Dissertations / Theses on the topic 'Décision de destin cellulaire'

L’inhibition latérale par Notch est un mécanisme bien conservé au sein des espèces qui permet la formation de pattern de destins cellulaires1. Dans de nombreux tissus, la signalisation intercellulaire entre Delta et Notch coordonne dans le temps et l’espace des décisions de destin cellulaire binaires dont l’origine est proposée stochastique. Dans le contexte du développement des organes sensoriels chez la Drosophile, il a été proposé que la rupture de symétrie entre cellules équipotentes dépendait de fluctuations aléatoires dans le niveau d’expression de Delta/Notch2 (ou d’un de ses régulateurs en amont, par exemple YAP1 dans l’intestin de la souris3), avec des petites différences qui sont amplifiées et stabilisées pour générer des destins distincts. La décision cellulaire stochastique médiée par Notch peut aussi être biaisée par des facteurs intrinsèques (par exemple, l’histoire de la cellule4) ou des facteurs extrinsèques. Bien que l’inhibition latérale ait été largement étudiée dans de nombreux contextes développementaux, il manque toujours une analyse détaillée in vivo de la dynamique de l’acquisition du destin cellulaire et des signaux régulant cette décision. Ici, nous avons utilisé une approche quantitative d’imagerie en temps réel pour étudier la dynamique de spécification des organes sensoriels dans l’abdomen de la drosophile. Pour suivre la compétence des cellules à s’engager dans le destin neural et devenir une cellule précurseur des organes sensoriels (SOP), nous avons utilisé l’accumulation du facteur de transcription Scute, un régulateur majeur de la formation des organes sensoriels dans l’abdomen. Pour visionner Scute directement dans les pupes en développement, nous avons utilisé des pupes exprimant la protéine Scute taguée par une GFP. Nous avons généré des films haute résolution dans le temps et l’espace puis nous avons segmenté et traqué tous les noyaux grâce un pipeline personnalisé. Nous avons ainsi pu étudier quantitativement la dynamique de l’expression de Scute dans toutes les cellules. Après avoir défini un index de différence de destin cellulaire (FDI), nous avons trouvé que la rupture de symétrie était détectée tôt, quand les cellules exprimaient encore un niveau faible et hétérogène de Scute. Quelques rares cas de résolution tardive ont été observés c’est-à-dire quand deux cellules voisines accumulent toutes les deux un fort niveau de Scute avant d’être séparées. Il est aussi intéressant de noter que le niveau de Scute n’a pas rapidement diminué dans les cellules non sélectionnées, immédiatement après la rupture de symétrie. D’autre part, nous avons trouvé une corrélation positive entre la pente du FDI après la rupture de symétrie et l’hétérogénéité intercellulaire mesurée dans le niveau de Scute mais il reste à démontrer si l’augmentation de l’hétérogénéité est causalement liée à la rupture de symétrie. Nous avons ensuite voulu savoir si cette décision cellulaire stochastique était biaisée par l’ordre de naissance (comme proposé dans le contexte de décision AC/VU chez le C. elegans4) ou par la taille et la géométrie des contacts cellulaires (comme suggéré par une modélisation5). Nous avons trouvé qu’aucun des deux biais ne semblait influencer la décision cellulaire binaire médiée par Notch dans l’abdomen de la Drosophile. En conclusion, nos données d’imagerie fournissent une analyse quantitative détaillée de la dynamique des proneuraux pendant l’inhibition latérale chez la Drosophile
Lateral inhibition by Notch is a conserved mechanism that regulates the formation of regular patterns of cell fates1. In many tissues, intercellular Delta-Notch signaling coordinates in time and space binary fate decisions thought to be stochastic. In the context of sensory organ development in Drosophila, it has been proposed that fate symmetry breaking between equipotent cells relies on random fluctuations in the level of Delta/Notch2 (or one of their upstream regulators, e.g. YAP1 in the mouse gut3), with small differences being amplified and stabilized to generate distinct fates. Notch-mediated stochastic fate choices may also be biased by intrinsic, i.e. cell history4, or extrinsic factors. Although lateral inhibition has been extensively studied in many developmental contexts, a detailed in vivo analysis of fate and signaling dynamics is still lacking. Here, we used a quantitative live imaging approach to study the dynamics of sensory organ fate specification in the Drosophila abdomen. The accumulation of the transcription factor Scute (Sc), a key regulator of sensory organ formation in the abdomen, was used as a proxy to monitor proneural competence and SOP fate acquisition in developing pupae expressing GFP-tagged Sc. We generated high spatial and temporal resolution movies and segmented/tracked all nuclei using a custom-made pipeline. This allowed us to quantitatively study Sc dynamics in all cells. Having defined a fate difference index (FDI), we found that symmetry breaking can be detected early, when cells expressed very low and heterogeneous levels of Sc. We also observed rare cases of late fate resolution, e.g. when two cells close to each other accumulate high levels of GFP-Scute before being pulled away from each other. Interestingly, we did not observe a rapid decrease in GFP-Sc levels in non-selected cells right after symmetry breaking. Also, the rate of change of FDI values after symmetry breaking appeared to positively correlate with cell-to-cell heterogeneity in Sc levels. Whether increased heterogeneity is causally linked to symmetry breaking remains to be tested. We next addressed if this stochastic fate decision is biased by birth order (as proposed in the context of the AC/VU decision in worms4) or by the size and geometry of cell-cell contacts (as modeling suggested5). We found that neither appeared to significantly influence Notch-mediated binary fate decisions in the Drosophila abdomen. In conclusion, our live imaging data provide a detailed analysis of proneural dynamics during lateral inhibition in Drosophila

Générer de la diversité cellulaire est essentiel en biologie du développement et pour préserver l'homéostasie des tissus chez l'adulte. Cela résulte du choix des cellules souches et progéniteurs à s'engager dans un destin particulier en réponse à des signaux extrinsèques et à des propriétés intrinsèques. L'objectif de ma thèse était d'élucider le rôle du cycle cellulaire dans le processus de neurogenèse (production de neurones) en utilisant comme paradigme le tube neural d'embryon de poulet. D'une part, j'ai développé une nouvelle stratégie d'imagerie permettant de mesurer la longueur des quatre phases du cycle cellulaire en temps réel dans les progéniteurs neuraux. D'autre part, j'ai réalisé des expériences de gain et perte de fonction d'un régulateur de l'entrée en mitose, la phosphatase CDC25B, dans les progéniteurs neuraux et montré que ce régulateur du cycle favorise les divisions neurogéniques au dépend des divisions prolifératives contrôlant ainsi la production neuronale
Generating cell diversity is essential in developmental biology and to preserve tissue homeostasis in adulthood. This results from the choice of stem cells and progenitor cells to commit into a particular fate in response to extrinsic cues and to intrinsic properties. The aim of my PhD was to elucidate the role of the cell cycle in the neurogenesis process (i.e. in neuron generation) using the embryonic chick neural tube as a paradigm. On the one hand, I have developed a new real time imaging strategy to measure the length of the four cell cycle phases in neural progenitors. On the other hand, I performed gain and loss of function experiments of a regulator that control mitosis input, the CDC25B phosphatase, in neural progenitors and showed that this cell cycle regulator promotes neurogenic divisions at the expense of proliferative divisions, thus controlling neuronal production

Le vieillissement est un processus complexe souvent ponctué par l’apparition de maladies liées à l’âge telles que l’arthrose, la fibrose pulmonaire ou l’ostéoporose et associé à une diminution des capacités de régénération et des stocks de cellules souches adultes. En 2007, le Dr Yamanaka et ses collaborateurs montraient pour la première fois que des fibroblastes humains pouvaient être convertis en cellules souches pluripotentes en induisant l’expression de 4 facteurs de transcription : OCT4, SOX2, KLF4 et c-MYC. Au laboratoire, il a été montré en 2011 qu’il est possible de reprogrammer les cellules sénescentes s’accumulant au cours du vieillissement et de les redifférencier en cellules somatiques rajeunies.In vivo, une reprogrammation totale conduirait à la formation de tératomes, mais en induisant le processus de reprogrammation et en le stoppant avant d’obtenir des cellules souches pluripotentes nous pensons qu’il est possible de restaurer la physiologie cellulaire altérée et ainsi de retarder le vieillissement tissulaire et ses effets néfastes. Le Dr Izpisua Belmonte a validé cette hypothèse en décembre 2016 en montrant, dans un modèle murin transgénique récapitulant le phénotype de vieillissement accéléré du syndrôme d’Hutchinson Gilford et permettant dans le même temps l’induction contrôlée de l’expression de facteurs (OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC), qu’il était possible d’allonger l’espérance de vie des animaux et de retarder l’apparition du phénotype pathologique lié à l’âge. Nous avons mis en place un modèle murin similaire et avons montré qu’une reprogrammation transitoire peut non seulement allonger l’espérance de vie des animaux mais également retarder la perte de poids qui advient au cours du vieillissement et l’apparition du phénotype pathologique lié à l’âge. De plus, nous avons réussi à maintenir une capacité de régénération accrue jusqu’à la fin de la vie des souris. D’autre part, en modélisant des pathologies liées à l’âge telles que l’arthrose ou la fibrose pulmonaire chez des animaux inductibles pour les facteurs de transcription de Yamanaka, nous avons montré qu’une reprogrammation transitoire pouvait prévenir les dommages provoqués. Cette étude aura donc permis de confirmer l’importance que la reprogrammation cellulaire peut avoir dans les stratégies de lutte contre le vieillissement
Aging is a complex process which is often punctuated by the appearing of age-related diseases such as arthritis, idiopathic pulmonary fibrosis or osteoporosis, and which is associated with a decrease of regeneration abilities and of adult stem cells number. In 2007, Dr. Yamanaka and his collaborators showed for the first time that human fibroblasts could be converted into pluripotent stem cells by inducing the expression of 4 transcription factors: OCT4, SOX2, KLF4 and c-MYC. In the laboratory, it was showed in 2011 that it is possible to reprogram senescent cells which are accumulating in aging organisms and to differentiate them into rejuvenated somatic cells.In vivo, a total reprogramming would lead to teratomas formation but if the reprogramming process is induced and stopped before getting pluripotent stem cells, we think that it is possible to restore altered cell physiology and to delay tissues aging and its deleterious consequences. Dr. Izpisua Belmonte validated this hypothesis in December 2016. He designed a murine transgenic model which recapitulates the premature aging phenotype of Hutchinson Gilford syndrome and which can be induced to express OCT4, SOX2, KLF4 and c-MYC, and he proved that it is possible to increase mice lifespan and to delay the appearing of pathological aging phenotype. We built a similar murine model and showed that a transient reprogramming can not only increase lifespan, but also delay age-related weight loss and pathological aging phenotype. Moreover, we were able to maintain a higher regenerative capacity until mice death. We also modeled age-related pathologies such as arthritis or idiopathic pulmonary fibrosis in mice which were inducible for the Yamanaka’s transcription factors and we showed that transient reprogramming could prevent damages. This study will have allowed to confirm the importance that cellular reprogramming can have in the fight against aging

