Dissertations / Theses on the topic 'Embryology – Experimental'

This thesis presents an examination of the notion of 'normal development' and its role in biological research. It centres on a detailed historical analysis of the experimental embryological work of the American biologist Edmund Beecher Wilson in the early-1890s. Normal development is a fundamental concept in biology, which underpins and facilitates experimental work investigating the processes of organismal development. Concepts of the normal and normality in biology (and medicine) have been fruitfully examined by philosophers. Yet, despite being constantly used and invoked by developmental biologists, the concept of normal development has not been subject to substantial philosophical attention. In this thesis I analyse how the concept of normal development is produced and used in experimental systems, and use this analysis to probe its theoretical and methodological significance. I focus on normal development as a technical condition in experimental practice. In doing so I highlight the work that is required to create and sustain both it and the work that it enables. Variation between embryos can cause problems for scientists trying to produce valid and comparable results. In my study of Wilson's work, I examine how the practices associated with normal development deal with the variation between embryos. In the 1890s, Wilson became increasingly interested in which causes were responsible for the processes of differentiation (the production of different cells and organs) and determination in the process of embryonic development. He performed a series of experiments on the marine invertebrate Amphioxus, which exhibits considerable variability in early development (Wilson, 1893a). Wilson carefully observed his samples and outlined a normal development based on them, which included a considerable range of variation. How Wilson treated variation was reflected in the different way in which he conceived of the process of development compared to other prominent embryologists, such as Hans Driesch and Wilhelm Roux. 4 Having introduced and assessed normal development, I use two analytical approaches to make further sense of it. Furthermore, these approaches identify why appreciating the role of normal development enables us to understand important aspects of scientific practice, such as experimental methodology and making causal attributions based on the results of experimental manipulations. The two main analytical approaches I use are James Woodward's manipulationist theory of causation (Woodward, 2003 and 2010), and Hans- Jörg Rheinberger's experimental systems approach (Rheinberger, 1997). The former assesses the factors involved in assessing proposed causal factors, rather than simply demarcating between causes and non-causes. The latter focuses on the way experimental set-ups are configured by scientists in ongoing series of experiments to frame phenomena of interest: 'epistemic objects'. My experimental systems are produced and reproduced, and to how attributions of causality which arise from experimental work are made.

Thesis (Ph. D.)--University of Oregon, 1999.
Typescript. Includes vita and abstract. Includes bibliographical references (leaves 110-119). Also available for download via the World Wide Web; free to University of Oregon users. Address: http://wwwlib.umi.com/cr/uoregon/fullcit?p9955919.

A mouse embryo culture medium which would allow for in vitro development from 1-cell stage to blastocyst stage could offer many benefits for human research. Previous researchfrom our lab has demonstrated a mouse embryo culture medium named CZB seems to allow for in vivo-like conditions for development. Compared to other commonly used mouse embryo culture media, CZB medium promotes a higher frequency of 1 cell mouse embryos developing to blastocyst stage (Chatot et 1989). A key difference between CZB and other mouse embryo culture media is that CZB contains the amino acid glutamine metabolism is glutamate dehydrogenase (GDH). In order to determine if CZB cultured embryos follow in vivo-like patterns of gene expression for GDH, a quantitative competitive RT-PCR system was designed. A mutant GDH mRNA template was created which lacked a specific restriction enzyme site and was used as a competitive template in quantitative RT-PCR. This system was used to determine the amount of GDH mRNA present in in vivo grown blastocyst stage mouse embryos. It was determined that the amount of GDH mRNA present in in vivo blastocyst stage embryos was 282 fg/embryo. It is believed this system will also allow for quantitation of GDH mRNA in the earlier preimplantation stages of in vivo grown embryos, as well as the preimplantation stages 2-cell to blastocyst of CZB cultured embryos.
Department of Biology

O presente trabalho avaliou a efetividade do tratamento com tripsina (TT) na eliminação do BoHV-1 Colorado, causador da Rinotraqueíte Infecciosa Bovina (IBR). Camundongos fêmeas Swiss, com idade entre 6 e 8 semanas, foram superovuladas com 0,2mL a 5UI de hormônio eCG e, após 48h com hCG e acasaladas com machos inteiros da mesma linhagem e idade. Após 18 horas, as fêmeas foram eutanasiadas e, através de abertura no peritônio, os zigotos foram coletados. Foram separados zigotos para cinco ensaios que forneceram os seguintes dados: o BoHV-1 Colorado altera a taxa de clivagem e a morfologia do embrião; a tripsina, seguindo recomendações da IETS, não danifica o embrião; os embriões expostos aos vírus e submetidos ao TT não alteram sua morfologia e taxa de clivagem; foram detectados (nested-PCR+) vírus viáveis (MDBK+) após o TT. Estes resultados demonstram que o TT não foi efetivo para eliminar o BoHV-1 Colorado, porém em alguns ensaios o TT demonstrou eficiência na inativação do vírus o que torna-o um importante método de controle in vitro.
This study evaluated the effectiveness of treatment with trypsin (TT) in the elimination of BoHV-1 Colorado, which causes infectious bovine rhinotracheitis (IBR) Swiss female mice, aged 6 and 8 weeks, were superovulated with 0.2 mL 5UI hormone eCG and 48h after hCG and mated with males of the same lineage and age. After 18 hours, females were euthanized, and through na opening in the peritoneum, the zygotes were collected. Zygotes were separated for five trials that provided the following data: the Colorado BoHV-1 alters the cleavage rate and embryo morphology; trypsin, following recommendations of the IETS, does not damage the embryo; the embryos exposed to the virus and subjected to TT does not change their morphology and cleavage rate; were detected (nested-PCR +) viable virus (MDBK +) after the TT. These results demonstrate that TT was not effective to eliminate the BoHV-1 Colorado, but in some tests showed the TT efficiency in inactivating the virus makes it na important method of control in vitro.

