Dissertations / Theses on the topic 'Glicogeno'

Hoje a criação de avestruz ((Struthio camelus, Linnaeus 1758)) é uma atividade de grande potencial, porém não existem padrões definidos sobre a histologia do seu fígado, que é um órgão de grande importância no metabolismo, o conhecimento de sua histologia e anatomia pode contribuir para a detecção de doenças e deficiências nutricionais que influenciam no crescimento e desenvolvimento do animal. Os objetivos desta pesquisa são: Estudar a anatomia e histologia do fígado e a ramificação de sua artéria hepática, veia porta hepática e ducto biliar. Para a realização da parte macroscópica foram utilizados quinze avestruzes com idades entre 12 e 18 meses (com peso médio em torno de 80 a 100 kg), provenientes do abatedouro Don Pig, situado próximo à cidade de Botucatu no estado de São Paulo. Os animais foram abatidos com pistola pneumática e posteriormente submetidos a sangria. Foram injetadas com látex a artéria hepática, o ducto biliar e a veia porta. O fígado dos avestruzes apresentam dois lobos (direito e esquerdo). No caso o direito é maior que o esquerdo e ambos são subdivididos em dorsal, intermédio e ventral. Além disso, amostras do fígado foram processadas para a observação em microscopia de luz e microscopia eletrônica de transmissão (MET). A hematoxilina e eosina (H.E), picrossírius, Gordon e Sweets, Sudan black e o ácido peródico de Schiff (PAS) são colorações usadas respectivamente para observar a morfologia do fígado, colágeno, fibras reticulares, gordura e glicogênio. Foram encontrados os espaços porta- hepáticos (artéria hepática, veia porta e ducto biliar e as veias centrolobulares). O glicogênio presente mostrou a média de 5,68%. O conteúdo lipídico, conferiu um aspecto goticular compatível com um quadro de esteatose hepática e a média obtida foi de 9,83%. Foi encontrado colágeno ao redor dos espaços porta-hepáticos, artérias centrolobulares e capilares sinusóides e a média foi de 14,71%. Encontrou-se também fibras reticulares ao redor dos capilares sinusóides e a média foi de 5,96%. Quanto à MET notou-se que no citoplasma dos hepatócitos desses animais existem numerosas mitocôndrias, glicogênio, muitas gotas de gordura, alguns lisossomos, retículo endoplasmático granular ao redor das mitocôndrias, algumas células estreladas, eritrócitos, núcleo, célula em degeneração e o canalículo biliar ao centro. Provavelmente o quadro sugestivo de esteatose é resultante do estado nutricional dos animais, já que nenhum outro aspecto relevante foi encontrado. Como estas aves são destinadas ao abate, sua alimentação é formulada para que os animais apresentem rápido desenvolvimento e alto ganho de peso, provavelmente com níveis de lipídios acima do necessário, causando uma deposição de micelas de gordura nos hepatócitos. Estes resultados demontraram que os hepatócitos dos avestruzes são muito simulares as outras aves apesar de também serem muito similares na estrutura das células do fígado de mamíferos.
At present the ostrich (Struthio camelus) breeding has been showing a great economical potential, although yet there are not distinct patterns about the histology of its liver, which is an organ of key importance in terms of metabolism. The knowledge of its histology and anatomy can help the detection of diseases and nutritional deficiencies that affect the growth and development of this bird. The aims of this work are to study the liver anatomical and histological structure and the branching of the hepatic artery, hepatic portal vein and bile duct. In the macroscopic study 15 ostriches with an average age of 12-18 months and average weight of 80-100 Kg, proceeding from Don Pig Abatteur, located next to Botucatu, São Paulo, were used. The birds were slaughtered with air gun and subsequently submitted to bleeding. The hepatic artery, the bile duct and the hepatic portal vein were injected with latex. The ostrich liver presents two lobules (right and left), being the right one larger than the left and both are subdivided into dorsal, intermediate and ventral. Liver samples were processed for light and electron transmission microscopic studies. Hematoxilin and eosin (HE), picrosirius, Gordon and Sweets, Sudan black and Schiff periodic acid (PAS) were respectively used to observe the liver morphology, collagen, reticular fibers, lipids and glycogen. The liver portal spaces were determined (hepatic artery, portal vein, bile duct and centrolobular veins). An average of 5.68% of glycogen was observed. The lipidic content provided a droplet aspect compatible to hepatic esteatosis, with an average of 9.83%. Collagen fibers around the liver portal spaces, centrolobular arteries and sinusoidal cappilaries were detected, at an average of 14.71%, as well as reticular fibers located in the vicinity of sinusoidal capillaries with an average of 5.96%. Through transmission electron microscopy we noticed in the hepaticyte cytoplasm the presence of numerous mithocondria, glycogen, several lipidic droplets, some lysosomes, granular endoplasmatic reticulum around the mithocondria, some stellate cells, erythrocytes, nucleus and degenerating cells, besides the central biliary canaliculus. The suggestive steatotic results might result from the animals nutritional status, once no other relevant aspect was detected. The birds are slaughtered for food comsumption and their ration is balanced striving for faster growth and higher weight gains, which are achieved through extra lipidic levels, motivating deposition of lipidic micelles in the hepatocytes. Our results demonstrated that ostrich and other birds hepatocytes are very similar.

O Rhipicephalus microplus é um parasita obrigatório hematófago, monoxeno, que gera grande impacto econômico a partir da ação espoliativa sobre o seu hospedeiro preferencial. A glicogênio sintase quinase 3 (GSK-3), uma proteína altamente conservada e ubiquamente expressa entre diversas espécies, foi identificada no carrapato bovino sob a isoforma GSK-3β. Envolvida na modulação da atividade da proteína glicogênio sintase, como um agente regulador da síntese de glicogênio, essa proteína atua no metabolismo energético do R. microplus. A GSK-3 também está envolvida na via de sinalização Wnt, e por isso, já foi descrita como uma quinase essencial para a formação do embrião, estando diretamente envolvida no processo reprodutivo deste carrapato. Neste contexto, a GSK-3β é uma candidata para o desenvolvimento de novas alternativas de controle do carrapato bovino. Dessa forma, o objetivo desse trabalho foi estudar a participação da proteína GSK-3β na fisiologia do R. microplus a partir da inibição de sua atividade. Ensaios in vitro e in vivo foram realizados para testar a inibição química e imunológica da atividade dessa proteína. Anticorpos contra peptídeos sintéticos baseados na sequência da GSK-3β (anti- SRm0218 e anti-SRm86100) usados neste trabalho não foram capazes de inibir a atividade dessa proteína, no entanto, a inibição da GSK-3β foi alcançada quando células embrionárias de R. microplus foram submetidas à inibição química, por meio de um inibidor específico. Este resultado sustenta o potencial dessa proteína como alvo para o desenvolvimento de uma alternativa de controle do carrapato bovino, pois a sua inibição possivelmente atuaria negativamente na capacidade reprodutiva do carrapato R. microplus.
Rhipicephalus microplus is a monogenetic, hematophagous ectoparasite that has a large economic impact due to associated losses in the cattle industry. Glycogen synthase kinase 3 (GSK-3) is a highly conserved and ubiquitously expressed protein in several species. It has been identified as GSK-3β isoform in the cattle tick, and is involved in the modulation of glycogen synthase activity, as a regulator of glycogen synthesis with a role in energy metabolism of R. microplus. GSK-3β is also involved in the Wnt signaling pathway. It is a fundamental kinase for embryo development, and is directly linked with R. microplus reproductive process. Thus, the aim of this study was to investigate the role of GSK-3β in R. microplus physiology by inhibiting its activity. In vitro and in vivo assays were carried out to test its immunological and chemical inhibition. Rabbit antibodies against synthetic peptides based on GSK-3β sequence (anti-SRm0218 and anti-SRm86100) used in this work were not capable to inhibit GSK- 3β activity, but GSK-3β inhibition was reached when R. microplus embryo cells were cultivated with a specific inhibitor. This result supports the potential of this protein as a target to develop a new cattle tick control method, because its inhibition probably acts detrimentally in the reproductive capacity of the tick.

La glicogen sintasa (GS) és un enzim cabdal en el metabolisme de carbohidrats, catalitzant l’addició d’un residu glicosil a l’extrem no reductor d’una cadena de glicogen preexistent. Les GSs eucariotes són enzims altament regulats, tant per al•losterisme com per fosforilació. Gràcies a diferents estructures de GSs resoltes en els darrers anys ja es té una idea aproximada el mecanisme enzimàtic de la reacció, així com els llocs d’unió de la molècula donadora del grup glicosil UDP-glucosa. Tot i que experimentalment es coneix la gran afinitat entre la GS i el glicogen, l’acceptor en la reacció catalítica, se sap poc de la interacció d’ambdós. En el nostre laboratori es va identificar un lloc d’unió a carbohidrats a la superfície de la GS de l’arqueó Pyrococcus abyssi (PaGS) gràcies a la resolució de l’estructura cristal•logràfica d’aquest enzim unit a una molècula de maltohexaosa. En aquesta tesi es demostra que aquest lloc d’unió a carbohidrats de PaGS es tracta d’un lloc d’unió a glicogen funcional ja que, quan el modifiquem per mutagènesi, l’enzim perd la seva capacitat d’unió al glicogen. Aquesta pèrdua d’afinitat té un impacte directe sobre l’eficiència catalítica de PaGS a l’hora d’utilitzar glicogen com a substrat. Per alineament de seqüències deduïm una possible conservació d’aquest lloc d’unió en la glicogen sintasa muscular humana (HMGS). La mutació d’aquest domini de la HMGS resulta en una disminució de l’afinitat per glicogen de l’enzim, un canvi en la seva localització subcel•lular i un clar impacte en la capacitat de l’enzim per acumular glicogen in vivo. D’aquesta manera identifiquem fins a cinc residus aminoacídics, tots allunyats del centre actiu, la mutació dels quals disminueix l’afinitat de l’enzim pel glicogen i que formarien, per tant, part d’un nou lloc d’unió a glicogen no catalític en la HMGS, que es mostra com un element regulador crític responsable de l’eficiència catalítica de l’enzim in vivo. Una vegada establerta la importància del domini d’unió a glicogen en HMGS, mesurem l’afinitat de la isoforma hepàtica de la glicogen sintasa humana (HLGS) pel glicogen. Tot i que ambdues isoformes de la GS humana tenen una alta identitat en la seva seqüència d’aminoàcids, els resultats mostren que HLGS té una menor afinitat pel glicogen. No hem pogut identificar els residus responsables d’aquest canvi d’afinitat. Al nostre laboratori es va descriure per primera vegada com la HMGS transloca al nucli cel•lular quan exhaureix els seus reservoris de glicogen. Els mutants de HMGS que no s’uneixen al glicogen també transloquen al nucli cel•lular, confirmant el glicogen com a únic factor de retenció citoplasmàtic de HMGS. Finalment, en aquesta tesi també s’intenta deduir si la localització nuclear de HMGS té algun paper biològic. Hem aconseguit identificar tres proteïnes que col•localitzen al nucli cel•lular amb HMGS, i que tenen en comú la seva capacitat d’unió a ARN. Hem observat com la incubació amb l’inhibidor de la transcripción actinomicina D de cèl•lules amb HMGS nuclear fa que l’enzim transloqui a la perifèria nucleolar, comportament descrit per moltes altres proteïnes que uneixen ARN. Finalment, un assaig in vitro d’unió entre HMGS i ARN apunta a la possible interacció entre ambdós. Totes aquestes evidències recolzen una possible funció nuclear per a la HMGS.
Thesis title: “Determinants of glycogen binding and translocation of glycogen synthase”. Author: Carlos Martínez Pons. ABSTRACT Glycogen is a glucose polymer synthesized by the cell to store large amounts of glucose and is subsequently mobilized when energy demand increases. The importance of glycogen is reflected in its conservation among archaea, bacteria and eukarya. The glycogen granule is considered as a finely regulated organelle, with most of its proteins locating at the granule thanks to a direct interaction with glycogen through a carbohydrate-binding site. But it still remains unclear if these sites have other implications on protein regulation and catalytic performance. In this thesis we structurally identify a functional non-catalytic glycogenbinding site on a key enzyme of glycogen metabolism. When we mutate this carbohydrate-binding site we observe an alteration of the subcellular distribution of the enzyme and, moreover, a dramatic decrease of its catalytic performance, showing that the glycogen-binding site is not only used to remain bound at the glycogen granule, but that it is necessary for the proper functioning of the enzyme.

Il glucosio in eccesso viene immagazzinato come glicogeno nel muscolo scheletrico e nel fegato come substrato energetico facilmente disponibile attraverso la via glicolitica. Il malfunzionamento degli enzimi glicolitici provoca disturbi da accumulo di glicogeno come la malattia di Pompe (PD) o glicogenosi di tipo II. PD è una malattia metabolica autosomica recessiva con un'incidenza stimata di 1 su 40000 nati vivi. La malattia di Pompe è causata da difetti a carico dell'enzima lisosomiale acid α-glucosidasi (GAA) o maltasi acida, necessario per la degradazione del glicogeno. Lo spettro di gravità della malattia comprende diversi fenotipi clinici. Essi vanno dalla forma "classica" più grave, caratterizzata da insorgenza durante la prima infanzia, cardiomiopatia grave, decorso progressivo rapido ed esito fatale prima dei due anni, fino ad una forma infantile "intermedia" esprimendo un fenotipo più mite e forme giovanili e adulte caratterizzate dal coinvolgimento prevalente del muscolo scheletrico. La quasi totale carenza dell'enzima GAA causa la forma infantile grave della malattia, mentre la carenza parziale è responsabile delle forme intermedie e lievi. La terapia sostitutiva enzimatica (ERT), in cui l’enzima GAA viene fornito tramite infusione endovenosa è l'unica terapia disponibile dal 2006. Nonostante l'ERT abbia rappresentato una pietra miliare nel trattamento dei pazienti con malattia di Pompe, e abbia dimostrato di essere efficace nella forma infantile grave, non tutti i casi ad esordio tardivo rispondono ugualmente bene a questo trattamento. Pertanto, la correzione del fenotipo muscolare nei casi ad esordio tardivo è ancora ostica, mettendo in luce la necessità di trovare terapie più efficaci. Le difficoltà nel ripristino della funzione muscolare da parte della GAA esogena sono state attribuite ad una concomitante alterazione dell’autofagia. Il processo autofagico è un meccanismo molecolare chiave nel mantenimento dell’omeostasi cellulare, e assicura il corretto turnover delle macromolecole nella cellula. Tuttavia, non è chiaro quali siano le modificazioni dell'autofagia nella malattia di Pompe, poiché non è ancora noto se sia presente un'accelerazione o una riduzione eccessiva di questo processo. In particolare, la recente scoperta di un processo autofagico difettoso nella malattia di Pompe, ha stimolato sia una rivalutazione dei meccanismi patogeni della patologia, sia lo studio di nuovi approcci terapeutici, compresa la ricerca di terapie alternative mirate sia all'accumulo di glicogeno che all'autofagia. Tra le numerose molecole interessanti per il loro effetto di interferire con l'accumulo di glicogeno, abbiamo selezionato l'Acido-3-Bromopiruvico (3-BrPA), un inibitore dell'esochinasi (HK), il quale riveste un ruolo molto importante, essendo un enzima glicolitico. Studi in vitro e in vivo hanno riportato che il 3-BrPA è un efficace farmaco antitumorale, in particolare in quei tipi di tumori in cui le cellule, per crescere e proliferare, dipendono preferibilmente dalla glicolisi per produrre adenosina trifosfato (ATP). La proprietà anticancro di questo particolare composto è dovuta alla sua capacità di inibire la glicolisi. Essa abolisce la produzione di ATP da parte della cellula, impedendo di conseguenza la trasformazione da parte dell’HK del glucosio in glucosio-6-fosfato, e innescando successivamente la modulazione del processo autofagico. Tra le 4 diverse isoforme di esochinasi presenti nei mammiferi (HKI, HKII, HKIII e HKIV), si è visto che l’isoforma HKII è espressa a livello relativamente alto solo nel muscolo scheletrico, nel tessuto adiposo e nel cuore. Lo scopo di questo progetto è quello di testare l’azione del 3-BrPA, valutandone gli effetti sia sul sistema muscolare sia a livello subcellulare, e per fare questo, è stato generato un modello malattia in zebrafish.
Excess glucose is stored as glycogen in skeletal muscle and liver as an energy substrate readily available through the glycolytic pathway. Perturbation of glycolytic enzymes results in glycogen storage disorders such as Pompe disease (PD) or glycogenosis type II. PD is an autosomal recessive metabolic disease with an estimated incidence of 1:40000 live births. PD is due to a defect of the lysosomal enzyme acid α-glucosidase (GAA), or acid maltase, necessary for glycogen degradation. The spectrum of disease severity encompasses a broad continuum of clinical phenotypes ranging from the most severe “classic” form, characterized by early childhood onset, severe cardiomyopathy, rapidly progressive course and fatal outcome before two years of age, to an “intermediate” infantile form expressing a milder phenotype, and to juvenile and adult forms characterized by prevalent involvement of skeletal muscle. The almost total deficiency of the GAA enzyme results in the severe infantile form, while partial deficiency is responsible for the intermediate and mild forms. Enzyme replacement therapy (ERT), where GAA is provided via intravenous infusion is the only therapy available since 2006. While ERT represented a major milestone in the treatment of patients with Pompe disease and it has been shown to be efficacious in infantile severe PD, not all late onset cases respond equally well to this treatment. Therefore, the correction of the skeletal muscle phenotype in late onset cases is still challenging, revealing a need for more effective therapies. GAA difficulties in restoring muscle function have been ascribed to a concomitant altered autophagy, a key molecular mechanism that maintains cellular homeostasis and ensures correct macromolecule turnover in the cell. However, it remains unclear how autophagy is disrupted in PD, since it is yet unknown if an excessive acceleration or reduction of this process is present. Notably, this recent defective autophagy finding in PD has stimulated both a reassessment of the pathogenic mechanisms as well as the investigation of new therapeutic approaches, including search for adjunctive and alternative therapies addressing both glycogen accumulation and autophagy. Among the small molecules to be explored for interfering with glycogen accumulation we have selected the Acid-3-Bromopyruvic (3-BrPA), an inhibitor of hexokinase (HK), which is a key glycolytic enzyme. In vitro and in vivo studies have reported this molecule to be an efficacious anti-tumor drug, in those tumor phenotypes in which cancer cells preferentially depend on glycolysis to produce adenosine triphosphate (ATP) for growth and proliferation. The anti-cancer property of this particular compound is due to its ability to inhibit glycolysis, by abolishing cell ATP production and consequently impeding the transformation by hexokinase of glucose into glucose-6- phosphate, and to trigger modulation of the autophagic process. Among the different hexokinase isoforms HKI, HKII, HKIII, and HKIV found in mammals, HKII is expressed at relatively high level only in skeletal muscle, adipose tissue, and heart. The aim of this project was to use this molecule, as an inhibitor of the key glycolytic enzyme hexokinase-II, to modulate glycogen incorporation into cells. We used zebrafish as in vivo model, in order to evaluate the effect of this specific molecule on the muscular system at subcellular detail. The demonstration of its role as HKII inhibitor and as an autophagy modulator, has created the basis for developing a new strategy to improve muscle function in PD patients.

A doença de armazenamento do glicogênio tipo I (GSDI) é uma doença genética autossômica recessiva caracterizada por hipoglicemia, hiperlactatemia, hiperlipidemia e hiperuricemia. Na GSDIa, ocorre a deficiência da glicose-6-fosfatase (G6Pase) e na GSDIb a deficiência de uma translocase G6P-especifica (G6PT). Ambas apresentam manifestações clínicas semelhantes, porém na GSDIb há alterações dos neutrófilos e o aparecimento de doença inflamatória intestinal. O tratamento é essencialmente dietético, sendo preconizado o uso de amido de milho cru a cada 4 horas. Em lactentes, é utilizada dieta contínua noturna por sonda nasogástrica. Além disso, os pacientes devem fazer a exclusão de lactose, sacarose e frutose da dieta. Na ausência de tratamento, os pacientes apresentam baixa estatura, adenomas hepáticos, hiperfiltração glomerular e risco de morte por hipoglicemia grave. Suplementação vitamínica e de minerais, uso de inibidores da enzima conversora da angiotensia (IECA), alopurinol e citrato de potássio são utilizados de forma individualizada, dependendo das manifestações clínicas apresentadas. Objetivos: Caracterizar os aspectos clínicos, laboratoriais e antropométricos de uma amostra de pacientes brasileiros com GSDI, acompanhados em um serviço de referência para Erros Inatos do Metabolismo. Métodos: Estudo de série de casos de base ambulatorial, com amostragem por conveniência. Foram avaliados dados sobre o método de diagnóstico empregado: clínico, anatomopatológico, dosagem de glicose-6-fosfatase hepática e/ou análise molecular. Além disso, foram coletados dados atuais sobre o tratamento, realizada avaliação antropométrica e avaliados exames laboratoriais e de imagem recentes. Resultados: Vinte e um pacientes foram incluídos; destes, 17 tinham GSDIa e 4 GSDIb, com uma mediana de idade de 10 anos (variou 1-25 anos). Todos os pacientes estavam fazendo tratamento com amido de milho cru com intervalos regulares. A mediana de idade do diagnóstico foi de sete meses ( variou de 1-132 meses), sendo que 19/21 realizaram biópsia hepática para confirmação diagnóstica. Na avaliação antropométrica, o excesso de peso estava presente na maioria dos pacientes (16/21). A baixa estatura foi observada em 4/21 pacientes. Houve correlação entre os escores Z de estatura e de IMC apresentados pelos pacientes (r=0,561; p=0,008). Hepatomegalia e nódulos hepáticos estavam presentes, respectivamente, em 9/14 e 3/14 pacientes. Conclusão: O diagnóstico de GSDI foi tardio em nossa população, visto que os sintomas podem estar presentes desde o nascimento ou nos primeiros meses de vida. Também podemos observar que a maioria dos pacientes foi submetida à biopsia hepática para confirmação do diagnóstico. O quadro clínico característico associado à análise molecular continua sendo um critério seguro e pouco invasivo para o diagnóstico. Outro aspecto importante diz respeito ao tratamento. O uso de grande quantidade de amido de milho tem como efeito colateral o excesso de peso. Contudo, o excesso de peso parece estar associado a um aumento do ganho estatural.
Glycogen storage disease type I (GSDI) is an autosomal recessive genetic disease characterized by hypoglycemia, hyperlactatemia, hyperlipidemia, and hyperuricemia. If left untreated, patients may develop short stature, hepatocellular adenomas, glomerular hyperfiltration, and life-threatening hypoglycemia. In GDIa there is deficiency of glucose-6-phosphatase (G6Pase), and GSDIb is caused by a defect in G6P translocase (or G6PT). In GSD type Ib, the clinical presentation is quite similar to that of GSDIa, but may occur neutropenia with recurrent infections and an increased incidence of inflammatory bowel disease. Management of GSDI is essentially dietary, using uncooked cornstarch at regular four hours intervals. In infants frequent meals and continuous nocturnal infusion through a nasogastric or gastrostomy tube are recommended. Besides that, fructose, sucrose, and lactose intake must be excluded. Vitamin and minerals supplementation, angiotensin converting enzyme (ACE) inhibitor, alopurinol and potassium citrate can be used, as well, depending patients`clinical conditions. Objectives: To characterize the clinical, laboratory, and anthropometric profile of a sample of Brazilian patients with GSDI cared at an outpatient referral clinic for inborn errors of metabolism. Methods: This was a cross-sectional outpatient study based on a convenience sampling strategy. Data on diagnosis methods used (clinical, histopathological, Glucose-6-phosphatase in liver and molecular analysis) were accessed. Besides that, data about treatment conducted, anthropometric parameters, and laboratory and image tests follow-up were analysed. Results: Twenty-one patients were included in this study. Seventeen were diagnosed as GSDIa and four GSDIb, with median age of 10 years (range 1–25 years). All were taking uncooked cornstarch therapy. Median age at diagnosis was seven months (range, 1–132 months), and 19 patients underwent liver biopsy for diagnostic confirmation. On anthropometric evaluation, overweight was present in 16/21 patients (n =). Short stature was observed in 4/21 patients. A correlation was found between height-for-age and BMI-for-age z scores (r=0.561; p=0.008). Hepatomegaly, and liver nodules were present 9 /14, and 3 / 14 patients respectively. Conclusions: Diagnosis of GSDI was delayed in our sample, since symptoms can be found on the early months of life. Most patients underwent liver biopsy for diagnostic confirmation, even though the combination of a characteristic clinical presentation and molecular methods can provide a less invasive but definitive diagnosis. Another important is that obesity is a side effect of cornstarch therapy. However it appears to be positively associated with growth in these patients.

En aquest estudi es mostra clarament que en hepatòcits la Glu 6-P produïda per la HK I no pot ser dirigida cap al glicogen ja que no pot activar la GS de fetge. Aquesta evidència sembla indicar que la GK és l'element que facilita que l'hexosa fosforilada activi la LGS i serveixi per a la síntesi de glicogen en hepatòcits. A més, l'activació de la GS per part de la Glu 6-P de la gluconeogènesi, tal i com s'ha demostrat en els estudis presentats, reforça la idea que la GK no és la única, ni imprescindible per a la funcionalitat de la GS hepàtica, sinó que la HK I n'és l'excepció.

D'aquests estudis, també podem concloure que l'acumulació hepàtica de glicogen a partir de glucosa està sotmesa a un sistema de control en el qual el controlador, GS, és alhora controlat per la GK. Aquest sistema és diferent de les cascades de fosforilació, en el qual l'enzim controla directament l'activitat del que el succeeix en la sèrie. En el nostre sistema, el control de manera indirecta l'exerceixen els nivells de Glu 6-P, que engeguen la desfosforilació de la GS, i per tant l'activen. Per això considerem la Glu 6-P tant un precursor com una molècula de senyalització que dirigeix la incorporació de glucosa a glicogen

Per aprofundir en l'estudi del mecanisme d'activació de la LGS per glucosa s'han utilitzat les cèl·lules FTO-2B aprofitant que no expressen la GK. Fins aquest moment, s'acceptava que la glucosa quan era fosforilada per la GK estimulava l'activació de la GS millor que si era fosforilada per la HK I. La LGS endògena s'activa en resposta a concentracions creixents de glucosa quan la GK hi ha estat expressada però no quan la font de Glu 6-P és la HK I endògena o HK I sobreexpressada. Això suggereix la presència de com a mínim dues poblacions de Glu 6-P en la cèl·lula. Una d'aquestes poblacions prové de l'acció de la GK i és accessible a la LGS, mentre que la població de molècules de Glu 6-P produïdes per la HK I es localitzen en un compartiment cel·lular del qual està exclosa la LGS. En aquestes s'ha observat que la LGS, però no la MGS, diferència entre la Glu 6-P produïda per la GK o per la HK I. La isoforma hepàtica presenta especificitat per l'origen d'aquest metabòlit a diferència de la isoforma muscular, cosa que reforça les diferencies en els mecanismes de la síntesi del glicogen en el fetge i el múscul.

Tots aquests resultats i aquells descrits a la bibliografia amb anterioritat, ens permeten concloure: primer, que la síntesi de glicogen succeeix a la perifèria de l'hepatòcit, i és funció de l'activació de la GS via Glu 6-P. En la perifèria cel·lular és on, probablement, es donen les condicions òptimes, com l'accés a substrats, per a la síntesi de glicogen.

