Dissertations / Theses on the topic 'FARMACOLOGIA, CHEMIOTERAPIA E MICROBIOLOGIA'

2001/2002
Development of antibiotic resistance in bacteria is mainly due to the presence of resistance genes and to the selective pressure exerted by antibiotic use. Resistance can result from spontaneous mutations or acquisition of genes coding for a resistance mechanism. Antibacterial agents are used in agricultural techniques, in human and animai therapy and prevention of bacteria infections, and are added continuously to animai feeds to promote growth. As a result of exposure to antibiotics, the level of antibiotic resistance of bacteria belonging to the normal intestina! flora of human and animals increases. These bacteria not only constitute an enormous reservoir of resistance genes for potentially pathogenic bacteria, but also their level of resistance is considered to be a good indicator for the selection pressure exerted by antibiotic use in that population and for the resistance problems to be expected in pathogens. Indeed, reservoirs of antibiotic resistance in humans and in animals can interact in different ways: food and water are the most probable vectors of trasmission to the intestina! flora. Population of gulls (Larus cachinnans michahellis) has increased in North-East of Italy during the past decade. This increase has been attribuited to the ability of gulls to adapt to urban areas, in fact they are able to nest on roofs and feed of urban waste. Gulls ability to over fly large areas suggests that their feces may have a potential role in bacterial dissemination and more underhand antibiotic resistance in urban and rural environment. Transfer of antibiotic resistance genes between different species of bacteria c an be facilitated by mobile DNA elements, such as transposons and plasmids. Integrons have been identified on these mobile elements, and they often contain one or more genes that encode antibiotic resistance. Nine classes of integrases have been described, but class l is prevalent in Enterobacteriaceae. In this work l 02 cloacal swabs of Larus cachinnans michahellis were collected in natural reserve during spring in 2000 and 200 l. 214 strains of Enterobacteriaceae were isolated and identified as Proteus sp.(n = 89), E.coli (n = 84), Klebsiella sp.(n. = 18), Sa/monella sp. (n = 17) and Citrobacter sp. (n = 6). Also 162 Gram-positive bacteria strains were identified as Enterococcusfaecalis (n= 101) and Staphylococcus sp. (n= 61). Isolated avian strains were tested for susceptibility to a battery of antibiotics representing various classes of them. Gram-positive isolates showed low levels of resistance, but Enterobacteriaceae were resistant to a lot of antibiotics, especially to ampicillin (Sa/monella sp., E. coli and Proteus sp.), to tetracycline (Sa/monella sp., andE. coli), to streptomycin (Proteus sp., E. coli, Klebsiella sp. and Sa/monella sp.), to nalidixic acid (Proteus sp. andE. coli). The high resistance levels found in Gram-negative strains are very important if we consider the natural habitat of monitorated avifauna, and we could explain this fact as a result of the spread of environmental antibiotic contaminants with their consequent selection pressure and the dissemination of antibiotic resistance genes by horizontal transfer. Gram-negative avian strains were also screened for class l integrase using a specific probes which hybridizes to conserved regions of integron encoded gene intll. 25 of the 214 isolates were positive and showed to have class l integrons. Their sizes were detected by PCR with specific primers 5'CS-3'CS, flanking variable region of integron. Integrons ranged from 500 hp to 4800 bp. The incidence of class l integrons was correlated with multiple-drug resistances exhibited by avian Enterobacteriaceae to streptomycin, trimethoprimsulfamethoxazolo, tetracycline and chloramphenicol. The prevalent size ofintegrons was 1000 hp, 1600 hp and 1700 hp. Also 80 human clinical Enterobacteriaceae strains were screened for the integron presence, 16 strains showed to carry integrons ranged from 1000 pb to 2000 pb.The molecular characterization of integrons from avian and human strains, using different restriction endonucleases like Alul, Cfol, Mspl and Rsal, revealed the same types of integrons: 1000 pb integron, with the same restriction pattem, was found in 2 E. coli from Larus, in l E. coli and 5 Proteus sp. from human. An identica! 1600 pb integron was found in 6 avian strains (3 E. coli, l Klebsiella sp. and 2 Proteus sp.) and 3 Proteus sp. from human; 1700 pb integron was found in 2 E. coli from Larus and 4 E. coli from human. PFGE analysis ofthe strains from animals and humans carring the same types of integrons revelead different pattems. The presence of identica! integrons in different isolates from animals and humans implies horizontal transfer of the complete integron arrangement. 1000, 1600 and 1700 pb integrons were further characterized by sequencing. In integrons of l 000 pb sequence analysis identified a single aadA l gene cassette, integrons of 1600 pb contained dhfrl and aadA genes; integrons of 1700 pb contained d.frl7 and aadA5 genes. aadA, aadA l and aadA5 gene cassettes encoding an Aminoglicoside adenyltransferase and conferring resistance to streptomycin an d spectinomycin, dhfr an d dfr 17 gene cassettes encoding a dihydrofolate reductase and conferring resistance to trimethoprim
XV Ciclo
1967
Versione digitalizzata della tesi di dottorato cartacea.

2007/2008
Colorectal cancer is among four most common malignancies and the second leading cause of cancer death in the western world. Although the standard treatment regimens have improved the prognosis, resistance to cytotoxic chemotherapy is still a common problem in these patients and a major obstacle to effective treatment of disseminated neoplasms. The subject of this study was to evaluate a possible role of anthocyanidins, natural products belonging to the group of flavonoids, in the treatment of colorectal cancer. Primary (CACO-2) and metastatic human colorectal carcinoma cell lines (LoVo and LoVo ADR) were used to test different aspects of their pharmacological effect, such as their ability to affect cancer cell growth and to modulate the cytotoxicity of certain well established anticancer drugs. Their proapototic properties, as well as their capacity to induce changes in the cellular redox status and modulate drug transport mechanisms were also explored. The anthocyanidins used in this study, delphinidin and cyanidin, demonstrated strong cytotoxic effect in metastatic human colorectal cancer cell lines, LoVo and LoVo ADR, and were able to modulate the cytotoxicity of camptothecin, drug used in most colorectal cancer treatment regimes. Although well known for their antioxidant properties and lower toxicity in normal cells, delphinidin and cyanidin showed strong prooxidant activity in the metastatic colon carcinoma cell lines. We show that anthocyanidins inactivate the glutathione antioxidant system thus promoting oxidative stress in these cells, which might be responsible for their proapoptotic activity. Moreover, when applied at low, non-cytotoxic concentrations over a long period of time, they also affect anticancer drug transport across cell membranes by modulating expression of certain transport proteins (ABC transporters). These results suggest that anthocyanidins can be good candidates for improving colorectal cancer therapy and warrant new investigation on their activity.
XXI Ciclo
1976

2006/2007
I flavonoidi sono metaboliti secondari presenti in numerose piante commestibili che rappresentano una parte integrante dell’alimentazione umana. Numerosi studi epidemiologici hanno dimostrato che una dieta ricca di flavonoidi può avere un ruolo rilevante nella prevenzione di diverse patologie, come alcune neoplasie e le malattie cardiovascolari. L’endotelio vascolare svolge un ruolo fondamentale nel mantenimento dell’omeostasi vascolare e alterazioni a questo livello, in particolare se croniche, possono causare l’avvio di lesioni arteriosclerotiche. I flavonoidi esplicano le loro azioni a livello dell’endotelio vascolare attraverso meccanismi diversi, che vanno dalle loro attività anti-infiammatorie, alla loro capacità di modulare la sintesi e l’espressione di proteine e di secondi messaggeri coinvolti in numerose reazioni cellulari. Le proprietà biologiche di questi composti naturali sono state oggetto di numerosi studi, ma ancora oggi il meccanismo che spiega l’entrata di queste sostanze all’interno delle cellule, ed in particolare, nelle cellule endoteliali, rimane poco conosciuto. La maggior parte dei flavonoidi è presente negli alimenti in forma glicosilata, altamente idrofilica, pertanto non in grado di attraversare le membrane biologiche se non attraverso specifici trasportatori di membrana. In particolare, tra le proteine di membrana coinvolte nel trasporto di questi composti, sembra ricoprire un ruolo importante la bilitranslocasi (TC 2.A.65.1.1), un trasportatore di anioni organici situato al polo sinusoidale della cellula epatica e presente anche nella mucosa gastrica, che ha dimostrato di mediare il trasporto della quercetina, un flavonolo, e di alcuni antociani, una classe di flavonoidi contenuta soprattutto nel vino e nella frutta rossa. Anche alcuni componenti della superfamiglia delle proteine ABC (ATP-Binding Cassette), come le proteine P-glicoproteina (ABCB1), MRP1 (Multi-Drug Resistance related Protein 1) (ABCC1), MRP2 (Multi-Drug Resistance related Protein 2) (ABCC2) e BCRP (Breast Cancer Resistance related Protein) (ABCG2), hanno dimostrato di interagire con numerosi flavonoidi. Queste proteine agiscono da pompe di membrana e, attraverso un meccanismo energia –dipendente, legato all’idrolisi dell’ATP, permettono l’estrusione dei loro substrati dall’interno verso l’esterno delle cellule. I trasportatori in entrata ed in uscita possono, quindi, avere un ruolo importante nel regolare le concentrazioni intracellulari dei flavonoidi, necessarie per le loro azioni biologiche. Lo scopo di questa ricerca è stato analizzare tre modelli di cellule endoteliali nei quali sono stati studiati l’espressione della bilitranslocasi e delle proteine ABC ed il loro possibile ruolo nel trasporto di flavonoidi. Sono state utilizzate cellule endoteliali primarie di aorta umana e la linea cellulare endoteliale umana Ea.hy 926, che deriva dalla fusione di cellule endoteliali HUVEC (Human Umbilical Vein Endothelial Cells) con la linea cellulare di carcinoma polmonare A549. I dati di queste cellule sono stati confrontati con quelli ottenuti in cellule endoteliali primarie di aorta di ratto, espiantate mediante un metodo messo a punto nei nostri laboratori. Sono state condotte analisi di immunocitochimica, di Western blot e di valutazione dell’espressione dell’RNA messaggero mediante tecnica RT-PCR, per studiare l’espressione delle proteine di membrana nei tre diversi modelli cellulari. Infine, è stato messo a punto un saggio di uptake della quercetina per studiare il trasporto dei flavonoidi nei queste cellule. I risultati ottenuti mediante le tecniche immunochimiche hanno evidenziato l’espressione della bilitranslocasi in tutti e tre i tipi di cellule endoteliali. Tra i trasportatori ABC, le proteine MRP1, MRP2 e BCRP sono state tutte identificate in queste cellule, mentre la P-glicoproteina è risultata meno espressa in tutti e tre i modelli cellulari. Il saggio di trasporto messo a punto in queste cellule ha permesso di dimostrare che la quercetina entra nell’endotelio vascolare mediante la bilitranslocasi, come trasportatore in entrata, e viene estrusa dalle proteine ABC nelle cellule endoteliali. Il saggio, inoltre, ha permesso di studiare il trasporto anche di altri polifenoli, contenuti nella dieta, come la malvidina 3-glucoside, un antociano presente soprattutto nel vino rosso, e dell’acido caftarico, che si trova principalmente nel vino bianco. I risultati ottenuti hanno messo in luce un ruolo della bilitransloacasi nel trasporto anche di questi composti.
1979