Bovine morulae (day 6: n=257) were obtained to evaluate the [effect of immunoglobulins (Ig) on early bovine embryo development in vitro. Fifty-four cows superovulations were conducted in 36 cows with follicle stimulating hormone. Embryos were collected by non-surgical procedures and morphologically evaluated and randomly assigned to culture. Embryos were cultured in Ham's F-10 containing 10% (6.4 mg/ml) steer serum (SS), 1% (.64 mg/ml) bovine gamma . globulins (GG), 1% (.64 mg/ml) bovine IgG, 1% (.64 mg/ml) bovine 1gM, 10% SS plus 1% GG, 10% SS plus 1% 1gG, or 10% SS plus 1% 1gM. Embryos were cultured to the hatched blastocyst stage or degeneration and evaluated at 12 h intervals.
Master of Science

The establishment of the embryonic axis in the Drosophila embryo relies on four maternal systems. Anterior and posterior axes rely on morphogens located at the poles that will generate a gradient of activity along the embryo. In contrast, terminal and dorsoventral system rely on cues that are generated by follicle cells in the egg chamber to induce the restricted activation of their receptors, Torso and Toll respectively. In the case of the terminal signaling, the torso (tor) gene encodes for a tyrosine kinase receptor uniformly localised all around the membrane of the embryo but exclusively activated at the poles upon the activity of the Torso-like (Tsl) protein. Restricted activation of the Torso receptor at the embryonic poles relies on the tsl gene. Indeed, Tsl is expressed at the poles of the egg chamber during oogenesis and, in embryogenesis, accumulates at both poles of the inner side of the vitelline membrane, the innermost eggshell layer, by means of three protein encoded by the Nasrat (f(s) N), Polehole (f(s) Ph) and Closca (clos) genes. f(s) N, f(s) Ph and clos encode for proteins that localise in the vitelline membrane and are involved in the crosslinking of the vitelline membrane converting the eggshell into a stiff and insoluble layer. Indeed, females bearing mutations in any of these genes produce collapsed eggs due to defects in their eggshell. fs(1)N12, fs(1)ph1901 and clos1 are the only point mutation alleles which do not abolish the integrity of the vitelline membrane but cause the lack of terminal structures. The main objective of this work was to shed light on the role of Tsl, Nasrat, Polehole and Closca in ensuring restricted of Tor activation at the embryonic poles. In the case of Tsl, we found that, during oogenesis, it accumulates at the vitelline membrane while, in embryogenesis it localises at both ends of the embryonic plasma membrane probably at egg activation. These results suggest a a mechanism to transfer the Tsl from the egg chamber to the early embryo. This mechanism relies on the initial anchoring of Tsl at the vitelline membrane as it is secreted by the follicle cells, followed by its later translocation to the egg plasma membrane. In the case of Nasrat, Polehole and Closca,we found that embryo laid by fs(1)N12, fs(1)ph1901 and clos1 mutant females display defects in dorsoventral patterning specification besides their terminal phenotype. Nasrat, Polehole and Closca, are required for proper anchorage and activity of Nudel, a protease acting both in embryonic dorsoventral patterning and vitelline membrane integrity, thus providing a mechanism for the role of Nasrat, Polehole and Closca in vitelline membrane cross linking and dorsoventral patterning. Therefore, the dorsoventral and terminal systems, hitherto considered independent, share a common extracellular mechanism constituted by the Nasrat, Polehole and Closca proteins. Moreover, we found that these proteins have a new Tsl-independent role in terminal signaling. In the embryonic terminal system, Tor is activated only at the poles by its ligand Trunk while, in Drosophila larvae, Tor is also expressed and activated by another ligand called Prothoracicotropic hormone (PTTH) in the Prothoracic Gland. Ectopic expression of PTTH in the embryo is able to activate Tor ectopically even in the absence of Tsl but requires Nasrat, Polehole and Closca. From these results, we propose that a Nasrat/Polehole/Closca complex acts as a multifunctional hub to anchor various proteins synthesized at oogenesis, ensuring their spatial and temporal restricted function. These findings shed light on the eggshell not just as protective layer but as a specialised extracellular matrix that regulates the spatial and temporal control of early embryonic developmental processes.
El eje antero-posterior del embrión de Drosophila se especifica por acción de tres sistemas maternos: el sistema anterior, el sistema posterior y el sistema terminal. En el sistema terminal el receptor tirosina quinasa Torso (Tor) está localizado uniformemente en la membrana del embrión temprano pero se activa sólo en los polos por acción de la proteína Torso-like (Tsl). Aunque el papel de Tsl en la activación de Tor no está del todo claro, se ha descrito que Tsl es la única proteína de todo el sistema terminal localizada en los polos. De hecho, Tsl se acumula en la cara interna de la membrana vitelina (MV), anclado a las proteínas Nasrat, Polehole y Closca. El papel molecular de estas proteínas es poco conocido, pero análisis genéticos han demostrado que se necesitan para una correcta estructura de la MV y también para la activación de Tor. En esta tesis, nos hemos focalizado en la función de las proteínas Tsl, Nasrat, Polehole y Closca y su papel en la activación de Tor en los polos. Respecto a Tsl, descubrimos que esta proteína se acumula en la MV durante la oogénesis y, al principio de la embriogénesis, transloca de la MV a la membrana plasmática del embrión. En cuanto a Nasrat, Polehole y Closca descubrimos que estas proteínas se necesitan también para la correcta localización y función de Nudel, una proteína involucrada en la especificación del eje dorso ventral del embrión. Además encontramos que Nasrat, Polehole y Closca tienen una función adicional en el sistema terminal independiente de Tsl. De los resultados aquí descritos proponemos que un complejo formado por las proteínas Nasrat, Polehole y Closca podría funcionar en la MV como un centro multifuncional para anclar proteínas importantes por la especificación de los ejes del embrión.

