Academic literature on the topic 'Espressione genica in pianta'

L’autore compie una rassegna anzitutto delle metodiche che vengono ricomprese sotto le denominazioni di genomica funzionale e proteomica, ne illustra l’applicazione per la migliore conoscenza delle malattie poligenichemultifattoriali e pertanto complesse a larga diffusione (più dell’1% della popolazione adulta) e causa di elevata morbillità e mortalità. Le possibilità offerte dei DNA-microarrays nell’analisi dei polimorfismi dei nucleotidi, correlate alle potenzialità offerte dai supporti bioinformatici, caratterizzano la genetica che ha fatto seguito al sequenziamento del DNA, consentendo l’analisi dei “profili di espressione genica”.Lo sviluppo delle moderne tecniche di indagine sulle proteine permette, a sua volta, di riconoscere le proteine che sono correlate a stati morbosi attraverso loro livelli di espressione alterati se confrontati con quelli provenienti da soggetti sani. Queste linee di ricerca, appena al loro inizio, offrono certamente positivi giudizi se valutate sotto il profilo della conoscenza scientifica, ma non sono prive di rischi e riserve sotto il profilo etico. L’autore ne esamina i vari aspetti che riguardano sia la singola persona che la comunità: se - in casi ben circoscritti - possono stimolare comportamenti favorevoli alla prevenzione di malattie ad insorgenza tardiva, sono da paventarsi - sul piano culturale - forme di riduzionismo di natura sociobiologica, pericoli di discriminazione e soprattutto - in epoca prenatale - espressioni ancora più estese di quell’eugenismo che caratterizza negativamente la società contemporanea.

La fibrosi cistica (FC) è una malattia autosomica recessiva causata da mutazioni nel gene CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator). Finora sono state descritte circa 2000 mutazioni, ma per la maggior parte di esse è difficile definirne l’effetto senza complesse procedure in vitro. Abbiamo effettuato il campionamento (mediante brushing), la cultura e l’analisi di cellule epiteliali nasali umane (HNEC) utilizzando una serie di tecniche che possono aiutare a testare l’effetto delle mutazioni CFTR. Abbiamo eseguito 50 brushing da pazienti FC e controlli, e in 45 casi si è ottenuta una coltura positiva. Utilizzando cellule in coltura: i) abbiamo dimostrato l’espressione ampiamente eterogenea del CFTR nei pazienti e nei controlli; ii) abbiamo definito l’effetto di splicing di una mutazione sul gene CFTR; iii) abbiamo valutato l’attività di gating di CFTR in pazienti portatori di differenti mutazioni; iv) abbiamo dimostrato che il butirrato migliora in modo significativo l’espressione di CFTR. I dati provenienti dal nostro studio sperimentale dimostrano che l’uso del modello ex-vivo di cellule epiteliali nasali è un importante e valido strumento di ricerca e di diagnosi nella studio della FC e può anche essere mirato alla sperimentazione ed alla verifica di nuovi farmaci. In definitiva, in base ai nostri dati è possibile esprimere le seguenti conclusioni: 1) il prelievo delle cellule epiteliali nasali mediante brushing è applicabile senza alcuna anestesia ed è ben tollerato da tutti i pazienti affetti da FC (bambini e adulti), è scarsamente invasivo e facilmente ripetibile, è anche in grado di ottenere una sufficiente quantità di HNECs rappresentative, ben conservate, idonee allo studio della funzionalità di CFTR; 2) la conservazione delle cellule prelevate è possibile fino a 48 ore prima che si provveda all’allestimento della coltura e ciò permette di avviare studi multicentrici con prelievi in ogni sede e quindi di ottenere una ampia numerosità campionaria; 3) la coltura di cellule epiteliali nasali può essere considerata un modello adatto a studiare l’effetto molecolare di nuove mutazioni del gene CFTR e/o mutazioni specifiche di pazienti “carriers” dal significato incerto; 4) il modello ex-vivo delle HNECs consente inoltre di valutare, prima