionado à ocorrência de patologias hemorrágicas e ao maior risco para desenvolvimento de aterosclerose e doença arterial oclusiva. O primeiro objetivo deste estudo foi estudar as alterações do complexo das glicoproteínas de membrana plaquetária (GP) Ib(a e f3)-IX-V que levam à perda da sua capacidade hemostática, resultando na patologia hemorrágica denominada Síndrome de Bernard-Soulier (SBS). Foram avaliadas as alterações moleculares da GP Iba, que contém os sítios de ligação para fator de von Willebrand (FvW), trombina e integrinas (presentes na região N-terminal globular da GP Iba). Entre os casos com plaquetopenia persistente avaliados no Ambulatório de Hemostasia do Hemocentro da Unicamp, houve a confirmação do diagnóstico de SBS em três pacientes. Em dois destes indivíduos com SBS foi possível identificar duas mutações distintas em homozigose na região N-terminal globular da GP Iba. Uma destas mutações é resultado da troca de T~A, levando à substituição da Cys209 ~ Ser, comprometendo uma das ligações dissulfídicas que ocorrem entre os resíduos Cys209 - Cys248 e Cys211 - Cys268. Esta mesma mutação já havia sido descrita anteriormente por Simsek e cols. (1994). A segunda mutação evidenciou pela primeira vez a ocorrência da troca de T~C, com substituição da Leu115~Pro, na região das repetições ricas em leucina da GP Iba. Em ambos os casos a avaliação por citometria de fluxo mostrou que a GP Iba estava ausente, sugerindo que estes resíduos sejam essenciais para manter a integridade da molécula. o terceiro paciente apesar do diagnóstico clínico e laboratorial de 888, confirmado pela ausência das GP Iba e GP IX pela citometria de fluxo evidenciou exclusivamente uma alteração não descrita no códon iniciador ATG do gene da GP IbB, levando à substituição da -25Met --7 Arg em heterozigose. No entanto, foi observado que outros membros da família, apesar de assintomáticos, eram portadores da mesma alteração. Embora na literatura, a 888 seja relacionada exclusivamente com mutações ocorrendo nos genes da GP Iba, GP IbB e GP IX, é possível que a diferença fenotípica e clínica deste caso possa revelar outros mecanismos reguladores do complexo GP Ib-IX-V possam estar envolvidos na ocorrência da 888. Na outra parte deste estudo, foi estudada a prevalência genotípica de três polimorfismos da GP Iba: seqüência Kozak, HPA-2 e VNTR. A avaliação de 492 indivíduos brasileiros, pertencentes a três grupos étnicos distintos (caucasóides; negróides e indígenas), permitiu a identificação de dez haplótipos distintos, onde: o Kozak-TT/HPA-2aaNNTR-CC foi o mais comum (-40%) entre os caucasóides e negróides e o Kozak- TT/HP A-2aaNNTR-CC e Kozak- TC/HP A-2aaNNTR-CC estiveram presentes na mesma proporção entre os indígenas. Embora anteriormente fosse descrita a presença de uma ligação de desequilíbrio entre os polimorfismos VNTR e HPA-2, neste estudo esta ligação não foi completa em cerca de 10% dos indivíduos de todos os três grupos. Dois indivíduos não relacionados apresentaram uma variante rara, o alelo VNTR - E, onde há perda da seqüência de 39 pb, o que foi confirmado pelo seqüenciamento da região. O estudo funcional das plaquetas destes indivíduos e seus familiares, não evidenciaram diferença em relação às demais variantes do VNTR. alelo VNTR-A com quatro cópias da repetição de 39 pb, presente em populações asiáticas, não foi encontrado em nenhum dos cerca de 1.000 indivíduos aqui estudados. No entanto, entre duas espécies de primatas não humanos (chimpanzé e gorila), ambos apresentaram oalelo VNTR-A em homozigose (Kozak-TT/HPA- 2aaIVNTR-AA). Foi possível desta maneira sugerir um novo mecanismo evolutivo para o surgimento das variantes do gene da GP Iba, onde diferentemente do proposto anteriormente, acreditamos que a variante com maior número de cópias tenha precedido as demais, e com a perda sucessiva destas cópias, as variantes menores foram surgindo. Finalmente em um estudo caso-controle investigou-se o risco para ocorrência de infarto agudo do miocárdio (IAM) relacionado aos três polimorfismos da GP Iba. Foram avaliados 350 indivíduos com antecedente de IAM, divididos em grupo 1, que foram incluídos no momento do primeiro IAM e grupo 2, que sobreviveram a um ou mais episódio de IAM há mais de seis meses. Estes pacientes foram pareados por sexo, idade e raça a 350 controles. O genótipo VNTR-CD, assim como o alelo D, foi mais freqüente entre os pacientes com IAM que entre os controles. Embora esses resultados sejam diferentes do descrito na literatura. A análise da gravidade da doença coronariana oclusiva, baseada no número de vasos com obstrução de pelo menos 50% do lúmen, mostrou um aumento significativo da prevalência do alelo D entre os indivíduos com doença mais grave. Os resultados deste trabalho corroboram com estudos anteriores sobre a influência dos polimorfismos do gene da GP Iba e a função plaquetária