Body axis elongation is a hallmark of the vertebrate embryo, which also comprises the morphogenesis of the caudal neural tube (NT). The contribution of bipotential neuromesodermal progenitors (NMPs) to the cranio-caudal elongation of the embryo is beginning to be understood. However, the signalling pathways and tissue remodelling events required for shaping the caudal NT from NMPs remain largely unknown, even though the failure in this process generates caudal neural tube defects (NTDs). The caudal NT in amniote embryos forms by a process termed secondary neurulation (SN). SN shapes a secondary neural tube (SNT) through the lineage restriction and the mesenchymal-to-epithelial transition (MET) of NMPs into neural progenitor cells (NPCs), and the concomitant opening of a lumen de novo in the centre of the tissue. In human embryos, the development of the lumbar, sacral, coccygeal and equinal cord largely involves SN. The limited availability of human tissue to perform histological analyses at different developmental stages reinforces the need to use animal models to understand the events shaping the SNT, particularly since NTDs rank among the most common categories of birth defects, affecting 1 in every 1000 established pregnancies worldwide. Here, we combine the genetic manipulation of the chick embryo with an in vivo imaging technique to decipher the cellular events driving SNT formation and to demonstrate that TGF-b/SMAD3 signalling is required for proper SN, since its inhibition results in NTDs with multiple lumens. Our analysis demonstrates that the lineage restriction and the MET of Sox2+ T/Bra+ mesenchymal NMPs into Sox2+ T/Bra- epithelial neural progenitor cells (NPCs) are independent of SMAD3 activity. In the developing SNT, both the neural restriction and the MET tightly associate to the growing basement membrane (BM), which assembles in a dorso-ventral fashion. Hence, the first cells to adopt a neural identity and to undergo MET are those contacting the BM, located in the dorsal periphery of the medullary cord. On the contrary, centrally located cells remain mesenchymal, even to the very end of the process. It is between these two cell populations that small cavities of varied size and shape form, always at a one-cell distance from the BM, being SMAD3 also dispensable for lumen initiation. We found that the resolution of a single, centrally positioned continuous lumen in the SNT takes place through the intercalation of central cells, rather than through their programmed cell death. Indeed, results show an important novel activity for TGF-b/SMAD3 in the intercalation of central cells during lumen resolution. Notably, cell intercalation is always preceded by a cell division, either a symmetric II, which generates two intercalating daughter cells, or an asymmetric IC, which generates one intercalating and one central daughter cell. These two modes of division associate to different cranio-caudal levels, with II occurring cranially to IC. In addition, a third mode of division, the symmetric CC division, occurs in the caudal tail bud in order to generate two central mesenchymal NMPs and to expand the progenitor pool driving body axis elongation. Finally, we found lengthened primary cilia in sh-SMAD3 electroporated NPCs, a ciliopathy that might compromise the sensory functions of this organelle and ultimately contribute to the failure in central cell intercalation. Altogether, here we describe the cellular events driving SNT formation in the chick embryo and found a TGF-b/SMAD3-associated NTD. We anticipate our findings to be relevant to understand human SN and the embryonic origin of closed NTDs.
El alargamiento del eje del cuerpo es un sello distintivo del embrión de vertebrados. Los progenitores neuro-mesodérmicos (NMPs) llevan a cabo este proceso, incluyendo la morfogénesis del tubo neural caudal. En amniotas, éste se forma por el proceso conocido como neurulación secundaria (SN). El papel de los NMPs en el alargamiento del eje cráneo-caudal se conoce en mayor medida. Sin embargo, las vías de señalización y los eventos celulares que conforman el tubo neural secundario (SNT) se mantienen ampliamente desconocidos, aun cuando fallos en la SN producen defectos de tubo neural (NTDs). Aquí combinamos la manipulación genética del embrión de pollo con técnicas de imagen in vivo para descifrar los eventos celulares que conducen la formación del SNT y demostrar también que la vía de señalización TGF-beta/SMAD3 juega un papel muy importante en este proceso. Así, si ésta es inhibida durante el desarrollo del SNT se generan NTDs caracterizados por la presencia de múltiples lúmenes. Nuestro análisis demuestra que los eventos iniciales de la SN como la restricción de los NMPs en células progenitoras neurales (NPCs) y la subsecuente transición mesénquima-epitelio (MET) son independientes de la actividad de TGF-beta/SMAD3. No obstante, la resolución de un único lumen central, posible gracias a la intercalación de las células centrales, requiere la actividad de TGF-beta/SMAD3. Por todo ello, creemos que los hallazgos aquí presentados son relevantes para entender el proceso de SN en humano y así desentrañar el origen embrionario de los NTDs.

