Dissertations / Theses on the topic 'Génomique tumorale'

Les sarcomes pléomorphes sont des tumeurs mésenchymateuses rares caractérisées par de nombreux remaniements chromosomiques. Leur processus d’oncogenèse reste encore mal compris, aucune altération génétique motrice de l’initiation tumorale n’a pu être identifiée de façon récurrente et spécifique à ce jour. Les travaux que j’ai réalisés durant ma thèse avaient pour but de mieux comprendre la biologie de ces tumeurs, notamment les conséquences transcriptomiques de leur remodelage génomique.Nous avons caractérisé les transcrits de fusion exprimés dans ces tumeurs par séquençage haut-débit (RNA-seq). Ceci nous a amené à identifier l’expression de plusieurs transcrits chimériques impliquant le gène TRIO (5,1% des tumeurs). De plus, cette analyse ainsi que l’identification de variants exprimés nous ont permis d’identifier de fréquentes mutations de gènes suppresseurs de tumeurs tels qu’ATRX (16% des tumeurs) et plus généralement des membres du complexe SWI/SNF (47% des tumeurs). Les altérations de ce complexe majeur de remodelage de la chromatine sont associées à une plus grande instabilité génétique et à un phénotype plus agressif.Dans les sarcomes pléomorphes, l’instabilité génétique est liée à la progression tumorale via l’expression d’une signature transcriptomique pronostique. Cette signature, nommée CINSARC, est impliquée dans le contrôle de la mitose et de la ségrégation chromosomique. Nous avons voulu déterminer l’origine de cette expression via une étude intégrant la génomique et des mécanismes de régulation épigénétique, transcriptionnelle et post-transcriptionnelle. Si ces mécanismes ne semblent pas directement causals de l’expression de CINSARC, d’importantes modifications ont pu être mises en évidences. D’un point de vue clinique, nous avons démontré que l’expression de cette signature est un facteur pronostique universel de l’agressivité tumorale dans de nombreux types de cancers. De plus, CINSARC est un meilleur marqueur pronostique que le grade FNCLCC, actuel standard international d’évaluation du risque métastatique des sarcomes des tissus mous. Nous avons ainsi développé une méthode permettant une application clinique routinière de la signature CINSARC afin d’améliorer la prise en charge thérapeutique de ces tumeurs
Pleomorphic sarcomas are rare mesenchymal tumors characterized by many chromosomal rearrangements. Their oncogenic process is still poorly understood, no recurrent and specific genetic alteration able to drive the tumor initiation has been identified yet. The work I did during my thesis had the objective to better understand the biology of these tumors, focusing on transcriptomic consequences of their genomic remodeling.We characterized fusion transcripts in these tumors by high-throughput sequencing (RNA-seq). This led us to identify the expression of several chimeric transcripts involving TRIO (5.1% of cases). Moreover, this analysis and the identification of expressed variants allowed us to identify frequent mutations of tumor suppressor genes such as ATRX (16% of cases) and more generally members of the SWI/SNF complex (47% of cases). Alterations of this major complex of chromatin remodeling are associated with higher genetic instability and more aggressive phenotype.In pleomorphic sarcomas, genetic instability is linked to tumor progression through the expression of a prognostic transcriptomic signature. This signature, termed CINSARC, is involved in mitosis control and chromosome segregation pathways. We wanted to determine the origin of such expression by integrating genomics and epigenetics, transcriptional and post-transcriptional regulation mechanisms. Though these mechanisms do not seem to directly regulate CINSARC expression, important changes have been highlighted. From a clinical standpoint, we demonstrated that the signature expression is a global prognostic factor of tumor aggressiveness in numerous cancer types. In addition, CINSARC is a better prognostic marker than the FNCLCC grading system, the current international standard to evaluate the metastatic risk in soft tissue sarcomas. We consequently developed a method allowing a daily clinical application of the CINSARC signature to improve the therapeutic management of these tumors

Les génomes des cellules cancéreuses subissent de profonds changements tant au niveau de leur structure, qu'au niveau épigénétique. Les tumeurs de sein présentent en particulier des profils d'anomalies génétiques et épigénétiques complexes et hétérogènes. Alors qu'une meilleure compréhension de la dynamique d'apparition des anomalies permettrait de mieux appréhender la complexité des tumeurs, peu d'informations sont disponibles à ce sujet. En effet la plupart des données, ont été, et sont produites à partir de tumeurs primitives ou de lignées cancéreuses établies et ne renseignent pas sur la séquence d'événements qui accompagnent le passage de l'état normal à cancéreux. De ce fait, nous nous sommes intéressés aux étapes précoces de la cancérogenèse. Nos travaux se basent sur l'utilisation d'un modèle de transformation progressive in vitro de cellules épithéliales mammaires primaires (HMEC). Les cellules, transduites de façon séquentielle à l'aide de constructions rétrovirales portant des shARN et différentes combinaisons d'oncogènes, ont été caractérisées à chaque étape au niveau cellulaire et moléculaire (CFH, MeDIP, Micro-array) afin de répondre aux questions suivantes : (1) Quelle est la séquence d'apparition des modifications épigénétiques et structurales au cours de la transformation tumorale ? (2) Les profils d'anomalies génétiques et épigénétiques sont-ils modulés en fonction de la voie oncogénique initialement activée dans la tumeur ? Contrairement aux données de la littérature, nous avons obtenu des cellules transformées grâce à l'expression de seulement deux éléments génétiques définis et non trois. Nos résultats indiquent que l'inactivation de p53 provoque la mise en place d'un terrain favorable à l'acquisition de nouvelles anomalies génomiques mais induit surtout d'importantes modifications du méthylome. De plus nous avons montré que les profils de remaniements génétiques et épigénétiques dépendent de l'oncogène initialement activé. Pour finir, nos résultats indiquent que la nature de l'oncogène initialement activé et responsable de la transformation, conditionne la dynamique de production et de sélection des anomalies et supportent l'hypothèse que l'hétérogénéité du cancer du sein peut être à l'origine de l'activation de voies oncogéniques distinctes
The genome of cancer cells undergoes profound changes at genetic and epigenetic level. Breast tumors exhibit in particular complex and heterogeneous genetic and epigenetic profiles. While a better understanding of the dynamics of these changes could allow a better understanding of tumor complexity, little information is available on this subject. In fact, most data have been, and are produced from primary tumors or established cancer cell lines and do not provide information on the sequence of events that accompany the transition from normal to cancerous state. Therefore, we have been interested in the early stages of carcinogenesis. To this aim, we have developed a stepwise transformation model of HMECs (human mammary epithelial cell) by sequential transduction of oncogenes and/or shRNA. Each cellular variant have been characterized at the cellular and molecular level (CGH, MeDIP, and Micro-array) in order to answer the following questions (1) what is the sequence of structural and epigenetic changes during malignant transformation? (2) The patterns of genetic and epigenetic abnormalities are they modulated according to the oncogenic pathway initially activated in the tumor? Contrary to the literature data, we have obtained transformed cells with the expression of only two defined genetic elements. Our results indicate that p53 inactivation promotes the acquisition of genomic alteration but mainly induces significant changes at the DNA methylation level. In addition, we have shown that the remodeling of genetic and epigenetic profiles depends on the oncogene initially activated. Finally, our results suggest that the nature of the oncogene initially activated and responible for the transformation affects the dynamics of production and selection of anomalies, and supports the hypothesis that the heterogeneity of breast cancer may be due to activation of different oncogenic pathways

Le cancer bronchique est la première cause de mortalité par cancer, notamment parce qu’il est le plus grand pourvoyeur de métastases cérébrales (MC). Une meilleure connaissance de la biologie des cancers bronchiques non à petites cellules (CBNPC) a amélioré le pronostic des patients. Cependant, l’efficacité cérébrale des traitements est variable. Ce travail avait pour objectif une meilleure connaissance de la biologie des MC de CBNPC et de l’hétérogénéité génomique entre la MC et les autres sites tumoraux pour guider la prise en charge thérapeutique des malades.Nous avons montré que l’efficacité intracérébrale de l’immunothérapie était variable et que l’incidence et l’évolution des MC étaient associées au profil mutationnel. Nous avons ensuite comparé le séquençage pan-exomique de paires d’échantillons de tumeurs pulmonaires (TP) et MC de patients atteints de CBNPC et identifié 13 gènes spécifiques des MC.Nous avons ensuite constitué une cohorte prospective de patients atteints de CBNPC avec MC opérées. Dans ces MC, nous avons trouvé un nombre de mutations très élevé, dont 2 mutations des 13 gènes. De plus, l’ADNtc dans le LCR était représentatif des mutations des MC. Ces travaux soulignent l’importance de l’hétérogénéité tumorale entre les MC, les TP et l’ADNtc. Il est difficile d’établir une signature spécifique des MC, notamment du fait du faible nombre d’échantillons disponibles et de la difficulté d’obtenir des paires TP/MC mais l’étude de l’ADNtc dans le LCR peut être une piste. Nous allons ensuite étudier le microenvironnement cérébral et utiliser d’autres approches comme la modélisation mathématique pour une meilleure compréhension de la biologie des MC
Lung cancer is the leading cause of cancer-related deaths, partly because it is the first cause of brain metastases (BM). A better knowledge of non-small cell lung cancer (NSCLC) molecular biology and the development of targeted therapies have improved patients’ outcomes. However, the intracranial efficacy of these new treatments is inconstant. The objective of this work was a better knowledge of BM biology in lung adenocarcinoma and a better knowledge of genomic heterogeneity between BM and PT to guide patients’ treatment strategy.We showed that intracranial efficacy of immunotherapy was inconstant and that BM incidence and recurrence after local treatment was associated with mutation profile. We then compared whole exome sequencing of paired frozen samples from PT and BM of patients with NSCLC and identified 13 genes with recurrent mutations in BM never mutated in PT samples. We then analyzed a prospective cohort of patients with CBNPC and resected BM. In these BM, the number of mutations was high, including 2 genes among the 13 genes identified. Moreover, CSF ctDNA was representative of BM mutation status.This work highlights the importance of tumor heterogeneity between BM, PT and ctDNA. Whereas it is difficult to establish a specific signature of BM because of the poor number of samples available and the difficulty to have paired PT/BM samples for each patient, CSF ctDNA study may be a way to assess BM biology. We plan to study brain microenvironment and use new approaches such as mathematical modeling for a better understanding of BM biology

