Dissertations / Theses on the topic 'Diagnostic vétérinaire'

Les flavivirus ayant un impact en médecine vétérinaire sont largement distribués dans le monde (à l’exemple de la fièvre West Nile (WNF) présente sur les cinq continents ou de l’Encéphalite japonaise (EJ) en Asie du Sud-Est) et sont responsables de maladies à dominante neurologique chez l’homme et/ou le cheval.La virémie étant généralement brève lors de ces infections virales, les méthodes de diagnostic utilisées sont essentiellement sérologiques. Or le chevauchement fréquent des aires de répartition des flavivirus complique le diagnostic sérologique. En effet, des réactions sérologiques croisées entre flavivirus sont observées lors de l’utilisation de méthodes de diagnostic usuelles telles que l’ELISA et l’immunofluorescence (IF). Les résultats sérologiques doivent donc être confirmés par la méthode fastidieuse de séroneutralisation (SNT) virale avec les différents flavivirus existants dans la région. De plus, le risque d’émergence sur un territoire donné de nouveaux flavivirus comme le virus Zika au Brésil ou en Amérique du Nord ne peut être exclu.Nous avons donc développé dans la première partie de ce travail une nouvelle stratégie de diagnostic sérologique multiplexe à l’aide de la méthode d’immuno-essai (MIA) sur billes. Sachant que la glycoprotéine d’enveloppe soluble (sE) des flavivirus est divisée en 3 domaines (D) structuraux, DI, DII et DIII et que les épitopes du DIII sont spécifiques de chaque flavivirus, des protéines EDIII recombinantes de différents flavivirus d’intérêt ont été synthétisées en système d’expression Drosophila S2 et leur antigénicité a été testée sur sérums équins et ovins. Nous avons obtenu des résultats très encourageants en démontrant que l’utilisation des EDIII associée avec la capacité de multiplexage de la méthode MIA apparaît comme une réponse adaptée au défi du diagnostic sérologique des infections à flavivirus.Nous avons en outre utilisé la même méthode de multiplexage mais avec des antigènes NS1 du WNV pour mettre en place un test DIVA (Differentiating Infected from Vaccinated Animals) permettant de différencier les chevaux infectés par le WNV des chevaux vaccinés avec un vaccin recombinant WNV.Un autre écueil en médecine vétérinaire est le traitement des affections à flavivirus. En effet l’arsenal thérapeutique est limité et le traitement est avant tout symptomatique. Nous avons dans la seconde partie de ce travail testé in vitro une molécule antivirale à large spectre, le sr1057 sur nos virus d’intérêt (WNV et JEV). Cette molécule qui provient d’une stratégie de criblage développée par l’Institut Pasteur a probablement pour cible la cellule de l’hôte car elle est capable d’inhiber des virus très différents, à génome à ARN de polarité positive ou négative et ADN.Les résultats que nous avons obtenus avec ce composé sont en demi-teinte pour les flavivirus testés avec une efficacité démontrée pour le JEV mais plus modeste pour le WNV. Ils n’excluent cependant pas une possible utilisation de cet antiviral en médecine vétérinaire équine car une activité inhibitrice in vitro sur les virus de l’Herpes équin de type I et de l’artérite virale a été confirmée par d’autres collaborateurs
Flaviviruses with a major impact in veterinary medicine are widely distributed (e.g. West Nile fever (WNF) has spread across the five continents and Japanese Encephalitis (JE) is reported in South-East Asia) and are mainly responsible for neurological diseases in humans and/or horses.After flavivirus infection, viremia in mammal hosts is generally short and consequently indirect methods are mostly used to diagnose flavivirus infections. However, frequent spatial overlapping in their circulation areas renders the interpretation of serological assays difficult. Indeed, cross-reactions between flaviviruses are observed in rapid serological tests such as in ELISA and immunofluorescence assays (IFA). Serological assay results should thus be confirmed by the tedious comparative virus neutralization test (VNT) using a panel of viruses known to circulate in the area. Moreover, the risk of emergence of new flaviviruses such as reported recently with the Zika virus in Brazil or in North America should be considered when studying flavivirus epidemiology.In the first section, a new strategy aiming at improving the serological diagnosis of flavivirus infections was developed using the multiplexing capacity of microsphere immunoassays (MIA). The flavivirus soluble envelope (sE) glycoprotein ectodomain is composed of three domains (D), e.g. DI, DII and DIII, with EDIII containing virus-specific epitopes. Recombinant EDIIIs of different flaviviruses were synthesized in the Drosophila S2 expression system. The microspheres coupled with rEDIIIs were assayed with equine and ovine sera from natural and experimental flavivirus infections or non-immune samples. Very encouraging results have been obtained and this innovative multiplex immunoassay based on flavivirus rEDIIIs appears to be a powerful alternative to ELISAs and VNTs for veterinary diagnosis of flavivirus-related diseases.MIA with WNV nonstructural 1 protein were also implemented to differentiate Infected from Vaccinated Animals (DIVA). Such a DIVA approach was only successful when horses had been immunized with a recombinant canarypox vaccine, while horses receiving inactivated WNV vaccine developed immune responses close to the ones induced after natural infection.Another pitfall in veterinary medicine is the lack of therapeutics for viral diseases and specifically for flaviviruses. The therapeutic arsenal is indeed rather limited and animals are generally administered supportive treatments only. In the second part, the results of the in vitro testing of a broad spectrum antiviral named sr1057 on WNV and JEV replication are presented. This chemical, identified from a unique screening strategy developed by Pasteur Institute, is probably targeting the host cell and was found to inhibit the replication of varied RNA and DNA viruses belonging to different virus families. The sr1057 compound was not as efficient at inhibiting the replication of flaviviruses as for other RNA+ viruses, with a modest antiviral effect demonstrated for WNV and a higher efficacy on JEV. This antiviral presents however potentials for applications in equine veterinary medicine because it efficiently inhibited equine herpes virus-1 and equine arteritis virus in vitro, as clearly shown by other collaborators

