Academic literature on the topic 'Déficits immunitaires – Génétique'

Le syndrome d’activation macrophagique (SAM) ou syndrome hémophagocytaire est une pathologie compliquant soit certains déficits immunitaires d’origine génétique, soit certaines maladies hématologiques (essentiellement des lymphomes non hodgkiniens), infectieuses (herpèsvirus, bactéries, parasites) ou auto-immunes (lupus, maladie de Still). Il se caractérise par une suractivation aiguë du système immunitaire et plus particulièrement des lymphocytes T cytotoxiques et des cellules histiocytaires/macrophagiques, déclenchant une production massive de cytokines pro-inflammatoires avec fièvre, pancytopénie, organomégalie, altérations du bilan hépatique et de la coagulation. Une défaillance multiviscérale est fréquente, nécessitant la prise en charge en réanimation et mettant souvent en jeu le pronostic vital, avec une mortalité qui reste dans certains cas à près de 50 %. Le SAM implique souvent le rein, par le biais d’une nécrose tubulaire aiguë, d’une néphropathie interstitielle inflammatoire ou d’une glomérulopathie sévère, responsable de syndrome néphrotique. La mise en évidence de ce syndrome n’est pas toujours facile chez un patient avec un tableau de sepsis ou de choc septique, mais elle peut guider la prise en charge thérapeutique, notamment l’initiation d’un traitement par chimiothérapie ou immunosuppresseurs, selon l’étiologie identifiée.

Le dépistage néonatal a débuté en Europe dans les années 1960 avec celui de la phénylcétonurie. Le nombre de maladies dépistées a, par la suite, augmenté progressivement, de manière plus marquée à la fin des années 1990 avec l’arrivée de la spectrométrie de masse en tandem (MS/MS) qui a permis le dépistage de 40 à 50 maladies sur une seule goutte de sang séché. Les ajouts les plus récents à cette liste de maladies (mucoviscidose, déficits immunitaires combinés sévères et atrophie musculaire spinale) ont été rendus possibles grâce à la génétique moléculaire. À partir des informations provenant de 51 pays d’Europe, nous décrivons dans cette revue l’évolution du dépistage entre 2010 et 2020, ainsi que les progrès réalisés pendant cette période, tout en soulignant les aspects qui méritent d’être améliorés. Des progrès pourront en effet être accomplis grâce aux échanges d’informations et, pour certains pays, en tirant profit de l’expérience acquise dans des pays voisins. La plupart des programmes de dépistage mis en place dans l’Europe « géographique » au cours de cette période ont gagné en maturité en termes méthodologiques (modernisation des techniques) et en termes quantitatifs (augmentation du nombre des maladies dépistées). Ces développements nous montrent que la collaboration entre les différentes organisations s’accélère en Europe. Ce n’est qu’en travaillant ensemble que nous pourrons identifier en temps opportun les nouveau-nés atteints d’une des nombreuses maladies rares détectables et prendre les mesures qui s’imposent.

La narcolepsie et la cataplexie sont décrites pour la première fois à la fin du XIXe siècle en Allemagne et en France. La prévalence de la maladie est établie à 0,05 % et un modèle canin est découvert dans les années 1970. En 1983, une étude japonaise révèle que les patients narcoleptiques sont porteurs d’un marqueur génétique unique, l’antigène leucocytaire HLA-DR2, suggérant l’auto-immunité comme cause de la maladie. Il faudra attendre 1992 pour qu’il soit montré, grâce à une étude chez des patients afro-américains, que DQ0602, un autre gène HLA, est la véritable cause de cette association. Des études pharmacologiques conduites sur le modèle canin établissent que la stimulation dopaminergique est le mode d’action des stimulants sur l’éveil, tandis que les antidépresseurs suppriment la cataplexie en inhibant la recapture adrénergique. Aucune association HLA n’est cependant mise en évidence chez les chiens, suggérant une cause distincte de la maladie humaine. Une étude de liaison génétique chez les chiens, initiée en 1988, révèle en 1999 que la narcolepsie canine est causée par des mutations du récepteur 2 de l’hypocrétine (orexine). En 2000, l’hypocrétine-1/orexine A est mesurée dans le liquide céphalo-rachidien (LCR) et on découvre qu’elle est indétectable chez la plupart des patients narcoleptiques, établissant qu’un déficit hypocrétinergique est la cause de la narcolepsie humaine. La diminution de l’hypocrétine-1 dans le LCR, secondaire à la perte des 70 000 neurones hypothalamiques produisant l’hypocrétine, est démontrée, ce qui, avec l’association au locus HLA, suggère qu’une destruction immunitaire de ces cellules est la cause de la maladie. D’autres études génétiques, notamment d’association à l’échelle du génome (GWAS), révèlent l’existence de nombreux facteurs génétiques prédisposant à la narcolepsie, la plupart étant également impliqués dans d’autres maladies auto-immunes. Une association forte et unique avec les loci des récepteurs lymphocytaires T (TCR) alpha et bêta est aussi observée, suggérant un rôle prépondérant des lymphocytes T. En dépit de nombreux efforts, toutes les tentatives visant à démontrer la présence d’auto-anticorps contre les cellules à hypocrétine dans la narcolepsie échouent, et la cause auto-immune présumée de cette maladie reste à l’état d’hypothèse. À la suite de la grippe pandémique influenza A pH1N1 en 2009, de nombreux cas de narcolepsie apparaissent, suggérant un mimétisme moléculaire avec le virus de la