Academic literature on the topic 'EMATOPOIETICO'

Haematopoietic stem and progenitor cells have been successfully used for autologous and al- logeneic transplantations for many years. Quantitative and qualitative laboratory assays allow controlling di erent cellular products during collection, concentration and preservation. The in- formation about cell number, viability, functionality and purity of the gra ensure safe applica- tion and help predict the likelihood of successful engra ment. Almost 50 years of research have disclosed the great heterogeneity of cells that exhibit a haematopoietic di erentiation potential. This will enable the identification of subpopulations within the population of CD34-positive ha- ematopoietic stem cells.

Negli ultimi anni, l’editing genetico nelle cellule staminali/progenitrici ematopoietiche umane (HSPC) per il trattamento di malattie genetiche del sangue è migliorato drasticamente trasformando inserzioni genetiche casuali in precise e mirate modificazioni del genoma. La modifica mirata dei geni mutati ereditati consente la correzione in situ e la ricostituzione funzionale con il mantenimento del controllo endogeno dell'espressione. Recentemente abbiamo dimostrato che sia le rotture del DNA a doppio filamento indotte dall’editing che il genoma stesso dell’Adeno-Associated Virus 6 (AAV) innescano una risposta dipendente da p53 nell'HSPC che risulta in un ritardo della proliferazione con conseguente diminuzione della ricostituzione ematopoietica dopo il trapianto delle cellule editate in animali immuno-compromessi. Per cui, abbiamo quindi dimostrato come la soppressione di questa risposta mediante l’espressione transitoria della forma negativa dominante di p53 preservi la ricostituzione del lineage ematopoietico. Tuttavia, la biologia sottostante è rimasta sconosciuta, così come l'impatto dell'editing genetico sulle dinamiche clonali dell'HSPC modificate con riparo diretto per omologia (Homology Directed Repair, HDR) al momento del trapianto. Inoltre, lo stato quiescente delle HSC primitive costituisce un limite per l’editing genetico mediato da HDR, riducendo le sue possibili applicazioni cliniche. In questo lavoro, abbiamo prima superato tale limite esprimendo transitoriamente la proteina dell'adenovirus 5 E4orf6/7, che regola il principale controllore del ciclo cellulare, E2F, insieme alla nucleasi. Mediante un'analisi dell'espressione genica globale e mirata, abbiamo dimostrato come E4orf6/7 spinga le cellule in fase S/G2 con concomitante sovra-regolazione di tutti i principali componenti del macchinario HDR, aumentando così l'efficienza dell'inserimento del transgene in cellule precedentemente quiescenti. Nel contesto dello xenotrapianto, l'espressione combinata di E4orf6/7 e l'inibizione di p53 hanno migliorato l'efficienza del HDR (>50%) all'interno dell'innesto umano totale, superando i livelli riportati fino ad ora in letteratura. Tale risultato è stato riprodotto in diversi donatori da diverse fonti di HSPC e sono stati modificati più loci genomici, dimostrando la maggior versatilità di questa piattaforma se paragonata ad altre strategie di editing. In parallelo, abbiamo ideato una nuova tecnologia (BAR-seq) che consente il monitoraggio clonale di singole HSC modificate con HDR. Questo approccio prevede l’introduzione di un codice a barre ereditabile univoco (BAR) nel templato AAV6 necessario al HDR. Il sequenziamento ad alta copertura di tali sequenze negli xenotrapianti ha mostrato come l’editing genetico risulti in un attecchimento di pochi cloni dominanti. Mentre l'inibizione transitoria di p53 durante l’editing ha consentito un aumento sostanziale della composizione clonale dell'innesto senza alterare la capacità ripopolante delle HSC. Inoltre, questi dati suggeriscono come la risposta mediata da p53 sia responsabile di un'ematopoiesi oligoclonale. È importante sottolineare che il BAR-seq ha fornito la prima prova diretta che le HSC umane modificate con HDR mantengono un potenziale multilineage e subiscono più cicli di divisioni simmetriche e asimmetriche nei trapianti primari e secondari. In conclusione, auspichiamo che i miglioramenti messi a punto nel nostro protocollo di editing possano ampliare le possibili applicazioni cliniche dell’editing genetico.