Le glioblastome (GBM) est une tumeur cérébrale maligne de grade IV dont le pronostic est de 14,6 mois avec le traitement standard. Le pronostic des patients est difficile à préciser et de meilleures connaissances de révolution de ce cancer nous permettraient d’identifier de nouveaux marqueurs permettant d’estimer plus précisement le stade du cancer et ainsi, la survie des patients. L’équipe du Dr Ju Yan a étudié les profils de longueurs individuelles des télomères des cellules de patients normaux et de patients atteints de leucemie myéloïde chronique (LMC) avec les techniques d’analyse des fragments terminaux de restriction des télomères (TRF) et d’hybridation in situ observée en fluorescence de façon quantitative (Q-FISH). En utilisant les mêmes protocoles sur les GBM, nous avons évalué les longueurs individuelles des télomères et leurs profils. L’analyse complète de onze spécimens de GBM humains et de la lignée cellulaire de glioblastome U-87 MG nous a permis d’observer que les télomères 12p, 16p, 22q, 17p, 17q, 19p et 22q sont maintenus plus longs dans les profils de longueurs individuelles relatives. En comparant avec les données du Dr Yan, nous avons pu déterminer que les télomères 21p et 2q sont fréquemment observés parmi les télomères les plus courts dans les GBM et dans la LMC. Les comparaisons des télomères significativement plus courts à ceux plus longs nous ont permis d’identifier l’allongement des télomères 12p, 16p et 20q de même que le raccourcissement des télomères 3q, 9p et 22q comme étant des événements potentiellement spécifiques à révolution des GBM. Les télomères 12q et 22q ont été observés parmi les télomères les plus courts et parmi les plus longs dans différents cas de GBM et de LMC, suggérant que le maintien de la longueur et le raccourcissement de ces extrémités peuvent jouer un rôle dans l'évolution du cancer. L’utilisation du FISH multicolore (M-FISH) nous a permis d’identifier les chromosomes impliques de façon récurrente parmi les anomalies de nombre et de structure. Nous avons noté les délétions des chromosomes 1, 2, et 20 ainsi que des segments des chromosomes 6, 11q , 13q, 14q et 18. Au niveau des duplications, on retrouve majoritairement le bras court du chromosome 4 et un segment du chromosome 7. Nous avons aussi observé dans nos analyses que les chromosomes 1, 6, 12, 13, 22 et 14 sont particulièrement impliqués dans les réarrangements et leurs télomères sont fréquemment retrouvés dans les plus courts (1p, 1q, 13p, 22p et 6p). Globalement, nous avons observés que les tumeurs décrites comme étant agressives sont associées avec une survie courte après diagnostic et elles présentent des télomères courts et/ou plusieurs anomalies chromosomiques. Les tumeurs décrites comme étant indolentes sont associées avec une survie longue après diagnostic et elles présentent des télomères souvent de longueur normale et un nombre inférieur d’anomalies chromosomiques comparativement aux tumeurs agressives.

La colibactine est une toxine largement distribuée chez Escherichia coli. Sa synthèse est assurée par des enzymes codés par un îlot génomique appelé pks. Elle provoque des cassures double brin de l'ADN, des mutations, d'important remaniements chromosomiques et favorise l'émergence de tumeurs intestinales en modèle murin. Par ailleurs, les E. coli producteurs colonisent fréquemment les tumeurs de patients atteints de cancer colorectal. Nos travaux montrent que les bactéries productrices de colibactine induisent la sénescence cellulaire et stimulent de façon indirect la prolifération cellulaire in vitro et la croissance tumorale in vivo. L'action pro-proliférative des cellules rendues sénescentes par les E. coli producteurs de colibactine est liée à la production du facteur de croissance HGF. L'étude de la signalisation cellulaire responsable montre l'implication du facteur de transcription c-Myc, l'activation de la transcription d'un microARN qui en ciblent la peptidase SENP1, et une modification de la SUMOylation des protéines de l'hôte, notamment p53, un effecteur connu de la sénescence cellulaire. Cette voie de signalisation et les transcripts codant HGF ont été analysés dans des tumeurs de patients atteints de cancer colorectal colonisés ou non par des E. coli producteurs de colibactine. Les résultats obtenus soutiennent les résultats obtenus in vitro et dans le modèle murin. L'ensemble suggère que les bactéries productrices de colibactine favorisent l'émergence d'un micro-environnement tumoral sénescent susceptible de favoriser la croissance tumorale via la sécrétion de HGF. En parallèle, nous avons caractérisé sur le plan structural et fonctionnel la protéine ClbP de l'îlot pks. Les résultats obtenus montrent que ClbP est une peptidase à serine active dont le site actif est extracytoplasmique et indispensable à l'activité biologique de l'îlot pks. Des inhibiteurs « drug-like » de ClbP ont été identifiés à l'aide d'approches structurales, biochimiques, cellulaires et microbiologiques. Ces molécules se lient au site actif de ClbP avec une affinité nanomolaire et bloquent les activités génotoxiques et pro-tumorales des E. coli producteurs de colibactine. ClbP constitue donc une cible thérapeutique potentielle permettant de bloquer les effets délétères des E. coli producteurs de colibactine
The colibactin toxin is widely distributed in Escherichia coli. Its synthesis is performed by enzymes encoded by the genomic island pks. It causes DNA double-strand breaks, mutations, chromosomal rearrangements in host cells and contributes to tumorigenesis in a mouse model. In addition, colibactin-producing E. coli are frequently isolated from tumors of patients with colorectal cancer. Our work shows that colibactin-producing bacteria induce cellular senescence and, consequently, can indirectly stimulate cell proliferation in vitro and tumor growth in vivo. The pro-proliferative effect mediated by these senescent cells is due to the secretion of growth factors, in particular HGF. The cell signaling responsible for cellular senescence shows the involvement of the transcription factor c-Myc, the transcription of a microRNA targeting the peptidase SENP1, and a modification of protein SUMOylation, including p53, a well-known effector of cellular senescence. This signaling pathway and HGF-encoding transcripts were analyzed in tumors of patients with colorectal cancer colonized or not by colibactin-producing E. coli. The results support the findings obtained in vitro and in the mouse model. Taken together, the results suggest that, in tumors, colibactin-producing bacteria promote the emergence of a senescent microenvironment, which can stimulate tumor growth via the secretion of HGF. In parallel, we determined the structure and function of the pks-encoded protein ClbP. The results show that ClbP is an active serine peptidase, whose active site is extracytoplasmic and essential to the biological activity of pks island. "Drug-like" inhibitors of ClbP were identified using structural, biochemical, cellular and microbiological approaches. These molecules bind to the active site of ClbP with nanomolar affinity and block the genotoxic and pro-tumoral activities of colibactin-producing E. coli. ClbP is therefore a potential therapeutic target to block the deleterious effects of bacteria-producing colibactin