grippe qui pourrait déclencher la maladie auto-immune. Cette hypothèse est confirmée par un criblage peptidique montrant une plus grande réactivité des lymphocytes T CD4+ à un segment spécifique de l’hypocrétine (HCRTNH2) et une réactivité croisée des TCR correspondants à un segment d’hémagglutinine de pH1N1 qui partage une homologie avec HCRTNH2. De façon remarquable, le TCR le plus fréquent dans la population et qui reconnaît ces antigènes contient des séquences TRAJ24 ou TRVB4-2, segments modulés par des polymorphismes génétiques associés à la narcolepsie dans les études GWAS. Il est probable que les lymphocytes T CD4+ autoréactifs avec HCRTNH2 recrutent par la suite des lymphocytes T CD8+ qui détruisent les cellules à hypocrétine. On peut s’attendre à ce que d’autres séquences mimiques grippales inconnues soient découvertes prochainement puisque la narcolepsie existait avant 2009. Ces découvertes démontrent enfin la cause auto-immune de la narcolepsie. Les travaux menés au cours des années sur la narcolepsie offrent une perspective unique sur la conduite de la recherche sur l’étiopathogénie d’une maladie bien identifiée.

L’anaplasmose granulocytaire ou ehrlichiose, due à l’infection par Anaplasma phagocytophilum, est une maladie bactérienne liée à la présence de tiques, à l’origine de lourdes pertes économiques en élevage, consécutives notamment à la chute de production laitière, aux avortements et aux surinfections fréquentes suite au déficit immunitaire induit. Les signes cliniques apparaissent en général lors de primo-infection, mais les veaux et les génisses non gestantes présentent le plus souvent des formes asymptomatiques ou atténuées de la maladie. Les mesures de prévention consistent à limiter les contacts des femelles gestantes avec les tiques et à faire sortir les veaux et les génisses non gestantes sur les pâtures à risque afin de favoriser le développement d’une immunité de prémunition. Cependant, certains élevages bovins présentent plusieurs épisodes cliniques successifs d’anaplasmose granulocytaire, notamment chez les adultes, entraînant des pertes économiques, malgré les mesures mises en place chez les jeunes animaux. L’existence de variants génétiques d’A. phagocytophilum circulant concomitamment au sein d’un élevage, ainsi que les risques de réinfection ou de coinfection par deux variants ou avec une autre espèce bactérienne, pourraient expliquer l’apparition de ces épisodes cliniques successifs.

Les déficits immunitaires primitifs sont un groupe de troubles causés par des mutations monogéniques dans des gènes jouant un rôle clé dans le développement et la fonction du système immunitaire. Dans cette thèse, une approche multiomique a été adoptée pour étudier deux gènes associés à ces conditions, afin d'élucider davantage les mécanismes par lesquels les variants pathogènes nuisent au système immunitaire. Le premier sujet était HYOU1, défini comme un gène dont les défauts causent un déficit immunitaire primitif. Nous avons observé une hypogranularité dans les neutrophiles du patient et révélé un arrêt de maturation dans la lignée des cellules B avant le stade des cellules B pro. Le deuxième sujet était ITGAL, un gène candidat potentiel non précédemment décrit en relation avec les déficits immunitaires primitifs. Nous avons démontré que le variant étudié est hérité selon un mode autosomique récessif, et les analyses de voies ont révélé un dysfonctionnement de plusieurs voies liées à l'adhésion et à la motilité. De plus, nous avons montré une élévation de l'expression d'autres intégrines, suggérant une réponse compensatoire visant à contrebalancer les intégrines défectueuses
Primary immunodeficiencies, or inborn errors of immunity, are a group of disorders caused by monogenic mutations in genes playing a key role in the development and function of the immune system. In this thesis, a multiomics approach was taken to study two genes associated with these conditions, further elucidating the mechanisms by which pathogenic variants impair the immune system. The first subject was HYOU1, defined as a gene whose defects cause primary immunodeficiency. We observed hypogranularity in the patient's neutrophils and revealed a maturation arrest in the B cell lineage before the pro-B cell stage. The second subject was ITGAL, a potential candidate gene not previously described in relation to primary immunodeficiencies. We demonstrated that the studied variant is inherited in an autosomal recessive pattern, and pathway analyses revealed impairment of multiple adhesion and motility-related pathways. Moreover, we showed an elevation in the expression of other integrins, suggesting a compensatory response to counterbalance the defective integrins