The scope of genome engineering in hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs) has broadened from random to precise genome insertions for treating genetic diseases of the blood lineages. Targeted editing of inherited mutant genes allows in situ correction and functional reconstitution with preserved expression control. We recently showed that both the induced double-strand DNA breaks and the AAV6 genome trigger a p53-dependent DNA damage response in HSPC delaying proliferation and decreasing hematopoietic reconstitution after xenotransplantation. Suppression of this response by transient expression of a dominant negative p53 released cell-cycle block and rescued hematopoietic reconstitution. Yet, the underlying biology remained unknown as well as the impact of gene editing on clonal dynamics of HDR-edited HSPC upon transplantation. Moreover, it has long been contended that the quiescence of primitive HSC constrains HDR-mediated gene editing, thus limiting its perspective clinical applications in several diseases. Here, we first overcame such constraints by transiently expressing the adenovirus 5 protein E4orf6/7, which operates the major cell cycle controller E2F, together with the nuclease. By global and targeted gene expression analysis we showed engagement of targeted cells in S/G2 phases with concomitant upregulation of all major components of the HDR machinery, thus increasing the efficiency of targeted transgene insertion. Combined E4orf6/7 expression and p53 inhibition enhanced >50% HDR efficiency within human graft surpassing the levels reported until now in the literature. Such outcome was reproducible across several HSPC donors and sources, genomic loci and conceivably portable to most types of editing platforms. In parallel, we devised a novel technology (BAR-seq) which enables clonal tracking of individual HDR-edited HSC by introducing a unique heritable barcode in the AAV6 template. Deep sequencing of integrated BARs in human hematochimeric mice showed that only few (5-10) dominant clones of edited HSC robustly contributed to the hematopoietic graft long-term after transplant. Transient p53 inhibition during editing enabled substantial increase in polyclonal graft composition without altering individual HSC output, thus explaining the improved engraftment and highlighting the p53-mediated response as culprit of an otherwise oligoclonal hematopoiesis. Importantly, BAR-seq provided the first direct evidence that human HDR-edited HSC maintain multilineage potential and undergo multiple rounds of symmetric and asymmetric divisions in primary and secondary xenogeneic hosts. Altogether, we expect that the substantial gains obtained in HDR efficiency and polyclonal repopulation by our improved editing protocol should broaden applicability of HSC gene editing and pave its way to clinical translation.

Oltre alla progressiva perdita dei linfociti T CD4, i pazienti HIV-infetti presentano diverse citopenie periferiche. In particolare l’anemia si riscontra nel 10% dei pazienti asintomatici e nel 92% di quelli con AIDS e la terapia cART non è in grado di risolvere tale problematica. I meccanismi patogenetici alla base di questa citopenia si ritiene che possano riguardare la deregolazione citochinica, il danno alle HPCs, alle cellule in differenziamento e alle cellule stromali. Le cellule progenitrici ematopoietiche CD34+, dopo essere state separate da sangue cordonale e differenziate verso la linea eritroide, sono state trattate con HIV-1 attivo, inattivato al calore e gp120. In prima istanza è stata messa in luce la mancata suscettibilità all’infezione e l’aumento dell’ apoptosi dovuto al legame gp120-CD4/CXCR4 e mediato dal TGF-β1 nelle cellule progenitrici indifferenziate. L’aspetto innovativo di questo studio però si evidenzia esaminando l’effetto di gp120 durante il differenziamento verso la filiera eritrocitaria. Sono stati utilizzati due protocolli sperimentali: nel primo le cellule sono inizialmente trattate per 24 ore con gp120 (o con HIV-1 inattivato al calore) e poi indotte in differenziamento, nel secondo vengono prima differenziate e poi trattate con gp120. Il “priming” negativo determina una apoptosi gp120-indotta molto marcata già dopo 48 ore dal trattamento ed una riduzione del differenziamento. Se tali cellule vengono invece prima differenziate per 24 ore e poi trattate con gp120, nei primi 5 giorni dal trattamento, è presente un aumento di proliferazione e differenziamento, a cui segue un brusco arresto che culmina con una apoptosi molto marcata (anch’essa dipendente dal legame gp120-CD4 e CXCR4 e TGF-β1 dipendente) e con una drastica riduzione del differenziamento. L’insieme dei risultati ha permesso di definire in modo consistente la complessità della genesi dell’anemia in questi pazienti e di poter suggerire nuovi target terapeutici in questi soggetti, già sottoposti a cART.
