Academic literature on the topic 'Enzymatic immobilisation'

Enzymatic hydrolysis of starches using free glucoamylase to reducing sugars have difficulties in recovering and recycling of the enzyme, hence immobilisation on inert supports were widely studied. However, effectiveness of the immobilised glucoamylase were merely observed only on soluble starches. It was considered a valuable thing to know performance of glucoamylase on Mesostructured Cellular Foam (MCF) silica in hydrolysing of tapioca. An optimised study on enzymatic hydrolysis of tapioca using glucoamylase on MCF silica (9.2T-3D) and its kinetics were described including justification of the predicted model as it was required to develop in large scale operations. Central Composite Design was used to model the process by studying effects of three factors on DE values after enzyme immobilisation. Immobilisation of glucoamylase on this support gave up to 82% efficiency with the specific activity of 1,856.78 U.g-1. Its used to hydrolysis of tapioca resulted DE values of 1.740-76.303% (w/w) where the highest DE was obtained at pH of 4.1, temperature of 70 ℃ and agitation speed of 140 rpm. The optimisation produced a polynomial quadratic model having insignificant lack-of-fit and low standard deviation, so that it was applicable and reliable in simulating the DE with only 0.80% of data were not described. Temperature affected the process highly, but the buffer pH, agitation speed and factorial interactions were considered not important. KM value for immobilised enzyme was better than the free glucoamylase, however, its reaction rate was slower than the free glucoamylase catalysis. Copyright © 2019 BCREC Group. All rights reserved

β-Galactosidase is an important industrial enzyme in the hydrolysis of milk and whey lactose. The enzymatic hydrolysis of lactose allows to avoid health and environmental problems posed by this disaccharide. In addition, this enzyme catalyses the formation of galacto-oligosaccharides, which are prebiotic additives for the so-called “healthy foods”. β-Galactosidase is one of the relatively few enzymes that have been used in large-scale processes in both free and immobilised forms. This article presents a review of recent trends in immobilisation of β-galactosidase and their application in food industry.

The work reported in this Ph.D. thesis is focused on the use and immobilisation of enzymes to produce new materials, which are important for biotechnological applications. The use of enzymes in industrial sectors is continuously increasing. Enzymes offer many advantages over traditional chemical processes. The research work of this thesis can be divided into two parts. The first part is focused on the immobilisation of laccase and chitinase. The main object of enzymatic immobilisation is to enhance the economics of biocatalytic processes. Enzymatic immobilisation allows the reuse of enzymes for an extended period of time and enables easier separation of the catalyst from the product. Furthermore, immobilisation improves many properties of enzymes: performance in the organic solvents, pH tolerance and heat stability. The most widely used immobilisation method is the covalent binding of the enzyme to support. Different type of support can be chosen for enzymatic immobilisation. As the material can plays a crucial role in the immobilisation process and the properties of the produced catalytic system. In this thesis we have chosen two different supports: super paramagnetic nanoparticles for both the enzymes used and the chitosan beads as an alternative support for chitinase. Magnetic nanoparticles show interesting properties for enzymatic immobilisation, they can be obtained with small size, increasing the yield of enzymatic immobilisation and above all, the reaction products can be easily recovered applying an external magnetic field. Magnetic nanoparticles were prepared following the traditional method of co-precipitation of Fe2+ and Fe3+ ions. This immobilisation process was successfully used for chitinase, obtaining a high immobilisation yield and increasing enzymatic stability. Different was for laccase, which having a different catalytic mechanism a revision of the synthesis has been attempt. The use of the magnetic nanoparticles obtained with the traditional method hampered the detection of stable radical species formed during the catalytic mechanism as it happens for the oxidation product of 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonic acid) (ABTS), the standard compound used to test the enzyme activity. Changing some synthetic parameters, the new magnetic nanoparticles were produced and characterized. In fact nanoparticles with a lower aggregation state and a smaller hydrodynamic diameter were obtained and tested without any interference with the ABTS substrate. Chitinase was also immobilised on chitosan beads/Macro-Spheres (CMS), as this support is completely atoxic and so most suitable for application in food industries.The presence of active amino groups in deacetylated GlcNAc units of chitosan also enables the binding of the linker (glutaraldehyde and genipin) and then of the enzyme. The goal of this part of the thesis was to attempt the immobilisation of Chitinase on different supports, MNPs and CMS, for the efficient production of COS. The second part of this thesis is focused on the use of enzymes to produce melanin pigments. Melanins have a variety of biological functions, including protection against UV radiation, free radical scavengers and metal ions chelators. Thanks to their properties, melanins found applications in several fields such as cosmetics, optoelectronics, food, and pharmacology. Eumelanin and Pheomelanin have been produced by oxidative enzymatic synthesis using laccase from Trametes versicolor and then characterized by the use of Multifrequency Continuos Wave (CW) and pulse Q-band EPR. Then, as soluble melanin pigments have important technological applications in different fields, like in optoelectonics, soluble pigments mimicking pyomelanin structure have been synthesized starting from Homogentisic Acid and Gentisic Acid monomers and spectroscopically characterized with their antioxidant activities determination.