Une etude epidemiologique effectuee dans le sud-ouest a revele une prevalence elevee de l'infestation par oestrus ovis. L'evolution larvaire qui est fonction de la temperature exterieure et du niveau de precipitations, comprend une courte phase estivale de developpement actif et une phase prolongee d'inhibition hivernale. Des essais d'infestations experimentales ont confirme l'influence des facteurs climatiques sur la dipause. Dans une etude de simulation de l'strose par des transplantations larvaires repetees, des resultats ante mortem et post mortem significativement differents ont ete observes entre les animaux infestes et les temoins. La faiblesse du taux de recolte larvaire est du principalement a la grande mortalite des larves resultant de la reaction de l'hote. Un test de depistage par elisa a ete mis au point, les reactions optimales, hautement reproductibles et specifiques ont ete obtenues avec l'ag 20% de 2eme stade a 2 microgrammes de proteines par millilitre, avec des dilutions de serum et de peroxydase de 1/200 et 1/1000. F. Hepatica et h. Contortus n'ont presente aucune reaction croisee avec oestrus ovis. Des le septieme jour apres l'infestation unique, une augmentation du taux d'anticorps circulants a ete notee. Lors de l'infestation repetee, une chute initiale a ete suivie cinq semaines apres, par une augmentation spectaculaire. Des differences significatives de taux ont ete observees entre des groupes de moutons d'ages varies soumis a des infestations naturelles. Une cinetique bimodale de la population d'eosinophiles est la caracteristique de l'infestation unique. Une sensibilisation par des antigenes larvaires a declenche une reaction fugace, mais identique qu'avec des larves vivantes. L'effet mediateur des eosinophiles, par degranulation au contact de la larve semble etre le mecanisme principal de la reaction de l'hote. La reaction d'hypersensibilite immediate associee a cette infestation serait modulee par les produits des granules des eosinophiles

Il est maintenant évident que la dégradation des environnements peut favoriser la transmission des maladies infectieuses notamment en rapprochant les humains, des vecteurs ou des animaux. Concernant les Maladies Tropicales Négligées (MTN), l’OMS tente de mobiliser les institutions et la communauté scientifique en identifiant pour chacune des MTN, les lacunes existantes dans les besoins de diagnostic clinique, les critères requis pour leur développement ainsi que les stratégies à adopter pour lutter contre la maladie. Parmi elles, la schistosomiase, seconde maladie parasitaire humaine, souffre d’un manque flagrant d’outils de diagnostic alliant sensibilité et déployabilité afin de détecter les cas de faible intensité parasitaire dans les zones endémiques ; mais également pour permettre la réalisation de diagnostic animal et environnemental visant à adopter une approche intégrative dans la lutte contre la maladie. Les objectifs de cette thèse s’inscrivent dans la stratégie One Health en proposant le développement et l’application d’outils de diagnostics de terrain chez l’Homme, chez l’animal et dans l’environnement. Les efforts continus en matière de recherche, de développement de prévention, de traitement et de sensibilisation sont essentiels pour parvenir à un monde où la schistosomiase et plus généralement les MTN ne seront plus une menace pour la santé humaine
It is now evident that environmental degradation can facilitate the transmission of infectious diseases, particularly by bringing humans into closer proximity with vectors or animals. In the case of Neglected Tropical Diseases (NTDs), the World Health Organization (WHO) is endeavoring to mobilize institutions and the scientific community by identifying, for each NTD, existing gaps in clinical diagnostic needs, the criteria required for their development, and the strategies to be adopted to combat the disease. Among them, schistosomiasis, the second most prevalent human parasitic disease, suffers from a distinct lack of diagnostic tools that combine sensitivity and deployability to detect cases with low parasitic intensity in endemic areas. Additionally, such tools are needed to facilitate animal and environmental diagnosis, enabling an integrated approach to disease control. The objectives of this thesis align with the One Health strategy, proposing the development and application of field-friendly diagnostic tools for humans, animals, and the environment. Ongoing efforts in research, development, prevention, treatment, and awareness are essential to achieve a world where Schistosomiasis and other neglected tropical diseases cease to threaten human health

Mycoplasma hyopneumoniae est l'agent étiologique primaire de la pneumonie enzootique du porc. Cette maladie respiratoire chronique est largement répandue à travers le monde et se révèle préoccupante dans les pays à production porcine intensive. Dans la lutte contre l'infection le diagnostic joue un rôle déterminant. Au laboratoire il s'effectue soit par la mise en évidence de m. Hyopneumoniae au niveau pulmonaire, soit par la détection des anticorps sériques produits en réponse à l'infection. L'existence de polypeptides possédant des épitopes communs a m. Hyopneumoniae, m. Flocculare et m. Hyorhinis, isolés de l'appareil respiratoire du porc remet en cause la spécificite des tests actuels. Notre objectif a été la mise au point de tests de diagnostic plus performants. Pour détecter les anticorps induits après l'infection, nous avons mis au point un elisa par compétition. Ce dernier est fondé sur la détection des anticorps dirigés contre une protéine membranaire de m. Hyopneumoniae. Cette protéine n'est pas détectée par les anticorps sériques de porcs par m. Flocculare ou par m. Hyorhinis. Par ce test, les anticorps dirigés contre m. Hyopneumoniae sont détectés entre 2 et 3 semaines après l'infection expérimentale et sont encore présents 22 semaines plus tard. Ce test permettra d'effectuer le suivi sérologique des élevages porcins du terrain. En vue de détecter m. Hyopneumoniae, nous avons produit une sonde moléculaire. Celle-ci a conduit à l'élaboration d'un test de diagnostic par hybridation adn-adn spécifique et sensible. Ce test permet de mettre en évidence m. Hyopneumoniae dans les liquides de lavages trachéo-bronchiques de porcs infectés artificiellement. Les résultats obtenus permettent dès lors d'envisager l'utilisation de cette sonde pour détecter le mycoplasme dans des prélèvements effectués sur des porcs du terrain. Une sonde adn pour détecter spécifiquement m. Flocculare a aussi été produite.