Beside the CD4 T cells progressive loss, HIV-infected subjects exhibit some peripheral cytopenias. In particular, anemia is found in 10% of asymptomatic and in 92% of AIDS patients and cART therapy is not able to solve this problem. The pathogenic mechanisms underlying this cytopenia are related to cytokine dysregulation, damage of HPCs, impairment of stromal cells and inhibition of the differentiation of HPCs. The CD34+ hematopoietic progenitor cells were separated from cord blood, differentiated towards the erythroid lineage and treated with active HIV-1, heat-inactivated virus and gp120. First of all we demonstrate that HPCs are not susceptible to infection and the gp120-CD4/CXCR4 binding cause a TGF-β1 mediated apoptosis. The innovative aspect of this study, however, is evident examining the effect of gp120 during differentiation towards the erythrocyte. Two experimental protocols are used: in the first cells are initially treated for 24 hours with gp120 ( HIV-1 or with heat-inactivated ) and then induced into differentiation, in the second cells are firstly differentiated and then treated with gp120. The negative "priming" induces a gp120-mediated apoptosis 48 hours after treatment and a differentiation reduction. If these cells are instead primarily differentiated for 24 hours and then treated with gp120, in the first 5 days after treatment, there is an increase of proliferation and differentiation, which is followed by a very marked apoptosis (also TGF-β1 mediated and due to gp120-CD4/CXCR4 binding) and a drastic reduction of differentiation. These results allowed us to define the complexity of the genesis of anemia in these patients and suggest new therapeutic targets for these subjects already receiving cART .

Oltre alla progressiva perdita dei linfociti T CD4, i pazienti HIV-infetti presentano diverse citopenie periferiche. In particolare l’anemia si riscontra nel 10% dei pazienti asintomatici e nel 92% di quelli con AIDS e la terapia cART non è in grado di risolvere tale problematica. I meccanismi patogenetici alla base di questa citopenia si ritiene che possano riguardare la deregolazione citochinica, il danno alle HPCs, alle cellule in differenziamento e alle cellule stromali. Le cellule progenitrici ematopoietiche CD34+, dopo essere state separate da sangue cordonale e differenziate verso la linea eritroide, sono state trattate con HIV-1 attivo, inattivato al calore e gp120. In prima istanza è stata messa in luce la mancata suscettibilità all’infezione e l’aumento dell’ apoptosi dovuto al legame gp120-CD4/CXCR4 e mediato dal TGF-β1 nelle cellule progenitrici indifferenziate. L’aspetto innovativo di questo studio però si evidenzia esaminando l’effetto di gp120 durante il differenziamento verso la filiera eritrocitaria. Sono stati utilizzati due protocolli sperimentali: nel primo le cellule sono inizialmente trattate per 24 ore con gp120 (o con HIV-1 inattivato al calore) e poi indotte in differenziamento, nel secondo vengono prima differenziate e poi trattate con gp120. Il “priming” negativo determina una apoptosi gp120-indotta molto marcata già dopo 48 ore dal trattamento ed una riduzione del differenziamento. Se tali cellule vengono invece prima differenziate per 24 ore e poi trattate con gp120, nei primi 5 giorni dal trattamento, è presente un aumento di proliferazione e differenziamento, a cui segue un brusco arresto che culmina con una apoptosi molto marcata (anch’essa dipendente dal legame gp120-CD4 e CXCR4 e TGF-β1 dipendente) e con una drastica riduzione del differenziamento. L’insieme dei risultati ha permesso di definire in modo consistente la complessità della genesi dell’anemia in questi pazienti e di poter suggerire nuovi target terapeutici in questi soggetti, già sottoposti a cART.