Nous avons mis en évidence par hybridation génomique comparative (CGH) un profil simple et spécifique d'aberrations chromosomiques pour des stades cliniques précoces de cancers VADS, qui n'implique de manière récurrente que les chromosomes 3, 8 et 11. Le déséquilibre chromosomique le plus fréquent est le gain partiel ou total du chromosome 3q, détecté dans 67 % des cas. Dans la région consensus de gain 3q26-qter, deux oncogènes candidats émergent de la littérature par leurs fonctions liées à la cancérogenèse : PIK3CA en 3q26 et p63 en 3q28. Nous avons montré, par RT-PCR quantitative, que seules des tumeurs ayant un gain en 3q26 présentent une sur-expression significative de PIK3CA par rapport à des tissus normaux alors que p63 est fortement exprimé dans la majorité des tumeurs, indépendamment du nombre de copies du locus 3q28. PIK3CA, contrairement à p63, semble donc participer à la progression des tumeurs VADS en conséquence d'un gain en 3q. Afin de cartographier à haute résolution les amplifications en 3q dans les cancers VADS, nous avons mis en place au laboratoire une méthode développée récemment, la CGH-array. Nous avons détecté par cette méthode une amplification de haut niveau et de petite taille en 3q25. 3 dans une lignée cellulaire de cancer VADS. Nous avons montré, sur puce d'ADNc et par RT-PCR quantitative, que 4 gènes amplifiés en 3q25. 3 sont sur-exprimés en conséquence dans cette lignée. Seul un de ces gènes, cyclin L, est également sur-exprimé de façon significative dans une population de 20 tumeurs primitives comparées aux tissus normaux correspondants. Ce gène code pour une cycline potentiellement impliquée dans l'entrée en cycle cellulaire. Nous proposons donc cyclin L comme candidat à la fonction d'oncogène dans les cancers VADS. Notre résultat illustre l'intérêt de l'analyse simultanée des génomes et des transcriptomes tumoraux sur puces à ADN pour isoler de nouveaux oncogènes candidats, amplifiés et sur-exprimés dans les cellules néoplasiques.

Résumé : Les biopsies liquides ouvrent de nouveaux champs d'applications dans la prise en charge des patients au diagnostic, au cours de leur suivi et également en recherche translationnelle. Ces dernières années, de nombreux efforts ont été consacrés au développement de l'ADN tumoral circulant (ADNct) et des cellules tumorales circulantes (CTC). Il y a malgré tout de nombreux terrains encore en friches dans les cancers de l'enfant, et parmi eux dans les sarcomes pédiatriques.Nous avons souhaité explorer dans ce travail différents aspects des applications cliniques éventuelles et d'utilisation de ces technologies pour la compréhension de la biologie des tumeurs. La première partie de ce projet est une revue de la littérature qui se rapporte à l'application de l'ADNct dans les cancers solides pédiatriques. Nous présentons ensuite un travail de recherche qui vise à utiliser les CTC à visée diagnostique dans les sarcomes à translocation. Cette étude présente une approche permettant d'identifier des fusions pathognomoniques de sarcome à partir de très faibles quantités de tissu fixé, de CTC sur des modèles murins ou chez des patients. La deuxième étude présentée s'intéresse à la détection de l'ADNct au diagnostic de rhabdomyosarcome en utilisant les altérations de nombre de copie de chromosome, les réarrangements chromosomiques et les variants de nucléotide. Nous avons démontré que la détection au diagnostic est faisable et a un impact pronostique fort sur le devenir des patients. La dernière partie de ce manuscrit présente le développement d'un processus de traitement d'échantillons de patient pour détecter et isoler des cellules tumorales circulantes dans le but d'analyser les particularités génomiques de cette population à une résolution cellulaire.Ce travail explore certains aspects de l'utilisation de la biopsie liquide dans les sarcomes pédiatriques, parmi de nombreux autres. Il est crucial dans le développement de ce champ de recherche, de maîtriser les particularités intrinsèques de chaque type tumoral et des technologies disponibles. Nous avons démontré l'utilité d'une telle approche au diagnostic dans deux applications. Cette aire de recherche ouvre de nombreuses possibilités qui appellent à poursuivre les efforts afin d'élargir les applications en recherche et en clinique
Abstract: Liquid biopsy is an opportunity for improved diagnosis, treatment monitoring and genomic studies in oncology. Substantial effort in recent years has focused on circulating tumor DNA (ctDNA) and circulating tumor cells (CTC). However, pediatric cancer, including sarcomas, are still largely unexplored disease areas in this field.In this work, we sought to explore several aspects of liquid biopsy applied to pediatric sarcomas including their clinical use at diagnosis and as a tool to understand tumor biology. We first present a review of the literature demonstrating the feasibility of applying liquid biopsy to pediatric solid malignancies. Then, we report a methodological study using CTC for diagnostic purposes in translocation driven sarcomas. This approach identified fusions from as little as two unstained slides of FFPE tumor biopsy tissue, from CTC collected from tumor-bearing mice, and from liquid biopsy samples from patients with known fusion-positive cancers. The second study focuses on ctDNA for prognostication at the time of diagnosis in rhabdomyosarcoma by detecting copy number alterations, rearrangements, and single-nucleotide variants. Our study demonstrates that baseline ctDNA detection is feasible and has prognostic value. The last part of this work presents the development of a workflow to isolate single sarcoma cancer cells for sequencing, with an ultimate goal to analyze CTC genomic features at a single-cell resolution.This work explores several clinically and scientifically relevant aspects of liquid biopsy in pediatric sarcoma. We showed that liquid biopsy has utility at diagnosis in two different applications. Further development in this field will require a strong knowledge of tumor-specific biology, the clinical care of patients with these diseases, and the adaption of new technologies. My findings demonstrate the transformative possibilities this research may bring to the care of patients with pediatric sarcomas

Les protéines kinases de la voie de signalisation de l'Epidermal Growth Factor Receptor sont l'objet d'une dérégulation au cours des cancers broncho-pulmonaires. Les gènes encodant ces protéines sont porteurs de mutations oncogéniques mutuellement exclusives induisant la transformation tumorale des cellules de l'épithélium respiratoire. Ces mutations définissent autant de sous-groupes moléculaires spécifiques caractérisés sur le plan clinique, histologique, et biologique. Notre travail a consisté en l'étude de ces mutations dans trois situations cliniques spécifiques, les cancers broncho-pulmonaires du non-fumeur, les cancers bronchopulmonaires multiples, et les tumeurs thymiques. L'évaluation des polymorphismes génétiques chez les patients non-fumeurs atteints de cancer broncho-pulmonaire suggère le rôle de gènes spécifiques, différents de ceux impliqués chez le patient fumeur. L'étude génomique des cancers broncho-pulmonaires multiples montre la possibilité d'utiliser les mutations oncogéniques pour évaluer le degré de clonalité des lésions tumorales multiples, avec une corrélation significative avec leur analyse histo-pathologique détaillée. L'analyse génomique intégrative des tumeurs thymiques indique l'existence de sous-groupes moléculaires spécifiques, corrélés à la classification histologique, et caractérisés par des mutations oncogéniques prédictives de l'efficacité de certains traitements ciblés. Nos données illustrent les principes de la médecine personnalisée en oncologie thoracique, consistant en l'analyse des caractéristiques moléculaires de chaque tumeur individuelle, pour permettre une meilleure personnalisation de la prise en charge des patients

La voie de signalisation du récepteur des androgènes (RA) reste une cible thérapeutique privilégiée dans les cancers de la prostate (CaP). Ce travail de thèse a abordé trois thématiques : 1) l’identification et l’étude fonctionnelle des mutations du RA, 2) l’étude du lien existant entre les RA tronqués, résultant de mutations non-sens, et l’angiogenèse tumorale et 3) l’étude exploratoire de l’hétérogénéité tumorale dans les CaP. Au cours de la 1e partie, nous avons identifié 90 mutations du RA à l’aide d’un test fonctionnel chez la levure et émis des hypothèses concernant leur implication dans de potentiels mécanismes de résistance à l’hormonothérapie (HT). La 2e partie nous a permis de montrer un lien entre les variants tronqués et l’expression du VEGF-A, médiateur principal de l’angiogenèse. Enfin dans la dernière partie nous avons étudié, par approche de séquençage à haut-débit, l’hétérogénéité tumorale en fonction du temps et du stade de la maladie. L’ensemble du travail a permis une meilleure connaissance des altérations de la voie de signalisation du RA, leur rôle dans les étapes clés de la progression tumorale et l’évolution des anomalies génomiques
The androgen receptor signaling pathway (AR) remains a prime therapeutic target in prostate cancer (PCa). This work focused on three topics: 1) the identification of AR mutations and their functional impact, 2) the assessment of a link between the truncated AR, resulting from nonsense mutations and tumor angiogenesis and 3) an exploratory study of tumor heterogeneity in PCa. In the first part, we identified 90 AR mutations using a yeast-based functional assay and speculated about their involvement in potential mechanisms to hormone therapy (HT) resistance. In the second part we assessed a link between the truncated AR and the overexpression of VEGF-A, the main proangiogenic factor. In the last part we investigated the tumor heterogeneity within the primary tumor and metastasis using a whole exome sequencing approach. This work leads to a better knowledge of the AR signaling pathway alterations, their role in the key steps of tumor progression and the evolution of genomic abnormalities