2007/2008
Rispetto al ruolo svolto da nucleosidi e nucleotidi adeninici come neurotrasmettitori/neuromodulatori, quello delle purine a base guaninica è ancora largamente sconosciuto. In questo studio, è stato valutato l’effetto della guanosina sulle cellule SH-SY5Y, derivate da un neuroblastoma umano. In questa linea cellulare, la guanosina aumenta la proliferazione di cellule sottoposte a stress da deprivazione da siero per 24, 48 e 72h (MTT test), effetto che sembra coinvolgere la via delle MAPK e quella di PI3K, ma non quella dell’AMP ciclico (AMPc). Utilizzando [3H]Adenosina e [3H]Guanosina è stato dimostrato che entrambe le purine subiscono uptake con una cinetica sovrapponibile ma con affinità 100 volte minore per la guanosina rispetto all’adenosina. L’uptake è dovuto principalmente a trasportatori equilibrativi NBTI-sensibili, mentre risultano assenti i trasportatori concentrativi. Mediante esperimenti di binding su membrane di cellule SH-SY5Y è stata confermata la presenza di siti per [3H]NBTI saturabili e reversibili; esperimenti di competizione hanno confermato la capacità di guanosina e adenosina di spiazzare [3H]NBTI dai suoi siti di legame con IC50 pari a 1568 ± 243 µM e 191 ± 59 µM, rispettivamente. Su cellule mantenute al 10% di siero, la guanosina provoca variazioni morfologiche quali allungamento dei neuriti tempo- e concentrazione-dipendente, indice di differenziazione. L’effetto è visibile già dopo 24 h di trattamento e dopo 72 h è risultato paragonabile a quello dell’acido retinoico. L’effetto differenziante della guanosina è risultato indipendente dal blocco dei trasportatori NBTI-sensibili e dall’attivazione dei recettori A1 e A2A dell’adenosina. Studi di tempo-dipendenza fino a 7 giorni di trattamento sono stati effettuati mediante colorazione del citoscheletro con Falloidina. Studi di immunocitochimica hanno evidenziato la capacità della guanosina di aumentare in maniera tempo-dipendente l’espressione dei markers neuronali beta-tubulina, MAP2 e NeuN. Tramite test della sulforodamina B è stata verificata la capacità della guanosina di ridurre in maniera tempo- e concentrazione-dipendente la proliferazione cellulare, come conseguenza dell’effetto differenziante. Dopo 7 giorni di trattamento, acido retinoico, guanosina e il suo derivato guanina hanno determinato una riduzione della proliferazione con valori di IC50 pari a 37 ± 4 µM, 172 ± 113 µM e 190 ± 17 µM, rispettivamente. Non essendoci in letteratura dati riguardanti la presenza dell’enzima PNP su cellule di neuroblastoma, ne è stata accertata l’espressione nella linea cellulare SH-SY5Y tramite RT-PCR. Per quanto riguarda le vie di trasduzione del segnale attivate nell’effetto neuritogenico indotto da guanosina, prove dirette e indirette dimostrano il coinvolgimento della via di MAPK e PI3K, ma non del AMPc. Inoltre, la guanosina non determina variazioni dei livelli di [Ca+2]i. In cellule differenziate per 48h con guanosina o acido retinoico si è osservato un aumento significativo dei livelli basali di AMPc, rispetto alle cellule non differenziate, e un potenziamento dell’attività dell’inibitore delle fosfodiesterasi di tipo IV rolipram da parte della guanosina 100 µM. In conclusione, questi risultati dimostrano che la guanosina gioca un ruolo importante nell’omeostasi neuronale, agendo come un composto endogeno neuroprotettivo e differenziante. In collaborazione con il Dipartimento di Chimica Farmaceutica dell’Ateneo e dell’Università degli Studi di Pavia è stato fatto uno screening mediante la tecnica del Radioligand Binding di circa 100 composti di neosintesi con possibile affinità verso i recettori sigma-1 e sigma-2, classe di recettori coinvolta nella neuroprotezione. Per valutare l’efficacia dei ligandi dei recettori sigma-1, in termini di agonismo o antagonismo, sono stati effettuati due test in vitro. Il primo sfrutta la capacità della fenitoina di spostare verso sinistra la curva di competizione di agonisti mentre non ha alcun effetto sugli antagonisti. I risultati ottenuti non sono stati incoraggianti a causa della scarsa sensibilità del metodo. Il secondo test sfrutta la capacità di agonisti dei recettori sigma-1 di differenziare le cellule SH-SY5Y nelle quali abbiamo verificato la presenza di entrambi i sottotipi recettoriali ottenendo valori di Kd pari a 19,8 ± 5 nM e 17,9 ± 3 nM per [3H]PTZ e [3H]DTG, rispettivamente. L’agonista pentazocina è risultato l’unico composto di riferimento in grado di indurre differenziazione mentre gli antagonisti aloperidolo e DTG sono risultati inefficaci. Con il test della Sulforodamina B, sempre sfruttando la diminuzione della proliferazione come conseguenza di un’attività differenziante, abbiamo confermato che solo la pentazocina è in grado di ridurre in maniera tempo- e concentrazione- dipendente la proliferazione cellulare con un valore di IC50 a 72 h pari a 44 ± 4 µM. Estendendo lo studio ad alcuni dei ligandi di neosintesi, quello maggiormente affine e selettivo, LEk (IC50s1 0,104 ± 0,034 nM; IC50s2 492 ± 102 nM), è risultato in grado di mimare l’effetto della pentazocina sulla proliferazione e differenziazione cellulare. Questo suggerisce un suo possibile e prezioso impiego come agonista altamente selettivo e ad alta affinità per lo studio dei recettori sigma-1 e dei potenziali impieghi terapeutici ad essi correlati.
XXI Ciclo
1979

Novel bioconjugates in cancer treatment: Hyaluronic acid as drugs vector. in vitro and in vivo evaluation of different hyaluronic acid bioconjugates.
valutazione in vitro ed in vivo di nuovi farmaci a base di acido ialuronico per il trattamento dei tumori.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, 2011.
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Biomoléculas são cada vez mais utilizadas em medicamentos e cosméticos e, principalmente aquelas destinadas a tratamentos dermatológicos, são, com freqüência, preparadas em farmácias magistrais. A capacidade de neutralização de conservantes por parte de proteínas e tensoativos não iônicos é bem conhecida, e a utilização desses dois componentes numa mesma formulação gera uma preocupação com relação à conservação desse tipo de produto farmacêutico, que, uma vez mal conservado, poderia gerar riscos à saúde de seus consumidores. Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar a eficácia de um sistema conservante composto por metilparabeno, propilparabeno e imidazolidinil uréia, de uma formulação base que continha um tensoativo não iônico e desta mesma formulação adicionada de diferentes biomoléculas farmacêuticas, além de realizar estudos de adaptação microbiana frente ao sistema conservante utilizado nas formulações que continham estas biomoléculas. Os resultados obtidos mostraram que a qualidade microbiológica, tanto das matérias-primas quanto das formulações testadas , está de acordo com os limites aceitos em compêndios oficiais. Os testes de avaliação da eficácia do sistema conservante mostraram que a formulação base está adequadamente conservada, mas que a presença das biomoléculas farmacêuticas estudadas na formulação, numa concentração de 3% (p/p) pode provocar modificações no comportamento do sistema conservante frente a alguns dos microrganismos testados. O ensaio de adaptação microbiana revelou que há uma tendência à adaptação ao sistema conservante por parte da maioria dos microrganismos testados quando estão presentes no meio de cultura o tensoativo não iônico e um dos ativos cosméticos estudados. A avaliação da concentração inibitória mínima sugere que as concentrações de sistema conservante utilizadas nas formulações testadas são eficazes, pois a concentração necessária à inibição de crescimento para os diferentes microrganismos padrões foi inferior ou igual à concentração utilizada nas formulações testadas. No entanto, a exposição dos microrganismos às biomoléculas farmacêuticas e ao tensoativo não iônico em concentrações crescentes, no teste de adaptação microbiana, produziu cepas de microrganismos cuja inibição necessitou de maiores concentrações dos conservantes, em alguns casos acima da concentração normalmente utilizada nas formulações. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT
Biomolecules have been progressively more used in medicines and cosmetics, and especially those aimed at dermatological treatments are often prepared in magistral pharmacies. The neutralizing ability of preservatives by nonionic surfactants and proteins is well known, and use of both these ingredients into the same formulation raises a concern regarding the conservation of this kind of pharmaceutical product which, once poorly preserved, could generate health risks for the consumers. Thus, the purpose of this study was to evaluate the effectiveness of a preservative system consisting of methylparaben, propylparaben and imidazolidinyl urea, in a basic formulation containing a nonionic surfactant and in this same formulation added with different pharmaceutical biomolecules. Furthermore, it had the intention to study the possibility of microbial adaptation to the preservative system when in presence of the studied biomolecules and nonionic surfactant. The results showed that the microbiological quality of both raw materials and the formulations tested complies with the limits accepted in literature. Evaluation of the preservative system effectiveness showed that the basic formulation is properly preserved, but the presence of studied biomolecules in the pharmaceutical formulation at a concentration of 3% (w/w) can promote changes in the behavior of the preservative system against some of the microorganisms tested. The microbial adaptation assay revealed that the majority of the microorganisms had a tendency to adapt to the preservative system when the nonionic surfactant and one of the tested cosmetic ingredients were present in the culture medium. Evaluation of minimum inhibitory concentration suggests that concentrations of the preservative system used in the formulations tested are effective, since the concentration needed to inhibit the different standard-microorganisms growth was lower than or equal to the preservative system concentration used in the formulations tested. However, exposure of microorganisms to pharmaceutical biomolecules and nonionic surfactant in increasing concentrations, situation acquired in microbial adaptation assay, produced strains of microorganisms whose inhibition required higher concentrations of the preservative system, in some cases above the concentration normally used in used formulations.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000439217-Texto+Completo-0.pdf: 703680 bytes, checksum: 20bc10f7a801c99b27dde05bf2a6dc66 (MD5) Previous issue date: 2012
Tuberculosis (TB) remains a leading cause of death worldwide, due to the great adaptability of the bacillus, which can survive in various conditions inside and outside the human host. Previous studies showed evidence that polymorphisms in P2X7 receptor are e associated with increased risk of TB. The present study aimed to analyze the role of purinergic P2X7 receptor in M. tuberculosis infection and host interaction mechanisms in vitro and in vivo. The macrophage murine cell line RAW 264. 7 was used for in vitro experiments. Our results demonstrated that treatment of RAW 264. 7 cells with ATP (3 and 5 mM) resulted in a statistically significant reduction of counting colony forming units (CFUs). Male wild-type C57BL/6 (wild-type) and P2X7 receptor KO (P2X7R-/-) mice (25–30 g) were used throughout this study for in vivo. Immunohistochemistry showed that the purinergic P2X7 receptor expression was found significantly augmented in the lungs of mice infected with M. tuberculosis. Furthermore, M. tuberculosis-infected P2X7R-/- mice showed an increase of M. tuberculosis burden in lung tissue, when compared to infected wild type mice. Infected mice showed a marked increase in the spleen weight, in comparison to non-infected animals, indicating the occurrence of splenomegaly. In P2X7R-/- spleens, we observed a significant decrease in the populations of Treg (CD4+Foxp3+), T cells (CD4+, CD8+CD25+ and CD4+CD25+), dendritic cells (CD11c+) and B220+ cells. However, a significant increase in CD11b+ cells was observed in P2X7R-/- mice, when compared to wild-type animals. In the lungs, P2X7R-/- M. tuberculosis-infected mice exhibited pulmonary infiltrates containing an increase of Treg cells (CD4+Foxp3+), T cells (CD4+ and CD8+) and a decrease in the B220+ cells, when compared with wild-type M. tuberculosis-infected mice. The findings observed in the present study provide novel evidence on the role of P2X7 receptors in the pathogenesis and control of tuberculosis. Whether selective agonists or antagonists of this receptor might be useful for improving TB complications remains a matter to be investigated.
A tuberculose (TB) continua sendo uma das principais causas de morte no mundo, devido à grande capacidade de adaptação do bacilo que pode sobreviver em diferentes condições dentro e fora do hospedeiro humano. Estudos prévios mostraram evidências de que polimorfismos no receptor purinérgico P2X7 estão associados ao aumento da suscetibilidade à TB. O presente estudo objetivou analisar o papel do receptor purinérgico P2X7, na infecção por M. tuberculosis em camundongos, e os possíveis mecanismos de interação do receptor P2X7 com o hospedeiro, em modelos in vivo e in vitro. Nos experimentos para avaliação da viabilidade da micobacteria intracelular in vitro foi utilizada a linhagem de macrófagos murinos, RAW 264. 7. Nossos resultados demonstraram que o tratamento das células RAW 264. 7 com ATP (3 e 5 mM) resultou em uma redução estatisticamente significativa da contagem de unidades formadoras de colônias (CFUs). Nos experimentos in vivo foram utilizados camundongos machos C57BL/6 (tipo selvagem) e camundongos knockout para o receptor P2X7 (P2X7R-/-) (25-30 g). Os resultados com imuno-histoquímica mostraram que a expressão do receptor purinérgico P2X7 foi encontrada significativamente aumentada nos pulmões de camundongos infectados com M. tuberculosis. Além disso, camundongos P2X7R-/- infectados com M. tuberculosis mostraram um aumento da carga da micobacteria no tecido pulmonar, quando comparado com camundongos do tipo selvagem infectados. Camundongos infectados mostraram um aumento marcante no peso do baço quando comparado com animais não infectados, indicando a ocorrência de esplenomegalia. Em baços de camundongos P2X7R-/-, observou-se uma diminuição significativa nas populações de Treg (CD4 + Foxp3 +), células T (CD4 +, CD8 + CD25 + e CD4 + CD25 +), células dendríticas (CD11c +) e células + B220. No entanto, houve um aumento significativo de células CD11b + em camundongos P2X7R-/-, quando comparados aos animais do tipo selvagem. Nos pulmões, camundongos P2X7R-/- infectados com M. tuberculosis apresentaram infiltrado pulmonar contendo um aumento de células Treg (CD4 + Foxp3 +), células T (CD4 + e CD8 +) e uma diminuição nas células + B220, quando comparado com camundongos do tipo selvagem infectados com M. tuberculosis. Portanto, os resultados observados no presente estudo fornecem novas evidências sobre o papel dos receptores P2X7 na patogênese e controle da tuberculose. O uso de agonistas ou antagonistas seletivos deste receptor como uma ferramenta terapêutica continua sendo uma questão a ser investigada.

