Academic literature on the topic 'Diabète non-insulinodépendant – Génétique'

Les maladies cardio-vasculaires et métaboliques représentent une proportion de plus en plus importante des facteurs réduisant la qualité et l’espérance de vie et entrainant une hausse vertigineuse des dépenses publiques dans le domaine de la santé. Cette augmentation est une des conséquences du vieillissement de la population dans nos sociétés occidentales ainsi que d’un changement marqué du mode de vie. Ce même phénomène touche également de plus en plus les pays en voie de développement. Devant cette urgence à remédier aux conséquences d’une telle explosion, la recherche des bases moléculaires de ces pathologies ainsi que de bio-marqueurs permettant d’augmenter leur prédictibilité représente une priorité. L’approche génétique, dans ce contexte, est une des voies les plus prometteuses. Cette approche présente de nombreuses variantes. Une des plus populaires dans la dernière décennie est l’approche des études d’association génome entier. La stratégie développée repose sur l’hypothèse d’un rôle important joué par variants génétiques fréquents pour des pathologies fréquentes. Ce paradigme a été nommé l’hypothèse de « Maladie fréquente, polymorphisme génétique fréquent » (« Common Variant / Common Disease »). Dans le cadre de ma thèse, j’explore l’effet de variants fréquents sur trois pathologies, le Diabète de Type 2, la Prolapsus Valvulaire Mitral, pathologies fréquentes et le Syndrome de Brugada, qui est rare dans la population. Ces trois pathologies présentent un poids important dans l’explosion des besoins sanitaires des populations, soit par la gravité des complications pour le Diabète de Type 2, soit par les besoins d’intervention chirurgicale lourde pour le Prolapsus Valvulaire Mitral ou enfin par le risque de Mort Subite inexpliquée pour le Syndrome de Brugada. J’ai appliqué différentes techniques génétiques que sont l’imputation, la méta-analyse et la correction de stratification afin de contribuer à mettre en évidence leurs bases génétiques. Dans le diabète de Type 2, la mise en évidence de l’architecture génétique était déjà bien avancée et j’ai participé à l’approfondissement de ces connaissances. Ces travaux ont permis de mettre en évidence jusqu’à 40 gènes associés après correction pour le nombre de tests. De façon important, nous avons montré qu’il existe une composante polygénique importante et que la plupart des gènes impliqués pointent vers un dysfonctionnement des cellules bêta. Les études sur le Prolapsus Valvulaire Mitral sont à un stade moins avancé. J’ai sélectionné des variants génétiques montrant une association possible et ces variants sont en cours de réplication. Les résultats préliminaires sur l’étude Framingham montrent la possible implication de gènes de la matrice extracellulaire. Enfin, pour le Syndrome de Brugada, j’ai clairement identifié trois loci qui montrent une association très significative et ne laissant pas de place au doute. Ces loci ont été répliqués aussi bien dans une population Européenne que dans une population Japonaise. Si l’implication de gènes codant pour des canaux ionique est confirmée, une autre voie liée au développement cardiaque est également mise en évidence. Enfin, au cours de ma thèse, j’ai également contribué à faire apparaître la notion de variant fréquent pour pathologie rare, dans l’étude d’association portant sur le Syndrome de Brugada
The escalating prevalence of cardio-vascular and metabolic disorders, and the limitations of currently available preventive and therapeutic options are increasingly important factors reducing the quality and life expectancy resulting in a dramatic increase in public spending in the health field. This emergency highlights the need for a more complete understanding of the pathogenesis of these diseases as well as the need for bio-markers to increase their predictability is a priority. The genetic approach, in this context, is among the most promising strategies. This approach has many variants. One of the most popular in the last decade is the approach of genome-wide association studies. The strategy is based on the assumption of an important role played by common genetic variants for common diseases. This paradigm has been called the assumption of "common variant, common disease". As part of my thesis, I explored the effect of common variants in three diseases, Diabetes Type 2, Mitral Valvular