Les enzymes sont des biocatalyseurs de plus en plus utilisés pour la transformation de molécules organiques (chimie fine, bioconversions, dépollution, chimie du pétrole) car elles possèdent de très bonnes sélectivité et réactivité, générant rapidement de larges quantités de produit. Cependant, la fragilité des enzymes, notamment en solution, limite souvent leur utilisation. Il est donc crucial de les immobiliser et de les stabiliser dans des supports adaptés. Une grande variété de matrices d’immobilisation (organiques ou inorganiques) a déjà étudiée, mais aucune ne satisfait pleinement aux critères nécessaires pour le développement de bio-réacteurs (accessibilité au site actif de l’enzyme, relargage de l’enzyme, diffusion des réactifs, recyclabilité, stabilité..). En outre, la majorité de ces matrices présente une porosité désordonnée, inadaptée pour une immobilisation homogène. L’utilisation de matériaux hybrides, cristallins et poreux de type Metal-Organic Frameworks (MOFs) a été récemment proposée comme alternative avec des applications en biocatalyse et en biodétection.Le travail de cette thèse a consisté à associer des matériaux de type Metal-Organic Frameworks à une mini-enzyme, la microperoxidase 8 (MP8), afin d’obtenir des matériaux multifonctionnels. Dans une première partie, le MOF mésoporeux, MIL-101(Cr), a été utilisé pour encapsuler la MP8, ce qui a conduit à une amélioration de son activité catalytique dans des conditions qui ne sont pas adéquates pour l’activité enzymatique (conditions acides, forte concentration en H2O2), démontrant ainsi le rôle protecteur du MOF vis-à-vis de l’enzyme. De plus, il a été possible de recycler le biocatalyseur. Cette approche a également permis d’améliorer considérablement la sélectivité de la MP8 pour la dégradation d’un colorant organique toxique négativement chargé, le méthyl orange, grâce à son adsorption sélective par interaction électrostatique avec les particules de MIL-101(Cr). La seconde partie a été consacrée à l’utilisation de matériaux MIL-101(Cr) fonctionnalisés. Tout d’abord, l’influence de la fonctionnalisation du ligand (avec un groupement –NH2 ou –SO3H) sur l’encapsulation de la MP8 ainsi que sur son activité catalytique pour des réactions de sulfoxydation a été étudiée. Il a été montré que l’activité catalytique et la réactivité de la MP8 sont affectées par le microenvironnement spécifique des pores du MOF, notamment pour des réactions de sulfoxydation mettant en jeu des dérivés thioanisole. Ensuite, un MOF à métal mixte (MIL-101(Cr/Fe)) choisi pour ses propriétés catalytiques stables, a été synthétisé et caractérisé. Enfin, la dernière partie de cette thèse a été consacrée à la synthèse in-situ d’un MOF (le microporeux MIL-53(Al)-FA) en présence de biomolécules (BSA) dans des conditions compatibles avec la préservation de la structure protéique (en solution aqueuse à température ambiante). Les matériaux hybrides obtenus ont été caractérisés en couplant de nombreuses techniques. Cette méthode d’encapsulation a conduit à des taux d’immobilisation extrêmement élevés. Une étude préliminaire a été initiée avec l’enzyme, Horseradish Peroxidase , qui conserve son activité catalytique après immobilisation
The use of enzymes in biocatalytic processes has been a challenging goal over the years. While enzymes present exceptional catalytic properties, their fragility hinders their industrial application. Their stabilization and protection are therefore of paramount importance. This can be effectively addressed through their immobilization within host solid matrices. Traditional materials (silica, clays, polymers, biopolymers, porous carbons…) have been widely studied as supports. Their pure organic or inorganic nature often requires a compromise between affinity with enzymes and robustness of the matrix. Besides, most of them have non-ordered porosity, with non-homogenous pore size distributions, unsuitable for homogeneous immobilization. Metal-Organic Frameworks (MOFs) have been recently introduced as alternative supports, thanks to their hybrid nature and their crystalline and highly porous structures.The aim of this PhD was to combine Metal-Organic Frameworks (highly porous and chemically stable polycarboxylate MOFs) and a mini-enzyme, microperoxidase 8 (MP8) to obtain multifunctional biocatalysts. In a first part, the mesoporous MIL-101(Cr) was used as a host matrix to encapsulate MP8. The encapsulation led to an increased catalytic activity under conditions (acidic conditions, high concentration of H2O2) detrimental to the catalytic activity of MP8, thereby demonstrating the protecting effect of MIL-101(Cr) matrix. The biocatalyst was also efficiently recycled. The selectivity of