L’association entre déficits immunitaires primitifs (DIPs) et manifestations auto-immunes peut sembler paradoxale lorsque l’on aborde les DIPs comme des défauts d’immunité opposés à l’autoimmunité vue comme excès d’immunité adaptative à l’encontre du soi. Néanmoins, loin de se résumer à un simple défaut d’une ou plusieurs composantes du système immunitaire qui prédispose aux infections par divers agents pathogènes, les DIPs sont fréquemment associés à une autoimmunité; parfois révélatrice. Ainsi, les données épidémiologiques issues de registres ou de larges séries de patients atteints de DIPs s’accordent sur une prévalence globale de 25 à 30% de complications auto-immunes (au premier rang desquelles figurent les cytopénies auto-immunes). Différentes hypothèses sont avancées pour rendre compte de l’auto-immunité dans les DIPs. On peut citer : 1°) une perturbation profonde de l’homéostasie lymphocytaire, en particulier dans les déficits immunitaires combinés sévères (CID) avec lymphopénies T et B ; 2°) des défauts intrinsèques des lymphocytes B permettant une rupture de tolérance précoce des LB auto réactifs ; 3°) un comportement aberrant des LT (défaut de maturation, excès d’activation) ; 4°) une absence de lymphocytes T ou de B régulateurs ; 5°) une production inappropriée de certaines cytokines proinflammatoires comme dans les interféronopathies. Ces hypothèses concernent surtout les DIPs pédiatriques sévères. Mon travail de thèse explore la rupture de tolérance immunitaire adaptative au cours des DIPs de l’adulte par différentes approches. Nous nous sommes en particulier attachés au plus fréquent, le DICV (Déficit Immunitaire Commun Variable), déficit immunitaire humoral pas toujours bien défini sur le plan génétique et physiopathologique qui constitue un défi thérapeutique lorsqu’il est compliqué d’une auto-immunité nécessitant un traitement immunosuppresseur
The association between primary immune deficiency (PID) and autoimmunity may seem paradoxical when PID is considered only as an immune response defect against pathogens and autoimmunity only as an excess of immunity. Nevertheless, far from being simple immune defects increasing the risk of infections, DIPs are frequently associated with autoimmunity. Even more, autoimmunes manifestations can sometimes reveal a PID. Thus, epidemiological data from registers or large series of patients with PIDs agree on an overall prevalence of 25 to 30% of autoimmune complications (with auto-immune cytopenias as first causes). Several hypotheses have been proposed with different underlying mechanisms to explain the tolerance breakdown in PIDs. We can cite : 1°) a severe disturbance of lymphocyte homeostasis, for example in severe combined immunodeficiencies ; 2°) an impaired B-cell developpement with earlystage defects of tolerance ; 3°) a dysregulation of T cells (developpement or activation impairments) ; 4°) a dysfunction of T-reg (or B-reg) ; 5°) an excess of production of proinflammatory cytokines. These hypotheses are especially true for early-onset PIDs (in infancy). In this work (PhD), we explore the mechanisms of tolerance breakdown involved in adults PIDs. We use several approaches to describe the pathways leading to autoimmunity, focusing on the most common PID in adult : CVID (common variable immunodeficiency). This syndrome is not well defined on the genetic and physiopathological level. It is still a therapeutic challenge when complicated by autoimmunity (requiring immunosuppressive therapy)

La protéine tyrosine kinase ZAP-70 jour un rôle clé dans l'ontogénie et l'activation des cellules T. Les patients déficients en ZAP-70 présentent un déficit immunitaire combiné et sévère (DICS) caractérisé par un défaut de développement des cellules T CD8+ dans le thymus, associé à un défaut de fonction des cellules T CD4+ en périphérie. Ces patients peuvent être traités avec succès par une transplantation de cellules souches hématopoïétiques (TCSH) histocompatibles. Cependant, les greffes réalisées à partir de donneurs non-histocompatibles sont associés à de graves complications et à une reconstitution immune retardée et incomplète. La mise au point d'un traitement optimal pour ces patients nécessite une bonne connaissance du rôle fondamental de la protéine mutée. J'ai en premier lieu étudié le rôle de ZAP-70 dans les étapes précoces de la signalisation via le TCR. Nous avons montré que ZAP-70 est non seulement capable de transduire le signal, mais aussi de l'amplifier en augmentant la phosphorylation de la chaîne [zêta] du TCR et ainsi, de promouvoir sa propre phosphorylation ou celle de sa kinase homologue Syk. Ces résultats remettent en cause le modèle linéaire de signalisation via le TCR admis jusque-là et confirment le rôle essentiel que joue ZAP-70 dans l'activation des cellules T après engagement du TCR. Dans la deuxième partie de ce travail, j'ai exploré l'efficacité de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant le thymus en utilisant le modèle murin de la déficience en ZAP-70. Pour ce la, nous avons injecté des cellules souches hématopoïétiques (CSH) sauvages ou un vecteur lentiviral exprimant le transgène ZAP-70 directement dans le thymus des souris ZAP-70-/-. Ceci a permis une restauration de la différenciation thymique à long terme avec production de cellules T fonctionnelles chez les souris injectées. Le maintien de la thymopoïèse pendant plusieurs mois après transfert de gène suggère fortement la transduction de progéniteurs thymiques. Par ailleurs, l'injection intrathymique de CSH a permis une meilleure reconstitution de la lignée T par rapport à la TCSH conventionnelle effectuée par voie intraveineuse, avec production d'un plus grand nombre de cellules T, au répertoire plus diversifié. L'ensemble des données ainsi obtenues devrait contribuer au développement de stratégies thérapeutiques génique et cellulaire optimales et sûres pour le traitement, non seulement de l'immunodéficience liée à ZAP-70, mais aussi pour celui d'autres formes d'immunodéficiences. Par ailleurs, le ciblage du thymus peut constituer un outil intéressant pour l'immunomodulation, ainsi que pour les études fondamentales du développement et fonction des cellules T.