Segon, que la font utilitzada per sintetitzar la Glu 6-P es determinant per activar la GS. En el cas que s'utilitzi un precursor gluconeogènic per sintetitzar glicogen, la G6Pasa juga un paper clau al decidir en quina direcció (producció de glucosa o síntesi de glicogen) s'utilitzarà la Glu 6-P. En aquest sentit, recentment s'ha descrit que in vivo la inhibició de la Glu 6-P translocasa porta a una utilització de la Glu 6-P produïda per gluconeogènesi cap a la síntesi de glicogen.

Tercer, quan la Glu 6-P prové de la fosforilació de glucosa per part de la GK, la síntesi de glicogen incrementa en funció dels nivells de glucosa. El glicogen es produeix de manera més eficient gràcies a la inactivació de la GP per glucosa i la conseqüent disminució de la degradació del glicogen. El funcionament tan acurat d'aquesta maquinària esdevé essencial en el balanç entre la producció hepàtica de glucosa i la síntesi de glicogen.

Orientadores : Fumio Yokoya, Luiz Carlos Basso
Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos
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Resumo: O resumo podera ser visualizado no texto completo da tese digital
Abstract: The abstract is available with the full electronic digital document
Doutorado
Doutor em Ciência de Alimentos

En l'entramat metabòlic cel·lular, milers de substrats estan interconnectats mitjançant reaccions bioquímiques. Tot i que aquest alt grau d'interrelació podria conduir al flux de substrats en múltiples direccions simultàniament, a la pràctica els fluxos metabòlics passen a través de rutes específiques. Els nostres estudis evolutius sobre el metabolisme del glicogen mostren que els isoenzims que catalitzen les diverses etapes d'aquesta ruta contribueixen a definir i a aïllar els mòduls funcionals, un punt clau per entendre la organització metabòlica en els vertebrats. Aquests isoenzims específics de teixit sorgeixen per duplicació gènica a l'origen dels vertebrats i que les seves propietats bioquímiques co-evolucionen per adaptar-se a les necessitats metabòliques específiques dels teixits on s'expressen. La retroinhibició de les hexoquinases d'alta afinitat o l'activació al·lostèrica de les glicogen sintases, ambdós efectes mediats per la glucosa-6-fosfat, són clars exemples de que les característiques cinètiques dels isoenzims es modulen al llarg de l'evolució dels vertebrats per satisfer les diferents funcions del metabolisme del glicogen. A més, els nostres resultats ajuden a entendre la única situació descrita on, paradoxalment, els isoenzims del metabolisme del glicogen majoritaris en cervell, múscul i fetge es barregen i es co-expressen en el mateix teixit: el fetge embrionari de mamífer. Els resultats presentats en aquesta memòria indiquen que la síntesi de glicogen en el fetge embrionari, essencial per assegurar la supervivència del nounat, requereix la re-organització de l'expressió dels isoenzims que hi participen, a fi d'estabilitzar el contingut de glicogen embrionari en front de les variables condicions fisiològiques maternes.
Estudis previs indicaven que els ratolins defectius per la isoforma muscular de la glicogen sintasa mostren greus defectes en el desenvolupament cardíac. Per aprofundir en les bases moleculars d'aquesta alteració, hem caracteritzat la translocació nucleo-citoplàsmica de la glicogen sintasa muscular humana i hem analitzat la seva funció en el nucli. Els nostres resultats mostren com aquest enzim transloca vers al nucli i forma agregats nuclears quan es deplecionen les reserves de glicogen de la cèl·lula. A més, els resultats obtinguts amb els mutants de deleció de l'enzim indiquen que el domini implicat en l'activació al·lostèrica de l'enzim per G6P, la regió rica en arginines, és crucial per a la seva acumulació nuclear. En conjunt, aquestes observacions suggereixen que, a part de la funció metabòlica, la glicogen sintasa podria participar en processos nuclears on es requerís un sensor de l'estat energètic de la cèl·lula.
In the metabolic network of the cell, hundreds of substrates are interconnected through biochemical reactions. Although such interconnection could lead to the simultaneous flow of substrates in numerous directions, in practice metabolic fluxes pass through specific pathways. Our metabolic and evolutionary studies on glycogen metabolism showed that isoenzymes contribute to define and isolate separate functional modules, a key issue to understand metabolic organisation in vertebrates. These tissue-specific isoenzymes are generated by gene duplication at the dawn of vertebrates and their biochemical properties co-evolved to suit specific metabolic roles of the tissues where they are expressed. The retro inhibition of high-affinity hexokinases, or glycogen synthase allosteric activation, both effects mediated by G6P, are clear examples of kinetic features that are modulated through vertebrate evolution to satisfy different roles of glycogen metabolism. Furthermore, our results help to understand the only reported situation where, paradoxally, isoenzymes of glycogen metabolism enzymes from liver, muscle and brain are merged and co-expressed in the same tissue: the mammalian embryonic liver. Our results indicate that embryonic glycogen synthesis in liver, essential for newborn survival, requires the re-design of isoenzyme distribution in order to buffer the embryonic glycogen content in front of changing maternal metabolic conditions.
In addition, it has been described that muscle glycogen synthase isoenzyme (MGS) knockout mice show severe developmental heart defects. In order to adress the molecular basis of this growth alteration, we characterised the nucleo-cytoplasmic translocation of MGS and analyzed its nuclear function. We showed that this enzyme translocate into the nucleus and form nuclear aggregates when cells are depleted of glucose and glycogen deposits. Moreover, the results that we obtained with the deletion mutants indicate that the domain involved in the allosteric activation of the enzyme by G6P, the arginine-rich cluster, is crucial for its nuclear acumulation. Taken together, these observations suggest that, in addition to its metabolic function, MGS may participate in nuclear processes which would require a sensor of the cellular enregy state.

El fetge manté l'homeòstasi de glucosa per emmagatzematge de l'excés del monosacàrid en forma de glicogen després de les ingestes, i per la producció de glucosa en post absorció. La reducció en la deposició del glicogen juga un paper central en els mecanismes que condueixen a la hiperglucèmia en la diabetis. Aquesta disminució és una conseqüència de la reducció en la forma defosforilada, i per tant activa, de la glicogen sintasa hepàtica (LGS), l'enzim clau en la síntesi del polisacàrid en aquest teixit.

Diverses estratègies han suggerit una possible relació entre l'augment de la capacitat d'acumulació de glicogen en fetge i la millora de l'homeòstasi de glucosa. Molts dels agents terapèutics per a combatre la diabetis que actualment es troben en desenvolupament es basen en una acció indirecta para augmentar l'activitat LGS, mitjançant inhibició de la quinasa GSK-3, que fosforila i per tant inactiva a la LGS. Tanmateix, a part de la GSK-3, hi ha d'altres quinases que inactiven a la LGS per fosforilació, i tampoc s'ha evidenciat si els residus diana de la GSK-3 exerceixen un paper clau en el control de l'activitat de la LGS. Per tant, inclús quan s'inhibeix la GSK-3, altres residus de fosforilació de la LGS, que no serien diana d'aquesta quinasa, podrien ésser fosforilats per d'altres quinases inactivant així a la LGS. A més, la GSK-3 i les altres dianes de la resta d'aproximacions que també tindrien como objectiu l'augment de la capacitat d'acumulació de glicogen en el fetge, són proteïnes que es troben involucrades en molts processos biològics, així doncs els mecanismes moleculars en resulten poc definits i es fa difícil establir si la procedència de la millora es només deguda a un augment en l'acumulació de glicogen en el fetge. Així doncs, falta una prova directa que evidenciï que la sola activació de la LGS pot conduir a la disminució de la glicèmia. Per tant, una aproximació per restaurar l'emmagatzematge de glicogen hepàtic, que es troba alterat en la diabetis, podria ésser l'augment de l'activitat de l'únic enzim que sintetitza glicogen en el fetge, la LGS.

Per aquest propòsit, es va establir com objectiu l'augment de la forma defosforilada de la LGS en fetge de rata i examinar les conseqüències metabòliques en l'estat diabètic. El primer pas va ésser la determinació dels llocs de fosforilació que exerceixen un major control sobre l'activitat enzimàtica de LGS en la línea hepàtica FTO2B i en cultius primaris d'hepatòcits. Per això, es va expressar formes mutants de l'enzim, de serines per alanines, mitjançant infecció amb adenovirus. Una vegada establert quins llocs de fosforilació eren claus, es va expressar aquesta forma mutada de l'enzim en fetge de rata sana a través de la infusió intravenosa dels adenovirus. Els nostres resultats mostren una disminució significativa en la glucèmia, un augment en l'acumulació hepàtica de glicogen i una millora en la tolerància a glucosa. En rates diabètiques tipus I, per injecció d'estreptozotocina, l'expressió hepàtica d'aquest enzim actiu produïa una reducció en la hiperglucèmia i la normalització del contingut de glicogen en fetge. Aquests resultats suggereixen que l'activació de la LGS pot resultar en un mecanisme eficaç per a la intervenció terapèutica de la diabetis.
The accumulation of glycogen is altered in nearly all forms of diabetes, contributing to the development of hyperglycemia. The diabetic liver is characterized by a defective glycogen synthesis in the transition between fasting and feeding. The expression of liver glycogen synthase (LGS), the key enzyme in the regulation of glycogen synthesis in this tissue, is not altered in insulin-dependent diabetes. However, the dephosphorylated and therefore active form of LGS is significantly reduced as a result of the decrease in the activity of protein phosphatase 1 (PP1) and an increase in the activity of glycogen synthase kinase -3 (GSK-3), both involved in the dephosphorylation and phosphorylation, in the key residues responsible of the regulation of LGS activity.

Our working hypothesis was that an increase of the GS activity in liver could restore the glycogen storage capacity and therefore contribute to the amelioration of the diabetic state. To this end we aimed to increase the dephosphorylated form of LGS in rat liver and examine the metabolic consequences in the diabetic state. The first step was to determine the phosphorylatable serines exerting the main control in the enzymatic activity of LGS in the hepatoma cell line FTO2B and in primary cultured hepatocytes, by heterologous expression with recombinant adenoviruses. Once identified, we expressed this form of the enzyme in vivo through intravenous infusion of recombinant adenovirus in healthy rats. Our results revealed a significant decrease in glycaemia, improved glucose tolerance and increased in hepatic glycogen accumulation, which was reduced in response to fasting. In STZ-diabetic rats, the expression of active LGS in liver was sufficient to reduce hyperglycemia as well as to normalize the liver glycogen content. These results suggested that activation of LGS could be an effective mechanism for improving glucose homeostasis in altered states such as diabetes.

Descreve-se uma enfermidade hereditária em bovinos caracterizada por acúmulo lisosssomal de glicogênio em diversos órgãos. A doença foi diagnosticada em um rebanho da raça Brahman com 20 vacas e um touro, mantidos em criação extensiva, no município de Porto Lucena, Rio Grande do Sul, Brasil. A doença afetou 3 de 16 bezerros nascidos (18,75%) no ano 2000, 5 de 19 (26,3%) em 2001 e 2 de 12 (16,6%) em 2002. Os animais afetados, após 1 mês de idade, apresentavam dificuldade de acompanharem a mãe e crescimento retardado, desenvolviam fraqueza e tremores musculares, letargia e perda de condição corporal progressivos. Com o agravamento dos sinais clínicos os animais eram eutanasiados por apresentarem dificuldade em se alimentar ou beber água sem auxílio. Todos os bezerros eram descendentes do mesmo touro. Após a retirada deste animal do plantel e introdução de um touro Nelore não houve o nascimento de animais doentes. Foi realizada necropsia em 3 bezerros doentes e palidez muscular do tronco e membros foi a única alteração macroscópica encontrada. Vacuolização citoplasmática de diversos órgãos foi a principal alteração histológica observada. Os vacúolos citoplasmáticos eram mais evidentes na musculatura esquelética, miocárdio, especialmente nas fibras de Purkinje e neurônios do Sistema Nervoso Central (SNC). Nos tecidos mais afetados, também foi observada grande quantidade de grânulos ácido periódico de Schiff (PAS) positivos e negativos quando o tecido era tratado previamente com diastase. A microscopia eletrônica de transmissão mostrou acúmulo anormal de glicogênio livre no citoplasma das células ou envolto por membrana na musculatura esquelética, neurônios do SNC e fígado As amostras processadas de pele, musculatura esquelética e tecido nervoso na histoquímica de lectinas apresentaram reação com as lectinas Griffonia simplicifolia (GS-II) e Concanavalia ensiformes (Con-A). Uma mutação letal no gene da alfa glicosidase ácida, causadora da glicogenose generalizada em bovinos da raça Brahman, a 1057∆TA, foi detectada pela técnica de reação em cadeia de polimerase (PCR) em tecidos dos animais necropsiados. Também foi detectada presença dessa mutação no gene da alfa glicosidase ácida, através da análise de amostra de sangue, de animais que tem parentesco com bezerros que nasceram com a doença. Os achados clínicos, patológicos e ultra-estruturais são semelhante ás descrições de glicogenose tipo II em bovinos da raça Brahman. Até o momento não há casos descritos de glicogenose tipo II em bovinos da raça Brahman no Brasil. O diagnóstico de glicogenose hereditária foi baseado nos dados epidemiológicos, sinais clínicos, achados histológicos e ultra-estruturais, histoquímica de lectinas e pelos resultados de PCR.

Les glicogen i midó sintases són glicosiltransferases que catalitzen la transferència de residus glucosil a l'extrem no reductor d'una cadena creixent d'un glucà α-1,4, retenint la configuració del carboni anomèric del sucre transferit. Aquest procès és central en el metabolisme energètic de la majoria d'èssers vius.

En aquest treball presentem l'estructura cristal·logràfica de la glicogen sintasa de Pyrococcus abyssi (PaGS). Aquest enzim és termoestable i presenta una activitat màxima a 80ºC i és capaç d'utilitzar indistintament ADPG i UDPG com a donadors de glucosil. La PaGS forma de cossos d'inclusió en totes les condicions d'expressió en E.coli assajades. Amb el mètode de renaturalització en columna hem aconseguit que la PaGS es replegui correctament i ens ha permès obtenir la quantitat de proteïna pura necessària per encetar estudis de cristal·lització i de caracterització en solució.

D'altra banda, el domini C-terminal de la PaGS s'expressa de forma soluble i la seva purificació ens ha permès disposar de quantitat suficient de proteïna per a realitzar estudis de cristal·lització. Aquest domini és monomèric tant en solució com en el cristall. La resolució de l'estructura del domini C-terminal a 1.7 Å a partir de reemplaçament molecular utilitzant el domini homòleg de la GS d'Agrobacterium tumefaciens (AtGS) ha permès utilitzar-lo com a model inicial per a resoldre l'estructura de la PaGS a 2.8 Å.

La PaGS és un trímer tant en solució com en el cristall, amb una disposició triangular plana. Cadascuna de les seves subunitats està formada per dos dominis αβα tipus plegament de Rossmann separats per un solc molt profund on es troba el centre catalític de l'enzim. L'estructura global és molt similar a la de la resta d'estructures resoltes del grup GT-B que actuen amb retenció de la configuració anomèrica. La trimerització de la PaGS implica exclusivament els dominis N-terminals de l'enzim, quedant els dominis C-terminals lliures per a poder realitzar la transició d'obertura i tancament necessària per a la catàlisi.
El domini C-teminal conté la cavitat d'unió a nucleòtid, mentre que la majoria d'interaccions amb l'oligosacàrid acceptor es produeixen a través de residus del domini N-terminal. L'elevada similitud del centre actiu entre les GS i les GP suggereix que ambdues operen a través d'un mecanisme catalític similar, si be no idèntic.

L'estructura de la PaGS i la seva comparació amb l'estructura de l'AtGS ofereixen les bases per a entendre l'especificitat de les GS eucariotes per UDPG, com a substrat donador de glucosil, i la promiscuïtat de les GS d'arqueons per unir tant UDPG com ADPG.

La localització d'una molècula de glucosa en la superfície de la PaGS i la comparació amb les GP eucariotes permeten suggerir un possible lloc d'emmagatzematge del glicogen en les GS.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias.
Made available in DSpace on 2012-10-18T05:20:29Z (GMT). No. of bitstreams: 0
O Estado de Santa Catarina é o maior produtor brasileiro de bivalves marinhos cultivados. A espécie de ostra mais cultivada comercialmente é Crassostrea gigas, e sua reprodução e sobrevivência em águas brasileiras na estação do verão. Durante os processos reprodutivos em bivalves, o acúmulo de glicogênio é fundamental, garantindo melhores ou piores resultados na produção de gametas. Faz-se necessário o estudo do acúmulo de glicogênio em ostras mantidas em laboratório durante o verão, como um primeiro passo no estudo da reprodução induzida de C. gigas nesta época, podendo favorecer o aumento do fornecimento de sementes, visando o aumento da produção. O desenvolvimento sexual de bivalves é controlado por fatores endógenos e exógenos, sendo a temperatura da água o mais importante fator ambiental controlando o ciclo gonádico. No presente estudo, foi avaliada a influência de 3 condições térmicas sobre o acúmulo de glicogênio em Crassostrea gigas. 450 ostras foram obtidas do cultivo experimental de moluscos marinhos da Unicersidade Federal de Santa Catarina (UFSC) no Sambaqui - Florianópolis/SC e induzidas à desova, em janeiro de 2000. Grupos de 150 animais foram mantidos em 3 tratamentos durante 75 dias: tratamento 1, com ostras que retornaram ao ambiente natural (média de 27,5 ºC); tratamento 2, com ostras mantidas em água resfriada (média de 16,6 ºC) e tratamento 3, com ostras mantidas em água à temperatura ambiente (média de 22,3 ºC) no Laboratório de Cultivo de Moluscos Marinhos - LCMM/UFSC, na Barra da Lagoa - Florianópolis. As ostras foram analisadas quanto ao teor de glicogênio, a características histológicas e histoquímicas da gônada, em relação à presença de glicogênio e fase do ciclo sexual. Obteve-se diferenças estatísticas no teor de glicogênio antes e depois da desova. Ocorreu acúmulo de glicogênio nas ostras no decorrer da pesquisa, evidenciado por diferenças estatísticas entre o início e final do experimento. Não houve diferença estatística quanto ao teor de glicogênio entre os tratamentos, ao final do trabalho. Observou-se grande heterogeneidade das fases de desenvolvimento gonádico, mas a predominância foi de ostras em repouso sexual. O maior número de indivíduos em fase progressiva ocorreu no tratamento de temperatura resfriada, que também apresentou um maior número de fêmeas. Nos procedimentos histoquímicos, verificou-se maior concentração de glicogênio no citoplasma dos ovócitos em indivíduos fêmeas e nas células interfoliculares em indivíduos machos.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:05Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-07-13Bitstream added on 2014-06-13T20:10:34Z : No. of bitstreams: 1 candido_ts_me_araiq_parcial.pdf: 929806 bytes, checksum: e0eb6ae6bd716ab4fe86de16a7032888 (MD5) Bitstreams deleted on 2014-08-22T14:57:04Z: candido_ts_me_araiq_parcial.pdf,Bitstream added on 2014-08-22T15:02:07Z : No. of bitstreams: 1 000713117.pdf: 3856340 bytes, checksum: eac0f3890cdcdcf0aec970764ebd55b6 (MD5)
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)
Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)
Neste trabalho, uma coleção de linhagens mutantes de N. crassa em proteínas quinases foi adquirida pelo nosso laboratório e estas linhagens foram utilizadas a fim de identificar as proteínas envolvidas no controle do metabolismo do glicogênio no fungo. Estas proteínas foram anotadas como pertencentes a diferentes classes de proteínas quinases devido às características dos seus domínios quinases. Inicialmente foram identificadas as quinases que estão envolvidas no controle do metabolismo do carboidrato através da quantificação do conteúdo de glicogênio, tanto em uma situação de crescimento vegetativo (30 °C), como sob a condição de estresse térmico (45 °C). Nesta parte, as linhagens mutantes que mostraram perfis de acúmulo de glicogênio diferente da linhagem selvagem, nas condições avaliadas foram selecionadas. Posteriormente, foram realizadas quantificações de atividade da enzima glicogênio sintase de N. crassa (GSN), sob as mesmas condições experimentais, na presença e ausência do modulador alostérico glicose-6-fosfato (G6P). Foi verificado que a enzima GSN presente em algumas linhagens mutantes provavelmente estaria diferentemente fosforilada, quando comparada à proteína presente na linhagem selvagem. Por este motivo, uma análise das diferentes isoformas de fosforilação foi realizada em algumas das linhagens mutantes combinando os ensaios 2D-PAGE e Western blot. Através destas análises foi possível verificar quais proteínas quinases estão envolvidas no controle do metabolismo do glicogênio e que atuam mais especificamente na regulação por fosforilação da enzima GSN. Das 55 linhagens inicialmente utilizadas, 6 linhagens apresentaram diferenças no acúmulo de glicogênio, na atividade GSN e no estado de fosforilação da enzima GSN, quando comparadas com a selvagem. Portanto, caracterizam proteínas...
In this work, a collection of N. crassa strains mutated in genes encoding protein kinases was used to identify proteins involved in the control of glycogen metabolism in this fungus. These proteins were annotated as belonging to different classes of protein kinases due to their kinase domains. Initially, we identified the proteins involved in the metabolism control by quantifying the glycogen accumulated under vegetative growth (30 °C) and under a stress condition such as heat stress (45 °C). The mutant strains showing glycogen accumulation profiles different from the wild-type strain under the conditions evaluated were selected. The selected mutant strains were used to quantify glycogen synthase activity (GSN), under the same experimental conditions, in the presence and absence of the allosteric modulator glucose-6-phosphate (G6P). From this assays, it was observed that GSN in some mutant strains would be differently phosphorylated when compared to the enzyme present in the wild-type strain. Therefore, an analysis of the GSN phosphorylation isoforms was performed in such mutant strains by combining 2D-PAGE and Western blot. Through these analysis, it was possible to identify which protein kinases are involved in the control of glycogen metabolism and specifically act in the GSN phosphorylation. Of the 55 strains initially used six strains showed differences in the glycogen accumulation, in the GSN activity, and in the state of GSN phosphorylation, compared to the wild-type strain. Therefore, they characterize putative protein kinases that regulate glycogen metabolism by regulating the GSN enzyme. The strain knocked-out in the ORF encoding the protein PHO85-like (a cyclin-dependent protein kinase) showed differences in the glycogen content, increased -/+ G6P ratio, and changes in the GSN phosphorylation... (Complete abstract click electronic access below)

Orientador: Maria Célia Bertolini
Co-orientador: Fernanda Zanolli Freitas
Banca: Cleslei Fernando Zanelli
Banca: Roberto do Nascimento Silva
Resumo: Neste trabalho, uma coleção de linhagens mutantes de N. crassa em proteínas quinases foi adquirida pelo nosso laboratório e estas linhagens foram utilizadas a fim de identificar as proteínas envolvidas no controle do metabolismo do glicogênio no fungo. Estas proteínas foram anotadas como pertencentes a diferentes classes de proteínas quinases devido às características dos seus domínios quinases. Inicialmente foram identificadas as quinases que estão envolvidas no controle do metabolismo do carboidrato através da quantificação do conteúdo de glicogênio, tanto em uma situação de crescimento vegetativo (30 °C), como sob a condição de estresse térmico (45 °C). Nesta parte, as linhagens mutantes que mostraram perfis de acúmulo de glicogênio diferente da linhagem selvagem, nas condições avaliadas foram selecionadas. Posteriormente, foram realizadas quantificações de atividade da enzima glicogênio sintase de N. crassa (GSN), sob as mesmas condições experimentais, na presença e ausência do modulador alostérico glicose-6-fosfato (G6P). Foi verificado que a enzima GSN presente em algumas linhagens mutantes provavelmente estaria diferentemente fosforilada, quando comparada à proteína presente na linhagem selvagem. Por este motivo, uma análise das diferentes isoformas de fosforilação foi realizada em algumas das linhagens mutantes combinando os ensaios 2D-PAGE e Western blot. Através destas análises foi possível verificar quais proteínas quinases estão envolvidas no controle do metabolismo do glicogênio e que atuam mais especificamente na regulação por fosforilação da enzima GSN. Das 55 linhagens inicialmente utilizadas, 6 linhagens apresentaram diferenças no acúmulo de glicogênio, na atividade GSN e no estado de fosforilação da enzima GSN, quando comparadas com a selvagem. Portanto, caracterizam proteínas... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo)
Abstract: In this work, a collection of N. crassa strains mutated in genes encoding protein kinases was used to identify proteins involved in the control of glycogen metabolism in this fungus. These proteins were annotated as belonging to different classes of protein kinases due to their kinase domains. Initially, we identified the proteins involved in the metabolism control by quantifying the glycogen accumulated under vegetative growth (30 °C) and under a stress condition such as heat stress (45 °C). The mutant strains showing glycogen accumulation profiles different from the wild-type strain under the conditions evaluated were selected. The selected mutant strains were used to quantify glycogen synthase activity (GSN), under the same experimental conditions, in the presence and absence of the allosteric modulator glucose-6-phosphate (G6P). From this assays, it was observed that GSN in some mutant strains would be differently phosphorylated when compared to the enzyme present in the wild-type strain. Therefore, an analysis of the GSN phosphorylation isoforms was performed in such mutant strains by combining 2D-PAGE and Western blot. Through these analysis, it was possible to identify which protein kinases are involved in the control of glycogen metabolism and specifically act in the GSN phosphorylation. Of the 55 strains initially used six strains showed differences in the glycogen accumulation, in the GSN activity, and in the state of GSN phosphorylation, compared to the wild-type strain. Therefore, they characterize putative protein kinases that regulate glycogen metabolism by regulating the GSN enzyme. The strain knocked-out in the ORF encoding the protein PHO85-like (a cyclin-dependent protein kinase) showed differences in the glycogen content, increased -/+ G6P ratio, and changes in the GSN phosphorylation... (Complete abstract click electronic access below)
Mestre