MP8 for the degradation of the harmful negatively charged organic dye methyl orange was also enhanced, thanks to the charged-based selective adsorption of the dye in MIL-101(Cr) porosity. A second part of the work was devoted to the use of functionalized MIL-101(Cr) analogs. First, functionalized ligands (bearing –NH2 and –SO3H groups) were used, and their influence on MP8 encapsulation was evaluated. The catalytic activity toward sulfoxidation reactions was also studied. The successful encapsulation of MP8 was strongly dependent on charge matching between the enzyme and the MOFs particles, while its catalytic activity was affected by the specific microenvironment of the pores. The MOF frameworks also modified the reactivity of MP8 toward different thioanisole derivatives. Then, a mixed metal MOF (MIL-101(Cr/Fe)), selected for its stable catalytic properties, was synthesized and characterized. Finally, the last part was devoted to the in-situ synthesis of MOFs (microporous MIL-53(Al)-FA) in presence of biomolecules (BSA) under compatible conditions with the preservation of the protein’s quaternary structure (aqueous media and room temperature). The resulting hybrid materials were thoroughly characterized and presented high loadings of BSA. A preliminarily study was performed with the enzyme, Horseradish Peroxidase, which retained its catalytic activity after immobilization

This thesis aims at presenting the use and development of original catalytic systems based on lipases immobilized on clays which are efficient for the synthesis of biopolyesters and allowing the preparation of organic/inorganic nanohybrids based on clay nanoparticles (sepiolite and montmorillonite) grafted with such polyesters. These nanoclays were used as lipase supports and the clay-immobilized forms of Candida antarctica lipase B (CALB) were tested for ε-caprolactone and lactide isomers polymerization. Polymerization kinetics and characterization of resulting materials have shown that lipases immobilized on montmorillonite show better performances compared to the ones immobilized on sepiolite. Clay surface organo-modification has proved to greatly enhance the catalytic activity of the corresponding systems. CALB immobilized on montmorillonite allowed the elaboration of organic/inorganic nanohybrids as evidenced by the effective grafting of polyester chains from the clay surface. Finally, random PCL/PLA copolyesters were successfully obtained by lipase-catalyzed copolymerization of D-lactide with ε-caprolactone.

L’immobilisation fonctionnelle des enzymes redox sur un support solide conducteur, en termes de densités de courant catalytique et de stabilité, est l’un des défis les plus importants à relever avant la commercialisation de systèmes tels que les piles à combustible enzymatiques et les biocapteurs. Cette thèse vise à la compréhension des facteurs moléculaires qui contrôlent le processus de transfert d'électrons interfacial et l'efficacité catalytique des enzymes redox immobilisées, en considérant l'effet de la quantité, de l'orientation et de la conformation des biomolécules à l’interface électrochimique. L'objectif ultime est d'obtenir une rationalisation des bioélectrodes. Des enzymes redox d’origine et de propriétés différentes, et des surfaces d’électrodes de chimie et structuration variées sont explorées pour moduler la connexion électrique de l’enzyme, et donc le processus de transfert d'électrons. Les propriétés requises de surface de l'électrode en tant que matrice hôte pour les enzymes sont tout d’abord déterminées sur électrodes planes puis étendues à des électrodes nanostructurées. Afin de déduire un modèle d'adsorption, un couplage sans précédent de l'électrochimie à des techniques de surface telles que la résonance plasmonique de surface (SPR), la spectroscopie d'absorption par réflectance infrarouge à modulation de polarisation (PMIRRAS) et l'ellipsométrie. Enfin, de nouvelles électrodes nanostructurées obtenues par ablation au laser sont explorées comme de nouvelles plates-formes stables capables de contrôler le taux de recouvrement surfacique enzymatique, ouvrant la voie à l'électrochimie d'une molécule unique