Mestrado em Microbiologia Molecular e Celular
A leishmaniose representa uma infecção endémica que ocorre, predominantemente em países das regiões tropicais e subtropicais. Actualmente, a leishmaniose é considerada endémica em 88 países e estima-se que 12 milhões de pessoas estejam infectadas. Mundialmente existem 2 milhões de novos casos por ano e 1/10 da população mundial está em risco de ser infectada. Além disso, a co-infecção com o vírus de imunodeficiência adquirida (HIV) é uma doença emergente em numerosas partes do mundo. A leishmaniose pode ser dividida, de acordo com as manifestações clínicas, em 3 grupos: cutânea, mucocutânea e visceral. A leishmaniose visceral é uma doença grave causada pelo crescimento de um protozoário do complexo Leishmania donovani ou Leishmania infantum em células do retículo endotelial. Um insecto (vector) é responsável pela transmição do parasita entre pessoas ou animais. Estes parasitas desenvolvem uma variedade de mecanismos adaptativos que permitem a sua sobrevivência não só no vector, mas também na corrente sanguínea do hospedeiro vertebrado, conseguindo multiplicar-se em condições hostis, no interior dos macrófagos. Os fármacos actualmente disponíveis não conjugam actividade com níveis de toxicidade e custos aceitáveis. Além disso, a emergência de resistência parasitária a fármacos antileishmaniais e a ausência de uma abordagem quimioterapêutica alternativa revelam uma necessidade em desenvolver novos fármacos ou novas estratégias para o tratamento desta doença. As dinitroanilinas têm propriedades anti-leishmaniais, ligando-se preferencialmente às tubulinas dos parasitas. A orizalina (ORZ) é uma dinitroanilina que demonstrou ter actividade contra a Leishmania infantum in vitro. Contudo, a baixa solubilidade e a baixa pressão de vapor deste fármaco têm dificultado a sua aplicação como um agente anti-parasitário in vivo. As potencialidades dos lipossomas como sistema transportador de fármacos, têm sido exploradas com êxito, proporcionando um aumento da eficácia terapêutica de diversos fármacos. Além disso, a captação preferencial das formulações lipossómicas pelos macrófagos abre importantes perspectivas para o tratamento de Leishmania com ORZ. O objectivo da presente dissertação consistiu no desenvolvimento, caracterização e optimização de formulações lipossomais contendo ORZ, a fim de estudar a estabilidade destes sistemas em soro fisiológico e em albumina sérica bovina (BSA) para futuro teste de actividade in vivo.
The leishmaniasis represents endemic infection that afflicts the world´s poorest populations. Currently, the leishmaniasis is considered to be endemic in 88 countries and an estimated 12 million people are infected. Worldwide, there are 2 million new cases each year and 1/10 of the world´s population is at risk of infection. However, leishmaniasis has recently emerged as a very important cause of opportunistic infections for individuals positive for human immunodeficiency virus (HIV) in many parts of the world. The leishmaniasis can be divided into 3 major clinical syndromes: cutaneous, mucocutaneous and visceral leishmaniasis. Visceral leishmaniasis is a several vector-borne disease caused by a protozoan growth of the Leishmania donovani and Leishmania infantum complex within reticuloendothelial cells throughout the body. An insect vector transmits the parasite from person to person or via an animal reservoir. These parasites have developed a variety of adaptive mechanisms not only to live inside the vector, but also to evade the vertebrate host immune responses, including survival within the host macrophage. The available drugs do not conjugate high activity with acceptable toxicity at moderate costs. Moreover, the emergence of parasite resistance to anti-leishmanial drugs and the absence of an alternative chemotherapeutic approach reveal the necessity to develop new drugs for the treatment of this disease. Dinitroanilines are tubulin-binding agents with reported anti-leishmanial properties in vitro. Oryzalin (ORZ) is a dinitroaniline that proved to have activity against Leishmania infantum. However, its therapeutic application is severely restricted by its low water solubility and low vapor pressure, two features that have created problems in their development as anti-parasitic agent in vivo. The potential use of liposomes as drug carriers has been exploited with success to enhance the efficiency of several drugs. Furthermore, the preferential uptake of liposomes by macrophages opens some important perspectives for the treatment of Leishmania with ORZ. The aim of the present thesis was the development, characterization and optimization of liposomal formulations containing ORZ, in order to study the ORZ liposomes stability in physiologic serum and bovine serum albumin (BSA) for further tests in vivo.

Made available in DSpace on 2013-08-07T19:05:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000439097-Texto+Completo-0.pdf: 7980733 bytes, checksum: af8f6a7fa6a599651957ad5f12054783 (MD5) Previous issue date: 2012
Tuberculosis continues to be one of the deadliest diseases in the world. The emergence of drug-resistant strains of Mycobacterium tuberculosis, the unbearable side effects of the available drugs and the frequent patient non-compliance in completing the therapy have increased the need for development of new effective agents. We have previously demonstrated a potent in vitro inhibitory activity for two pentacyano(isoniazid)ferrate(II) compounds, namely IQG-607 and IQG-639 against the M. tuberculosis enoyl-ACP reductase enzyme. Importantly, IQG- 607 and IQG-639 were active against cultures of M. tuberculosis H37Rv and two isoniazid-resistant clinical isolates in vitro. In the present study, the activity of these compounds was evaluated by using an in vivo murine model of tuberculosis. Swiss mice were infected with M. tuberculosis H37Rv strain, and IQG-607 and IQG-639 (250 mg/kg) were administered during 28 or 56 days. As well, a dose-response study was performed with IQG-607 (at 5, 10, 25, 50, 100, 200 and 250 mg/kg). The activity of test compounds was compared with that of the positive control drug isoniazid at 25 mg/kg. After 28 or 56 days of treatment, either IQG-607 or isoniazid significantly reduced M. tuberculosis-induced splenomegaly, and also significantly diminished the colony-forming units in both spleens and lungs. IQG-607 or isoniazid ameliorated the lung macroscopic aspect, reducing the lung lesions to a similar extent. However, IQG-639 was not capable of significantly modifying any evaluated parameter. IQG-607 did not display a classical dose-dependent profile in our murine model of tuberculosis, and 10 mg/kg was the lowest dose able to show significant activity, which was similar to the inhibition observed for higher doses. In addition, experiments using early and late controls of infection revealed a bactericidal activity for IQG-607 in our model. The promising activity of IQG-607 in M. tuberculosis-infected mice suggests that this compound might represent a good candidate for clinical development as a new antimycobacterial agent.
A tuberculose é uma das principais causas de morte no mundo. O surgimento e disseminação de cepas de Mycobacterium tuberculosis resistentes a fármacos, os efeitos indesejáveis dos fármacos atualmente disponíveis e a falta de adesão dos pacientes ao tratamento têm aumentado a necessidade do desenvolvimento de novos agentes anti-tuberculose. Estudos prévios revelaram uma potente atividade inibitória in vitro de dois compostos pentaciano(isoniazida)ferrato(II), denominados IQG-607 e IQG- 639, frente a enzima enoil-ACP redutase de M. tuberculosis. Ainda, o IQG- 607 e o IQG-639 foram ativos quando testados em culturas de M. tuberculosis H37Rv e sobre dois isolados clínicos resistentes à isoniazida in vitro. Neste trabalho, a atividade destes dois compostos foi avaliada in vivo, utilizando um modelo murino de infecção por M. tuberculosis. Camundongos suíços foram infectados com a cepa de M. tuberculosis H37Rv e o IQG-607 ou o IQG-639 (250 mg/kg) foram administrados aos animais durante 28 ou 56 dias. Adicionalmente, um estudo de dose-resposta foi realizado com o composto IQG-607, empregando as doses de 5, 10, 25, 50, 100, 200 e 250 mg/kg. As atividades dos compostos-teste foram comparadas à atividade da isoniazida (25 mg/kg), o controle positivo do tratamento. Após 28 ou 56 dias de tratamento, tanto o IQG-607 quanto a isoniazida reduziram significativamente a esplenomegalia induzida pela infecção e, também, diminuíram as unidades formadoras de colônia, tanto nos pulmões quanto nos baços dos animais tratados. O IQG-607 e a isoniazida melhoraram o aspecto macroscópico dos pulmões, reduzindo as lesões pulmonares de maneira semelhante. Por sua vez, o IQG-639 não foi capaz de modificar significativamente nenhum parâmetro avaliado neste estudo. O IQG-607 não apresentou um perfil clássico de dose dependência, sendo observada atividade inibitória significativa similar, entre as doses de 10 mg/kg e 250 mg/kg. Além disto, um experimento utilizando um “controle pré-tratamento” demonstrou que o IQG-607 possui atividade bactericida no nosso modelo. A atividade satisfatória do IQG-607 em camundongos infectados com M. tuberculosis sugere que este composto pode ser um candidato promissor no desenvolvimento clínico de um novo agente antimicobacteriano.