dell’impiego nell’uomo, l’effetto di farmaci (potenziatori e/o correttori) sulle cellule di pazienti portatori di mutazioni specifiche di CFTR; tali farmaci possono modulare l’espressione genica del canale CFTR aprendo così nuove frontiere terapeutiche e migliori prospettive di vita per pazienti affetti da una patologia cronica come la Fibrosi Cistica; 5) la metodologia da noi istituita risulta essere idonea alla misura quantitativa, mediante fluorescenza, dell’attività di gating del canale CFTR presente nelle membrane delle cellule epiteliali nasali prelevate da pazienti portatori di differenti genotipi; in tal modo è possibile individuare: a) pazienti FC portatori di 2 mutazioni gravi con un’attività < 10% (in rapporto ai controlli -100%), b) soggetti FC portatori contemporaneamente di una mutazione grave e di una lieve con un’attività tra 10-30%, c) i cosiddetti portatori “carriers”- eterozigoti - con un’attività tra 40-70%. In conclusione la possibilità di misurare l’attività del canale CFTR in HNECs fornisce un importante contributo alla diagnosi di FC, mediante individuazione di un “cut-off diagnostico”, ed anche alla previsione della gravità fenotipica della malattia; quindi quanto rilevabile dalla misura del suddetto canale permette di prospettare per il futuro la possibilità di valutare meglio i pazienti per i quali il test del sudore ha dato risultati ambigui (borderline o negativi). La metodica da noi sperimentata consente anche di monitorare i pazienti durante il trattamento farmacologico, valutando in tal modo i reali effetti delle nuove terapie.

Il trattamento poli-farmacologico ha determinato, nel corso degli anni, un significativo rallentamento della progressione della malattia renale cronica verso lo stadio di uremia terminale, ma siamo ancora distanti dallo sviluppo di interventi terapeutici in grado di bloccare questo inesorabile e irreversibile processo. Studi clinico-patologici hanno chiaramente dimostrato che il principale elemento coinvolto nel danno renale è la fibrosi tubulo-interstiziale e che il meccanismo patogenetico alla base di questa condizione ha inizio in larga parte nel compartimento tubulare. In particolare, il processo di transizione epitelio-mesenchimale gioca un ruolo importante nella genesi del danno cronico. Durante questo processo, le cellule epiteliali tubulari subiscono un incremento significativo di markers di superficie di natura mesenchimale e, grazie al rimodellamento del citoscheletro e alla degradazione della membrana basale, sono in grado di migrare nell'interstizio dove svolgono un ruolo chiave nel processo patogenetico. In questo contesto, sembra avere un ruolo chiave l'enzima eparanasi, una endo-β-D-glucuronidasi che taglia le catene dell'eparan-solfato a livello di siti specifici intracatena, e partecipa attivamente alla degradazione e al rimodellamento della matrice extracellulare. La degradazione dei vari costituenti dell'ECM, inclusi i proteoglicani eparan-solfato fa-vorisce il rilascio di fattori trofici quali il FGF-2 che induce l'espressione dei marcatori mesenchimali alfa-SMA, VIM e FN, porta alla degradazione della membrana basale mediante la secrezione di metalloproteinasi della matrice ed aumenta la motilità cellulare. L'epressione dell'eparanasi è regolata da fattori di trascrizione, dalla metilazione del DNA e da varie molecole endogene. L'importanza di questo enzima è stata confermata clinicamente dal riscontro di una sua iperespressione in preparati istologici di biopsie effettuate in soggetti affetti da nefropatie croniche (per esempio, nefropatia diabetica). Pertanto visto l'importante ruolo dell'eparanasi sono in fase di standardizzazione numerose strategie per inibire la sua espressione genica e/o la sua attività enzimatica. Infine, è stato proposto il suo possibile utilizzo come biomarker di progressione del danno tubulo-interstiziale da utilizzare routinariamente in ambito nefrologico.