Functional immobilization of redox enzymes on conductive solid support, which must result in high current densities and operation stabilities, is one of the most significant challenge before the commercialization of biodevices like biofuel cells and biosensors. In order to get and to maintain the enzymatic activity in the immobilized state, this thesis aims to develop the molecular understanding that controls the efficiency of immobilized redox enzymes while considering the effect of loading, orientation and conformation as a function of various parameters like pH, electric field, ionic strength and covalent connections. The overall goal is to get a full rationalization of bioelectrodes.In this thesis, varieties of combinations that include properties of redox enzymes and/or electrode surfaces are explored to optimize immobilization, electrical wiring and thereby the ET process and its viability for bioelectronics. In order to deduce an adsorption model based on electrostatic interaction, an unprecedented coupling of electrochemistry to surface sensitive techniques like surface plasmon resonance (SPR), Polarization Modulation Infrared Reflectance Absorption Spectroscopy (PMIRRAS) and Ellipsometry is discussed which will ultimately help in understanding the combined effect of loading, orientation, and conformation on bioelectrocatalysis. Additionally, role of nanomaterials for the optimization of bioelectrocatalytic process is also explored. The desired properties of the electrode surface as a host matrix for enzymes are put forward accordingly while comparing the merit of planar and nanostructured electrodes

L'objectif global de cette étude était de produire du bioéthanol à partir de biomasse lignocellulosique en utilisant des enzymes libres ou immobilisées de type xylanase, cellulase et β-1,3-glucanase. L'isolement de la souche AUKAR04 de Trichoderma citrinoviride a permis de produire par fermentation solide ces trois enzymes à un taux de 55 000, 385 et 695 UI / gd, respectivement. L’activité biochimique des enzymes libres a été caractérisée en faisant varier différents paramètres : pH, température et concentration en cations métalliques, et les paramètres cinétiques correspondants ont été identifiés. Par la suite, les enzymes ont été immobilisées en phase solide, soit sous forme d’agrégats sans support de type (combi-CLEA), soit par association avec des nanoparticules magnétiques bifonctionnalisées (ISN-CLEA). Ces dernières ont fourni de meilleures performances en termes de stabilité thermique, d’activité et d’aptitude à réutilisation après un temps de conservation prolongé. Le substrat végétal utilisé (SCB : bagasse de canne à sucre) a été prétraité chimiquement par cuisson à l'ammoniac, permettant d’éliminer 40% de la lignine initiale tout en préservant 95% de glucane, 65% de xylane et 41% d'arabinane. L’hydrolyse enzymatique du substrat prétraité a permis une conversion de la cellulose en 87% de glucose, et une conversion des hémicelluloses (arabinoxylanes) en 74% de xylose et 64% d'arabinose, chiffres notoirement supérieurs à l'activité des enzymes libres. L'analyse chimique et structurale du substrat a été faite par spectrométrie ATR-FTIR et DRX, et par analyse TGA. L’étude FTIR a prouvé l’efficacité du traitement enzymatique en montrant que les hémicelluloses et la cellulose subissent une dépolymérisation partielle par l’action simultanée des trois enzymes immobilisées dans les ISN-CLEA. L’étude TGA a montré que la stabilité thermique des échantillons prétraités à l'ammoniac puis traités par des enzymes est notoirement améliorée. L’analyse DRX a montré que l'indice de cristallinité du substrat prétraité à l’ammoniac puis traité par l'ISN-CLEA a augmenté de 61,3 ± 1%, par rapport au substrat avant traitement enzymatique. La fermentation par la levure Saccharomyces cerevisiae LGP2Y1 utilisée en monoculture, à partir d’un hydrolysat enzymatique contenant 103,8 g / L de glucose, a produit 42 g / L d'éthanol en 36 h de fermentation. Le rendement métabolique global atteint ainsi environ 79% du rendement théorique. La fermentation en co-culture avec Saccharomyces cerevisiae LGP2Y1 et Candida utilis ATCC 22023 d’un hydrolysat à 107,6 g / L de glucose et 41,5 g / L de xylose a produit 65 g / L d'éthanol en 42 h de fermentation. Ainsi, en co-culture fermentaire, le rendement métabolique global atteint environ 88 % du rendement théorique
The overall objective of the study was to produce bioethanol from lignocellulosic biomass by using free and immobilized xylanase, cellulase and β-1, 3-glucanase. Specifically, this study was focused on the isolation of Trichoderma citrinoviride strain AUKAR04 and it produces xylanase (55,000 IU/gds), Cellulase (385 IU/gds) and β-1, 3-glucanase (695 IU/gds) in solid state fermentation. Then the free enzymes were biochemically characterized such as effect of pH, temperature and metal ion concentration and kinetics parameters. Then the enzymes were subjected to two types of immobilization using carrier-free co-immobilization (combi-CLEAs) method and immobilized on bifunctionalized magnetic nanoparticles (ISN-CLEAs) with higher thermal stability, extended reusability and good storage stability. Liquid ammonia pretreatment removed 40% lignin from the