Abstract: Platelets are associated not only with haemostatic activity, but also with inflammatory response. Functional alterations of platelets are related with bleeding diseases and with a greater risk for developing atheriosclerosis and occlusive artery disease. In this study we analyzed the molecular alterations in the platelet membrane glycoprotein (GP) Iba, the subunit of the complex GP Ib(a and ~)-IX-V. The GP Iba contains binding sites for von Willebrand factor (vWF), thrombin and actin-binding proteins. First of ali, we studied the mutations in the complex GP Ib-IX-V related with the 1055of haemostatic function, resulting in a bleeding disease denominated Bernard-Soulier syndrome (BSS). We identified two distinct mutations in homozygous affecting the Nterminal globular region (where the vWF and thrombin biding sites are located) in two unrelated subjects with BSS. One of these mutations, was first describe by Simsek et aI., 1994, where a homozygous single base pair mutation T-7A, resulted in a substitution of a Cys209 -7 Ser, which involving one of the two disulfide loops from the C-terminal flanking sequence between Cys209 - Cys248 and Cys211 - Cys268. The second subject with BSS presented for the first time, the occurrence of a single base pair exchange T-7C, leading to a single amino acid substitution of the Leu115-7Pro, in the region of the leucine-rich repeats of the GP Iba. In both cases a 1055of GP Iba expression was observed, suggesting that these residues, are essential in maintaining the integrity of the molecule. The third case of BSS, presents serious hemorrhagic symptoms and an intense reduce in the platelet number, in addition to a lack of expression of GP Iba and GP IX. Although none of the other family members presented a bleeding history, the mother of the patient, a maternal uncle and her maternal grandfather, presented a mild macrothrombocytopenia. The sequence of the involved genes (GP Iba, GP Ib(3e GP IX), revealed a non described alteration with the exchange of T~G in initial start ATG codon of the GP Ib(3gene exclusively, leading to the substitution of the -25Met ~ Arg in heterozygosity as in the patient and between the affected members of the family. Thus, it may be that the BSS phenotype in this patient involves other proteins or gene regulators related to the complex GP Ib-IX-V. There are no other genes described involving BSS development , except the first three described, GP Iba, GP Ib(3e GP IX. In the other part of this study, we determined the prevalence of the distinct genetic variants of the GP Iba, resulting from three polymorphisms: Kozak sequence, HPA-2 and VNTR. First, 492 subjects from three distinct Brazilian ethnic groups were evaluated, including: Caucasians; African descents, and Indigenous. The presence of 10 distinct haplotypes were determined. The most common (-40%) haplotype was the Kozak-TT/HPA-2aaNNTR-CC for both Caucasian and African descents. However, among Indigenous, Kozak-TT/HPA-2aaNNTR-CC and Kozak-TC/HPA-2aaNNTR-CC were equal/y present. Although a strong linkage disequilibrium between VNTR and HPA-2 polymorphism had been observed at first, here we determined incomplete linkage disequilibrium in 10% of the subjects from ali ethnic groups. Two unrelated subjects presented the allele VNTR - E, arare variant lacking the 39bp repeat, and functional platelet studies among these subjects and their family members revealed no abnormalities. No VNTR-A allele, the largest variant containing 4 copies of the repeats, was identified among approximately 1,000 subjects studied in this population. However, homozygosity for the VNTR-A allele (Kozak-TT/HPA-2aaNNTRAA) was determined in two distinct species of non-human primates (chimpanzee and gorilla). These results suggest a greater complex evolutionary mechanism in the macroglycoprotein region of the GP Iba gene, different from that previously proposed, an hypothesis is that the largest variant, VNTR-A should be considered the oldest allele and that subsequent deletions resulted in the smaller forms. We also carried out a case-control study correlating the three polymorphisms of the GP Iba and the risk for myocardial infarction (MI) occurrence. 350 subjects who had suffered a previously episode of MI, were divided into: group 1, having suffered the first MI at the moment of inclusion and group 2, who had survived to one or more episodes of MI, in which the last episode had occurred at least six months before enrollment. These patients were matched by sex, age and race to 350 controls. Genotype VNTRCD, as well as allele D were more frequent among the patients with MI than among controls. Although this differed from that previously described, it was possible to observe that when the severity of coronary artery disease among these patients was analyzed, assigned by the number of affected vessels by coronary angiography, the allele O was also associated with more extensive disease. Also, it is in accordance to functional data related to the polymorphisms of GP Iba gene previously described