Orientador: Gabriel Hessel
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas
Made available in DSpace on 2018-08-09T01:55:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Banin_MarciaRegina_M.pdf: 2211563 bytes, checksum: e16e20135efbf828907adc92ed40ba6b (MD5) Previous issue date: 2007
Resumo: Racional - As doenças de depósito de glicogênio compreendem um grupo de doenças geneticamente determinadas e classificadas em 11 tipos, de acordo com as deficiências enzimáticas identificadas. Há pouca informação sobre a evolução dessas doenças. Objetivos - Descrever as características clínicas e laboratoriais, na admissão e evolução, de pacientes com doença de depósito de glicogênio. Pacientes e métodos ¿ Participaram do estudo 22 pacientes com diagnóstico de glicogenose hepática, sendo 11 (50%) do sexo feminino. O estudo foi descritivo e longitudinal. A ficha de coleta de dados constituiu-se de informações iniciais de: quadro clínico, peso, estatura, índice de massa corporal (IMC) e resultados dos exames laboratoriais (hemograma, enzimas hepáticas, colesterol total e frações, triglicérides, glicemia, ácido úrico, uréia e creatinina). Selecionou-se os momentos 1 (admissão), 3 (12 meses de evolução) e 7 (36 meses de evolução) para coleta dos seguintes dados: peso, estatura, IMC, ácido úrico, glicemia, colesterol e triglicérides. Também, foram comparados os resultados de antropometria e exames bioquímicos dos pacientes em dois momentos: admissão e última consulta. Para as variáveis peso e estatura, calculou-se o Z escore sendo considerado déficit quando o valor se situava abaixo do segundo desvio padrão. A velocidade de crescimento foi calculada a partir da 2ª e 1ª consulta (V1) e a partir da última e penúltima consulta (V2). A taxa de aderência foi determinada pela porcentagem de absenteísmo das consultas da seguinte forma: boa: se absenteísmo menor que 20%; regular: se absenteísmo entre 20% e 40% e ruim: se absenteísmo maior que 40%. Utilizou-se como teste estatístico a análise de variância e os testes de Kruskal-Wallis, Mann-Whintney e Wilcoxon, sendo o nível de significância adotado de 5%. Resultados - A média da idade de início dos sintomas foi de 10,7 meses e do diagnóstico de 28,18 meses. O tempo médio de seguimento foi de 105 meses. As manifestações clínicas iniciais mais freqüentes foram: hepatomegalia em 21 (95%), abdômen protuberante em 19 (86%), face de boneca em 14 (64%), diarréia em 10 (45%) e história de hipoglicemia em 8(36%). Nos exames laboratoriais, observou-se, na maioria dos casos, aumento das enzimas hepáticas, hipercolesterolemia, hipertrigliceridemia e hipoglicemia. Na admissão, o déficit de peso/idade foi de 26% (5/19) e de estatura/idade foi de 35% (7/20). Não houve diferença estatística na comparação do Z escore de peso/idade, estatura/idade, índice de massa corporal e exames laboratoriais na admissão, com 12 e 36 meses. Entre a admissão e a última consulta, observou-se diferença significativa no índice de massa corporal, enzimas hepáticas, glicemia e triglicérides, o que não aconteceu com Z escore de peso/idade, estatura/idade e os exames de ácido úrico e colesterol. A taxa de aderência foi considerada boa em 64% dos pacientes. Na comparação da velocidade de crescimento, observou-se tendência de aumento comparando V1 com V2. Conclusões ¿ Houve demora no encaminhamento ao centro de referência para o diagnóstico das glicogenoses. As manifestações clínicas mais freqüentes foram abdômen protuberante e hepatomegalia e as alterações laboratoriais mais significativas foram a elevação dos triglicérides, colesterol e diminuição da glicemia. Na evolução, não houve diferença nos parâmetros antropométricos, mas uma tendência de melhora de velocidade de crescimento. O tratamento melhorou o desarranjo metabólico
Abstract: Background ¿ Glycogen storage diseases comprise a group of genetic diseases determined and classified into 11 types, according to the identified enzymatic deficiency. There is little information regarding the disease evolution. Aim ¿ Describe clinical and laboratorial characteristics in the admission and evolution of patients with glycogen storage disease. Patients and methods ¿ Twenty-two patients with hepatic glycogen diagnosis participated in the study, 11 (50%) of which were female. The study was descriptive and longitudinal. The collected data file consisted of admission information: clinical features, weight, height, body mass index (BMI) and laboratorial exam results: hemogram, hepatic enzymes, total cholesterol and fractions, triglycerides, glycemia, uric acid, urea and creatin. Afterwards, the following phases were selected: 1 (admission), 3 (12 months of evolution) and 7 (36 months of evolution) for the weight, height, BMI and laboratorial tests: uric acid, glycemia, total cholesterol and triglycerides. The antropometric data, hepatic enzymes and mentioned tests were compared during 2 moments: admission and last appointment of each patient. The score Z was utilized to evaluate the weight and height of patients, considered if the standard deviation was under 2. The growth velocity was calculated among the second and first consult and the last and the penultimate consult. The adherence percentage was determined by the appointment absence percentage: Good: absenteeism minor 20%; regular: absenteeism major 20% and minor 40%; bad: absenteeism major 40%. The statistical tests applied were ANOVA, Kruskal-Wallis, Mann-Whintney, and Wilcoxon. The significance level was 5%. Results - The mean time during the first symptoms was 10,73 months and the mean time up to diagnosis was 28,18 months. The mean time of follow-up was 105 months. The most frequent initial clinical manifestations were: hepatomegaly in 21 (95%), protuberant abdomen in 19 (86%), doll face in 14 (64%), diarrhea in 10 (45%) and history hypoglycemia in 8 (36%). In the admission the deficit of the weight to age was 26% (5/19) and height to age was 35% (7/20), In the initial biochemical tests showed elevation of hepatic enzymes, hypercholesterolemia, hypertriglyceridemia, hypoglycemia. There was no statistical difference among the score Z weight to age, score Z height to age, body mass index and laboratorial tests of admission within 12 and 36 months. Significant differences were observed in BMI, hepatic enzymes, glycemia and triglycerides between the first and the last appointments, opposing to the score Z weight to age, score Z height to age, uric acid and cholesterol exam results. In the comparison of the growth velocity there was elevation tendency between the V1 and V2. There was difference significative of the growth velocity among the first and second versus the penultimate and the last consult. The adherence percentage was considered good in 64%. Conclusions - The patients delayed in seeking the reference center for glycogenosis early diagnosis. The most frequent clinical manifestations were protuberant abdomen, hepatomegaly, elevation of triglycerides and cholesterol, and glycemia reduction. In the evolution, there wasn¿t difference statistic in the antropometric parameters, but there was improvement tendency on the growth velocity. The treatment has improved the metabolic derangement
Mestrado
Saude da Criança e do Adolescente
Mestre em Saude da Criança e do Adolescente

Orientadores: Edi Lucia Sartorato, Denise Yvonne Janovitz Norato
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas
Made available in DSpace on 2018-07-27T18:22:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Reis_FernandadeCastro_M.pdf: 23985784 bytes, checksum: e92f2903bb320c3ac779c96e20940b1a (MD5) Previous issue date: 2001
Resumo: A doença de depósito de glicogênio do tipo Ia (GSDIa), é a forma mais comum entre as glicogenose do tipo I (GSDI), com uma freqüência de 1:100.000 nascimentos. É uma doença de herança autossômica recessiva, clinicamente caracterizada por hipoglicemia, hepatomegalia, retardo no crescimento, hiperlipidemia, hiperuricemia e acidose láctica. Esses sintomas são provocados pela deficiência da enzima glicose 6- fosfatase (G6Pase), que cataliza as etapas finais da gliconeogênese e glicogenólise através da conversão da glicose 6-fosfato (G6P) em glicose e fosfato. No passado, muitos pacientes com GSDI morriam pela doença. Atualmente, com o diagnóstico precoce e início de um tratamento contínuo e adequado, complicações como adenomas hepáticos e renais podem ser prevenidas. O isolamento do cDNA humano da G6Pase demonstrou que o gene G6PC é composto de cinco exons, possui um tamanho de 12,5Kb e se localiza no cromossomo 17. Desde sua clonagem, mais de 50 diferentes mutações foram descritas no gene. Em pacientes caucasianos provenientes dos EUA e do Noroeste europeu, as mutações R83C e Q347X são responsáveis por 22,5% e 22,4% de todos os alelos mutantes respectivamente. O diagnóstico de GSDIa pode ser feito através de testes enzimáticos e confirmado pela análise de mutação no gene G6PC. A caracterização do gene da G6Pase possibilitou a identificação de mutações que causam GSDIa. Este fato nos dá a opção de aplicar um diagnóstico baseado em análise de DNA para detecção de portadores e diagnóstico prénatal. A caracterização do gene também possibilita um insight em tomo da relação estrutura-função da catálise da G6Pase, revelando a função estrutural de aminoácidos específicos. No presente estudo, vinte e sete pacientes de GSDIa provenientes de 26 famílias não relacionadas foram investigados. O diagnóstico pela análise da atividade da enzima G6Pase em biópsia de fígado foi confirmado em apenas quatro pacientes. A estratégia dos minigenes foi utilizada para verificar o efeito das mutações intrônicas sob o mecanismo de splicing, não sendo identificados transcritos aberrantes. A perda de exons ou incorporação de fragmentos intrônicos nos exons são mecanismos mutacionais comuns, freqüentemente causados por mudanças nas seqüências conservadas de regiões de sítios de splicing. Da mesma forma seqüências fora dessas regiões também podem afetar a inclusão ou exclusão de exons. Essas alterações que atuam nos mecanismos de splicing podem estar localizadas em introns ou em exons, e padrões de splicing alternativos podem ser determinados pela visualização do tamanho do produto de transcrição. Foram identificadas oito alterações no gene G6PC, incluindo uma nova mutação de ponto encontrada até o momento somente na população brasileira, publicada por nosso grupo, duas mutações intrônicas, uma mutação silenciosa e quatro mutações de ponto previamente descritas. Foi analisado também o polimorfismo T1176C que está em associação com a mutação R83C. Esse polimorfismo pode ser utilizado como marcador para o diagnóstico de portadores e pré-natal de famílias com GSDIa que têm mutações não identificadas e que são informativas para esse marcador. Esse estudo enfatiza que a análise molecular genética é uma alternativa confiável e conveniente ao ensaio enzimático feito em biópsia de figado para o diagnóstico de GSDIa
Abstract: Glycogen storage disease type (GSD) is the most prevalent form among the glycogen storage disease type I (GSDI), with an overall frequency of 1:100.000 live births. It' s an autosomal recessive disorder clinically characterized by hypoglycemia, hepatomegaly, growth retardation, hyperlipidemia, hyperuricemia, and lactic acidemia. These symptoms are caused by a deficiency in glucose 6-phosphatase (G6Pase), which catalyzes the terminal steps in gluconeogenesis and glycogenolysis by converting glucose 6-phosphate (G6P) into glucose and phosphate. In the past, many patients with type I glycogen storage disease used to die. At present, with early diagnosis and initiation of continuous proper treatment such as hepatic and renal adenomas can be prevented. Isolation of human G6Pase cDNA showed that G6PC gene is composed of five exons, spanning approximately 12,5Kb on chromosome 17.From its cloning, more than 50 different mutations have been reported in this gene. In Caucasian patients trom the USA and from North-West Europe, R83C and Q347X account for 25.2% and 22.4% of all mutant alleles respectively. Diagnosis of GSDla can be done by enzymological tests and confirmed by mutation analysis of the G6PC gene. The characterization of the G6Pase gene enabled the identification of the mutations causing GSDla. This fact provides an option on applying DNA-analysis based diagnosis for carrier detection and prenatal diagnosis. The characterization of the gene also provides an insight into the structure-function relation of the G6Pase catalysis, by revealing the structural roles of specific amino acid residues. In the present study, twenty seven GSDla patients trom twenty six unrelated families were investigated. The diagnosis by the G6Pase enzyme activity analysis in the liver biopsy was confirmed only in four patients. The minigenes strategy was used in order to verify the effect of the intronic mutations in the splicing mechanism. No aberrant transcripts were identified. Exon skipping or exon intronic fragment incorporation is an usual mutational mechanism, often caused by changes in the consensus sequences at splicing site region. Likewise, sequences outside these regions can also affect the inclusion or exclusion of exons. Such splicing enhancers may be located in introns or exons, and alternative splicing pattems could be determined by visualization of a sized transcription product. Eight alterations in the G6PC gene were identified, including a new point mutation found so far only in Brazilian population and published by our group, two intronic mutations, a silent mutation, and four point mutations previously described. It was also analyzed the T1176C polymorphism that is in association with the R83C mutation. This polymorphism can be used as a marker in carrier and prenatal diagnosis of GSDla families which have unidentified mutations and are informative for this marker. This study emphasizes that molecular genetic analysis is a reliable and convenient altemative to the enzyme assay in a tresh liver biopsy specimen to diagnose GSDla
Mestrado
Ciencias Biomedicas
Mestre em Ciências Médicas

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:04Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-03-08Bitstream added on 2014-06-13T20:29:46Z : No. of bitstreams: 1 savassa_sm_me_araiq_parcial.pdf: 560908 bytes, checksum: 7322d6c1907899887286e7c9514807e4 (MD5) Bitstreams deleted on 2015-07-02T12:36:14Z: savassa_sm_me_araiq_parcial.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2015-07-02T12:37:34Z : No. of bitstreams: 1 000719185_20180101.pdf: 541449 bytes, checksum: 71b832c9a74978e0b6356b081a51d520 (MD5) Bitstreams deleted on 2018-01-02T17:04:40Z: 000719185_20180101.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2018-01-02T17:05:45Z : No. of bitstreams: 1 000719185.pdf: 3296921 bytes, checksum: 3209de8217c724ff260135d1572d7752 (MD5)
O fungo filamentoso Neurospora crassa é um organismo modelo muito utilizado para estudos de diversos aspectos da biologia dos eucariotos. Nosso laboratório tem utilizado este fungo para o estudo dos mecanismos moleculares e bioquímicos da regulação do metabolismo de glicogênio. A presente proposta de trabalho é uma consequência de experimentos anteriores realizados com o objetivo de identificar proteínas (fatores de transcrição ou não) que se ligam à região promotora do gene gsn, o qual codifica a enzima glicogênio sintase, regulatória do processo de síntese do carboidrato. Esses estudos combinaram experimentos de ensaios de retardamento em gel utilizando fragmentos do promotor gsn e proteínas do extrato total do fungo, acoplados à análise proteômica e identificação das proteínas por espectrometria de massas. Os experimentos resultaram na identificação de algumas proteínas do fungo, as quais podem ou não estar envolvidas na regulação da expressão do gene. Alguns estudos preliminares com estas proteínas foram anteriormente realizados no laboratório e apontaram um provável papel das mesmas na regulação do metabolismo do carboidrato em N. crassa. Duas dessas proteínas, as codificadas pelas ORFs NCU3482 e NCU06679 foram objeto de estudo neste trabalho. Portanto, o objetivo deste trabalho foi realizar a caracterização das linhagens mutantes nestas ORFs, além da produção e purificação das proteínas na forma recombinante. Foram realizadas análises morfológicas da linhagem mutante na ORF NCU06679, tais como: crescimento colonial e radial, crescimento linear e análise microscópica das extremidades das hifas. Esses experimentos foram realizados em comparação com a linhagem selvagem do fungo e, mostraram esta proteína está envolvida no processo de desenvolvimento do...
The fungus Neurospora crassa has been widely used as a model organism for fundamental aspects of eukaryotic biology. We have been studying the biochemical and molecular mechanisms involved in glycogen metabolism regulation in this fungus. The present work is a consequence of previous experiments performed in the laboratory to identify proteins that bind to the promoter region of the gsn gene which encodes glycogen synthase, the regulatory enzyme in glycogen synthesis. Previous studies were performed by using a combination of DNA gel shift assay coupled to proteomic analysis, followed by identification of proteins by mass spectrometry. The assays resulted in the identification of proteins likely involved in the regulation of gene expression. Preliminary studies with these proteins have previously been carried out and suggested that they might have a role in the regulation of glycogen metabolism in N. crassa. Two of them, the ORFs NCU3482 and NCU06679 gene products were object of study in this work. The main objective was to characterize the mutant strains in both proteins and to produce and purify the recombinant proteins. Morphological analyzes were performed in the ORF NCU06679 mutant strain such as colony and radial linear growth and microscopic examination of the ends of the hyphae. These experiments showed that this protein is involved in the fungus development since growth and ability to conidiate were deficient when compared to the wild-type strain. The expression of gsn and gpn (encodes glycogen phosphorylase, the regulatory enzyme in glycogen degradation) genes were analyzed by qPCR and the results showed differences in gene expression of both genes during vegetative growth of the NCU06679 mutant strain when compared to the wild-type strain. The protein encoded by ORF NCU06679 was produced as a recombinant protein and the purification... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:00Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-07-11Bitstream added on 2014-06-13T20:41:02Z : No. of bitstreams: 1 goncalves_rd_dr_araiq_parcial.pdf: 284569 bytes, checksum: f7e48a4c9ff942697ece9e42f05b6fea (MD5) Bitstreams deleted on 2015-06-25T13:01:23Z: goncalves_rd_dr_araiq_parcial.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2015-06-25T13:03:34Z : No. of bitstreams: 1 000713132_20161231.pdf: 275112 bytes, checksum: 63f307a03521b081835abe229f60fbf4 (MD5) Bitstreams deleted on 2017-01-02T15:03:46Z: 000713132_20161231.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2017-01-02T15:05:06Z : No. of bitstreams: 1 000713132.pdf: 8332325 bytes, checksum: 76068ad08200d9297dc8e7da373fb7ed (MD5)
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)
Resultados prévios, em nosso laboratório, permitiram identificar fatores de transcrição provavelmente atuando como reguladores do metabolismo de glicogênio no fungo Neurospora crassa utilizando uma coleção de linhagens mutantes do fungo contendo ORFS codificadoras de fatores de transcrição individualmente nocauteadas. O presente trabalho teve como objetivo realizar análises funcionais de alguns dos fatores de transcrição anteriormente identificados, tais como o regulador transcricional XlnR, descrito em outros fungos filamentosos como regulador de genes codificadores de enzimas xilanolíticas e/ou celulolíticas e o produto da ORF NCU04390, uma proteína sem função conhecida. Inicialmente foram realizadas análises de acúmulo de glicogênio e da expressão dos genes gsn (codificador da enzima glicogênio sintase) e gpn (codificador da enzima glicogênio fosforilase) durante o crescimento vegetativo (30ºC) e sob condição de estresse térmico (45ºC) nas linhagens mutantes e comparadas à linhagem selvagem. Ambas as linhagens mutantes apresentaram alterações tanto no conteúdo de glicogênio como na expressão dos genes citados anteriormente, o que indicou o possível envolvimento dos fatores de transcrição na regulação do metabolismo do carboidrato. Foram realizados experimentos com o objetivo de investigar a função do fator de transcrição XlnR na regulação do metabolismo de glicogênio. Foi verificado que esta proteína regula os níveis do carboidrato, bem como a expressão do gene gsn quando o fungo foi crescido em fontes alternativas de carbono. Entretanto, o fator de transcrição XLR-1 de N. crassa produzido na forma recombinante em E. coli (inteiro e truncado) não foi capaz de ligar ao motif presente no promotor gsn. Genes codificadores de duas endoxilanases foram identificados no genoma de N. crassa...
Previous results from our laboratory using a collection of Neurospora crassa strains mutated in genes encoding transcription factors allowed us to identify transcription factors likely involved in glycogen metabolism regulation. The present work aimed to perform a functional analysis of some transcription factors previously identified, such as the transcriptional regulator XlnR, described in many filamentous fungi as a transcriptional regulator of xylanolitic and/or cellulolitic genes and a protein with unknown function, the ORF NCU04390 product. Initially, analysis of glycogen accumulation and gsn (coding glycogen synthase) and gpn (coding glycogen phosphorylase) gene expression were performed under vegetative growth (30 °C) and under heat shock cond ition (45 ºC) in the two mutant strains and compared to the wild-type strain. Both mutant strains showed changes in the glycogen levels as well as in the gsn and gpn expression, suggesting an involvement of these transcription factors in the regulation of glycogen metabolism. Additional analysis was performed in order to investigate the function of the XlnR transcription factor. It was observed that this transcription factor regulates the glycogen levels as well as the gsn expression under alternative carbon sources. However, the recombinant XLR-1 transcription factor produced in E. coli (entire and truncated proteins) was not able to bind to the XLR-1 motif present in the gsn promoter. Two endoxylanases coding genes were identified in the N. crassa genome database and analysis of their gene expression showed the upregulation of both genes during growth in xylan instead of xylose as carbon sources. This result suggested that the XLR-1 transcription factor is not the only protein that regulates the endoxylanases genes. The transcription factor encoded by NCU04390 ORF was... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:00Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2004-09-03Bitstream added on 2014-06-13T19:19:50Z : No. of bitstreams: 1 paula_rm_dr_araiq.pdf: 2077296 bytes, checksum: aa9a17baf3828015b873a455a57c08c8 (MD5)
Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)
Glicogênio representa um dos principais carboidratos de reserva em muitos organismos e seu metabolismo está sob o controle de um complexo mecanismo envolvendo o balanço de nutrientes e sinais ambientais. A proteína glicogenina constitui a molécula iniciadora do processo de síntese de glicogênio, sendo as etapas seguintes efetuadas pelas enzimas glicogênio sintase e enzima ramificadora. Glicogênio sintase é a enzima limitante no processo e é regulada alosterismo e fosforilação reversível. Neste trabalho foi realizada uma caracterização do metabolismo de glicogênio no fungo N. crassa enfocando as enzimas glicogenina, glicogênio sintase e glicogênio sintase quinase-3. A proteína glicogenina (GNN) foi caracterizada do ponto de vista molecular, bioquímico e funcional. O cDNA codificando para esta proteína foi isolado e a seqüência polipeptídica deduzida mostrou uma proteína de 664 aminoácidos, uma das maiores proteínas glicogenina já isoladas. A inativação do gene gnn resultou em uma linhagem mutante incapaz de acumular glicogênio. A produção da proteína GNN em E. coli resultou em um polipeptídeo altamente susceptível à proteólise e formas truncadas da proteína mostraram ser mais estáveis e igualmente ativas nos processos de auto- e trans-glicosilação, além de servirem de substrato para ação da glicogênio sintase. Tais formas também foram capazes de complementar funcionalmente mutantes de S. cerevisiae. Além disso, a expressão do gene gnn foi mostrado ser regulado durante crescimento vegetativo e deprivação de carbono. Os resíduos Tyr196 e Tyr198 foram identificados como os sítios de glicosilação, os quais contribuem diferencialmente para este processo. Análise das interações entre GNN e a proteína glicogênio sintase de N. crassa (GSN) demonstrou que a região C-terminal da GNN é a mais importante para a interação. Entretanto, o...
Glycogen represents one of the main reserve carbohydrates in many organisms and its metabolism is under control of a complex mechanism involving the balance of nutrients and environmental signals. The protein glycogenin is the initiator molecule in glycogen biogenesis and the subsequent steps are carried out by the enzymes glycogen synthase and branching enzyme. Glycogen synthase is the rate-limiting enzyme in the process and is regulated both by alosterism and reversible phosphorylation. In this work we performed a characterization of the glycogen metabolism in the filamentous fungus Neurospora crassa, focusing on the enzymes glycogenin, glycogen synthase and glycogen synthase kinase-3. The protein glycogenin (GNN) was characterized under the molecular, biochemical and functional aspects. The cDNA encoding for this protein was isolated and the deduced polypeptide sequence showed a protein with 664 residues, one of the largest glycogenins isolated so far. The inactivation of the gnn gene rendered a mutant strain that was no longer able to accumulate glycogen. The production of GNN protein in E. coli cells resulted in a polypeptide highly susceptible towards proteolysis and truncated forms were more stable and equally active, judged by their abilities to self- and trans-glucosylate, and to serve as substrate for glycogen synthase elongation. These proteins were also able to recover the glycogen deficiency phenotype in a S. cerevisae mutant strain. Moreover, the gnn gene expression was shown to be ...(Complete abstract, click electronic access below)

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde. Programa de Pós-Graduação em Farmácia.
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O diabetes melito é caracterizado como um grupo de desordens com diferentes etiologias, que afeta o metabolismo de carboidratos, lipídios e proteínas. É causado pela deficiência inerente ou adquirida da produção de insulina ou pela sua inefetividade. Muitas espécies de plantas são conhecidas na medicina popular pelas propriedades hipoglicemiantes e a utilização destas plantas é uma alternativa de tratamento para os diabéticos, principalmente aqueles que não têm acesso aos medicamentos. Flavonóides são compostos fenólicos, derivados de plantas, que apresentam diversas propriedades e cujo potencial terapêutico é cada vez mais investigado. Recentemente foram isolados alguns destes compostos das folhas da Bauhinia forficata, entre eles o majoritário, canferitrina. Este demonstrou efeito hipoglicemiante em animais diabéticos, além de estimular a captação de glicose no músculo sóleo de ratos. Do caule da espécie Cyathea phalerata também foram isolados flavonóides, sendo o canferol-3-neohesperidosídeo, o predominante e cuja ação hipoglicemiante foi ainda melhor do que da canferitrina. O presente trabalho teve como objetivos estudar o mecanismo de ação do canferol-3-neohesperidosídeo, obtido da Cyathea phalerata, na captação de [14C]DG e no conteúdo de glicogênio muscular e comparar com o efeito estimulatório da insulina. Além disso, estudar o efeito da quercetina e do canferol (aglicona) na captação de [14C]DG e o efeito hipoglicemiante de outro flavonóide isolado da Bauhinia forficata, o canferol 3-O- -L-ramnopiranosil- -D-glicopiranosideo-7-O- -L-ramnopiranosídeo, em ratos diabéticos. Para tanto, foram utilizados ratos Wistar machos entre 50-55 dias de idade. O diabetes foi induzido com 50 mg/kg de aloxana pela via intravenosa. Nos experimentos onde foram estudados os níveis glicêmicos, as dosagens foram realizadas nos tempos 0, 1, 2 e 3 h após a administração do composto pelas vias oral e intraperitoneal. Nos ensaios para determinação do conteúdo de glicogênio os tecidos foram retirados dos animais após 24 h da administração do canferol-3-neohesperidosídeo. A captação de [14C]DG foi estudada após a incubação do músculo sóleo com canferol-3-neohesperidosídeo, insulina, quercetina ou canferol, na presença ou não de diferentes inibidores e do radioisótopo no período de 1 h. A captação de [14C]DG foi estimulada significativamente pelo canferol-3-neohesperidosídeo. Este aumento no transporte de glicose foi semelhante ao apresentado pela insulina, ocorrendo via PI-3K e PKC e independentemente da síntese ativa de proteínas. O conteúdo de glicogênio muscular aumentou aproximadamente 4 vezes nos animais tratados com canferol-3-neohesperidosídeo. A quercetina estimulou a captação de [14C]DG no músculo sóleo de ratos normais, mas não potenciou o efeito estimulatório da insulina e o canferol não demonstrou efeito na captação de [14C]DG. O canferol 3-O- -L-ramnopiranosil- -D-glicopiranosideo-7-O- -L-ramnopiranosídeo não apresentou ação hipoglicemiante significativa em nenhuma das doses e tempos estudados. Destes resultados podemos concluir que o canferol-3-neohesperidosídeo foi tão eficaz e potente quanto a insulina no estímulo da captação de glicose no músculo sóleo. Aparentemente, pelas mesmas vias de sinalização da insulina que levam à ativação da translocação de GLUTs sem interferir na transcrição gênica e síntese protéica neste período agudo de ação. Além disso, foi hábil em aumentar o conteúdo de glicogênio muscular após um período prolongado de tratamento.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Neurociências, Florianópolis, 2013.
Made available in DSpace on 2013-12-05T22:59:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 321218.pdf: 10314943 bytes, checksum: 212309873a422bc62579d82ce541a167 (MD5) Previous issue date: 2013
A glicogênio sintase cinase 3 (GSK3) é uma cinase serina/treonina quefoi primeiramente isolada e purificada como uma enzima capaz defosforilar e inativar a enzima glicogênio sintase. Dentre as diversasfunções reguladas pela GSK3 a inflamação é uma das mais importantes.O presente estudo investigou o efeito do N-(4-metoxibenzil)-N0-(5-nitro-1,3-tiazol-2-il)uréia (AR-A014418), um inibidor específico daGSK3, na nocicepção aguda e crônica e os mecanismos neurobiológicosenvolvidos nesse efeito. O pré-tratamento dos animais com ARA014418(0,01-1 mg/kg, intraperitoneal, i.p., 30 minutos antes)diminuiu a nocicepção aguda induzida pelo ácido acético e ainflamatória (segunda fase) causada pela formalina, sem afetar anocicepção neurogênica (primeira fase) deste teste; e o AR-A014418(0,1-10 µg/sítio) co-injetado intraplantarmente (i.pl.) com a formalinatambém inibiu a segunda fase deste modelo. Além disso, o ARA014418(0,1-100 ng/sítio) injetado intratecalmente (i.t.) foi capaz dediminuir a nocicepção aguda nas duas fases do teste da formalina. A coadministraçãode AR-A014418 intratecalmente (10 ng/sítio) reduziu anocicepção induzida pelo glutamato, N-metil-D-aspartato (NMDA); (±)-1-aminociclopentano-trans-1,3-ácido dicarboxílico (trans-ACPD), fatorde necrose tumoral alfa (TNF-a) e interleucina-1 beta (IL-1ß). Em outrogrupo experimental, o AR-A014418 (0,3 mg/kg, i.p.) também diminuiua nocicepção crônica, caracterizada pela hiperalgesia ao estímulomecânico (filamento de von Frey) e térmico ao frio (placa fria) causadapela ligação parcial do nervo isquiático (PSNL), um modelo de dorneuropática. O efeito antinociceptivo do AR-A014418 foi!!significativamente reduzido pelo pré-tratamento dos animais com PCPA(100 mg/kg, i.p., um inibidor da síntese de serotonina) e AMPT (100mg/ kg, i.p., um inibidor da tirosina hidroxilase), mas não pelaadministração de L-arginina (600 mg/kg, i.p., um precursor do óxidonítrico). Além disso, o AR-A014418 (0,3 mg/kg, i.p.) preveniu oaumento dos níveis das citocinas TNF-a e IL-1ß na medula espinal decamundongos submetidos à PSNL. Finalmente, a administração de ARA014418(0,1-1 mg/kg, i.p.) não afetou a atividade locomotora dosanimais. Coletivamente, estes resultados fornecem evidências de que oAR-A014418, administrado pelas vias sistêmica, periférica e central;diminuiu a nocicepção aguda e crônica em camundongos. O mecanismoda ação antinociceptiva do AR-A014418 está relacionado, direta ouindiretamente, com a inibição dos receptores glutamatérgicosionotrópicos e metabotrópicos e/ou pela inibição de citocinas próinflamatórias(TNF-a e IL-1ß), bem como pela ativação de vias decontrole inibitório descendentes da dor (serotoninérgicas ecatecolaminérgicas). Assim, o presente trabalho demonstra que ainibição da GSK3 pode ser um novo e interessante alvo farmacológicono tratamento da dor aguda e crônica.