Le système immunitaire est particulièrement dépendant des mécanismes de réparation de l’ADN, en effet le développement du système immunitaire adaptatif nécessite certains mécanismes de réparation de l’ADN, lors de la recombinaison V(D)J et lors de la commutation de classe des immunoglobulines. De plus, le système hématopoïétique est par sa nature très sensible aux lésions spontanées de l’ADN. Il existe chez l’homme de nombreux déficits immunitaires directement liés à un défaut de réparation de l’ADN. L’identification du gène responsable est importante pour un conseil génétique familial approprié et pour la prise en charge médicale. Nous avons accès aujourd’hui à de puissants outils de dépistage génétique grâce au séquençage à haut débit et la liste des gènes responsables d’un déficit immunitaire s’allonge de plus en plus en rapidement. La première partie de ce travail porte sur la mise au point d’un nouvel outil de dépistage rapide des déficits de la réparation de l’ADN, en particulier dans le cas de déficit immunitaires. Ce test est fondé sur l’observation d’un biais du répertoire du TCRdes lymphocytes T circulants lorsque les thymocytes ont une durée de vie diminuée, or un défaut de réparation de l’ADN entraîne une diminution de la survie thymocytaire. Nous avons mis au point deux techniques, par biologie moléculaire et par cytométrie en flux, pour détecter un éventuel biais du répertoire du TCRα et évaluer la pertinence de ce test dans les déficits immunitaires liés à un défaut de réparation de l’ADN. Un biais a notamment été détecté dans les cas de déficit en facteur du NHEJ et en ATM. Nous avons également établi en collaboration avec le service d’Immunologie Clinique de l’hôpital Saint-Louis une cohorte de patients atteints de déficit immunitaire commun variable (DICV) dont la présentation clinique est évocatrice d’un défaut de réparation de l’ADN. Une série de test fonctionnels de dépistages de déficit de la réparation de l’ADN ainsi que des analyses génétiques (CGH array, séquençage complet de l’exome) ont été fait chez ces patients afin d’identifier de nouveaux gènes impliqués dans les DICV. Parmi les 18 patients analysés, dans 5 cas on retrouve une sensibilité cellulaire accrue aux agents génotoxiques et chez 15 patients, un gène candidat a été identifié. Ces résultats sont encore préliminaires et la caractérisation génétique et fonctionnelle des mutations identifiées sera poursuivie par notre équipe. Pour finir, nous avons entrepris l’exploration génétique et fonctionnelle de deux mutations identifiées chez une jeune patiente atteinte de déficit immunitaire combiné (CID) associé à un syndrome lymphoprolifératif et une auto-immunité, et chez qui une hypersensibilité cellulaire à la Mitomycine C, agent pontant de l’ADN, a été détectée. La première mutation a été identifiée dans le gène ELKS qui code pour un facteur impliqué dans la réparation de l’ADN. La complémentation fonctionnelle de ce gène prouve l’implication de cette mutation dans l’hypersensibilité des cellules de la patiente à la MMC. Nous avons développé un modèle murin KO conditionnel de ce gène dans les cellules hématopoïétiques qui n’a pas montré de défaut de développement du système immunitaire. La deuxième mutation identifiée se situe dans le gène BACH2 codant pour un répresseur transcriptionnel très impliqué dans le développement du système immunitaire. Les souris KO pour ce gène ont un phénotype proche du déficit immunitaire décrit chez cette patiente. Les investigations de cette mutation sont en cours chez elle et chez les membres de sa famille également porteurs de la mutation
The immune system is particularly dependent on DNA damage response (DDR) pathways. The development of the adaptive immune system requires certain DDR mechanisms, in particular during the V(D)J recombination and during class switch recombination (CSR), furthermore, the hematopoietic system is very sensitive to spontaneous DNA lesions. Therefore, there are many immune deficiencies in human directly related to a DDR deficiency. The identification of the responsible gene is important for appropriate genetic counseling. Today, we have access to powerful genetic screening tools, in particular next generation sequencing (NGS) and the list of genes responsible for immune deficiency is growing rapidly. The first part of this work focuses on the development of a new screening tool for DDR defects, in particular in the case of immune deficiency, and evaluation of clinical interest. This test is based on the observation of a bias of the TCRα repertoire in circulating T lymphocytes when thymocytes lifespan is diminished and we know that DDR defect causes decreased thymocyte survival. We have developed two techniques, by molecular biology and by flow cytometry, to detect a potential bias of the TCRα repetoire and assess the suitability of this test in some immunodeficiencies linked to a DDR defect. A significant bias was detected in the case of ATM and NHEJ factor deficiency. Furthermore, we have established a cohort of patients suffering from common variable immunodeficiency (CVID) with a clinical presentation highly suggestive of DDR defect, in collaboration with the Clinical Immunology Service of Hôpital Saint-Louis (Paris). Functional test for DDR defect and genetic analysis (CGHarray, whole exome sequencing) were performed in these patients to identify new genes involved in CVID. Among the 18 patients analyzed until