Il existe une forte corrélation entre perte de polarité des cellules épithéliales et carcinome. Toutefois, la relation de cause à effet reste à découvrir. Dans les cellules souches, la perte de polarité cellulaire et les anomalies de division asymétrique qui en découlent pourraient entraîner des défauts de différenciation cellulaire. Ces anomalies seraient capables d'empêcher la descendance des cellules souches de répondre aux mécanismes qui contrôlent normalement la prolifération cellulaire. Pour tester cette hypothèse, nous avons généré dans la larve de Drosophile des neuroblastes portant des mutations dans différents gènes qui contrôlent la division asymétrique de ces cellules. Nous avons testé le potentiel prolifératif de ces neuroblastes en les transplantant dans des hôtes adultes. Nos résultats montrent que des morceaux de cerveaux de larve comportant des neuroblastes dont les gènes pins, mira, numb ou pros sont mutés peuvent grossir plus de cent fois dans l'hôte. Ces tumeurs envahissent les organes de l'hôte, le tuant en moins de trois semaines. Ces tumeurs deviennent immortelles et peuvent être retransplantées pendant des années. L'instabilité génomique et l'altération des centrosomes, deux caractéristiques fréquentes des carcinomes, n'existent pas dans la phase d'initiation de ces tumeurs. Pourtant, six semaines après la première transplantation, ces deux traits particuliers des carcinomes affectent plus de 10% des cellules tumorales. De nombreux travaux suggèrent que certains cancers pourraient provenir de cellules souches malignes. Nos résultats montrent que la perte de fonction d'un seul gène parmi plusieurs gènes qui contrôlent la différenciation de la descendance des cellules souches peut entraîner une prolifération incontrôlée de ces lignées cellulaires, déclenchant une chaîne d'événements qui dérèglent l'homéostasie cellulaire au sens large et peut conduire au cancer
Loss of cell polarity and cancer are tightly correlated, but a causative relationship has remained elusive. In stem cells, polarity loss and the resulting impairment of asymmetric cell division could bring about cell-fate alterations that could render one or the two daughters unable to respond to the mechanisms that control proliferation in the wild-type lineage. To test this hypothesis we have generated Drosophila larval neuroblasts that are mutant for different genes that control the asymmetric cell-division machinery and assayed their proliferative potential upon transplantation into adult hosts. We have found that pieces of larval brains carrying pins, mira, numb or pros mutant neuroblasts can grow over a hundred-fold the size of the implant, invading other tissues, and killing the hosts in less than three weeks. These tumors become immortal and can be re-transplanted into new hosts for years. Genome instability and centrosome alterations, two frequent traits of malignant carcinomas, are kept at wild-type levels during the initial stages of development in these tumors. However, six weeks after the first transplantation they affect at least 10% of the cells in all tumor lines. Growing evidence strongly suggests that the origin of some tumors may be a cancerogenic stem cell. Our results show that loss of function of any single one of several genes that control the cell-fate asymmetry of stem-cells daughters may result in over-proliferation of this lineage, triggering a chain of events that subverts cell homeostasis in a very general sense, and leads to cancer

Devant le grand nombre de tumeurs du sein triple négatif résistant aux traitements, il est essentiel de comprendre les mécanismes de résistance et de trouver de nouvelles molécules efficaces. En premier lieu, nous analysons deux ensembles de données pharmacogénomiques à grande échelle. Nous proposons une nouvelle classification basée sur des profils transcriptomiques de lignées cellulaires, selon un processus de sélection de gènes basé sur des réseaux biologiques. Notre classification moléculaire montre une plus grande homogénéité dans la réponse aux médicaments que lorsque l’on regroupe les lignées cellulaires en fonction de leur tissu d'origine. Elle permet également d’identifier des profils similaires de réponse aux traitements. Dans un second travail, nous étudions une cohorte de patients atteints d’un cancer du sein triple négatif ayant résisté à la chimiothérapie néoadjuvante. Nous effectuons des analyses moléculaires complètes basées sur du RNAseq et WES. Nous constatons une forte hétérogénéité moléculaire des tumeurs avant et après traitement. Bien que nous observons une évolution clonale sous traitement, aucun mécanisme récurrent de résistance n’a pu être identifié. Nos résultats suggèrent fortement que chaque tumeur a un profil moléculaire unique et qu'il est important d'étudier de grandes séries de tumeurs. Enfin, nous améliorons une méthode pour tester la surreprésentation de motifs connus de protéines de liaison à l'ARN, dans un ensemble donné de séquences régulées. Cet outil utilise une approche innovante pour contrôler la proportion de faux positifs qui n'est pas réalisé par l'algorithme existant. Nous montrons l'efficacité de notre approche en utilisant deux séries de données différentes
Given the large number of treatment-resistant triple-negative breast cancers, it is essential to understand the mechanisms of resistance and to find new effective molecules. First, we analyze two large-scale pharmacogenomic datasets. We propose a novel classification based on transcriptomic profiles of cell lines, according to a biological network-driven gene selection process. Our molecular classification shows greater homogeneity in drug response than when cell lines are grouped according to their original tissue. It also helps identify similar patterns of treatment response. In a second analysis, we study a cohort of patients with triple-negative breast cancer who have resisted to neoadjuvant chemotherapy. We perform complete molecular analyzes based on RNAseq and WES. We observe a high molecular heterogeneity of tumors before and after treatment. Although we highlighted clonal evolution under treatment, no recurrent mechanism of resistance could be identified Our results strongly suggest that each tumor has a unique molecular profile and that that it is increasingly important to have large series of tumors. Finally, we are improving a method for testing the overrepresentation of known RNA binding protein motifs in a given set of regulated sequences. This tool uses an innovative approach to control the proportion of false positives that is not realized by the existing algorithm. We show the effectiveness of our approach using two different datasets

Le pyruvate est rapidement decarboxyle par les mitochondries des tumeurs d'ehrlich pour former de l'acetoine qui, si ajoutee aux mitochondries, est rapidement utilisee pour former de petites quantites d'ethanol et de citrate. Elle a aussi ete detectee dans les mitochondries as 30-d mais pas dans celles du foie de rat controle. Elle resulte de la condensation d'acetaldehyde active et d'acetaldehyde par le complexe pyruvate deshydrogenase tumoral (pdh). Elle controle le metabolisme du pyruvate par l'inhibition competitive du complexe pdh, ainsi que l'oxydation du succinate qu'elle inhibe. La forte accumulation de cholesterol dans les membranes mitochondriales entraine une diminution de la fuite passive des protons. Cette derniere, avec la presence insolite d'isozymes de la creatine kinase et la presence d'une hexokinase liee a la membrane externe de la mitochondrie alimentant la glycolyse a partir d'atp mitochondrial, contribuent a distribuer efficacement les molecules energetiques pour les besoins cellulaires comme la division. Une anomalie de la restriction de l'adn mitochondrial as 30-d accompagne ce metabolisme deviant: un des deux sites de restriction par l'enzyme xba i a disparu. Les molecules normales et mutees coexistent avec une heteroplasmie d'environ 50%

Les cancers coliques ayant des instabilités chromosomiques (CIN) sont les plus fréquents des cancers digestifs. A l’heure actuelle, une succession d’altérations génomiques sont décrites dans la progression tumorale mais aucun consensus n’a permis de valider des marqueurs pronostiques. Une des raisons serait l’hétérogénéité inter-tumorale : une analyse par allélotypage d’adénomes et de carcinomes de différents stades a identifié trois groupes en fonction du nombre des altérations génomiques indépendant du stade clinique, suggérant l’existence de plusieurs voies de carcinogenèse. Mes travaux de thèse sur des adénomes et des carcinomes ont validé les modèles de progression décrits dans la littérature mais en redéfinissant la chronologie d’apparition des altérations (APC, TP53, K-Ras, méthylation) en tenant compte de la localisation anatomique des échantillons. En complément, l’étude du statut génomique du chromosome 20q par allélotypage et FISH a montré un gain complet du bras qui se fait par aneusomie (gain d’un nombre impair de chromosomes) ou tétrasomie (gain d’un nombre pair de chromosomes), ces événements n’intervenant pas simultanément dans la séquence de progression. En parallèle, des puces CGH ont permis d’identifier une microdélétion en 1p36. 11-12 ciblant entre autre le facteur de transcription E2F2. Des expériences de QPCR ont validé la délétion du gène E2F2, qui serait de bon pronostic pour la survie sans événement de patients ayant un carcinome distal. Ces travaux ont permis de redéfinir la séquence d’apparition des anomalies décrites en tenant compte de la localisation (proximale-distale) et caractériser de nouvelles altérations ayant une valeur pronostique
Colon cancer with chromosomal instability (CIN) is the most common gastrointestinal cancer. At present, a series of genomic alterations are described as involved in tumor progression, but no consensus has helped to validate prognostic markers. One reason could be the inter-tumor heterogeneity, because allelotyping on adenomas and and carcinomas of different stages, identified three groups according to the number of genomic alterations independently of clinical stage, suggesting the existence of several pathways of carcinogenesis. My work has confirmed the heterogeneity of alterations and validated the model of progression described in the literature but by redefining more accurately the chronology of the alteration appearance (i. E. APC, TP53, K-Ras, methylation) by taking into account the anatomical location. In addition, studying the chromosome 20q genomic status by allelotyping and FISH showed that the gain of the arm is complete, homogenous and proceeds through aneusomy (odd number of chromosomes) or tetrasomy (even number of chromosomes). In parallel, CGH arrays identified a restraint micro-deletion in 1p36. 11-12, a region including several genes whose transcription factor E2F2. QPCR experiments validated the genomic deletion of the E2F2 gene, deletion which would be of good prognosis for event-free survival of patients with distal carcinoma. This work confirms the involvement of some genomic abnormalities already described in the tumoral initiation and the progression; however, we could redefine the sequence of appearance of these anomalies by taking into account the localization (proximal-distal) and characterized new changes with a prognostic value