biomass and retained 95% of glucan, 65% of xylan and 41% of arabinan in sugarcane bagasse (SCB). SCB was enzymatically hydrolyzed and converted to 87% glucose from cellulose and 74% of xylose, 64% of arabinose from the hemicelluloses which is remarkably higher than the activity of the free enzymes. Chemical and structural analysis of SCB was done by ATR-FTIR, TGA and XRD. FTIR result showed a successful pretreatment of the SCB raw material. It showed that hemicelluloses and cellulose are partially depolymerized by the action of xylanase, cellulase and β-1,3-glucanase in ISN-CLEAs. TGA studies showed that the thermal stability of the ammonia pretreated and enzymatically treated samples have improved remarkably. XRD results showed that the crystallinity index of the ISN-CLEAs treated SCB increased to 61.3±1% when compared to the ammonia-treated SCB. Mono-culture fermentation using Saccharomyces cerevisiae LGP2Y1 utilized SCB hydrolysate containing 103.8 g/L of glucose and produced 42 g/L ethanol in 36 h of fermentation. The overall metabolic yield achieved was about 79% of theoretical yield. Co-culture fermentation using Saccharomyces cerevisiae LGP2Y1 and Candida utilis ATCC 22023 utilized SCB hydrolysate containing 107.6 g/L of glucose and 41.5 g/L xylose and produced 65 g/L ethanol in 42 h of fermentation. The overall metabolic yield in co-culture fermentation achieved was about 88 % of the theoretical yield

Approche multi-échelle pour l’étude de la réaction de N-acylation enzymatique d’acides aminés La réaction de N-acylation d’acides aminés ou de peptides permet l’obtention de dérivés de ces molécules présentant des propriétés bioactives et/ou techno-fonctionnelles, avec une biodisponibilité, une hydrophobie et une stabilité accrue. Les acides aminés acylés ont été largement décrits comme constituant une classe d'agents tensioactifs avec d'excellentes propriétés de surface, des activités biologiques intéressantes, un faible potentiel de toxicité et un faible impact environnemental. Actuellement réalisée de manière chimique à l’échelle industrielle, l’acylation de ces acides aminés ou peptides présente des contraintes en termes de sélectivité réactionnelle et d’innocuité vis-à-vis de l’environnement ainsi qu’en termes de coût de retraitement des effluents polluants. Une alternative à cette voie chimique est l’utilisation d’enzymes capables de catalyser ces réactions d’acylation. Dans la littérature, différents couples d’enzymes et de solvants ont déjà été décrits. Néanmoins, les performances réactionnelles de ces systèmes demeurent parfois limitées. L’objectif de cette thèse a donc été l’amélioration du procédé d’acylation par une approche à différentes échelles. À l’échelle moléculaire, une étude a été réalisée avec la lipase B de Candida antarctica (CALB). Une approche de modélisation moléculaire a été utilisée afin de mettre au point une méthodologie associant des simulations de docking et des calculs d’interaction permettant d’améliorer la compréhension et permettre la prédiction de la régiosélectivité de CALB lors de l’acylation de la lysine par différents acides gras. Des études ont également été conduites à l’échelle réactionnelle, notamment avec la recherche de nouveaux biocatalyseurs de type aminoacylases dans l’extrait brut de Streptomyces ambofaciens. La régiosélectivité et les performances de la réaction catalysée par ces enzymes ont été comparés à celles de CALB. Les résultats ont mis en évidence un potentiel très prometteur des aminoacylases de S. ambofaciens concernant la synthèse d’acide aminés/peptides acylés. En effet, en plus de leur aptitude à réaliser la réaction d’acylation en milieu aqueux, ces enzymes possèdent une régio-sélectivité qui diffère de celle de CALB. Cette régio-sélectivité orientée vers les groupements N-terminaux est un atout très peu décrit à ce jour, car elle permet d’acyler ces molécules sans modifier les chaînes latérales des acides aminés ou des peptides et donc leurs fonctionnalités. Dans la dernière partie de ces travaux, des études à l’échelle procédé ont été menées. Tout d’abord, l’immobilisation des aminoacylases sur des matériaux mésoporeux silicatés a été réalisée et différentes méthodes d’immobilisation ont pu être comparées. Cette étude a permis de proposer une méthode d’immobilisation des aminoacylases de S. ambofaciens par physisorption, permettant de conserver l’activité spécifique pendant au moins 3 cycles. Puis, dans une dernière partie, l’intensification de la réaction d’acylation en réacteur micro-ondes ou microstructurés a été abordée. Les expérimentations réalisées dans un réacteur chauffé par irradiation micro-onde ont montré que ce type de réacteur était adapté à la réaction d’acylation catalysé par CALB sous sa forme immobilisée commerciale (Novozym435®) en solvant organique, ce qui n’est pas le cas avec des aminoacylases de S. ambofaciens libres, en milieux aqueux. Pour cette réaction, d’autres méthodes d’intensification ont été envisagées, notamment en réacteur microstructuré de type microfluidique. L’efficacité du mélange étant primordiale notamment en milieu biphasique, celle-ci a pu être améliorée avec un taux de conversion supérieur dans ce réacteur comparativement à un réacteur classique agité mécaniquement