Beside the CD4 T cells progressive loss, HIV-infected subjects exhibit some peripheral cytopenias. In particular, anemia is found in 10% of asymptomatic and in 92% of AIDS patients and cART therapy is not able to solve this problem. The pathogenic mechanisms underlying this cytopenia are related to cytokine dysregulation, damage of HPCs, impairment of stromal cells and inhibition of the differentiation of HPCs. The CD34+ hematopoietic progenitor cells were separated from cord blood, differentiated towards the erythroid lineage and treated with active HIV-1, heat-inactivated virus and gp120. First of all we demonstrate that HPCs are not susceptible to infection and the gp120-CD4/CXCR4 binding cause a TGF-β1 mediated apoptosis. The innovative aspect of this study, however, is evident examining the effect of gp120 during differentiation towards the erythrocyte. Two experimental protocols are used: in the first cells are initially treated for 24 hours with gp120 ( HIV-1 or with heat-inactivated ) and then induced into differentiation, in the second cells are firstly differentiated and then treated with gp120. The negative "priming" induces a gp120-mediated apoptosis 48 hours after treatment and a differentiation reduction. If these cells are instead primarily differentiated for 24 hours and then treated with gp120, in the first 5 days after treatment, there is an increase of proliferation and differentiation, which is followed by a very marked apoptosis (also TGF-β1 mediated and due to gp120-CD4/CXCR4 binding) and a drastic reduction of differentiation. These results allowed us to define the complexity of the genesis of anemia in these patients and suggest new therapeutic targets for these subjects already receiving cART .

In questi ultimi anni è stata prospettata la potenzialità trapiantologica e validata la procedura di espansione ex-vivo delle cellule staminali ematopoietiche isolate da sangue di cordone ombelicale (SCO). Diverse esperienze, in particolare in ambito pediatrico, hanno confermato la fattibilità clinica del trapianto di sangue placentare, da donatore correlato e non, determinando un crescente interesse per questa fonte emopoietica alternativa. I limiti maggiori sono costituiti dal numero insufficiente di cellule staminali e/o progenitori emopoietici presenti nelle unità placentari che risultano, inadeguate, a trapiantare pazienti adulti, essendo in genere sufficienti per il trapianto in un paziente pediatrico. Recentemente è stato dimostrato che IL-16, il ligando naturale del recettore CD4, capace di modulare la migrazione e l’attività delle cellule CD4+, è capace di indurre la proliferazione e la differenzazione delle cellule CD34+. Sebbene le cellule CD34+ presentino sulla loro superfice Il CD4, il ruolo funzionale dell’IL-16 non è ancora stato ben definito. Nel presente studio, abbiamo investigato il ruolo dell’IL-16 nella espansione ex vivo delle cellule staminali e/o progenitrici nelle SCO. A questo scopo, cellule CD34+ isolate da SCO sono state coltivate in vitro in presenza di: stem cell factor (SCF), trombopoietina (TPO), e flt-3 ligand (FL) utilizzati come cocktail di base in presenza o in assenza di IL-16. Dopo 7 e 14 giorni di coltura sono state valutate il numero totale delle cellule nucleate, l’attività clonogenica (unità formanti colonie [CFC]), sono state allestite colture a lungo termine ( Dexter modificato [LTC]) in cui sono state valutate la potenzialità differenziativa (cellule mieloidi e linfoidi B ed NK). Inoltre è stato valutato il ruolo dell’IL-16 nel ciclo cellulare e nell’apoptosi. I progenitori CD34+ espansi in presenza di IL-16 presentano una aumentata espressione dell’inibitore del ciclo cellulare p21cip/waf1, e della proteina antiapoptotica BCL-2. Questi risultati indicano che l’IL-16 non solo incrementa l’espansione delle cellule staminali e/o progenitori, ma conserva anche il compartimento delle cellule staminali. Questi dati costituiscono importanti informazioni sia da un punto di vista biologico che per future applicazioni cliniche.