Doutorado
Clinica Medica
Doutor em Clínica Médica

Orientadora: Mirela Tinucci Costa
Banca: Suely Nunes Esteves Beloni
Banca: José Jurandir Fagliari
Resumo: A erliquiose canina é uma doença de alta incidência na região nordeste do Estado de São Paulo, sendo responsável pela morte de muitos cães. O diagnóstico precoce favorece a pronta instituição do tratamento e melhora o prognóstico do animal. Estudos têm apontado que a determinação da concentração de proteínas de fase aguda (PFA) pode contribuir para detecção precoce de doenças e auxiliar na predição do prognóstico. O presente estudo objetivou avaliar o perfil de proteínas de fase aguda (PFA) em cães experimentalmente infectados com Ehrlichia canis, amostra Jaboticabal, no início da infecção e após o tratamento. Para tanto, foram utilizados 10 cães sem contato prévio com hemoparasitas. Deste, cinco foram infectados e cinco serviram de controle da infecção. Hemogramas, nested PCR, detecção de anticorpos anti-E. canis e eletroforetograma de proteínas séricas foram realizados em períodos pré-determinados. Os resultados mostraram que a proteína-C reativa, ceruplasmina e a α1-glicoproteína ácida tiveram suas concentrações aumentadas antes do aparecimento dos sinais clínicos e das alterações de hemograma nos cães infectados. Os sinais clínicos da doença tornaram-se evidentes por volta do 17º dia de infecção. Trombocitopenia foi registrada a partir do 3º dia de infecção. Mórulas intracitoplasmáticas foram detectadas a partir do 15º dia. Títulos sorológicos anti-E. canis, variando de 1:2560 a 1:5120, e nPCR positiva foram evidenciados no 18º dia. Nas avaliações após o tratamento os cães infectados estavam assintomáticos, com nPCR negativo e acentuada redução dos títulos de anticorpos específicos em quatro dos cinco cães. Todas as PFA estudadas reduziram suas concentrações a títulos próximos aos iniciais. Este estudo mostrou que as mensurações das PFA contribuem para o diagnóstico precoce e predição de cura... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo)
Abstract: Canine ehrlichiosis is an endemic disease, with high incidence in the Northwest area of Sao Paulo State - Brazil and it is responsible for the death of numerous dogs. The rapid and accurate diagnosis helps the prompt establishment of treatment and improves the prognosis of the animal. Evidence has shown that the measurement of acute phase proteins (APP) can contribute for the early detection of the disease and help to predict its prognosis. This study evaluated the profile of APP in dogs experimentally infected with Ehrlichia canis, Jaboticabal - SP - Brazil sample, at the onset of the infection and after its treatment. Ten dogs, with no previous hemoparasitosis, were randomly assigned in either the infected group (5 animals), which received the bacteria, or the control group (5 animals). In pre-determined intervals, their blood was colected and hemogram, nested PCR, anti-E. canis antibodies detection and tritation and eletrophoresis of serum proteins were performed. We showed that, in infected dogs, the concentration of C-reactive protein, ceruplasmin and α-1 acid glycoprotein were increased previous to the clinical signs forthcoming and hemogram alterations. The clinical signs were evident around the 17th day of infection. Thrombocytopenia was found on the 3th day of infection. Intra-cytosolic morules were detected on the 15th day of infection. Sorologic tritation of anti-E. canis, ranging from 1:2560 to 1:5120, and positive nPCR were found on the 18th day of infection. In the post-treatment evaluation, the infected dogs were asymptomatic with negative nPCR and decreased tritation of specific antibodies in four out of five dogs. All APP analyzed were similar to basal levels. This study showed that the measurement of APP can, indeed, contribute for the early diagnosis and prediction of cure, after treatment, of the experimental acute phase of canine Ehrlichiosis.