Depuis plus d’une dizaine d’années, des efforts ont été menés dans le domaine de la tomographie par rayons X pour le petit animal essentiellement pour l’amélioration de la résolution spatiale et la baisse de la dose absorbée. Le CPPM a développé un micro-TDM, le PIXSCAN, basé sur un détecteur à pixels hybrides, XPAD2. Dans ce contexte, mon travail de thèse consiste à étudier le démonstrateur PIXSCAN/XPAD2 et donc l’apport des pixels hybrides à l’imagerie du petit animal. Une simulation analytique rapide, FastSimu, a été développée. Une extrapolation des performances du démonstrateur PIXSCAN ainsi que la validation des résultats obtenus avec les données réelles ont été menées à l’aide du simulateur analytique FastSimu. Le démonstrateur PIXSCAN/XPAD2 a permis d’obtenir des images reconstruites d’une assez bonne qualité pour une dose absorbée relativement faible. Sa résolution spatiale est dégradée par un nombre élevé des pixels défectueux présents sur son détecteur XPAD2. Par ailleurs, une nouvelle version du démonstrateur PIXSCAN/XPAD3 est en cours de conception. Cette dernière, caractérisée par des pixels deux fois et demi plus petits et une quasi absence des pixels défectueux apportera une amélioration considérable de la résolution spatiale
Since more than a dozen years, efforts were led in the field of X-ray tomography for small animal principally for the improvement of spatial resolution and the diminution of the absorbed dose. The CPPM developed a micro-CT, PIXSCAN, based on an hybrid pixels detector, XPAD2. In this context, my thesis work consists in studying the demonstrator PIXSCAN/XPAD2 and the contribution of the hybrid pixels in the imaging of the small animal. A rapid analytical simulation, FastSimu, was developed. An extrapolation of the performances of the demonstrator PIXSCAN as well as the validation of the results obtained with the real data were led by means of the analytical simulator FastSimu. The demonstrator PIXSCAN/XPAD2 allowed to obtain reconstructed images with a rather good quality for a relatively weak absorbed dose. Its spatial resolution is degraded by the presence of a high number of defective pixels on its detector XPAD2. Besides, a new version of the demonstrator PIXSCAN/XPAD3 is under fabrication. This last, characterized by pixels two and a half times smaller and the almost absence of the defective pixels will bring a considerable improvement of the spatial resolution

En élevage bovin, la détection précoce des femelles non gravides grâce au diagnostic de gestation permet une réinsémination rapide des animaux. Idéalement, ce diagnostic devrait être réalisé avant la fin du cycle sexuel, pendant la période péri-implantatoire, ce qui n’est pas possible actuellement. Pendant cette étape de la gestation précoce, le conceptus produit un facteur de reconnaissance maternelle de la gestation, l’interféron tau (IFNt), qui occupe un rôle important dans le dialogue entre le conceptus et l’organisme maternel. Plusieurs études ont montré que l’expression de gènes régulés par l’IFNt était augmentée dans l’endomètre et dans les leucocytes sanguins des ruminants, pendant la période péri-implantatoire.Les récentes avancées technologiques permettant l’analyse fonctionnelle du génome ont ouvert de nouvelles perspectives pour l’utilisation de ces marqueurs biologiques à des fins diagnostiques. L'objectif de ce travail a donc été l'identification de marqueurs diagnostiques fiables et précoces de la gestation, dans les cellules immunitaires circulantes des ruminants, ainsi que la caractérisation de la réponse locale (endomètre) et systémique (leucocytes sanguins) de l'organisme maternel à la gestation.Pour identifier de nouveaux candidats, nous avons réalisé un transcriptome des leucocytes d’animaux gravides et non gravides, que nous avons combiné à une analyse transcriptomique de l’endomètre caronculaire et des nœuds lymphatiques drainant spécifiquement l'utérus. Pour des raisons pratiques, ces prélèvements ont été réalisés chez l’ovin. A partir de ces résultats, nous avons sélectionné, parmi les gènes différentiellement exprimés (DEG), des candidats pour mettre au point un test de diagnostic précoce de gestation chez la brebis dans un premier temps, puis chez la vache dans un second temps. L’expression de ces gènes a été évaluée par RT-qPCR et des tests de diagnostic de gestation basés sur les niveaux d‘expression de ces gènes ont été conduits sur 2 lots expérimentaux de brebis et de vaches puis, sur un lot de brebis provenant d’élevages commerciaux. Cinq candidats ont été identifiés et évalués : CXCL10, STAT1, MX1, MX2, ISG15. Les tests, performants dans les lots expérimentaux, n’ont pas permis de discriminer efficacement la gestation dans le lot d’animaux d’élevage commerciaux. Chez ces animaux, une grande variabilité de l’expression des gènes candidats a été observée et suggère un défaut de spécificité de ces gènes dans le cadre du diagnostic de gestation en élevage.Pour comprendre ce défaut de spécificité, une analyse conjointe des transcriptomes des leucocytes sanguins, des nœuds lymphatiques et de l’endomètre caronculaire a montré un différentiel d’expression pour respectivement 118, 17 et 2823 gènes dans les 3 tissus explorés. Peu de DEG ont été trouvés dans les nœuds lymphatiques. Mais, si 78 % des DEG dans les leucocytes sanguins l’étaient aussi dans l’endomètre, les DEG communs à l’endomètre et aux leucocytes ne représentent que 3 % des DEG de l’endomètre. Les analyses de data mining ont mis en évidence dans les leucocytes et dans l’endomètre une réponse forte associée à la gestation, une réponse de type interféron liée à l’IFNt. Cependant, cette signature transcriptomique commune aux deux tissus n’est pas spécifique de la gestation et peut être associée à la présence d’agents infectieux.Ce travail a ainsi permis de mettre en évidence une certaine concordance entre la réaction locale et la réponse périphérique de l’organisme maternel à la gestation. Mais il a également montré que la signature transcriptomique de type interféron observée n’est pas spécifique de la gestation. Ce défaut de spécificité est à l’origine du manque de fiabilité du test de diagnostic de gestation basés sur les niveaux d’expression des gènes régulés par l’interféron que nous avons tenté de mettre au point. D’autres études sont nécessaires pour identifier des marqueurs alternatifs de la gestation, indépendants de l’IFNt
In cattle farming, reproductive performance is closely linked to farm profitability. The early identification of non-pregnant females, using pregnancy diagnosis tests, would allow rapid re-insemination of the animals, thus shortening the interbreeding interval. Ideally, pregnancy detection would be performed prior to the return to oestrous, namely at the time of implantation, which is not possible using current state-of-the-art pregnancy diagnosis techniques. At this early stage of pregnancy, the conceptus produces a ruminant-specific antiluteolytic signal, the interferon tau, which is responsible for the maternal pregnancy recognition. This interferon is critical in the communication between conceptus and maternal organism. The expression of numerous genes has been reported to be regulated by the interferons, in the endometrium and in blood leucocytes of ruminants, at the time of implantation.Recent technical advances for functional analysis of the genome have provided new opportunities for the use of these biological markers in pregnancy diagnosis. The main purpose of this work was to identify non-invasive, reliable and early pregnancy diagnostic markers in immune circulating cells, along with the characterisation of the local and systemic responses of the maternal organism to pregnancy.In order to identify new candidate genes, we performed a transcriptome analysis of pregnant and non-pregnant peripheral blood mononuclear cells, which we combined to a transcriptome analysis of the caroncular endometrium and the lymph nodes that specifically drain the uterus. For practical and cost-effectiveness reasons, these samples were collected in sheep. Based on the results of the transcriptome analysis, we selected, among the differentially expressed genes (DEG), a set of candidate genes in order to develop an early pregnancy diagnosis test initially in ewes and in cows in a second step. Expression of these genes was assessed using real time qPCR. Based on the expression levels of these candidate genes, pregnancy diagnosis tests were performed on different sets of animals: an experimental set of ewes, an experimental set of cows and finally, on a set of ewes from commercial herds. Five candidate genes were identified and evaluated: CXCL10, STAT1, MX1, MX2 and ISG15. Diagnosis tests displayed reliable results in the experimental sets of animals but failed to discriminate pregnancy in the set of farm animals. In this group, we observed high variations in interferon stimulated genes (ISG) expression levels highlighting the low specificity of ISG based pregnancy diagnosis tests performed in farm on heterogeneous batch of animals.To understand this lack of specificity, a simultaneous transcriptome analysis of blood leucocytes, lymph nodes and caroncular endometrium revealed respectively 118, 17 and 2823 DEG. Very few DEG were noticed in the lymph nodes. But if 78% of the DEG in blood leucocytes were found in the endometrium as well, only 3% of the DEG in the endometrium were shared with blood cells. Data mining analysis of the lists of DEG showed a strong pregnancy associated response in both blood leucocytes and the endometrium, an interferon response type, related to the implication of the interferon tau. However, this transcriptomic signature, identified in both biological tissues, is not pregnancy specific as it is frequently associated with pathogen agents.Finally, this work has enabled to highlight the slight correlation between the local (endometrium) and the peripheral (blood leucocytes) response during early pregnancy. But this work has also pointed out that the transcriptomic signature related to pregnancy, an interferon response type, is not pregnancy-specific. This lack of specificity is due to the unreliability of ISG based pregnancy diagnosis tests. Further investigations are needed to identify alternative pregnancy markers, independent of the interferon tau