La retinite pigmentosa (RP) è una malattia genetica caratterizzata da una perdita progressiva della vista dovuta alla degenerazione dei fotorecettori. Più di 100 geni diversi sono stati correlati alla RP e l'elevata eterogeneità genetica ostacola lo sviluppo di trattamenti per la cura di questa malattia invalidante. Per lo sviluppo di nuovi approcci terapeutici è necessaria un'elucidazione più profonda a livello molecolare dei meccanismi alla base della progressione della malattia. Questo studio si è concentrato sui cambiamenti trascrizionali che avvengono durante la degenerazione dei bastoncelli al fine di comprendere i meccanismi della malattia e trovare possibili bersagli terapeutici. Per investigare la degenerazione dei bastoncelli, abbiamo sviluppato un nuovo modello in vitro basato sulla linea cellulare 661W che simula la mutazione di perdita di funzione del gene PDE6 nei pazienti RP e nei modelli animali correlati. Questo modello si basa sul trattamento della linea cellulare con zaprinast, un inibitore della PDE6. Abbiamo poi confrontato le cellule esposte a zaprinast rispetto a quelle non trattate tramite analisi RNAseq e sono stati identificati con successo i geni differenzialmente espressi in risposta all'inibizione della PDE6. Tra questi sono emersi, in particolare, geni legati alla pathway del colesterolo. Diversi cambiamenti genici legati alla biosintesi e al metabolismo del colesterolo sono stati convalidati nel sistema cellulare da analisi qPCR. È stata confermata la rilevanza dei geni identificati nella degenerazione retinica tramite analisi in rilevanti modelli animali di RP. In conclusione, la degenerazione dei fotorecettori inizia nei bastoncelli, i quali sono neuroni post-mitotici. Il nuovo sistema in vitro che abbiamo sviluppato per mimare la degenerazione è uno strumento fondamentale per le analisi future e consenteirà studi molecolari sui meccanismi di morte cellulare degli stessi. Grazie a questo nuovo sistema, abbiamo analizzato i cambiamenti di espressione genica durante la degenerazione ed abbiamo scoperto che le vie della biosintesi del colesterolo e del metabolismo potrebbero avere un ruolo cruciale nella perdita dei bastoncelli. La conferma delle variazioni geniche sui modelli animali mostra che le mutazioni che causano la RP possono innescare uno squilibrio nelle vie del colesterolo suggerendo che possano essere un nuovo bersaglio per lo sviluppo di nuovi approcci terapeutici.
Retinitis Pigmentosa (RP) is a genetic disorder characterized by progressive vision loss due to the degeneration of photoreceptors. More than 100 different genes have been linked to RP, and the high genetic heterogeneity hampers the development of treatments to the cure of this disabling disease. A more profound elucidation at the molecular level of the mechanisms underlying the progression of the disease is needed for the development of new therapeutic approaches. This study focused on transcriptional changes during rod photoreceptor degeneration to understand disease mechanisms and find possible therapeutic targets. To gain insights into rod photoreceptor degeneration, we developed a new in vitro model based on the 661W cell line that mimics the PDE6 gene loss of function mutation in RP patients and related animal models. The cell model relies on the treatment of the cell line with zaprinast, a PDE6 inhibitor, and we compared by RNAseq analysis cell exposed to zaprinast versus not treated cells. We successfully identified differentially expressed genes in response to PDE6 inhibition, especially related to cholesterol biosynthesis and metabolism. Several gene changes linked to cholesterol biosynthesis and metabolism have been validated by Real-time qPCR in the cell system. Confirmation of the relevance of the identified genes in retinal degeneration was performed in relevant animal models of RP. In conclusion, the primary degeneration starts in the rod photoreceptors that are post-mitotic neurons. We developed a new in vitro system to mimic rod photoreceptor degeneration, a fundamental tool for future studies enabling molecular studies on cell death mechanisms. Thanks to the new cell system, we analyzed gene expression changes during degeneration. We found that cholesterol biosynthesis and metabolism pathways might have a crucial role in rod photoreceptor loss. Validation of the genes on the animal models shows that the mutations causing RP can trigger an imbalance in cholesterol pathways. We suggest that the cholesterol pathways can be a new target for the development of new therapeutic approaches.