La partie dorsale du somite, le dermomyotome contient des progéniteurs multipotents Pax3+ donnant naissance à de nombreux types cellulaires : musculaires, dermiques, endothéliales, murales et adipocytes bruns. Le but de ma thèse été de comprendre les mécanismes associés aux choix de destins cellulaires chez l’embryon de souris. Nous avons dans un premier temps montré que la voie de signalisation Notch favorise l’entrée des progéniteurs multipotents vers un destin vasculaire plutôt que myogénique, en agissant sur l’équilibre génétique Pax3 :Foxc2. Afin de déterminer si Foxc1, l’homologue de Foxc2, est aussi impliqué dans ce mécanisme, nous avons spécifiquement délété ces deux gènes dans les progéniteurs Pax3+. Ceci engendre de nouveaux phénotypes que nous documentons dans cette étude. Le nombre de cellules vasculaires est réduit, tout comme l’est le nombre de cellules myogéniques du membre. Différentes hypothèses sont proposées pour expliquer ce défaut. Foxc2 est un facteur également impliqué dans la différenciation du tissu adipeux brun. Nous avons étudié le développement de ce tissue au cours du développement et proposons un modèle selon lequel il se développe en deux étapes, la première étant le développement d’une « masse adipogénique indifférenciée » et la seconde correspondant à la différenciation des adipocytes bruns. Des approches de perte et gain de fonction nous ont permis de montrer que Foxc1 et Foxc2 semblent jouer un rôle dans le contrôle de la fonction mitochondriale au cours de la différenciation des adipocytes bruns, et ce même rôle pourrait être joué par Foxc1 dans les fibres musculaires oxydatives chez l’adulte où Foxc1 est spécifiquement exprimé
The dorsal part of the somite, the dermomyotome contains multipotent Pax3+ progenitors, which give rise to different cell types such as skeletal muscle, dermal, endothelial, mural and brown adipose cells. The aim of this thesis was to understand mechanisms underlying cell fate decisions in this context in the mouse embryo. We have first shown that the Notch signaling pathway directs multipotent progenitors towards a vascular instead of a myogenic fate, by acting on the Pax3 :Foxc2 genetic equilibrium. To determine if Foxc1, the homologue of Foxc2, is also implicated in this mecanism, we have conditionally deleted both genes in Pax3+ progenitors. We document new phenotypes, including a reduction in vascular, cells, notably endothelial cells in the forelimb, where, surprisingly myogenic cells are also absent, leading to a number of possible hypotheses. Foxc2 is also implicated in the differentiation of brown adipose tissue, which we show is a derivative of Pax3+ cells in the dermomyotome. We have studied the development of this tissue in the embryo and propose a model in two steps, with initial formation of an “undifferentiated adipogenic mass” which subsequently differentiates into brown adipocytes. Gain and loss of function approaches suggest that Foxc1/2 play a role in the control of mitochodrial function during the differentiation of brown adipocytes in the embryo. This role may also be played by Foxc1 in the slow fibers of skeletal muscle where it is specifically expressed in the adult

Le cerveau des mammifères abrite deux régions spécifiques où la neurogenèse adulte ne cesse pas après l'embryogenèse, mais persiste dans le cerveau postnatal et adulte. Ces deux régions sont la zone sous-granulaire du gyrus denté de l’hippocampe et la zone sous-ventriculaire (SVZ) des ventricules latéraux.Dans la SVZ, des cellules souches neurales génèrent des neuroblastes qui migrent jusqu’au bulbe olfactif (OB) pour coloniser les couches granulaires et glomérulaires et se différencier en différent types d’interneurones dont une petite fraction sont des interneurones dopaminergiques. La découverte de la neurogenèse postnatale et adultes a changé le point de vue de la plasticité du cerveau remarquable et ouvre de nouvelles perspectives pour la thérapie des maladies neurodégénératives. Etant donné que dans la maladie de Parkinson les symptômes moteurs principaux sont causés par la dénervation dopaminergique du striatum, la compréhension de la génération et de la différenciation des neurones dopaminergiques bulbaires a reçu une attention particulière au vu de leur intérêt potentiel pour la thérapie cellulaire. Dans ce contexte, le neuromédiateur dopamine lui-même a été suggéré d'influencer la neurogenèse olfactive et la spécification des interneurones dopaminergique.Dans ma thèse, j'ai analysé l’influence de l’innervation dopaminergique issue du mésencéphale sur la neurogenèse et le destin cellulaire des précurseurs de la SVZ. J'ai combiné un modèle 6-OHDA de dénervation dopaminergique chez la souris postnatale avec l’électroporation in vivo du ventricule latéral pour marquer spécifiquement les progéniteurs latéraux et dorsaux et suivre leur destin dans le OB
In the postnatal and adult mammalian brain neurogenesis persists in the subgranular zone of the hippocampal dentate gyrus and the subventricular zone (SVZ). In the SVZ slowly dividing stem cells give rise to neuroblasts that migrate to the olfactory bulb (OB) where they reach the granule and glomerular cell layer of the OB and differentiate into different interneuron subtypes including a small fraction of dopaminergic interneurons. The discovery of postnatal and adult neurogenesis has changed the view of the plasticity of the brain remarkably and raised the hope for new therapeutical approaches in the field of neurodegenerative diseases. Since in Parkinson’s disease the main motor symptoms are caused by the dopaminergic denervation of the striatum adjacent to SVZ, the understanding of the generation and differentiation of OB dopaminergic neurons has received special attention. Interestingly, the neurotransmitter dopamine itself has been suggested to influence olfactory bulb neurogenesis via direct innervation of SVZ by midbrain dopaminergic neurons. However, data on this topic have been contradictory. In this study, I investigated how dopaminergic innervation influences SVZ neurogenesis and the fate of SVZ progenitors. I combined a 6-OHDA model of dopaminergic denervation in postnatal mice with in vivo forebrain electroporation to specifically label lateral and dorsal SVZ progenitors and to follow their fate in the olfactory bulb

Les cellules souches adultes sont des cellules non différenciées, essentielles au le renouvellement constant de nos tissus. Elles produisent des cellules différenciées nécessaires au fonctionnement de nos organes, tout en maintenant un réservoir de cellules souches dans le tissu. Cet équilibre entre prolifération et différentiation cellulaire est crucial pour le maintien d’un état constant du tissu appelé homéostasie tissulaire. Entre identité « souche » et différenciation : Quels programmes génétiques contrôlent ces états ? Cette question suscite un intérêt majeur tant pour la recherche dans le domaine des cellules souches que pour les perspectives thérapeutiques qui en découlent. Dans cette optique, ce travail de thèse a permis de mettre en évidence un nouveau rôle du gène spen dans le contrôle des cellules souches intestinales chez Drosophila melanogaster. Une inactivation du gène spen est à l’origine d’une accumulation aberrante des cellules souches au sein de l’intestin de drosophile. La mise en place d’un protocole de purification par FACS des cellules souches, associé à un séquençage à grande échelle des ARN, a permis de mettre à jour les réseaux de gènes régulés par Spen dans les cellules souches. Ainsi, en combinant des techniques de génétique et d’analyses in vivo, ce travail montre que Spen est un facteur clé du processus de spécification des cellules souches intestinales et de la régulation de leur prolifération. Cette étude participe ainsi à la compréhension de la fonction moléculaire des protéines de la famille SPEN dans les cellules souches et les dérégulations à l’origine des pathologies auxquelles elles sont associées
Adult stem cells are non-differentiated cells that maintain tissue homeostasis by supplying differentiated cells while at the same time self-renewing. How is this balance between stem cell state and differentiated state controlled? This question became one of the major interests of the Stem cell research and Translation, mostly due to the potential therapeutic perspectives that it gives. Regarding this effort, this thesis work describes a new function of a gene call split-ends/spen in adult stem cell regulation in Drosophila intestine. SPEN familly is composed by essential genes, which codes conserved proteins from Plants to Metazoa. They are involved in key cellular processes such as cell death, differentiation or proliferation, and are associated with various molecular functions controlling transcriptional and post-transcriptional gene expression. We found that a spen inactivation in Drosophila intestine leads to an abnormal increase in adult stem cells. In this work, by combining genetics tools and in vivo stem cell analysis methods, we could show that Spen works as a key factor of intestinal stem cell commitment and plays a role in their proliferation control. How does genetics programs control cellular identity? In order to investigate the molecular signature of intestinal stem cells and progenitor cells knockdowned for spen, we combined genetics, cell sorting and mRNA sequencing analysis to uncovered Spen target genes regulated in intestinal stem cells. Here, we provide a new function of spen in adult stem cell regulation, which may also shed light on its mode of action in other developmental and pathological contexts