Les épizooties du passé, malgré leur impact économique, sanitaire et social sur les sociétés agro-pastorales anciennes, sont particulièrement mal documentées en archéologie, et leurs millions de victimes semblent n’avoir laissé aucune trace matérielle. Cette thèse s’attache donc à démontrer qu’il est non seulement possible de mettre en évidence des dépôts animaux consécutifs à des crises de mortalité, mais aussi d’identifier les causes spécifiques des décès. Elle adopte une démarche interdisciplinaire, mêlant méthodes et données de l’archéologie, de l’histoire et de la médecine vétérinaire. Deux outils méthodologiques y sont développés. Le premier est une grille d’analyse permettant l’identification des crises de mortalité animales parmi tous les dépôts de faune rencontrés en archéologie. Le second est une démarche de diagnostic différentiel de la nature des crises, reposant sur la confrontation entre les caractéristiques épidémiologiques des dépôts animaux et celles des principales causes de mortalité identifiées aux époques étudiées. Des examens complémentaires ciblés permettent alors la validation des hypothèses diagnostiques obtenues. Une cinquantaine de dépôts animaux témoignant vraisemblablement de crises de mortalité passées sont ainsi identifiés dans la bibliographie, corpus faisant l’objet d’une analyse multicritère diachronique et spécifique. Six assemblages ovins datés de l’Antiquité à la période Moderne font ensuite l’objet d’une étude archéologique et ostéologique approfondie. L’application du protocole d’analyse permet la formulation d’hypothèses diagnostiques dans cinq cas sur six, et dans un cas sa confirmation par la mise en évidence du pathogène incriminé
Acute episodes of animal mortality had severe impacts on past societies, with lasting economical, sanitary and social consequences. They remain however largely undocumented, in particular in archaeology, where the millions of animal victims described in historical texts appear to have left no material evidence. This dissertation thus strives to explore this discrepancy and to demonstrate that not only is it possible to identify archaeological deposits of mass animal mortality, but that it is also possible to diagnose the specific cause of the deaths. Theses aims are addressed by an interdisciplinary approach, drawing on methods and data from the fields of archaeology, history and veterinary science, and leading to the development of two methodological tools. The first tool allows the identification of animal mass mortality deposits through a flow chart based on objective archaeological criteria. The second presents as a protocol allowing the differential diagnosis and those of the main causes for animal mortalities in that time and place. Selected diagnostic hypotheses are then tested by targeted analyses. This allows us to identify fifty-one archaeological animal deposits probably resulting from mass mortality events in the bibliographical record, and to carry out a multi-criteria analysis of the resulting corpus in a diachronic and a species-specific perspective. Six ovine assemblages dating from the Roman period to the Modern period are then selected for an in-depth archaeological and osteological study. Likely diagnostic hypotheses are identified through our protocol in five cases out of six, one of which is confirmed by the paleoparasitological identification of the suspected pathogen

Le wssv (white spot syndrome virus) est un agent viral hautement pathogene pour les crevettes penaeidae en elevage. Il est a l'origine de l'effondrement de la production de crevettes en asie et plus particulierement en chine. Nos recherches ont d'abord porte sur la construction de differentes banques genomiques issues de fragments d'adn viral. A partir de ces donnees nous avons tente d'assembler des fragments afin de reconstituer le genome viral, d'en dresser la carte physique et d'en determiner sa taille. Un certain nombre de fragments sequences on pu etre analyses, et utilises comme outils de diagnostic. Nos resultats montrent que le wssv possede un genome d'une taille tres importante pour un virus (environ 300 kbp), montrant un profil de restriction (eco ri, hind iii et bam hi) tres complexe de par le nombre de sites detectes. L'analyse de sequences nucleiques et proteiques partielles n'a que tres peu montre de similarite avec des genes connus de virus. En revanche, certaines de ces sequences semblent plutot se rapprocher (par alignement de sequences et analyse phylogenetique) de genes d'eucaryotes comme la tata-box binding protein ou la ribonucleotide reductase. Ces resultats montrent que ce virus, malgre une convergence morphologique de sa structure avec celle des baculoviridae, serait eloigne de par ses caracteres genetiques de cette famille et appartiendrait plutot a une nouvelle famille virale. Enfin, de par son spectre d'hotes extremement large parmi les crustaces aussi bien marins que d'eau douce, le wssv apparait comme un virus extremement dangereux pour l'elevage des crustaces en general. Aussi, il etait important de developper des methodes de diagnostic specifiques, sensibles et precoces pour controler sa transmission au niveau de l'ecosysteme particulier que constitue la ferme d'elevage.