Ex-vivo expansion of cord blood, a source of hematopoietic stem cells, has been suggested as a strategy for both transplantation and gene therapy application. Umbelical cord blood (UCB) from related and unrelated donors has emerged as novel source of stem cell for patients requiring allogenic transplantation. Although UCB contains hematopoietic progenitor cells at a higher frequency and with a higher proliferative capacity than adult-derived bone marrow, the low number of total hematopoietic stem cell contained in one UCB graft limits the potential for rapid hematologiacl recovery in adult patients. Allogeneic transplantation with umbelical cord blood is limited in adult recipients by a low CD34+ cell dose. The natural ligand for CD4 receptor is IL-16, characterized as an immunomodulatory cytokine that contributes to the regulatory process of CD4+ cell recruitment and activation at site of inflammation. Although it is known that CD34+ hematopoietic progenitors express CD4 on their surface, the functional role of IL-16 on these cells is still poorly defined. The objective of this study was to investigate the role of interleukin IL-16 for the ex-vivo expansion of cord blood cells. The results suggest a new role of IL-16 in the induction of the CD34+ hematopoietic cells from cord blood to ex-vivo expansion. After 7-14 days of ex-vivo expansion by adding IL-16 to the basal cocktail (a combination of early acting cytokines together), the total cells population, the CFC, the LTC increase more as compare to the basal cocktail alone.Importantly, early CD34+ progenitors from cultures expandend with IL-16 demostrated higher cytoplasmic expression of the cell-cycle inhibitor, p21cip1/waf1, and the antiapoptotic protein BCL-2, compared with UCB expanded in cytokines alone, suggesting improved maintenance of stem cell function in the presence of IL-16. Taken together, these results strongly suggest that the addition of IL-16 provides improved conditions for expansion of early UCB CD34+ and may serve to inhibit their differentation and rates of apoptosis during short-term in vitro expression.

Il lavoro descritto in questa tesi si focalizza sullo studio delle interazioni tra i vettori virali e le cellule ematopoietiche staminali umane nel contesto della terapia genica, studiando sia i meccanismi di immunità innata attraverso cui i vettori virali vengono riconosciuti dalla cellula ospite, sia il ruolo di fattori di restrizione antivirali che ostacolano la trasduzione nelle cellule ematopoietiche staminali.
The work described in this thesis focuses on the study of vector-host interactions in the context of human hematopoietic stem cell gene therapy. We study the innate immune sensing mechanisms of viral vectors and the role of host antiviral restriction factors in the poor permissivity of hematopoietic stem cells to viral transduction.

Background. Several studies have shown that patients undergoing HSCT in pediatric age may manifest issues on different areas, psychological, social and medical (Khera et al., 2012; Syrjala et al., 2012). Few studies have focused on simultaneous analysis of quantitative data with qualitative data (Bingen et al., 2012). The aim of this study is to analyze the perception of illness experience in patients, survivor, and their families. Another aim of the study is to correlate qualitative with quantitative data. Method. Three different populations were asked to answer an open-ended single question about subjective experience of the disease by writing a brief composition. For the first group (Group A), composed by pediatric patients, their parents and siblings, the brief composition was collected before HSCT and one year after the transplantation. In the same way, psychological problems, of the patients and their siblings, were detected with the Child Behavior Checklist 6-18 (CBCL) (Achenbach and Rescorla, 2001) and the HRQoL of parents with the 36-Item Short Form Health Survey (SF-36). The second group (Group B) was composed by survivors, their parents and siblings at least 5 years after HSCT. CBCL was used for the