now, five cases of cellular sensitivity to genotoxic agents have been detected and a candidate gene was identified in 15 of them. These results are still preliminary and our team will pursue genetic and functional characterization of the identified mutations. Finally, we undertook genetic and functional exploration of two mutations identified in a young patient with combined immunodeficiency (CID) associated with a lymphoproliferative disease and autoimmunity, and in whom a cellular hypersensitivity to mitomycin C, a DNA crosslinking agent, was detected. The first mutation was identified in the ELKS gene, which codes for a factor involved in DNA repair. Functional complementation of this gene demonstrates the involvement of this mutation in the hypersensitivity of patient’s cells to MMC. We have developed a conditional knockout mouse model of this gene in hematopoietic cells that did not show any defect in development of the immune system. The second mutation was identified in BACH2 gene encoding a transcriptional repressor involved in the development of the immune system. Knockout mice for this gene have a similar phenotype to the immune deficiency described in this patient. Investigations on this mutation are ongoing in the patient and among family members that also carry the mutation

Au-delà du bénéfice clinique du diagnostic, l'étude des patients atteints de déficits immunitaires héréditaires a aussi largement contribué à la compréhension des mécanismes moléculaires complexes impliqués dans la réponse adaptative humaine contre les pathogènes. Cependant, un grand nombre d’immunodéficiences primaires n’a pas encore été génétiquement défini, en particulier le déficit immunitaire commun variable (ou CVID en anglais). Au cours de ma thèse, j'ai cherché à identifier et caractériser de nouvelles causes moléculaires aux immunodéficiences primaires en me basant sur des mutants naturels humains comme modèle de recherche. Par séquençage entier de l'ADN de patients présentant une forme pédiatrique ou familiale de lupus érythémateux disséminé (ou SLE en anglais) et CVID, nous avons identifié trois variations hétérozygotes distinctes prédites comme délétères chez un patient atteint de CVID (RELAWT/Y306X), un patient pédiatrique SLE (RELAWT/R329X) et les patients atteints de SLE (RELAWT/H86N). Afin de comprendre comment les mutations identifiées peuvent affecter le rôle de RELA dans la voie NF-kB, nous avons confirmé que les deux mutations non-sens de RELA entraînent l'expression de formes tronquées de la protéine, tandis que la mutation faux-sens menait à l'expression de formes mutées de la protéine. Par immunoblot des protéines nucléaires et par immunofluorescence cellulaire, nous avons démontré que les deux formes tronquées de RELA peuvent entrer dans le noyau. Ensuite, en utilisant un oligonucléotide consensus NF-κB marqué, nous avons démontré que les deux formes tronquées de RELA étaient capables de se lier à l'ADN. Les trois protéines RELA mutées, lorsqu'elles étaient exprimées de manière ectopique, présentaient une altération de l'activité transcriptionnelle. Enfin, nous avons montré par co-immunoprécipitation que les trois protéines RELA mutées exprimées de manière ectopique sont capables d'interagir avec ses partenaires protéiques et de former des homodimères. En conclusion, nos résultats indiquent que des mutations affectant le facteur de transcription RELA peuvent être associées à des CVID ou des SLE. Étant donnés les cas précédents décrivant des haploinsuffisances de RELA liées à un syndrome lymphoprolifératif avec auto-immunité associé à une cytopénie auto-immune ainsi qu’aux ulcérations cutanéo-muqueuses TNF-dépendantes associées à des inflammations intestinales, notre travail élargit le spectre des maladies et des phénotypes cliniques liés à un dysfonctionnement de la protéine RELA et suggère que différentes mutations du gène RELA entraînent diverses conséquences fonctionnelles
Beyond the clinical benefit for diagnosis, the study of patients with primary immunodeficiency (PID) has also largely contributed to the deciphering of the complex molecular mechanisms involved in the human adaptive response against pathogens. Still, a large number of PIDs, especially common variable immunodeficiency (CVID), are genetically not defined. During my thesis, I aimed to identify and characterize novel molecular causes of PIDs based on human natural mutants as a research model (1). By whole-exome sequencing of DNA from patients presenting either with pediatric or familial form of CVID and Systemic Lupus Erythematosus (SLE), we identified three distinct heterozygous single nucleotide variations predicted deleterious in a CVID patient (RELAY306X), a pediatric SLE patient (RELAR329X) and familial SLE patients (RELAH86N). To better understand how the identified mutations may impact the role of RELA in the NF-kB pathway, we confirmed that the two nonsense RELA mutations led to the expression of truncated forms of the protein, while the missense mutation led to the expression of mutated forms of the protein. By immunoblotting of nuclear protein extracts and cellular immunofluorescence, we demonstrated that the two truncated forms of RELA can translocate into the nucleus. Then, using a labeled NF-κB consensus oligonucleotide, we demonstrated that the two truncated forms of RELA were able to bind to DNA. All three mutated RELA proteins, when expressed ectopically, had an impaired transcriptional activity. Finally, we showed by immunoprecipitation that all three ectopically expressed mutated RELA proteins are able to interact with protein partners and form homodimers. As a whole, our results indicate that mutations affecting the transcription factor RELA can be associated with CVID or SLE. Given the previous cases associating RELA haploinsufficiency to autoimmune lymphoproliferative syndrome with autoimmune cytopenia and to TNF-dependent mucocutaneous ulceration and inflammatory intestinal disease, our work widens the spectrum of disease and clinical phenotypes associated with RELA dysfunction and suggests that different RELA mutations lead to different functional consequences