Le problème majeur de la chimiothérapie est l'émergence de cellules tumorales résistantes aux traitements. Ce processus est difficile à aborder car les mécanismes de résistance impliquent souvent une panoplie de gènes. L'Hybridation Génomique Comparative identifie des anomalies quantitatives présentes dans un génome. Son intérêt est donc évident pour le ciblage de gènes amplifiés ou délétés et la revue de la littérature présentée ici en témoigne. Après son optimisation, nous avons appliqué la CGH à des lignées cellulaires tumorales chimiorésistantes : une lignée LAL-T résistante à la vinblastine, impliquant la voie P-gp/MDR1; 3 lignées d'adénocarcinomes pulmonaires résistantes à l'étoposide, impliquant des processus indépendants de la voie P-gp; et enfin, 4 lignées d'adénocarcinome ovarien présentant une résistance à la vincristine et une perte de leurs propriétés malignes. La CGH a révélé de nouveaux loci chromosomiques dans ces génomes tumoraux chimiorésistants
Acquired chemotherapy resistance is a major problem in the treatment of many human cancers. This process is difficult to assess because mechanisms of resistance often implicate a panoply of genes. The Comparative Genomic Hybridization identifies quantitative abnormalities present in a genome. CGH interest is thus evident for the targeting of amplified or deleted genes, as testify the review of literature presented in this work. After the optimization of the CGH, we applied it to different chemoresistant tumor cell lines: a ALL-T cell line resistant to vinblastine, mediated by the classical way of P-gp/MDR1; 3 lung adenocarcinoma cell lines resistant to increasing concentrations of etoposide, implicating some process independent to the P-gp way; and finally, 4 ovarian adenocarcinoma cell lines presenting a resistance to various concentrations of vincristine, and a loss of tumorigenicity properties. The CGH reveals new chromosomal loci in these tumor chemoresistant genomes

La première partie du travail a évalué par cytométrie en flux (CMF) les anomalies du contenu en ADN de deux types de tumeurs solides. L’étude de 377 adénomes colorectaux provenant de 301 patients a permis de montrer une corrélation de l’ADN-ploïdie aux critères histopronostiques classiques de ces adénomes (taille, nature histologique, degré de dysplasie). Le suivi effectué pour 159 des 301 patients a montré que l’ADN-aneuploïdie n’était pas un facteur pronostique utile à la prise en charge des patients porteurs d’adénomes colorectaux. L’étude d’une série de 52 carcinomes hépatocellulaires a montré que l’ADN-aneuploïdie évaluée sur du matériel de cytoponction hépatique à l’aiguille fine était un facteur pronostique indépendant. L’évolution des techniques de cytogénétique moléculaire a supplanté la CMF. La deuxième partie de ce mémoire expose l’utilisation des techniques de cytogénétique moléculaires dans l’étude de l’origine de la surexpression de la protéine FAK (focal adhesion kinase) dans des lignées leucémiques et de tumeurs solides. FAK intervient dans les phénomènes d’adhérence cellulaire et se trouve ainsi impliquée dans la carcinogenèse et la progression tumorale (dérèglement du processus de mort cellulaire programmée). L’association des techniques de cytogénétique conventionnelles et du caryotype multicouleurs (M-FISH), de l’hybridation in situ fluorescente (FISH) et de l’hybridation génomique comparative (CGH) a permis de préciser les aberrations génétiques des lignées notamment celles qui concernent le chromosome 8 porteur du gène FAK. Il ne semble pas y avoir de relation entre les anomalies du chromosome 8 et le niveau d’expression de la protéine FAK.

Le mélanome est un cancer de la peau dont l'incidence double tous les dix ans depuis quarante ans. C'est une pathologie multigénique et multifactorielle. Des études épidémiologiques ont permis d'établir le rôle causal des radiations UV aiguës dans l'induction du mélanome. Cet effet cancérogène des UV a été attribué principalement aux UVB, l'action complémentaire des UVA n'étant pas totalement confirmée. En dépit de ces données, le rôle des UVB dans la genèse du mélanome photo-induit reste mal cerné au niveau biologique. De plus, l'identification des sujets à risque pour le mélanome à partir des gènes de susceptibilité actuellement identifiés, est très difficile, imparfaite. Notre laboratoire s'intéresse à la recherche de nouveaux marqueurs biologiques de susceptibilité au mélanome, et à une meilleure compréhension de la mélanocarcinogenèse, afin d'étayer les études épidémiologiques sur le mélanome et de proposer de nouvelles stratégies de prédiction du risque. Dans un premier temps, nous nous sommes intéressés à une protéine de stress impliquée dans certains cancers : la "Pancreatitis Associated Protein-I" (PAP-I). Nous avons montré que celle-ci avait une interaction avec l'invasivité rencontrée dans le mélanome. La structuration du laboratoire a ensuite permis de mettre en place une stratégie plus globale de recherche et de caractérisation des gènes cibles de la mélanocarcinogenèse photo-induite, par une approche de génomique fonctionnelle. Des gènes fonctionnellement liés dans la réponse des mélanocytes au stress UVB ont été déterminés grâce à la technologie des micromatrices à ADN, appliquée à 9000 gènes humains. Parmi les 198 gènes modulés, 159 sont des gènes connus et 39 correspondent à des « Expressed Sequence Tag » (EST). Plusieurs arguments suggèrent que les gènes modulés ont une interaction forte avec la mélanocarcinogenèse. Certains d'entre eux pourraient représenter des gènes candidats pour les stratégies de prédiction moléculaire du risque chez les patients. Deux ESTs, l'EST46 et l'EST111, exprimées de manière différentielle dans les tumeurs et les cellules de mélanome, ont été choisies dans le but de caractériser leur séquence codante entière. Le transcrit entier de l'EST46, qui correspond à un nouveau gène UVB-sensible, a été déterminé. Il possède deux cadres de lecture ouverts potentiels, codant pour les protéines hypothétiques Mel46. 2 et Myo38. Nous avons pu voir, par surexpression instrumentale, que l'expression de ces deux protéines entraînait une diminution de la résistance des cellules de mélanome SK-MEL-2 au stress UVB. La détermination de la séquence du transcrit EST111 a posé plus de problèmes en raison de la présence de séquences répétées de type Alu et de son appartenance probable à une famille de protéines. Dans un programme parallèle du laboratoire, l'expression de ces deux ESTs, dans des mélanocytes naeviques, ainsi que celle d'autres gènes UVB-sensibles est déjà utilisée dans l'élaboration de cartographies d'expression génique en fonction du tableau clinico­épidémiologique. Le but de cette étude est de proposer une stratégie de prédiction du risque objective fondée sur la génomique fonctionnelle.