Made available in DSpace on 2015-09-26T02:05:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000475172-Texto+Completo-0.pdf: 1033533 bytes, checksum: 3695eeb1d157f2c6ed87073d37aa8b1e (MD5) Previous issue date: 2015
Tuberculosis (TB) caused predominantly by Mycobacterium tuberculosis is an infectious disease responsible for a significantly number of deaths worldwide. The first line TB drugs that are currently used, and others available, present several problems, such as duration and complexity of treatment, and adverse effects, factors that decrease the patient adherence to treatment regimen. These problems increase the number of cases of drug resistant TB. The pentacyano(isoniazid)ferrate(II) (IQG-607) compound is an inorganic complex designed to treat INH-resistant strains of M. tuberculosis containing mutations in catalase-peroxidase gene, katG. The compound appears to be a promising anti-TB drug candidate according to previous studies that demonstrated its effectiveness both in vitro and in vivo. However, the difficulties encountered in the development of an analytical method for detection and quantification of the compound, due to its chemical properties, were impeding further studies, such as the pharmacokinetic studies. In this context, the present study describes two analytical methods for the detection of IQG-607 for the first time. The voltammetric method was shown to be a powerful analytical tool for quantification of IQG-607 and may be used to monitoring the stability and quality control. The proposed method, together with enzymatic inhibition assay, shown that the IQG-607 is stable for at least 1week at 4 ºC. The detection of IQG-607 by high performance liquid chromatography (HPLC) was also described, and we were able to observe the retention of the compound on the stationary phase of a chromatography column for the first time in this work. In addition, the analysis of IQG-607 in mouse plasma by HPLC was also demonstrated. Therefore, this conventional method will be optimized and validated to conduct pharmacokinetics studies.
A tuberculose (TB) causada predominantemente por Mycobacterium tuberculosis é uma doença infecciosa responsável por um número considerável de mortes em todo o mundo. Os medicamentos utilizados no tratamento de primeira linha atual, e os demais disponíveis, apresentam diversos problemas, como a duração, complexidade, e efeitos adversos, dificultando a adesão dos pacientes ao regime terapêutico. Isto favorece o aumento do número de casos de TB resistente a medicamentos. O pentaciano(isoniazida)ferrato(II) (IQG-607) é um composto proposto para agir contra casos de TB resistentes à INH devido a infecção com cepas que possuem mutações no gene katG. O composto demonstrou ser um promissor agente anti-TB em estudos prévios, e a sua eficácia in vitro e in vivo foi comprovada. No entanto, as dificuldades encontradas no desenvolvimento de um método analítico para a detecção e quantificação do composto devido as suas características químicas estavam impedindo a realização de outros estudos, e dentre eles, a determinação de parâmetros farmacocinéticos. Tendo isto em vista, o presente trabalho descreve, pela primeira vez, dois métodos analíticos para detecção de IQG-607. O método voltamétrico mostrou potencialidade na quantificação do composto, podendo ser utilizado para monitorar a estabilidade e em controle de qualidade. Observamos, por meio deste método, juntamente com ensaios de inibição enzimática, que o IQG-607 é estável em solução por até 1 semana se for mantido a 4ºC. A detecção do IQG-607 por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) também foi demonstrada, e, pela primeira vez, observamos a interação do composto em coluna cromatográfica. Ainda, por CLAE, demonstramos a detecção do IQG-607 no plasma de camundongos, e por ser um método convencional, será otimizado e validado para a realização de futuros estudos de farmacocinética.

Submitted by Setor de Tratamento da Informa??o - BC/PUCRS (tede2@pucrs.br) on 2015-09-25T11:33:13Z No. of bitstreams: 1 475172 - Texto Completo.pdf: 1033533 bytes, checksum: 3695eeb1d157f2c6ed87073d37aa8b1e (MD5)
Made available in DSpace on 2015-09-25T11:33:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 475172 - Texto Completo.pdf: 1033533 bytes, checksum: 3695eeb1d157f2c6ed87073d37aa8b1e (MD5) Previous issue date: 2015-07-10
Tuberculosis (TB) caused predominantly by Mycobacterium tuberculosis is an infectious disease responsible for a significantly number of deaths worldwide. The first line TB drugs that are currently used, and others available, present several problems, such as duration and complexity of treatment, and adverse effects, factors that decrease the patient adherence to treatment regimen. These problems increase the number of cases of drug resistant TB. The pentacyano(isoniazid)ferrate(II) (IQG-607) compound is an inorganic complex designed to treat INH-resistant strains of M. tuberculosis containing mutations in catalase-peroxidase gene, katG. The compound appears to be a promising anti-TB drug candidate according to previous studies that demonstrated its effectiveness both in vitro and in vivo. However, the difficulties encountered in the development of an analytical method for detection and quantification of the compound, due to its chemical properties, were impeding further studies, such as the pharmacokinetic studies. In this context, the present study describes two analytical methods for the detection of IQG-607 for the first time. The voltammetric method was shown to be a powerful analytical tool for quantification of IQG-607 and may be used to monitoring the stability and quality control. The proposed method, together with enzymatic inhibition assay, shown that the IQG-607 is stable for at least 1week at 4 ?C. The detection of IQG-607 by high performance liquid chromatography (HPLC) was also described, and we were able to observe the retention of the compound on the stationary phase of a chromatography column for the first time in this work. In addition, the analysis of IQG-607 in mouse plasma by HPLC was also demonstrated. Therefore, this conventional method will be optimized and validated to conduct pharmacokinetics studies.
A tuberculose (TB) causada predominantemente por Mycobacterium tuberculosis ? uma doen?a infecciosa respons?vel por um n?mero consider?vel de mortes em todo o mundo. Os medicamentos utilizados no tratamento de primeira linha atual, e os demais dispon?veis, apresentam diversos problemas, como a dura??o, complexidade, e efeitos adversos, dificultando a ades?o dos pacientes ao regime terap?utico. Isto favorece o aumento do n?mero de casos de TB resistente a medicamentos. O pentaciano(isoniazida)ferrato(II) (IQG-607) ? um composto proposto para agir contra casos de TB resistentes ? INH devido a infec??o com cepas que possuem muta??es no gene katG. O composto demonstrou ser um promissor agente anti-TB em estudos pr?vios, e a sua efic?cia in vitro e in vivo foi comprovada. No entanto, as dificuldades encontradas no desenvolvimento de um m?todo anal?tico para a detec??o e quantifica??o do composto devido as suas caracter?sticas qu?micas estavam impedindo a realiza??o de outros estudos, e dentre eles, a determina??o de par?metros farmacocin?ticos. Tendo isto em vista, o presente trabalho descreve, pela primeira vez, dois m?todos anal?ticos para detec??o de IQG-607. O m?todo voltam?trico mostrou potencialidade na quantifica??o do composto, podendo ser utilizado para monitorar a estabilidade e em controle de qualidade. Observamos, por meio deste m?todo, juntamente com ensaios de inibi??o enzim?tica, que o IQG-607 ? est?vel em solu??o por at? 1 semana se for mantido a 4?C. A detec??o do IQG-607 por cromatografia l?quida de alta efici?ncia (CLAE) tamb?m foi demonstrada, e, pela primeira vez, observamos a intera??o do composto em coluna cromatogr?fica. Ainda, por CLAE, demonstramos a detec??o do IQG-607 no plasma de camundongos, e por ser um m?todo convencional, ser? otimizado e validado para a realiza??o de futuros estudos de farmacocin?tica.

Made available in DSpace on 2015-04-14T14:51:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 439217.pdf: 703680 bytes, checksum: 20bc10f7a801c99b27dde05bf2a6dc66 (MD5) Previous issue date: 2012-03-03
Tuberculosis (TB) remains a leading cause of death worldwide, due to the great adaptability of the bacillus, which can survive in various conditions inside and outside the human host. Previous studies showed evidence that polymorphisms in P2X7 receptor are e associated with increased risk of TB. The present study aimed to analyze the role of purinergic P2X7 receptor in M. tuberculosis infection and host interaction mechanisms in vitro and in vivo. The macrophage murine cell line RAW 264.7 was used for in vitro experiments. . Our results demonstrated that treatment of RAW 264.7 cells with ATP (3 and 5 mM) resulted in a statistically significant reduction of counting colony forming units (CFUs). Male wild-type C57BL/6 (wild-type) and P2X7 receptor KO (P2X7R-/-) mice (25 30 g) were used throughout this study for in vivo. Immunohistochemistry showed that the purinergic P2X7 receptor expression was found significantly augmented in the lungs of mice infected with M. tuberculosis. Furthermore, M. tuberculosis-infected P2X7R-/- mice showed an increase of M. tuberculosis burden in lung tissue, when compared to infected wild type mice. Infected mice showed a marked increase in the spleen weight, in comparison to non-infected animals, indicating the occurrence of splenomegaly. In P2X7R-/- spleens, we observed a significant decrease in the populations of Treg (CD4+Foxp3+), T cells (CD4+, CD8+CD25+ and CD4+CD25+), dendritic cells (CD11c+) and B220+ cells. However, a significant increase in CD11b+ cells was observed in P2X7R-/- mice, when compared to wild-type animals. In the lungs, P2X7R-/- M. tuberculosis-infected mice exhibited pulmonary infiltrates containing an increase of Treg cells (CD4+Foxp3+), T cells (CD4+ and CD8+) and a decrease in the B220+ cells, when compared with wild-type M. tuberculosis-infected mice. The findings observed in the present study provide novel evidence on the role of P2X7 receptors in the pathogenesis and control of tuberculosis. Whether selective agonists or antagonists of this receptor might be useful for improving TB complications remains a matter to be investigated.
A tuberculose (TB) continua sendo uma das principais causas de morte no mundo, devido ? grande capacidade de adapta??o do bacilo que pode sobreviver em diferentes condi??es dentro e fora do hospedeiro humano. Estudos pr?vios mostraram evid?ncias de que polimorfismos no receptor purin?rgico P2X7 est?o associados ao aumento da suscetibilidade ? TB. O presente estudo objetivou analisar o papel do receptor purin?rgico P2X7, na infec??o por M. tuberculosis em camundongos, e os poss?veis mecanismos de intera??o do receptor P2X7 com o hospedeiro, em modelos in vivo e in vitro. Nos experimentos para avalia??o da viabilidade da micobacteria intracelular in vitro foi utilizada a linhagem de macr?fagos murinos, RAW 264.7. Nossos resultados demonstraram que o tratamento das c?lulas RAW 264.7 com ATP (3 e 5 mM) resultou em uma redu??o estatisticamente significativa da contagem de unidades formadoras de col?nias (CFUs). Nos experimentos in vivo foram utilizados camundongos machos C57BL/6 (tipo selvagem) e camundongos knockout para o receptor P2X7 (P2X7R-/-) (25-30 g). Os resultados com imuno-histoqu?mica mostraram que a express?o do receptor purin?rgico P2X7 foi encontrada significativamente aumentada nos pulm?es de camundongos infectados com M. tuberculosis. Al?m disso, camundongos P2X7R-/- infectados com M. tuberculosis mostraram um aumento da carga da micobacteria no tecido pulmonar, quando comparado com camundongos do tipo selvagem infectados. Camundongos infectados mostraram um aumento marcante no peso do ba?o quando comparado com animais n?o infectados, indicando a ocorr?ncia de esplenomegalia. Em ba?os de camundongos P2X7R-/-, observou-se uma diminui??o significativa nas popula??es de Treg (CD4 + Foxp3 +), c?lulas T (CD4 +, CD8 + CD25 + e CD4 + CD25 +), c?lulas dendr?ticas (CD11c +) e c?lulas + B220. No entanto, houve um aumento significativo de c?lulas CD11b + em camundongos P2X7R-/-, quando comparados aos animais do tipo selvagem. Nos pulm?es, camundongos P2X7R-/- infectados com M. tuberculosis apresentaram infiltrado pulmonar contendo um aumento de c?lulas Treg (CD4 + Foxp3 +), c?lulas T (CD4 + e CD8 +) e uma diminui??o nas c?lulas + B220, quando comparado com camundongos do tipo selvagem infectados com M. tuberculosis. Portanto, os resultados observados no presente estudo fornecem novas evid?ncias sobre o papel dos receptores P2X7 na patog?nese e controle da tuberculose. O uso de agonistas ou antagonistas seletivos deste receptor como uma ferramenta terap?utica continua sendo uma quest?o a ser investigada.