Le déficit immunitaire commun variable (DICV) est le déficit immunitaire symptomatique le plus fréquent de l'adulte. De cause inconnue, il est caractérisé par un défaut de production d'immunoglobulines associé à un ensemble hétérogène de manifestations cliniques comprenant des infections ainsi que des complications autoimmunes et lymphoprolifératives. Les granulomatoses constituent une des complications lymphoprolifératives et sont caractérisées par l'infiltration d'un ou plusieurs organes par des structures histologiques composées de macrophages activés entourés d'une couronne lymphocytaire. La granulomatose du DICV est d'étiologie inconnue. Nous avons caractérisé le phénotype de 59 patients atteints de granulomatose et montré qu'il s'agissait d'un groupe homogène présentant un déficit immunitaire sévère. Nous avons montré que la présence du polymorphisme +488A du gène du TNFA était associé à la survenue d'une granulomatose au cours du DICV. Nous avons étudié la prévalence des polymorphismes rs2076530 du gène BTNL2 et rs1049550 du gène ANXAll associés à la survenue d'une sarcoïdose et montré que ceux-ci n'étaient pas associés à la granulomatose du DICV. Nous avons enfin fait l'hypothèse que certaines mutations hypormorphes touchant des gènes responsables de déficits immunitaires pédiatriques pouvaient être responsables de formes monogéniques de DICV avec granulomatose et ainsi mis en évidence une mutation faux sens p. S94T du gène IL2RG chez un patient atteint d'une granulomatose liée à une maladie de Whipple ainsi que deux mutations hétérozygotes faux sens (p. S676R et p. Q242R) de RAGI chez deux patients atteints de DICV avec granulomatose et lymphome
Common variable immunodeficiency (CVID) is the most frequent primary immune deficiency in adults. It encompasses a broad spectrum of clinical manifestations including infectious, autoimmune and lymphoproliferative complications. Granulomatous disease, defined by nodal or extranodal non-caseating granulomas, belongs to lymphoproliferative complications and remains of unknown etiology. We analyzed the clinical and biological phenotype of 59 patients with CVID-associated granulomatous disease and showed that they belonged to a highly homogeneous subgroup with severe immune deficiency. We also showed a strong association between granulomatous disease and a SNP located at position 488 of the TNFA gene. We failed to demonstrate any statistical association with two SNPs in the BTN L2 and ANXA 11 genes recently linked to sarcoidosis occurrence. We hypothesized that hypomorphic mutations of SCID genes could be responsible for some cases of granulomatous-associated CVID and identified an IL2 RG mutation in a patient with Tropheryma Whipplei infection and two heterozygous RAG 1 mutations in two patients with lymphoma. All mutations were previously undescribed missense mutations and resulted in hypomorphic alleles

Le DICV est une maladie dont la physiopathologie reste encore largement incomprise. La caractéristique de ce syndrome est l'hypogarnmaglobulinémie, les patients peuvent également combiner plusieurs complications cliniques : infections à répétition, lymphoprolifération, maladie auto-immune. Cette maladie touche presque exclusivement des individus d'origine caucasienne (1/30 000 en France). Dans la cohorte DEFI, 21% de cas familiaux sont recensés, ce qui a justifié d'orienter ce travail de thèse vers la génétique. L'identification de deux nouveaux patients porteurs de mutations dans le gène CD 19 a permis d'améliorer la compréhension de ce déficit immunitaire et de montrer une hétérogénéité phénotypique chez les patients. Le CD 19 apparaît donc comme un acteur majeur dans la réponse efficace aux infections nécessitant la participation des LB. TACI présente le paradoxe d'être le gène le plus fréquemment muté dans le DICV (10% des patients), mais aussi le plus controversé quant à son implication dans la genèse de l'hypogammaglobulinémie car des mutations sont aussi retrouvées dans la population générale. Les mutations de TACI prédisposent à l'apparition du DICV, mais elles ne sont ni nécessaires ni suffisantes et d'autres facteurs (génétiques, environnementaux) sont certainement impliqués. Ce travail a donc permis de mieux comprendre la physiopathologie du DICV par l'identification de mutations dans des gènes connus avec des phénotypes cliniques ou biologiques inhabituels et par la confirmation de la fréquence des mutations de TACI dans le DICV, sans que l'on puisse dégager de consensus clair quant au rôle effectif de TACI dans la genèse de rhypogammaglobulinêmie chez l'homme