Durant el desenvolupament d’aquesta tesi doctoral hem identificat i caracteritzat la variant d’histona H1 present a la línia germinal i l’embrió primerenc de Drosophila melanogaster. Els metazous contenen múltiples variants d’histona H1. Particularment, la majoria d’espècies estudiades contenen diverses variants d’histona H1 que reemplacen les H1 somàtiques a la línia germinal i als primers estadis del desenvolupament embrionari. Drosophila era l’excepció ja que, fins ara tan sols es coneixia una única histona H1, que s’expressa des de la cel·lularització de l’embrió i que perdura durant tot el cicle biològic de la mosca. En aquest treball hem identificat la histona H1 embrionària i de la línia germinal de D.melanogaster, dBigH1. dBigH1 és molt abundant durant els primers estadis embrionaris, abans de la cel·lularització de l’embrió, quan la histona H1 somàtica (dH1) és absent i el genoma zigòtic es troba silenciat. Durant la cel·lularització, quan el genoma del zigot s’activa progressivament, dH1 reemplaça dBigH1 a les cèl·lules somàtiques. Tot i això, dBigH1 es reté a les primordial germ cells (PGCs) com a mínim fins l’estadi 12. Aquestes cèl·lules donaran lloc a la línia germinal del futur organisme. En aquest treball vam generar una mutació de falta de funció de dBigH1 a la qual vam anomenar dbigH1100. Els embrions mutants dbigH1100 presenten una activació prematura del genoma zigòtic, tan a les cèl·lules somàtiques com a les PGCs. Els embrions mutants dbigH1100 moren abans de la cel·lularització i presenten un augment dels nivells de RNA Polimerasa II elongant i un augment de trànscrits zigòtics. A més a més, la letalitat va acompanyada de dany al DNA i defectes mitòtics. Aquests resultats suggereixen que dBigH1 té una funció essencial en la regulació de l’activació del genoma zigòtic durant la cel·lularització. De la mateixa forma que altres metazous, dBigH1 també es troba present a la línia germinal femenina. Tot i això, a diferència d’altres espècies estudiades, on existeixen variants d’H1 específiques de mascle, dBigH1 també es troba present a la línia germinal masculina. Tan a les gònades masculines com a les femenines, dBigH1 està expressada a les cèl·lules mare germinals (GSC), que es troben adherides a un nínxol que ajuda al seu manteniment com a cèl·lules mare. A les gònades masculines dBigH1 no està present a la regió proliferativa, on hi ha els grups d’espermatogònies, i torna a expressar-se als espermatòcits. A les gònades femenines, dBigH1 té un patró de localització similar ja que es troba absent a les oogònies proliferants, però torna a expressar-se a les cambres ovàriques. En una condició de falta de funció de dBigH1 es produeixen defectes en la gametogènesi masculina i es detecta una acumulació d’espermatogònies. En aquestes gònades es produeix un augment dels nivells de Bam, un factor de diferenciació clau en aquest procés. En una situació control, els nivells de Bam augmenten durant la fase proliferativa, però aquest gen es torna a mantenir silenciat per tal que les espermatogònies deixin de proliferar i es diferenciïn a espermatòcits. Aquests resultats suggereixen que dBigH1 té una contribució en la regulació de l’expressió de bam durant la diferenciació de les espermatogònies. A més a més, també hem mostrat que la distribució de dBigH1 al llarg de la cromatina dels espermatòcits correlaciona negativament amb l’expressió gènica. Així doncs, els gens que es troben silenciats tenen un contingut alt en dBigH1, mentre que els gens més expressats tenen un contingut menor en la proteïna. De fet, en una situació de falta de funció de dBigH1 als espermatòcits, es produeix un augment de l’expressió d’aquells gens que, en una situació control, es troben silenciats. Aquests resultats suggereixen que dBigH1 també té una contribució en la regulació de l’expressió gènica durant la gametogènesi masculina.
During the development of this thesis we have descrived the germline and embryonic histone H1 variant of Drosophila melanogaster. Metazoans usually contain multiple histone H1 variants. In particular, specific variants replace somatic histone H1s in the germline and early embryogenesis. In this regard, Drosophila was an exception because a single dH1 was known. During this work, we identified the embryonic histone H1 of Drosophila, dBigH1. dBigH1 is abundant during early embryogenesis before cellularization occurs, when the somatic H1 is absent and the zygotic genome is inactive. Upon cellularization, when the zygotic genome si progressively activated, dH1 replaces dBigH1 in the soma, but not in the primordial germ cells (PGCs). dBigH1 loss-of-function mutant embryos show premature zygotic genome activation, both in the soma and the PGCs. Mutant embryos die at cellularization, showing increased levels of active RNApol II and zygotic transcripts, along with DNA damage and mitotic defects. These results show an essential function of dBigH1 in zygotic genome activation regulation. Like in other metazoans, dBigH1 is present in the female germline. However, it is also present in the male germline, while other metazoans contain diferent male-specific H1s. In the gonads, dBigH1 is expressed in the germ stem cells attached to the stem cell niche, both in males and females. In male gonads it is also present in the spermatocytes and, in the female gonads, it is also present in the egg chambers. dBigH1 knock-down testis have problems in the regulation of spermatogenesis, which results in spermatogonia accumulation and a decrease in male fertility. This is due to an upregulation of bam, a key regulator of this process. These results show a dBigH1 contribution in the regulation of bam expression during gametogenesis. Moreover, we also show that dBigH1 distribution across spermatocytes chromatin negativelly correlates with gene expression. dBigH1 is accumulated in genes which must remain silenced, whereas genes highly expressed in these cells contain less dBigH1 content. In this regard, a dBigH1 knock-down condition show an upregulation of these silenced genes. These results show that dBigH1 also contributes to transcriptional regulation in the germline.

En esta tesis se ha estudiado en detalle la genoarquitectura de la placa neural del anfioxo en desarrollo. La expresión de varios genes había sido descrita en el primordio nerual del anfioxo, pero no existe ningún consenso sobre la significación morfológica de las partes distinguibles por patrones moleculares concretos descritos en el sistema nervioso central. En este estudio hemos analizado cerca de cincuenta genes de diferenciación y, sobretodo, factores de transcripción que se expresan en el análogo neural de las néurulas de anfioxo, corroborando y complementado estudios previos. En vertebrados, sus ortólogos delinean distintos territorios cerebrales, contribuyendo con el concepto de bauplan neural gracias al modelo prosomérico. Nuestro principal objetivo fue determinar si el anfioxo podría constituir una aproximación a ese modelo, y en ese caso, en qué medida se podría definir un bauplan neural para cordados. Nuestros resultados revelan varios patrones de expresión discretos que discriminan tanto entre regionalización antero posterior como dorso ventral. En el caso de la regionalización antero posterior, los territorios Otx- y Gbx-positivos son fácilmente identificables pronto en el desarrollo, de la misma forma que ocurre en vertebrados. Dentro del territorio Otx-positivo, en la región se delimitan dos subdivisiones: el primordio del hipotálamo (HyP) y el primordio del di-mesencéfalo (DiMeP), la el límite entre las dos es conicidente con la aposición de los dominios de Fesf y Irx. Y, conjuntamente con el primordio rombo- espinal (RhSp), que se define en el territorio Gbx-positivo, las tres subunidades principales quedan delimitadas por las mismas barreras topológicas que definen equivalentes dominios moleculares, tanto en cefalocordados como en vertebrados. Además los límites entre las tres subunidades principales son coincidentes con el posicionamiento y desarrollo de los organizadores secundarios en vertebrados. Ésta correspondecia topológica entre la región tálamo-pretecto-mesencefálica con el DiMeP, simple o simplificado de anfioxo, sugiere que estas tres regiones en vertebrados, que están delimitadas y especificadas por los organizadores secundarios compartan origen evolutivo. Extendiendo las correlaciones y extrapolaciones que surgen de este studio genoarquitectónico, en esta tesis se describe un bauplan neural para cordados y se discuten otros temas relacionados con el origen y la evolución del complejo sistema nervioso central de vertebrados.
In this thesis we have studied thoroughly the genoarquitecture of the neural plate of amphioxus embryos. The expression of various genes have been studied variously in the neural primordium of Amphioxus but, there was no consensus about the morphological significance of the CNS regions that are distinguishable by characteristic molecular patterns. We have now analysed around fifty differentiation genes and transcription factors that are expressed in the neural anlage of amphioxus at the middle neurula stage, corroborating and complementing earlier reports. Homologs of the chosen markers delineate distinct brain territories in vertebrates, contributing to current concepts of the neural bauplan by means of the prosomeric model. Our main aim was to determine whether amphioxus in any way approximates that model, and whether if it can be defined a common neural bauplan for chordates. Our results revealed various discrete patterns discriminating along both the anteroposterior and dorsoventral dimensions (AP, DV). As regards AP expression patterns, Otx-positive versus Gbx-positive territories were early observable, as in vertebrates. The Otx-positive subregion is further partitioned by several markers in two major parts, which we named as primordial hypothalamus (HyP) and a primordial di-mesencephalon (DiMeP). And, along with the rhombospinal primordium (RhSP), that corresponds to the Gbx-positive territory, the three main subunits are delimited by the same topological boundaries, defining the same molecular limits, that define the secondary organizers in vertebrates. This topological correspondence between the thalamic-pretectal-mesencephalic region with the DiMeP in amphioxus suggests that this three regions in vertebrates, that are surrounded by the specifying effect of the secondary organizers, may share common ancestry. Extending the correlations that issue from this genoarquitectonic study, in this thesis, a neural bauplan for chordates is described, and other issues related with the origin and evolution of central nervous systems are debated.