Abstract : Glycogen synthase kinase 3 (GSK-3) is a serine/threonine kinase thatwas first isolated and purified as an enzyme capable of phosphorylatingand inactivating the enzyme glycogen synthase. Among the diversefunctions that are regulated by GSK3, inflammation has recentlyemerged as one of the most important. The present study investigatedthe antinociceptive effects of N-(4-methoxybenzyl)-N0 -(5-nitro-1,3-thiazol-2-yl)urea (AR-A014418), a specific inhibitor of GSK3 in acuteand chronic nociception and the neurobiological mechanisms involved.A 30-minute pretreatment with AR-A014418 (0.01-1 mg/kg,intraperitoneal, i.p.) inhibited the nociception induced by an i.p.injection of acetic acid and also decreased the late (inflammatory) phaseof formalin-induced licking, without affecting the responses of the first(neurogenic) phase. In a different set of experiments, AR-A014418 (0.1-10 µg/site) coinjected intraplantarly (i.pl.) with formalin inhibited thelate phase of formalin-induced nociception. Furthermore, AR-A014418intrathecal (i.t.) administration (0.1-100 ng/site) inhibited both phases offormalin-induced licking. In addition, AR-A014418 coinjection (i.t.)inhibited the nociception induced by glutamate, NMDA, (±)-1-aminocyclopentane-trans-1,3-dicarboxylic acid (trans-ACPD), tumornecrosis factor-alpha (TNF-a), and interleukin-1beta (IL-1ß). ARA014418also presented an antihyperalgesic effect on the partial ligationof the sciatic nerve (PSNL), a neuropathic pain model. AR-A014418administered i.p. (0.3 mg/kg) inhibited mechanical (von Frey filament)and cold hyperalgesia (cold plate) induced by PSNL. Pre-administrationof PCPA (100 mg/kg, i.p., inhibitor of serotonin synthesis) and AMPT!!(100 mg/ kg, i.p., inhibitor of tyrosine hydroxylase), but not L-arginine(600 mg/kg, i.p., a nitric oxide precursor), significantly reduced themechanical anti-hyperalgesia elicited by AR-A014418 (0.3 mg/kg, i.p.).Furthermore, the administration of AR-A014418 (0,3 mg/kg)significantly prevented the increase of TNF-a and IL-1ß levels. Finally,intraperitoneal administration of AR-A014418 (0.1-1 mg/kg, i.p.) didnot affect locomotor activity in the open-field test. Collectively, theseresults provide convincing evidence that AR-A014418, given byperipheral, systemic, and central routes, produces antinociception inacute and chronic pain models. The AR-A014418-dependentantinociceptive effects were induced by modulation of the glutamatergicsystem through metabotropic and ionotropic receptors and the inhibitionof the proinflammatory cytokines (TNF-a and IL-1ß), as well asincreases in serotonergic and catecholaminergic pathways. The presentstudy suggests that the inhibition of GSK3 may be a novelpharmacological target for the treatment of acute and chronic pain.

Orientador: Antonio Ari Gonçalves
Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia
Made available in DSpace on 2018-07-22T05:48:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_CarlosAlbertoda_D.pdf: 4885610 bytes, checksum: aedd6b59eb89402aeec23a117f5f0cd9 (MD5) Previous issue date: 1997
Resumo: O objetivo deste trabalho foi avaliar in vivo e in vitro o conteúdo de glicogênio em eritrócitos de ratos, relacionando este conteúdo com as variações na concentração de glicose e/ou hormônios, tendo em vista a sua possível participação na homeostasia glicêmica. Por isso, estendemos este estudo aos eritrócitos de ratos diabéticos e aos efeitos de substâncias como a metformina e fenobarbital utilizadas no tratamento de diabéticos. Eritrócitos de ratos normais (in vivo e in vitro) aumentaram o conteúdo de glicogênio linearmente à elevação da glicemia e depletaram suas reservas durante a hipoglicemia. O conteúdo eritrocitário de glicogênio é maior na veia supra-hepática e nas artérias de que no ramo venoso. Em ratos submetidos a jejum durante 24h, as reservas eritrocitárias de glicogênio foram depletadas, mas recuperam-se parcialmente durante o jejum de 48 h, mostrando um comportamento idêntico ao dos hepatócitos. Em resposta a uma condição indutora de estresse (natação forçada durante 50 min), também houve depleção das reservas hepáticas e eritrocitárias de glicogênio. "In Vitro" a insulina não modificou o conteúdo de glicogênio dos eritrócitos. No entanto, hormônios glicogenolíticos promoveram intensa depleção das reservas; mesmo na presença de altas concentrações de glicose. Eritrócitos de ratos diabéticos, os quais, apresentam redução na captação e no metabolismo de glicose possuem baixo conteúdo de glicogênio e demonstraram baixa capacidade de incorporar glicose às reservas de glicogênio, in vivo e in vitro. Esta capacidade foi restabelecida parcialmente (in vivo e in vitro), pelo tratamento com fenobarbital ou com metformina. De maneira semelhante, o conteúdo de glicogênio no fígado de ratos diabéticos foi restabelecido. Os ratos controle e diabéticos tratados com metformina e fenobarbital não apresentaram redução na glicemia mostrando que o tratamento não induz hipoglicemia. Quanto à concentração plasmática de lactato, não observamos hiperlactatemia nos ratos tratados com metformina. Nossos resultados mostraram que os eritrócitos são importantes reservatórios de glicose, captando-a durante a passagem pelo fígado e distribuindo-a na periferia. Também foi demonstrado que as reservas eritrocitárias de glicogênio são sensíveis a ação dos hormônios glicogenolíticos, à semelhança do que ocorre nos hepatócitos. Esta propriedade dos eritrócitos pode ser importante durante a hipoglicemia. Este trabalho também mostrou diversas semelhanças entre hepatócitos e eritrócitos no que se refere ao metabolismo de carboidratos de ratos normais e diabéticos. A avaliação periódica do conteúdo de glicogênio eritrocitário poderia constituir um bom índice de avaliação das alterações metabólicas (particularmente dos carboidratos) em estudos ou tratamentos que requerem frequente retiradas de amostras e naqueles em que tais amostragens são postergadas para épocas de sacrifícios ou após a morte natural do animal ou sujeito
Abstract: The major objective in the development of this work was demonstrate that erythrocytes participates in the glycemic homeostasis. The following parameters was evalueted in erythrocytes: glucose consumption, glycogen storage, transport and mobilization and transport of lactate/pyruvate. The hepatic storage and mobilization of glycogen in certain condition was studied, too. In vivo, we showed that erythrocyte glycogen content changed according to glycaemia in vessels. Arteriovenous difference and difference between portal and suprahepatic veins in glycogen content is parallel to glycemia differences. These are evidencies for the occurrence of hydrolysis of glycogen and release to plasma when glycemia falls and that erythrocyte take glucose up and synthetize glycogen when crossing the liver. Also, we presented evidences for an exchange of lactate for glucose between erythrocytes and liver. In accordance to the results above mentioned, erythrocytes incubated in saline at 37°C increased, linearly, their content of glycogen with increase in extracellular glucose concentration and reduced it when glucose concentration diminished. 80th, charge and discharge are well correlated to extracellular glucose concentration (r = 0.942), similarly to that measured " in vivo". Stressing condictions, as 24h fasting or heavy exercise (50 min swiming) almost deplete the erythrocytes glycogen content. Those conditions also acutely deplete glycogen liver stores. This response is characteristic of erythrocytes because they responded " in vitro " to hyperglycemic hormones, glucagon (1 U/ml), adrenaline (200 ng.ml-1 noradrenaline (200 ng.ml-1) and corticosterone (22 µg.ml-1 reducing their content of glycogen, even in the presence of high glucose concentration. This resembles the hepatocytes response to the same hormones. On the other hand, insulin do not affect erythrocyte glycogen content. In contrast to normal, erythrocytes from aloxanized rats showed a pronouced reduction in their hability to store glucose as glycogen. This results suggest that glycogen synthesis is deficient in aloxanized rats, even in the presence of high glucose concentration. Metformin and phenobarbital, substances used as coadjuvant for the treatment of diabetes, also stimulated the accumulation of glycogen in diabetic erythrocytes, in vivo and in vitro. This is another similarity between liver and erythrocytes since those substances are known to recovery the hability of liver to sinthetize and store glycogen. Those data confirm in rats the effects observed in human liver. Our data demonstrated that glucose metabolism is defective in erythrocyte from diabetic rats, affecting both free and stored glucose metabolism. As shown in liver and skeletal muscle, this defect is reversed in erythrocytes by treatment with metformin or Phenobarbital
Doutorado
Fisiologia e Biofisica
Doutor em Ciências Biológicas

Orientadores: Fernanda Klein Marcondes, Maria Jose Costa Sampaio Moura
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba
Made available in DSpace on 2018-08-03T18:56:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cunha_TatianadeSousada_M.pdf: 3157497 bytes, checksum: 1ef8facb7f0f8aff10a29cb8b2906f7d (MD5) Previous issue date: 2004
Resumo: A supercompensação do glicogênio é uma das adaptações induzi das pelo treinamento fisico. Visando potencializar este fenômeno, muitos atletas utilizam doses supra-fisiológicas de esteróides anabólicos androgênicos (EAA). Entretanto, o abuso de tais substâncias pode acarretar vários efeitos colaterais. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da nandrolona e do treinamento fisico sobre a supercompensação do glicogênio, bem como o efeito do EAA sobre o tecido hepático. Ratos Wistar machos, com 2 meses de idade, aleatoriamente divididos em quatro grupos experimentais: Sedentário + veículo; Treinado + veículo; Sedentário + EAA; Treinado + EAA, receberam injeção i.m. (2x/semana) de nandrolona (Deca-Durabolin@, 5 mg/Kg) ou veículo (propilenoglicol, 0,2 mL/Kg) durante 6 semanas. Durante este período, os animais treinados foram submetidos a treinamento fisico resistido anaeróbio, através de sessões de saltos em meio líquido. Quarenta e oito horas após a última sessão os animais foram anestesiados e sacrificados para realização das análises. Ao final do experimento, ratos treinados apresentaram menor peso corporal, menores níveis plasmáticos de triglicerídeos e maior concentração hepática de glicogênio, do que os respectivos sedentários. A concentração cardíaca de glicogênio aumentou em resposta à associação do treinamento fisico com EAA e no músculo sóleo em resposta ao tratamento com EAA. Animais treinados tratados com veículo apresentaram maior reserva de glicogênio na porção vermelha do músculo gastrocnêmio do que os respectivos sedentários, e animais sedentários tratados com EAA apresentaram aumento na concentração de glicogênio em relação aos sedentários tratados com veículo. Na porção branca do músculo gastrocnêmio, o treinamento estimulou aumento das reservas de glicogênio e animais sedentários tratados com EAA apresentaram maior concentração de glicogênio do que os sedentários tratados com veículo. A glicemia permaneceu inalterada nos quatro grupos, bem como os níveis séricos das transaminases aspartato aminotransferase (AST/TGO) e alanina aminotransferase (ALT/TGP). O treinamento empregado mostrou-se um recurso eficaz para a redução do peso corporal bem como para o aumento das reservas hepáticas e musculares de glicogênio, principalmente em músculos com predominância de fibras glicolíticas. O uso de doses supra-fisiológicas de EAA potencializou somente alguns destes efeitos sem alterar os níveis das transaminases AST /TGO e AL T /TGP
Abstract: Glycogen supercompensation is one of the adaptations induced by physical training. To potentiate this phenomenon, many athletes use supraphysiological doses of anabolic androgenic steroids (AAS). However, the abuse of these substances can cause many si de effects. Then, the purpose of this study was to evaluate in rats the influence of nandrolone and physical training on glycogen supercompensation, and the effect of AAS on hepatic tissue. Male Wistar rats, 2 months old, randomly divided into four experimental groups: Sedentary + vehicle; Trained + vehicle; Sedentary + AAS; Trained + AAS, received intra-muscular injections (2x/week) ofnandrolone (Deca-Durabolin@, 5 mg/Kg) or vehicle (propilenglycol, 0,2 mL/Kg) during 9 weeks. During this period, trained animaIs were submitted to anaerobic physical training, using a protocol of jumping up and down in water carrying an overload. F orty-eight hours after the last exerci se session animaIs were anesthesiated and sacrificed to do the analysis. In the end of the experimental period, trained rats presented lower body weight and plasmatic triglycerides levels and higher hepatic glycogen content than the respective sedentary. Cardiac glycogen content enhanced in response to the association between physical training and AAS administration, and on soleus it enhanced in response to the treatment with AAS. Trained animaIs treated with vehicle presented higher glycogen content on gastrocnemious red portion than the respective sedentary, and sedentary animais treated with AAS presented higher glycogen concentration than the sedentary treated with vehicle, on the same muscle. On gastrocnemious white portion, physical training enhanced glycogen content, and sedentary animais treated with AAS presented higher glycogen concentration than the sedentary treated with vehicle. Blood glucose was not altered, as well as seric levels of glutamate oxalate transaminase (GOT) and glutamate pyruvic transaminase (GPT). The protocol of physical training used in this experiment was efficient to reduce body weight and to enhance hepatic and muscle glycogen content, mainly on muscles with predominance of white fibers. The use of supraphysiological doses of AAS potentiated only some of these effects with no alteration of seric transaminases levels
Mestrado
Fisiologia Oral
Mestre em Odontologia

Orientadores : Edi Lucia Sartorato, Denise Yvone Janovitz Norato
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas
Made available in DSpace on 2018-07-31T15:03:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Caldas_HeloisaCristina_M.pdf: 16831040 bytes, checksum: 18bbddcc1afb7e9b973df9e22e2bc68b (MD5) Previous issue date: 2001
Resumo: As doenças de depósito de glicogênio (GSD) incluem aproximadamente 12 tipos, onde existe falta de uma ou de diversas enzimas que metabolizam o glicogênio normal e são também chamadas de glicogenoses. Os acúmulos intracelulares do glicogênio afetam principalmente células hepáticas, renais, músculo cardíaco e esquelético. As diferentes formas de GSD foram classificadas de acordo com a ordem cronológica em que os defeitos enzimáticos foram identificados. A GSDI compreende um grupo de doenças raras, com padrão de herança autossômico recessivo apresentando grande heterogeneidade clínica e bioquímica. Existem dois principais subgrupos, GSDIa e Ib, confirmados em nível molecular. O subtipo Ia se refere à deficiência da enzima glicose-6-fosfatase (G6Pase), enzima responsável pela manutenção da glicose sanguínea; a GSDIb relacionada à deficiência da glicose-6-fosfato translocase (G6PTl) responsável pelo transporte da glicose-6-fosfato para o lúmen do retículo endoplasmático, onde a unidade catalítica da G6Pase está situada. Outros subgrupos menos comuns foram também identificados, tais como o subgrupo Ic que envolve o transporte de fosfato e pirofosfato e, finalmente, Id que envolve a enzima responsável pelo retomo da glicose do lúmen do retículo para o citosol, existindo, no entanto, controvérsia com relação à classificação desses últimos subtipos. A GSDID é causada pela deficiência da enzima bifuncional AGL, uma proteína monomérica com dois sítios catalíticos diferentes: oligo-l, 4-1,4 glucontransferase e amilo-1,6-glucosidase, e para o funcionamento normal, ambas as atividades são requeridas. A enzima AGL combinada à ação da fosforilase é responsável pela completa degradação do glicogênio. Devido à heterogeneidade clínica dos tipos I e m, durante a infância é difícil se diferenciar clinicamente as duas formas, ambas apresentando sintomas similares de hepatomegalia, hipoglicemia, hiperlipidemia,retardo de crescimento entre outros. Neste trabalho foram estudados 14 indivíduos com sinais clínicos sugestivos de GSDI onde não foram encontradas alterações no gene da G6Pase, responsável pelo subtipo Ia, esses pacientes são, portanto classificados como tipo I non-Q. O gene G6PTl foi seqüenciado completamente em todos os pacientes estudados e dois deles foram diagnosticados em nível molecular como sendo na verdade GSDIb. Foram estudados 6 exons do gene AGL, onde estão localizadas a maioria das mutações descritas até o momento no gene, e somente foram detectados polimorfismos em todos os indivíduos estudados. O protocolo molecular desenvolvido no presente trabalho mostrou-se adequado para o rastreamento de mutações, apesar de terem sido diferenciados molecularmente somente dois indivíduos com subtipo Ib
Abstract: There are 12 types of glycogen storage disease (GSD). There disease are characterized by the absence of one or many of enzymes called glycogenoses, which are responsible for normal glycogen metabolismo The intracelular increase of glycogen mainly affects hepatic, kidney, cardiac and squeletic muscle cells. GSDs have been classified according to the cronological order in which enzymatic defects were identified. GSDI includes a group of rare disease of autosomal recessive disorders and clinical and biochemical heterogeneity. There are two main subgroups GSDIa and Ib. A diagnosis can only be confirmed by molecular studies. Subtype Ia is caused by a deficiency glucose-6-phosphatase (G6Pase), is responsible for the mantainance of blood glucose homeostasis. Subtype Ib results trom a deficiency of the glucose-6-phosphate translocase enzyme. This enzyme transports glucose-6-phosphato into the lumen ofthe endoplasmic reticulum, where the G6Pase catalitic site situated. Such as Ic and Id have also been identified. Subtype Ic is related to phosphate and pyrophosphate transporter and Id is related to the enzyme responsable for glucose transport trom lumen to cytosol. GSDm is caused deficiency of bifunctional enzyme (AGL) is a monomeric protein, with both amylo-l,6-glucosidase and 0Iigol,4-1,4 glycosyl transferase activity at two separate catalytic sites. The AGL enzyme, together with phosphorylase, is responsible for degradation of glycogen. During infancy, type m disease may be almost indistinguishable from type I disease, as hepatomegaly, hypoglycemia, hyperlipidemia, and growth retardation are similar predominant features. In the present study, we report molecular and clinical finding in 14 patients with suggestive clinical symptoms of GSDI which didn't be found mutations in the G6Pase gene, responsable by subtype Ia, these patients are thus, classifieds as type I non-a. DNA sequencing of the exons ofthe G6PTl in 14 patients mutations in the G6PTl gene were found in two patients. Six exons of AGL gene were studied, which are found the majority of describe mutation, and just be found polymorphism in all studieds individuals. The molecular protocol that was studied, showed suitable to mutation screemng, whowever to be were find only two individuals with subtype Ib
Mestrado
Ciencias Biomedicas
Mestre em Ciências Médicas

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:05Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-08-15Bitstream added on 2014-06-13T19:49:46Z : No. of bitstreams: 1 virgilio_s_me_araiq_parcial.pdf: 346426 bytes, checksum: b52f7a11a59780ad34a571ead7eb48c6 (MD5) Bitstreams deleted on 2015-06-03T11:42:46Z: virgilio_s_me_araiq_parcial.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2015-06-03T11:44:11Z : No. of bitstreams: 1 000713098_20150815.pdf: 331522 bytes, checksum: 24d4cb0ce1bd6719c247a8fd735ff6d2 (MD5) Bitstreams deleted on 2015-08-17T11:07:13Z: 000713098_20150815.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-17T11:07:57Z : No. of bitstreams: 1 000713098.pdf: 1996543 bytes, checksum: 874f4dd2c6c18ce24b3770e47bc254d6 (MD5)
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)
Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)
O fungo filamentoso Neurospora crassa é um organismo modelo utilizado na compreensão de diversos aspectos da biologia dos eucariotos, e tem sido usado, em nosso laboratório, para estudos celulares básicos, como os mecanismos bioquímicos e moleculares envolvidos na regulação do metabolismo de glicogênio. Uma análise sistemática realizada com uma coleção de linhagens mutantes em genes codificadores de fatores de transcrição permitiu identificar várias proteínas potencialmente envolvidas na regulação do metabolismo do glicogênio neste organismo. Algumas linhagens mutantes apresentaram alterações no perfil de acúmulo de glicogênio e na expressão dos genes que codificam as enzimas glicogênio sintase (gsn) e glicogênio fosforilase (gpn) quando comparadas à linhagem selvagem. Dentre estas, duas linhagens mutantes em genes que codificam para a proteína RCO-1 (regulator of conidiation-1) e para uma proteína hipotética foram selecionadas para o presente estudo, levando em consideração que ambas linhagens também apresentaram variações na progressão do ciclo celular quando analisadas por citometria de fluxo. Como a proteína RCO-1 é uma provável parceira da proteína RCM-1 (regulator of conidiation and morphology-1), então a linhagem mutante no gene codificador de RCM-1 foi incluída neste trabalho. Portanto, foi feita a caracterização de um fator de transcrição anotado como proteína hipotética e de dois cofatores transcricionais RCO-1 e RCM-1, ortólogos ao complexo corepressor Tup1-Ssn6 de Saccharomyces cerevisiae. As proteínas RCO-1, RCM-1 e a codificada pela ORF NCU09739 estão envolvidas na regulação do metabolismo do glicogênio, atuando na regulação da expressão dos genes gsn e/ou gpn. Estas mesmas proteínas também são necessárias para o crescimento e desenvolvimento normal do...
The filamentous fungus Neurospora crassa is a model organism used to understand various aspects of eukaryotic biology. It has been used, in our laboratory, in basic cellular studies, such as the biochemical and molecular mechanisms involved in the regulation of glycogen metabolism. A systematic analysis performed with a collection of mutant strains in genes encoding transcription factors led to the identification of proteins likely involved in the regulation of glycogen metabolism in this organism. Some mutant strains showed changes in the glycogen accumulation profile and in the expression of the genes encoding the enzymes glycogen synthase (gsn) and glycogen phosphorylase (gpn) when compared to the wild-type strain. Among these, two mutant strains in the genes encoding RCO-1 (regulator of conidiation-1) and a hypothetical proteins were selected for the present study. Both strains presented variations in cell cycle progression when analyzed by flow cytometry. RCO-1 protein is likely a partner of RCM-1 (regulator of conidiation and morphology-1) protein, thus the mutant strain in the gene encoding RCM-1 was included in this work. Therefore, we performed the characterization of a transcription factor annotated as a hypothetical protein and the two transcriptional cofactors RCO-1 and RCM-1, orthologs of the Saccharomyces cerevisiae corepressor complex Tup1-Ssn6. RCO-1, RCM-1 and the product of the ORF NCU09739 are involved in the regulation of glycogen metabolism, acting in the regulation of gsn and/or gpn gene expression. The same proteins are necessary for growth and normal development of the fungus, since the mutant strains showed changes in hyphae length, pigmentation and conidiation. Gene expression analysis showed that the NCU09739 gene was highly expressed at the beginning of the conidia germination, showing the importance... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2015-06-17T19:34:32Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-07-24. Added 1 bitstream(s) on 2015-06-18T12:48:38Z : No. of bitstreams: 1 000810781.pdf: 632378 bytes, checksum: cae110de7addc333397c5c0be577d1ef (MD5)
O glicogênio muscular é uma importante fonte de energia e uma fator potencialmente limitante do desempenho equino. Devido ao grande número de estudos usando concentrados de baixo amido e alta fibra e gordura para o manejo de distúrbios metabólicos, o uso de tais concentrados se tornou prática popular. Entretanto, há pouca evidência sobre a eficiência de tais concentrados sobre a manutenção e a reposição das concentrações de glicogênio muscular. Para avaliar o efeito de três dietas com conteúdo diferente de amido sobre a manutenção do glicogênio muscular durante um período de treinamento e sobre a repleção das reservas de glicogênio após exercício de alta intensidade, seis cavalos Puro-Sangue Inglês previamente condicionados fisicamente foram usados em um delineamento Quadrado Latino 3x 3. Os cavalos receberam 1 kg/100 kg de PV/dia de um concentrado com conteúdo de amido alto (HS), moderado (MS) ou baixo (LS). A forragem foi fornecida a uma taxa de 1.25 kg/100 kg PV/dia em todos os tratamentos. Os cavalos foram treinados por 3 semanas e então foram submetidos a três dias de exercício intenso programado para depletar substancialmente as reservas de glicogênio, e foram subsequentemente observados durante 4 dias de recuperação. Biópsias musculares foram obtidas antes da depleção e O, 24, 48 e 72 horas após a depleção. O primeiro dia de depleção consistiu em um teste incremental (IET) e sangue foi amostrado a cada etapa de velocidade para análise de glicose e lactato. Durante o IET os cavalos usaram uma máscara para verificação do consumo de Oxigênio (V02), da produção de Dióxido de Carbono (VCO2) e do coeficiente respiratório (RER). Um teste submáximo de esforço foi realizado antes e depois da depleção das reservas de glicogênio para investigar alterações na utilização dos substratos energéticos em função da depleção. A glicose plasmática e o RER ...
Muscle glycogen is an important energy substrate and a potentially limiting factor of performance in horses. Due to the large number of studies using low-starch, high-fat and fiber concentrates for the management of metabolic diseases, the use of such feeds has become widely popular. However, there is scarce evidence of the effectiveness of such feeds on glycogen maintenance and replenishment. To evaluate the effect of three diets varying in starch content on the maintenance of glycogen leveis during a training period and on repletion of glycogen stores after high-intensity exercise, six previously conditioned Thoroughbred horses were used in a 3 x 3 Latin Square design. Horses were fed (at 1 kg/100kg BW/day) either a high-starch (HS), a moderately starch-rich, high-fat concentrate (MS) or a low-starch, high-fat and fiber concentrate (LS). Forage was fed at 1.25 kg/100 kg BW/day in ali treatments. Horses were trained for three weeks and then underwent three days of strenuous exercise designed to substantially deplete glycogen reserves, and were subsequently observed over four days of recovery. Muscle biopsies were obtained before depletion and at 0, 24, 48 and 72 hours post-depletion. Day one of depletion was an incremental exercise test (IET) and blood was sampled at each speed step for plasma glucose and lactate. During the IET horses wore a loose-fit mask for assessment of Oxygen consumption (V02), Carbon Dioxyde production (VCO2) and Respiratory Exchange Ratio (RER). A submaximal exercise test was performed both before and after depletion of glycogen reserves to verify alterations in energy substrate utilization due to depletion. Plasma glucose, lactate and RER during the IET were not different among treatments. RER during the submaximal exercise test were lower for the LS treatment (P<0.05). Post-depletion RER for HS and MS were different from pre-depletion RER in the submaximal test ...