Les cellules souches adultes sont des cellules non différenciées, essentielles au le renouvellement constant de nos tissus. Elles produisent des cellules différenciées nécessaires au fonctionnement de nos organes, tout en maintenant un réservoir de cellules souches dans le tissu. Cet équilibre entre prolifération et différentiation cellulaire est crucial pour le maintien d’un état constant du tissu appelé homéostasie tissulaire. Entre identité « souche » et différenciation : Quels programmes génétiques contrôlent ces états ? Cette question suscite un intérêt majeur tant pour la recherche dans le domaine des cellules souches que pour les perspectives thérapeutiques qui en découlent. Dans cette optique, ce travail de thèse a permis de mettre en évidence un nouveau rôle du gène spen dans le contrôle des cellules souches intestinales chez Drosophila melanogaster. Une inactivation du gène spen est à l’origine d’une accumulation aberrante des cellules souches au sein de l’intestin de drosophile. La mise en place d’un protocole de purification par FACS des cellules souches, associé à un séquençage à grande échelle des ARN, a permis de mettre à jour les réseaux de gènes régulés par Spen dans les cellules souches. Ainsi, en combinant des techniques de génétique et d’analyses in vivo, ce travail montre que Spen est un facteur clé du processus de spécification des cellules souches intestinales et de la régulation de leur prolifération. Cette étude participe ainsi à la compréhension de la fonction moléculaire des protéines de la famille SPEN dans les cellules souches et les dérégulations à l’origine des pathologies auxquelles elles sont associées
Adult stem cells are non-differentiated cells that maintain tissue homeostasis by supplying differentiated cells while at the same time self-renewing. How is this balance between stem cell state and differentiated state controlled? This question became one of the major interests of the Stem cell research and Translation, mostly due to the potential therapeutic perspectives that it gives. Regarding this effort, this thesis work describes a new function of a gene call split-ends/spen in adult stem cell regulation in Drosophila intestine. SPEN familly is composed by essential genes, which codes conserved proteins from Plants to Metazoa. They are involved in key cellular processes such as cell death, differentiation or proliferation, and are associated with various molecular functions controlling transcriptional and post-transcriptional gene expression. We found that a spen inactivation in Drosophila intestine leads to an abnormal increase in adult stem cells. In this work, by combining genetics tools and in vivo stem cell analysis methods, we could show that Spen works as a key factor of intestinal stem cell commitment and plays a role in their proliferation control. How does genetics programs control cellular identity? In order to investigate the molecular signature of intestinal stem cells and progenitor cells knockdowned for spen, we combined genetics, cell sorting and mRNA sequencing analysis to uncovered Spen target genes regulated in intestinal stem cells. Here, we provide a new function of spen in adult stem cell regulation, which may also shed light on its mode of action in other developmental and pathological contexts

Le programme d'expression du génome est régulé par la composition des séquences d'ADN ainsi que les facteurs pouvant s'y associer. Ces facteurs peuvent soit être des facteurs de transcription soit des cofacteurs. Les cofacteurs, même s'ils ne reconnaissent pas des séquences d'ADN spécifiques, peuvent fortement réguler l'expression du génome. Chez les eucaryotes, certains de ces cofacteurs peuvent modifier de manière post-traductionnelle les protéines structurelles de l'ADN (histones). Ces enzymes et les modifications qu'elles catalysent peuvent recruter d'autres cofacteurs et/ou réguler directement la structure chromatinienne permettant ainsi la modulation fine de l'expression du génome. Cela permet par exemple de contrôler le programme de transcription au cours du développement embryonnaire ou de la différenciation musculaire terminale. Ainsi, la méthylation des lysines 9 et 27 de l'histone H3 (H3K9, H3K27) au niveau des promoteurs des gènes est essentiellement associée à la répression de la transcription. Ces lysines sont méthylées par différentes enzymes spécifiques appelées lysines méthyltransférases (KMT). Le laboratoire a précédemment démontré l'existence d'un complexe contenant 4 méthyltransférases de H3K9 (G9A, GLP, SUV39H1 et SETDB1). Au cours de ces expériences, l'équipe a pu identifier l'interaction entre les méthyltransférases de H3K9 et de H3K27 (PRC2). L'objectif principal de mon projet de thèse a été d'identifier les différentes cibles génomiques des KMT de H3K9, que sont G9A, GLP, SUV39H1 et SETDB1. Au cours de ces expériences nous avons principalement pu mettre en évidence une coopération entre G9A et le complexe PRC2
The genome expression program is regulated by the composition of DNA sequences and the factors that may be associated. These factors may either be transcription factors or cofactors. Cofactors, even if they do not recognize specific DNA sequences, can strongly regulate the expression of the genome. In eukaryotes, some of these cofactors can post-translationally modify structural DNA proteins (histones). These enzymes and their catalized modifications can recruit other cofactors and/or directly regulate chromatin structure allowing fine modulation of the expression of the genome. For example, this allows to control the transcription program during embryonic development or terminal muscle differentiation. Thus, methylation of lysines 9 and 27 of histone H3 (H3K9, H3K27) at gene promoters is essentially associated with transcriptional répression. These lysines are methylated by different specific enzymes called lysine methyltransferases (KMT). The laboratory has previously demonstrated the existence of a complex containing 4 H3K9 methyltransferases (G9A, GLP, and SETDB1 and SUV39H1). During these experiments, the team was able to identify the interaction between H3K9 methyltransferases and H3K27 (PRC2). The main aim of my thesis project was to identify the different genomic targets of KMTs. In these experiments we mainly were able to demonstrate a cooperation between G9A and PRC2 complex

La formation du schéma corporel des vertébrés dépend, lors de l’embryogenèse, de l’organisation spatiale des différents types cellulaires le long de l’axe antéro-postérieur. Ce processus est orchestré par les facteurs de transcription HOX qui sont différentiellement exprimés le long de cet axe et confèrent leur identité positionnelle aux tissus en développement. Ces patrons d’expression sont initiés par l’activation séquentielle des gènes HOX dans les progéniteurs axiaux, une population de cellules souches nourrissant l’allongement progressif du corps des embryons en développement, notamment les somites et la moelle épinière. Parallèlement à l’induction progressive de cette famille de gènes, ces progéniteurs génèrent donc des structures de plus en plus caudales transformant la séquence temporelle d’activation en domaines d'expression spatiaux le long de l’axe antéro-postérieur. Néanmoins, les mécanismes qui rythment la temporalité de cette induction et sa transformation en domaines spatiaux restent mal connus, en particulier chez l’humain. Pour aborder ces questions, au cours de ma thèse, j’ai produit à partir de cellules souches pluripotentes humaines des progéniteurs arborant les caractéristiques moléculaires et fonctionnelles des progéniteurs axiaux. En effet, nous avons montré que ces progéniteurs activent séquentiellement les gènes HOX et peuvent donner naissance à des organoïdes récapitulant de multiples aspects de la génération et de l’organisation de l’axe antéro-postérieur comme la formation de somites entourant un tube neural le long duquel les patrons d’expression spatiaux de plusieurs HOX sont récapitulés. En utilisant ces progéniteurs axiaux produits in vitro, nous avons tout d’abord démontré que la vitesse d’induction des gènes HOX est dynamiquement modulée par l’activité graduelle de facteurs extrinsèques, FGFs et GDF11 qui sont séquentiellement exprimés dans la région caudale des embryons vertébrés au cours du développement. Puis, nous avons montré 1) que les gènes HOX activés sont des cibles directes des voies de signalisation en aval de ces facteurs et 2) que la vitesse d’activation des gènes exprimés de plus en plus tardivement est déterminée par la durée d‘activation des voies de signalisation dans les progéniteurs axiaux, une propriété des voies régulée par des mécanismes intrinsèques de rétrocontrôles négatifs. Dans l’ensemble, mes résultats permettent de proposer un nouveau modèle dans lequel le rythme d’activation des gènes HOX est une propriété émergente des dynamiques de voies de signalisation en aval de facteurs extrinsèques. Parallèlement, mes études ont permis d’améliorer l’ingénierie cellulaire et tissulaire des cellules du tronc à partir de cellules souches pluripotentes humains culminant en des protocoles de génération des différents sous-types de motoneurones présent le long de l’axe du corps et en un nouveau modèle d’organoïde mimant la morphogenèse et la formation de la diversité cellulaire le long de l’axe du corps humain
During embryogenesis, the formation of the vertebrate body plan depends on the spatial organization of different cell types along the anterior-posterior axis. This process is orchestrated by HOX transcription factors, which are differentially expressed along this axis, conferring positional identity on developing tissues. HOX patterns of expression are initiated by the sequential activation of HOX genes in axial progenitors, a population of stem cells fueling the progressive elongation of the body of developing embryos, forming notably the somites and the spinal cord. In parallel with the progressive induction of this gene family, these progenitors generate increasingly caudal structures, transforming the temporal sequence of activation into spatial domains of expression along the anterior-posterior axis. Nevertheless, the mechanisms that regulate the temporality of this induction and its transformation into spatial domains remain poorly understood, particularly in humans. To address these questions, during my thesis I generated progenitors from human pluripotent stem cells that display the molecular and functional characteristics of axial progenitors. Indeed, we have shown that these progenitors sequentially activate HOX genes and can give rise to organoids recapitulating multiple aspects of the generation and organization of the anterior-posterior axis, such as the formation of somites surrounding a neural tube along which the spatial expression patterns of several HOXs are recapitulated. Using these in vitro-produced axial progenitors, we first demonstrated that the tempo of induction of HOX genes is dynamically modulated by the graded activity of two extrinsic factors, FGFs and GDF11, which are sequentially expressed in the caudal region of vertebrate embryos during development. Then, we showed that 1) activated HOX genes are direct targets of signaling pathways downstream of these factors and 2) that the speed of activation of genes expressed later and later is determined by the duration of pathway activation in axial progenitors, a property of the pathways regulated by intrinsic negative feedback mechanisms. Overall, my results suggest a new model in which the timing of HOX gene activation is an emergent property of the dynamics of signaling pathways downstream of extrinsic factors. In parallel, my studies have led to improved cellular and tissue engineering of trunk cells from human pluripotent stem cells, culminating in protocols for generating the different motor neuron subtypes present along the body axis, and a new organoid model mimicking morphogenesis and the formation of cellular diversity along the human body axis