Common variable immunodeficiency is a primary immunodeficiency characterized by defective antibody production leading to recurrent infections, lymphoproliferation or autoimmune diseases. This affection is closely restricted to Caucasian population (1/30,000 in France). The 21% of family cases observed in the DEFI cohort led us to study the genetic aspects of CVID. We identified two patients with new mutations in CD19. Their phenotypes indicate that CD 19 signalling remains crucial for a robust humoral response and point to its possible role in IgGl switching and control of autoimmunity. TACI is very frequently mutated in CVID (10% of patients). However, its involvement in CVID genesis is controversial since mutations are also present in controls. TA CI mutations predispose to the onset of CVID, but they are neither necessary nor sufficient, suggesting other features (genetic or environmental) are certainly involved. This work has improved the understanding of CVID pathophysiology by the discovery of mutations in previously known genes (BTK, SH2D1A, CD 19) with unusual clinical and biological features and by the confirmation of TACI mutations frequency in CVID

La sous-unité catalytique p110 de la phosphatidylinositol-4,5-biphosphate 3-kinase (PI3K) est exprimée spécifiquement dans les leucocytes, et possède un rôle central dans la biologie des lymphocytes. Des mutations germinales dominantes gain-de-fonction de PI3KCD (codant p110 ) ont été identifiées récemment chez des patients présentant une immunodéficience combinée caractérisée par une présentation clinique hétérogène incluant des infections récurrentes des voies respiratoires et des lymphoproliférations associées à une virémie EBV et/ou CMV élevée, connue sous le nom de syndromes APDS. L’hétérogénéité des présentations cliniques suggère l’existence de facteurs secondaires, génétiques ou environnementaux. Au cours de ma thèse de doctorat, j’ai rapporté le cas de deux nouveaux patients présentant des anomalies génétiques affectant la voie PI3K. Le premier patient, né dans une famille consanguine, présentait une mutation gain- de-fonction de PIK3CD déjà décrite. Par séquençage de l’exome du patient, nous avons identifié une seconde mutation homozygote non-sens de SEC14L2, un régulateur connu de la voie PI3K. Nous avons analysé le phénotype et la fonctionnalité des lymphocytes du patient, et avons mis en évidence in vitro certains mécanismes de régulation de l’activation lymphocytaire par SEC14L2. Enfin, nous avons réalisé une étude de transcriptome afin d’identifier les voies de régulation dérégulées chez notre patient. Dans l’ensemble, ces résultats ont permis d’identifier le premier co-facteur génétique associé au syndrome APDS. Le second patient est également né dans une famille consanguine et présentait des infections sévères des voies respiratoires et un syndrome d’infection chronique à l’EBV (CAEBV) fatal. Par séquençage de l’exome du patient, nous avons identifié une mutation homozygote rare dans PIK3CD. Une modélisation de la structure de la protéine a montré que l’acide aminé muté se situe dans le domaine catalytique de p110 , dans une boucle phylogénétiquement conservée interagissant avec la sous-unité régulatrice p85↵ de la PI3K, et que la mutation conduisait à la perte de cette interaction. In vitro, la mutation de p110 cause la perte de l’activité PI3K, et les lymphocytes T du patient présentaient une diminution de phosphorylation d’AKT et de p70 S6K, deux cibles de la PI3K. Les lymphocytes T du patient présentaient également une production diminuée d’IFN- et de TNF↵, et un excès de prolifération et de flux calcium suite à la stimulation du TCR. Des lignées cellulaires Jurkat déficientes pour PIK3CD générées par CRISPR/Cas9 ont également présenté un défaut de phosphorylation d’ATK et un excès de prolifération et de flux calcium. L’expression de la version sauvage de p110 dans ces cellules, mais pas de la version mutée, a permis une restauration des réponses normales, prouvant l’implication de la mutation dans les phénotypes cellulaires identifiés. De manière intéressante, nous avons mis en évidence l’existence d’un équilibre entre l’activité PI3K et PLC- 1 lors de l’activation T, qui pourrait être expliqué par une compétition pour l’accès à leur substrat commun, le PIP2. Enfin, nous avons identifié chez notre patient une seconde mutation homozygote délétère dans le gène TNFRSF9. Cette mutation est également retrouvée chez la sœur saine du patient, qui présentait une réplication persistante de l’EBV dans le sang, suggérant que cette mutation pourrait agir comme facteur génétique secondaire. Dans l’ensemble, cette étude à permis l’identification de la première immunodéficience associée à des mutations perte-de-fonction de PIK3CD
The pathway p110 catalytic subunit of phosphatidylinositol-4,5-biphosphate 3-kinase (PI3K) is selectively expressed in leukocytes and has a central role in lymphocytes biology. Gain-of-function dominant germline mutations of PIK3CD (encoding p110 ) have been recently described in patients presenting a heterogeneous combined immunodeficiency associated with respiratory tract infections, lymphadenopathy and high EBV and/or CMV viremia. The heterogeneous clinical presentation suggests the existence of genetic or environmental modifying factors. In my thesis I report two new patients with different genetic defects causing CID. The first patient, born from a consanguineous family, presented a known gain-of- function mutation of PIK3CD. His clinical presentation was partially compatible with the already described patients. By