Prolapse, both being common pathologies and the Brugada syndrome, which is rare in the population. These three diseases strongly contribute to the explosion of population health needs, either by the severity of complications for Type 2 Diabetes, through the need of major surgery for Mitral Valvular Prolapse and through the increased risk of Sudden Death for Brugada Syndrome. I applied various techniques such as genetic imputation, meta-analysis and correction of stratification to help highlight their genetic bases. In Type 2 diabetes, highlighting of the genetic architecture was already well advanced and I participated in the deepening of knowledge. This work helped identify up to 40 genes. We have also shown that there is a substantial polygenic component underlying the genetic architecture of this disease and that most of the identified genes point to a dysfunction of beta cells. Studies on Mitral Valvular Prolapse are less advanced. I selected genetic variants showing a possible association and these variants are being replicated. Preliminary results on the Framingham study showed the possible involvement of genes of the extracellular matrix. Finally, for Brugada Syndrome, I clearly identified three loci that show a highly significant association with the disease. These loci were replicated as well in a European population in Japanese population. If the involvement of genes coding for ion channel proteins (SCN5A and SCN10A) seems to be confirmed, strengthening the definition of Brugada Syndrome as a channelopathy, another pathway possibly related to cardiac development was also identified (through the gene HEY2). Finally, during my PhD, I also contributed to create the concept of common variant for rare disease (CV/CR)

Les études d'association à l'échelle du génome (GWAS) ont montré que le locus P2RY1 est associé au risque de diabète de type 2 (DT2) et aux traits glycémiques associés. P2RY1 est un récepteur couplé à une protéine G (GPCR) activé par l'ATP et l'ADP, qui est fortement exprimé dans les îlots pancréatiques, en particulier dans les cellules bêta, où l'ATP/ADP stimule la sécrétion d'insuline en activant les canaux potassiques dépendants de l'ATP. À travers la génétique fonctionnelle, nous avons cherché à analyser les contributions potentielles des variants génétiques de P2RY1 au risque de DT2 et à d'autres caractéristiques métaboliques. Nous avons ensuite caractérisé les voies de signalisation en aval de P2RY1 dans les cellules bêta pancréatiques humaines et déchiffré son rôle potentiel dans la sécrétion d'insuline.P2YR1 a été séquencé chez 9,266 adultes, y compris des cas de DT2 et des témoins à glycémie normale. Pour évaluer l'effet fonctionnel de chaque variant identifié, nous avons réalisé 1) des expériences de luciférase (système NFAT-RE) sur des cellules HEK293 surexprimant chaque variant, suivis de l'activation de P2YR1 par des doses croissantes de MRS2365 (méthanocarba-2MeSADP), qui est un agoniste spécifique de P2RY1, et 2) une immunofluorescence pour évaluer la localisation cellulaire et l'expression de chaque mutant. Nous avons également effectué une analyse de locus de caractères quantitatifs (eQTL) chez 103 donneurs, basée sur la séquence d'ARN dans les îlots pancréatiques et le génotypage par microaray d'ADN. Dans les cellules bêta pancréatiques humaines (EndoCBH5), nous avons réalisé des expériences de sécrétion d'insuline stimulée par le glucose (GSIS) couplés à l'activation de P2YR1 par MRS2365 ou son inhibition par MRS2500.Nous avons identifié 22 variants faux-sens rares dans P2RY1 (dont 10 nouveaux variants). Nos analyses in vitro ont mis en évidence 7 mutations de perte de fonction. 87 % des porteurs de mutations présentaient un DT2. Les analyses eQTL ont montré qu'un groupe de polymorphismes nucléotidiques (SNP ; n=63) situé dans une région enhencer était significativement associé à une augmentation de l'expression de P2RY1 dans les îlots et à une diminution du risque de DT2, tandis qu'un autre groupe de SNP (n=51) était significativement associé à une diminution de l'expression de P2RY1 dans les îlots humains et à une augmentation du risque de DT2. Dans des cellules bêta Humaine (EndoCBH5), des experiences de secretion d'insuline (GSIS) ont montré que l'agoniste spécifique de P2RY1, MRS2365, entraînait une augmentation de 40 % de la sécrétion d'insuline lorsque les cellules était stimulé par 20 mM de glucose. Alors que