Normal kidney and urinary tract development is a complex process, regulated by a strict space-time-corrected sequential activation of a cascade of genes encoding transcription factors, growth factors, cell death/proliferation factors and adhesion molecules. An alteration disrupting this sequential gene expression may cause a defective ureteric bud-to-metanephric mesenchyme cross-talk that results in a renal and urinary tract developmental abnormality (congenital anomalies of kidney and urinary tract - CAKUT). Phenotype severity depends on the stage of nephrogenesis in which the alteration of the developmental program occurs, thus renal dysplasia is the most severe manifestation. However, little is known about CAKUT pathogenesis. The recent advent of microarray technology provided an unique tool to identify genes potentially involved in the pathogenesis of several diseases. During the first stage of this research, we applied the microarray technique to study gene expression profiles of primary renal cell cultures, using an array composed by 21329 oligonucleotides. The aim was to identify potential biomarkers of renal dysplasia. Four genes seemed to be more interesting (UPK1B, SOX11, SPRY1, MMP2). We analysed the expression of these four genes using Real Time PCR on RNA extracted from renal tissue samples of 10 patients with a histological picture of renal dysplasia and 10 with histologically normal renal tissue. Mutation analysis of SPRY1 gene, whose murine homologue is hugely involved in the regulation of GDNF growth factor's expression during ureteric branching, was carried out on 27 patients with renal duplicity. Mutation analysis identified 2 new genomic variants - whose frequency was analysed in a control population - that may be "genomic variants involved in splicing" (SpaGVs). Our research results allow to hypothesize that SPRY1 gene may be involved in the pathogenesis of kidney and urinary tract developmental diseases.

Il primo capitolo di questo lavoro di tesi introduce i concetti di biologia necessari per comprendere il fenomeno dell’espressione genica. Il secondo capitolo descrive i metodi e le tecniche di laboratorio utilizzate per ottenere il cDNA, il materiale genetico che verrà amplificato nella real-time PCR. Nel terzo capitolo si descrive la tecnica di real-time PCR, partendo da una descrizione della PCR convenzionale fino a delineare le caratteristiche della sua evoluzione in real-time PCR. Si prosegue con la spiegazione del principio fisico alla base della tecnica e delle molecole necessarie (fluorofori e sonde) per realizzarla; infine si descrive l’hardware e il software dello strumento. Il quarto capitolo presenta le tecniche di analisi del segnale che utilizzano metodi di quantificazione assoluta o relativa. Infine nel quinto capitolo è presentato un caso di studio, cioè un’analisi di espressione genica con real-time PCR condotta durante l’esperienza di tirocinio presso il laboratorio ICM. e delle molecole necessarie (fluorofori e sonde) per realizzarla; infine si descrive l’hardware e il software dello strumento. Il quarto capitolo presenta le tecniche di analisi del segnale che utilizzano metodi di quantificazione assoluta o relativa. Infine nel quinto capitolo è presentato un caso di studio, cioè un’analisi di espressione genica con real-time PCR condotta durante l’esperienza di tirocinio presso il laboratorio ICM.

Questo progetto ha confrontato gli effetti indotti da diversi tipi di radiazioni, diversa intensità delle dosi, diverso rateo di dose su sistemi cellulari differenti. In particolare sono stati seguiti due studi differenti, finalizzati all’indagine degli effetti e dei meccanismi indotti da trattamenti radioterapici su cellule in coltura. Nel primo studio -EXCALIBUR- sono stati investigati i meccanismi di induzione e trasmissione del danno a basse dosi di radiazioni, in funzione della qualità della radiazione (raggi gamma e protoni) e della dose. Cellule di glioblastoma umano (T98G) sono state irraggiate con raggi gamma e protoni a due diverse dosi (0,25 Gy e 2 Gy); in questo studio è stata valutata e analizzata la variazione di espressione genica rilevata utilizzando la tecnologia dei microarray. Per mezzo dell’analisi statistica, con due software diversi, si è osservato come nelle cellule irraggiate si attivino i geni legati alla senescenza cellulare; questo risultato è significativo, visto che potrebbe rappresentare una prospettiva terapeutica interessante per molte neoplasie. Il secondo studio –Plasma Focus- ha lo scopo di ampliare le applicazioni nel settore medicale di una sorgente radiante che produce raggi X ad altissimo rateo di dose (plasma focus). In questo studio, l’attenzione è stata posta sulla preparazione dei campioni biologici per l’irraggiamento. Cellule di adenocarcinoma mammario (MCF7) sono state coltivate in laboratorio e posizionate all’interno di appositi portacampioni pronte per essere irraggiate con raggi X ad alto e a basso rateo di dose. Per mezzo della microscopia ottica e della citometria a flusso in fluorescenza, si è osservato come un rateo di dose elevato provochi danni cellulari superiori. L’analisi quantitativa ha mostrato che, nelle cellule trattate con il plasma focus, il 18% risulti danneggiato rispetto al 7% delle cellule di controllo; con i raggi X convenzionali risulta danneggiato l'8% di cellule, rispetto al 3% delle cellule di controllo.