La formació d’un sistema nerviós fou una innovació clau en l’evolució dels animals que va permetre desenvolupar una comunicació ràpida i eficient entre les cèl·lules d’un organisme a mesura que n’augmentava la complexitat. Analitzar la neurogènesi embrionària en el major nombre possible d’organismes és, per tant, necessari per reconstruir quin fou el mode ancestral de neurogènesi als metazous. Recentment s’ha descrit que el procés de formació d’aquest sistema d’òrgans pot ser acotat a una sèrie de passos discrets que estan controlats per xarxes gèniques comunes entre organismes model ben establerts. En general, el primer pas d’aquest procés es caracteritza per la separació de l’ectoderma neurogènic i epitelial durant la gastrulació de l’embrió; posteriorment, l’ectoderma neurogènic, o neuroectoderma, es regionalitza en els diferents eixos de coordenades i s’amplifica en quant a nombre de cèl·lules, i, finalment, dona lloc al sistema nerviós. Als Spiralia, un dels dos principals clades d’animals protòstoms, els estudis sobre les qüestions relacionades amb aquests processos s’han centrat als mol·luscs i anèl·lids mentre que poc se sap de la resta de fílums. Així doncs, en aquesta tesi ens hem plantejat utilitzar la planària d’aigua dolça Schmidtea polychroa, un platihelmint amb un sistema nerviós morfològicament simple, per a caracteritzar l’organogènesi dels sistemes nerviosos central, perifèric, i visual, i, posteriorment, analitzar alguns dels mòduls conservats de la neurogènesi dels organismes bilaterals. La nostra estratègia s’ha basat en l’estudi del marcatge amb anticossos neurals i amb l’anàlisi de l’expressió de gens pan-neurals i de subpoblacions neuronals per proposar un model de desenvolupament del sistema nerviós durant l’embriogènesi d’aquella espècie. Els resultats d’aquesta tesi demostren l’origen de novo a l’estadi 4 i a partir d’una població de cèl·lules embrionàries determinades d’aquell sistema d’òrgans; posteriorment, aquestes cèl·lules conjunten en un primordi nerviós bilateral situat al futur pol ventral de l’embrió que serà l’origen d’estructures nervioses com el cervell o els cordons nerviosos laterals i ventrals. A més, també hem determinat la dinàmica temporal i espaial de desenvolupament dels ulls durant l’embriogènesi més tardana; en concret, aquests òrgans es formen a la part més anterior de l’organisme i des d’una cèl·lula precursora comuna que, més tard, es separarà en els primordis de l’ull dret i esquerra. Finalment, hem aïllat i caracteritzat gens ortòlegs del grup soxB i un conjunt de membres dels bHLH proneurals, que són famílies gèniques amb un paper ben establert en la determinació de l’ectoderma neurogènic i l’especificació neuronal, així com també de gens associats amb la diferenciació dels ulls, com ara els membres de la xarxa gènica controlada per pax6 i també altres factors de transcripció com rx, otxA o atonal. L’anàlisi molecular d’aquests mostra, per una banda, que un ortòleg de la família soxB1 es detecta en el presumptiu neuroectoderma de l’embrió i en cèl·lules progenitores neuronals, mentre que els gens de les famílies soxB2, achaete-scute, neuroD i beta3, així com alguns dels gens relacionats amb el desenvolupament dels ulls, estan associats amb l’especificació de poblacions neuronals. En conjunt, els nostres resultats suggereixen que els principals mecanismes moleculars de control de la neurogènesi es troben substancialment conservats als tríclads, tot i que aquests animals mostren un patró embrionari que divergeix clarament de l’ancestral de la resta d’organismes espirals. En resum, la nostra tesi expandeix la comprensió actual de la neurogènesi dels animals bilaterals i, alhora, proporciona un marc bàsic per a futurs estudis sobre el desenvolupament embrionari de les planàries.
The development of a nervous system is a key innovation in the evolution of metazoans, which is illustrated by the presence of a common developmental toolkit for the formation of this organ system. Neurogenesis in the Spiralia, and in particular the Platyhelminthes, is, however, poorly understood when compared with other animal groups. In this thesis we used the planarian Schmidtea polychroa, a free-living flatworm with a morphologically simple nervous system, as a model organism for studying the organogenesis of the central, peripheral and visual nervous systems. Using a combination of immunolabelling and gene expression analysis of neural-specific markers we show that the nervous system is formed de novo from a population of embryonic cells when the embryo adopts the definitive axial identities. Later on, these cells aggregate in a bilateral neural primordium which differentiates the brain, and the ventral and lateral nerve cords. Also, during this late embryonic phase, the eyes develop in the anterior-most part of the organism from a shared precursor. To further understand the early steps of neurogenesis, we isolate and characterize soxB and a set of bHLH genes, which are gene families with a well-established role in metazoan neural development, and genes associated with the specification of eye cell types -in particular, the pax6-gene network and transcription factors of the otx and rx families. Thus, we demonstrate that soxB1-1 is expressed in the putative neuroectoderm and neural progenitor cells, whereas soxB2, neural bHLH genes (achaete-scute, neuroD and beta3), and the eye-related genes so, eya and otxA are associated with the specification of neural subpopulations. Altogether, our findings suggest that the ancestral neural-specific gene regulatory network is substantially conserved in triclad, despite exhibiting a divergent mode of development. In summary, this thesis expands the current understanding of bilaterian neurogenesis and provides a basic framework for further studies in planarian embryonic development.
La formación de un sistema nervioso fue una innovación clave en la evolución de los animales que permitió desarrollar una comunicación rápida y eficiente entre las células de un organismo a medida que aumentaba la complejidad. Analizar la neurogénesis embrionaria en el mayor número posible de organismos es, por lo tanta, necessario para reconstruir cual fue el modo ancestral de neurogénesis de los metazoos. Recientemente se ha descrito que ese proceso puede ser definido con un conjunto de pasos o etapas que están controlados por redes génicas comunes entre organismos modelo bien establecidos. En general, el primer paso de la neurogénesis implica la separación del ectodermo neurogénico y epitelial durante la gastrulación del embrión; posteriormente, el ectodermo neurogènico, o neuroectodermo, se regionaliza en los principales ejes de coordenadas y se amplifica en cuanto a número de células y, finalmente, da lugar a las células nerviosas. En los organismos del grupo de los Spiralia, uno de los dos principales clados de protóstomos, los estudios sobre temas relacionados con esas etapas se han centrado en los moluscos y anélidos mientras que poco se sabe del resto de filos del grupo. Así pues, en esta tesis doctoral nos hemos planteado utilizar la planaria de agua dulce Schmidtea polychroa, un platihelminto con un sistema nervioso morfológicamente simple, para caracterizar la organogénesis de los sistemas nerviosos central, periférico, y visual, y, posteriormente, analizar algunos de los módulos conservados de la neurogénesis de los organismos bilaterals. Inicialmente nuestra estrategia se basó en el estudio del marcaje con anticuerpos específicos neurales y con el análisis de la expresión de genes pan-neurales y de subpoblaciones neuronales para proponer un modelo de desarrollo del sistema nervioso durante la embriogénesis de esta especie. Los resultados de nuestra tesis demuestran el origen de novo en el estadio 4 y a partir de una población de células embrionarias determinadas del sistema nerviosos definitivo; más tarde, estas células se condensan en un primordio nervioso bilateral situado en el futuro polo ventral del embrión que será el origen de estructuras como el cerebro o los cordones laterales y ventrales. Además, también hemos determinado la dinámica temporal y espacial de desarrollo de los ojos durante las etapas más tardías de la embriogénesis: estos órganos se forman en la parte más anterior del embrión y a partir de unas células precursoras comunes que se separarán en los primordios de los ojos derecho e izquierdo. Por último, hemos aislado y caracterizado genes ortólogos del grupo soxB y un conjunto de miembros de los bHLH proneurales, que son familias génicas con un papel bien establecido en la determinación del ectodermo neurogénico y la especificación neuronal, y también de genes asociados con la diferenciación de los ojos, como por ejemplo los miembros de red génica controlada por pax6 y también otros factores de transcripción como rx, otx o atonal. Su análisis molecular muestra que un ortólogo del grupo soxB1 se detecta en el putativo neuroectodermo del embrión y en células progenitoras neuronales de S. polychroa, mientras que los genes de los grupos soxB2, achaete-scute, neuroD y beta3, así como algunos genes relacionados con el desarrollo de los ojos, están asociados con la especificación de diferentes poblaciones neuronales. En conjunto, nuestros datos sugieren que, a pesar de que los tríclados muestran un patrón de desarrollo del zigoto que difiere claramente del patrón típico de la segmentación espiral, los principales mecanismos moleculares de control de la neurogénesis se encuentran conservados en su grupo. En resumen, nuestra tesis doctoral expande la comprensión sobre el desarrollo del sistema nerviosos de los bilaterales a la vez que proporciona un marco básico para futuros estudios con embriones de planarias.