Made available in DSpace on 2015-04-14T13:35:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 439097.pdf: 7980733 bytes, checksum: af8f6a7fa6a599651957ad5f12054783 (MD5) Previous issue date: 2012-05-16
Tuberculosis continues to be one of the deadliest diseases in the world. The emergence of drug-resistant strains of Mycobacterium tuberculosis, the unbearable side effects of the available drugs and the frequent patient non-compliance in completing the therapy have increased the need for development of new effective agents. We have previously demonstrated a potent in vitro inhibitory activity for two pentacyano(isoniazid)ferrate(II) compounds, namely IQG-607 and IQG-639 against the M. tuberculosis enoyl-ACP reductase enzyme. Importantly, IQG-607 and IQG-639 were active against cultures of M. tuberculosis H37Rv and two isoniazid-resistant clinical isolates in vitro. In the present study, the activity of these compounds was evaluated by using an in vivo murine model of tuberculosis. Swiss mice were infected with M. tuberculosis H37Rv strain, and IQG-607 and IQG-639 (250 mg/kg) were administered during 28 or 56 days. As well, a dose-response study was performed with IQG-607 (at 5, 10, 25, 50, 100, 200 and 250 mg/kg). The activity of test compounds was compared with that of the positive control drug isoniazid at 25 mg/kg. After 28 or 56 days of treatment, either IQG-607 or isoniazid significantly reduced M. tuberculosis-induced splenomegaly, and also significantly diminished the colony-forming units in both spleens and lungs. IQG-607 or isoniazid ameliorated the lung macroscopic aspect, reducing the lung lesions to a similar extent. However, IQG-639 was not capable of significantly modifying any evaluated parameter. IQG-607 did not display a classical dose-dependent profile in our murine model of tuberculosis, and 10 mg/kg was the lowest dose able to show significant activity, which was similar to the inhibition observed for higher doses. In addition, experiments using early and late controls of infection revealed a bactericidal activity for IQG-607 in our model. The promising activity of IQG-607 in M. tuberculosis-infected mice suggests that this compound might represent a good candidate for clinical development as a new antimycobacterial agent.
A tuberculose ? uma das principais causas de morte no mundo. O surgimento e dissemina??o de cepas de Mycobacterium tuberculosis resistentes a f?rmacos, os efeitos indesej?veis dos f?rmacos atualmente dispon?veis e a falta de ades?o dos pacientes ao tratamento t?m aumentado a necessidade do desenvolvimento de novos agentes anti-tuberculose. Estudos pr?vios revelaram uma potente atividade inibit?ria in vitro de dois compostos pentaciano(isoniazida)ferrato(II), denominados IQG-607 e IQG- 639, frente a enzima enoil-ACP redutase de M. tuberculosis. Ainda, o IQG- 607 e o IQG-639 foram ativos quando testados em culturas de M. tuberculosis H37Rv e sobre dois isolados cl?nicos resistentes ? isoniazida in vitro. Neste trabalho, a atividade destes dois compostos foi avaliada in vivo, utilizando um modelo murino de infec??o por M. tuberculosis. Camundongos su??os foram infectados com a cepa de M. tuberculosis H37Rv e o IQG-607 ou o IQG-639 (250 mg/kg) foram administrados aos animais durante 28 ou 56 dias. Adicionalmente, um estudo de dose-resposta foi realizado com o composto IQG-607, empregando as doses de 5, 10, 25, 50, 100, 200 e 250 mg/kg. As atividades dos compostos-teste foram comparadas ? atividade da isoniazida (25 mg/kg), o controle positivo do tratamento. Ap?s 28 ou 56 dias de tratamento, tanto o IQG-607 quanto a isoniazida reduziram significativamente a esplenomegalia induzida pela infec??o e, tamb?m, diminu?ram as unidades formadoras de col?nia, tanto nos pulm?es quanto nos ba?os dos animais tratados. O IQG-607 e a isoniazida melhoraram o aspecto macrosc?pico dos pulm?es, reduzindo as les?es pulmonares de maneira semelhante. Por sua vez, o IQG-639 n?o foi capaz de modificar significativamente nenhum par?metro avaliado neste estudo. O IQG-607 n?o apresentou um perfil cl?ssico de dose depend?ncia, sendo observada atividade inibit?ria significativa similar, entre as doses de 10 mg/kg e 250 mg/kg. Al?m disto, um experimento utilizando um controle pr?-tratamento demonstrou que o IQG-607 possui atividade bactericida no nosso modelo. A atividade satisfat?ria do IQG-607 em camundongos infectados com M. tuberculosis sugere que este composto pode ser um candidato promissor no desenvolvimento cl?nico de um novo agente antimicobacteriano.

This thesis collects the work I have done during the three-year PhD Course. During my first year I have started a path that has allowed me to acquire different techniques devoted to set up and maintain primary cell cultures and cancer derived cell lines as well as to evaluate the cytotoxicity of potential novel synthetic inhibitors of human cancer cells. Part of the second and all the third year was spent at the University of Cape Town, South Africa, in the laboratory of prof. Ariel Katz under the supervision of proff. Roger Hunter and Catherine H. Kaschula investigating the anticancer activity of Z-ajoene, a garlic compound. Overall, the main aim of all the my research project was to identify and characterize natural or synthetic compounds as new antineoplastic agents. The results obtained are divided according to the research topics addressed: Anticancer activity of new Phenanthroline compounds (Part I); The garlic compound Z-ajoene as anticancer agents (Part II). Studies referring to the Part have been carried out at the University of Cagliari and were focalized on the evaluation of new Cu(II) -phenanthroline complexes as a potent antineoplastic agents against various solid and suspension tumours. The [Cu(1,10-phenanthrolin -5,6-diol)2(OH2)](ClO4)2 complex appears to be the most potent compound against human leukemia, prostate and lung cancer cell lines. The results obtained on the biological activity of this class of compounds, providing valuable information for the design of new anticancer drugs, have been published in the Journal of Inorganic Biochemistry (2014). As for the Part II of my research, I focused on the mechanisms underlying the anti-tumoral activity of garlic compound Z-ajoene on human triple –negative breast cancer cells. The results indicate that Z-ajoene localizes in the ER of MDA-MB-231 cells where it activates the unfolded protein response (UPR) and ER stress. These findings have been published in the Molecular Carcinogenesis journal (2015) Moreover, immunofluorescence studies support the concept that the Z-ajoene main target is a ER-resident chaperon protein (PDI), whose functional alteration may well be the cause of the cytotoxic effect. Another molecular target of Z-ajoene is the cytoskeleton protein Vimentin. Z-ajoene interacts with Vimentin through a S–thiolation causing the disruption of Vimentin filaments and therefore an alteration of the cell morphology. Given that Vimentin is known to participate to the early stage of the metastatic process, I also investigated the potential effect of Z-ajoene at non-cytotoxic concentrations in a specific cell assay and found that it effectively inhibits cell migration, both in the absence and presence of a chemotactic agent. The metastatic inhibition induced by Z-ajoene seems caused by modification of several signaling pathways as expression of Axl and Src proteins, and phosphorylation of β–catenin were changed. Although following inhibition of cell migration, a reduction of Vimentin expression was to be expected, Z-ajoene treatment surprisingly induced an upregulation of Vimentin. We interpreted this result as a consequence of Z-ajoene binding to Vimentin which unable this protein to perform its physiologic functions (manuscripts in preparation). Altogether, the data of my in vitro study indicate that Z-ajoene is a promising chemotherapeutic agent simultaneously acting on different molecular targets, also able to affect the metastatic process in cells derived from highly invasive breast tumors. Due to its potential use in the clinic, preclinical evaluation in xenograft mouse models of cancer are ongoing.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior
A avaliaÃÃo, in vivo, do efeito do Extrato hidroalcÃolico dos frutos da Punica granatum L. (EHA) na inibiÃÃo da placa bacteriana supragengival, foi realizada em portadores de aparatologia ortodÃntica fixa. O material foi coletado pela manhÃ, apÃs 24 horas sem higiene oral, de 23 homens e 37 mulheres (com idade variando entre 9 e 25 anos), em consultÃrio odontolÃgico, na cidade de Crato (CearÃ), Brasil. ApÃs randomizaÃÃo, foram divididos em trÃs grupos de vinte indivÃduos cada. Grupo 1 - EHA; Grupo 2 - gluconato de clorhexidina a 0,12% (CLX); Grupo 3 (controle) â Ãgua destilada . Cada grupo recebeu, sob a forma de bochecho de 1 minuto, 15 ml do EHA (60mg/ml), do CLX e da Ãgua destilada. A placa dentÃria foi coletada antes e apÃs o bochecho com uma destas trÃs substÃncias. As colÃnias bacterianas foram contadas para determinaÃÃo de unidades formadoras de colÃnias (UFC/ml) e determinou-se a concentraÃÃo inibitÃria mÃnima (CIM) e o tempo de duraÃÃo do efeito do EHA sobre os microorganismos da placa dentÃria. Avaliou-se a atividade antimicrobiana in vitro do EHA e da CLX sobre 14 linhagens patogÃnicas do Banco de Microorganimos da Faculdade de Medicina de Juazeiro â FMJ. Foi determinada a CIM do EHA frente a quatro linhagens sensÃveis (S. β-hemoliticus, S.aureus, P. aeruginosa e C. albicans). A anÃlise estatÃstica (Mann-Whitney U) nÃo mostrou diferenÃa entre os grupos EHA e CLX (p = 0.7251), mas uma diferenÃa significante foi observada no EHA (p< 0.0001), quando comparado com o grupo controle. As porcentagens de inibiÃÃo foram de 83.5% e 79%, apÃs bochecho com EHA e CLX, respectivamente. A CIM do EHA sobre os microorganismos da placa dentÃria foi de 15 mg/ml. Houve uma reduÃÃo em UFC/ml de 72.2% e de 63.8%, imediatamente apÃs o bochecho com EHA e 1 hora depois, respectivamente. O EHA apresentou um efeito antibacteriano semelhante ao observado com a CLX, ambos mostraram-se ativos contra as linhagens de S. aureus, S. β-hemolyticus, S. β-hemolyticus, P. aeruginosa, E. coli, K. pneumoniae e P. vulgaris. O EHA foi efetivo contra C. albicans. A CIM do EHA sobre linhagens de S. β-hemolyticus, S. aureus, P. aeruginosa e C. albicans foram, respectivamente, 1.87, 3.75, 7.5 e 15 mg/ml. O EHA apresenta uma atividade significante contra microorganismos presentes na placa dentÃria
The in vivo, evaluation, of the effect of the hydroalcoholic extract from Punica granatum L. (HAE) in the inhibition of the supragengival dental plaque, was carried with 60 voluntaries using fixed orthodontic appliance. The material was collected in the morning after 24h without oral hygiene, from 23 men and 37 women (age ranging from 9 to 25 years) at the city of Crato (CearÃ), Brasil. The voluntaries were randomly distributed in to 3 groups of 20 subjects. Group 1: HAE; group 2: 0.12% Chlorhexidine gluconate (CLX); group 3 (control): distilled water. Each group received, under the form of a mouth-rinse for 1 minute, 15 ml of either HAE; CLX or distilled water. The dental plaque was collected before and after the mouth-rinse with one of these three substances. The bacteria colonies were counted and results expressed as colony forming unities (CFU). The minimum inhibitory concentration (MIC) and duration of the antimicrobial effect of HAE on the dental plaque were determined. The bacterial susceptibility tests in vitro to HAE and chlorhexidine on 14 pathogenic bacterial strains of the FMJ Bank, were assessed and MIC values for each bacterial strain susceptible to HAE were also determined. The statistics analysis (Mann-Whitney U) showed no difference between HAE and CLX groups (p = 0, 7251), but a significant difference was observed in the HAE group (p<0.0001) as compared against control. The percentages of inhibitions of the order of 83.5% and 79% after mounth-rinse with the HAE and CLX respectively. The MIC of the HAE on the microorganisms of the dental plaque was of 15 mg/ml. The antibacterial effect of the HAE lasted for at least 1h and the percentage of inhibition of the CFU was 72.2% after the mounth-rinse and 63.8%, 1h later. The HAE presents an antimicrobial efficacy similar to that shown by CLX, both being actives against S. aureus, S. β-hemoliticus, S. β-hemoliticus, P. aeruginosa, K. pneumoniae, P. vulgaris and E. coli. The HAE was also effective against C. albicans. The MICs of HAE on the strains of S. β-hemoliticus, S. aureus, P. aeruginosa and C. albicans were 1.87, 3.75, 7.5 and 15 mg/ml, respectively. The HAE presents a significant activity against microorganisms present in the dental plaque