Mestre

O cloridrato de tramadol é um analgésico de ação central, análogo sintético da codeína e morfina, o qual vem sendo amplamente estudado em equinos, sendo avaliado sua farmacocinética e farmacodinâmica. Em humanos, há relato de que o tramadol é substrato para a Gp-P, o que pode ser fator limitante na absorção do tramadol. A Gp-P funciona como uma bomba de efluxo celular, de maneira que, transporta ativamente xenobióticos do meio intracelular para o extracelular, atuando como um mecanismo de proteção contra xenobióticos. O estudo teve como objetivo a detecção do Gene MDR1 a partir do cDNA, e avaliar as alterações fisiológicas e efeito analgésico do tramadol em equinos submetidos a inibição da Gp-P entérica pela ivermectina. Seis equinos, machos e fêmeas, pesando 448±68Kg, foram distribuídos em três grupos autocontrole, recebendo tramadol por sonda nasogástrica na dose 1 mg/kg (GT1), 4 mg/kg (GT4) e recebendo tramadol 1mg/kg associada a ivermectina 0,2mg/kg VO. Foram avaliados FC, f, motilidade intestinal, temperatura corpórea aos 30 min antes, imediatamente antes da administração de qualquer substância para determinação dos valores basais e aos 30min, 60 min, 90 min, 120 min e a cada 60 min até 360 min após o tratamento. A claudicação foi avaliada aos 30 min, 60 min e a cada 60 min até os 360 min. Os parâmetros hemogasométricos foram avaliados no momento 0, 60 min e 120 min. Para as variáveis paramétricas utilizou-se análise de variância (ANOVA) para amostras pareadas, com posterior teste de Dunnett. Para comparações entre os grupos, realizou-se análise de variância, seguido de teste de Tukey. Para a variável não-paramétrica, motilidade intestinal, utilizou-se teste de Wilcoxon para amostras pareadas. As diferenças foram consideradas significantes quando P<0,05. Não foram observadas diferenças na FC e na avaliação analgésica. Houve hipomotilidade no GT1 e GT4 apenas ao final das avaliações e aumento da f em todos os grupos. Houve aumento do HCO3+ e redução do K+ e Ca++. Conclui-se que a inibição da Gp-P entérica pela ivermectina não alterou os efeitos do tramadol nas doses estudadas, sugerindo que o mesmo não é substrato para Gp-P, mas estudos futuros devem ser realizados a fim de avaliar a interação da ivermectina como inibidor da Gp-P na farmacocinética do tramadol.
Tramadol hydrochloride is a centrally acting analgesic, synthetic analogue of codeine and morphine, which has been widely studied in horses, being evaluated its pharmacokinetics and pharmacodynamics. In humans, there is a report that tramadol is a substrate for P-gp, which can be a limiting factor in the absorption of tramadol. P-gp acts as an efflux pump cell, that actively transports xenobiotics from the intracellular to the extracellular environment, acting as a protective mechanism against xenobiotic. The study aimed the detection of MDR1 Gene from cDNA, and the evaluation of physiological parameters and analgesic effect of tramadol in horses submitted to inhibition of enteric P-gp by ivermectin. Six horses, control of themselves, male and female, weighing 448 ± 68kg, were distributed into three groups, receiving tramadol by nasogastric tube in dose of 1 mg/kg (GT1), 4 mg/kg (GT4) and tramadol 1 mg/kg associated with ivermectin 0.2 mg/kg orally. Were evaluated HR, RR, intestinal motility, body temperature 30 min before, and immediately before the administration of any substance for determination of baseline and posterior at 30 min, 60 min, 90 min, 120 min and every 60 min up to 360 min after treatment. The analgesic evaluation occurred at 30 min, 60 min and every 60 min to 360 min. Blood gas parameters were evaluated at 0, 60 min and 120 min. For parametric variables were used analysis of variance (ANOVA) for paired samples, followed by Dunnett's test. For comparisons between groups, ANOVA followed by Tukey test were used. The non-parametric variable, intestinal motility, we used the Wilcoxon test for paired samples. Differences were considered significant when P <0.05. Differences in HR and analgesic evaluation were not observed. Hypomotility occurs in GT1 and GT4 only at the end of evaluation and RR increased in all groups. There was an increase of HCO3- and reduction of K+ and Ca++. We conclude that inhibition of enteric P-gp by ivermectin did not alter the effects of tramadol in the studied doses, suggesting that tramadol it is not a substrate for P-gp, but future studies should be conducted to assess the interaction of ivermectin as inhibitor of P-gp on the pharmacokinetics of tramadol.