The bloom of genomic data has revealed a vast amount of gene losses across all life kingdoms. However, the impact of gene loss on the evolution of the mechanisms of embryo development remains an important challenge. In this work, we have used the successful gene loser Oikopleura dioica, to study the impact of gene loss on the evolution of the cardiopharyngeal gene regulatory network (GRN), and we have extrapolated our results to decipher the ancestral condition of tunicates as free-living or sessile, a hot topic of discussion. To address this question, we have searched for gene losses by combining best reciprocal blast hit (BRBH) with exhaustive phylogenetic reconstructions of the gene family of interest. We have also performed expression analyses of the present orthologs to test for their cardiac function as well as, in the case of lost orthologs, with paralogs trying to detect potential events of function shuffling. Finally, we performed functional analyses by inhibiting the FGF and BMP signaling pathways and started the implementation of a microinjection facility for future functional analyses by gene targeting. Our results show a clear deconstruction of the cardiopharyngeal GRN with the loss of many genes (Mesp, Ets1/2a, Gata4/5/6, Mek1/2, Tbx1/10, and RA- and FGF-signaling related genes) and cardiac subfunctions (FoxF, Islet, Ebf, Mrf, Dach, and Bmp signaling) crucial for cardiopharyngeal development in ascidians and vertebrates. All these losses have led to the dismantling of two genetic modules related to the maintenance of multipotency in the cardiopharyngeal precursors. This has been accompanied by the loss of the second heart field and pharyngeal muscles in appendicularians, which has been phenotypically translated into an open bilaminar heart with an accelerated development compared to the tubular heart present in the rest of chordates. The deconstruction of the cardiopharyngeal GRN in appendicularians can therefore be interpreted as an evolutionary adaptation to the transition from a sessile to a free-living lifestyle based on the innovation of the filter-feeding house. Therefore, our results show O. dioica as a paradigmatic example of the advantages of using species that along their evolution has lost many genes (evolutionary knockout models, eKO) to better understand the evolution of GRNs, mechanisms of embryo development, or any physiological adaptation in the absence of any given gene of interest.