Objectives. At the light of properties and limits of cisplatin (CDDP) as an anticancer agent, and in view of the potential clinical relevance of the synergic effect of CDDP with the Cu(II)-phen complexes previously reported against T-leukemia cells (Pivetta et al.,Talanta, 2013), my research project was aimed at (1) extending the studies of CDDP-Cu(II)-phen combinations as such, as well as with the addition of a third drug component; (2) determining the potential degree of selectivity of the most synergic drug combinations. Methods. Most studies were focused on the most potent Cu(II)Phen compound (C0), lead of the cupper-phen complex series. Wild type and CDDP-resistant human T-leukemia CEM cells, wild type and CDDP-resistant human ovarian carcinoma A2780 cells, and ex vivo cultures of human peripheral blood lymphocytes from healthy donors, were used as cell models to characterize the cytotoxic activity of both binary and ternary drug combinations. Experimental Design (ED) and Artificial Neural Network (ANN) were used for setting experiments and for evaluation of data. Results. Binary and ternary drug combinations showed statistically significant synergisms either against the CDDP-sensitive and the CDDP-resistant cancer cell models. The three-drug cocktail was the most potent with a markedly higher cytotoxicity against leukemic lymphocytes than against ex vivo healthy proliferating lymphocytes. An ESI-MS study of CDDP-C0 mixed combination showed the formation of copper-platinum adducts which, leading to the release of a phenantroline moiety, may -at least in part- explain the synergism observed in the cell models. In addition, the analysis of phospholipid profiles showed lipid alterations in the CDDP-resistant CEM and A2780 cells with respect to their parental counterparts. Conclusions. Besides of the need of further studies to unveil the molecular target(s) of the triple-drug cocktail, based on the promising selectivity index (SI = 5) for cancer cells, investigations on its effectiveness in a xenograft mice models of human susceptible and CDDP-resistant ovarian carcinoma are on the way.

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FAPESPA - Fundação Amazônia de Amparo a Estudos e Pesquisas
CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
A cromoblatomicose (CBM) é uma doença causada por implantação transcutânea de várias espécies de fungos melanizados. O estado do Pará é a principal área endêmica do país, sendo Fonsecaea pedrosoi o principal agente etiológico. O tratamento desta doença não é padronizado e diversas formas de intervenção são relatadas na literatura. Por outro lado, os testes de susceptibilidade in vitro aos fármacos antifúngicos podem ajudar na escolha do esquema terapêutico e na identificação de cepas resistentes. Este trabalho tem como objetivo avaliar a susceptibilidade in vitro ao itraconazol (ITZ), ao cetoconazol, (CTZ), ao fluconazol (FCZ) e a terbinafina (TBF) em 20 isolados clínicos de Fonsecaea pedrosoi, bem como as possíveis alterações morfológicas induzidas por ITZ ou TBF na Concentração Inibitória Mínima (CIM) e em altas concentrações. Os testes de susceptibilidade foram conduzidos de acordo com as recomendações do Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, documento M38-A2). As concentrações finais de ITZ, TBF e CTZ em cada teste variaram de 16 a 0.03 μg/mL e de 64 a 0.125 μg/mL para o FCZ. A CIM para cada fármaco utilizado foi obtida após cinco dias de incubação a 30°C, sendo definida como a mínima concentração do fármaco capaz de reduzir em 100% o crescimento visual do fungo quando comparado com o grupo controle. O ITZ demonstrou ser o fármaco mais efetivo in vitro contra conídios de F. pedrosoi (CIM 90= 1μg/mL). A TBF apresentou baixa atividade in vitro, com 70% das cepas apresentando CIM ≥ 0.5 μg/mL. Quando se analisa morfologicamente os conídios tratados com a CIM para ITZ observa-se um aumento no diâmetro celular, a presença de conídios em processo de divisão e formação de pequenas cadeias. Na maior concentração do teste de susceptibilidade (16 μg/mL) observou-se a irregularidade no contorno celular, o desprendimento de material pigmentado da parede celular e a vacuolização. Em 32 μg/mL e 64 μg/mL notou-se a ruptura da parede celular e conídos amorfos. Não foram observadas - em nenhuma das concentrações analisadas - alterações morfológicas significativas induzidas pela TBF. Além disso, a 5-Fluorocitosina (5-FC) e o FCZ não impediram o crescimento dos conídios, mesmo em altas concentrações. No entanto, alterações ultraestruturais foram notadas após tratamento com 5-FC 64 μg/mL. Portanto, sugere-se um comportamento morfológico diferente de conídios frente ao ITZ ou TBF durante os testes de susceptibilidade in vitro. Em síntese, dentre os fármacos estudados, ITZ apresentou a melhor atividade antifúngica in vitro, enquanto a 5-FC somente provocou alterações estruturais em hifas e conídios na mais alta concentração utilizada no estudo.
Choromoblastomycosis (CBM) is a disease caused by traumatic implantation of many species of melanized fungi. The State of Pará is the major endemic area in Brazil and Fonsecaea pedrosoi is the major etiological agent. The treatment is not standardized and many forms of interventions are related in the literature. In the other hand, the in vitro susceptibility test to antifungal drugs may help in the therapeutic choice and in the identification of resistant strains. The objective of this work is to evaluate the in vitro susceptibility of 20 F. pedrosoi clinical isolates to itraconazole (ITZ), ketoconazole (KCZ), fluconazole (FCZ) and terbinafine (TBF) as well as the possible morphological alterations induced by ITZ or TBF in the Minimal Inhibitory Concentration (MIC) and high concentrations. The tests were performed according to the Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, M38-A2 document) recommendations. The final concentrations of ITZ, TBF and KCZ in each test were to 16 to 0.03 μg/mL. To FCZ the final concentrations were to 64 to 0.125 μg/mL. The MIC was defined as the lowest drug concentration that inhibit 100% the visual growth when compared to the non-treated group after five days of incubation at 30°C. ITZ proved to be the most effective drug in vitro against F. pedrosoi (CIM 90= 1μg/mL). TBF showed a low drug activity with 70% of the isolates with MIC ≥ 0.5 μg/mL. The conidia morphological analysis revealed an increasing in the diameter, an interruption of the cellular division and the formation of little chains after the treatment with ITZ in the MIC. At the high concentration used in the susceptibility test we noticed an irregular shape, a detachment of pigmented material from the cell wall and a vacuolization. Rupture in cell wall and amorphous conidia were observed at 32 μg/mL and 64 μg/mL. Significant alterations were not observed after treatment with TBF at the same concentrations. Moreover, the 5-fluorocytocise (5-FC) and FCZ do not stop the conidia growth at high concentrations. However, ultrastructure alterations were noticed after treatment with 5-FC 64 μg/mL. Thus, it is suggested a different morphological pattern after ITZ or TBF treatment during the in vitro susceptibility test. In synthesis, ITZ shown better in vitro antifungal activity while 5-FC only provoked structures alterations in the highest concentration tested.

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ficha_de_caroline_borges_biotecnologia.pdf: 7018 bytes, checksum: b335f912cae89a687603fa35c4e44d7d (MD5) Previous issue date: 2007-10-16
Xanthan yield and physical and chemical characteristics can be improved by modification in culture conditions, as well as, by post-fermentation treatments in order to obtain a xanthan with the required characteristics. The aim of this work was to study the operational conditions in xanthan production by Xanthomonas arborícola pv pruni strains 106 and 115 to be used in oilwell drilling fluids. The influence of thermal treatment applied to the fermentation broth was evaluated in the xanthan produced by strain 106 in a range of pH and stirrer speed. The thermal treatment decreased the yield between 5.8 and 14%, nevertheless, was observed increase of aqueous solution and fermentation broth viscosities. The aggregation of xanthan molecules caused by thermal treatment and determined by increase of molar mass was dependent on the sodium content. As a result, a correlation between molar mass and xanthan solution viscosity can be observed. The fermentation broth sterilization was adopted for experiment in which a pre-selection of production medium in orbital shaker was performed for subsequent pH, production medium and stirrer speed study in fermentor by strains 106 and 115. Xanthan production and viscosity was dependent on the strain of X. arborícola pv pruni and on the operational condition used. The production medium B showed the best balance of yield and viscosity results, in orbital shaker, as well as in fermentor. The best results for both strains were obtained at pH 7, 600 rpm and 66 h of fermentation. The two strains showed potential for xanthan production. In an evaluation study of, physical and chemical characteristics, the xanthan produced by strain 115 was compared to the characteristics of the commercial xanthans, Roeper and Kelzan. The former is for application in food, pharmeceutical products and cosmetics and the latter for application in oilwell drilling fluids. The results were within the literature specified patterns, except by the low piruvate content of xanthan produced by strain 115, low monovalent salt content of Roeper sample and high divalent salt content of both commercial samples. The xanthans produced by X. arborícola pv pruni were evaluated as viscosifying fluid for use in oilwell drilling, in comparison to Duo Vis, Kelzan and Xanvis commercial brands. As a whole, the results obtained in this study show that the commercial polymers are more efficient when used in aqueous solution, since these polymers contain high salt concentrations. Xanthans produced by patovar pruni, Xc 106 600 and Xc 115 600, as having low salt concentration, they show potential for application in oilwell drilling fluid, when a salt solution was used, similar to the conditions of marine exploration.
O rendimento e as características físicas e químicas da xantana podem ser melhorados através das modificações nas condições de cultivo, assim como, por tratamentos empregados após a fermentação, para a obtenção de uma xantana com características desejadas para o fim que se propõe. O trabalho objetivou estudar as condições operacionais de produção de xantana por Xanthomonas arboricola pv pruni cepas 106 e 115 para aplicação em fluidos de perfuração de poços de petróleo. A influência do tratamento térmico aplicado no caldo fermentado foi avaliada na xantana produzida pela cepa 106 em diferentes condições de pH e velocidade de agitação. O tratamento térmico reduziu o rendimento entre 5,8 e 14%, entretanto, foi observado o aumento da viscosidade da solução aquosa e do caldo fermentado. A agregação de moléculas de xantana provocada pelo tratamento térmico, e comprovada pelo aumento da massa molar foi dependente da concentração de sódio. Como resultado pode ser observada relação entre a massa molar e a viscosidade da solução de xantana. A esterilização do caldo fermentado foi adotada para o experimento posterior, em que foi realizada uma pré-seleção de meios de produção, em agitador incubador, para posterior estudo de pH, meio de produção e velocidade de agitação em fermentador pelas cepas 106 e 115. A produção e a viscosidade das xantanas sintetizadas foram dependentes da cepa de X. arboricola pv pruni e das condições operacionais. O meio de produção B apresentou o melhor equilíbrio entre produção e viscosidade, em agitador incubador, assim como no fermentador. Os melhores resultados para ambas as cepas foram obtidos em pH 7, 600 rpm e 66 h de fermentação. As duas cepas apresentaram potencial para serem utilizadas na produção de xantana. No estudo da avaliação das características físicas e químicas, a xantana produzida pela cepa 115 foi comparada as características das xantanas comerciais, Roeper e Kelzan. A primeira, para aplicação em alimentos, produtos farmacêuticos e cosméticos e a segunda, para aplicação em fluido de perfuração de poços de petróleo. Os resultados apresentaram-se dentro dos padrões especificados pela literatura, exceto pelo baixo conteúdo de piruvato da xantana produzida pela cepa 115, baixo conteúdo de sais monovalentes da amostra Roeper e alto conteúdo de sais divalentes das duas amostras comerciais. As xantanas produzidas por X. arboricola pv pruni foram avaliadas como viscosificante de fluido para aplicação na perfuração de poços de petróleo, comparando-as com amostras comerciais: Duo Vis, Kelzan e Xanvis. De uma forma geral, os resultados obtidos neste estudo mostram que os polímeros comerciais apresentaram maior eficiência quando preparados em solução aquosa, pois estes polímeros continham alta concentração de sais. Já as xantanas produzidas pelo patovar pruni, Xc 106 600 e Xc 115 600, por apresentarem baixa concentração de sais, apresentaram potencial para aplicação em fluido de perfuração de poços de petróleo, quando preparados em solução salina, condição semelhante a utilizada na exploração marítima.