Cette thèse présente mon travail de recherche sur la conception d'une chaîne de lecture dédiée à la TEP (Tomographie à Emission de Positons) fondée sur l'APD (Avalanche Photo Diode) pour les petits animaux. Le laboratoire IPHC (Institut Pluridisciplinaire Hubert Curien, UMR 7178) est en train de développer un système d'imagerie multimodale dénommé AMISSA (A Multimodality Imaging System for Small Animal) dédié au petit animal. L'AMISSA est composé par un micro imageur TDMX (micro TomoDensitoMétrie X), un micro imageur TEMP (Tomographie d'Emission Mono Photonique) et un micro imageur TEP. Le TDMX et le TEMP ont été réalisés. L'imagerie TEP permettra d'ajouter la modalité manquante au banc d'imagerie. Deux prototypes ont été développés afin de réaliser la chaîne de lecture complète dédiée à l'APD. Le premier prototype APD Chip est un circuit bas bruit de dix voies. Chaque voie est constituée d'un CSA (Charge Sensitive Amplifier), d'un CR-(RC)2 « shaper » et d'un « buffer » analogique. Le test montre que l'ENC (Equivalent Noise Charge) à l'entrée est égal à 275 ± 2 e- + 10 e-/pF pour un « shaping time » de 136 ns. Le deuxième prototype PETROC est un microcircuit mixte qui comprend un PDH (Peak Detect and Hold) d'huit voies et un TDC (Time-to-Digital Converter) de cinq voies. L'erreur sur le pic détecté est inférieure à 0. 7%. Une interpolation multi-niveaux est incluse dan la conception du TDC afin d'obtenir une plage de mesure de 10 µs et un pas de 20 ps. Dans ce texte, des analyses théoriques et des prototypes sont présentés, ainsi que la conception des circuits. Les résultats des tests du premier prototype sont également exposés
This thesis presents my research work on the conception of a readout chain dedicated to the APD (Avalanche Photo Diodes)-based PET (Positron Emission Tomography) imaging for small animal. The PET imaging allows the conjunction of its modality with the micro CT (X-ray Computerized Tomography) and micro SPECT (Single Photon Emission Computed Tomography) imaging which have been developed at IPHC (Institut Pluridisciplinaire Hubert Curien, UMR 7178). These three imaging compose a multi-modality imaging system for small animal (AMISSA). Two prototypes have been designed in order to finally realize the complete readout chain. The first one (called APD Chip) is a ten-channel low noise front-end circuit. Every channel consists of a Charge Sensible Amplifier (CSA), a CR-(RC)2 shaper, and an analogue buffer. The Equivalent Noise Charge (ENC) in input from test is equal to 275 ± 2 e- + 10 e- /pF for a shaping time of 136 ns. The second prototype PETROC is a mixed circuit. It comprises an eight-channel Peak Detect and Hold (PDH) circuit and a five-channel Time-to-Digital Converter (TDC). The simulation shows that the error is less than 0. 7% over the whole dynamic range. A multi-level interpolation was implemented in the TDC design to obtain a measurement range up to 10 µs and a bin size of 20 ps. In this thesis, the prototypes are presented for both their theoretical analyses and their circuit designs. The test results of the first prototype are also presented

Depuis l'invention du scanner, les détecteurs à intégration de charges sont largement employés pour les applications d'imagerie biomédicale utilisant des rayons X. Néanmoins, des alternatives existent. Les développements réalisés en instrumentation pour les expériences en physique de hautes énergies ont permis l'émergence d'une nouvelle technologie de détection directe à base de semiconducteur. Cette nouvelle technologie, appelée détecteur à pixel hybrides; fo,ctionne en monde comptage de photons et permet de sélectionner l'énergie minimum des photons comptés. Le groupe imXgam du CPPM développe le démonstrateur PIXSCAN, un tomodensitomètre à rayons X basé sur le détecteur à pixels hybrides XPAD. L'objectif de ce développement est d'évaluer l'impact de la technologie à pixels hybrides sur la qualité des images et sur la dose délivrée lors d'examens tomodensitométriques du petit animal. Suite à un premier prototype de détecteur à pixels hybrides XPAD1 démontrant la faisabilité du projet, un imageur complet XPAD2 a été conçu et intégré dans le démonstrateur PIXSCAN. Depuis, avec l'évolution de l'industrie de la microélectronique, des améliorations notables ont été envisageables. Pour réduire la taille des pixels et améliorer la précision en énergie des détecteurs, une troisième version XPAD3 a été développé et sera prochainement intégrée dnas un démonstrateur PIXSCAN de deuxième génération. Dans ce projet, mon travail de thèse a porté sur une participation à la conception des électroniques de lecture des détecteurs, la caractérisation des circuits et des détecteurs à pixels hybrides ainsi que sur la définition d'une architecture d'autocalibration des pixels en énergie
Since the invention of computerized tomography (CT), charge integration detector were widely employed for X-ray biomedical imaging applications. Nevertheless, other options exist. A new technology of direct detection using semiconducors has been developped for high energy physics instrumentation. This new technology, called hybrid pixel detector, works in photon counting mode and allows for selecting the maximum energy of the counted photons. The iXgam research team at CPPM develops the PIXSCAN demonstrator, a CT-scanner using the hybrid pixel detector XPAD. The aim of his project is to evaluate the improvement on image quality and on dose delivered durinf X-ray examinations of a small animal. After a first prototype of hybrid pixel deector XPAD1 proving the feasibility of the project, a complete imager XPAD2 was designed and intergrated in the PIXSCAN demonstrator. Since then, with the evolution of microelectronic industry, important improvements are conceivable. To reducing the size of pixels and to improving the energy resolution of detectors, a third design XPAD3 was conceived and will be soon integrated in a second generation of PIXSCAN demonstrator. In this project, my thesis(s work consisted in taking part to the design of the detector readout electronics, to the characterization of the chips and of the hybrid pixel detectors, and also to the definition of a autozeroing architecture for pixels