H19 est un long ARN non codant jouant un rôle clé dans la tumorigenèse et la progression tumorale de nombreux cancers. Notre équipe a montré que l’expression du gène H19 est activée par E2F1, réprimée par des suppresseurs de tumeur comme p53 et RB, et impliquée dans le cycle cellulaire des cellules cancéreuses mammaires. Mes travaux de thèse démontrent que H19 interagit avec p53 dans les cellules cancéreuses mammaires. Ceci entraîne la dégradation de p53, et altère son activité en empêchant sa translocation dans le compartiment nucléaire. Nous montrons que H19 interagit non seulement avec p53 mais aussi avec MDM2, formant un complexe ternaire. De plus, H19 réduit l’activité transcriptionnelle de p53 et empêche l’arrêt du cycle cellulaire, l’induction de l’apoptose et la sénescence des cellules après endommagement de leur ADN. En outre, nous mettons en évidence que l’expression de H19 favorise l’instabilité génomique, entraînant l’accumulation de mutations. Ensuite, nous avons analysé l’implication de H19 dans la réponse aux dommages de l’ADN. Nous montrons que H19 réprime la phosphorylation du variant d’histone H2AX. Ceci s’accompagne d’une augmentation de l’activité de réparation par jonction des extrémités non homologues (NHEJ) et par recombinaison homologue (HR). Des essais comètes révèlent que l’expression de H19 réduit la proportion de cassures de l’ADN, suggérant que H19 permet l’accélération de la réparation de l’ADN. Enfin, nous avons étudié l’implication ainsi que la contribution relative de H19 et de son miR-675 dans l’augmentation du potentiel métastatique mammaire. Nous montrons que H19 comme le miR-675 favorisent la migration et l’invasion des cellules, ainsi que leur clonogénicité. H19 induit la transition épithélio-mésenchymateuse des cellules, mais le miR-675 semble augmenter l’expression des marqueurs épithéliaux et mésenchymateux, suggérant un phénotype hybride ou une transition mésenchymo-éphithéliale. De plus, nous montrons pour la première fois que le miR-675, comme H19, favorise le phénotype souche des cellules cancéreuses mammaires. Pour conclure, mes résultats de thèse mettent en évidence de nouveaux mécanismes impliquant le lncRNA H19 dans la tumorigenèse et la progression tumorale mammaire, suggérant ainsi un rôle pertinent pour H19 en tant que marqueur diagnostic et thérapeutique
H19 is a long non-coding RNA described to play key roles in the progression and metastasis of cancers from different tissue origins. We have previously shown that the H19 gene is activated by E2F1, repressed by p53 and RB tumor suppressors and implicated in breast cancer cell cycle progression. My PhD work demonstrates that H19 can interact with p53 in breast cancer cells. This interaction induces p53 degradation but also impairs p53 function by preventing its translocation into the nuclear compartment. We show that H19 interacts not only with p53 but also with MDM2 to form a ternary complex. Moreover, H19 reduces p53 transcriptional activities and impairs cell cycle blockage, apoptosis induction and senescence of cells after DNA damage. Furthermore, we highlight that H19 expression favors also genetic instability, allowing for the accumulation of gene mutations. Thereafter, we investigated the implication of H19 during the DNA damage response. We show that H19 expression represses the activation of histone variant H2AX. Interestingly, this is accompanied by enhanced repair mechanisms such as non-homologous end-joining (NHEJ) and homologous recombination (HR). Comet assays revealed that H19 expression reduces the DNA breaks proportion, suggesting that H19 accelerates DNA repair. Finally, we determine the implication but also the relative contribution of H19 and its miR-675 in the enhancement of breast cancer metastatic potential. We show that both H19 and miR-675 enhance cell migration and invasion as well as colony formation. H19 induces epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) but interestingly, miR-675 seems to simultaneously increase the expression of both epithelial and mesenchymal markers, suggesting the induction of a hybrid phenotype or mesenchymal-to-epithelial transition (MET). Finally, we demonstrated for the first time that miR-675, like its precursor H19, increases stemness properties of breast cancer cells. To conclude, our findings highlight new mechanisms of lncRNA H19 in breast cancer tumorigenesis and aggressiveness, thus suggesting an interesting role for H19 as a prognostic and therapeutic marker

Le neuroblastome, tumeur embryonnaire d'origine neuro‐ectodermique, représente, après les tumeurs cérébrales, la tumeur maligne la plus préoccupante de l'oncologie pédiatrique. L'extrême hétérogénéité des tumeurs neuroblastiques conduit d'une part, à rechercher les mécanismes de son oncogenèse, d'autre part, à améliorer la prédiction du risque de gravité, au diagnostic de la maladie.Le travail de thèse a consisté, à l'aide d'une cohorte tumorale de patients et de lignées de neuroblastome, à rechercher les microARN impliqués dans la progression tumorale. En comparant des tumeurs de bas risque à celles de haut risque, plusieurs microARN du cluster C14MC, situés au locus 14q32.31, ont été identifiés. L'expression de ces microARN corrèle le pronostic ; les tumeurs de haut risque présentant une perte d'expression différentielle. Ainsi, l'expression de miR‐487b et miR‐410 s'est révélée être un facteur pronostique supérieur à l'algorithme de risque standard actuel (âge, stade, statut de l'amplification de l'oncogène N‐MYC). Le contexte d'empreinte génomique parentale du cluster C14MC a conduit à rechercher d'autres microARN d'intérêt sur le second cluster de microARN du génome, C19MC, lui aussi soumis à empreinte. Dans les tumeurs de haut risque, une hyper‐expression relative du miR‐516a‐5p est significativement associée au pronostic. La combinaison des niveaux d'expression de miR‐487b et miR‐516a‐5p se révèle être un facteur pronostique supérieur aux seuls microARN du cluster C14MC : elle offre une nouvelle stratification de risque.Dans les tumeurs neuroblastiques, la dérégulation d'expression serait circonscrite aux microARN des deux clusters C14MC et C19MC ainsi qu'aux gènes vicinaux DLK1 et MEG3 du locus 14q 32.31, elle résulterait d'anomalies de méthylation. Le traitement de lignées de neuroblastome de phénotype neuronal par des modulateurs de l'épigénome (5‐Azacytidine et acide phényl‐butyrique) lève l'expression des microARN du C14MC et des gènes DLK1 et MEG3. Quant aux gènes cibles des miR‐487b et miR‐516a‐5p, les recherches désignent les gènes N‐MYC, TWIST1 et TWIST2 comme candidats directs ou indirects. Ces résultats et la littérature - rapportant, dans les formes agressives de plusieurs types de cancers de l'adulte, des anomalies d'expression des microARN des clusters C14MC (hypo‐expression) et C19MC (hyperexpression) - suggèrent très fortement l'implication de ces deux clusters dans la carcinogenèse humaine.

La caractérisation exaustive des variations de l'ADN peut aider à progresser dans de nombreux champs liés à la génomique du cancer. Le séquençage nouvelle génération (NGS en anglais pour Next Generation Sequencing) est actuellement la technique la plus efficace pour déterminer une séquence ADN, du aux faibles coûts et durées des expériences comparé à la méthode de séquençage traditionnelle de Sanger. Cependant, la détection de mutations à partir de données NGS reste encore un problème difficile, en particulier pour les mutations somatiques présentes en très faible abondance comme lorsque l'on essaye d'identifier des mutations sous-clonales d'une tumeur, des mutations dérivées de la tumeur dans l'ADN circulant libre, ou des mutations somatiques dans des tissus normaux. La difficulté principale est de précisement distinguer les vraies mutations des artefacts de séquençage du au fait qu'ils atteignent des niveaux similaires. Dans cette thèse nous avons étudié la nature systématique des erreurs dans les données NGS afin de proposer des méthodologies efficaces capables d'identifier des mutations potentiellement en faible abondance. Dans un premier chapitre, nous decrivons needlestack, un nouvel outil d'appel de variants basé sur la modélisation des erreurs systématiques sur plusieurs échantillons pour extraire des mutations candidates. Dans un deuxième chapitre, nous proposons deux méthodes de filtrage des variants basées sur des résumés statistiques et sur de l'apprentissage automatique, dans le but de d'améliorer la précision de la détection des mutations par l'identification des erreurs non-systématiques. Finalement, dans un dernier chapitre nous appliquons ces approches pour développer des biomarqueurs de détection précoce du cancer en utilisant l'ADN circulant tumoral
Comprehensive characterization of DNA variations can help to progress in multiple cancer genomics fields. Next Generation Sequencing (NGS) is currently the most efficient technique to determine a DNA sequence, due to low experiment cost and time compared to the traditional Sanger sequencing. Nevertheless, detection of mutations from NGS data is still a difficult problem, in particular for somatic mutations present in very low abundance like when trying to identify tumor subclonal mutations, tumor-derived mutations in cell free DNA, or somatic mutations from histological normal tissue. The main difficulty is to precisely distinguish between true mutations from sequencing artifacts as they reach similar levels. In this thesis we have studied the systematic nature of errors in NGS data to propose efficient methodologies in order to accurately identify mutations potentially in low proportion. In a first chapter, we describe needlestack, a new variant caller based on the modelling of systematic errors across multiple samples to extract candidate mutations. In a second chapter, we propose two post-calling variant filtering methods based on new summary statistics and on machine learning, with the aim of boosting the precision of mutation detection through the identification of non-systematic errors. Finally, in a last chapter we apply these approaches to develop cancer early detection biomarkers using circulating tumor DNA