2008 - 2009
Serum profile, in physiological or pathological conditions, results from the whole effect of both nutritional intake and endogenous metabolism and is commonly used as diagnostic tool. Moreover individual serum components and their concentration are often related to specificity, development and progression of many metabolic diseases. Dietary fat intake strictly affects serum lipid profile and cardiovascular disease epidemiology. Fatty acids derived from diet, both saturated and polyunsaturated fatty acids, have specific and controversial effects. The underlying molecular mechanisms are numerous but partially understood, and they are related to homeostatic metabolic pathways as well gene expression effects. Consequently the aim of this project was to assess the ability of serum samples differing in content of nutritionally related lipid components to specifically affect gene expression of human hepatoma cells (HepG2). We collected 40 human sera, differing in metabolic and nutritionally relevant fatty acids, and tested their effect on hepatoma cells comparing samples from hyperlipidemic (cholesterol average 273 mg/dl) vs normolipidemic male subjects (cholesterol average 155 mg/dl). Analyzed genes were selected among those previously found modulated by lipid nutrients. Determination of fatty acids in sera showed that arachidonic acid (AA) was 88% more abundant in hypercholesterolemic subjects (p<0.01), while docosahexaneoic acid (DHA) and eicosopentanoic acid (EPA), as quota of total detected fatty acids, were significantly higher in normocholesterolemic subjects by 25% (p<0.05) and by 80% (p<0.01) respectively. Normocholesterolemic subjects had an higher n-3/n-6 fatty acids ratio (p<0.05). Hypercholesterolemic sera decreased sterol regulatory element binding protein-1c (SREBP-1c) mRNA by 40% (p<0.05). In hypercholesterolemic group ,UDP-glucuronosyltransferase-1A1 (UGT1A1) mRNA expression was significantly increased by 84% (p<0.01). Samples with higher concentrations of DHA, EPA and AA produced a higher expression of UGT1A1 mRNA. The amount of fatty acids, as c18:2, c18:3, DHA, EPA, AA, is more high in hypercholesterolemic subjects (p<0.01) and has an opposite trend compared to SREBP-1c mRNA expression (p<0.05). Our data clearly indicate that serum lipid profile is functionally linked with gene expression involved in metabolic and nutritional related conditions.[edited by author]
VIII n.s.

Swine physiology and anatomy share many features with those of human. Stable pig stem cell lines are not available and somatic cell nuclear transfer (SCNT) is the best way to obtain transgenic litter using genetically modified somatic cells. The knock-out of α1,3-galactosyltransferase gene (GAL-/-) overcame the hyperacute rejection in swine-non human primates xenografts but to prolong the lifespan of transplanted organs, the acute vascular rejection has to be prevented inserting human genes to inhibit complement (CD55), coagulation and inflammation (CD39, EPCR and TM) cascades. The aim of our study was to obtain tetra-transgenic GAL KO cloned pigs to use in solid organ xenotranplantation programs. The activity of pCAGGS promoter and utility of 5´MAR of chicken lysozyme were successfully tested creating live cloned green fluorescent pigs. After that different expression vectors were obtained for selected human genes and a reliable screening platform was set up using PK15 transgenic colonies. GAL-/- fibroblasts were separately cotransfected with CD55Hygro+CD39 and EPCRPuro+TM expression vectors and resistant clones were efficiently selected using Western blot (WB) and Immunocitochemistry (ICC). Two live piglets (DAFne and Aretusa) were obtained using one GAL-/-/CD55+ colony and CD55 expression was widely characterized by WB, ICC, Immunohystochemistry and FACS in all analysed tissues and organs. One GAL-/-/CD55+CD39+ stillborn piglet (090210) was achieved but expression of CD55 and CD39 was maintained only in muscles. Instead, no pregnancies were obtained using EPCR+TM+ colonies. These results suggested us that strong expression of: CD55 is compatible with life of cloned piglets and it has cytoprotective effects on endothelial cells; CD39 has lethal anticoagulant effects; EPCR and TM are lethal for cloned embryos aborted after 45 days of pregnancy. Tissue-specific or inducible promoters will be used in order to obtain better cloning efficiency.