On admet communément que les tumeurs proviennent de cellules échappant aux contrôles homéostatiques qui sous-tendent les structures histologiques saines et que le phénotype d’une cellule n’est pas le résultat de processus génétiques et biochimiques déterministes mais la conséquence stochastique de réseaux de régulation intra- et intercellulaires. Ce doctorat vise à étudier quantitativement l’homéostasie phénotypique de populations cellulaires et à présenter une approche à la question fondamentale, mais jusqu’alors jamais étudiée, concernant l’autonomie versus le contrôle collectif du devenir des cellules. Nous avons étudié sur le long terme, par cytométrie de flux et dans des conditions 2D puis 3D, le niveau d’expression de CD24 et CD44 de deux lignées cellulaires de cancer du sein (SUM149-PT et SUM159-PT). Trois phénotypes ont été isolés (CD24-/CD44+, CD24+/CD44+, CD24-/CD44-), ce dernier n’avait pour le moment pas été documenté dans la littérature. Le comportement phénotypique des sous-populations CD44-low et CD44-high a été caractérisé en évaluant leur proportion et en analysant leur spectre de fluorescence. Ainsi nous avons observé des comportements périodiques d’apparition et de disparition de pool de cellules caractéristiques des lignées et une re-diversification des phénotypes pour chacune des sous-population. Seule la population issue de CD24-/CD44- re-diversifiée présente le même équilibre que la population initiale non triée. En 3D, le processus de re-diversification a été observé dans les tumorsphères issues de CD24-/CD44+ et CD24+/CD44+. Les cellules CD24-/CD44- n’ont pas ce potentiel mais survivent néanmoins à l’anoïkis. Ces comportements laissent penser qu’il existe une coordination intercellulaire régulant l’équilibre des proportions phénotypiques. Pour découvrir les règles sociales régissant l’organisation spatiale inter-phénotypique, nous avons mis en place un rapporteur des variations du niveau d’expression endogène des marqueurs d’intérêt et élaboré un modèle théorique d’interactions cellulaires. Ce travail a conforté notre hypothèse selon laquelle il s’établit des règles sociales inter-cellulaires déterminant l’expression phénotypique à l’échelle uni- et pluricellulaire
It is commonly accepted that tumors arise from cells that escape the homeostatic controls which underlie the healthy histological structure and that cell phenotype is not the result of deterministic biochemical and genetic processes, but rather the stochastic and dynamic outcome of multiple intra- and intercellular regulation networks. This PhD aims to quantitatively study the phenotypic homeostasis of the cell populations and to present an approach to the fundamental question, never heretofore studied, regarding the autonomy versus collective control of cell fate. We studied in the long run, using flow cytometry and in 2D and 3D conditions, the level of expression of CD24 and CD44 of two breast cancer cell lines (SUM149-PT and SUM159-PT). Three phenotypes were isolated (CD24-/CD44+, CD24+/CD44+, CD24-/CD44-), the latter had not previously been documented in the literature. The phenotypic behavior of CD44-low and CD44-high subpopulations has been characterized by assessing their proportion and analyzing the fluorescence map. Thereby, we observed both a periodic behavior of appearance and disappearance of pool of cells characteristics of each cell lines and a phenotypic re-diversification for each subpopulation. Only the resulting population derived from CD24-/CD44- provided the same balance as the original unsorted population. 3D re-diversification process was observed in tumorspheres from CD24-/CD44+ and CD24+/CD44+. The cells CD24-/CD44did not have that potential but nonetheless outlived anoikis. These behaviors suggest that there is an inter-cell coordination regulating the balance of phenotypic proportions. To discover the social rules regulating inter-phenotypic spatial organization, we have set up a reporter of the endogenous variations of CD24 and CD44 and developed a theoretical model of cell interactions. This work has confirmed our hypothesis that inter-cellular social rules are determining the phenotypic expression at both the uni- and multicellular scales

L’objectif de cette thèse est d'étudier l'influence d'hydrogels de faibles rigidité sur l’organisation de la chromatine de cellules épithéliales PtK2 et cancéreuses SW480. Sur des hydrogels mous, la chromatine de PtK2 se structure en hétérochromatine. Les hydrogels très mous conduisent à la nécrose. Sur ces substrats, l'euchromatine, maintenue par inhibition de HDAC, guide la cellule en quiescence. Ces cellules se divisent après transfert sur surfaces rigides. Un processus de dissémination métastatique est développé en cultivant des cellules cancéreuses sur des hydrogels très mous (E20) et des surfaces rigides (verre). Les cellules meurent lors du 1er passage sur E20. Au 2ème passage sur E20, leur survie, motilité et pourcentage en hétérochromatine augmentent. Au 3ème passage, la survie et la motilité progressent cependant le pourcentage en hétérochromatine diminue. Du 1er-2ème passage, les cellules répondent à un processus de dissémination « hétérochromatine­ dépendant » , du 3ème-4ème passage à un processus « euchromatine-dépendant »
The aim of this thesis is to investigate the influence of soft hydrogels on the chromatin plasticity of epithelial PtK2 and cancer cells SW480. On soft hydrogels, the chromatin of PtK2 cells is organized in heterochromatin. The very soft hydrogels direct the cell death by necrosis. On these substrates, the euchromatin maintained by inhibition of HDAC guides the cells into quiescence. These cells transferred on stiff substrate enter in mitosis. A process of metastatic dissemination is developed from cancer cells grown on very soft hydrogels (E20) and stiff surfaces (glass). On the 1st seeding on E20, cells die. The 2nd seeding on E20 shows that cell viability, motility and heterochromatin percentage increase. On the 3rd seeding on E20, survival and motility continue to increase while the heterochromatin percentage decrease. From the 1st- 2nd E20 seeding, cells respond to a heterochromatin-dependent process of metastatic dissemination and from the 3rd-4th E20 seeding to an euchromatin-dependent process

Le cerveau adulte des mammifères conserve sa capacité à générer de nouvelles cellules cérébrales à partir de cellules souches neurales (CSNs), principalement localisées dans deux régions cérébrales spécifiques, l'hippocampe et la zone sous-ventriculaire (SVZ). Ce processus, appelé neurogenèse, permet la formation de nouveaux neurones et de nouvelles cellules gliales (astrocytes et oligodendrocytes). Différents signaux contrôlent la prolifération et la différenciation des CSNs. Parmi ces signaux, les hormones thyroïdiennes (HTs) sont impliquées dans la prolifération des CSNs de la SVZ et dans la différenciation neuronale. À l’inverse des cellules différenciées, telles que les neurones ou les glies, les CSNs ont un fonctionnement – ou métabolisme – principalement basé sur la glycolyse et sur une faible respiration mitochondriale. Or l'évolution du métabolisme des CSNs peut influencer leur choix de destin cellulaire. Les HTs jouant un rôle important dans l'activation du métabolisme mitochondrial, j'ai testé l'hypothèse selon laquelle le choix du destin des CSNs de la SVZ adulte se ferait grâce à l'influence de la signalisation thyroïdienne sur l'activité mitochondriale. J'ai tout d'abord montré in vivo et in vitro que les HTs permettent la détermination des CSNs en précurseurs neuronaux dans la SVZ, tandis qu'une période d'hypothyroïdisme favorise la détermination gliale. La transthyrétine, protéine de liaison des HTs, est spécifiquement présente dans les cellules de la SVZ ayant un destin neuronal, alors que la désiodase de type 3, inactivatrice des HTs, est exprimée par les précurseurs oligodendrocytaires (OPCs), indiquant une activationdifférentielle de la signalisation thyroïdienne dans les deux lignages cellulaires. Par ailleurs j'ai pu observer que les cellules s'engageant vers un destin neuronal possèdent une plus grande activité mitochondriale que les OPCs. La présence d'HTs favorise de plus la respiration mitochondriale, ainsi que la production de dérivés réactifs de l'oxygène (ROS) issus de l'activité des mitochondries, dans les cellules de la SVZ. Un blocage des protéines de la chaîne respiratoire empêche les HTs de promouvoir la détermination neuronale, montrant la nécessité de l'activation mitochondriale pour l'engagement des CSNs en précurseurs neuronaux. On sait d'autre part que les modifications morphologiques (ou dynamiques) mitochondriales sont nécessaires à l'augmentation de la respiration. La division (ou fission) des mitochondries est en particulier essentielle à une bonne répartition intracellulaire de la production de l'énergie issue de la respiration, ainsi qu'à la migration cellulaire. Dans les cellules de la SVZ, j'ai montré que l'action des HTs permet l'activation de la protéine DRP1, médiatrice de la fission mitochondriale, et ce principalement dans les cellules du lignage neuronal. Les HTs favorisent donc la détermination des CSNs de la SVZ vers un destin neuronal grâce à l'activation de la respiration et de la fission mitochondriales
The adult mammalian brain maintains its capacity to generate new cells from neural stem cells (NSCs), mainly localized in two specific brain regions, the hippocampus and the sub-ventricular zone (SVZ). This process, named neurogenesis, results in the production of new neurons and new glial cells (astrocytes and oligodendrocytes). Several signals control NSCs proliferation and differentiation. Among those, thyroid hormones (THs) are involved in NSCs proliferation in the SVZ and in neuronal differentiation. NSC metabolism relies mainly on glycolysis associated with a low mitochondrial activity, whereas mature cells, like neurons and glia, preferentially use oxidative phosphorylation. Changes in NSC metabolism can impact cell fate. As THs play an important part in activating mitochondrial metabolism, I hypothesized that the influence of TH signaling on mitochondrial activity triggers NSC fate choice in the adult SVZ. First, I showed in vivo and in vitro that THs allow NSC determination in neuronal precursors, whereas a short hypothyroidism favors glial determination. Transthyretine, a TH binding protein, is specifically present in the SVZ cells having a neuronal fate, while type 3 deiodinase, a TH inhibitor, is expressed by oligodendrocyte precursor cells (OPCs). These results indicate that THs signaling isdifferentially activated in neuronal and glial cell lineages. I observed that cells adopting a neuronal fate display a greater mitochondrial activity when compared to OPCs, and that TH signaling favors mitochondrial respiration and ROS production in the SVZ cells. Inhibiting the mitochondrial respiratory chain prevents TH-mediated promotion of neuronal determination, proving the need of mitochondrial activation for NSC commitment toward a neuronal phenotype. Besides, it is also known that modifications of mitochondrial morphology (or mitochondrial dynamics) are required for the respiration to increase. Among mitochondrial dynamics, fission is crucial for a good intracellular repartition of energy production, and for cell migration. In the SVZ cells, I showed that, DRP1, the main inducer of mitochondrial fission, is activated by THs mainly in cells adopting a neuronal fate. Thus, THs favor NSC fate choice toward a neuronal phenotype through the activation of mitochondrial metabolism and mitochondrial fission in the adult mouse SVZ