Rhipicephalus (Boophilus) microplus é um parasita que infesta bovinos causando grandes perdas na pecuária. O método convencional para o controle é através do uso de produtos químicos. Esses produtos causam a seleção de carrapatos resistentes a acaricidas e a poluição do meio-ambiente. Uma abordagem alternativa tem sido testada, o qual inclui o uso de vacinas. Entretanto, o sucesso dessa estratégia é dependente da caracterização de antígenos do carrapato. A Glicogênio Sintase Quinase-3β (GSK-3β) é uma serina\treonina quinase que está envolvida no metabolismo do glicogênio, durante a embriogênese do carrapato. O estudo da embriogênese do carrapato é fundamental no desenvolvimento de novas metodologias propostas para o controle desses vetores. A interferência na embriogênese pode resultar em um decréscimo na viabilidade dos ovos ou até em uma letalidade precoce. Nesse trabalho, a região codificadora da GSK-3β do carrapato foi obtida através do 5’RACE, 3’RACE. A transcrição relativa do gene da GSK-3β em ovário de carrapato foi maior quando comparado com intestino e corpo gorduroso, sugerindo que a GSK-3β está envolvida no desenvolvimento de oócitos. Na embriogênese a transcrição relativa do gene da GSK-3β começou no 1º dia de postura com um aumento gradual até 15º dia. No 18º dia ocorre um declíneo e depois a transcrição relativa do gene aumentou novamente, indicando que a GSK-3β teria alguma função relacionada com o final de embriogênese. A transcrição relativa do gene da GSK-3β em células embrionárias do carrapato (BME26) aumentou com o tratamento de insulina. Quando tratadas com tirfostin (inibidor do receptor de insulina), SB216763 (inibidor específico da GSK-3), e wortimanina (inibidor da PI3K) a transcrição relativa do gene foi semelhante ao controle. O alsterpaullone (inibidor específico da GSK-3) inibiu o desenvolvimento dos embriões tanto em fêmeas injetadas com o inibidor como em fêmeas alimentadas artificialmente, sugerindo que a GSK-3β seria crucial para o desenvolvimento embrionário.
Rhipicephalus (Boophilus) microplus is a parasite that infests bovines causing losses in cattle production. The conventional method for control is the use of synthetic chemical products. These products cause the selection of acaricideresistant ticks and pollution of the environment. A range of alternative approaches have been taken, which include the use of vaccine. However, the success of this strategy is dependent on the characterization of the tick antigens. The Glycogen Synthase Kinase (GSK-3β) is a serine/threonine kinase that is involved in glycogen metabolism during tick embryogenesis. The tick embryogenesis studies have played a fundamental role in designing new methodologies proposed for the control of these vectors. Interference on embryogenesis can result in the decrease of the egg’s viability or even in early lethality. In this work, the full length cDNA encoding the GSK-3β protein of the tick has been obtained by 5'-RACE and 3'- RACE. The relative transcription of GSK-3β gene in ovaries was higher when compared with gut and fat body, suggesting that GSK-3β was involved in the oocytes development. In the embryogenesis the relative transcription of the GSK- 3β gene started on 1st day with gradual increase until a peak at 15th day post oviposition. In 18th day occured a decline and after the relative transcription increase again. Probably the GSK-3β has some function related with final embryogenesis. The relative transcription of GSK-3β gene in cells BME26 when treated with insulin increased. When treated with tyrphostin, wortimanin and SB216763 did not increase. The alsterpaullone, GSK-3β specific inhibitor, blocks the embryo development of females ticks injected with the inhibitor and with artificial capillary feeding method, suggesting that GSK-3β could have a crucial function in the embryo development.

Com intuito de esclarecer a associação do ganho de peso do feto no ato da tosquia, fato este, que diminui a taxa de mortalidade ao nascer, utilizamos vinte e uma ovelhas da raça merino australiano, divididos em 2 grupos com 10 integrantes cada: um tosquiado (OT) aos 70 dias do período gestacional e um segundo mantido como controle (ONT). Destas fêmeas durante o período final de gestação retirou-se a placenta e o feto através do procedimento cirúrgico segundo técnica cesariana convencional. Para efeito comparativo mensurou-se inicialmente as características morfométricas da placenta e dos fetos. Como caracterização da placenta quantificamos o número de placentônios e suas medidas. As amostras de placenta foram fixadas e processadas para microscopia de luz, com inclusão em parafina. A quantificação do glicogênio foi obtida com a mensuração de 5 campos randômicos de cada lâmina produzida seqüencialmente. As análises foram realizadas por efeito comparativo de diferença de coloração por reação histoquímica de P.A.S. Para análise estatística foi utilizado o teste T normal comparativo entre médias. Os resultados macroscópicos indicaram que o tratamento da tosquia não aumentou significativamente os pesos placentários e fetais, e tão pouco as medidas referentes ao placentônio. Nas análises microscópicas, a quantidade média de glicogênio entre as áreas quantificadas no placentônio não apresentaram diferenças significativas, já no fígado na região da tríade portal e no músculo reto houve diferença entre os animais tosquiados e os não tosquiados. Com isto podemos concluir que a tosquia realizada aos 70 dias do período gestacional influência no acumulo de glicogênio no fígado e no músculo reto femural, podendo ser estes os fatos responsáveis pelo aumento do peso dos fetos ao nascer.
In order to clarify the association of weight increase of the fetus in the act of shorn, and remembered that this fact decreases the rate of mortality at birth we tested twenty Merino australian sheep. Animals were divided into 2 groups with 10 members each: shorn (OT) to 70 days of gestational period and a second kept as control (ONT). The placenta and fetus were removed by a surgical procedure of caesarean, according conventional technique. As characterization of the placenta quantification of the placentome numbers and their measures. Samples of placenta were fixed and routinely processed for the light microscopy, with inclusion in paraffin. The quantification of glycogen was obtained with the measurement of 5 fields in each slides produced sequentially. The tests were conducted by comparative effect of a difference in color between the slides and the area covered by the histochemistry PAS reaction For statistical analysis was used the T test (student) and comparison between normal averages. The macroscopic results indicated that the treatment of shorn not significantly increased the fetal and placental weights, and so little measures regarding placentomes. The microscopic analysis, shows that the average between the areas of glycogen quantified in placentome were not different (P <0.05). Already in the liver at the portal triad region and in the rectus femoris muscle were found a significant increase of glycogen deposits (P <0.05). With this results we can conclude that the shorn done at 70 days of gestational period influence on the accumulation of glycogen in the liver and muscle of the fetuses and thus increase the weight of them at birth.

As Glicogenoses Hepáticas são erros inatos do metabolismo do glicogênio. O fenótipo depende do subtipo de doença e do controle metabólico, porém as características principais são: retardo de crescimento, baixa estatura, face arredondada ("boneca"), hepatomegalia, hipoglicemia, hiperlactatemia, hipercolesterolemia e hipertrigliceridemia. O tratamento inclui a controle dietético com restrição de carboidratos simples (frutose, maltose, glicose, lactose, galactose), administração de amido de milho cru diversas vezes ao dia, incluindo o período noturno, além de acompanhamento de parâmetros clínicos e laboratoriais. A prevalência de dificuldades alimentares e distúrbio miofuncional orofacial nesses pacientes é desconhecida. Objetivo: Investigar a prevalência de dificuldades alimentares e distúrbio miofuncional orofacial em pacientes com Glicogenose Hepática. Métodos: Trata-se de um estudo transversal, prospectivo com coleta de dados históricos, de 36 indivíduos com diagnóstico confirmado de glicogenose hepática (tipo Ia=22, Ib=8, III=2, IXa=3; IXc=1; sexo masculino=19; mediana de idade=12.0 anos (8.0-18.7). Todos os pacientes estavam em tratamento com médico geneticista e nutricionista. A avaliação incluiu: questionário para avaliação do comportamento alimentar, avaliação miofuncional orofacial (AMIOFE), percepção olfativa (Sniffin Sticks) e gustativa (Taste Strips), antropometria facial. Resultados: Nove (25%) pacientes apresentaram diminuição da percepção olfativa, 4 (11%) da gustativa, 8 (22.2%) de gustativa para o azedo. Vinte e seis pacientes (72.2%) apresentaram dificuldade alimentar e 18 (50%) apresentaram distúrbio miofuncional orofacial. A mediana de escore miofuncional orofacial foi 87.5 (83.0-92.7). distúrbio miofuncional orofacial esteve estatisticamente associado à dificuldade alimentar, via alternativa de alimentação, seletividade alimentar, preferência por alimentos líquidos/pastosos, estresse nas refeições (p<0.05). Treze pacientes 9 (36.1%) apresentaram respiração oral/oronasal, estando associado com seletividade alimentar (p=0.011) e com realizar refeições separadamente da família (p=0.041). Menores escores nas funções de deglutição e de mastigação estiveram relacionados à dificuldade alimentar, (respectivamente p=0.001, p=0.009) e a questões específicas relacionadas ao comportamento alimentar. Conclusão: A prevalência de dificuldades alimentares e distúrbio miofuncional orofacial em indivíduos brasileiros com Glicogenose Hepática é alta. Comportamento alimentar, diminuição do paladar e olfato e aspectos miofuncionais orofaciais estão associados na Glicogenose Hepática.
The hepatic glycogen storage diseases are innate errors of glycogen metabolism. The phenotype depends on the disease subtype and extent of metabolic control, but the major features include growth retardation, short stature, rounded (“doll’s”) face, hepatomegaly, hypoglycemia, hyperlactatemia, hypercholesterolemia, and hypertriglyceridemia. The treatment includes restricted intake of simple carbohydrates (fructose, maltose, glucose, lactose, galactose), administration of uncooked cornstarch several times a day, including overnight; and management of clinical and laboratory parameters. The prevalence of feeding difficulties and orofacial myofunctional disorders in these patients is unknown. Objective: To ascertain the prevalence of feeding difficulties and orofacial myofunctional disorders in patients with GSD. Methods: This was a cross-sectional, prospective study of 36 patients (19 males, 17 females; median age, 12.0 years; range, 8.0–18.7 years) with confirmed diagnoses of GSD (type Ia, n=22; Ib, n=8; III, n=2; IXa, n=3; IXc, n=1). All patients were being treated by a medical geneticist and a dietitian. Evaluation included a questionnaire for evaluation of feeding behavior, the orofacial myofunctional evaluation (AMIOFE), olfactory performance (Sniffin’ Sticks test), taste perception (Taste Strips), and facial anthropometry. Results: Nine (25%) patients had decreased olfactory perception and four (11%) had decreased taste perception. Eight patients (22.2%) had decreased perception of sour taste. Twenty-six patients (72.2%) had feeding difficulties, and 18 (50%) had orofacial myofunctional disorders. The median orofacial myofunctional score was 87.5 (83.0–92.7). Orofacial myofunctional disorders was significantly associated with feeding difficulty, alternative feeding routes, food selectivity, preference for fluid and semisolid foods, and mealtime stress (p<0.05). Thirteen patients (36.1%) exhibited mouth breathing or oronasal breathing, which was significantly associated 11 with food selectivity (p=0.011) and not eating together with the rest of the family (p=0.041). Lower swallowing and chewing scores were associated with feeding difficulty (p=0.001 and p=0.009, respectively) and with specific issues related to eating behavior. Conclusion: There is a high prevalence of feeding difficulties and orofacial myofunctional disorders in patients with hepatic glycogen storage diseases. Eating behavior, decreased taste and smell perception, and orofacial myofunctional issues are associated with hepatic glycogen storage diseases.

Made available in DSpace on 2014-12-02T11:16:38Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-02-18Bitstream added on 2014-12-02T11:21:06Z : No. of bitstreams: 1 000773336_20190218.pdf: 311514 bytes, checksum: 3013fb73613f9ad6df44d3e85824afe7 (MD5)
O fungo filamentoso Neurospora crassa é um organismo modelo amplamente utilizado para estudos de diversos aspectos da biologia dos eucariotos. Nosso laboratório tem utilizado este fungo para estudar os mecanismos moleculares e bioquímicos envolvidos na regulação do metabolismo de glicogênio. A avaliação de uma coleção de linhagens mutantes individualmente nocauteadas em genes que codificam fatores de transcrição permitiu identificar várias proteínas potencialmente envolvidas na regulação do metabolismo de glicogênio do fungo N. crassa. Dentre as proteínas, o fator de transcrição FLBC foi identificado como uma possível proteína regulatória do metabolismo de glicogênio. A linhagem mutante apresentou alterações no perfil de acúmulo de glicogênio e na expressão do gene gsn em relação à linhagem selvagem, quando submetidas a estresse térmico. Estudos preliminares realizados anteriormente em nosso laboratório mostraram severas alterações morfológicas na linhagem flbCKO, como reduzida capacidade de conidiação, com a presença de poucos microconídios, formação de hifas aéreas reduzidas, morfologia das extremidades das hifas alterada, aspecto e morfologia alterados das colônias e produção acentuada do pigmento melanina, indicando que a proteína FLBC desempenha importante papel no desenvolvimento do fungo. O fator de transcrição FLBC, objeto de estudo deste trabalho, é uma proteína homóloga às proteínas FlbC e FLE1 dos fungos Aspergillus nidulans e Podospora anserina, respectivamente, ambas envolvidas nos processos de conidiação e desenvolvimento dos fungos. O objetivo deste trabalho foi realizar uma caracterização funcional detalhada deste fator de transcrição em N. crassa. Análises de expressão gênica mostraram níveis elevados do transcrito flbC durante o crescimento vegetativo do fungo e após a indução do desenvolvimento assexual. A linhagem nocaute mostrou uma desregulação...
The filamentous fungus Neurospora crassa is a model organism widely used for studies of several aspects of the biology in eukaryotes. We have been studying the molecular and biochemical mechanisms involved in glycogen metabolism regulation in this fungus. The screening of a knocked-out strains set in genes encoding transcription factors has identified many proteins likely involved in the regulation of glycogen metabolism in the fungus N. crassa. Among the proteins, the transcription factor FLBC was identified as a regulatory protein of the glycogen metabolism. The mutant strain showed changes in the glycogen accumulated and in the gsn gene expression when compared to the wild-type strain under heat stress. Preliminary studies carried out in our laboratory showed severe morphological changes in the strain flbCKO, such as reduced ability to conidiate, presence of a few microconidia, reduced production of aerial hyphae, altered morphology of hyphae tips, changes in the colonies morphology and high production of the pigment melanin, suggesting that FLBC plays an important role in the fungus development. The transcription factor FLBC, object of study in this work, is the Aspergillus nidulans and Podospora anserina FlbC/FLE1 homologous protein, respectively, both involved in conidiation and fungal growth. The purpose of this study was to perform functional characterization of this transcription factor in N. crassa. Analysis of gene expression showed high levels of the transcript flbC during vegetative growth and after induction of asexual development. The knockout strain presented a misregulation in the accumulation of reserve carbohydrate (glycogen and trehalose) during vegetative growth accumulating higher levels of both carbohydrates as compared to the wildtype strain. Analysis of gene expression in the strains wild-type and flbCKO showed that gdn (encoding for debranching enzyme) and gpn (encoding glycogen phosphorylase) genes are...

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Farmácia, Florianópolis, 2009.
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A diabetes é considerada uma patologia complexa e multifatorial de elevada morbidade e mortalidade e, por esse motivo, é considerada um problema significativo de saúde pública mundial. É caracterizada por distúrbios no metabolismo de carboidratos, proteínas e lipídios resultantes da absoluta ou relativa insuficiência na secreção e/ou ação da insulina. A classificação da diabetes melito está baseada na etiologia da doença e a divide clinicamente em duas formas básicas: tipo 1 e tipo 2 sendo que, a diabetes melito tipo 2 é a forma prevalente da doença estando presente em 90 a 95% dos casos. Muitas plantas são conhecidas na medicina popular de diferentes culturas pelas propriedades hipoglicemiantes e pelo uso crescente no tratamento da diabetes. Flavonóides são compostos fenólicos, derivados de plantas, que apresentam diversas propriedades e cujo potencial terapêutico é cada vez mais investigado. O presente trabalho teve como objetivos estudar os efeitos do extrato bruto, frações e compostos isolados das folhas da Averrhoa carambola na glicemia, na secreção de insulina e no conteúdo de glicogênio em ratos normais hiperglicêmicos. Além disso, estudar o mecanismo de ação do canferol-3-neohesperidosídeo, obtido da Cyathea phalerata, bem como da apigenina-6-C- -L-fucopiranosídeo (composto 1) e da apigenina-6-C-(2"-O- -L-ramnopiranosil)- -L-fucopiranosídeo (composto 2) na síntese de glicogênio muscular e na captação de glicose e comparar com o efeito estimulatório da insulina. Para tanto, foram utilizados ratos Wistar machos entre 50-55 dias de idade. Para a realização da curva de tolerância à glicose as coletas de sangue foram realizadas nos tempos zero, 15, 30, 60, 120 e 180 minutos. Nos ensaios para a determinação do conteúdo de glicogênio os tecidos foram retirados dos animais após 3 h da administração dos flavonóides. A síntese de glicogênio muscular e a captação de glicose foram estudadas após a incubação do músculo sóleo com os respectivos flavonóides e/ou insulina, na presença ou não de diferentes inibidores e do radioisótopo no período de 1 h. O extrato bruto, as frações acetato de etila, n-butanol e os flavonóides apigenina-6-C- -L-fucopiranosídeo (composto 1) e apigenina-6-C-(2"-O- -L-ramnopiranosil)- -L-fucopiranosídeo (composto 2) reduziram significativamente a glicemia de ratos normais hiperglicêmicos e potencializaram a secreção de insulina induzida por glicose. Além disso, os compostos 1 e 2 aumentaram o conteúdo de glicogênio no músculo sóleo e fígado após os tratamentos. A síntese de glicogênio foi estimulada significativamente pelo canferol-3-neohesperidosídeo e pela apigenina-6-C- -L-fucopiranosídeo. Este aumento foi mediado através da via da PI3K-PKB-GSK-3 e MAPK-PP1. A apigenina-6-C-(2"-O- -L-ramnopiranosil)- -L-fucopiranosídeo (composto 2) estimulou a captação de glicose no músculo sóleo através de uma via, pelo menos parcialmente comum, à via de sinalização da insulina. Os resultados da ação dos flavonóides estudados neste trabalho na regulação da homeostasia da glicose, em estudos in vivo e in vitro, demonstram o potencial efeito insulino-mimético e/ou anti-hiperglicêmico destes compostos.

Orientador: Maria Célia Bertolini
Resumo: Glicogênio representa um dos principais carboidratos de reserva em muitos organismos e seu metabolismo está sob o controle de um complexo mecanismo envolvendo o balanço de nutrientes e sinais ambientais. A proteína glicogenina constitui a molécula iniciadora do processo de síntese de glicogênio, sendo as etapas seguintes efetuadas pelas enzimas glicogênio sintase e enzima ramificadora. Glicogênio sintase é a enzima limitante no processo e é regulada alosterismo e fosforilação reversível. Neste trabalho foi realizada uma caracterização do metabolismo de glicogênio no fungo N. crassa enfocando as enzimas glicogenina, glicogênio sintase e glicogênio sintase quinase-3. A proteína glicogenina (GNN) foi caracterizada do ponto de vista molecular, bioquímico e funcional. O cDNA codificando para esta proteína foi isolado e a seqüência polipeptídica deduzida mostrou uma proteína de 664 aminoácidos, uma das maiores proteínas glicogenina já isoladas. A inativação do gene gnn resultou em uma linhagem mutante incapaz de acumular glicogênio. A produção da proteína GNN em E. coli resultou em um polipeptídeo altamente susceptível à proteólise e formas truncadas da proteína mostraram ser mais estáveis e igualmente ativas nos processos de auto- e trans-glicosilação, além de servirem de substrato para ação da glicogênio sintase. Tais formas também foram capazes de complementar funcionalmente mutantes de S. cerevisiae. Além disso, a expressão do gene gnn foi mostrado ser regulado durante crescimento vegetativo e deprivação de carbono. Os resíduos Tyr196 e Tyr198 foram identificados como os sítios de glicosilação, os quais contribuem diferencialmente para este processo. Análise das interações entre GNN e a proteína glicogênio sintase de N. crassa (GSN) demonstrou que a região C-terminal da GNN é a mais importante para a interação. Entretanto, o...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo)
Abstract: Glycogen represents one of the main reserve carbohydrates in many organisms and its metabolism is under control of a complex mechanism involving the balance of nutrients and environmental signals. The protein glycogenin is the initiator molecule in glycogen biogenesis and the subsequent steps are carried out by the enzymes glycogen synthase and branching enzyme. Glycogen synthase is the rate-limiting enzyme in the process and is regulated both by alosterism and reversible phosphorylation. In this work we performed a characterization of the glycogen metabolism in the filamentous fungus Neurospora crassa, focusing on the enzymes glycogenin, glycogen synthase and glycogen synthase kinase-3. The protein glycogenin (GNN) was characterized under the molecular, biochemical and functional aspects. The cDNA encoding for this protein was isolated and the deduced polypeptide sequence showed a protein with 664 residues, one of the largest glycogenins isolated so far. The inactivation of the gnn gene rendered a mutant strain that was no longer able to accumulate glycogen. The production of GNN protein in E. coli cells resulted in a polypeptide highly susceptible towards proteolysis and truncated forms were more stable and equally active, judged by their abilities to self- and trans-glucosylate, and to serve as substrate for glycogen synthase elongation. These proteins were also able to recover the glycogen deficiency phenotype in a S. cerevisae mutant strain. Moreover, the gnn gene expression was shown to be ...(Complete abstract, click electronic access below)
Doutor

Orientador: Maria Célia Bertolini
Banca: Marcia Aparecida Silva Graminha
Banca: Marcos Roberto Mattos Fontes
Resumo: O fungo filamentoso Neurospora crassa é um organismo modelo muito utilizado para estudos de diversos aspectos da biologia dos eucariotos. Nosso laboratório tem utilizado este fungo para o estudo dos mecanismos moleculares e bioquímicos da regulação do metabolismo de glicogênio. A presente proposta de trabalho é uma consequência de experimentos anteriores realizados com o objetivo de identificar proteínas (fatores de transcrição ou não) que se ligam à região promotora do gene gsn, o qual codifica a enzima glicogênio sintase, regulatória do processo de síntese do carboidrato. Esses estudos combinaram experimentos de ensaios de retardamento em gel utilizando fragmentos do promotor gsn e proteínas do extrato total do fungo, acoplados à análise proteômica e identificação das proteínas por espectrometria de massas. Os experimentos resultaram na identificação de algumas proteínas do fungo, as quais podem ou não estar envolvidas na regulação da expressão do gene. Alguns estudos preliminares com estas proteínas foram anteriormente realizados no laboratório e apontaram um provável papel das mesmas na regulação do metabolismo do carboidrato em N. crassa. Duas dessas proteínas, as codificadas pelas ORFs NCU3482 e NCU06679 foram objeto de estudo neste trabalho. Portanto, o objetivo deste trabalho foi realizar a caracterização das linhagens mutantes nestas ORFs, além da produção e purificação das proteínas na forma recombinante. Foram realizadas análises morfológicas da linhagem mutante na ORF NCU06679, tais como: crescimento colonial e radial, crescimento linear e análise microscópica das extremidades das hifas. Esses experimentos foram realizados em comparação com a linhagem selvagem do fungo e, mostraram esta proteína está envolvida no processo de desenvolvimento do... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo)
Abstract: The fungus Neurospora crassa has been widely used as a model organism for fundamental aspects of eukaryotic biology. We have been studying the biochemical and molecular mechanisms involved in glycogen metabolism regulation in this fungus. The present work is a consequence of previous experiments performed in the laboratory to identify proteins that bind to the promoter region of the gsn gene which encodes glycogen synthase, the regulatory enzyme in glycogen synthesis. Previous studies were performed by using a combination of DNA gel shift assay coupled to proteomic analysis, followed by identification of proteins by mass spectrometry. The assays resulted in the identification of proteins likely involved in the regulation of gene expression. Preliminary studies with these proteins have previously been carried out and suggested that they might have a role in the regulation of glycogen metabolism in N. crassa. Two of them, the ORFs NCU3482 and NCU06679 gene products were object of study in this work. The main objective was to characterize the mutant strains in both proteins and to produce and purify the recombinant proteins. Morphological analyzes were performed in the ORF NCU06679 mutant strain such as colony and radial linear growth and microscopic examination of the ends of the hyphae. These experiments showed that this protein is involved in the fungus development since growth and ability to conidiate were deficient when compared to the wild-type strain. The expression of gsn and gpn (encodes glycogen phosphorylase, the regulatory enzyme in glycogen degradation) genes were analyzed by qPCR and the results showed differences in gene expression of both genes during vegetative growth of the NCU06679 mutant strain when compared to the wild-type strain. The protein encoded by ORF NCU06679 was produced as a recombinant protein and the purification... (Complete abstract click electronic access below)
Mestre