Le varianti istoniche svolgono un ruolo fondamentale nel complesso scenario dell’epigenetica e del rimodellamento della cromatina; l’evidenza della loro incorporazione replicazione-indipendente all’interno della cromatina e di un turnover rapido hanno recentemente portato a ipotizzare un loro coinvolgimento nella fisiopatologia e plasticità del sistema nervoso centrale (SNC), ma rimane ancora da chiarire quale parte svolgano in questi processi. La variante istonica H3.3, altamente espressa nel cervello, è codificata da due diversi geni chiamati H3f3a e H3f3b. Sebbene le proteine che ne derivano, rispettivamente H3.3A e H3.3B, siano identiche, inattivando H3f3b si genera un fenotipo più grave rispetto a H3f3a, il che suggerisce la mancanza di una completa sovrapposizione funzionale. Questi diversi fenotipi potrebbero derivare da una diversa espressione cellulo-specifica e distribuzione regionale nel SNC delle due isoforme. Al fine di comprendere il ruolo funzionale dell’espressione della variante H3.3 nel SNC è necessario dunque chiarire la localizzazione e l'espressione cellulare delle due isoforme. Questo consentirà di definire se il turnover di H3.3A e H3.3B, singolarmente o insieme, è alla base di processi neuroplastici e alterazioni funzionali in specifici circuiti neuronali. In questo progetto di tesi sono stati usati topi H3.3A (WT/HA-fH3.3A) e H3.3B (WT/HA-fH3.3B) che esprimono un tag di emoagglutinina (HA) per eseguire un'analisi dettagliata della distribuzione delle isoforme di H3.3, nelle regioni di sostanza bianca e grigia del SNC, tramite immunoistochimica (IHC) semi-quantitativa. È stata inoltre valutata l’espressione cellulo-specifica di queste proteine mediante l’utilizzo di anticorpi diretti contro microglia, astrociti, oligodendrociti e neuroni grazie a tecniche di doppia immunofluorescenza e microscopia confocale ad alta risoluzione. H3.3A e H3.3B hanno una differente distribuzione nel SNC, per entrambe molto diffusa ma eterogenea, e, per quanto riguarda la loro espressione cellulare, sono per la maggior parte, ma non esclusivamente, espresse dai neuroni. Tecniche innovative quali la chiarificazione dei tessuti e la microscopia a foglio di luce hanno permesso di ottenere una visione d’insieme della localizzazione delle isoforme di H3.3 nell’intero cervello. Abbiamo infine studiato i possibili cambiamenti nell’espressione di H3.3 in diverse condizioni fisiologiche, quali l’invecchiamento e l’esposizione ad ambiente arricchito, una procedura che mima gli effetti neurotrofici e neuroprotettivi di un livello elevato di istruzione negli uomini. In quest’ultimo modello, è stato osservato un incremento nell’espressione di H3.3B in specifiche aree cerebrali e specifici tipi cellulari. I nostri risultati descrivono per la prima volta la precisa distribuzione regionale ed espressione cellulare delle due isoforme di H3.3 nel SNC di topo così come i loro cambiamenti in varie condizioni fisiologiche. Questo studio apre la strada alla generazione di topi knock-out condizionali per specifiche popolazioni cellulari al fine di comprendere il contributo delle isoforme di H3.3 in specifici circuiti cerebrali.