El blenio de río (Salaria fluviatilis) es un pez de agua dulce de distribución circum-mediterránea que se encuentra amenazado en muchos de los países en los que se ha descrito. Con tal de aportar información útil para su conservación, en la presente tesis, se abordaron diferentes aspectos de comportamiento como: las estrategias reproductivas, el desarrollo embrionario en función del cuidado parental, la personalidad y la capacidad de aprendizaje. En cuanto a la estrategia reproductiva, los resultados obtenidos revelan que la ausencia de machos dominantes más grandes promueve el desarrollo en caracteres sexuales secundarios (CSSs) y la adopción de la táctica parental en los machos jóvenes, mientras que su presencia inhibe estos procesos. La escasez de nidos, por su parte, estimula el crecimiento de la cresta cefálica. El estudio de desarrollo embrionario muestra que los embriones mantenidos con los progenitores presentan un mayor volumen de saco vitelino, una menor altura de cabeza y una menor longitud de mandíbula al nacer que los embriones mantenidos sin los progenitores. Ello sugiere que la presencia de ambos padres (especialmente del macho, quién tiene un contacto próximo con las puestas y presenta cuidado parental) podría afectar el desarrollo de los embriones y por tanto debería mantenerse en los programas en cautividad. En el estudio de personalidad se investiga si el tiempo que tardan los machos en emerger de un refugio al estar expuestos a un entorno nuevo se relaciona con el desarrollo en CSSs. Se observa que los machos que tardan menos en asomarse del refugio presentan más tarde, durante la época reproductora, un mayor desarrollo de la cresta cefálica y que los que salen completamente del refugio crecen más en longitud. Por último, en el estudio de aprendizaje espacial, se observa que los machos aprenden el ejercicio antes que las hembras y se relaciona la rapidez de aprender de dichos machos con el desarrollo de su cresta cefálica. Todas estas observaciones permiten comprender mejor cómo se adapta la especie a su entorno y pueden aportar información relevante para la conservación in situ así como en el ámbito de la cría en cautividad y de las reintroducciones.
The river blenny (Salaria fluviatilis) is a freshwater fish inhabiting the circum-Mediterranean region that has been described as threatened in many of the countries where it occurs. In order to provide useful information for its conservation, in the present thesis, different aspects related to behaviour were approached: reproductive strategies, embryo development related to parental care, personality and learning capacity. Results concerning reproductive strategies show that the absence of larger dominant males promotes the secondary sexual characteristics (SSCs) development and the parental status acquisition in young males, while their presence inhibits these processes. Nest limitation, meanwhile, stimulates the cephalic crest growth. Embryo development study reveals that embryos maintained with progenitors have a major yolk sac volume, a minor head height and a minor jaw length at birth than the embryos maintained without progenitors. This suggests that the presence of both parents (specially the male, who has a close contact with clutches and exhibit parental care) could affect embryo development and therefore should be maintained in captivity programs. In the study about personality, it is explored if the time to emerge from a refuge when exposed to a novel environment is related to SSCs development. Males that emerge faster from the refuge present later, during reproductive period, a major development of the cephalic crest, and those who exit completely the refuge grow more in body length. Finally, in the spatial learning study, it is observed that males learn faster the task than females and their rapidity to learn is associated to the cephalic crest development. All these observations allow us to understand better how this species adapts to the environment and might provide relevant information for the conservation in situ, captive breeding and reintroduction programs.

La morfogènesi dels organismes multicel•lulars depèn de la coordinació de varies vies moleculars capaces de controlar i coordinar diverses característiques cel•lulars com ara la seva proliferació, diferenciació, morfologia i migració. En particular, la migració i el guiatge cel•lulars són dos processos essencials durant la morfogènesi que requereixen una coordinació temporal i espacial molt precisa per a que las cèl•lules puguin establir connexions a llargues distàncies. Conèixer la seva regulació és crucial per entendre el desenvolupament normal dels organismes multicel•lulars i els processos de carcinogènesi. La morfogènesi del sistema traqueal i del sistema nerviós de Drosophila melanogaster són models àmpliament utilitzats per estudiar la migració i el guiatge cel•lular en la morfogènesi. Es va procedir a l’anàlisi d’una col•lecció de mutants embrionaris identificats pels seus fenotips en el sistema nerviós a fi de detectar fenotips traqueals. Un d’aquests mutants es va mapejar com un al•lel de patched (ptc), receptor de la via de senyalització de Hedgehog (Hh), i hem analitzat la contribució d’aquest en el sistema traqueal, i en particular, la seva implicació durant la migració i el guiatge cel•lular. En concret, l’objectiu del nostre estudi va ser el fet que en els embrions mutants de ptc, les branques ganglionars (BGs) no estenen fins arribar al sistema nerviós central, tal i com passa en els embrions wt. Vam detectar que el nombre de cèl•lules que constitueix l’arbre traqueal en els mutants de ptc és un 35% menor que en els embrions wt, fet que no és degut a apoptosi, ja que no hem detectat activitat de la caspasa, i el fet de tenir menys cèl•lules tampoc és el causant de la falta de migració de les BGs. El fenotip traqueal dels embrions de ptc ja és visible a estadis primerencs de l’embriogènesi, com 12 i 13, en els que les BGs comencen a mostrar defectes de migració/extensió, i mostren un nombre més elevat de cèl•lules positives per DSRF (factor de transcripció que s’expressa en les cèl•lules terminals), en comparació amb els embrions wt. L’activació o la inactivació de la via de senyalització de Hh només en les cèl•lules de la tràquea, ja sigui utilitzant formes actives o inactives, no mostra cap fenotip, la qual cosa suggereix un requeriment no-autònom de les cèl•lules de la tràquea pel que fa la via de senyalització de Hh. A més, la sobreexpressió de Hh en la regió embriònica ventral, reprodueix el fenotip de la migració/extensió de les BGs. Per aquesta raó, vam analitzar l’expressió de branchless (bnl), el lligand de la via de FGF, en mutants embrionaris de ptc, on la migració no té lloc correctament. A través d’anàlisis d’hibridacions in situ i de quantificacions amb la RT-PCR, vam poder detectar nivells més alts d’expressió de bnl en embrions mutants de ptc en comparació amb el wt. En paral•lel al projecte de Ptc en el sistema traqueal, com que ja havíem observat alguns fenotips en el sistema nerviós, vam decidir analitzar més curosament les observacions que havíem fet en la sobreexpressió de Hh en la línia mitjana. És sabut que en vertebrats, el morfogen Shh actua com un quimioatraient d’axons que col•labora amb la Netrin-1 pel guiatge d’aquests en la placa del terra. Nosaltres hem pogut demostrar que en Drosophila es produeix el mateix efecte, ja que si sobreexpressem el morfogen tant en la línia mitjana utilitzant sim o fora de la línia mitjana utilitzant Apterous (Apt) com a driver, es confirma l’efecte de Hh com a molècula de guiatge axonal.
We have analysed the tracheal phenotype of patched (ptc) mutant embryos to clarify the involvement of Ptc in tracheal development, in particular its role in cell migration and pathfinding. One of the main points of interest is the fact that in ptc mutants the ganglionic branches (GB) do not invade the ventral nerve cord as they do in the wild-type (wt). We found that the number of cells that constitute the tracheal tree in the mutant is slightly lower than in wt but these changes in cell number are not due to apoptosis, as we cannot detect any additional caspase activity in mutant embryos, and, in addition, these lower numbers of cells are not sufficient to prevent the extension of the GBs. The ptc tracheal phenotype is already visible by stage 12 and 13 of embryogenesis when the GBs start showing defects in migration/extension, and show higher number of DSRF positive cells, compared to the wt. Embryonic Ptc protein expression and activation or inactivation of the Hh pathway in tracheal cells alone, either using active or inactive forms, does not show a phenotype, suggesting a non-autonomous requirement for the Hh pathway in tracheal cells. In addition, overexpression of Hh in the embryonic ventral region, phenocopies the GB migration/extension phenotype. For these reasons, we have analysed the expression of Branchless (Bnl), the FGF ligand, in ptc mutant embryos, where migration is not properly occurring. By using in situ hybridisation and RT-PCR we have found that wt and ptc mutants show different levels of bnl expression, these being higher in ptc mutants than in wt embryos. In parallel of the Ptc project in the tracheal system, and since we already knew and have observed some phenotypes in the nervous system, we decided to further analyse some observations we have done while overexpressing Hh in the midline. It is reported that in vertebrates the morphogen Sonic Hedgehog acts as an axon chemoattractant that collaborates with Netrin-1 in midline axon guidance at the level of the floor plate. We have been able to demonstrate that the same is occurring in Drosophila. We could see the same effect while overexpressing the morphogen outside the midline using Apterous (Apt) as a driver, confirming the effect of Hh as a guidance molecule.