identification of psychological problems in survivors. The third group (Group B-over) included adult subjects undergoing HSCT in pediatric age, at least 5 years after transplantation; the HRQoL was evaluated, for this group, using the SF-36. Socio-demographic and medical data were also collected. For the qualitative analysis of brief composition was used the software T-LAB (Ver. 8.1.4; Lancia 2012), which is capable of connecting evaluation of quantitative data, collected with the use of psychometric questionnaires, with qualitative data, obtained through the brief compositions. Results For the Group A 47 compositions were obtained in T0 and 27 in T1. Abnormal scores in the investigated scales of the CBCL (internalizing problems, externalizing problems) and the SF-36 (Mental Health) recurrently shows some semantic groups. In the waiting for HSCT are frequent lemmas as OTHER_CHILDREN_SICK, OTHER_PARENTS, UNCERTAINTY, DESPAIR, MD_INSTRUMENTS, HSCT and WITH_TOGETHER. Instead, one year after transplant, the lemmas, that are easily used, were ANXIETY_ANGUISH, ACCUSTOM, GOD, LUCK, TOO_MUCH and DEATH. The absence of abnormal scores, in the investigated scales, are related to different semantic themes such as WAIT, DO_NOT_SEE, WHY, SUCCEED, REACT, FACE, UNITED. A year away instead there are lemmas as HELP, FORCE, MOTHER, FATHER, MET_WAR, SERENITY. For Group B 98 compositions were obtained. Abnormal scores of the CBCL scales investigated (Internalizing Problems, Externalizing Problems, Total Problems) show a recurrence with semantic themes such as SIBLINGS, SICK_CHILD, HEALTHY_CHILD, MOTHER, BATTLE. High Scores instead were more correlated with themes such as DESCRIBE, THINKING, MENTAL and DEATH. For the Group B-over 18 brief composition were obtained. We can detect the differences between the genders as males focus more on lemmas such as BODY, CANCER_TREATMENT, OPERATION_MD, MEDICAL_TREATMENT, TEST_MD, while females focuses on semantic themes such as MOTHER, PEOPLE, DONOR, SIBLINGS, FATHER, PSYCHOLOGISTS, MD. Abnormal scores of SF-36 questionnaire (General Health scale) are correlated with the group of patients undergoing autologous HSCT and lemmas such as BODY, CANCER_TREATMENT, OPERATION_MD, TOO_MUCH. High Scores instead are related to keywords like MOTHER, FATHER, PEOPLE, DONOR, SUPPORT and with an allogeneic transplant un-related donor. Conclusion. The first group shows significant differences in the narrations between the various members of the family group even when comparing the scales of the questionnaires used. These differences, present during both stages of the research, indicate that the unit or division of the family, as well as the attitude of acceptance of the disease and how the disease is faced, have an important impact on the mental health status of family members. The family separation, as well as all expressions referring to the disease as a fight, battle and war, appear as a fundamental semantic core in the second group for abnormal scores of the scales investigated. The third group shows significant differences respect to the gender and the type of HSCT. In general we can assume that the care approach should have a particular focus on how the disease acts on the family relationship of all its components.
Premesse. Numerosi studi hanno mostrato come i pazienti sottoposti a HSCT in età pediatrica possano manifestare alcune problematicità su diversi ambiti, come quello psicologico e sociale oltre che su quello medico (Khera et al., 2012; Syrjala et al., 2012). Pochi studi si sono concentrati sull’analisi simultanea di dati quantitativi con dati qualitativi (Bingen et al., 2012). Lo scopo di questo studio è quello di analizzare la percezione dell’esperienza di malattia sia nei pazienti, o survivor, che nei loro familiari. Altro scopo è quello di correlare dati di natura qualitativa con dati di natura quantitativa. Metodo. Abbiamo chiesto a tre popolazioni differenti di soggetti di rispondere ad una singola domanda aperta con una breve composizione scritta rispetto alla loro esperienza di malattia. Per il primo gruppo (Gruppo A), che ha compreso pazienti pediatrici, genitori e fratelli tale scritto è stato raccolto prima del trapianto e ad un anno da questo. In maniera medesima sono state indagate eventuali problematiche psicologiche nei pazienti e nei loro fratelli mediante il questionario Child Behavior Checklist 6-18 (CBCL) (Achenbach and Rescorla, 2001) e la QdV per i genitori attraverso il 36-Item Short Form Health Survey (SF-36). Il secondo gruppo (Gruppo B) invece ha compreso ex-pazienti pediatrici e i loro familiari testati a cinque anni dal trapianto. È stato utilizzato il questionario CBCL per l’individuazione di problematiche psicologiche negli ex-pazienti. Il terzo gruppo (Gruppo B-over) ha compreso soggetti adulti sottoposti a HSCT in età pediatrica, ad almeno 5 anni distanza dal trapianto, per questo gruppo è stata valutata anche la QdV mediante il questionario SF-36. Dati socio-demografici e sanitari sono stati raccolti. Per le analisi qualitativa dei testi è stato utilizzato il software T-LAB (Ver. 8.1.4; Lancia, 2012), che permette anche la valutazione congiunta di dati quantitativi raccolti mediante i test psicometrici e i dati qualitativi ottenuti attraverso le composizioni scritte. Risultati. Per il gruppo A sono stati raccolti 47 testi in T0 e 27 testi in T1. Punteggi anomali nelle scale indagate della CBCL (Problemi Internalizzanti, Problemi Esternalizzanti) e del SF-36 (Salute mentale) indicano in maniera ricorrente alcuni nuclei semantici. Nell’attesa del trapianto sono frequenti lemmi come ALTRI_BAM_MALATI, ALTRI_GENITORI, INCERTEZZA, DISPERAZIONE, MD_OGGETTI, HSCT E CON_INSIEME. Ad un anno di distanza invece i lemmi che facilmente ricorrono sono ANSIA_ANGOSCIA, ABITUARE, DIO, FORTUNA, MOLTO_TANTO e MORTE L’assenza di punteggi anomali nelle scale indagate invece si correlano a temi semantici differenti come ATTESA, NON_VEDERE, PERCHE_MOT, RIUSCIRE, REAGIRE, AFFRONTARE, UNITI. Ad un anno di distanza invece vi sono lemmi come AIUTO_AIUTARE, FORZA, MAMMA, PAPA, MET_GUERRA, SERENITA. Per il gruppo B sono stati ottenuti 98 scritti. I punteggi anomali delle scale indagate mediante la CBCL (Problemi Internalizzanti, Problemi Esternalizzanti, Problemi Totali) indicano una ricorrenza con temi semantici come FRATELLO_SORELLA, FILGIO_A, FIGLIO_SAN, MAMMA, BATTAGLIA. Punteggi migliori invece correlano maggiormente con temi come DESCRIVERE, PENSARE, PSICHICO_MENTALE, MORTE. Per il gruppo B-over invece sono stati ottenuti 18 brevi scritti. Possiamo rilevare delle differenze tra i generi per cui i maschi si concentrano maggiormente su lemmi come CORPO, CHEMIO_RADIO, OPERAZIONE_MD, CURE_MEDICHE, ESAMI_MD; mentre le femmine su temi semantici come MAMMA, PERSONE, DONATORE, FRATELLO_SORELLA, PADRE, PSICOLOGI, MD. I punteggi anomali indagati mediante il questionario SF-36 (Salute Generale) sono correlati con il gruppo di soggetti sottoposti ad autotrapianto e lemmi come CORPO, CHEMIO_RADIO, OPERAZIONE_MD, MOLTO_TROPPO. Punteggi migliori invece sono legati a parole chiave come MADRE, PADRE, PERSONE, DONATORE, SOSTENERE e con il trapianto allogenico da banca. Conclusioni. Per il primo gruppo emergono differenze significative rispetto alle narrazioni tra i vari membri del gruppo famiglia anche rispetto alle scale dei questionari utilizzati. Tali differenze oltre ad essere presenti rispetto ai due tempi della ricerca indicano come l’unità o la segregazione familiare abbia un’importante impatto sul proprio stato di salute mentale e dei propri figli, così come l’atteggiamento di accettazione e di come viene affrontata la malattia. La segregazione familiare compare come nucleo semantico fondamentale anche nel secondo gruppo per i punteggi anomali rispetto alle scale da noi indagate, come anche tutte le espressioni riferite alla malattia come lotta, battaglia e guerra. Nel terzo gruppo emergono differenze significative rispetto al genere come al tipo di trapianto effettuato. In generale possiamo ritenere che l’approccio di cura debba avere una particolare attenzione su come la malattia agisca sul vincolo familiare di tutti i suoi componenti.