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CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
FAPESPA - Fundação Amazônia de Amparo a Estudos e Pesquisas
O arsênio é um metalóide tóxico que se tornou um problema de saúde pública em todo o mundo. Como forma de reduzir a contaminação ambiental por este metalóide, a qual é proveniente de atividades antropogênicas e naturais, a utilização de microorganismos em processos de biorremediação se tem mostrado uma estratégia promissora. A cianobactéria filamentosa homocitada, Geitlerinema unigranulatum UFV-E01, pertencente à ordem Pseudanabaenales, foi isolada de um ambiente contaminado por arsênio, sugerindo uma habilidade em lidar com o efeito tóxico deste metalóide. Com vista nisso, o presente trabalho objetivou caracterizar a resistência ao arsenato de sódio e quantificar o arsênio total extracelular da cianobactéria G. unigranulatum UFV-E01. As análises de resistência ao arsenato de sódio revelaram que a cianobactéria foi capaz de crescer em até 50 mM por 20 dias. Além disso, a cianobactéria G. unigranulatum UFV-E01 acumulou arsenato de sódio por 10 dias, reduzindo em até 67% o arsênio extracelular. Pelos dados obtidos neste estudo, a cianobactéria G. unigranulatum UFV-E01 foi capaz de resistir a altas concentrações de arsenato de sódio, no entanto outras análises, como a caracterização das vias metabólicas envolvidas no processo de resistência, devem ser realizadas para considerar sua aplicação em ambientes impactados por arsênio.
Arsenic is a toxic metalloid that has become a public health problem worldwide. In order to reduce the environmental contamination by this metalloid, which is derived from natural and anthropogenic activities, the use of micro-organisms in bioremediation process has shown to be a promising strategy. A filamentous homocitada cyanobacterium belonging to the order Pseudanabaenales, Geitlerinema unigranulatum UFV-E01, was isolated from an environment contaminated by arsenic, suggesting an ability to deal with the toxic effect of this metalloid. In view of this, this study aimed to characterize the resistance to sodium arsenate and quantify the total arsenic extracellular cyanobacterium G. unigranulatum UFV-E01. Analyses of sodium arsenate resistance showed that the cyanobacterium was able to grow in 50 mM for 20 days. Furthermore, the cyanobacterium G. unigranulatum UFV-E01 accumulated sodium arsenate for 10 days, reducing up to 67% arsenic extracellular. From the data obtained in this study, the cyanobacterium G. unigranulatum UFV-E01 was able to withstand high concentrations of sodium arsenate, although other analysis, the characterization of the metabolic pathways involved in the resistance must be taken to consider their use in environments impacted by arsenic.

Submitted by Edisangela Bastos (edisangela@ufpa.br) on 2013-12-06T18:21:21Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Dissertacao_ResistenciaBioacumulacaoArsenio.pdf: 658991 bytes, checksum: a40d3444f6b9f083c08c6db338495936 (MD5)
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CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
FAPESPA - Fundação Amazônia de Amparo a Estudos e Pesquisas
UFPA - Universidade Federal do Pará
A contaminação ambiental por arsênio vem aumentando nos últimos anos, seja através de fontes naturais ou antropogênicas, o que pode ocasionar uma maior exposição do homem a este composto tóxico. Vários estudos vêm analisando o potencial de espécies cianobacterianas como possíveis biorremediadoras na busca de soluções para diminuir os impactos causados por este metaloide. A cianobactéria filamentosa Phormidium sp. se destaca por apresentar mecanismos bem desenvolvidos de adaptação às diversas condições ambientais. O presente estudo objetivou analisar o perfil de resistência da Phormidium sp. em diferentes concentrações de arsenato de sódio. A cianobactéria foi inoculada em tubos contendo 4 mL de meio BG-11 líquido e diferentes concentrações de arsenato (5, 10, 30, 50, 100, 130, 150, 200 e 250 mM) e sem a presença do metaloide (controle) e cultivadas durante 20 dias a 25ºC, sem agitação e com fotoperíodo de 12/12 horas de luz/escuro. A toxicidade do arsenato para Phormidium sp. foi caracterizada pela inibição do crescimento, sendo este determinado pela concentração de clorofila a. Todas as condições foram realizadas em triplicatas. A determinação do arsênio total presente nas amostras foi obtida através da técnica de espectrometria de emissão óptica com plasma induzido, do Instituto Evandro Chagas. A resistência de Phormidium sp. ao arsenato foi observada em até 50 mM do composto (p>0,05). À partir de 100 mM de arsenato foi observada inibição do crescimento cianobacteriano (p<0,05). As análises da dosagem de arsênio total no meio de cultura mostram que, durante os primeiros dias de experimento, a concentração de arsênio no meio de cultura foi reduzido, seguido de um aumento gradativo na concentração deste metaloide. Provavelmente, esta cianobacteria pode acumular o arsênio e posteriormente excretar este metaloide para o meio extracelular. Os resultados obtidos indicam a capacidade que a cianobactéria Phormidium sp. possui de crescer em meio contendo altas concentrações de arsênio. No entanto, outras análises se tornam fundamental para elucidar as vias metabólicas envolvidas durante o processo de resistência a este metaloide.
Environmental contamination by arsenic has been increasing in recent years, either through natural or anthropogenic sources, which can cause greater exposure of humans to this toxic compound. Several studies have been developed to analyze the capacity of cyanobacterial species in bioremediation. The filamentous cyanobacterium Phormidium sp. excels due to well developed mechanisms to adapt to different environmental conditions. The present study aimed to analyze the resistance profile of Phormidium sp. at different concentrations of sodium arsenate. The cyanobacterium was inoculated in tubes containing 4 ml of BG-11 liquid medium and different concentrations of arsenate (5, 10, 30, 50, 100, 130, 150, 200 and 250 mM) without the presence of metalloid (control) and cultured for 20 days at 25 ° C without agitation and with a photoperiod of 12/12 h light / dark. The toxicity of arsenate to Phormidium sp. has been characterized by growth inhibition being determined by the concentration of chlorophyll a. All conditions were performed in triplicate. The determination of total arsenic in the samples was obtained using the technique of optical emission spectrometry with inductively coupled plasma, the Instituto Evandro Chagas. The resistance of Phormidium sp. to arsenate was observed up to 50 mM of compound (p>0.05). Growth inhibition was observed above 100mM of arsenate (p<0.05). The analyzes of the total dose of arsenic in the culture medium showed that during the first day of experiment, the concentration of arsenic in the culture medium was lowered, followed by a gradual increase in the concentration of this metalloid. Probably, this cyanobacteria can accumulate arsenic and later excrete this metalloid to the extracellular medium. The results indicate the ability of the cyanobacterium Phormidium sp. has to grow in medium containing high concentrations of arsenic. However, other analyzes become fundamental for elucidating the metabolic pathways involved in the process of resistance to this metalloid.

The family Amaranthaceae consist of approximately 65 genus and 1000 species of herbaceous plants. The genus Alternanthera is in this family and can be found spread worldwide. The Alternanthera brasiliana (L.) Kuntze and Alternanthera dentata (Moench) Stuchlik species are known as penicillin and can be found in Brazil, commonly in Santa Catarina and Rio Grande do Sul. The popular usage of the A. brasiliana specie is for the treatment of tonsillitis, cold and the influenza and the A. dentata is used to treat infections, fever along with headache and is also used as antiseptical for the treatment of itches and wounds. This work aims at to stipulate pharmacognostics parameters of distinguishment between the two cited species because there is a disagreement among the botanics about the existence of the dentata species. The macroscopical characteristics that can help authenticate them are: the perimeter, color, the abundance of trichomas in the limb and the shape of the stalk. The anatomical analysis had allowed the distinction through the type of found stomata (anfiestomatic and hipostomatic), the existence of the collenchyma disposal of the phloem and the absence of trichomes in the adaxial surface of A. dentata. The presence of the Kranz sheath characterized the type C4 of the Amaranthaceae family. Additionally, this work describes the identification of β-sitosterol, stigmasterol and espinasterol isolated from dichloromethane fraction of A. brasiliana leaves. The A. brasiliana leaves used in the pharmacobotanic and phytochemistry analyses and in the biological activities were collected in December 2004 and March 2005 in Santa Cruz do Sul (RS) and Santa Maria (RS), the leaves were identified by the biologist Dr. Thaís do Canto Dorow (Dpt. of Biology, UFSM). The vouchers are deposited in the Department of Biology herbarium of UFSM respectively under the register numbers SMDB 10038 and 10039. The A. dentata specie used in the morphoanatomic study was collected in Florianópolis (SC) and was identified by the researcher Antônio Amaury Silva Jr. of EPAGRI-SC and confirmed by Elen N. Garcia and Sílvia Rubin, both biologists of the Federal University of Pelotas. This specie used in the study is registered in the institution 03 herbarium (PEL-UFPEL) 04/07/06 and in the UFSM herbarium SMDB 10100. In relation to the antimicrobial activity the best result was obtained in the dichloromethane fraction with the Prototheca zopffi algae but it was also found satisfactory MIC for the Gram-positive S. aureus and B. subtillis bacteria and for the S. cerevisiae fungus. The biggest antioxidant activity was found in the acetate of ethyla fraction wich evidenced a IC50=163, 01ug/mL. The correlation between the polyphenol tenors and the antioxidant activity was not possible.
A família Amaranthaceae compreende, aproximadamente 65 gêneros e 1000 espécies de herbáceas. O gênero Alternanthera está inserido nesta família e encontra-se amplamente distribuído pelo mundo. As espécies Alternanthera brasiliana (L.) Kuntze e Alternanthera dentata (Moench) Stuchlik são igualmente conhecidas por penicilina , sendo encontradas no Brasil, mais comumente nos estados de Santa Catarina e Rio Grande do Sul. O uso popular da espécie A. brasiliana destina-se ao tratamento de amigdalites, gripes e resfriados já para a espécie A. dentata foi referenciada em infecções, febre acompanhadas de dor de cabeça e também como antiséptico para sarnas e feridas. Este trabalho visa determinar parâmetros farmacognósticos de diferenciação entre as referidas espécies, uma vez que há discordância entre botânicos da existência da espécie dentata. As características macroscópicas que podem auxiliar na autenticação das espécies são contorno, cor, abundância de tricomas no limbo e a forma do pecíolo. As análises anatômicas permitiram a diferenciação através do tipo de estômatos encontrados (anfiestomático e hipostomático) além da ocorrência do colênquima, disposição do floema e a ausência de tricomas tectores na face adaxial de A. dentata. A presença da bainha vascular com anatomia de Kranz caracterizou o tipo C4 da família Amaranthacea. Adicionalmente, o trabalho descreve a identificação de β-sitosterol, estigmasterol e espinasterol oriundos da fração diclorometânica das folhas de A. brasiliana. As folhas de A. brasiliana para as análises farmacobotânica, fitoquímicas e atividades biológicas foram coletadas em dezembro de 2004 e março de 2005 nos municípios de Santa Cruz do Sul e Santa Maria, sendo identificadas pela bióloga Drª. Thaís do Canto Dorow (Dpto. Biologia, UFSM). As excicatas estão depositadas no Herbário do Departamento de Biologia da UFSM sob registro SMDB10038 e 10039, respectivamente. A espécie A. dentata utilizada no estudo morfo-anatômico foi coletada no município de Florianópolis, sendo identificada pelo pesquisador da EPAGRI-SC Antônio Amaury Silva Jr., e confirmada pelas biólogas da Universidade Federal de Pelotas Elen N. Garcia e Sílvia Rubin, tendo seu registro no herbário da instituição 03 (PEL-UFPEL) 04/07/06 e no Herbário da UFSM SMDB 10100. Quanto a atividade antimicrobiana, a melhor resposta obtida foi com a fração diclorometânica frente a alga Prototheca zopffi mas também foram encontrados CIM satisfatórios para as bactérias Gram-positivas S. aureus e B. subtillis e para o fungo S. cerevisiae. A maior atividade antioxidante foi encontrada na fração acetato de etila, a qual evidenciou um IC50=163, 01μg/mL. Não foi evidenciada correlação entre teores de polifenóis e atividade antioxidante.