l'inhibition de P2RY1 entraînait une diminution de 25% de la sécrétion d'insuline. Une analyse transcriptomique (par séquençage d'ARN) de la voie P2RY1 dans les cellules EndoCBH5 en réponse à l'agoniste MRS2365 ont démontrées que l'activation de P2RY1 entraînait une diminution de l'expression de TXNIP.Nos études génétiques, génomiques fonctionnelles et pharmacologiques suggèrent que la dysfonction de P2RY1 est causalement associée au risque de DT2 et que P2RY1 contribue à l'activation de la voie de sécrétion d'insuline. Des agonistes spécifiques et puissants de P2RY1 qui ne peuvent pas traverser la barrière hémato-encéphalique sont disponibles et pourraient être testés en tant que nouvelle classe potentielle d'insulinosécréteurs
Genome-wide association studies (GWAS) have shown that the P2RY1 locus is associated with type 2 diabetes (T2D) risk and with glucose levels. P2RY1 is a G-protein coupled receptor (GPCR) activated by ATP and ADP, which is highly expressed in pancreatic islets, particularly in β cells where, ATP/ADP stimulate insulin secretion by activating the ATP-dependent potassium channels. Through functional genetics, we aimed to analyze the putative contributions of genetic variants of P2RY1 to T2D risk and to other metabolic traits. We then characterized the downstream signaling pathways of P2RY1 in human pancreatic beta cells and deciphered its putative role in insulin secretion.P2YR1 was sequenced in 9,266 adults including cases with T2D and normal glucose controls. To assess the functional effect of each identified variant, we performed 1) luciferase assays (NFAT-RE system) on HEK293 cells overexpressing each variant, followed by P2YR1 activation by increasing doses of MRS2365 (methanocarba-2MeSADP) that is a specific agonist of P2RY1, and 2) immunofluorescence to assess cellular localization and expression of each mutant. We also performed expression quantitative trait loci (eQTL) analysis in 103 donors based on RNA-seq of pancreatic islets and DNA microrrays genotyping. In human pancreatic β cells (EndoCBH5), we performed glucose-stimulated insulin secretion (GSIS) assays coupled to P2YR1 activation by MRS2365 or inhibition by MRS2500.We identified 22 rare missense variants in P2RY1 (including 10 novel variants). Our in vitro analyses highlighted 7 loss-of-function mutations. 87% of the mutation carriers presented with T2D. Expression QTL analyses showed that a block of single nucleotide polymorphisms (SNPs; n=63) located in an enhancer of human islets was significantly associated with increased islet expression of P2RY1 and decreased T2D risk while another block of SNPs (n=51) was significantly associated with decreased expression of P2RY1 in human islets and increased T2D risk. In EndoCBH5, the GSIS assay showed that the P2RY1 specific agonist MRS2365 led to a 30% increase of insulin secretion when stimulated with 20mM of glucose. A kinome analysis (through PAMGENE technology) and transcriptomic analysis (through RNA sequencing) of the P2RY1 pathway in the EndoCBH5 cells in response to MRS2365 agonist orevealed that the activation of P2RY1 led to a decrease in the expression of TXNIP.Our genetic, functional genomic and pharamacological studies suggest that P2RY1 dysfunction is causatively associated with T2D riskand that P2RY1 contributes to the activation of the insulin secretion pathway. P2RY1 potent and selective agonists that cannot cross the blood-brain barrier are available, and could be tested as a potential new class of insulin secretagogues

Le diabète de type 2 résulte d’une diminution de la masse fonctionnelle de cellules bêta pancréatiques, possiblement liée à une dédifférenciation cellulaire : les cellules bêta restent présentes, mais leur production d’insuline s’effondre. Ce phénomène, s’il est avéré, ouvrirait la voie à de nouvelles recherches thérapeutiques. Mais s’il est démontré dans certains modèles murins, il n’existe que des arguments très indirects chez l’Humain. Notre objectif est d’apporter de nouveaux arguments pour ce phénomène chez l’humain en modélisant la dédifférenciation de cellules bêta humaines, en utilisant la lignée de cellules bêta pancréatiques humaines EndoC-βH1 et des îlots pancréatiques humains primaires. Nous avons découvert qu’un traitement par FGF2 effondrait la production d'insuline, et des études par RNA-Seq ont révélé un effondrement de plusieurs marqueurs spécifiques de la cellule bêta, incluant