Робота присвячена проблемі з’ясування механізмів морфогенезу та формування серця і плаценти ембріона щура, зумовлених дією електромагнітного випромінювання. Проведено узагальнення щодо позитивного впливу НВЧ-випромінення та негативного впливу СВЧ-випромінення на кардіогенез щура та плаценту в експерименті. Визначено спектр вад серця та аномалій розвитку і формування плаценти після дії СВЧ-випромінювання. Дослідження проводилися на серцях ембріонів, плацент щурів у кількості 380 з використанням морфологічних методів дослідження. Кількісно оцінені структурні зміни в різних відділах ембріонального серця щура: передсердях, шлуночках, атріовентрикулярних та півмісяцевих клапанах, міжпередсердній та міжшлуночковій перегородках і ворсин хоріона плаценти після впливу електромагнітного випромінювання. Для виявлення змін під час основних гістогенетичних процесів використано імуногістохімічні та лектиногістохімічні маркери. Накопичення маркерів проліферації та апоптозу дало можливість співставити процеси проліферація – апоптоз у нормі та виявити та підтвердити зміни в моделях експерименту. Виявлення маркерів судинного ендотелію та маркера гладенької м’язової тканини дало можливість визначити основні терміни та етапи васкулогенезу і диференціювання первинних судин серця та плаценти. Перерозподіл рецепторів лектинів на поверхності клітин пояснює гетерогенність з’язування лектинів адгезії та міграції в тканині серця та зміни їх накопичення після впливу електромагнітного випромінювання. Вплив тератогену СВЧ-випромінювання визначив наявність термінаційних періодів кардіогенезу та плацентації, коли спостерігається пряма залежність процесів септації та плацентації від впливу фізичного фактора.

Cited2 is a member of the Cited gene family, which has no homology to any other genes. It encodes a transcriptional co-factor that is expressed during early heart formation (cardiogenesis). Embryos lacking Cited2 display a range of cardiac defects including bilaterally identical atria, aortic arch abnormalities, rotation of the aorta and pulmonary artery, and malseptation of the cardiac chambers. The latter results in communication between the aorta and pulmonary artery, the aorta and both ventricles, and the atria and ventricles (with themselves and each other). Cardiogenesis is complex, and requires many different cell types and processes to occur correctly. Some of these cells and processes are external to the primary heart. For example, once the initial muscle cells of the heart form a tube, cells from other regions such as the secondary heart field (adjacent mesoderm) and cardiac neural crest (ectoderm) migrate into this tube, and are required for the formation of additional muscle cells and septa. Furthermore, cardiogenesis also requires correct left-right patterning of the embryo to be established prior to heart formation. To understand the developmental origins of the cardiac defects observed in Cited2-null embryos, the expression pattern of Cited2 and the anatomy of Cited2-null embryo hearts were studied. Subsequently, the expression of genes required for left-right patterning were studied in both Cited2-null and Cited2 conditionally-deleted embryos. This demonstrated that Cited2 may be required in many, possibly all, of the processes required for cardiogenesis. Next this study focused on the role of Cited2 in patterning the left-right axis of the embryo. Firstly, Cited2 was found to regulate the expression of the master regulator of left-right patterning (Nodal). Secondly, Cited2 was shown to regulate the expression of the left-specific transcription factor Pitx2 independently of Nodal. Thirdly, gene expression and conditional deletions of Cited2 suggested that Cited2 might regulate left-right patterning in the paraxial mesoderm, a tissue which has not previously been shown to regulate the left-right axis in the mouse. Lastly, an argument is made suggesting the possibility that all the cardiac defects found in Cited2-null embryos may directly or indirectly stem from a failure of correct left-right patterning.