Mycobacterium tuberculosis est la cause d’une des maladies infectieuses les plus fréquentes dans le monde causant la mort de plus de 1,2 millions de personnes chaque année selon l’organisation mondiale de la santé (OMS). Actuellement, la tuberculose à M. tuberculosis émerge chez d’autres espèces comme l’a montré notre revue bibliographique des cas de tuberculose à M. tuberculosis chez les primates non-humains, les éléphants d’Asie, les animaux de ferme, les animaux de compagnie et certains animaux sauvages. Nous avons montré que ces trois espèces survivent dans le sol pendant au moins 12 mois et restent pathogènes dans un modèle souris. Egalement nous avons montré que le sol infecté par M. tuberculosis est une source potentielle de contamination pour les animaux. Nous avons ensuite développé un protocole de culture rapide de M. tuberculosis, incluant un nouveau milieu de culture solide, des conditions optimisées d’incubation, et la détection des microcolonies par autofluorescence. Notre travail de thèse a permis de mettre en place des techniques et protocoles qui révolutionnent la culture et l’isolement de M. tuberculosis en réduisant les délais de culture et des antibiogrammes, un point déterminant pour la lutte contre la tuberculose notamment dans les pays à ressources limitées et les pays à forte émergence de souches de M. tuberculosis de plus en plus résistantes. Ces protocoles sont en cours de transfert pour la routine de laboratoire
Mycobacterium tuberculosis is the cause of one of the most common infectious diseases in the world killing more than 1.2 million people each year according to the World Health Organization (WHO). Currently, M. tuberculosis tuberculosis emerges in other species like non-human primates, Asian elephants, farm animals and some wild animals. We have shown that three species of M. tuberculosis complex survive in the soil for at least 12 months and are pathogenic in a mouse model and M. tuberculosis-infected soil is a potential source of infection for animals. We then developed a protocol for rapid culture of M. tuberculosis, including a new solid culture medium, optimized conditions of incubation, and detection of microcolonies by autofluorescence. Our thesis has helped develop techniques and protocols that are revolutionizing the culture and isolation of M. tuberculosis by reducing delays culture and susceptibility testing, a crucial point for the fight against tuberculosis, especially in countries limited resources and countries with strong emergence of M. tuberculosis strains more resistant. These protocols are being transferred to the routine laboratory

Un virus fortement pathogene pour les larves de setothosea asigna van eecke qui causent d'importants degats aux palmiers a huile en indonesie a ete isole et caracterise. Avec une capside de symetrie cubique de 35 nm de diametre, un seul polypeptide capsidaire de 55 kda et un genome constitue d'une molecule d'arn monocatenaire lineaire de 6,2 kb, ce virus presente les proprietes essentielles des virus -nudaurelia de la famille des tetraviridae. Par transcription reverse de l'arn viral des fragments d'adnc ont ete obtenus et clones. L'un d'eux de 945 paires de bases a ete sequence. Deux methodes de diagnostic, l'un immunologique: test elisa, l'autre reposant sur l'hybridation du genome viral avec un adnc clone: sonde nucleique non radioactive, ont ete mis au point. Le pouvoir pathogene du virus etudie en laboratoire sur des larves de differents stades s'est avere tres fort quelque soit le stade, les jeunes larves etant les plus sensibles. Les prelevements effectues en plantation et lors d'epizooties naturelles ont montre une incidence importante de la virose sur la dynamique des populations naturelles du ravageur. Le traitement d'une parcelle a base de broyats de chenilles infectees et le suivi pendant deux generations des larves ont montre l'efficacite du virus pour juguler une pullulation du ravageur et les potentialites du virus comme biopesticide

L'imagerie par résonance magnétique (IRM) appliquée au domaine vétérinaire exploite des systèmes à bas champ magnétostatique qui ont de nombreux avantages, notamment leur faible coût d'achat et d'entretien. Mais sur ces machines, les capteurs radiofréquence (RF) sont initialement dédiées à l'homme et ne permettent pas une qualité d'image optimale. Dans le cadre de cette thèse, des méthodes simples d'optimisation de capteurs à 0,2 T ont été développées, puis exploitées pour des applications de recherche et préclinique. Le travail d'optimisation a été partagé en deux axes. Dans un premier temps, un modèle analytique a été développé sous MATLAB pour l'estimation du rapport signal sur bruit intrinsèque à un capteur paramétré par ses dimensions et les propriétés de l'objet imagé. La validation du modèle a été obtenue par la comparaison entre mesures et simulations du facteur de qualité. Cette méthode d'optimisation a été appliquée pour deux études spécifiques qui ont fait l'objet d'une publication. Dans un second temps, un travail sur le découplage actif a été mené. En effet, sur l'IRM 0,2 T à notre disposition, le découplage passif est la méthode retenue par le constructeur. Mais pour certaines applications des artefacts d'imagerie sont inévitables et le facteur de qualité réduit. Des moyens de découplage actif ont donc été développés. Les performances des capteurs ainsi équipés se sont avérées meilleures qu'en découplage passif. Ce système de découplage associé à un dispositif de connexion par couplage inductif du signal de résonance magnétique a été également démontré à 3 T comme une preuve de concept d'un dispositif de connexion universelle. Ce dispositif a fait l'objet d'un article récemment soumis pour publication
Magnetic resonance imaging {MRl) in veterinary practice employs low magnetostatic field devices which have numerous advantages such as their low maintenance and initial cost. Yet, the radiofrequency {RF) coils commercially provided with these devices are dedicated to human morphology, therefore reducing image quality. ln this work, simple optimization methods for 0.2 T RF coils were developed for an implementation in research and preclinical studies. Optimization protocol was subdivided into two main steps. First, an analytical model was developed using MATLAB in order to estimate the intrinsic signal to noise ratio variations with coil and imaged sample characteristics. Validation of the model was assessed thanks to quality factor comparison between simulated and measured values. The use of the analytical model for two specific studies was described in a recently accepted publication. Second, active decoupling was investigated. lndeed, passive decoupling is the decoupling method implemented on the 0.2 T MR device at our disposal. However, this technique can lack of efficiency in some experiments, inducing imaging artifacts and reduced quality factor. Active decoupling method was therefore implemented. The electronic performances of the coils equipped this way were better than in passive decoupling. This active decoupling device combined with an inductive coupling connecting system was tested at 3 T to demonstrate the technical feasibility of a new universal connecting device, for which an article was recently submitted