INS, MAFB, SLC2A2, SLC30A8 and GCK. Parallèlement, le traitement par FGF2 induisait l'expression de gènes normalement absents d’une cellule bêta, tels les facteurs de transcription MYC, HES1, SOX9 et NEUROG3. La dédifférenciation induite par le FGF2 était temps- et dose-dépendante, et réversible après wash-out. En outre, nous démontrons que la dédifférenciation modifie l’interaction de la cellule bêta avec son environnement : l'expression de TNFRSF11B (ostéoprotégerine), un récepteur tronqué pour RANKL (receptor activator of nuclear factor-kappaB ligand), est induite lors du traitement par FGF2, et les cellules β sont alors protégées contre la signalisation RANKL (TNFSF11) par inhibition de la phosphorylation de P38. Enfin, les analyses des données transcriptomiques ont révélé des niveaux accrus d'ARNm de FGF2 dans les cellules canalaires, endothéliales et stellaires dans les pancréas d’individus diabétiques de type 2, alors que les taux d'ARNm de FGFR1, SOX9 et HES1 sont augmentés dans les îlots pancréatiques d’individus diabétiques de type 2. Nous avons donc développé un modèle de dédifférenciation des cellules bêta humaines induit par le FGF2, identifié de nouveaux marqueurs de dédifférenciation, et trouvé des signes d'augmentation de FGF2, FGFR1 et des marqueurs de dédifférenciation au cours du diabète de type 2
Clinical and experimental evidences indicate a reduced functional β cell mass in type 2 diabetes. A recent hypothesis implicates β cell dedifferentiation in this reduction of functional β-cell mass. The vast majority of data related to β cell dedifferentiation derive from rodent models, and only indirect evidences are available in human. Our goal was to model human β-cell dedifferentiation using the functional human pancreatic β-cell line, EndoC-βH1, and primary human pancreatic islets. By screening a number of molecules in EndoC-βH1 cells, we found that FGF2 treatment dramatically reduces insulin production and MAFA expression, a β cell specific transcriptional activator. RNASeq of EndoC-βH1 cells treated with FGF2 revealed the down-regulation of additional human β cell specific markers, including INS, MAFB, SLC2A2, SLC30A8 and GCK. In parallel, FGF2 treatment activated the expression of β cell disallowed genes. This is the case for transcription factors such as MYC, HES1, SOX9 and NEUROG3. This is also the case for hormones such as GASTRIN and PYY. Such data were further confirmed by qPCR and immunostaining on primary human islets, attesting that dedifferentiation process occurs in human primary β cells. FGF2-induced dedifferentiation was time- and dose-dependent, and reversible upon wash-out. Furthermore, transcriptomic analysis revealed an increase of TNFRSF11B (osteoprotegerin) expression upon FGF2 treatment. TNFRSF11B is a decoy receptor for the receptor activator of nuclear factor kappa B ligand (RANKL). Our experimental data on EndoC-βH1 demonstrated that FGF2-induced TNFRSF11B protected β cells against TNFSF11 (RANKL) signaling by preventing P38 phosphorylation. Finally, analyses of transcriptomic data revealed increased FGF2 mRNA levels in ductal, endothelial and stellate cells in pancreases from type 2 diabetic patients, whereas FGFR1, SOX9 and HES1 mRNA levels increased in islets from type 2 diabetic patients. In conclusion, we developed a robust model to study β-cell dedifferentiation in a human context. We discovered SOX9, HES1 and MYC as positive markers of human β cell dedifferentiation, demonstrating evidence for dedifferentiation process in human β cell

Le diabètes mellites de type 2 (T2DM) est caractérisé par une hyperglycémie provenant d’une dérégulation de la sécrétion d’insuline combinée avec une altération de l’action de l’insuline. CaMK1D est un nouveau gène identifié, dont le rôle reste à explorer. Dans l’étude exposée ici, j’ai montré que CaMK1D a un effet majeur sur la régulation du glucose. J’ai observé une réduction exceptionnelle des taux de glucose sanguins à jeun, ce qui entraine une amélioration globale de la tolérance au glucose. Les souris mutantes montrent une augmentation conséquente dans les niveaux sanguins d’insuline. Les souris invalidées pour CaMK1D présentent des ilots pancréatiques de taille plus importante due à une hypertrophie des cellules béta. De plus, les souris mutantes sont protégées contre la stéatose hépatique. Dans l’ensemble, mon travail met en évidence le nouveau rôle clé de CaMK1D chez les cellules béta et apporte plus de compréhension quant à son rôle lors du développement du T2DM
Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is characterized by hyperglycemia resulting from defects in insulin secretion in combination with impaired insulin action. CaMK1D represents one potential candidate gene, the in vivo function remained elusive. In this work, I have found that CaMK1D plays a central role in blood glucose regulation. Pancreas-specific CaMK1D knockout mice display dramatically reduced fasting blood glucose levels leading to an overall improved glucose tolerance. CaMK1D knockout mice show markedly higher ad libitum and fasting insulin levels. Interestingly, pancreas-specific CaMK1D knockout mice display islet hyperplasia caused by beta-cell hypertrophy. Furthermore, conditional knockout mice are protected against high-fat feeding-induced hepatic steatosis. Overall, my work establishes an essential role of CaMK1D in pancreatic beta-cells and provides further understanding about its role in the development of T2DM

Le diabète et l’obésité ont atteint de telles proportions dans le monde qu’on parle de pandémie. Les enjeux médicaux et financiers font de ces deux maladies un problème majeur de santé publique. Deux groupes de facteurs contribuent à ces deux maladies : l’environnement, et la génétique sur laquelle cette thèse s’appuie. Ce travail s’est focalisé sur les formes rares et monogéniques qui constituent les formes extrêmes de diabète de type 2 et d’obésité.Ces formes sont loin d’être totalement élucidées. Mon projet s’est concentré sur l’utilisation du séquençage de nouvelle génération (NGS) pour identifier de manière plus optimale, par rapport au séquençage classique de type Sanger, des mutations dans des gènes déjà connus chez de nouveaux patients introduits dans notre cohorte dans une optique de diagnostic. Le deuxième objectif était d’utiliser les techniques de NGS pour découvrir de nouveaux loci, liés à de nouvelles voies de signalisation impliquées dans la physiopathologie du diabète et de l’obésité.La première approche utilise une technique d’enrichissement par hybridation en phase liquide et se focalise sur 34 gènes associés à des formes monogéniques et polygéniques d’obésité. Le criblage a été réalisé sur 201 individus dans 13 familles dont la cause d’obésité est inconnue. Cette approche a mené à l’identification d’une mutation dans un gène connu de l’obésité : PCSK1. Cette mutation est causale, car elle conduit à un codon-stop au début de la protéine et n’est présente que chez des individus obèses. De plus, l’étude fonctionnelle a démontré une inhibition partielle de PC1/3 par la protéine tronquée et un possible impact sur la maturation et la sécrétion de l’enzyme.La deuxième approche se base sur une technique d’amplification par PCR dans des microgouttelettes lipidiques développée par la société Raindance, dont le premier test vise à réidentifier les mutations causales du diabète et/ou de l’obésité chez 40 patients. Cette approche a donné des résultats satisfaisants, car pour une large majorité de patients, les mutations causales ont pu être à nouveau identifiées. Seul un patient n’a pu être reconfirmé à cause des outils bioinformatiques actuels qui restent limités dans la détection des indels complexes. Parmi les 39 patients identifiés, 3 d’entre eux sont potentiellement porteurs de plusieurs mutations causales. Cette technique pourrait être envisagée dans le domaine clinique, car elle permet une approche multigénique en fournissant un diagnostic rapide, moins couteux et qualitativement aussi bon que le séquençage Sanger.La troisième approche met en jeu le séquençage de l’exome entier (WES) chez 4 individus où la famille entière s’est précédemment révélée négative pour tous les gènes connus du diabète. Cette approche a permis la découverte d’un 13e gène du MODY, KCNJ11, et confirme le large spectre phénotypique qui va du diabète néonatal au MODY selon les mutations. La difficulté majeure de cette technique est le filtrage des variants en vue d’aboutir à une seule mutation causale (ou éventuellement plusieurs sur un même gène) pour identifier de nouveaux gènes du MODY. La stratégie utilisée combinait à la fois un filtrage bioinformatique, avec par exemple des filtres sur la coségrégation familiale et sur des bases de SNPs référencés, et un filtrage biologique, avec l’utilisation d’une technique de génotypage haut débit. En conclusion, ce travail a permis de tirer parti des avancées technologiques comme la capture, le séquençage ciblé de masse et le NGS pour élucider et améliorer le criblage des formes monogéniques de diabète et d’obésité. Cette amélioration de la compréhension des mécanismes moléculaires conduira peut-être au développement de meilleurs traitements comme la médecine personnalisée. On espère voir des améliorations directes pour le patient dans un futur proche, par exemple un diagnostic moléculaire plus rapide, plus sûr et plus exhaustif