Le cancer est désormais considéré comme une maladie génomique de la cellule. Les moyens d’étude de l’oncogénome étaient basés sur les différentes modalités du caryotype, peu résolutif. L’application des techniques de micromatrices d’oligonucléotides, notamment l’aCGH, a permis une avancée majeure dans la caractérisation des génomes des cancers.La première partie de notre travail a porté sur les lymphomes de Burkitt (LB), caractérisés par une translocation entre un gène d'immunoglobuline et MYC. L’étude portait sur 12 tumeurs primaires et 15 lignées cellulaires. L’aCGH (44K et 244K), concordait avec les cytogénétiques morphologique et moléculaire (FISH) sauf pour les translocations. Plus de la moitié des variations du nombre de copies (<2Mb) étaient des polymorphismes (CNV). Les anomalies pathologiques (CNA) (n=136) intéressaient les régions suivantes : gains 1q, 13q, 7q, 8q, 2p, 11q et 15q ; pertes 3p, 4p, 4q, 9p, 6p, 17p, 6q, 11pterp13 et 14q12q21.3. Vingt régions minimales critiques (MCR) d’une taille varie entre 0.07-71.36 Mb, étaient délimitées. Trois MCR étaient identifiées sur le 1q : 1q21.1q25.2, 1q32.1 et 1q44. La région proximale de 1q21.1q25.2 était le siège d’une amplification, contenant entre autres les gènes BCA2, PIAS, BCL9. L’étude par transcriptome, sur 15 lignées, a démontré la surexpression uniquement de BCL9, remanié dans les LAL B et faisant partie de la voie de signalisation de MYC. Sur la région 11q23.1, le gain intéressait le gène POU2AF1 dont le messager était élevé. La MCR 13q31.3q32.1 était le siège d’une amplification contenant ABCC4, et le polycistron miR17-92. La corrélation des résultats d’aCGH à ceux du transcriptome et du mirnome ont démontré une surexpression du miR17-92 qui contrôle le développement des lymphocytes B et intervient dans la voie de signalisation de MYC. Sur le 9p21.3, la perte emportait le locus p16INK4A/p15INK4B. Le transcriptome avait démontré une sous expression de p15INK4B. Le locus p16INK4A/p15INK4B contrôle les 2 voies majeures, pRB et p53.La seconde partie de notre travail a consisté à étudier 17 tumeurs congelées de carcinomes adénoïdes kystiques (CAK) par aCGH 44K. Les CNA étaient validées par FISH et/ou MLPA. L’expression protéique était étudiée par immunohistochimie. Les pertes excédaient les gains (41 versus 24). La t(6;9)(q23;p22) récurrente dans les CAK était indétectable car équilibrée. Dans un seul cas, le der(6)t(6;9) est probablement présent sur le profil aCGH. Les MCR les plus fréquentes (-6q22 et -6q24) n’incluaient pas 6q23. Treize MCR étaient identifiées. La MCR délétée en 8q impliquait le miR-124A2 qui régule les gènes CDK6 et MMP2. Sur le 9p21.3, le locus p16INK4A/p15INK4B était de nouveau perdu. Des gains isolés étaient observés au niveau des locus CCND1, KIT/PDGFRA/KDR, MDM2 et JAK2. Le gène MDM2, qui était amplifié sous forme de double minutes, est un élément clé de l’axe p16INK4A-ARF-p53.Pour la troisième partie de notre travail nous avons étudié 60 tumeurs primaires d’adénocarcinomes pulmonaires (AD) de non fumeur par aCGH (244K). Dans 50/60 tumeurs, le nombre de MCR était de 14. Cinq MCR contenaient un seul gène (MOCS2, NSUN3, KHDRBS2, SNTG1 et ST18). Une MCR gagnée, 5q35, contenait le gène NSD1. Une amplification, sous forme de HSR et mise en évidence par FISH, intéressait l’oncogène FUS. Une PCR quantitative avait permis de confirmer la surexpression FUS. A notre connaissance, c’est la première étude qui incrimine le gène FUS dans la carcinogenèse de l’AD du non-fumeur. D’autres gènes étaient également impliqués : ARNT, BCL9, CDK4, p15INK4B, EGFR, ERBB2, MDM2, MDM4, MET, MYC, NKX2-1 et KRAS. Un clustering non supervisé avait permis de dégager un groupe avec un gain de MYC ; un autre groupe caractérisé par la perte des gènes suppresseurs RB et WRN et un dernier groupe caractérisé par un gain 7p et 7q, et présentait une fréquence élevée de mutations de l’EGFR. Dans 10/60, le nombre de CNA était très rare et aucune MCR n’était détectée
Much of our current understanding of cancer is based on the hypothesis that it is a genetic disease, arising as a clone of cells that expand in an unregulated fashion because of somatically acquired mutations. High-throughput tools for nucleic acid characterization, such as array comparative genomic hybridization (aCGH), now provide the means to conduct comprehensive analyses of somatic anomalies in the oncogenome.In the first part of our work we have carried out a fine mapping of additional chromosomal anomalies in Burkitt lymphoma (BL). The hallmark of this disease is the translocation t(MYC;IG). We have applied whole-genome 244K and 44k oligonucléotides aCGH to 15 cells lines and 12 primary tumors of BL respectively. Karyotype and FISH analysis were used to validate aCGH results. As expected, all translocations remained undetectable with aCGH. More than half of the copy number alterations (CNAs) < 2 Mb were mapped to Mendelian CNVs, including GSTT1, and BIRC6. Somatic cell line-specific CNVs localized to the IG locus were consistently observed with the 244 K aCGH platform. Among 136 CNAs, gains were found in 1q, 13q, 7q, 8q, 2p, 11q and 15q. Losses were found in 3p, 4p, 4q, 9p, 13q, 6p, 17p, 6q,11pterp13 and 14q12q21.3. Twenty one minimal critical regions (MCR), (range 0.04–71.36 Mb), were delineated in tumors and cell lines. Three MCRs were localized to 1q: 1q21.1q25.2, 1q32.1 et 1q44. The proximal one was mapped to 1q21.1q25.2 with a 6.3 Mb amplicon (1q21.1q21.3) harboring BCA2, BCL9 and PIAS3. Only BCL9 high level transcrit was noted on oligonucleotide microarray gene expression that was done on 15 cells lines. BCL9, was implicated in a LAL B translocation t(1;14)(q21;q32) and it is a member of MYC pathway. The 13q31.3q32.1, 89.58–96.81 Mb MCR contained an amplicon with several genes. The miR-17-92 cluster, upregulated on mirnome analysis that was done on 15 cells lines, is the gene driver of 13q MCR. The miR-17-92 cluster is a member of MYC pathway. The 9p21.3 MCR harbored p16INK4A/p15INK4B locus which is downregulated. MYC activates ARF,a protein encodes by p16INK4A/p15INK4B locus. . On the second part of our work, a 44k aCGH was applied on 17 frozen adenoid cystic carcinoma (ACC) to delineate with a high resolution the CNA associated with ACC. aCGH results were validated with FISH and/or MLPA. Protein expression was screened with immunohistochemistry analysis. The translocation t(6;9)(q23;p23p24)/ MYB-NFIB recurrent in ACC, was not detected with aCGH. In one case, the der(6)t(6;9) was suspected in the aCGH pattern. There were recurrent gains at 7p15.2, 17q21–25, 22q11–13, and recurrent losses at 1p35, 6q22–25, 8q12–13, 9p21, 12q12–13, and 17p11–13. Thirteen MCR were detected. The recurrent deletion at 8q12.3–13.1 contained miRN124A2 gene, whose product regulates MMP2 and CDK6. The 9p21.3 MCR harbored p16INK4A/p15INK4B locus which was deleted. On 17p11p13, the MCR contained several genes and TP53 was deleted in 2 cases. The MDM2 gene, a member of p16INK4A-ARF-p53 pathway, was amplified and overexpressed in one case. Among the other unique CNAs, gains harbored CCND1, KIT/PDGFRA/KDR, and JAK2. On the third part of this these, a high-resolution 244K aCGH was conducted on 60 frozen lung adenocarcinoma (AD) of never smokers patients in order to establish a catalog of CNA. In 50/60 tumors, fourteen new MCR of gain or loss was noted. One larger MCR of gain contained NSD1.One focal amplification and nine gains contained FUS. NSD1 and FUS are oncogenes hitherto not known to be associated with lung cancer. FUS was over-expressed in 10 tumors with gain of 16p11.2 compared to 30 tumors without that gain. A FUS hsr was observed with FISH screening. FUS was over-expressed in 10 tumors with gain of 16p11.2 compared to 30 tumors without that gain. Other cancer genes present in aberrations included ARNT, BCL9, CDK4, p15INK4B, EGFR, ERBB2, MDM2, MDM4, MET, MYC, NKX2-1 and KRAS

Les protéines à " Methyl-CpG-binding domain " (MBD) jouent un rôle important dans l'interprétationde la méthylation de l'ADN conduisant à la répression transcriptionnelle via le recrutement decomplexes remodelant la chromatine. Dans les cancers, MBD2 jouerait un rôle essentiel dans la perted'expression des gènes hyperméthylés. Ainsi, MBD2 serait une cible potentielle pour rétablir, enpartie au moins, leur expression. Caractériser, à l'échelle du génome, la distribution de MBD2 et sesconséquences sur la répression transcriptionnelle au cours de la cancérogenèse est donc une étapeincontournable. (1) L'impact sur l'expression génique de l'inhibition de MBD2 par interférence àl'ARN, a été étudié en utilisant des puces, dans des cellules normales MRC5. La perte de MBD2n'induit pas de surexpression génique globale et la densité en CpG des promoteurs méthylés sembleêtre une composante importante dans la force de répression par MBD2. (2) Les profils de méthylationde l'ADN, de liaisons de MBD2 et de l'ARN polymérase II dans les cellules HeLa ont été analysés parChIP-on-chip avec des puces promoteurs. Ces mêmes approches couplées à l'analyse de l'acétylationdes histones H3 ont été réalisées dans un modèle cellulaire syngénique de progression tumoralemammaire humain. Dans les modèles étudiés, une forte proportion de gènes silencieux et méthylés estliée par MBD2. Les comparaisons entre cellules immortalisées et transformées ne montrent pas dechangements majeurs de la méthylation de l'ADN ou de la répression transcriptionnelle, par contreune redistribution de MBD2 parmi ces sites est observée, suggérant une redondance entre les protéinesliant l'ADN méthylé.