Histone variants play a fundamental role in the complex scenery of epigenetic dynamics and chromatin remodelling; their replication-independent incorporation into chromatin and rapid turnover have recently suggested their involvement in central nervous system (CNS) pathophysiology and plasticity, though their precise role is still to be elucidated. The H3.3 histone variant, highly expressed in the brain, is encoded by two different intron-containing genes namely H3f3a and H3f3b. Although the coded proteins, H3.3A and H3.3B respectively, are identical, knocking out H3f3b generates a more severe phenotype compared to H3f3a, suggesting the lack of a complete functional overlap. This different impact may derive from a differential cell-type expression and regional distribution in the CNS. In order to investigate the functional role of H3.3 variant expression in the CNS it is therefore necessary to clarify the localization and cellular expression of the two isoforms. This will permit to define whether H3.3A and H3.3B turnover, alone or together, participates to molecular mechanisms that lead to neuroplasticity in specific neuronal circuits and associated functions. In this project, hemagglutinin (HA)-tagged H3.3A (WT/HA-fH3.3A) and HA-tagged H3.3B (WT/HA-fH3.3B) mice were used to perform a detailed analysis of H3.3 isoform distribution in CNS white and grey matter regions, by using semi-quantitative immunohistochemistry (IHC). Moreover, cell-specific expression of these proteins was assessed by using specific antibodies against microglia, astrocytes, oligodendrocytes and neurons through double immunofluorescent (IF) stainings and high-resolution confocal microscopy. H3.3A and H3.3B have a widespread though different region-specific distribution and, as concerns their cellular expression, they are mostly, though not exclusively, expressed by neurons. Innovative techniques such as tissue clearing and lightsheet microscopy allowed us to obtain an overall view of H3.3 isoform distribution in the whole brain. Finally, we investigated the possible changes in H3.3 expression in various physiological conditions, including ageing and exposure to an enriched environment, a procedure that models the neurotrophic and neuroprotective impact of high educational attainment in humans. In this latter model, an increased expression of H3.3B variant in specific brain areas and cell types was observed. Our results demonstrate for the first time a different regional distribution and cellular expression of the two H3.3 isoforms in the mouse CNS as well as their changes in various physiological conditions. This opens up a path to the generation of cell-population specific conditional knock-out mice to elucidate H3.3 isoform contribution to the function of precise cerebral circuits.

L’obiettivo della mia tesi è stato quello di valutare gli effetti delle alte pressioni di omogeneizzazione sulla vitalità, idrofobicità, modulazione degli acidi grassi di membrana e la risposta genica, legata soprattutto alla biosintesi di acidi grassi, di Lactobacillus paracasei A13 quando sottoposto a trattamenti ad alta pressione di omogeneizzazione compresi tra 50 e 200 MPa. I dati di carico cellulare, registrati anche dopo trattamento a 200 MPa, hanno dimostrato che Lb. paracasei A13 è fortemente baro tollerante. Inoltre, il trattamento iperbarico induce un incremento di idrofobicità del ceppo, soprattutto quando trattato a 150 MPa, influenzando potenzialmente in modo positivo l’interazione tra il microrganismo oggetto di studio e l’intestino dell’ospite. I dati riguardanti gli acidi grassi hanno dimostrato che la membrana cellulare, ritenuta uno dei bersagli più suscettibili alla pressione, è in grado di rispondere agli stress sub letali provocati dal trattamento iperbarico. In particolare, all’aumentare della pressione, aumenta il grado d’insaturazione della membrana, accompagnato anche da un incremento degli acidi grassi ciclici, da una riduzione della catena carboniosa degli acidi grassi C12, 13, 14 e da una diminuzione degli idrossiacidi, giustificata con la ben nota capacità di molti batteri lattici di trasformarli, in condizioni di stress, in molecole quorum sensing quali ad esempio i furanoni. I dati relativi allo studio di specifici geni, indicano chiaramente una iperespressione dei geni fabH e fabD, responsabili delle prime fasi di biosintesi degli acidi grassi. Pertanto, la loro significativa iperespressione a 150 e 200 MPa rende ragione del significativo incremento di acidi grassi a corta catena registrato in tali condizioni. Anche il significativo aumento degli acidi grassi insaturi può essere spiegato attraverso l’incremento di espressione di fabF e fabZ responsabili dell’introduzione di doppi legami nella catena carboniosa.