Diabetes and obesity have reached such proportions worldwide we are talking about pandemic. Both diseases are a major cause of mortality and multiple complications. Medical and financial issues are for both diseases a major public health problem. Two groups of factors contribute to these two diseases: environment, and genetics on which this thesis is based. This work focused on rare and monogenic forms which are extreme forms of type 2 diabetes and obesity.These forms are far from being fully understood. My project focused on the use of next generation sequencing (NGS) to identify more optimally, compared to conventional Sanger sequencing, mutations in already known genes among new patients in our cohort for diagnostic purposes. The second objective was to use NGS to discover new loci associated with new signaling pathways involved in the pathophysiology of diabetes and obesity.The first approach uses a liquid-phase hybridization technique and focuses on 34 genes associated with monogenic and/or polygenic obesity. The screening was carried out on 201 people in 13 families for which the cause of obesity is unknown. This approach led to the identification of a mutation in a known gene of obesity: PCSK1. This mutation is causal because it leads to a stop codon at the beginning of the protein and is present only in obese individuals. Additionally, functional studies have demonstrated partial inhibition of PC1/3 by the truncated protein and the possible impact on the processing and secretion of this enzyme. This study has been published published in the "International Journal of Obesity" newspaper.The second approach is based on a PCR amplification technique in lipid microdroplets developed by Raindance. The first test is to re-identify the causal mutations of diabetes and/or obesity in 40 patients. This approach has yielded satisfactory results because for a large majority of patients, the causative mutations have been identified again. Only one patient was unable to be reconfirmed because current bioinformatics tools are limited in the detection of complex indels. Of the 39 patients identified, 3 of them are potential carriers of several causative mutations. This technique could be considered in the clinical field because it allows a multigene approach by providing a rapid diagnosis, cheaper and with a quality similar to the gold standard Sanger sequencing. For us, the purpose of this technique is a fast and optimal clinical diagnosis in order to identify unsolved cases, which are candidates for exome sequencing. This second study was published in "Diabetes Care" journal.The third approach involves whole exome sequencing (WES) in 4 individuals where the whole family was previously tested negative for all known genes of diabetes. This approach led to the discovery of a thirteen MODY gene, KCNJ11, and confirms the broad phenotypic spectrum that goes from neonatal diabetes to MODY depending on the mutations. The major difficulty with this technique is filtering variants in order to get a single causal mutation (or possibly several on the same gene) to identify new MODY genes. The strategy we used combined both a bioinformatics filter for example with filters on family cosegregation and on SNP databases and a biological filter, with the use of a technique for high-throughput genotyping. This pioneering study in the use of NGS to identify new genes of MODY has been published in "PLoS ONE".In conclusion, this work took advantage of technological advances such as capture, targeted sequencing and NGS to elucidate and to improve the screening of monogenic forms of diabetes and obesity. This improved understanding of the molecular mechanisms may lead to the development of better treatments like personalized medicine. We hope to see direct improvements for patients in the near future, such as a more accurate, faster and more comprehensive molecular