Bien que largement étudiés, les mécanismes fondamentaux de prise de décision dans les processus de différenciation cellulaire restent mal compris. Les théories déterministes, souvent basées sur des études populationnelles, atteignent rapidement leur limite lorsqu’il s’agit d’expliquer les différences de choix individuels de cellules, pourtant exposées au même environnement. L’objectif de ma thèse est donc d’étudier les premières étapes de la différenciation des cellules hématopoïétiques à l’échelle de la cellule unique, par des analyses transcriptomiques, protéomiques et morphologiques. Ce travail a été effectué sur deux modèles de différenciation : les lymphocytes T régulateurs et les cellules CD34+ humaines issues de sang de cordon. Nous avons observé le comportement de ces cellules uniques après stimulation. Grâce à la combinaison de la microscopie en time lapse et des analyses moléculaires réalisées à l’échelle de la cellule individuelle, nous avons pu démontrer que le choix du devenir cellulaire n’était pas unique, programmé. La cellule passe d’abord par un état dit « multi-primed », métastable où elle exprime des gènes de plusieurs lignées différentes, puis elle passe par une phase dite « incertaine », instable où elle hésite entre deux phénotypes avant de se stabiliser dans un état fixe. Nos observations sont cohérentes avec une explication stochastique de la prise de décision. La différenciation serait donc un processus spontané, dynamique, fluctuant et non un processus prédéterminé. Les décisions du destin cellulaire sont prises séparément par les cellules individuelles
Despite intensively studies, the fundamental mechanisms of cell fate decision during cellular differentiation still remain unclear. The deterministic mechanisms, often based on studies of large cell populations, cannot explain the difference between individual cell fates choices placed in the same environment. The aim of my thesis work is to study the first steps of hematopoietic cell differentiation at the single cell level thanks to transcriptomic, proteomic and morphological analyses. Two differentiation models have been used: T regulatory lymphocytes and human cord blood-derived CD34+ cells. The behavior of individual cells following stimulation has been analyzed. Using time-lapse microscopy coupled to single cell molecular analyses, we could demonstrate that the cell fate choice is not a unique, programmed event. First, the cell reaches a metastable “multi-primed” state, which is characterized by a mixed lineage gene expression pattern. After transition through an “uncertain”, unstable state, characterized by fluctuations between two phenotypes, the cell reaches a stable state. Our observations are coherent with a stochastic model of cell fate decision. The differentiation is likely to be a spontaneous, dynamic, fluctuating and not a deterministic process. The cell fate decisions are taken by individual cells

L'apoptose est un processus physiologique essentiel permettant aux organismes de maintenir leurs tissus dans des conditions fonctionnelles. Lors du traitement du cancer, les mécanismes moléculaires qui contrôlent la décision cellulaire d’engager ou d’éviter l’activation de cette voie sont mal connus, ce qui a un impact important sur le développement thérapeutique. Pour obtenir une vue globale du rôle des protéines impliquées dans la dynamique de la réponse cellulaire aux anticancéreux, une nouvelle description détaillée de la voie de l'apoptose au niveau du récepteur a été implémentée en un système d'équations différentielles ordinaires. Le modèle a été calibré sur des données expérimentale en cellule unique, de populations de cellules HeLa présentant une réponse hautement hétérogène au ligand, TRAIL. Les sensibilités des réactions apoptotiques dans notre modèle ont été évaluées en utilisant la diversité des comportements expérimentaux observés in vitro. Une série de tests et d'analyses informatiques ont été effectués avec notre modèle pour identifier les origines de l'hétérogénéité de la réponse cellulaire, faisant émerger de nouvelles caractéristiques de la voie apoptotique. Ces analyses apportent de nouvelles connaissances biologiques et soulignent l’importance de la régulation du complexe des récepteurs de la mort, éventuellement par la Caspase-10, comme le suggèrent de nouvelles découvertes expérimentales. Cette thèse offre une nouvelle approche pour découvrir des informations biologiques importantes en utilisant des données en cellule unique, de voies de signalisation à dynamiques hétérogènes
Apoptosis is an essential physiological process through which organisms are able to equilibrate their cell numbers and maintain tissues in healthy and functional conditions. Despite the recent advances in the field, little is known on the molecular mechanisms controlling individual cell decisions to either engage or avoid the activation of this pathway upon cancer treatment, which inevitably impacts on therapeutics development. To obtain a global view of the intervening proteins and their role on cell response dynamics to anticancer drugs, a new and detailed description of the apoptosis pathway at the receptor level was translated into a system of ordinary differential equations. The model was calibrated to single-cell data, from recent experiments on a population of HeLa cells exhibiting a highly heterogeneous response when exposed to the death-inducing ligand TRAIL. The sensitivities of the apoptotic reactions in our model were evaluated using the diversity of experimental behaviors observed in vitro. A series of computational tests and analyses were performed with our model to identify the origins of cell response heterogeneity. New features of the apoptotic pathway emerged from a comparison of different heterogeneity modeling approaches, detecting a set of key reactions to be further expanded. These analyses yield new biological insights and highlights the importance of refining regulation of death receptor complex activity, possibly through Caspase-10 as suggested from new experimental discoveries. This thesis offers a novel framework that can be used to uncover important biological insights using single-cell data of heterogeneous dynamical pathways

Dans certaines régions du cerveau adulte des vertébrés, les cellules souches neurales (NSC) génèrent des neurones fonctionnels. Les NSC sont principalement en quiescence, mais peuvent passer de l’état quiescent à l’état activé (division). A l’échelle de la population, la proportion des NSCs activées reste constante pendant plusieurs années. Les changements du taux d'activation corrèlent avec le développement de pathologies. Aussi, la distribution spatio-temporelle des événements d'activation peut impacter le maintien homogène des NSCs ainsi que le positionnement des nouveaux neurones. Les mécanismes contrôlant le taux et la distribution spatio-temporelle des événements d'activation ne sont pas bien connus. Nous utilisons le télencéphale du poisson zèbre adulte pour répondre à ces questions. Le télencéphale héberge une grande quantité de NSCs et permet l'enregistrement de leurs comportements, sur plusieurs semaines, grâce à une procédure d'imagerie intra-vitale. Dans cette thèse, nous avons évalué l'existence de mécanismes non-cellulaires autonomes contrôlant l'équilibre activation/quiescence dans l'espace et au cours du temps. Nous avons aussi étudié la pertinence des hétérogénéités moléculaires et géométriques sur le comportement des NSCs. Ces travaux ont mis en évidence l'importance de la géométrie des NSCs lors de l'activation et le rôle des cellules progénitrices, produites par les NSCs, pour exercer une inhibition, via la signalisation Notch, empêchant l'activation des NSCs voisines. Grâce à un modèle analytique, nous montrons que cette inhibition maintient la distribution spatio-temporelle des NSCs et homogénéise spatialement la distribution des nouveaux neurones
In some regions of the adult vertebrate brain, Neural Stem Cells (NSCs) generate fully functional neurons. NSCs are found mostly in quiescence, but can shuttle from quiescence to activation (division). At the population level, the proportion of NSCs dividing at a given time remains constant throughout adulthood and perturbations of NSC activation rate correlate with pathological situations. Also, the spatiotemporal distribution of NSC activation events is expected to impact the homogeneous maintenance of the NSC pools and the locations of neuronal production. What controls the rate and spatiotemporal distribution of NSC activation events remain poorly understood. The adult zebrafish telencephalon is a good model to address these questions. The telencephalon hosts many NSCs and it allow the recording of their behaviors over weeks thanks to an intravital imaging procedure. In this thesis, we have used this model to study the regulation of adult NSCs behaviors from two perspectives. First, we assessed the existence of non-cell-autonomous mechanisms controlling the quiescence-activation balance of the NSC population in space and time. Second, we investigated the relevance of intrinsic heterogeneities on individual NSC behaviors. This work highlighted (i) the importance of NSC geometry for their fate decisions during activation and (ii) the role of their differentiated progeny to locally exert a delayed inhibition, via Notch signaling, to prevent neighboring NSC activation. Using modeling we also show how the lineage-related inhibition maintains NSCs with specific spatiotemporal correlations and can spatially homogenize the distribution of adult-born neurons

L'étude de la plasticité cellulaire est un puissant outil pour comprendre le choix du destin cellulaire pendant la différenciation et dans les processus cancéreux lors de la transformation d'une cellule normale en une cellule maligne. Chez la drosophile, le facteur de transcription Gcm contrôle la détermination du destin glial. Dans des mutants gcm, les cellules qui se développent normalement en glie entrent dans la voie de différenciation neuronale alors que l'expression ectopique de gcm dans des progéniteurs neuronaux induit de la glie. Ces données font de Gcm un outil important pour comprendre les bases de la plasticité cellulaire. Mon projet de thèse vise à comprendre les mécanismes contrôlant la plasticité des cellules souches neurales. Nous avons ainsi montré que la capacité des CSNs à se convertir en glie après expression forcée de Glide/Gcm décline avec l'âge et que lors de l'entrée en phase quiescente ou apoptotique, ils ne peuvent plus être convertis. Nous avons aussi découvert que le processus de conversion du destin ne se manifeste pas uniquement par l'expression de marqueurs gliaux mais aussi par des changements spécifiques au niveau de la chromatine. D'une manière intéressante, nous avons aussi montré que la stabilité de la protéine Glide/Gcm est contrôlée par deux voies opposées, où Repo et l'histone acetyltransférase CBP jouent un rôle majeur.