N-acylation of amino acids or peptides results in bioactive and/or functional molecules showing increased bioavailability, hydrophobicity and stability. Acylated amino acids have been broadly described as being a kind of surfactant with great surface chemistry properties, interesting biological activities, weak toxicity and low environmental impact. Acylation of amino acids or peptides is being performed chemically at industrial scale. It creates constraints in term of reaction selectivity, environmental safety and cost of polluted wastewater treatment. Enzymatic catalysis is an alternative to chemical acylation reaction. Several enzyme/solvent pairs have already been described in the literature. Their performance are however somewhat limited. The objective of this thesis work was thus to improve the capacity of acylation processes at different scales. At the molecular scale, a study was performed using Candida antarctica’s (CALB) lipase B. Molecular modeling was used to create a methodology coupling docking simulation and interaction calculus that would allow for a better understanding of CALB regioselectivity during lysine acylation by different fatty acids. Studies were also conducted at the reaction level, especially by searching for new aminoacylase-type of biocatalysts in Streptomyces ambofaciens raw extract. Regioselectivity and performance of these enzyme’s catalytic reactions were compared to those of CALB. Results brought into light a promising potential from S. ambofaciens’ aminoacylases in synthesizing acylated amino acids/peptides. Indeed, on top of their ability to catalyse acylation reaction in aqueous solution, these enzymes have a different regioselectivity compared to CALB’s. Regioselectivity targeting N-terminal groups is a rarely researched phenomenon allowing acylation to be performed without modifying amino acids or peptides lateral chains and hence their functionality. In the last part part of this work, studies at process scale were performed. Aminoacylase were first immobilized on mesoporous silicates and several immobilisation methods were compared. Using physisorption, a method for the immobilisation of S. ambofaciens’ aminoacylases was developed to reach a conserved specific activity during 3 cycles. Finally, intensification of acylation reaction was examined in microwave or microstructured reactors. First, an experimental set up was performed in an heated reactor using microwaves irradiation. This kind of reactor was demonstrated as being adapted to acylation reaction using a commercial immobilized form of CALB (Novozym435®) as catalyst in organic solvent. The microwave reactor was however not suited for free S. ambofaciens aminoacylase in aqueous solution. For that latter reaction, intensification had to be approached through other aspects of the process. Hydrodynamic appeared indeed as an important aspect for this reaction occurring in a biphasic medium composed of fatty acids and aqueous solution. A microstructured microfluidic reactor was hence tested. Conversion yield were increased with this system. This study demonstrated how mixing quality was an important factor for acylation reaction and could be a way to intensify the enzymatic process at larger scale

Dans ce mémoire nous discutons le développement de l’électrode de travail d’un bioréacteur électrochimique, dispositif permettant de synthétiser suivant un procédé dit de « Chimie Verte » des substances chimiques à haute valeur ajoutée. L’électrode de travail étant le siège de la synthèse électrocatalytique en jeu, l’optimisation de sa structure a été étudiée dans le but de maximiser l’aire de sa surface active. L’élaboration d’électrodes macroporeuses hautement organisées et de taille définie par les dimensions du prototype du réacteur pilote, a pu être obtenue en utilisant la méthode de Langmuir-Blodgett pour assembler le cristal colloïdal servant de template. La formation de ce dépôt organisé de colloïdes est suivie de l’électrodéposition du matériau d’électrode puis de la dissolution du template afin de révéler la structure macroporeuse. L’immobilisation de l’intégralité du matériel bio-électrocatalytique à