Introdução: As Glicogenoses (GSD) hepáticas são doenças genéticas relativamente frequentes. Entre as suas manifestações clínicas, a que mais se destaca é a ocorrência de hipoglicemias de repetição. O tratamento com amido de milho cru é o mais largamente utilizado atualmente. Contudo, tem sido observado na prática clínica que os pacientes apresentam resposta metabólica diferente ao uso de diferentes amidos de milho. Além disso, complicações a longo prazo vêm sendo descritas nos pacientes com GSD hepáticas, especialmente na GSD I, considerada a mais grave, entre elas anemia ferropriva e de doença crônica. Objetivos: 1) Analisar a digestão de amidos de milho de diferentes marcas e provenientes de diferentes países, e de possíveis substitutos aos mesmos, por meio do modelo gastrointestinal, in vitro, TIM-1 (TNO in vitro model of the gastrointestinal tract - 1); 2) Determinar as frações de amido e a razão de amilose/amilopectina de amidos de milho de diferentes marcas e provenientes de diferentes países, e possíveis substitutos aos mesmos; 3) Caracterizar o perfil de hepcidina, de IL-6 e de outros parâmetros do metabolismo do ferro (ferritina, ferro e saturação de transferrina), em plasma de pacientes com GSD hepáticas, e avaliar a sua associação com a presença de anemia, de forma a contribuir para a melhor compreensão da fisiopatogenia dessa complicação nessas condições. Metodologia: Para as análises com amidos, foram estudados as seguintes marcas: Argo® e Great Value® provenientes dos Estados Unidos da América; Maizena Duryea® e Yoki® provenientes do Brasil; Maizena Duryea® proveniente dos Países Baixos; Glycosade®, um amido modificado; e polvilho doce, amido brasileiro extraído da mandioca. As frações de amido (amido rapidamente disponível – RAG; amido lentamente disponível – SAG; e amido resistente – RS) foram analisadas por meio do método GTI (Glycemic TNO Index). A razão de amilose/amilopectina foi determinada por meio de ensaio com kit comercial. A digestão dos amidos foi determinada por meio do sistema TIM-1 (TNO in vitro model of the gastrointestinal tract - 1), um modelo gastrointestinal dinâmico, controlado por computador, que simula os processos sucessivos do estômago e do intestino curto. Para estudo de hepcidina e IL-6 nos pacientes com GSD hepáticas, foi realizado um estudo transversal com amostragem por conveniência. Foram determinadas as concentrações de hepcidina e de IL-6, por meio de kits comerciais ELISA, e de parâmetros do metabolismo do ferro (Hb, ferro, ferritina, transferrina e saturação de transferrina), em 32 pacientes com GSD hepática em tratamento com amido de milho (GSD Ia= 18, GSD Ib= 7, GSD III= 3, GSD IXa= 3; GSD IXb= 1; sexo feminino= 17; mediana de idade= 9,5 anos). Dados adicionais de tratamento, clínicos e bioquímicos, foram obtidos por meio de revisão de prontuário dos pacientes. Para fins de comparação, foram determinadas concentrações de hepcidina em 20 controles, não aparentados aos pacientes (sexo feminino= 10, mediana de idade= 12 anos). Adicionalmente foram determinados níveis de hepcidina e IL-6 em 8 indivíduos heterozigotos para GSD hepáticas (mediana de idade= 33,5 anos; mães de pacientes= 6). Para análise dos dados, foram utilizados métodos não paramétricos. Resultados: Nos experimentos com os amidos, todos os amidos de milho estudados apresentaram valores semelhantes de frações de amido, o Glycosade® apresentou valor superior de RAG e inferior de RS, enquanto o polvilho doce apresentou valor inferior de RAG e superior de RS, comparado aos demais amidos. O estudo da razão de amilose/amilopectina apresentou valores semelhantes para os amidos de milho, o Glycosade® apresentou valor superior de amilopectina, conforme descrito pelo fabricante, e o polvilho apresentou valor ligeiramente superior de amilopectina, comparado aos amidos de milho, e apresentou estabilidade nos diferentes lotes estudados. No estudo de digestão, utilizando a TIM-1, a quantidade final digerida foi entre 84 e 86% para os amidos de milho e para o Glycosade®, e foi de 75,5% para o polvilho doce. Aos 180 minutos do experimento, um ponto de tempo importante para pacientes com GSD, a quantidade digerida dos amidos era correspondente a 67,9-71,5% para os amidos de milho e o Glycosade®, enquanto para o polvilho doce esse valor era de 55,5%. No experimento realizado com uma mistura de amido de milho (Maizena Duryea® brasileira) e polvilho doce, a quantidade final digerida foi de 78,4%, enquanto o valor no momento de 180 minutos foi de 61,7%. No estudo com pacientes com GSD hepática, nove pacientes (GSD Ia= 3; GSD Ib= 6) apresentavam anemia (leve= 4; moderada=5). Cinco pacientes apresentavam adenoma hepático. A hepcidina correlacionou-se positivamente com os níveis de ferritina (r = 0,375; p= 0,034). Já a IL-6 correlacionou-se com níveis de Hb (r= - 0,572; p= 0,001), ferro (r= -0,538; p= 0,001), transferrina (r = -0,550; p= 0,001) e saturação de transferrina (r= -0,425; p= 0,015). Não foi encontrada correlação entre os níveis de hepcidina e IL-6 (p= 0,057) e dessas variáveis em relação a outros parâmetros bioquímicos e nutricionais estudados. Os pacientes com GSD Ib apresentaram níveis mais elevados de IL-6. Não foi encontrada relação entre a presença de adenomas e anemia, e pacientes com doença inflamatória intestinal apresentaram valores superiores de hepcidina. Pacientes apresentaram níveis de IL-6 superiores aos indivíduos heterozigotos (p= 0,003). Além disso, os níveis de hepcidina diferiram entre os grupos estudados (p= 0,006), estando aumentados em pacientes (mediana= 58,6 ng/mL; IQR= 41,7-71,9) e em indivíduos heterozigotos (mediana= 60,7 ng/mL, IQR= 51,7-68,3) quando comparados aos controles (mediana= 42,8 ng/mL, IQR= 30,9-50,5) (p= 0,005 e 0,006, respectivamente). Conclusões: Os amidos de milho e o amido comercial estudados apresentaram pequenas diferenças na liberação de glicose nos experimentos realizados no sistema TIM-1. Esses achados sugerem que diferenças nas respostas glicêmicas em pacientes com GSD hepáticas, podem ser relacionadas à variações inter- e intraindivíduos e/ou ainda relacionadas à adesão ao tratamento. Cabe ressaltar que as pequenas diferenças encontradas na digestão in vitro podem ter o seu efeito amplificado in vivo, quando variáveis como a resposta hormonal e o fenótipo da doença estão presentes. O polvilho doce apresentou uma liberação de glicose mais lenta e parece ser um produto interessante para ser melhor estudado como alternativa de tratamento, com intuito de prolongar a normoglicemia, para pacientes com GSD hepáticas. Em relação a anemia, a mesma apresentou-se como um achado frequente nas GSD hepáticas, sendo mais frequente na GSD Ib, tipo que apresenta os níveis mais elevados de IL-6. Nossos achados sugerem que a inflamação está relacionada à ocorrência de anemia nas GSD hepáticas, principalmente na GSD Ib.
Background: The hepatic glycogen storage diseases (GSD) are relatively common genetic disorders. Among their clinical manifestations, the most remarkable is recurrent hypoglycemia. Uncooked cornstarch (UCCS) administration is the most widely used treatment today. However, it has been observed in clinical practice that patients exhibit different metabolic responses to different cornstarches. Furthermore, long-term complications – including iron deficiency anemia and the anemia of chronic disease – have been described in patients with hepatic GSD, especially those with type I, which is considered the most severe form. Objectives: 1) To analyze the digestion of different brands of cornstarch from different countries, and of possible substitutes for these substances, using the TIM-1 (TNO in vitro model of the gastrointestinal tract - 1); 2) To determine the starch fractions and amylose/amylopectin ratios of cornstarches from different brands and countries and of possible substitutes for these substances; 3) To characterize levels of hepcidin, IL-6, and other markers of iron metabolism (ferritin, iron, transferrin saturation) in plasma of patients with hepatic GSD and evaluate the association of these parameters with the presence of anemia, so as to contribute to a better understanding of the pathogenesis of this complication in GSD. Methodology: The following brands and types of straches were studied: Argo® and Great Value®, from the United States of America; Maizena Duryea® and Yoki®, from Brazil; Maizena Duryea®, from the Netherlands; Glycosade®, a modified starch; sweet polvilho, a cassava-derived starch, from Brazil. Starch fractions (rapidly available glucose, RAG; slowly available glucose, SAG; and resistant starch, RS) were analyzed by the glycemic TNO index (GTI) method. The amylose/amylopectin ratio was determined using a commercial kit. Starch digestion was determined in the TIM-1 system, a dynamic, computer-controlled in vitro model of the gastrointestinal tract that simulates successive digestive processes in the stomach and small intestine. To study hepcidin and IL-6 profiles in patients with hepatic GSD, a cross-sectional study with convenience sampling was conducted. Plasma hepcidin and IL-6 levels (using commercial enzyme-linked immunoassay kits) and iron metabolism parameters (hemoglobin, iron, ferritin, transferrin, and transferrin saturation) were measured in 32 patients with hepatic GSD on cornstarch treatment (GSD Ia =18; GSD Ib= 7; GSD III= 3; GSD IXa= 3; GSD IXb= 1; 17 females; median age, 9.5 years). Additional data, about treatment, clinical and biochemical variables, were obtained from patients’ medical records. For comparison purposes, hepcidin levels were quantitated in 20 unrelated healthy controls (10 females; median age= 12 years). Additionally, hepcidin and IL-6 levels were evaluated in eight subjects heterozygous for hepatic GSD (median age= 33.5 years; 6 were mothers of patients with GSD). Nonparametric methods were used for data analysis. Results: All analyzed cornstarches displayed similar values for all starch fractions. Glycosade® had higher RAG and lower RS values, while sweet polvilho had lower RAG and higher RS values, as compared with the other starches. Analysis of amylose/amylopectin ratio revealed similar values for the tested UCCS. Glycosade® had a higher amylopectin content, as described by the manufacturer, whereas sweet polvilho had a slightly higher amylopectin content as compared with cornstarches and was stable across different studied batches. In the digestion study using the TIM-1 system, the final digested amount ranged from 84–86% for the UCCS and Glycosade®, but was 75.5% for sweet polvilho. In an experiment conducted with a mixture of cornstarch (Brazilian Maizena Duryea®) and sweet polvilho, a final digested amount of 78.4% was found, while the value at 180 min was 61.7%. On analysis of GSD patients, nine (GSD Ia= 3; GSD Ib= 6) were anemic (mild= 4; moderate= 5). Five patients had hepatic adenomas. Hepcidin correlated positively with ferritin levels (r= 0.375; p= 0.034), while IL-6 correlated with hemoglobin (r= -0.572; p= 0.001), iron (r= -0.538; p= 0.001), transferrin (r= -0.550; p= 0.001), and transferrin saturation (r= -0.425; p= 0.015). There was no correlation between hepcidin and IL-6 levels (p= 0.057), or between these variables and the other biochemical and nutritional parameters of interest. Patients with GSD Ib had the highest IL-6 levels. There was no association between presence of hepatic adenoma and anemia. Patients with inflammatory bowel disease exhibited higher hepcidin levels. Patients exhibited IL- 6 levels higher than those of heterozygotes (p=0.003). Furthermore, hepcidin levels were significantly different across the tested groups (p= 0.006), being elevated in patients (median= 58.6 ng/mL, IQR 41.7–71.9) and in heterozygous individuals (median= 60.7 ng/mL, IQR 51.7–68.3) as compared with controls (median= 42.8 ng/mL, IQR 30.9–50.5) (p= 0.005 and 0.006, respectively) Conclusions: In experiments performed in the TIM-1 system, the cornstarches and commercial modified starch analyzed in this study displayed only small differences in glucose release. These findings suggest that the differences in glucose response reported in GSD patients may be related to inter- and intraindividual variations and/or to treatment compliance. It is important to take into account that the small difference in glucose release found among the starches could be clinically important in vivo when taking variables such as hormonal responses and disease phenotype into account. Sweet polvilho was associated with slower glucose release and seems to be an interesting product that warrants more in-depth study as an alternative treatment, aiming to extend normoglycemia in patients with hepatic GSD. Anemia is a common finding in hepatic GSD, and was most common in GSD Ib, the type of GSD associated with the highest IL-6 levels. These findings suggest that inflammation is associated with development of anemia in hepatic GSD, particularly in GSD Ib.

Orientador: Antonio Herbert Lancha Junior
Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia
Made available in DSpace on 2018-08-10T15:31:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Campos_PatriciaLopesde_D.pdf: 998065 bytes, checksum: 6a4a069b0d9422cc32f9686a61e72b14 (MD5) Previous issue date: 2005
Resumo: Durante o exercício sub-máximo, a utilização de estoques de glicogênio muscular é de suma importância para possibilitar a continuidade do mesmo. A suplementação de Aminoácidos de Cadeia Ramificada (AACR ou BCAA, do inglês Branched Chain Amino Acids) tem sido experimentada como forma de gerar energia para o músculo nessas condições. Através da utilização dos seus esqueletos de carbono, podem ser gerados intermediários do ciclo dos ácidos tricarboxílicos (CAT ou TCA, do inglês Tricarboxilic Acids Cycle); no entanto, há controvérsias quanto à eficiência dos AACR em aumentar a atividade do ciclo, uma vez que autores sugerem a diminuição da eficiência do mesmo após tal estratégia de suplementação. Por outro lado, há toda uma discussão na literatura acerca da importância do aumento dos intermediários do TCA nos primeiros momentos do exercício para apoiar o metabolismo oxidativo, assim como o impacto que as reações anapleróticas, que promovem esse fenômeno, apresentam, considerando-se o fluxo de energia total do TCA. O objetivo desse trabalho foi avaliar se a suplementação dos aminoácidos em questão seria capaz de alterar o desempenho de ratos treinados em exercício sub-máximo, e também a formação de alguns intermediários do TCA ou mesmo a atividade de enzimas importantes para esse fenômeno. Para isso foram utilizados ratos Wistar machos adultos, que foram treinados por 8 semanas em sistema de natação, e receberam na última semana, a suplementação de isoleucina, leucina ou valina, exclusivamente, ou então os três aminoácidos em conjunto, ou placebo, por 7 dias. No sexto dia de suplementação, eles fizeram a última sessão de treinamento de 1 hora de natação, foram mantidos em jejum por 24 horas e, no dia seguinte, foram submetidos a um teste sub-máximo de natação, até a exaustão. O grupo AACR teve aumento na síntese de malato e o grupo isoleucina apresentou maior atividade das transaminases de alanina e aspartato (AAT e AST), quando comparados ao placebo. Não houve diferença no desempenho dos animais em relação à resistência à fadiga, apesar do grupo leucina apresentar menores concentrações de glicogênio muscular que o grupo placebo. Concluiu-se que os AACR não foram capazes de alterar atividade do ciclo de Krebs, nem o desempenho nessas condições experimentais
Abstract: During submaximal exercise, muscle glycogen utilization is important. Branched-chain AminoAcids supplementation has been utilized during the past years to provide energy for muscles in this condition, through their carbon skeletons, which might generate tricarboxilic acids cycle's intermediates (TCAI). However, this hypothesis remains controversial. On the other hand, there is a recent discussion on the literature about the real importance of the rapid muscle TCAI raise and its role for de TCA cycle. This study aimed to evaluate if BCAA supplementation in trained rats submitted to sub-maximal exercise were capable of changing TCAI activity or transaminases (AAT and AST) concentration, or even performance in muscle depletion. Wistar Male Adult rats were trained for 8 weeks in a proper swimming system. In the last week they received BCAA supplementation. Before the final experiment, they trained for 1 hour, and then wento through a 24 h fasting. The final test consisted on swimming until exhaustion, then they were euthanized and tissues were kept in liquid Nitrogen until further analysis. BCAA group had higher muscle concentrations of malate. Isoleucine group had higher muscle transaminases¿ concentration, although rats supplemented with leucine alone had lower muscle glycogen levels than placebo group. We concluded that none of the BCAA supplementation was able to affect performance or TCA activity in our experimental conditions
Doutorado
Bioquimica
Doutor em Biologia Funcional e Molecular

La glicogen sintasa muscular és un enzim altament regulat. Aquesta tesi doctoral ha aprofondit en diversos aspectes no resolts com la descripció del seu mecanisme catalític i les relacions estructura-funció o la distribució subcel·lular de l'enzim. Així doncs aquesta tesi doctoral ha combinat diferents tècniques, ja siguin bioinformàtiques, bioquímiques i de biologia cel·lular i molecular i els resultats obtinguts es resumeixen en els següents paràgrafs.

Els resultats de la comparació de les glicogen (midó) sintases i les glicogen sintases indiquen que a més de catalitzar la mateixa reacció, la síntesi de ?(1?4)-glucà, comparteixen característiques similars així com zones d'estructura secundària predita homòlogues. Per tant podrien incloure's en una mateixa "superfamília".

A més es detectà que les glicogen (midó) sintases d'arqueobacteris són filogenèticament properes a les glicogen sintases de fongs i mamífers. Endemés d'ésser similars a nivell de seqüència i estructura secundària predita presenten una especificitat de substrat semblant i una mida més reduïda. Per tant són bons models per a estudiar a nivell estructural tant les glicogen sintases com les glicogen (midó) sintases.

També s'ha demostrat que el residu Glu-510 de la HsMGS és essencial per a la catàlisi i el Glu-518 hi juga un paper important però secundari. Proposem que els equivalent d'aquests residus en les glicosiltransferases de les famílies 4, 5, i 15 també són fonamentals en el mecanisme de catàlisi.

La glicogen sintasa muscular de mamífers presenta una localització subcel·lular regulada entre el nucli i el citoplasma. Aquesta translocació no és exclusiva de l'enzim humà ni de les cèl·lules de tipus muscular ja que també es presenta la línia cel·lular 3T3-L1, un model d'adipòcits de ratolí. Ni la sobreexpressió ni la fusió de l'enzim a GFP alteren aquesta distribució regulada. Endemés quan se sobreexpressa la glicogen sintasa muscular en cèl·lules que no la expressen també es manté la distribució regulada.

De diferents experiments de mutagènesi dirigida també s'ha observat que la glucosa 6-fosfat juga un paper estimulador en l'export des del nucli de la HsMGS. L'augment de la concentració de glucosa 6-fosfat és necessaria per afavorir la seva localització correcta a l'hora de sintetitzar glicogen, per tal de fornir de substrat i per activar a la glicogen sintasa.

La concentració de la HsMGS en el nucli es produeix en resposta a la depleció del glicogen intracel·lular. El glicogen realitzaria una funció de retenció de la proteïna en el citoplasma impedint-ne la seva translocació al nucli.

Dins del nucli la HsMGS forma agregacions esfèriques que es distribueixen pel nucleoplasma. Aquestes agrupacions col·localitzen amb p80-coilina i PML.

La capacitat de l'enzim de catalitzar la síntesi de l'?(1?4)-glucà no és necessària per al control de la localització subcel·lular, ja que el mutant Glu-510 (catalíticament incapaç) es distribueix en la cèl·lula de la mateixa forma que l'enzim salvatge.

La fosforilació i desfosforilació dels llocs descrits que controlen l'activitat de la HsMGS no regulen la distribució subcel·lular d'aquest enzim. Malgrat això, existeixen certes evidències que d'altres residus no identificats es fosforilen, i tenint en compte que el transport nucleocitoplasmàtic es regula molt freqüentment mitjançant fosforilació-desfosforilació, seria possible que aquests nous llocs controlessin en alguna mesura la translocació de la HsMGS.

Finalment també s'ha demostrat que l'export nuclear de la HsMGS està mediat per la via clàssica d'export, que és leptomicina B sensible.

La glicogen sintasa muscular és un enzim altament regulat. Aquesta tesi doctoral ha aprofondit en diversos aspectes no resolts com la descripció del seu mecanisme catalític i les relacions estructura-funció o la distribució subcel·lular de l'enzim. Així doncs aquesta tesi doctoral ha combinat diferents tècniques, ja siguin bioinformàtiques, bioquímiques i de biologia cel·lular i molecular i els resultats obtinguts es resumeixen en els següents paràgrafs. Els resultats de la comparació de les glicogen (midó) sintases i les glicogen sintases indiquen que a més de catalitzar la mateixa reacció, la síntesi de ?(1?4)-glucà, comparteixen característiques similars així com zones d'estructura secundària predita homòlogues. Per tant podrien incloure's en una mateixa "superfamília".A més es detectà que les glicogen (midó) sintases d'arqueobacteris són filogenèticament properes a les glicogen sintases de fongs i mamífers. Endemés d'ésser similars a nivell de seqüència i estructura secundària predita presenten una especificitat de substrat semblant i una mida més reduïda. Per tant són bons models per a estudiar a nivell estructural tant les glicogen sintases com les glicogen (midó) sintases.També s'ha demostrat que el residu Glu-510 de la HsMGS és essencial per a la catàlisi i el Glu-518 hi juga un paper important però secundari. Proposem que els equivalent d'aquests residus en les glicosiltransferases de les famílies 4, 5, i 15 també són fonamentals en el mecanisme de catàlisi.La glicogen sintasa muscular de mamífers presenta una localització subcel·lular regulada entre el nucli i el citoplasma. Aquesta translocació no és exclusiva de l'enzim humà ni de les cèl·lules de tipus muscular ja que també es presenta la línia cel·lular 3T3-L1, un model d'adipòcits de ratolí. Ni la sobreexpressió ni la fusió de l'enzim a GFP alteren aquesta distribució regulada. Endemés quan se sobreexpressa la glicogen sintasa muscular en cèl·lules que no la expressen també es manté la distribució regulada.De diferents experiments de mutagènesi dirigida també s'ha observat que la glucosa 6-fosfat juga un paper estimulador en l'export des del nucli de la HsMGS. L'augment de la concentració de glucosa 6-fosfat és necessaria per afavorir la seva localització correcta a l'hora de sintetitzar glicogen, per tal de fornir de substrat i per activar a la glicogen sintasa.La concentració de la HsMGS en el nucli es produeix en resposta a la depleció del glicogen intracel·lular. El glicogen realitzaria una funció de retenció de la proteïna en el citoplasma impedint-ne la seva translocació al nucli.Dins del nucli la HsMGS forma agregacions esfèriques que es distribueixen pel nucleoplasma. Aquestes agrupacions col·localitzen amb p80-coilina i PML. La capacitat de l'enzim de catalitzar la síntesi de l'?(1?4)-glucà no és necessària per al control de la localització subcel·lular, ja que el mutant Glu-510 (catalíticament incapaç) es distribueix en la cèl·lula de la mateixa forma que l'enzim salvatge.La fosforilació i desfosforilació dels llocs descrits que controlen l'activitat de la HsMGS no regulen la distribució subcel·lular d'aquest enzim. Malgrat això, existeixen certes evidències que d'altres residus no identificats es fosforilen, i tenint en compte que el transport nucleocitoplasmàtic es regula molt freqüentment mitjançant fosforilació-desfosforilació, seria possible que aquests nous llocs controlessin en alguna mesura la translocació de la HsMGS.Finalment també s'ha demostrat que l'export nuclear de la HsMGS està mediat per la via clàssica d'export, que és leptomicina B sensible.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:06Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-01-30Bitstream added on 2014-06-13T18:09:18Z : No. of bitstreams: 1 avaca_js_me_araiq.pdf: 1586941 bytes, checksum: 07a6c5702a63cebb17218e18a8aa2449 (MD5)
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)
Neste trabalho foi realizado o isolamento do cDNA e do gene que codifica a proteína semelhante à Pho85p de Saccharomyces cerevisiae, em Neurospora crassa. Um fragmento de 1,1 kb correspondendo à seqüência nucleotídica do gene em N. crassa foi amplificado e confirmado por sequenciamento, o qual foi utilizado no rastreamento de uma biblioteca de cDNA de N. crassa, resultando em um plasmídeo contendo a ORF que codifica a Ncpho85 e as seqüências upstream e downstream à ORF. Este inserto foi seqüenciado, a ORF isolada apresentou 1014 bp, a região upstream contém 304 bp e a downstream 561 nucleotídeos. Após sequenciamento do cDNA, a seqüência polipeptídica da proteína foi comparada com outras proteínas semelhantes à Pho85p de fungos miceliares, leveduriformes além de S. cerevisiae. Esta ORF isolada foi utilizada no rastreamento de uma biblioteca genômica de N. crassa, possibilitando o isolamento de um plasmídeo contendo a seqüência genômica, o qual foi submetido a sequenciamento. No inserto foi possível confirmar a presença do intron (de 89 bp) no nucleotídeo 69, confirmando os dados existentes no banco de dados de N. crassa. A expressão do gene foi analisada ao longo do crescimento do fungo, em diferentes meios de cultivo, através de experimentos de Northern blot. A presença de duas bandas de hibridização, uma de 2,2 kb e uma 2,7 kb foi observada em todos os experimentos realizados. Um pico de expressão dos dois transcritos ocorreu no tempo de 12 horas, sendo mais evidente para o transcrito de menor tamanho, o qual seria o transcrito do cDNA isolado anteriormente. Resultados preliminares da expressão da proteína ao longo do crescimento do fungo foram obtidos por Western blot. Apenas uma banda da proteína foi observada, a qual apresentou o tamanho aproximado de 40 kDa, próximo ao tamanho da proteína NcPHO85, deduzida a partir da seqüência do cDNA.
In this study we performed the isolation of the cDNA and the gene that codes for the Pho85p-like protein from Saccharomyces cerevisiae in Neurospora crassa. A fragment of 1.1 kb corresponding to the nucleotide sequence of the gene from N. crassa was amplified by PCR and confirmed by DNA sequencing. This fragment was used to screen a N. crassa cDNA library resulting in a plasmid containing the ORF plus and the upstream and downstream regions. The insert from the plasmid was sequenced and the ORF showed to have 1014 bp, whereas the upstream and downstream regions had 304 bp and 561 bp, respectively. After sequencing the cDNA, the polypeptide sequence was compared to the same protein from mycelial fungi and yeasts. The isolated ORF was used to screen a N. crassa genomic library leading to the isolation of a plasmid containing the genomic sequence. After DNA sequencing the insert showed the presence of an intron (89 bp) starting at nucleotide 69. This result was in agreement with the information from the N. crassa database. Gene expression analysis during the vegetative growth in different media was performed by Northern blot. Two hybridization bands were observed in the experiments, one of 2.2 kb and another one of 2.7 kb. The maximum expression of both transcripts happened at 12 h of growth, this was more pronounced for the smaller transcript, which probably is the transcript of the isolated cDNA. Preliminary results of protein expression during vegetative growth were obtained by Western blot analysis. Only one band with approximately 40 kDa was observed, the expected size for the NcPHO85 protein sequence deduced from the cDNA sequence. In order to evaluate the role of this protein in glycogen metabolism and in other cellular functions in N. crassa we started the gene inactivation.