L'embryogenèse somatique (ES) est l'un des processus de propagation les plus prometteurs pour la diffusion à grande échelle de variétés élites. Cependant, quelle que soit l'espèce considérée, les recherches sur l’ES restent essentiellement empiriques et à bas débit, entraînant une difficulté à répondre à la demande croissante en matériel végétal, notamment en raison des faibles progrès techniques au cours des dernières décennies. Cette thèse présente un travail pionnier où deux groupes leader - Nestlé et le Cirad - ont décidé d'unir leurs forces pour démêler les mécanismes moléculaires impliqués dans les étapes clés de l’ES du caféier Arabica, l’un des procédés les plus avancés, en y appliquant les dernières technologies de métabolomique et de transcriptomique. En parallèle, la mise au point d’un système de criblage à haut débit de composés actifs sur l’ES, qui permettrait d'accélérer l'optimisation des protocoles, n'a toujours pas été proposée pour la micropropagation végétale.RésultatsSoixante-dix échantillons (14 stades de développement x 5 répétitions biologiques) couvrant l'ensemble du processus d’ES ont été étudiés. Une approche statistique robuste appliquée aux données RNA-seq a permis d'identifier 6 transitions (‘switches’) de développement clés pour le succès biologique de l’ES c.à.d. la production en masse d’embryons somatiques, et a révélé l’influence directe des facteurs (‘drivers’) environnementaux. La métabolomique a mis en évidence d'énormes reconfigurations des contenus hormonaux, des voies métaboliques primaires et des composés phénoliques lors des évènements précoces de la dédifférenciation et de la redifférenciation. La totipotence atteint son expression la plus visible au stade embryogène lorsque sont totalement inhibées les voies biochimiques liées au métabolisme du sucre et, au contraire, lorsque est activée l’expression des gènes codant pour des facteurs de transcription. L'étude a également montré que les profils de transcrits et de métabolites représentent des signatures discriminantes du destin cellulaire. Une liste de 23 gènes et 17 métabolites marqueurs du succès des différentes phases de développement a été identifiée, y compris le stade cals embryogènes si stratégique car à l’interface Dédifférenciation-Redifferentiation. En parallèle, nous avons réussi à reproduire à l'échelle pilote la différenciation d’embryons somatiques à partir de suspensions dans un système miniaturisé compatible avec une plateforme automatisée et ainsi permis le criblage de 4 régulateurs épigénétiques (HDACi) à différentes concentrations, apportant ainsi une preuve de concept de la faisabilité d’une optimisation haut-débit des milieux nutritifs. Pour toutes les étapes de développement clés de l’ES, le décryptage des principaux mécanismes moléculaires ainsi que l’identification de marqueurs moléculaires spécifiques offre de nouvelles perspectives pour la compréhension fine de ce phénomène de régénération et son optimisation raisonnée. Des stratégies sont proposées pour la validation des marqueurs candidats et l’industrialisation du système de criblage haut-débit. Il est proposé une combinaison des deux approches –omiques et automatisation pour une optimisation des protocoles rationnelle et plus efficace, permettant aux procédés d’ES de soutenir la diffusion à très grande échelle du progrès génétique chez le caféier
Somatic embryogenesis (SE) is one of the most promising propagation processes for the large-scale dissemination of elite varieties. However, whatever the species considered, research on SE remains essentially empirical and low-throughput, making it difficult to meet the growing demand for plant material, in particular due to the slow technical progress in recent decades. This thesis presents a pioneering work in which two leading groups - Nestlé and CIRAD - have decided to join forces to unravel the molecular mechanisms involved in the key stages of SE in Arabica coffee, one of the most advanced processes, by applying the latest metabolomics and transcriptomics technologies. In parallel, the implementation of a high-throughput screening system for active compounds on SE, that would speed up the optimization of protocols, has not yet been proposed for plant micropropagation.ResultsSeventy samples (14 developmental stages x 5 biological replicates) covering the whole SE process were studied. A robust statistical approach applied to RNA-seq data led to the identification of 6 key developmental switches for the biological success of SE i.e. the mass production of somatic embryos, and revealed the direct influence of environmental drivers. Metabolomics highlighted huge reconfigurations of hormonal contents, primary metabolic pathways and phenolic compounds during the early events of dedifferentiation and redifferentiation. Totipotency reaches its most visible expression at the embryogenic stage when the biochemical pathways related to sugar metabolism are inhibited and, on the contrary, when the expression of genes coding for transcription factors is activated. The study also showed that transcript and metabolite profiles represent discriminant signatures of cell fate. A list of 23 genes and 17 metabolites that mark the success of the different developmental phases has been identified, including the embryogenic callus stage, so strategic due to its position at the Dedifferentiation-Redifferentiation interface. In parallel, we succeeded in reproducing on a pilot scale the differentiation of somatic embryos from liquid cell suspensions in a miniaturized system compatible with an automated platform and thus allowed the screening of 4 epigenetic regulators (HDACi) at different concentrations, bringing a proof of concept of the feasibility of nutrient media high-throughput optimization. For all SE key developmental stages, deciphering the main molecular mechanisms as well as the identification of specific molecular markers offers new perspectives for a detailed understanding of this regeneration phenomenon and its rational optimization. Strategies are proposed for the validation of candidate markers and the industrialization of the high-throughput screening system. A combination of both -omics and automation approaches is proposed for rational and more efficient protocol optimization, allowing the SE processes to support the very large-scale dissemination of genetic progress in coffee

TLes travaux présentés ont pour objectif d'aider les biologistes au diagnostic de la viabilité cellulaire en utilisant des méthodes de classification floues. Notre travail fait part d'une stratégie de classification permettant de construire un partitionnement d'images de cellules venant d'un microscope optique. Nous aboutissons à une classification automatique des cellules, en segmentant l'image, par l'algorithme T-LAMDA que nous avons développé. Une étude portant sur les méthodes de classification existantes, l'espace couleur et la résistance au bruit, permet de trouver la structure la plus adaptée à notre étude. L'analyse comparative de différentes méthodes (dont les méthodes LAMDA et T-LAMDA), nous permet de mettre en exergue la plus appropriée pour la classification des cellules mélangées au bleu de méthylène. Nous proposons quelques algorithmes supervisés basés sur LAMDA afin de voir si le sens de traitement des données au niveau de cet algorithme influe sur le résultat. L'algorithme T-LAMDA, basé sur les arbres de décisions, se révèle le mieux adapté pour notre étude et donne ainsi des résultats plus précis que les autres méthodes, avec un temps d'exécution plus court. Nous suggérons de faire un apprentissage en utilisant l'application CELCA, Cell Classification Application, qui utilise l'algorithme T-LAMDA. Le logiciel se charge des calculs des cinétiques, en fonction des images qui respectent un protocole bien défini. Le temps de traitement de 117 images est de 6'47'' minutes, ce qui est largement en dessous du temps mis par les biologistes en effectuant manuellement le comptage
The presented works have for objective to help the biologists in the diagnosis of the cellular viability by using some methods of classification. Our work announces a strategy of classification allowing to building partition of images of cells coming from an optical microscope. We classify automatically the cells by operating the segmentation on images using the developed algorithm T-LAMDA. A statement concerning the existing classification methods, the color space and the resistance to noise, allows to finding the structure the most adapted to our study. The comparative analysis of various methods (of which LAMDA and T-LAMDA methods), allows us to put in evidence the most appropriate for the classification of cells subjected to the blue of methylene solution. We propose some supervised algorithms based on LAMDA to show if the way of treating the data influence the result. The T-LAMDA algorithm, based on the decision trees, shows itself the best adapted for our study and so gives more precise results than other methods, with a shorter time of execution. We suggest learning by using the CELCA application, Cell Classification Application, which uses the developed T-LAMDA algorithm. The software takes care of calculations of the kinetics, according to the images which respect to a well defined protocol. Time for treating 117 images is 6 '47'' minutes, what is widely below the time taken by biologists to count the cells

Le 21ème siècle a vu l'essor de la pathologie numérique. De fait, les challenges de l'analyse des données histopathologiques ont contribué à un effort mondial dans la lutte globale contre le cancer. Parallèlement, le succès récent de la décision par automate, plus particulièrement l'apprentissage profond, a révolutionné la recherche dans le domaine de la vision par ordinateur. Dans cette thèse, nous avons étudié la prédiction de la réponse au traitement chez des patients atteints d'un cancer du sein triple négatif avec deux approches différentes aux performances similaires. La première approche, basée sur le récent succès de la vision par ordinateur, extrait des caractéristiques afin d'en effectuer la classification finale. La deuxième approche contraint le flux d'information à passer par la segmentation de noyaux. En particulier, elle permet d'incorporer des informations de haute résolution à une vue globale basse résolution. Bien que cette approche soit plus attrayante, puisqu'elle repose sur l'analyse et la quantification d'un élément biologique précis, la segmentation de noyaux est une tâche fastidieuse. Nous proposons une nouvelle approche de segmentation par apprentissage profond, qui est particulièrement adaptée à la séparation de cellules en contact
The rise of digital pathology and with it the challenges of histopathology analysis have been the focus of a worldwide effort in the overall fight against cancer. In parallel, the recent success of automated decision-making, machine learning, and specifically deep learning, have revolutionised the basis of research as we know today. In this thesis, we tackle the prediction of treatment response in triple-negative breast cancer patients with two different approaches that reach similar outcomes. The first line of approach, based on the recent success of computer vision, extracts learned features from the data in order to perform classification. The second line of approach forces the information flow to pass through nuclei segmentation. In particular, it allows the incorporation of high-resolution information on to a lower resolution overview. Yet while this approach is more appealing as it is based on the analysis and quantification of a precise biological element, nuclei segmentation is troublesome. While solving the task of nuclei segmentation with deep learning, we propose a new formulation for nuclei segmentation which excels at separating touching objects

Depuis quelques années, de plus en plus d’études démontrent que la différenciation cellulaire est accompagnée d’une augmentation de la variabilité de l’expression des gènes. L’hypothèse de notre équipe est que cette variabilité influence en retour la différenciation. Pour tester cette hypothèse, nous avons identifié trois drogues chimiques (l’artémisinine,l’indométhacine et MB3) qui influencent à la fois cette variabilité, et le nombre de cellules différenciées dans une culture de progéniteurs érythocytaires aviaires. Cette thèse, divisée en deux parties, s’inscrit dans la continuité de ces observations. Dans un premier temps, nous définissons un modèle mathématique de la différenciation éythroïde aviaire in vitro, et nous le calibrons à l’aide de nos données expérimentales. Cette approche nous permet de quantifier l’effet des drogues sur la prolifération et la différenciation cellulaires. Puisque la comparaison de valeurs de paramètres entre les conditions traitées et non-traitées doit s’appuyer sur des estimations précises, une partie importante de notre travail porte sur l’identifiabilité de notre modèle. Nous démontrons dans cette partie que les drogues qui diminuent la variabilité de l’expression des gènes (l’artémisinine et l’indométhacine) diminuent aussi le taux de différenciation des cellules, et que la drogue qui augmente la variabilité (MB3) augmente aussi ce taux.Dans une second partie, nous observons que le résultat de l’expérience de différenciation in vitro qui nous sert à calibrer notre modèle est très variable. Nous essayons alors d’adapter notre modèle sous la forme d’un modèle à effets mixtes, dans lequel chaque réplicat de l’expérience est caractérisé par ses propres valeurs de paramètres. Les modèles à effets mixtes forment une classe de modèles statistiques dans laquelle les valeurs fixées des paramètres sont remplacées par des distributions de variables aléatoires, pour décrire la répétition d’une même mesure sur différents individus d’une population. Chaque individu est alors décrit par ses propres valeurs de paramètres, et la population est décrite par la distribution des valeurs de paramètres entre les individus. Nous démontrons que notre modèle à effets mixtes est non-identifiable et nous explorons ensuite différentes façon de le rendre identifiable, à travers une approche de design expérimental et une approche de réduction de modèle
During the past several years, several independent studies have shown that cell differentiation is accompanied by anincrease of the level of variability of gene expression. Hypothesizing that gene expression variability is a driver of celldifferentiation, our group has identified three chemical drugs (called artemisinin, indomethacin and MB3) whichinfluence both the extent of this variability and the number of differentiated cells in a culture of avian erythroidprogenitors.This thesis follows these observations, and is divided in two parts. First, we define a mathematical model ofavian in vitro erythroid differentiation and confront it to our experimental data, in order to disentangle the effect of thedrugs on cell proliferation, differentiation and death. Since the comparison of parameter values between the treated anduntreated conditions requires precise parameter estimates, an important part of the design of our model is theidentifiability of its parameters. We prove that the drugs which decrease gene expression variability (artemisinin andinndomethacin) also decrease the differentiation rate of the cells, and that the drug which increase variability (MB3)also increases the differentiation rate.Then, observing significant variability in the outcome of our in vitro differentiation experiment, we motivate thedesign of a mixed effect model of erythropoiesis, in which each replicate of the experiment is an individual characterizedby its own parameter values. Mixed effect models are a type of statistical models in which the fixed parameters arereplaced by distributions of random variables, in order to describe the repeated measurement of the same process ondifferent individuals from the same population. Each individual is then described by its own parameter values, and thepopulation is described by the distribution of parameter values across all individuals. We demonstrate the unidentifiabilityof this mixed effect model, and we finish by exploring ways of rendering it identifiable, using experimental design andmodel reduction