l’intérieur des pores a été investiguée dans le but de prévenir la pollution du milieu contenant le produit final d’électrosynthèse par un des constituants redox et d’augmenter la durée de vie du dispositif. Ainsi, des couches ultra-minces de silice électrogénérée et des matrices de polymère électrodéposé ont été étudiées dans le but de préserver et d’optimiser l’activité enzymatique du système qu’elles encapsulent. Une attention particulière a été portée sur la qualité des dépôts au sein des structures poreuses. La procédure d’immobilisation des protéines rédox dans les matrices de silice et de polymère a été en outre associée à un jeu de construction moléculaire qui a permis par l’instauration de diverses interactions électrostatiques, de retenir toutes les espèces responsables de la catalyse à la surface de l’électrode. Enfin, dans le but d’intensifier les réactions catalytiques responsables de la synthèse à réaliser, des nano-particules d’ormodifiées par une couche monomoléculaire d’un médiateur redox ont été incorporées aux différents matériaux d’immobilisation permettant de ce fait d’augmenter les interfaces d’échanges électrochimiques entre matériau conducteur et biomolécules. L’insertion de ces nano-objectscombinée à la nanostructuration du matériau d’électrode a permis de multiplier par plus de 170 fois l’intensité des réactions enregistrées
The present work deals with the development of the working electrode of an electrochemicalbioreactor. This device enables the green synthesis of high added value chemical compounds. As theelectrochemical synthesis is located at the interface of the working electrode, structural optimizationof this reactor key component is required in order to maximize the available active surface area.Elaboration of highly organized macroporous gold electrodes with a size required by the pilot reactordimensions were obtained with the Langmuir-Blodgett method that was used to assemble a colloidalcrystal as a template. The elaboration of the organized colloidal deposit is first followed by theelectrodeposition of the electrode material, then by the dissolution of the template. The immobilization of the complete bio-electrochemical system inside the electrode pores was investigated in order to prevent pollution of the final product medium by one of the catalytic chaincomponent. This also improves the device life time. Subsequently electrogenerated ultra-thin silicalayers and electrodeposited polymer matrices were studied in order to preserve and optimize the catalytic activity of the redox proteins. In order to enhance the electrocatalytic synthesis, mediatormodified gold nanoparticules were incorporated in the different immobilization matrices. This allowed to increase the area of the electrochemical interface. The combination of the nano-objectincorporation and electrode nano-structuring intensified by a factor of 170 the catalytic process
Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Entwicklung einer Arbeitselektrode für einenelektrochemischen Bioreaktor, der die umweltfreundliche Synthese von wertvollen chemischenKomponenten ermöglicht. Da die elektrochemische Synthese an der Oberfläche der Arbeitselektrodestattfindet, ist es nötig, den strukturellen Aufbau der Schlüsselkomponente des Reaktors zuoptimieren und die aktive Oberfläche der Elektrode zu erhöhen. Mit Hilfe der Langmuir-BlodgettTechnik wurden kolloidale Kristalle erzeugt, die als Template dienten, um hochgeordnetemakroporöse Goldelektroden, deren Dimensionen von dem Pilotreaktor bestimmt wurden,herzustellen. Nach dem Erzeugen von geordneten kolloidalen Filmen wurde der Zwischenraumzwischen den Partikeln mittels elektrochemischer Abscheidung gefüllt und das Templateanschließend chemisch aufgelöst. In der Folge wurde die Immobilisierung des komplettenbioelektrochemischen Systems im Poreninnenraum untersucht, mit dem Ziel eine Verunreinigung desReaktionsmediums durch eine der katalytischen Komponenten zu verhindern. Die Lebensdauer derElektrode kann so zusätzlich erhöht werden. Es wurde untersucht, inwieweit durch elektrogenerierteultra-dünne Silikaschichten oder durch Elektroabscheidung erzeugte Polymerfilme die katalytischeAktivität der Redoxproteine erhalten und weiter optimiert werden kann. Goldnanopartikel, die miteinem Mediator modifiziert wurden, wurden in die jeweilige Immobilisationsschicht integriert, mitdem Ziel die Effizienz der elektrokatalytischen Synthese zu erhöhen. Auf diese Weise konnte dieaktive elektrochemische Oberfläche der Elektrode weiter erhöht werden. Die Kombination aus einernanostrukturierten Elektrode und Nanoobjekten die in die Immobilisationsschicht eingebettetwurden, führte zu einer Signalerhöhung des katalytischen Prozesses um mehr als eineGrössenordnung