Made available in DSpace on 2016-02-05T18:29:39Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-04-30. Added 1 bitstream(s) on 2016-02-05T18:33:41Z : No. of bitstreams: 1 000854430_20160430.pdf: 194642 bytes, checksum: bb81f6467dc8e778046a85b1a3883c0d (MD5) Bitstreams deleted on 2016-05-04T13:08:34Z: 000854430_20160430.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2016-05-04T13:09:35Z : No. of bitstreams: 1 000854430.pdf: 866908 bytes, checksum: 304d39176d6ab7c06503c5a80740a3e6 (MD5)
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)
Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)
A Deficiência da Enzima Ramificadora de Glicogênio (Glycogen Branching Enzyme Deficiency [GBED] em equinos é uma doença hereditária recessiva fatal, caracterizada principalmente por abortos, natimortos e nascimento de potros fracos. A GBED é causada por uma mutação no gene GBE1. Não existem dados acerca da existência de animais com esta mutação no Brasil. O objetivo deste estudo foi verificar a prevalência de animais portadores do alelo mutante da GBED em cavalos da raça Quarto de Milha utilizados em cinco modalidades esportivas equestres no Brasil. Amostras de sangue e pêlo foram obtidas de 740 animais. Após purificação do DNA, foram realizados as reações de PCR, sequenciamento direto automatizado e análise das sequências. Dos 740 animais testados 59 foram considerados heterozigotos para a mutação responsável pela GBED representando uma frequência de 7,97% na população estudada. As prevalências de heterozigotos foram maiores nas linhagens de apartação (20%) e rédeas (10%), seguidos por tambor/baliza (5%) e conformação (3%), não foram encontrados heterozigotos para a modalidade de corrida. Os resultados demostram que a mutação está presente no rebanho brasileiro de cavalos Quarto de milha, e sugere que a doença (homozigotos recessivos) pode estar presente de forma silenciosa. Portanto a GBED deve ser considerada no diagnóstico diferencial nos casos de abortos e morte neonatal em cavalos da raça Quarto de milha no Brasil, e medidas de prevenção da transmissão da mutação devem ser estabelecidas
The deficiency of glycogen branching enzyme [GBED] in horses is a fatal recessive hereditary disease, mainly characterized by abortions, stillbirths and birth of weak foals. The GBED is caused by a mutation in the gene GBE1. The aim of this study was to determine the prevalence of mutation carriers causing GBED in a population of Quarter horse animals used in five equestrian sports practiced in Brazil. Samples of blood and were obtained from 740 animals. After DNA purification, PCR reactions, automated direct sequencing and sequence analysis were performed. Of the 740 animals tested 59 were considered heterozygous for the mutation responsible for GBED representing a prevalence of 7.97% in the population studied. The prevalences of heterozygotes were higher in cutting (20%) and reining (10%) subgroups, followed by barrel racing (5%) and halter (3%), were not found heterozygous for the racing subgroup. The results demonstrate that the mutation is present in the Quarter horse Brazilian herd, and suggests that the disease (homozygous recessive) may be present without being noticed. So the GBED should be considered in the differential diagnosis in cases of abortion and stillbirths in Brazilian Quarter horses and strategies should be developed to prevent transmission of the mutation

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:18:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 5995.pdf: 2869208 bytes, checksum: 78818b61943b25fd2cc3f8d00a47f406 (MD5) Previous issue date: 2013-06-06
The anatomical alterations of spine have been researched in experimental and clinical studies. The present study focused the analysis on the three aspects. The scoliosis and the alterations on the metabolic profile of the paravertebral and pectoral muscles (study I), the scoliosis and stretching influence in the plasma citocines concentration (study II) and the status of cardiac autonomic function front the scoliosis implantation (study III). The three studies were performed with male rats, which were divided into different experimental groups, with a total n of 68 animals. For the scoliosis induction were applied a non-invasive model composed by vests made of polyvinyl chloride (PVC). All data were expressed as mean ± epm. For the statistical analysis the Kolmogorov-Smirinov test was applied to investigate the normality of the data, whereas studies I and II were followed by the variance analysis ANOVA and Tukey post hoc (p<0,05), in the study III were used the Student-t test or the sum of rank in the Mann-Whitney test (p<0,05). In the first study were applied vests to the scoliotic group since the initial growth phase (post weaning) until the sixth week of growth, however in the studies II and III the vests application went up to the twelfth week. To the achievement of the first study the rats were divided into 2 experimental groups with n=6: control (C) and scoliotic (S). The outcomes from this study showed a reduction on the relation total protein/DNA, in the glycogen content and in the total weight of the scoliotic animals. This study established a homeostatic impairment of the pectoral and paravertebral muscles during the scoliosis induction process. In the second study the animals were distributed into 4 groups with n=8: control (C), stretched (S), scoliotic (SG) and stretched scoliotic (SS). The stretching consisted in 3 series of 30 seconds with 10 seconds of interval among the series. The results revealed an important increase in the concentration of IL-2, IL-6 and e TNF-α in the scoliotic group, whereas the intervention with stretching exercises could achieve a decrease of 4, 9 and 6% respectively on the concentration increase. These results suggest that the proposed model used to induce the scoliosis lead to a muscular disuse and the stretching has showed to be effective to minimize the deriving consequences of this disuse. In the third study the animals were divided into 2 groups again, control group (C, n=12) and scoliosis group (S, n=12). On this study the attention referred to possible alterations in the cardiovascular autonomic control system. Evaluations of heart rate variability, cardiac autonomic tonus and cardiac baroreflex sensitivity. From these results was possible to certify that scoliosis causes an alteration in the autonomic control, being that the scoliotic group presented best sympathetic modulation, greater vagal tone and greater cardiac baroreflex sensitivity. The outcomes suggest that scoliosis promote alterations in the autonomic function of the cardiac system. In general, the results from this study demonstrated that the scoliotic animals have smaller glycogen reserves and lower ratios of total protein/DNA; higher concentration of the citocines IL-2, IL-6 and TNF-α, while the scoliotic and stretched rats have lower concentrations from the same citocines; referring to the autonomic modulation the scoliosis led to a higher total variance, greater sympathetic cardiac modulation, greater vagal tono and best baroreflex sensitivity proving a better condition in the cardiovascular autonomic function through the most part of the evaluated items in the scoliotic rats.
As alterações anatômicas da coluna vertebral têm sido investigadas em estudos clínicos e experimentais. O presente trabalho concentrou suas análises em três vertentes: A escoliose e suas alterações no perfil metabólico da musculatura paravertebral e peitorais (estudo I), as influências da escoliose e do exercício de alongamento sobre a concentração de citocinas plasmáticas (estudo II) e o status da função autonômica cardiovascular frente à implantação da escoliose (estudo III). Os três estudos foram realizados com ratos machos divididos em diferentes grupos experimentais, com n total de 68 animais. Para a implantação da escoliose foi utilizado um modelo não invasivo constituído por um colete de filme de policloreto de vinil (PVC). Os dados foram apresentados em média ±epm. Para a avaliação estatística os dados foram submetidos ao teste de normalidade Kolmogorov-Smirnov, sendo que nos estudos I e II foi seguido da análise de variância ANOVA e post hoc de Tukey (p<0,05), no estudo III teste t-Student ou pela soma dos ranks no teste de Mann-Whitney (p<0,05). No primeiro estudo o grupo escoliótico recebeu a aplicação do colete desde as fases iniciais de crescimento (pós-desmame) até a sexta semana de crescimento, e nos estudos II e III a aplicação do colete foi até a décima segunda semana. Para a realização do primeiro estudo os animais foram distribuídos em 2 grupos experimentais de n=6: controle (C) e escoliótico (E). Os resultados desse estudo revelaram redução na relação proteína total/DNA, no conteúdo de glicogênio e no peso total dos animais escolióticos. Com esse estudo foi constatado comprometimento homeostático de músculos peitorais e paravertebrais durante o processo de indução de escoliose. No segundo estudo os animais foram distribuídos em quatro grupos de n=8: controle (C), alongado (A), escoliótico (E) e escoliótico alongado (EA). O alongamento consistiu de 3 séries de 30 segundos com intervalos de 10 segundos entre as séries. Os resultados revelaram importante aumento das concentrações de IL-2, IL-6 e TNF-α no grupo escoliótico, por outro lado a intervenção com exercício de alongamento foi capaz de reduzir em 4, 9 e 6% respectivamente esse aumento. Esse resultado sugere que a indução de escoliose com o modelo proposto promove desuso muscular e o alongamento se mostrou capaz de minimizar os efeitos decorrentes desse desuso. No terceiro estudo os animais foram divididos novamente em 2 grupos experimentais, grupo controle (C, n=12) e grupo escoliose (E, n=12). Nesse estudo a atenção foi voltada para possíveis alterações no sistema de controle autonômico cardiovascular. Foram realizadas avaliações da variabilidade da frequência cardíaca, do tônus autonômico cardíaco e da sensibilidade barorreflexa cardíaca. Com os resultados foi possível constatar que a escoliose promove uma alteração no controle autonômico, de forma que o grupo escoliótico apresenta maior modulação simpática, maior tônus vagal e maior sensibilidade baroreflexa cardíaca. Os dados sugerem que a escoliose promove alterações na função autonômica do sistema cardiovascular. No geral, os resultados desse trabalho revelam que os animais escolióticos possuem menores reservas glicogênica e menor relação proteína total/DNA; maiores concentrações das citocinas IL-2, IL-6 e TNF-α, ao passo que os ratos escolióticos e alongados possuem menor concentração das mesmas citocinas; quanto a modulação autonômica cardiovascular a escoliose levou a maior variância total maior modulação simpática cardíaca, maior tônus vagal e maior sensibilidade baroreflexa mostrando melhor condição da função autonômica cardiovascular pela maioria dos índices avaliados nos ratos escolióticos.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:06Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-06-26Bitstream added on 2014-06-13T20:50:01Z : No. of bitstreams: 1 goncalves_rd_me_araiq.pdf: 458621 bytes, checksum: b64d723b7092c74fd22ab470646c2f98 (MD5)
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)
Este trabalho teve como objetivo identificar fatores de transcrição envolvidos na via metabólica do glicogênio no fungo Neurospora crassa durante o crescimento vegetativo e na condição de choque térmico. Para isso foi utilizado uma coleção de 139 linhagens mutantes do fungo, as quais possuem genes codificadores de fatores de transcrição individualmente nocauteados. O conteúdo de glicogênio de todas as linhagens foi determinado tanto a 30ºC, temperatura fisiológica de crescimento, quanto a 45ºC, situação de choque térmico. Do total das linhagens analisadas, 10 apresentaram um perfil distinto daquele observado na selvagem. Com o objetivo de verificar o envolvimento dos fatores de transcrição identificados na expressão do gene que codifica a enzima glicogênio sintase (gsn), experimentos de Northern blot foram realizados e revelaram que do total de linhagens analisadas, 3 apresentaram diferenças na transcrição de gsn, sugerindo que os fatores de transcrição nocauteados nestas linhagens atuam diretamente na regulação da transcrição do gene. As linhagens mutantes selecionadas foram avaliadas quanto ao crescimento e comparadas à linhagem selvagem. Todas as linhagens selecionadas apresentaram uma taxa de crescimento bastante semelhante à linhagem selvagem, exceto a linhagem FGSC011062 (ORF NCU09739), a qual apresentou uma taxa de crescimento muito reduzida. Ferramentas de bioinformática disponíveis na internet foram utilizadas para a dedução teórica das características bioquímicas, moleculares e estruturais dos fatores de transcrição selecionados, tais como ponto isoelétrico, massa molecular, sinais de localização nuclear clássicos e a presença de domínios conhecidos. A análise por Blastp revelou que apenas 2 das 10 ORFs selecionadas codificam fatores de transcrição com função conhecida e as demais codificam proteínas hipotéticas...
The objective of this work was to identify transcription factors involved in the glycogen metabolic pathway of the fungus Neurospora crassa. We used a collection of 139 mutant strains, in which each strain has a gene codifying for transcription factor individually knockedout. The glycogen content was quantified during the vegetative growth (30ºC), and after a stress condition such as heat shock (transfer for 30ºC to 45ºC). Of all analyzed strains, 10 showed a pattern of glycogen accumulation distinct of the one observed for the wild type strain. To verify the involvement of the transcription factors identified in the expression of the gene encoding glycogen synthase (gsn), Northern blot experiments were performed and revealed that 3 strains showed differences in gene transcription, either before or after heat shock. The results suggested that the transcription factors knocked-out in the strains might act directly in the regulation of the gsn gene transcription. The growth of the selected mutant strains was evaluated and compared to the wild type strain. Most of the selected mutant had a growth rate similar to the wild type strain, except the strain FGSC01162 (ORF NCU09739), which showed a reduced growth rate. Online bioinformatics tools were used to predict the biochemical parameters, such as isoeletric point and molecular weight, as well protein domain, such as classic nuclear localization signal (cNLS). Analysis by Blastp revealed that 2 from 10 selected ORFs codify transcription factors having functional roles in public databases: the ORF NCU08000 codifies the cutinase transcription factor 1α that is involved in the induction of the expression of cutinases genes by fatty acids in ascomycetes, and the ORF NCU06971 codifies the protein XlnR a transcription factor responsible for the transcription activation of genes involved in the xylan degradation. The results described... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:00Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-02-02Bitstream added on 2014-06-13T21:01:54Z : No. of bitstreams: 1 freitas_fz_dr_araiq_prot.pdf: 4506629 bytes, checksum: 72017b1ea005ba3d7b6b2bb0d348f3cc (MD5)
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)
As células eucarióticas são capazes de responder e de se adaptar a diferentes condições ambientais estressantes tais como o choque térmico, modulando sua atividade metabólica. Na levedura Saccharomyces cerevisiae o choque térmico é conhecido por induzir múltiplos genes relacionados a esta forma de estresse, através dos elementos transativadores Hsf1p (Heat Shock Protein) e Msn2/4p, os quais se ligam, respectivamente, às seqüências consensos HSE e STRE, ativando a transcrição. A seqüência nucleotídica do gene da glicogênio sintase (gsn) de Neurospora crassa foi previamente isolada em nosso laboratório e uma análise da expressão gênica mostrou que a transcrição do gene foi diminuída na situação de choque térmico (30 para 45ºC). Uma análise da região 5' flanqueadora revelou a presença dos elementos de DNA CRE, HSE e STRE tanto na região promotora do gene quanto na 5'-UTR. Neste trabalho, nós investigamos o envolvimento destes elementos de DNA na regulação da transcrição na condição de choque térmico, através de ensaios de mobilidade em gel (EMSA) usando como sondas, fragmentos de DNA contendo os elementos transcricionais citados anteriormente. Para isto, foram utilizados como fonte de proteínas extratos nucleares brutos ou fracionados em coluna de Heparina-Sepharose, preparados a partir de micélios coletados antes e após choque térmico (amostras HS30). Os resultados obtidos mostraram a presença de proteínas capazes de reconhecer e ligar aos elementos de DNA testados sob a condição estressante analisada. A especificidade das bandas de mobilidade reduzida foi confirmada por diferentes ensaios de competição, tais como 1) adição prévia de sondas de DNA não marcadas antes da reação de ligação, 2) adição de oligonucleotídeo de DNA dupla fita contendo o elemento STRE do promotor gsn como competidor específico, 3) utilização...
Eukaryotic cells respond and adapt to environmental stressing conditions such as heat shock, by modulating metabolic responses to counteract them. In the yeast Saccharomyces cerevisiae heat shock activates multiple stressing related genes by the trans acting elements Hsfp (Heat shock factors) and Msn2/4p, which bind to the cis regulatory elements HSE (Heat Shock Element) and STRE (Stress Responsive Element), respectively, and activates the gene transcription. We have previously isolated the gene encoding the Neurospora crassa glycogen synthase (gsn) and demonstrated that the gene transcription was decreased under heat shock (30 to 45ºC). An analysis of the gsn 5' flanking region showed the presence of the DNA elements CRE, HSE, and STRE, in the promoter region and in the 5'-untranslated region. In this work we investigated the involvement of these DNA elements in gene transcription regulation under heat shock condition by performing electrophoretic mobility shift assays (EMSA) using, as probes, DNA fragments containing the regulatory elements, and crude or Heparin-Sepharose fractionated nuclear extracts prepared from mycelia collected before and after 30 min of heat shock (HS30 sample). Ours results showed the presence of nuclear proteins capable to recognize and bind to the DNA regulatory elements under heat stress. The specificity of the DNA shifts were confirmed by using 1) unlabelled DNA probes as specific competitor, 2) the gsn promoter STRE double-stranded oligonucleotide as specific competitor, 3) a mutated gsn promoter STRE probe, and 4) the HSE unlabelled probe in a cross-reaction competition assay with the gsn promoter STRE probe. The involvement of the regulatory CRE elements in the modulation of the gsn gene transcription was investigated by using EMSA in the wild type strain, and also in two N. crassa mutant strains defective in the cAMP-signaling pathway: one having hyperactive...(Complete abstract click electronic access below)

As glândulas salivares são glândulas exócrinas que vertem seus produtos para cavidade oral. As principais glândulas são as parótidas, sublinguais e submandibulares sendo elas as responsáveis pela contribuição do maior volume de saliva durante o processo de secreção que, assim como todas as atividades que nosso corpo exerce, também dependem de energia. A secreção salivar consome glicose e mobiliza o glicogênio para adquirir energia, e este processo pode sofrer influencia de alguns fatores dentre eles o estado diabético e o ritmo circadiano. O diabetes altera todo o metabolismo de carboidratos e diminui o fluxo salivar. Já o ritmo circadiano promove uma alteração fisiológica no fluxo e composição da saliva de acordo com o horário do dia. Desta forma o objetivo deste trabalho foi em um primeiro momento observar o comportamento da concentração de glicogênio em glândulas parótidas e submandibulares de ratos com diferentes idades e condições alimentares em um determinado período do dia. Em um segundo momento observar as alterações que ocorrem na concentração de glicogênio em ratos diabéticos durante o dia. Na primeira fase do estudo foram utilizados ratos saudáveis com 21, 30 e 60 dias de vida, divididos em grupos alimentado e alimentados com restrição. No grupo com restrição de alimento os animais ficaram restritos a alimentação noturna (19 7 horas) desde 2 dias antes do sacrifício. Na segunda fase do estudo, com ratos diabéticos, foram utilizados animais com 60 dias de vida e a indução do diabetes foi realizada através de uma injeção intraperitoneal de estreptozotocina (65 mg/Kg p.c.). 30 dias após a indução os animais foram sacrificados. Em todos os grupos o sacrifício foi realizado nos seguintes horários - 7, 9, 11, 13, 15, 17 e 19 horas. As glândulas submandibulares e parótidas foram removidas imediatamente para posterior análise da concentração de glicogênio. Os dados foram analisados estatisticamente pelos testes ANOVA e o teste de Tukey (p<0.05). Os resultados obtidos com os animais normais mostra uma variação da concentração de glicogênio durante o período analisado nas duas glândulas, sendo mais evidente quando os ratos não foram submetidos a restrição de alimento. Nesta condição a variação da concentração de glicogênio em glândulas parótidas pouco alterou independente da idade. Nos animais diabéticos observamos um acúmulo de glicogênio nas glândulas parótidas e uma diminuição da concentração de glicogênio em submandibulares. Durante o período analisado também houve pouca variação da concentração de glicogênio, assim como nos animais não diabéticos, sendo evidente a menor interferência do ritmo circadiano no estado diabético. Esse estudo nos mostrou que o ritmo circadiano interfere na concentração de glicogênio das glândulas salivares parótidas e submandibulares de ratos durante o período analisado e que a restrição de alimento durante o dia alterou a concentração de glicogênio principalmente nas glândulas parótidas. Observamos também que no estado diabético ocorre um acúmulo do glicogênio em glândulas parótidas e uma diminuição nas glândulas submandibulares.
The secretory process is very important for oral health. The majors salivary glands (parotid, submandibular and sublingual) are the most important for secretion of saliva, for this activity the glands needs energy and a common way obtain is using glucose from the mobilization of glycogen during the fast period. Because of the importance of glycogen in this process, this study aimed to analyze the behavior of glycogen concentration during the day (7 to 19 hours) in parotid, and submandibular glands of rats. In the first moment the study was made with health male rats in different ages (21, 30 and 60 days old), divided in a group with free access to food and other group fed only during the night (19 to 7 hours). The second part of the study was made using diabetic male rats to search for alterations caused by this disease in glycogen concentration. All animals were killed during the day in different hours (7, 9, 11, 13, 15, 17,19 hours), their glands were removed and clamped between aluminium plates pre-cooled in dry ice. The frozen glands were then stored at -80oC until analysis of glycogen concentration. The statistical analyses was made using ANOVA test and Tukey (p<0,5). In the group of health rats we observed a variation of the glycogen concentration during the period analyzed in both glands, but it became more evident when the animals had free access to food. When they were fed during the night the variation of the glycogen concentration in parotid glands were not so evident. The results with diabetics rats showed a higher accumulation of glycogen in parotid glands and a lower concentration of glycogen in submandibular glands. In this period we could not see the variation of glycogen that happen in health rats. This study showed that circadian rhythm modify the concentration of glycogen in parotid and submandibular glands in health rats and the restriction of food made alterations in glycogen concentration of parotid glands. In diabetic rats was possible to see a higher concentration of glycogen in parotid and lower concentration in submandibular gland compared with health rats.

Orientador: Maria Célia Bertolini
Banca: Marcos Roberto de Mattos Fontes
Banca: Dulce Helena Ferreira de Souza
Resumo: Este trabalho teve como objetivo identificar fatores de transcrição envolvidos na via metabólica do glicogênio no fungo Neurospora crassa durante o crescimento vegetativo e na condição de choque térmico. Para isso foi utilizado uma coleção de 139 linhagens mutantes do fungo, as quais possuem genes codificadores de fatores de transcrição individualmente nocauteados. O conteúdo de glicogênio de todas as linhagens foi determinado tanto a 30ºC, temperatura fisiológica de crescimento, quanto a 45ºC, situação de choque térmico. Do total das linhagens analisadas, 10 apresentaram um perfil distinto daquele observado na selvagem. Com o objetivo de verificar o envolvimento dos fatores de transcrição identificados na expressão do gene que codifica a enzima glicogênio sintase (gsn), experimentos de Northern blot foram realizados e revelaram que do total de linhagens analisadas, 3 apresentaram diferenças na transcrição de gsn, sugerindo que os fatores de transcrição nocauteados nestas linhagens atuam diretamente na regulação da transcrição do gene. As linhagens mutantes selecionadas foram avaliadas quanto ao crescimento e comparadas à linhagem selvagem. Todas as linhagens selecionadas apresentaram uma taxa de crescimento bastante semelhante à linhagem selvagem, exceto a linhagem FGSC011062 (ORF NCU09739), a qual apresentou uma taxa de crescimento muito reduzida. Ferramentas de bioinformática disponíveis na internet foram utilizadas para a dedução teórica das características bioquímicas, moleculares e estruturais dos fatores de transcrição selecionados, tais como ponto isoelétrico, massa molecular, sinais de localização nuclear clássicos e a presença de domínios conhecidos. A análise por Blastp revelou que apenas 2 das 10 ORFs selecionadas codificam fatores de transcrição com função conhecida e as demais codificam proteínas hipotéticas... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo)
Abstract: The objective of this work was to identify transcription factors involved in the glycogen metabolic pathway of the fungus Neurospora crassa. We used a collection of 139 mutant strains, in which each strain has a gene codifying for transcription factor individually knockedout. The glycogen content was quantified during the vegetative growth (30ºC), and after a stress condition such as heat shock (transfer for 30ºC to 45ºC). Of all analyzed strains, 10 showed a pattern of glycogen accumulation distinct of the one observed for the wild type strain. To verify the involvement of the transcription factors identified in the expression of the gene encoding glycogen synthase (gsn), Northern blot experiments were performed and revealed that 3 strains showed differences in gene transcription, either before or after heat shock. The results suggested that the transcription factors knocked-out in the strains might act directly in the regulation of the gsn gene transcription. The growth of the selected mutant strains was evaluated and compared to the wild type strain. Most of the selected mutant had a growth rate similar to the wild type strain, except the strain FGSC01162 (ORF NCU09739), which showed a reduced growth rate. Online bioinformatics tools were used to predict the biochemical parameters, such as isoeletric point and molecular weight, as well protein domain, such as classic nuclear localization signal (cNLS). Analysis by Blastp revealed that 2 from 10 selected ORFs codify transcription factors having functional roles in public databases: the ORF NCU08000 codifies the cutinase transcription factor 1α that is involved in the induction of the expression of cutinases genes by fatty acids in ascomycetes, and the ORF NCU06971 codifies the protein XlnR a transcription factor responsible for the transcription activation of genes involved in the xylan degradation. The results described... (Complete abstract click electronic access below)
Mestre

Orientador: Maria Célia Bertolini
Banca: Flávio Henrique da Silva
Banca: Nilce Maria Martinez Rossi
Banca: Maria Isabel Nogueira Cano
Banca: Nádia Monesi
Resumo: As células eucarióticas são capazes de responder e de se adaptar a diferentes condições ambientais estressantes tais como o choque térmico, modulando sua atividade metabólica. Na levedura Saccharomyces cerevisiae o choque térmico é conhecido por induzir múltiplos genes relacionados a esta forma de estresse, através dos elementos transativadores Hsf1p (Heat Shock Protein) e Msn2/4p, os quais se ligam, respectivamente, às seqüências consensos HSE e STRE, ativando a transcrição. A seqüência nucleotídica do gene da glicogênio sintase (gsn) de Neurospora crassa foi previamente isolada em nosso laboratório e uma análise da expressão gênica mostrou que a transcrição do gene foi diminuída na situação de choque térmico (30 para 45ºC). Uma análise da região 5' flanqueadora revelou a presença dos elementos de DNA CRE, HSE e STRE tanto na região promotora do gene quanto na 5'-UTR. Neste trabalho, nós investigamos o envolvimento destes elementos de DNA na regulação da transcrição na condição de choque térmico, através de ensaios de mobilidade em gel (EMSA) usando como sondas, fragmentos de DNA contendo os elementos transcricionais citados anteriormente. Para isto, foram utilizados como fonte de proteínas extratos nucleares brutos ou fracionados em coluna de Heparina-Sepharose, preparados a partir de micélios coletados antes e após choque térmico (amostras HS30). Os resultados obtidos mostraram a presença de proteínas capazes de reconhecer e ligar aos elementos de DNA testados sob a condição estressante analisada. A especificidade das bandas de mobilidade reduzida foi confirmada por diferentes ensaios de competição, tais como 1) adição prévia de sondas de DNA não marcadas antes da reação de ligação, 2) adição de oligonucleotídeo de DNA dupla fita contendo o elemento STRE do promotor gsn como competidor específico, 3) utilização...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo)
Abstract: Eukaryotic cells respond and adapt to environmental stressing conditions such as heat shock, by modulating metabolic responses to counteract them. In the yeast Saccharomyces cerevisiae heat shock activates multiple stressing related genes by the trans acting elements Hsfp (Heat shock factors) and Msn2/4p, which bind to the cis regulatory elements HSE (Heat Shock Element) and STRE (Stress Responsive Element), respectively, and activates the gene transcription. We have previously isolated the gene encoding the Neurospora crassa glycogen synthase (gsn) and demonstrated that the gene transcription was decreased under heat shock (30 to 45ºC). An analysis of the gsn 5' flanking region showed the presence of the DNA elements CRE, HSE, and STRE, in the promoter region and in the 5'-untranslated region. In this work we investigated the involvement of these DNA elements in gene transcription regulation under heat shock condition by performing electrophoretic mobility shift assays (EMSA) using, as probes, DNA fragments containing the regulatory elements, and crude or Heparin-Sepharose fractionated nuclear extracts prepared from mycelia collected before and after 30 min of heat shock (HS30 sample). Ours results showed the presence of nuclear proteins capable to recognize and bind to the DNA regulatory elements under heat stress. The specificity of the DNA shifts were confirmed by using 1) unlabelled DNA probes as specific competitor, 2) the gsn promoter STRE double-stranded oligonucleotide as specific competitor, 3) a mutated gsn promoter STRE probe, and 4) the HSE unlabelled probe in a cross-reaction competition assay with the gsn promoter STRE probe. The involvement of the regulatory CRE elements in the modulation of the gsn gene transcription was investigated by using EMSA in the wild type strain, and also in two N. crassa mutant strains defective in the cAMP-signaling pathway: one having hyperactive...(Complete abstract click electronic access below)
Doutor