Le cancer du pancréas est un problème majeur de santé publique. Le mauvais pronostic de l'adénocarcinome du pancréas est lié à un diagnostic tardif, une progression rapide, et à une mauvaise réponse aux traitements médicaux disponibles. Une caractérisation complète des altérations génétiques moléculaires sont aujourd'hui nécessaires pour permettre une détection plus précoce et identifier/élaborer de nouvelles thérapies ciblées dans le traitement de l'ADK du pancréas. En utilisant la technique d'hybridation génomique comparative, nous avons étudié les altérations du génome de 39 ADK. Plusieurs pertes récurrentes ont été observées, ainsi que des gains de matériel génétique. A partir de ces résultats, nous avons voulu aller plus loin en identifiant les gènes qui pourraient avoir des conséquences au niveau transcriptomique. A partir de données publiques, nous avons comparé les profils d'expression d'ADK (n=419) et de pancréas normal (n=105). Parmi les gènes trouvés amplifiés et/ou gagnés par aCGH, 170 (48%) étaient surexprimés dans les ADK par rapport au tissus normal. Les principales voies de signalisation impliquées touchaient la régulation du cycle cellulaire, les voies TP53 et TGFß. Parmi les gènes délétés en aCGH, 141 (41%) étaient sous exprimés dans les ADK du pancréas par rapport au tissus normal et étaient essentiellement liés au « métabolome » de la cellule pancréatique. Enfin, nous avons identifié une dizaine de gènes dont l'expression pourrait être liée à la survie des patients. Certains de ces gènes pourraient être des candidats à tester en tant que biomarqueurs pronostic ou cibles pour le développement de nouvelles thérapeutiques
Pancreatic adenocarcinoma (PDCA) is a major public health problem in France and worldwide. The inoperability and the poor prognosis of the PDCA are due to late diagnosis, rapid tumor progression (>80% of patients displayed metastases at diagnosis), early recurrences after resection, and poor response to available therapies. Innovative approaches and a comprehensive characterization of molecular genetic alterations are dearly needed to help develop techniques of early detection, identify new molecular targets and devise novel targeted-therapies (Hidalgo, 2010). Using high-resolution array-comparative genomic hybridization (aCGH), we studied the genome alterations of 39 fine-needle aspirations from PDCA. Recurrent losses were observed and comprised several known tumor suppressor genes. We identified frequent genetic gains. With this study, we decided to go one step further by identifying genes that might also be deregulated at the transcriptomic level. We started our analysis with a population of PDCA (n=419) versus normal pancreas (n = 105). Among the 352 genes found amplified and/or gained by aCGH, 170 (48%) were up regulated at the transcriptional level in PDCA compared to normal pancreatic tissues. Major pathways involved were cell cycle, TP53 and TGFß. Among the genes located in regions of losses, 141 (41%) were down regulated in PDCA compared to normal tissues. Furthermore, some genes were found related to a patients' survival With this study, we highlighted novels genes associated to PDCA oncogenesis. Some of those candidates should be further investigated as prognosis markers or as potential targets for new therapeutic approaches

L’ataxie-télangiectasie (A-T) est une maladie génétique récessive rare de l’enfant, caractérisée par un syndrome neurodégénératif, un déficit immunitaire et des télangiectasies cutanées. La maladie est causée par des mutations bialléliques inactivatrices dans le gène ATM (Ataxia-Telangiectasia Mutated). La maladie implique aussi un risque élevé de développer des cancers, en particulier des leucémies et des lymphomes. Les sujets atteints d’A-T ont également une radiosensibilité accrue. Les femmes de plus de 50 ans apparentées à un enfant atteint d'A-T, porteuses d’une seule copie mutée d’ATM (HetAT), ont un risque plus élevé de cancer du sein que les femmes de la population générale (RR 4,94, 95%CI 1,90 - 12,09). Des études épidémiologiques confirment l’implication d’ATM dans la prédisposition au cancer du sein et montrent que 0,5% à 1% de la population porte une mutation délétère dans ce gène mais le risque de cancer pour les individus HetAT sont encore mal estimés. Dans le premier volet de ma thèse, j’ai recherché des facteurs génétiques constitutionnels pouvant modifier le risque de cancer chez les femmes de la cohorte CoF-AT (cohorte de femmes apparentées à un enfant atteint d’A-T). J’ai ensuite décrit les caractéristiques histologiques et génomiques des tumeurs du sein de sujets HetAT afin d’identifier des biomarqueurs permettant de discriminer les tumeurs ATM des autres tumeurs.Les résultats obtenus dans la première partie de mes travaux menés sur un échantillon de 284 individus HetAT et 174 individus non-HetAT issus de 103 familles A-T montrent que les individus HetAT ont des télomères plus longs que leurs apparentés non-HetAT (p=0.0008). En revanche, la longueur des télomères n’est pas associée au risque de cancer dans cette population. De plus, le SNP rs9257445 (ZNF311) qui est associé à la longueur des télomères chez les individus HetAT n’est pas lui non plus associé au risque de cancer. En revanche les SNPs rs6060627 (BCL2L1) et rs2380205 (ANKRD16) modifient le risque de cancer chez les femmes HetAT et non-HetAT.Les résultats obtenus dans la deuxième partie de la thèse à partir de la description morphologique de 41 tumeurs mammaires montrent que les tumeurs des porteurs d’une mutation dans ATM sont majoritairement de sous-type luminal B. D’un point de vue moléculaire, les 23 tumeurs ATM étudiées ne présentent pas la signature BRCAness associée à de grandes pertes chromosomiques. En revanche, nous avons montré que la majorité des tumeurs ATM sont tétraploïdes et présentent une perte d’hétérozygotie au locus 11q22-23 entrainant une inactivation de l’allèle normal d’ATM dans les tumeurs. De plus, l’analyse du nombre de copies réalisée sur ces tumeurs montre une signature ATM impliquant des pertes des loci 13q14.11-q14.3, 21p11.2-p11.1 et 22q11.23.L’ensemble de ces travaux aura permis de mieux caractériser les caractéristiques génétiques des femmes de la cohorte CoF-AT et de mettre en évidence des bio-marqueurs des tumeurs ATM
Inherited biallelic mutations in the ATM gene cause Ataxia Telangiectasia (A-T), a multisystemic disorder characterized by neurological, cutaneous and immunological abnormalities. The disease is associated with an elevated risk of malignancies, particularly of lymphoma or leukemia, and a high radiosensitivity. Epidemiological studies have shown that female heterozygote carriers (HetAT) younger than 50 years are at increased risk of breast cancer, as compared to women from the general population (RR 4,94, 95%CI 1,90 - 12,09). Despite the rarity of A-T disease, 0.5 to 1% of the population is estimated to be HetAT. Epidemiological studies have confirmed that some specific truncating or missense variants in ATM are associated with increased breast cancer risk but this risk is not yet well estimated. The first part of my thesis project has consisted in characterizing inherited genetic factors modifying cancer risk in women participating in the prospective cohort CoF-AT (“cohorte de femmes apparentées à un enfant atteint d’A-T). In the second part of my work, I described the morphological and molecular features of ATM breast tumours with the aim to identify biomarkers allowing to distinguished ATM-associated tumours from sporadic tumours.Assessment of the contribution of inherited factors such as SNPs of telomere length on the risk of cancer was performed on 284 HetAT individuals and 174 non-HetAT individuals belonging to 103 A-T families. We showed that HetAT individuals have longer telomeres than their non-HetAT counterparts (p=0.0008). However, we found that telomere length was not associated with cancer risk in our study population. The SNP rs9257445 (ZNF311), which is associated with telomere length in HetAT participants, was not associated with cancer risk. Conversely, SNPs rs6060627 (BCL2L1) and rs2380205 (ANKRD16) modified cancer risk in HetAT and non-HetAT women.Pathology review of 41 ATM-associated breast tumours revealed that these tumours mostly belonged to luminal B molecular subtype. The molecular characterization of 23 ATM-associated tumours did not revealed the BRCAness profile associated with Large-Scale State Transitions. However, we found that ATM tumours were mostly tetraploïd and observed loss of heterozygosity at 11q22-23 in the majority of the tumours and loss of ATM wild type allele. Moreover, copy number losses at loci 13q14.11-q14.3, 21p11.2-p11.1 and 22q11.23 appeared to be specific of ATM tumours.Altogether, this project allowed to better characterize the genetic background of the CoF-AT participants and to highlight biomarkers of ATM breast tumours