The aims of this work were to investigate the role of nuclear Phospholipase C beta 1 (PI-PLCβ1) in human and mouse cell lines and to identify new binding partners of nuclear PI-PLCβ1 to further understand the functional network in which the enzyme acts. The intracellular distribution of PI-PLCβ1 was further investigated in human leukaemia cell lines (NB4, HL60, THP1, CEM, Jurkat, K562). With the exception of HL60, a high endogenous level of PI-PLCβ1 was detected in purified nuclei in each of the cell lines. We found that also in Ba/F3 pro-B cells overexpressing PI-PLCβ1b the protein localize within the nucleus. Although our data demonstrated that PI-PLCβ1b was not involved in cell proliferation and IGF-1 response as shown in other cell lines (FELC and Swiss 3T3), there was an effect on apoptosis. Activation of early apoptotic markers caspase-3 and PARP was delayed in PI-PLCβ1b overexpressing Ba/F3 cells treated with 5 gr/ml mitomycin C for 24h. We performed an antibody-specific immunoprecipitation on nuclear lysates from FELC-PLCβ1b cells. Mass spectrometry analysis (nano-ESI-Q-TOF) of co-immunoprecipitated proteins allowed for identification of 92 potential nuclear PI-PLCβ1b interactors. Among these, several already documented PI-PLCβ1b interacting partners (Srp20, LaminB, EF1α2) were identified, further validating our data. All the identified proteins were nuclear, mostly localized within the nuclear speckles. This evidence is particularly relevant as PI-PLCβ1 is known to localize in the same domains. Many of the identified proteins are involved in cell cycle, proliferation and transcriptional control. In particular, many of the proteins are components of the spliceosome multi-complex, strengthening the idea that PI-PLCβ1b is involved in mRNA processing and maturation. Future work will aim to better characterize the regulatory role of PI-PLCβ1b in mRNA splicing.

The aims of this work were to investigate the role of nuclear Phospholipase C beta 1 (PI-PLCβ1) in human and mouse cell lines and to identify new binding partners of nuclear PI-PLCβ1 to further understand the functional network in which the enzyme acts. The intracellular distribution of PI-PLCβ1 was further investigated in human leukaemia cell lines (NB4, HL60, THP1, CEM, Jurkat, K562). With the exception of HL60, a high endogenous level of PI-PLCβ1 was detected in purified nuclei in each of the cell lines. We found that also in Ba/F3 pro-B cells overexpressing PI-PLCβ1b the protein localize within the nucleus. Although our data demonstrated that PI-PLCβ1b was not involved in cell proliferation and IGF-1 response as shown in other cell lines (FELC and Swiss 3T3), there was an effect on apoptosis. Activation of early apoptotic markers caspase-3 and PARP was delayed in PI-PLCβ1b overexpressing Ba/F3 cells treated with 5 gr/ml mitomycin C for 24h. We performed an antibody-specific immunoprecipitation on nuclear lysates from FELC-PLCβ1b cells. Mass spectrometry analysis (nano-ESI-Q-TOF) of co-immunoprecipitated proteins allowed for identification of 92 potential nuclear PI-PLCβ1b interactors. Among these, several already documented PI-PLCβ1b interacting partners (Srp20, LaminB, EF1α2) were identified, further validating our data. All the identified proteins were nuclear, mostly localized within the nuclear speckles. This evidence is particularly relevant as PI-PLCβ1 is known to localize in the same domains. Many of the identified proteins are involved in cell cycle, proliferation and transcriptional control. In particular, many of the proteins are components of the spliceosome multi-complex, strengthening the idea that PI-PLCβ1b is involved in mRNA processing and maturation. Future work will aim to better characterize the regulatory role of PI-PLCβ1b in mRNA splicing.