The past thirty years have reported the introduction of multiple anticancer therapies targeting various aspects of the cancer hallmarks, which are essential for successful tumor propagation and dissemination. In this sense, the evolution of molecular-scale technology has been central to the identification of new cancer targets. The receptor tyrosine kinase (RTK) Hardy-Zuckerman 4 feline sarcoma virus homolog (c-KIT) is a critical regulator of growth, differentiation, migration and proliferation in the hematopoietic system, in germ cells and melanocytes. Since it activates a number of intracellular signaling pathways implicated in the tumor progression, it is one of the most studied proto-oncogenes as well as the target of drugs belonging to the family of tyrosine kinase inhibitors (TKIs). Actually, TKIs are employed for the treatment of human and canine c-KIT-dependent tumors as an alternative to standard chemotherapy. Nevertheless, multiple resistance phenomena frequently occur. Recently, the discovery of G-quadruplex (G4) structures highlighted a new role for DNA in cancer biology. DNA G4 are four-stranded globular nucleic acid secondary structures, formed in specific G-rich sequences with biological significance; among these ones, the human telomeres and the promotorial region of oncogenes such as c-KIT. In the first part of this dissertation, three compounds were proved to bind in silico c-KIT G4 and were tested in human and canine cell lines to check for their potential usefulness as therapeutic agents. Interesting results, e.g. c-KIT mRNA and protein inhibition, were obtained with an anthraquinone derivative (AQ1) that caused a block of cell proliferation. In another study, the occurrence of c-KIT mutations was investigated in matched primary and metastatic canine cutaneous mast cell tumor (MCT), to make a recommendation for the best therapeutic choice. In dogs, 10-30% of MCTs possess c-KIT mutations, and the relevance of the mutational status for the therapy with TKIs is nowadays accepted also in this species; however, little is known on c-KIT mutational status in metastatic MCTs. In all analyzed dogs, there was a perfect concordance between c-KIT mutational status in primary MCT and the relative lymph node metastasis. This has a relevant implication for clinical practices. Finally, during the Ph.D. program, a collaboration was established with the Centre de Recherche en Cancérologie de Marseille, and particularly with Dr. Patrice Dubreuil. In his most recent articles, he discovered a set of genes that are frequently mutated in human systemic mastocytosis (SM) and cooperate with c-KIT in the disease malignant evolution. In the last study illustrated in this Ph.D. thesis, the mutational profile of these hotspot genes in canine MCTs samples has been screened, in order to find molecular similarities between the two diseases, thereby justifying the use of domestic dog as an animal model in comparative oncology.
Negli ultimi trent’anni, l’evoluzione delle tecnologie in campo medico-scientifico ha permesso la più profonda conoscenza dei meccanismi molecolari alla base dello sviluppo, della crescita e della diffusione del tumore. Tutto ciò ha permesso di sviluppare le cosiddette terapie mirate, identificando nuovi bersagli terapeutici. Il recettore tirosin-chinasico c-KIT è un fattore critico per la regolazione della crescita, differenziazione, migrazione e proliferazione delle cellule germinali, di quelle del sistema ematopoietico e dei melanociti. c-KIT è anche coinvolto nell’attivazione di numerosi meccanismi intracellulari implicati nella progressione tumorale e, allo stesso tempo, è uno dei proto-oncogeni più studiati ed il bersaglio di farmaci appartenenti alla famiglia degli inibitori tirosin-chinasici (TKIs). Attualmente, i TKIs sono approvati come trattamento alternativo alla chemioterapia tradizionale in tumori c-KIT dipendenti in uomo e cane tuttavia, fenomeni di resistenza a questi farmaci si verificano frequentemente. Negli ultimi anni, la scoperta di strutture secondarie del DNA chiamate G-quadruplex (G4) ha evidenziato un nuovo ruolo degli acidi nucleici nella biologia tumorale. Tali conformazioni si formano in specifiche sequenze del DNA ricche in residui di guanina, localizzate principalmente nei telomeri e nelle regioni promotoriali di alcuni oncogeni come c-KIT. Nella prima parte di questa tesi di dottorato, tre composti scelti sulla base della loro capacità di legare e stabilizzare le conformazioni G4 sono stati testati in linee cellulari stabilizzate di uomo e cane al fine di determinare la loro efficacia come potenziali agenti terapeutici. In questo senso, alcuni risultati interessanti in termini di blocco della proliferazione nonché della trascrizione e traduzione di c-KIT si sono ottenuti con un derivato della famiglia degli antrachinoni chiamato AQ1. In un altro studio proposto, il profilo mutazionale di c-KIT è stato analizzato in una coorte di campioni di mastocitoma del cane composti da tumore primitivo e relativa metastasi linfonodale. Nel cane infatti, la percentuale tra il 10 ed il 30% dei mastocitomi presenta almeno una mutazione di c-KIT nel tumore primitivo, tuttavia, poche conoscenze si hanno relativamente al profilo mutazionale nelle metastasi. Dai risultati ottenuti, tutti i cani analizzati hanno dimostrato avere una perfetta concordanza tra tumore primitivo e metastasi in termini di status mutazionale di c-KIT con rilevanti implicazioni cliniche per la scelta della miglior terapia da attuare da parte degli oncologi veterinari. Infine, nel corso del secondo anno di dottorato, è nata una collaborazione con il Dr. Patrice Dubreuil del Centre de Recherche en Cancérologie de Marseille, a Marsiglia. Nei suoi recenti articoli sulla mastocitosi dell’uomo, egli ha scoperto un set di geni che presentano mutazioni in talune percentuali di casi e cooperano con c-KIT nello sviluppo delle forme più gravi ed aggressive della malattia. Nell’ultima pubblicazione illustrata in questa dissertazione, è stato eseguito lo screening del profilo mutazionale di questi nuovi geni in campioni di mastocitoma di cane al fine di trovare analogie molecolari che possano giustificare l’uso del cane come animale modello nell’oncologia comparata.

Estudi de l'avaluació de la possible contaminació de tipus genotòxic en l'abocador de Garraf (Barcelona), el qual recull els residus urbans de Barcelona i de les seves rodalies. Es va dur a terme el "Comet Test" (o SCGE: "Single Cell Gel Electrophoresis Assay") i el Test dels Micronuclis (MNT) en mostres de sang d'Apodemus sylvaticus (capturats a diferents àrees de l'abocador, i en una zona control lluny de la influència d'aquest i que pertany al Parc Natural del Garraf). Al mateix temps, es va aplicar la tècnica del Comet test en mostres de celomòcits d'exemplars d'Allolobophora caliginosa exposats a mostres de sòls procedents de l'abocador (5 zones situades a diferents distàncies d'aquest), i a mostres control. Per a les dues espècies utilitzades i els dos assaigs realitzats (SCGE i MNT en Apodemus, i SCGE en Allolobophora) es van obtenir valors majors de dany al DNA en les mostres de les zones d'influència de l'abocador respecte a les mostres control. No es va poder establir, pel cas dels lumbrícids, una relació del nivell de dany en relació a la distància a l'abocador (s'esperava una disminució dels valors, un apropament als valors control, quan les mostres fossin recollides més lluny de l'abocador). Mentre que en el cas dels ratolins, els valors corresponents a la zona més allunyada eren significativament menors que els obtinguts al voltant de la bassa de lixiviats. Les dues espècies, autòctones i abundants, poden servir com a bons sentinelles per a l'avaluació de la contaminació en l'abocador (tot i que en el cas dels lumbrícids utilitzats la interpretació pot ser més complicada).

Un altre estudi es va centrar en l'avaluació de la contaminació de tipus genotòxic en mostres de sòl de Doñana, recollides l'any 2000 en diferents zones afectades pel vessament tòxic de l'accident de les mines d'Aznalcóllar de l'abril del 1998. Es van exposar varis exemplars d'Allolobophora caliginosa a les diverses mostres de sòl, i es va dur a terme el SCGE en celomòcits. Al mateix temps es van comparar els resultats obtinguts pel SCGE amb la concentració de metalls pesants mesurada en les mostres de sòl. Les mostres contaminades pel vessament tòxic i les mostres de referència de la mateixa zona (suposadament no afectades pel vessament) indiquen valors superiors amb el "Comet test" als de les mostres control.
Una part molt important del treball realitzat es va basar en aspectes tècnics de l'assaig del cometa ("Comet test"), per poder conèixer una mica més el seu funcionament a nivell fisiològic i molecular. Així es van realitzar diversos estudis "in vitro" i "in vivo" per veure la possible interferència de la divisió cel·lular en els resultats del SCGE. Altres proves han estat dirigides a veure la relació que pot existir entre els resultats del SCGE i els estats d'apoptosi i necrosi de les cèl·lules, els quals podrien causar una interferència (de tipus citotòxic) en els resultats de l'assaig.

Un altre estudi està centrat en el seguiment de la cinètica de reparació. A determinades dosis d'una substància genotòxica (òxid d'estirè) a les que es podia observar un nivell de dany al DNA (mesurat amb el "Comet test"), al cap d'un determinat temps es podia veure una disminució d'aquest dany, atribuïble a la reparació, tant en experiments "in vivo" com "in vitro". La incubació de les mostres amb l'enzim de reparació Endonucleasa III permetia augmentar la sensibilitat del test, detectant lesions de tipus oxidatiu, i d'altres, a més de les normalment detectades amb el "Comet test" sense l'ús d'aquests enzims. En aquests experiments es va poder detectar la dosi/dependència de l'efecte genotòxic de l'òxid d'estirè.