Ces travaux de thèse pluridisciplinaires à l‘interface entre biocatalyse et nanomatériaux visent la conception de matériaux biohybrides innovants par assemblage dans des conditions douces de matériaux inorganiques de type hydroxydes doubles lamellaires (HDL) avec des enzymes. La première partie de ce mémoire est consacrée à la caractérisation des interactions physico-chimiques entre les HDL et la fructose-6-phosphate aldolase (FSA) catalysant la formation stéréosélective de liaisons C-C pour conduire à des polyols chiraux. Les structures lamellaires HDL permettent un confinement efficace de systèmes enzymatiques grâce à leur structure bidimensionnelle poreuse, leurs propriétés physico-chimiques favorables à l‘échange ionique et leur biocompatibilité. Différentes stratégies d‘immobilisation de la FSA dans des matrices d‘HDL ont été explorées, le taux d‘immobilisation et l‘activité biocatalytique étant fortement dépendant de la méthode d‘assemblage et de la nature des phases HDL. Le taux d‘immobilisation de l‘enzyme obtenu par coprécipitaton est supérieur à celui obtenu par adsorption. Dans une deuxième partie, un bioréacteur a été élaboré par un assemblage hiérarchisé constitué de la FSA, de nanoplaquettes d‘HDL et de billes de polysaccharide, ce dernier jouant le rôle de matrice macrostructurante. De façon notable, le taux d‘encapsulation de l‘enzyme dans la matrice macroscopique est amélioré lorsque le biocatalyseur est pré-encapsulé dans les nanoplaquettes d‘HDL. Ceci est attribué aux interactions électrostatiques favorables entre les chaînes de polysaccharide et les HDL, facilitant une charge de matière plus importante. L‘efficacité catalytique du bioréacteur obtenu et sa recyclabilité ont été démontrés. Dans la troisième partie de cette thèse, nous décrivons pour la première fois la conception de bionanoréacteurs enzymes@HDL par co-immobilisation de systèmes bi- ou tétra-enzymatiques dans les HDL permettant de réaliser des cascades multienzymatiques biomimétiques. L‘immobilisation des différentes enzymes prises séparément a d‘abord été optimisée afin de déterminer les conditions de co-immobilisation et de réaliser les cascades biocatalytiques en phase hétérogène. Ces bionanoréacteurs, dont nous avons démontré la recyclabilité, ont été appliqués pour la synthèse de sucres phosphorylés de série D. Enfin, une cascade multienzymatique a été conçue de novo en solution aqueuse et optimisée pour synthétiser différents sucres phosphorylés rares de série L
This multidisciplinary thesis at the biocatalysis/nanomaterial interface perfectly aims at designing innovative biohybrid materials by the assembly of inorganic materials the Layered Double Hydroxides (LDH) with enzymes under mild conditions. The first part of this thesis is devoted to the characterization of physico-chemical interactions between the LDH and the fructose-6-phosphate aldolase (FSA) catalyzing the stereoselective C-C bond formation to provide chiral polyols. LDH structures allow the effective confinement of enzymatic systems thanks to their opened two-dimensional structure as well as their chemical surface properties at the nanoscale and their biocompatibility. The FSA immobilization in different LDH matrices by different methods was studied. Biocatalytic activity is highly dependent on the method of assembling, modulating the final amount of FSA. The retaining activity rate of co-precipitated material was higher than that obtained for the adsorbed enzyme. In a second part, a bionanoreactor was developed based on a hierarchized assembly of FSA, LDH nanoplatelets and polysaccharide beads acting as a macrostructuring matrices. Significantly, the encapsulated enzyme rate in the beads was improved when the biocatalyst was pre-encapsulated in LDH nanoplatelets. This is attributed to favorable electrostatic interactions between the polysaccharide chains and LDH, facilitating a higher catalyst loading. The catalytic efficiency of the prepared bioreactor and its recyclability were demonstrated. In the third part of this thesis, we describe for the first time the design of bionanoreactors ―enzymes@LDH‖ by co-immobilisation of two and four enzymes in LDH allowing biomimetic multienzymatic cascades. We first studied the immobilization of the different enzymes taken separately. Then we worked on the optimization of the biocatalytic cascades in heterogeneous phase. These bionanoreactors, for which we have shown the recyclability, have been applied to the synthesis of D-series phosphorylated sugars. Finally, a multienzymatic cascade was de novo designed in aqueous homogeneous solution. It was optimized for the synthesis of rare L-phosphorylated sugars