The aim of this thesis was to provide a picture of the trypanosomosis and drug resistance prevalence in Eastern Province of Zambia, to understand the underlying factors of drug resistance (drug use habits), to improve the diagnosis of trypanosomosis in livestock and finally, to improve the diagnosis of isometamidium resistance in T.congolense. After an introductory part where available trypanosomosis and trypanocide resistance diagnostic methods are described and discussed, the body of the thesis is divided in two main sections. In the first section are presented the results of a cross-sectional and a longitudinal epidemiological survey describing the geographical distribution of trypanosomosis cases, of resistant isolates and of cattle treated with isometamidium chloride. The results of the monitoring of unsupervised treatments of cattle with isometamidium by farmers and veterinary assistants with the Isometamidium-ELISA technique are also presented. The second section describes the development of two new diagnostic methods, the first one allowing the diagnosis of trypanosome infections with high sensitivity and specificity through semi-nested polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism. This is the first report of a pan-trypanosome PCR test (a single PCR test for the diagnosis of all important pathogenic trypanosomes of cattle). The second new method that was developed allows the diagnosis of isometamidium resistant T.congolense strains by PCR-RFLP. This is the first report of a PCR based diagnostic test of trypanocide resistance in T. congolense.

Doctorat en sciences, Spécialisation biologie moléculaire
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Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis (MAP) est l'agent causal de la paratuberculose, maladie entérique, chronique et incurable des ruminants, avec un impact économique important. Une meilleure compréhension des facteurs de risque associés à l'introduction de la maladie dans un troupeau est essentielle pour sa prévention. L’amélioration des tests diagnostiques est aussi importante pour son contrôle. L’introduction des nouveaux animaux dans le troupeau et la présence et contact des différentes espèces sauvages et domestiques avec les vaches, semblent être des facteurs de risques d’introduction de la maladie. Nous avons réalisé une revue systématique dont l`objective était de recueillir l’information pertinente pour répondre à la question sur l’importance de ces facteurs et leur impact sur l’introduction de la maladie dans un troupeau. D`un autre côté, la détection de MAP dans les fèces par culture bactérienne demeure la méthode diagnostique de choix malgré les facteurs qui l`affectent. Une série de 3 étapes est requise afin de confirmer la présence du MAP : (1) culture (2) coloration, et (3) confirmation du MAP par PCR (si détecté à l´étape 2). Certains échantillons fécaux présentent une particularité en raison de leur forte charge de micro-organismes. Ces contaminants peuvent interférer avec la croissance et la détection de MAP. Une étude visant à : a) estimer l'impact des certain covariables sur les résultats de la culture de MAP parmi l`analyse rétrospective d`un banque des données et b) évaluer la possibilité d'optimiser le processus de diagnostic du MAP en effectuant l'analyse PCR sur les cultures déclarées comme contaminées a été réalisée.
Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis (MAP) is the causative agent of paratuberculosis an enteric, chronic and incurable disease of ruminants, with a major economic impact. A better understanding of the risk factors associated with the introduction of the disease in a herd, is essential for its prevention. Improving diagnostic tests are also important for the control. The introduction of new animals into the herd and the presence and contact of wild and domestic species with cattle, appear to be a risk factor for disease introduction. We conducted a systematic review to obtain relevant information to answer the question about the importance and impact of these factors on the introduction of the disease into a herd. On the other hand, the detection of MAP in feces by bacterial culture remains the diagnostic method of choice despite of the factors that can affect it. A series of 3 steps are required to confirm the presence of MAP: (1) culture (2) acid fast stain (3) MAP confirmation by PCR (if detected in step 2). Some fecal samples exhibit a particularity due to their normal heavy load of micro-organisms. These contaminants can interfere with the growth and detection of MAP. A study to: a) assess the impact of some covariables on the culture results by a retrospective analysis of a databank and b) to evaluate the possibility to optimize MAP diagnostic process by performing a PCR analysis on cultures declared as contaminated was realized.

L'otite moyenne est une condition fréquente chez le veau et peut parfois être subclinique, rendant difficile son diagnostic à la ferme. L'objectif de cette étude est d’estimer la sensibilité et la spécificité de l'échographie des bulles tympaniques pour le diagnostic d'otite moyenne clinique et subclinique et de déterminer sa répétabilité. Quarante veaux âgés entre 19 et 50 jours ont été sélectionnés dans une ferme de veaux de grain, en fonction des résultats de l'échographie réalisée à la ferme (A). L'échographie a été réalisée une seconde fois par le même échographiste (A') et par un second échographiste (B), et le diagnostic noté pour chaque bulle tympanique comme étant négatif, suspect ou positif. Les images ont été enregistrées pour relecture et le diagnostic noté. Les veaux ont été euthanasiés, soumis en nécropsie et l'histologie a été utilisée comme méthode de référence. À l'histologie, 45 bulles tympaniques étaient atteintes d'otite moyenne et 35 bulles tympaniques étaient saines. Selon l'échographiste et la classification des bulles tympaniques suspectes, la sensibilité de l'échographie variait de 32% à 63% et la spécificité variait de 84% à 100%. La répétabilité était modérée, avec des valeurs de kappa de 0,53 entre A' et B, de 0,48 entre A et A', et de 0,58 et 0,75 pour la relecture de leurs images par A' et B respectivement.
Otitis media is a common disease in calves but can remain subclinical, making diagnosis challenging on the farm. The objective of this study is to estimate the sensitivity and specificity of the ultrasound imaging technique of tympanic bulla for the diagnosis of clinical and subclinical otitis media, and to determine its repeatability. Forty calves 19-50 days of age were selected from a veal calf farm, on the basis of results of ultrasound examination performed on the farm (A). Ultrasound examination was performed a second time by the same ultrasonographer (A') and by another ultrasonographer (B), and diagnosis was recorded for both tympanic bulla as negative, suspicious or positive. Images were recorded for further re-reading. Calves were euthanized and submitted for necropsy, and histopathologic diagnosis was used as gold standard. Based upon histology, 45 bullae were affected with otitis media and 35 bullae were unaffected. Depending on ultrasonographer and on classification of suspicious bullae, sensitivity varies from 32% to 63% and specificity varies from 84% to 100%. Repeatability is moderate, with kappa values of 0.53 for A'-B, 0.48 for A-A', and 0.58 and 0.75 for re-reading of A' and B, respectively.