Au cours de ma thèse, mes projets de recherche ont visé à mieux comprendre les mécanismes moléculaires contrôlant la prolifération et la spécification des cellules progénitrices dans la rétine du xénope à travers trois projets principaux. Le réseau de régulation qui contrôle la spécification des cellules progénitrices vers les sous-types neuronaux est à ce jour très peu connu. C'est dans ce contexte que j'ai étudié le rôle du facteur de transcription à domaine bHLH, Ascl1, dans la détermination des sous-types rétiniens au cours du développement. Par des approches in vivo de gain et perte de fonction d'Ascl1, des expériences d'épistasie et la recherche de ses cibles transcriptionnelles, j'ai pu mettre en évidence qu'Ascl1 (i) est impliqué dans la genèse des neurones GABAergiques rétiniens, (ii) qu'il est épistatique sur des facteurs glutamatergiques tels que Neurog2, NeuroD1 ou Atoh7, (iii) que son activité GABAergique est conférée par son domaine basique de liaison à l'ADN et (iv) que cette activité implique la régulation directe du facteur de transcription Ptf1a. Ces données ajoutent donc une nouvelle pièce au réseau transcriptionnel gouvernant la spécification des sous-types GABAergiques au cours du développement de la rétine. La mise en place correcte des types et sous-types cellulaires de la rétine nécessite une coordination avec le moment de sortie du cycle cellulaire des progéniteurs rétiniens. Dans ce contexte, j'ai contribué à l'avancée d'un projet visant à étudier le réseau de signalisation contrôlant la prolifération des précurseurs de la rétine. Par des approches in vivo, génétiques et pharmacologiques, cette étude a montré que les voies Wnt et Hedgehog s'antagonisent pour réguler l'activité proliférative des cellules souches et progénitrices rétiniennes. Nos données préliminaires suggèrent que ces voies agissent de façon opposée à la fois sur la sortie et sur la cinétique du cycle cellulaire. Ce travail nous a conduit à proposer un modèle selon lequel ces voies Wnt et Hedgehog réguleraient la balance entre prolifération et différenciation dans la rétine post-embryonnaire. Enfin, dans le but d'élargir nos connaissances sur les réseaux de signalisation et les réseaux transcriptionnels impliqués dans le contrôle de la prolifération et de la détermination cellulaire dans la rétine, j'ai également contribué à la recherche de nouveaux marqueurs spécifiques des différentes populations cellulaires rétiniennes au travers d'un crible à grande échelle par hybridation in situ. De nombreux gènes spécifiquement exprimés dans les cellules souches ou les cellules progénitrices constituent des gènes candidats pour de futures approches fonctionnelles.

Les cellules se divisent, migrent, se réarrangent et acquièrent différents destins au cours du développement embryonnaire tout en s'organisant de manière à constituer un organisme de forme adéquate. Il est de plus en plus reconnu que la régulation de ces événements est contrôlée par des mécanismes d'auto-organisation. À la suite des travaux pionniers d'Alan Turing, qui a postulé, dans son modèle de réaction-diffusion, que l'interaction entre les molécules pouvait contrôler l'auto-organisation, des études ultérieures se sont concentrées sur l'identification des molécules de signalisation répondant aux critères de Turing. Cependant, alors que les forces mécaniques sont générées et propagées à l'échelle des tissus au cours de la morphogenèse, la possibilité qu'elles puissent agir comme des signaux dans l'auto-organisation embryonnaire est largement sous-explorée. L'embryon aviaire au stade de gastrula, qui se prête bien aux approches d'imagerie sur embryon vivant et aux perturbations mécaniques, constitue un excellent modèle pour étudier le rôle des forces mécaniques au cours du développement. En outre, les expériences classiques ont démontré la nature hautement régulatrice et auto-organisée du développement précoce des oiseaux : lorsque le disque épithélial précoce (blastoderme) est divisé en deux, des embryons entièrement formés émergent de chaque partie séparée. Bien que des travaux récents effectués au laboratoire aient permis de dresser un tableau précis des mécanismes qui façonnent l'embryon à ce stade, leur rôle dans la régulation et l'auto-organisation de l'embryon reste à étudier, et c'est précisément le sujet de cette thèse de doctorat. En collaboration avec un physicien, nous avons tout d'abord formulé un modèle mathématique qui rend compte de l’état stable des forces observées à la marge entre la région embryonnaire et extra-embryonnaire de l'embryon. Ce modèle est fondé sur l'hypothèse que la mécanique tissulaire à la marge s'auto-organise par analogie à un système mécanique de Turing : la contractilité tissulaire agit comme un activateur local et la tension tissulaire comme un inhibiteur à longue portée. Nous avons obtenu des prédictions novatrices, que nous avons testées expérimentalement pour évaluer la validité de notre modèle et, plus généralement, pour explorer le lien entre les forces mécaniques et l'expression génétique. Nous avons constaté que la modulation de la contractilité des tissus à la marge modifie l'expression normale de Gdf1, un morphogène clé dans la formation de l'embryon, et entraîne la formation de lignes primitives ectopiques (axe primaire du corps). Nous avons ensuite perturbé l'embryon mécaniquement. En utilisant l'imagerie sur embryon vivant et l'ablation au laser, nous avons pu orienter et bissecter précisément le blastoderme précoce. Nous avons constaté que dans les moitiés antérieures, la contractilité des tissus peut déclencher de manière ectopique l'expression de Gdf1 et la formation de lignes primitives. Par la suite, pour explorer davantage la rétroaction entre la mécanique des tissus et l'expression des gènes, nous nous sommes concentrés sur la moitié bissectée postérieure où Gdf1 est exprimé de manière endogène. Nous avons montré qu'après quelques heures suivant la coupe, les forces mécaniques se redimensionnent en fonction de la nouvelle taille de la marge et des domaines d'expression de Gdf1. De plus, nous avons également constaté que l'expression de certains marqueurs des territoires embryonnaires suivent le redimensionnement de la marge, suggérant un rôle actif de la mécanique tissulaire dans l'allocation du destin cellulaire au cours du développement. Enfin, nous avons montré que des lignes primitives ectopiques pouvaient se former en plaçant un obstacle physique à la marge, suivant une prédiction selon laquelle une friction ectopique s'ajoute au mouvement du tissu à la marge. [...]
During embryonic development, cells divide, migrate, rearrange, acquire different fates while organizing into a properly shaped organism. The regulation of these events is increasingly recognized to be controlled by self-organizing mechanisms. Following the seminal work of Alan Turing, who postulated, in his reaction-diffusion model, that self-organization could be controlled by the interaction between molecules, subsequent studies have focused on the identification of signaling molecules fulfilling Turing’s criteria. However, mechanical forces are generated and propagated at the tissue-scale level during morphogenesis, yet the possibility that they might act as signals in embryonic self-organization is largely underexplored. The gastrulating avian embryo, which is highly amenable to both live imaging approaches and mechanical perturbations, represents a great model to investigate the role of mechanical forces during development. Furthermore, classic experiments have demonstrated the highly regulative and self-organizing nature of early avian development: when the early epithelial disk (blastoderm) is bisected, fully formed embryos emerge from each separated part. Although recent work performed in the lab has drawn a precise mechanical picture that shapes the embryo at this stage, their role in regulating and self-organizing the embryo remains elusive, and it is the subject of this Ph.D. thesis. In collaboration with a physicist, we first formulated a mathematical model that accounts for the steady pattern of forces observed at the margin between the embryonic and extraembryonic region of the embryo. The model is based on the hypothesis that tissue mechanics at the margin self-organizes in analogy to a mechanical Turing system: tissue contractility acts as a local activator and tissue tension as a long-range inhibitor. We obtained unique predictions, which we tested experimentally to validate our model and ultimately explore the link between mechanical forces and gene expression. We found that modulation of tissue contractility at the margin alters the normal expression of Gdf1, a key morphogen in the formation of the embryo, and results in the formation of ectopic primitive streaks (primary body axis). We then perturbed the embryo mechanically. Using time-lapse imaging and laser ablation, we could orient and precisely bisect the early blastoderm. We found that in anterior halves, tissue contractility can ectopically initiate Gdf1 expression and primitive streak formation. Subsequently, to further explore the feedback between tissue mechanics and gene expression, we focused on the posterior bisected half where Gdf1 is endogenously expressed. We showed that after a few hours from the cut, the mechanical forces rescale according to the new size of the margin along with the expression domains of Gdf1. Moreover, we also found that the expression of selected embryonic territories markers follows the rescaling of the margin, suggesting an active role of tissue mechanics in allocating cell fate during development. Lastly, we showed that ectopic primitive streaks could form by placing a physical obstacle at the margin, following a prediction whereby ectopic friction is added to the motion of the tissue at the margin. This last result strongly argues against molecular diffusion as the driver of self-organization and rules out spurious events in the formation of ectopic embryos upon bisection (i.d. wound healing). Thus, this work uncovers the role of mechanical forces as signaling factors during embryonic development and demonstrates that tissue mechanics at the margin of the embryo self-organizes and underlies embryonic regulation in amniotes