whole exome sequencing, we identified a homozygous nonsense mutation in SEC14L2, a known regulator of PI3K pathway. We further analyzed the phenotype and functions of patient’s lymphocytes, and performed a transcriptome analysis to better characterize the implication of SEC14L2 mutation in the pathology. The second patient was born from consanguineous family and presented recurrent severe respiratory tract infections and a fatal Chronic Active EBV disease (CAEBV). By Whole Exome Sequencing, we identified a homozygous rare missense mutation in PIK3CD. 3D structure modelization showed that the mutated amino acid is located in p110 catalytic domain, in an evolutionarily conserved loop that interacts with alpha-helix of PI3K regulatory subunit p85a, which interaction is lost in mutated p110 . Phenotyping of patient’s circulating lymphocytes showed increased CD8+ T cells and reduced NK and CD4+ T cells. The mutation in PI3KCD resulted in impaired PI3K activity in vitro and in vivo. Moreover, patient’s T cells exhibited reduced activation-induced phosphorylation of AKT and p70-S6K, two indirect targets of p110 , that we restored by expressing wild type p110 . Patient’s T cells also showed a decreased induction of IFN- and TNF-↵ and an increased proliferation and calcium flux after TCR stimulation. By CRISPR CAS9 technology, we generated Jurkat T- cell lines expressing wild type or mutated PI3K. Jurkat cells expressing mutant PI3K showed decreased AKT phosphorylation and increased calcium flux and proliferation after TCR stimulation, confirming the implication of PIK3CD mutation in patient’s cells phenotype. Interestingly, we highlighted the existence of a balance between PI3K and PLC- 1 activity during T cell activation, that may be due to a competition for access to their shared substrate, the PIP2. Finally, we identified in our patient a second deleterious mutation in TNFRSF9 that is shared by his healthy sister, who also presented persistent EBV replication in blood, suggesting that this additional mutation may act as a modifying genetic factor. Taken together, the results presented in this thesis identified the first loss-of-function mutation in PIK3CD causing CID

La radiothérapie est un traitement majeur des cancers car les radiations ionisantes (RI) vont induire différents dommages à l'ADN dont les cassures doubles brins (CDB). Lors de l'irradiation d'une tumeur, les cellules du microenvironnements vont être aussi irradiées et cela pourraient modifier la réponse des cellules cibles. Parmi les cellules du stroma mammaire, les adipocytes pourraient jouer un rôle important car ce sont les cellules les plus abondantes du stroma mammaires et elles sécrètent de nombreux facteurs susceptibles de modifier le comportement de la tumeur. Je me suis intéressé dans un premier temps à la réponse des adipocytes à l'exposition aux RI, et dans un deuxième temps à l'influence des adipocytes sur la radiosensibilité de cellules tumorales mammaires. Nous avons pu montrer qu'au cours de l'adipogenèse, l'activité de réparation des CDBs est augmentée et cela est du à l'augmentation de l'expression et de l'activité d'une protéine clé de ce mécanisme de réparation, la DNA-PKcs. Ces résultats sont retrouvés pour une adipogenèse murine et humaine. Par ailleurs, nous avons pu montrer que les adipocytes étaient des cellules radiorésistantes, ce qui favorise l'hypothèse de leur participation à la réponse tissulaire aux RI. Effectivement, les premiers résultats obtenus montrent que dans un système de coculture en 2D, les adipocytes protègent les cellules tumorales mammaires de la mort clonogène, cet effet étant dépendant de facteurs solubles sécrétés par les adipocytes. Il serait intéressant d'étudiant l'influence des adipocytes dans un contexte d'obésité, car l'obésité est associée à un mauvais pronostic des cancers
Radiotherapy is a major therapeutic strategy in the treatment of many human tumors becase the exposure to ionizing radiation (IR) induces DNA damage and among them DNA double strand breaks (DSBs). However, cancer is a tissue-based disease in which malignant cells interact dynamically with multiple normal cell or stroma, and to the response to IR, emerging studies suggest that the irradiated stroma can influence the sensibility of cancer cell. Stroma was composed by differents types of cell, and adipocytes cells are excellent candidat because they are highly represented in breast tumor stroma and are able to secrete many factors. So the goal of our project was to investigate if adipocyte can influence the tissue response to IR. As a first step, we have demonstrated that the ability to repair DSBs is increased during adipocyte differentiation, that can explain by the increase of expression and activity of a key protei of DSB repair, DNA-PKcs. This result are observed during human and mrin adipogenesis. Moreover, we are observed that adipocyte are radioresistan cell and this ability to resist to genotoxic stress supports the idea that adipocytes might participate to radioresistance at a tissue level. In fact we demonstrated, in a 2D co-culture model that adipocytes protect breast cancer cell from clonogenic cell death in a manner that is dependent of secreted soluble factors. Accordingly, it would be of interest to evaluate the paracrine role of adipocytes within the context of obesity that has been recently established a negative prognostic factor even for localized breast tumors