Orientador: Antonio Ari Gonçalves
Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia
Made available in DSpace on 2018-08-04T15:30:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Costa_EuniceCristinadaSilva_D.pdf: 2678840 bytes, checksum: 439eb1d320bc5d4828c77cb0e086e763 (MD5) Previous issue date: 2005
Resumo: Objetivos: Metformina e glibenclamida são fármacos utilizados para diminuir a glicemia de diabéticos tipo 2. Metformina reduz a absorção gastrintestinal de glicose e a gliconeogênese hepática e aumenta a captação de glicose periférica. Por sua vez, glibenclamida aumenta a liberação de insulina após bloquear canais de K+. Apesar destes efeitos, metformina em altas concentrações e glibenclamida podem influenciar o sistema cardiovascular e acelerar a progressão de doenças vasculares, predispondo o coração à falência cardíaca ou infarto. Estas e outras mudanças fisiológicas podem ser associadas a um ECG anormal, mostrando aumento do intervalo QT e de sua dispersão (QTd). Estas mudanças podem ser associadas a um baixo limiar para arritmias ventriculares e provocar morte súbita durante isquemia. Neste estudo avaliamos os efeitos do tratamento com metformina e/ou glibenclamida em ratos diabéticos por aloxana sobre os intervalos do ECG: QT e suas derivadas QTc, QTd, e QTcd. Em outra série experimental avaliamos a pressão desenvolvida pelo ventrículo esquerdo (LVP) e as suas derivadas (DP/Dt+ e DP/Dt-), usando a preparação de Langendorff utilizando coração isolado de ratos diabéticos. A isquemia foi provocada pela perfusão (1 h) com noradrenalina (NE). Além disso, o glicogênio foi medido em coração de ratos antes e após perfusão com noradrenalina. As alterações histológicas no ventrículo também foram estudadas. Métodos: Ratos Wistar machos, diabéticos por aloxana, foram tratados com metformina (3,5, 30 e 74 mg.g-1 de peso corporal ¿ p.c) ou glibenclamida (0,10 mg/g-1 p.c) e/ou glibenclamida e metformina (0,10 + 3,5 mg.g-1 p.c), simultaneamente durante 30 dias. O ECG foi registrado no 15o e 30o dia de tratamento. No 30º dia, sob anestesia, o coração foi isolado e perfundido com solução de Krebs-Henseleit em um aparelho de Langendorff. A isquemia foi induzida com noradrenalina 10-6 M (2 ml.min-1.g-1) mantida durante 1 h na solução perfusora. O glicogênio tecidual (mg.100.mg-1) foi extraído de fragmentos de ventrículo de ratos em repouso ou após a perfusão. O glicogênio foi medido pelo método do fenol sulfúrico. Em outros grupos de ratos, preparados de modo idêntico, os corações foram removidos sob anestesia e fixados em formoldeído em tampão PBS. Secções de ventrículo foram preparadas depois de embebidas em parafina e em seguida, os cortes foram fixados em lâminas e corados pelo método hematoxilina eosina (HE). O ensaio do glicogênio ventricular foi feito usando o método ácido de Schiff. Os núcleos foram contados e as suas áreas foram medidas (mm2). Os grânulos de glicogênio foram detectados pela coloração violeta do citoplasma, usando o método de schiff (PAS positivo) e fotografados. Resultados: Após 15 e 30 dias, a glicemia, o intervalo QT e as suas derivadas aumentaram nos ratos diabéticos. Após 30 dias, a glicemia diminuiu em ratos diabéticos que foram tratados com doses baixa ou intermediária de metformina (3,5 e 30 mg.g-1 p.c.), ou com glibenclamida e com a combinação glibenclamida + metformina (3,5 mg.g-1 p.c.). Entretanto, o grupo tratado com a dose mais alta de metformina (74 mg.g-1 p.c) não teve a sua glicemia diminuída. Por outro lado, nos ratos tratados com doses: baixa ou intermediária de metformina os intervalos do ECG: QTc, QTd e QTcd foram reduzidos, em relação ao grupo diabético tratado com a maior dose de metformina. Estes resultados também produziram melhores efeitos em comparação aos grupos diabéticos tratados com glibenclamida e nos grupos tratados com a associação glibenclamida e metformina. Doses baixas, intermediárias e altas (3,5, 30 e 74 mg.g-1 p.c.) de metformina aumentou o armazenamento de glicogênio no ventrículo de ratos diabéticos de 0,19 ± 0,007 (controle) para 0,38 ± 0,007 mg.100 mg-1, 0,5 ± 0,05 mg.100 mg-1 e 0,7 ± 0,04 mg.100 mg-1 (p< 0,05), respectivamente. Quanto à pressão sistólica ventricular, houve rápido aumento da pressão logo no inicio da perfusão com NE no grupo controle, com pico de pressão a 145 ± 9,7 mmHg), seguido de lenta queda até 99 ± 3 mmHg. Esta tendência foi observada também nas derivadas DP/Dt+ e DP/Dt-. Metformina (3,5 e 30 mg.g-1 p.c) e glibenclamida isoladamente ou em associação com metformina protegeram o músculo cardíaco durante a isquemia, não diferindo do grupo controle. Contudo, ratos diabéticos não tratados ou tratados com a maior dose de metformina, desenvolveram pressão sistólica máxima inferior a todos os grupos experimentais, revertendo aos níveis basais mais rapidamente que nos demais grupos. As derivadas DP/Dt+ e DP/Dt- mostraram curvas semelhantes. Após a isquemia, o glicogênio diminuiu em todos os grupos, sendo 0,09 ± 0,007 no grupo controle; 0,1 ± 0,006 nos diabéticos e 0,6 ± 0,005 nos diabéticos tratados com 74 mg.g-1 pc de metformina. O tratamento com glibenclamida e/ou metformina diminuiu o estoque de glicogênio de 0,62 ± 0,05 mg.100 mg-1 para 0,19 ± 0,05 mg.100 mg-1 e de 0,74 ± 0,03 mg.100 mg-1 para 0,22 ± 0,008 mg.100 mg-1, respectivamente. Entretanto, a utilização de glicogênio foi proporcional em todos os grupos. A análise morfológica demonstrou um aumento na quantidade dos núcleos no coração de ratos diabéticos de 21,33 ± 1.17 (no grupo controle) para 36,6 ± 5 (p< 0,05) e redução na média da área dos núcleos, de 0,16 ± 0,02 (controle) para 0,08 ± 0,01 (p< 0,05). No grupo tratado com a menor concentração de metformina (DM 3.5) diminuiu a quantidade de núcleos de 36,6 ± 5 (grupo diabético) para 22,8 ± 2 (p< 0,05), porém aumentou a média da área dos núcleos de 0,08 ± 0,01 mm2 para 0,17± 0,01 mm2 (p< 0,05). Nos grupos tratados com as maiores doses de metformina (30 e 74 mg.g-1 p.c.), a quantidade de núcleos aumentou para 34,16 ± 1,85 e 47,29 ± 2,92, respectivamente), e suas respectivas áreas aumentaram para 0,86 ± 0,05 e 0,5 ± 0,06, diferindo dos grupos controle e dos diabéticos não tratados. Nos grupos diabéticos tratados com glibenclamida e glibenclamida + metformina, as áreas dos núcleos aumentaram de 0,08 ± 0,01 mm2 para 0,71 ± 0,09 mm2 e 0,67 ± 0,01 mm2, respectivamente, (p< 0,001). Conclusões: O aumento na dispersão dos intervalos QT com o tratamento pode significar um risco de arritmia que predispõe ratos à morte súbita. Os resultados da pressão obtidos pelo método de Langendorff indicam que a força de contração diminuiu durante o período de isquemia por NE, sugerindo que o coração estava mais rígido. Estes resultados permitem-nos deduzir que as maiores doses de metformina, 74 mg.g-1 indicados como as máximas para humanos, podem causar sérios prejuízos ao trabalho cardíaco em caso de sobrecarga. Por outro lado, altas doses de metformina, de glibenclamida e a associação entre estas drogas aumentam a quantidade e o tamanho dos núcleos. Conseqüentemente, o ventrículo hipertrofia, em decorrência do aumento da atividade celular, prejudicando de modo importante, a estrutura e a função cardíaca. Portanto, este aumento de glicogênio está associado à severidade e à duração do diabetes. Assim, o coração torna-se altamente susceptível à isquemia
Abstract: Metformin and glibenclamide are pharmacos used to decrease blood glucose on type 2 diabetics. Metformin decreases gastrointestinal absorption of glucose and gluconeogenesis and increases peripheric glucose uptake. Glibenclamide increases insulin secretion by blocking K+ channels. Besides these effects, metformin and glibenclamide may influence cardiovascular system, which accelerate the progression of vascular disease, predisposing heart to failure or infarct. These abnormalities associated to physiological changes may generate an abnormal ECG, with an increased QT interval and its correspondent dispersion (QTd). These changes could be associated to a lower threshold for malignant ventricular arrhythmias and a sudden death by ischemia. The aim of this study was to evaluate the effects of metformin and/or glibenclamide treatment on QT intervals and its derivatives: QTc, QTd, and QTcd. We also evaluated the pressure developed by left ventricle (LVP) and calculate the correspondents derivatives (DP/Dt+ and DP/Dt-) on heart isolated from diabetic rats, under ischemia caused by norepinephrine (NE). Glycogen was measured after ischemia and compared to control heart, non-submitted to NE. We also analyzed the histological changes in ventricle cells. Methods: Male Wistar diabetic rats were treated by metformin (3.5, 30 and 74 µg.g-1 b.w) or glibenclamide (0.13 µg.g-1 b.w) and its association to metformin (0.13 µg.g-1 b.w + 3.5 µg.g-1 b.w) during 30 days. A 6-lead ECG was recorded initially and after 15 and 30 days treatment. At the end, under anaesthesia, heart were isolated and perfused by Krebs-Henseleit solution in a Langendorff apparatus. Ischemia were induced by adding norepinephrine 10-6 M to the solution (2 ml.min-1.g) during 1 h. Glycogen (mg.100 mg-1 wet tissue) was measured on heart at rest or after perfusion, using the fenol sulfuric method. In another group, after anaesthesia hearts were removed, cleaned and fixed in phormoldheyde in PBS buffer. Thin ventricle sections were made and after paraffin embedding, fine slices were cut and stained with hematoxilin eosin (HE). Ventricle glycogen assay was performed on those slides using the acid Schiff process. The number of nuclei was counted out and nuclei area was measured (mm2). Glycogen granules were recognized the violet colored cytoplasm. Results: After 15 and 30 days, glycemia, QT interval and its derivates increased on diabetic rats. On the other hand, diabetic rats treated during 30 days by low and intermediate doses of metformin (3.5 and 30 µg.g-1 b.w.) or glibenclamide or glibenclamide plus metformin, all decreased glycemia. However, the group treated with the highest dose of metformin (74 µg.g-1 b.w) failed to reduce glycemia. On the other hand, the groups treated by low and intermediate doses reduced the ECG intervals: QTc, and QTd, and QTcd, in contrast to the diabetic group treated with the highest metformin dose and the groups treated by glibenclamide and glibenclamide associated to metformin. Metformin, in low and high doses (3.5, 30 and 74 mg.g-1 b.w.) increased glycogen storage on diabetic rat ventricle, from 0.19 ± 0.007 (control group) to 0.38 ± 0.007 mg.100 mg-1, 0.5 ± 0.05 mg.100 mg-1 and 0.7 ± 0.04 mg.100 mg-1, p< 0.05, respectively. The treatment with glibenclamide alone or associated to metformin increased glycogen, too. In the control group, isolate hearts showed a rapid increase on ventricular pressure, just initiation of NE perfusion (145 ± 9.7 mmHg), followed by a slow fall to 99 ± 3 mmHg. Similar changes was found on the derivates DP/Dt+ and DP/Dt-. Metformin (3.5 and 30 mg.g-1), glibenclamide and glibenclamide associated to metformin protected cardiac muscle during ischemia, similarly to the control group (p> 0.05). But, the non-treated diabetic group and the group treated by 74 mg.g-1 of metformin, produced a maximal pressure which were inferior to the control group and the reversion of the LVP, DP/Dt+ and DP/Dt- was faster than that of the control group. After ischemia, glycogen was reduced on all groups to 0.09 ± 0.007 mg.100 mg-1 on control group; 0.1 ± 0.006 mg.100 mg-1 on diabetic group and 0.06 ± 0.005 mg.100 mg-1 on DM74. However, this decrease was inferior to that of the group treated by the highest dose. The treatment with glibenclamide alone and associated to metformin diminished glycogen storage from 0.62 ± 0.05 mg.100 mg-1 to 0.19 ± 0.05 mg.100 mg-1 and 0.74 ± 0.03 mg.100 mg-1 to 0.22 ± 0.008 mg.100 mg-1. However its utilization was proportional for all groups. Heart submitted to ischemia decreases its reserve, (p< 0.05 compared to non-ischaemic). These results suggested that high doses metformin, in special 74 mg.g-1 b.w., indicated as maximal for humans, makes heart prompt to ischemia. Diabetic rat hearts showed an increase on the amount of nuclei, from 21.33 ± 1.17 to 36.6 ± 5 (p< 0.05) and a reduction of its area, from 0.16 ± 0.02 mm2 to 0.08 ± 0.01 mm2 (p< 0.05) in comparison to the control group. The lowest dose of metformin (DM 3.5) diminished the amount of nuclei (36.6 ± 5 vs 22.8 ± 2; p< 0.05) and increased theirs size (0.08 ± 0.01 vs 0.17± 0.01). The amount of nuclei increased to 34.16 ± 1.85 and 47.29 ± 2.92 during the treatment with high metformin doses, (30 and 74 mg.g-1 b.w., respectively), and the nuclei area increased to 0.86 ± 0.05 mm2 and 0.5 ± 0.06 mm2, respectively, differing from control and non-treated diabetic groups. Similar result, was obtained on the group treated by glibenclamide and/or metformin, on cardiac cells, which the nuclei area increased to 0.71 ± 0.09 mm2 and 0.67 ± 0.01 mm2, respectively, (p< 0.001). Conclusions: The increased dispersion of QT intervals during treatment may be subjacent to the risks of arrhythmias that predispose humans to sudden death. Results shown on Langendorff methodology indicate that contraction force decreased, suggesting that ventricle muscle were prone to ischemia. Then, high metformin doses (74 mg.g-1), as indicated for humans, may cause damage to cardiac work during overload. High metformin doses, glibenclamide and glibenclamide associated to metformin increase the number of nuclei, as well, theirs size. Consequently, the ventricle hypertrophy due to an increased cellular activity may cause important injuries to cardiac structure and function. We can conclude that, the increased glycogen content on ventricle was associated to the severity and the duration of diabetes. Then, heart became more susceptible to the ischemia effects
Doutorado
Fisiologia
Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Maria Célia Bertolini
Banca: Paulo Sergio Rodrigues Coelho
Banca: Otavio Henrique Thiemann
Banca: Gustavo Henrique Goldman
Banca: Aline Maria da Silva
Resumo: Resultados prévios, em nosso laboratório, permitiram identificar fatores de transcrição provavelmente atuando como reguladores do metabolismo de glicogênio no fungo Neurospora crassa utilizando uma coleção de linhagens mutantes do fungo contendo ORFS codificadoras de fatores de transcrição individualmente nocauteadas. O presente trabalho teve como objetivo realizar análises funcionais de alguns dos fatores de transcrição anteriormente identificados, tais como o regulador transcricional XlnR, descrito em outros fungos filamentosos como regulador de genes codificadores de enzimas xilanolíticas e/ou celulolíticas e o produto da ORF NCU04390, uma proteína sem função conhecida. Inicialmente foram realizadas análises de acúmulo de glicogênio e da expressão dos genes gsn (codificador da enzima glicogênio sintase) e gpn (codificador da enzima glicogênio fosforilase) durante o crescimento vegetativo (30ºC) e sob condição de estresse térmico (45ºC) nas linhagens mutantes e comparadas à linhagem selvagem. Ambas as linhagens mutantes apresentaram alterações tanto no conteúdo de glicogênio como na expressão dos genes citados anteriormente, o que indicou o possível envolvimento dos fatores de transcrição na regulação do metabolismo do carboidrato. Foram realizados experimentos com o objetivo de investigar a função do fator de transcrição XlnR na regulação do metabolismo de glicogênio. Foi verificado que esta proteína regula os níveis do carboidrato, bem como a expressão do gene gsn quando o fungo foi crescido em fontes alternativas de carbono. Entretanto, o fator de transcrição XLR-1 de N. crassa produzido na forma recombinante em E. coli (inteiro e truncado) não foi capaz de ligar ao motif presente no promotor gsn. Genes codificadores de duas endoxilanases foram identificados no genoma de N. crassa... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo)
Abstract: Previous results from our laboratory using a collection of Neurospora crassa strains mutated in genes encoding transcription factors allowed us to identify transcription factors likely involved in glycogen metabolism regulation. The present work aimed to perform a functional analysis of some transcription factors previously identified, such as the transcriptional regulator XlnR, described in many filamentous fungi as a transcriptional regulator of xylanolitic and/or cellulolitic genes and a protein with unknown function, the ORF NCU04390 product. Initially, analysis of glycogen accumulation and gsn (coding glycogen synthase) and gpn (coding glycogen phosphorylase) gene expression were performed under vegetative growth (30 °C) and under heat shock cond ition (45 ºC) in the two mutant strains and compared to the wild-type strain. Both mutant strains showed changes in the glycogen levels as well as in the gsn and gpn expression, suggesting an involvement of these transcription factors in the regulation of glycogen metabolism. Additional analysis was performed in order to investigate the function of the XlnR transcription factor. It was observed that this transcription factor regulates the glycogen levels as well as the gsn expression under alternative carbon sources. However, the recombinant XLR-1 transcription factor produced in E. coli (entire and truncated proteins) was not able to bind to the XLR-1 motif present in the gsn promoter. Two endoxylanases coding genes were identified in the N. crassa genome database and analysis of their gene expression showed the upregulation of both genes during growth in xylan instead of xylose as carbon sources. This result suggested that the XLR-1 transcription factor is not the only protein that regulates the endoxylanases genes. The transcription factor encoded by NCU04390 ORF was... (Complete abstract click electronic access below)
Doutor

Orientador: Fernanda Klein Marcondes
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba
Made available in DSpace on 2018-08-03T20:21:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bianchi_FabioJose_M.pdf: 1507476 bytes, checksum: fe0a31e90743ed0f1ec35a9dec958c54 (MD5) Previous issue date: 2004
Resumo: O objetivo deste trabalho foi analisar a influência do sexo e do ciclo estral nas respostas metabólicas e hormonais em ratos submetidos a estresse agudo. Ratos com 3 meses de idade, machos e fêmeas ovariectomizadas, ou com ciclo estral regular, foram usados (n = 7-11/grupo). Após a identificação da fase do ciclo estral, manipulação (machos) ou 21 dias após a castração, os animais foram submetidos a uma sessão de natação. Imediatamente após a aplicação do estresse, os animais foram sacrificados sob anestesia para coleta do sangue e dos tecidos. Estes procedimentos também foram realizados em animais controle. Amostras do fígado, coração, músculos sóleo, gastrocnêmio vermelho e branco foram usados para determinação da concentração tecidual de glicogênio (método colorimétrico do fenol-sulfúrico). Após a coleta de sangue e centrifugação, o plasma foi usado para determinação da concentração plasmática de glicose, triglicerídeos, corticosterona, estradiol e progesterona. A glicose e o triglicerídeo plasmáticos foram determinados por ensaios enzimáticos-colorimétricos. As determinações hormonais foram feitas por radioimunoensaio. Os dados foram analisados por ANOVA bifatorial seguida do teste de Tukey com nível de significância 5%. Ratos machos e fêmeas em diestro controle apresentaram maior concentração de glicogênio hepático quando comparados às demais fases do ciclo estral. A natação induziu uma diminuição neste parâmetro em todos os grupos analisados. Com relação ao glicogênio no músculo cardíaco, ratas em metaestro controle apresentaram menor concentração comparadas aos demais grupos e o estresse por natação causou mobilização em todos os grupos, exceto nesta fase do ciclo estral. Ratos machos e ratas em proestro controle apresentaram respectivamente concentração estatisticamente maior e menor de glicogênio no músculo sóleo comparados aos demais grupos e o estresse por natação induziu uma diminuição deste carboidrato em machos e fêmeas em estro, sem ocorrer alteração nas demais fases. Com relação ao glicogênio nos músculos gastrocnêmico vermelho e branco, machos apresentaram maior concentração basal deste polissacarídeo comparado aos demais grupos controle. Neste tecido o estresse por natação induziu diminuição nas concentrações de glicogênio em todos os grupos analisados. O grupo de ratas em metaestro controle apresentou maior glicemia em relação aos demais grupos. Após o estresse, ratos machos e fêmeas em proestro e em diestro apresentaram elevação neste parâmetro, sem alteração em fêmeas em estro e em metaestro. Com relação às concentrações plasmáticas de triglicerídeos, ratas em diestro controle apresentaram valores mais elevados que os demais grupos. Machos, fêmeas em proestro, estro e em metaestro submetidos à natação apresentaram elevação neste parâmetro, enquanto que o grupo de ratas em diestro apresentou diminuição. Ratas em metaestro apresentaram maiores concentrações plasmáticas de corticosterona em relação aos demais grupos controle. Após o estresse, houve elevação neste parâmetro em todos os animais, validando o modelo de estresse utilizado, porém este aumento foi menor em machos. As concentrações basais de estradiol foram mais elevadas em ratas em proestro em relação aos outros grupos analisados. Após a sessão de natação somente nesta fase foi observado aumento, sem alterações nas demais fases do ciclo estral. Com relação à concentração plasmática de progesterona, ratas em metaestro controle apresentaram concentração mais elevada comparadas às demais fases. O estresse induziu aumento e queda respectivamente no metaestro e no proestro. Desta forma, o sexo e o ciclo estral influenciaram a mobilização tecidual de glicogênio, a glicemia, a concentração plasmática de triglicerídeos e a secreção de corticosterona. Também, o ciclo estral influenciou a secreção de estradiol e progesterona após estresse agudo por natação
Abstract: The aim of this work was to analyze the influence of the sex and of the estrous cycle in the metabolic and hormonal responses from rats submitted to acute stress. Bilaterally ovariectomized rats with 3 months of age, males and females, with regular estrous cycle, were used (n = 7-11/grupo). After the identification of the phase of the estrous cycle, manipulation (male) or 21 days after the ovariectomizared, the animals were submitted to one swimming session. Immediately after the stress session, the animals were sacrificed under anesthesia for collection of the blood and tissues. These procedures were also done in control animals. Samples of liver, cardiac, soleus, red and white gastrocnemius muscles were used for glycogen determination (phenol-sulphuric method). After the collection of blood and centrifugation, the plasma was used for determination of the concentration of glucose, triacylglicerol, corticosterone, estradiol and progesterone. The plasmatic glucose and triacylglicerol levels were determined by enzymatic-colorimetric assay. The hormonal determinations were made by radioimunoassay. The data were analyzed by bifactorial ANOVA followed of the Tukey test with level of significance 5%. Male and Female rats in diestrus and ovareictomized control presented higher concentration of hepatic glycogen when compared to the other phases of the estrous cycle. Swimming induced a decreased in this parameter in all groups. Metestrus control rats presented lower glycogen concentration compared to the other control groups. Stress caused its mobilization in all the groups, but not in females at metestrus. Control male and female rats at proestrus showed respectively higher and lower concentration of glycogen in the soleus muscle compared to the other groups. Swimming stress decreased these levels only in males and female rat at estrus. Male and females ovarietomized rats presented higher basal concentration of glycogen in the muscles gastrocnemius red and white, compared to the other control groups. In this tissue the stress induced reduction in the glycogen concentrations in all groups. Control female rats at metestrus presented glucose plasmatic higher in relation to other control groups. After the swimming session, males and ovariectomized and at proestrus and diestrus females presented an increase in this parameter, without alteration in females at estrus and metestrus. Control female at diestrus presented higher plasmatic concentrations of triacylglicerol compared to the other control groups. In males, females at proestrus, estrus and metestrus swimming stress increased this parameter, and reduced it at diestrus female rats. Rats at metestrus presented higher plasmatic concentration of corticosterone compared to other control groups. After the stress, there was an increase in this parameter in all groups, validating the model of stress used. However this increase was lower in males. The basal concentration of estradiol was higher in rats at proestrus compared to the other control groups. After swimming stress the levels of this hormone increased in females at proestrus at control proestrus, without changes in the other groups. Rats at metestrus presented higher plasmatic concentration of progesterone compared to the other phases. Stress increased and decreased this hormone levels respectively at metestrus and proestrus. In summary, the sex and the estrous cycle influenced the tissue glycogen mobilization, glucose and triacylglicerol and corticosterone secretion after acute stress. Also, the estrous cycle influenced the estradiol and progesterone production after acute swimming stress
Mestrado
Fisiologia Oral
Mestre em Odontologia

O trans-resveratrol é uma fitoalexina natural encontrada em uvas, amoras, amendoim e muitas espécies de plantas. Em uvas o trans-resveratrol é responsável pela proteção natural contra doenças e sua concentração depende da origem geográfica, da variedade e dos métodos de fabricação do vinho; sendo considerado por muitos autores como um geroprotetor. O objetivo do presente trabalho foi verificar o efeito do transresveratrol na longevidade e no metabolismo de carboidratos (glicogênio, atividade e expressão da enzima glicogênio fosforilase - GFT) de Drosophila melanogaster em diferentes idades (0, 7, 14, 18 e 21 dias). Para a análise da longevidade espécimes de D. melanogaster com idade de 10 dias foram colocados em vidros contendo meio de cultura padrão acrescido de água ou dimetilsulfóxido (DMSO) 0,03%, ou trans-resveratrol nas concentrações de 1, 10 ou 20μM para ovoposição durante 24 horas, a prole recebeu os seus respectivos tratamentos durante toda a vida. Para as análises do metabolismo de glicogênio os espécimes de D. melanogaster foram colocados em meio de cultura padrão adicionado de água ou dimetilsulfóxido 0,03% (DMSO) ou ainda, trans-resveratrol na concentração de 1μM dissolvido em DMSO (0,03%) para ovoposição; seus ovos foram mantidos até a eclosão, durante a fase adulta os animais continuaram a receber os seus respectivos tratamentos até os pontos em que foram feitas as determinações bioquímicas e moleculares. Os resultados indicam que o tratamento com trans-resveratrol modulou o metabolismo de carboidratos em fêmeas e em machos de forma diferenciada; contudo, este composto não foi capaz de alterar a expressão gênica da GFT. Nas fêmeas tratadas com trans-resveratrol 1μM verificou-se um aumento de 127% na longevidade quando comparado ao grupo controle. Já nos machos tratados com trans-resveratrol 1μM observou-se um acréscimo de 50% na longevidade quando comparado ao grupo controle. Em ambos sexos tratados com Trans-resveratrol 10 e 20μM não houve aumento significativo da longevidade. Com base nos resultados podemos sugerir que o trans-resveratrol como outros antioxidantes descritos na literatura tem seus efeitos benéficos na menor dose administrada, podendo nas doses mais elevadas estar atuando como um pró-oxidante. Os resultados obtidos sugerem que o trans-resveratrol modula o metabolismo do glicogênio tanto em machos como em fêmeas e aumenta a longevidade do modelo experimental testado.

Os estuários são ecossistemas que apresentam uma constante variação no seu ambiente físico-químico, como teor de oxigênio dissolvido, temperatura ambiente, e principalmente de salinidade da água. O presente trabalho teve como objetivo investigar os efeitos do estresse osmótico (hipo e hiperosmotico) agudo (1h), in vitro, sobre as vias gliconeogênica, glicogênica e lipogênica em tecidos de caranguejos N. granulata. No presente estudo não foram constatadas variações na incorporação de 14C-alanina em glicose ou glicogênio no hepatopâncreas e nas brânquias anteriores. No entanto, foi constatada uma diminuição significativa (p<0,05) na incorporação de 14C-alanina em glicose nas brânquias posteriores durante os ajustes osmóticos a um meio mais concentrado. No hepatopâncreas não foram observadas variações na conversão de 14C-alanina em lipídeos, porém, nas brânquias anteriores houve uma diminuição na síntese de 14C-lipídeo a partir de 14C-alanina no choque hiperosmótico, enquanto que nas brânquias posteriores houve um aumento na síntese de lipídeos durante o choque hiposmótico. O presente trabalho mostra claramente que o fluxo de carbonos da alanina pode ser direcionado tanto para o metabolismo da glicose como de lipídios com o objetivo de aumentar ou diminuir os níveis de aminoácidos intracelulares.