La reproduction est un pilier majeur de la productivité des fermes laitières. Dans ce contexte, il est pertinent d’identifier à l’avance les animaux à risque d’avoir des performances en reproduction sous-optimales, surtout si un traitement efficace est disponible pour améliorer ces performances. Les endométrites clinique et subclinique sont des conditions définies selon leur impact sur les performances en reproduction subséquentes et donc, des outils très intéressants de surveillance de la santé utérine. Le premier objectif de cette étude était de déterminer simultanément des seuils diagnostiques pour les endométrites clinique (diagnostiquée par le Metricheck) et subclinique (diagnostiquée par la cytologie endométriale ou par l’estérase leucocytaire) selon leur impact sur les performances en reproduction à la première saillie. L’écoulement vaginal purulent a été identifié comme seuil pour l’endométrite clinique, alors que les seuils identifiés pour l’endométrite subclinique ont été un pourcentage de polymorphonucléaires de 6% à la cytologie et une « forte quantité de leucocytes » à l’estérase leucocytaire. Le second objectif de l’étude était d’évaluer l’effet d’un traitement intra-utérin de céphapirine sur les performances à la première saillie des animaux sains et atteints d’endométrite. Aucun effet du traitement n’a été observé chez les vaches saines ou atteintes d’endométrite clinique, alors qu’une tendance à l’amélioration des performances a été associée au traitement chez celles atteintes d’endométrite subclinique. L’anovulation post-partum prolongée pourrait altérer l’efficacité du traitement de céphapirine, surtout chez les vaches atteintes d’endométrite clinique.
Reproduction is a major concern in the dairy industry. In this context, it is relevant to have an early identification of cows at risk of altered subsequent reproductive performance, especially if a treatment is available and effective to improve this performance. Clinical and subclinical endometritis are defined based on their impact on reproductive performance and are interesting tools for reproductive tract health surveillance. The first objective of this research project was to determine simultaneously diagnostic criteria for clinical (diagnosed by Metricheck) and subclinical (diagnosed by endometrial cytology or leukocyte esterase testing) endometritis based on their impact on reproductive performance at first service. Clinical endometritis was defined as presence of purulent vaginal discharge whereas subclinical endometritis was defined as presence of ≥ 6% of polymorphonuclear cells using endometrial cytology or the presence of “large amount of leukocytes” using leukocyte esterase testing. The second objective of this research project was to determine the effect of an intrauterine infusion of cephapirin on the reproductive performance at first service in cows with clinical endometritis, subclinical endometritis, and in cows unaffected by endometritis. Cephapirin treatment had no effect on first service pregnancy risk in unaffected cows or in cows affected by clinical endometritis. However, there was a tendency of a positive effect of the treatment in cows affected by subclinical endometritis. Presence of prolonged postpartum anovulation in cows may reduce the efficacy of the cephapirin treatment, especially in cows affected by clinical endometritis.

L’objectif de la présente étude était d’évaluer un test d’estérase leucocytaire (LE) pour le diagnostic de l’endométrite subclinique chez les vaches Holstein en période postpartum. Les tests effectués à partir d’échantillons provenant soit de l’endomètre (UtLE) ou du col utérin (CxLE) ont été comparés à la cytologie endométriale (CE). Par ailleurs, deux méthodes d’évaluation des lames ont été comparées. Deux cent quatre vingt-cinq vaches Holstein de 5 troupeaux laitiers commerciaux ont été évaluées entre 21 et 47 jours en lait (JEL). Soixante sept vaches ont été diagnostiquées avec une endométrite clinique suite à un examen transrectal et vaginoscopique et ont été exclues de l’étude. Deux cent dix-huit vaches ont eu des prélèvements pour la CE et le test LE. La fonction ovarienne a été déterminée à la palpation transrectale. La banque de données utilisée pour chacune des vaches a été effectuée à partir du logiciel DSA (Dossier de Santé Animale) laitier. Le pourcentage de neutrophiles était significativement corrélé avec les scores de LE utérin et cervical. L’activité de CxLE et UtLE diminuait significativement avec les JEL, mais n’était pas associée au risque de gestation à 90 JEL (n= 186). Le pourcentage de neutrophiles mesuré à la CE entre 32 et 47 JEL était associé significativement au risque de gestation à 90 JEL (n=94, P=0.04). Pour la même période, selon une analyse de survie, les vaches avec >2,6% de neutrophiles à la CE étaient définies comme étant atteintes d’une endométrite subclinique avec une prévalence de 56%. Les résultats indiquent que le test d’estérase utérin ou cervical a une bonne concordance avec le pourcentage de neutrophiles à la CE. Une endométrite subclinique diagnostiquée par cytologie endometriale entre 32 et 47 JEL est associée à une réduction du risque de gestation au premier service.
The point toward this study was to determine the diagnostic test characteristics of the leukocyte esterase activity test for subclinical endometritis in postpartum Holstein dairy cows. The objectives were 1) to compare uterine leukocyte esterase activity and the endometrial cytology (EC), 2) to compare leukocyte esterase activity of the cervix (CxLE) and the uterus (UtLE), 3) Compare two methods of assessing the slides (i.e. an exhaustive method and a rapid method). Two hundred eighty five post partum Holstein cows from 5 commercial dairy herds had a post partum evaluation between 21 and 47 days in milk (DIM). Sixty seven cows where diagnosed with clinical endometritis by transrectal and vaginoscopy examinations and were excluded from the study. Two hundred eighteen cows were enrolled for endometrial cytology and esterase activity test. The ovarian status was determined by transrectal examination. Computerized databank, dairy DSA (Dossier de Santé Animale) indexing all the cows was used to retrieve individual information for analysis. The percentage of neutrophils was significantly correlated with the LE from the uterus and cervix. The LE from cervix and uterus decreased significantly with DIM, however, they were not statistically associated with pregnancy risk at 90 DIM (n=186). Between 32-47 DIM, the percentage of neutrophils and risk of pregnancy at 90 DIM were associated (n=94, P=0.04). For the same period, survival analysis identified cows with > 2.6 % neutrophils on EC as subclinical endometritis cows with a prevalence of 56%. The two methods for assessing the slides were correlated by 81%. Subclinical endometritis diagnosed by endometrial cytology between 32 and 47 DIM was associated with reduced risk of pregnancy at first service.