Le développement urbain apparaît distinct selon sa localisation géographique, le contexte socio-économique, politique ou culturel dans lequel il s’ancre. Néanmoins, l’action d’urbaniser s’appuie sur un seul et même principe : construire des bâtiments pour l’habitation et les activités humaines. Par conséquent, l’objectif principal de ce travail de recherche est de déterminer si une part universelle du processus de développement urbain peut se distinguer d’une part spécifique, liée à une localisation géographique. Cette recherche s’intéresse plus précisément aux changements d’occupation du sol sur la zone transfrontalière Franco-Allemande. En effet, le contexte transfrontalier renforce les différences au sein de la zone d’étude. Cependant, l’importance des frontières internes européennes en tant que séparation, a diminué parallèlement au renforcement des accords et de la coopération entre les pays membres de l’Union Européenne. Un questionnement sur le caractère éventuellement homogène de cette zone à travers l’étude des processus de développement urbain à l’œuvre, est donc d’autant plus pertinent. Pour une meilleure compréhension du processus de développement urbain, une méthode spécifique basée sur l’utilisation de l’apprentissage automatique par arbres de décision (AD) a été élaborée. Elle vise à générer et calibrer les règles de transition nécessaires à la simulation par automate cellulaire (AC). L’apprentissage s’appuie sur les caractéristiques d’occupation du sol dans le voisinage des cellules urbanisées entre 1990 et 2006, ainsi que sur les caractéristiques intrinsèques de ces cellules (accessibilité aux pôles urbains majeurs, localisation dans l’un ou l’autre des pays frontaliers). Les résultats obtenus par l’analyse du jeu de règles mettent en évidence une influence de la spécificité nationale et de l’occupation du sol initiale dans certaines règles. Cependant, il apparaît qu’une part du processus s’affranchit de l’une comme de l’autre des contraintes, tendant ainsi à une plus grande universalité. Une analyse plus détaillée de ces règles permet ensuite de dégager des critères de voisinage et d’accessibilité influençant positivement de l’urbanisation de chaque cellule, et de comparer leur importance suivant la nature des règles analysées (françaises, allemandes, transfrontalières). En résumé, l’apport de cette thèse se mesure à trois niveaux : (1) d’un point de vue théorique en proposant d’identifier un degré d’universalité dans les processus de développement urbain ; (2) d’un point de vue thématique en caractérisant l’influence de la localisation du développement urbain dans une zone frontalière ; et (3) d’un point de vue méthodologique en développant un modèle sur la base d’un couplage AD – AC qui a permis de générer et calibré automatiquement le modèles utilisé pour simuler le développement urbain dans ce travail de recherche
Urban development can take different forms or features, depending on its geographical location and its socio-economic, political and cultural context. Nevertheless, the overall action relies on one fundamental principle: building construction in order to give people housing. Therefore, the main objective of this research is to determine whether an underlying universal aspect of the urban development process can be distinguished from a specific one, being the reflect of local specificities. Specifically, this research analyzes the land use change on the French-German cross-border area. Indeed, the border context enhances the difference within this territory. Nonetheless, the internal European border importance as a separation is getting lower while European Union agreement and cooperation are getting stronger. Consequently, we tend to question a potential homogeneity of such area according the urban development analysis. To gain a better understanding of the urban development in the French-German cross-border area, a specific method using a decision tree (DT) process to generate and calibrate urban transition rules for cellular automata (CA) has been developed. In order to define CA rules, the learning algorithm is provided with data of land use, from 1990 and 2006, accessibility to the main urban area and country location. The findings demonstrate that the rule set identified rules, which are constrained at different levels: from the initial land use state needed for urbanization to the geographical location in a specific country. The analysis therefore shows rules specific to France or Germany, as well as rules free from any state location constraints, which characterize a cross-border urbanization process. The latter is more influenced by the location toward main urban areas. Proper neighborhood and internal characteristic of urbanized cells depending of the nature of the rule (French, German or Cross-border) are explicitly defined. In conclusion, this research contribution can be summarized according to the following three orientations: (1) from a theoretical point of view, which propose to identify urban processes degree of universality, (2) from a thematic outlook, describing the influence of the urban development process location on the border area, (3) from a methodological point of view, pairing DT and AC to automatically design and calibrate the urban development model used in this research work

A partir d'une réflexion conceptuelle et méthodologique pour un réel couplage des automates cellulaires et des modèles multi-agents, le modèle de simulation VisualSimores a été conçu pour répondre, en partie, aux problématiques de simulation de la mobilité résidentielle en milieu urbain. L'intérêt majeur de cette approche réside dans la mise en exergue, dans une perspective d'aide à la décision en aménagement et urbanisme, des rapports qu'entretiennent entre eux, deux phénomènes séparément observables : la mobilité résidentielle des ménages d'une part et les changements urbains d'autre part. La difficulté de l'exercice apparaît immédiatement : il s'agit de cerner les liens qui, à certains types de ménages font correspondre des catégories de logements et vise versa. Plus largement, il s'agit d'identifier les logiques selon lesquelles les ménages expriment et concrétisent leur choix résidentiels. Dans cette perspective, et en raison de la nature complexe du système urbain, la combinaison d'un modèle d'automates cellulaires contraint par un modèle bayésien du comportement des ménages et le paradigme multi agents se révèle plus appropriée.

Les objectifs de la thèse étaient d’identifier le nombre de MTI en développement, d’évaluer prospectivement l’impact financier que produiront les traitements innovants et de rechercher de nouvelles modalités de paiement des MTI pour aider les décideurs publiques à anticiper l’impact des MTI à court et moyen terme sur le budget de l’assurance maladie. Le nombre de MTI en développement est évalué par le dénombrement des essais cliniques des MTI dans 3 bases de données internationales. Cette étude a montré le grand nombre de MTI en développement et susceptible d’arriver sur le marché. L’impact budgétaire des MTI est évalué. Des modèles de Markov ont été développés pour 3 maladies : Alzheimer, Parkinson et l’insuffisance cardiaque. Ensuite, l’impact des MTI dans 35 maladies sera estimé à l’aide des hypothèses. Cette section montre que les prix élevés des MTI seront inabordables, les payeurs ne pourront pas payer le prix de tous les MTI à l’avance. Une identification des modèles de paiement des thérapies innovantes est effectuée via une revue de la littérature. Ces modèles ont été évalués et discutés durant une réunion d’experts puis un modèle de paiement optimal pour les MTI est suggéré. Des recommandations stratégiques sont présentées pour aider les industriels et les décideurs publiques à assurer l’accès des patients aux thérapies innovantes tout en maintenant la pérennité de l’assurance maladie et évitant la faillite
The objectives of this thesis were to identify the magnitude of the ATMPs pipeline, to assess the budget impact of ATMPs and to suggest new funding models for ATMPs in order to help decision-makers to anticipate the hypothetical short and medium term budget impact of such products. The magnitude of ATMPs pipeline was evaluated by identifying the number and characteristics of ATMPs clinical trials in 3 worldwide clinical trials databases. A large number of ATMPs are in development (939 clinical trials) and may successfully reach the market. Overall, the results showed that the number of ATMPs clinical trials has been consistently growing over the past 15 years. The budget impact of ATMPs was assessed. Markov models were developed to assess the cost-effectiveness and budget impact for ATMPs using 5 efficacy scenarios in Parkinson disease, Alzheimer’s disease and heart failure. Then, an estimation of the budget impact of 35 ATMPs was conducted suggesting that an ATMP can cure all patients. We have shown in this chapter that a cost-effective ATMP may be unaffordable; payers will not be able to pay upfront the costs of all ATMPs. The traditional funding models may not be adaptable for ATMPs. The proposed funding models for innovative high-cost therapies were identified through a literature review, discussed during a consensus meeting and an optimal funding model for ATMPs was recommended.Finally, health policy recommendations for the stakeholders – patients, physicians, payers and manufacturers – are presented. These recommendations aim to help to ensure patient access to innovation while maintaining the sustainability of healthcare system

Les changements évolutifs nous instruisent sur les nombreuses innovations permettant à chaque organisme de maximiser ses aptitudes en choisissant le partenaire approprié, telles que les caractéristiques sexuelles secondaires, les patrons comportementaux, les attractifs chimiques et les mécanismes sensoriels y répondant. L'haploïde de la levure Saccharomyces cerevisiae distingue son partenaire en interprétant le gradient de la concentration d'une phéromone sécrétée par les partenaires potentiels grâce à un réseau de protéines signalétiques de type kinase activées par la mitose (MAPK). La décision de la liaison sexuelle chez la levure est un événement en "tout–ourien", à la manière d'un interrupteur. Les cellules haploïdes choisissent leur partenaire sexuel en fonction de la concentration de phéromones qu’il produit. Seul le partenaire à proximité sécrétant des concentrations de phéromones égales ou supérieures à une concentration critique est retenu. Les faibles signaux de phéromones sont attribués à des partenaires pouvant mener à des accouplements infructueux. Notre compréhension du mécanisme moléculaire contrôlant cet interrupteur de la décision d'accouplement reste encore mince. Dans le cadre de la présente thèse, je démontre que le mécanisme de décision de la liaison sexuelle provient de la compétition pour le contrôle de l'état de phosphorylation de quatre sites sur la protéine d'échafaudage Ste5, entre la MAPK, Fus3, et la phosphatase,Ptc1. Cette compétition résulte en la dissociation de type « intérupteur » entre Fus3 et Ste5, nécessaire à la prise de décision d'accouplement en "tout-ou-rien". Ainsi, la décision de la liaison sexuelle s'effectue à une étape précoce de la voie de réponse aux phéromones et se produit rapidement, peut-être dans le but de prévenir la perte d’un partenaire potentiel. Nous argumentons que l'architecture du circuit Fus3-Ste5-Ptc1 génère un mécanisme inédit d'ultrasensibilité, ressemblant à "l'ultrasensibilité d'ordre zéro", qui résiste aux variations de concentration de ces protéines. Cette robustesse assure que l'accouplement puisse se produire en dépit de la stochasticité cellulaire ou de variations génétiques entre individus.Je démontre, par la suite, qu'un évènement précoce en réponse aux signaux extracellulaires recrutant Ste5 à la membrane plasmique est également ultrasensible à l'augmentation de la concentration de phéromones et que cette ultrasensibilité est engendrée par la déphosphorylation de huit phosphosites en N-terminal sur Ste5 par la phosphatase Ptc1 lorsqu'elle est associée à Ste5 via la protéine polarisante, Bem1. L'interférence dans ce mécanisme provoque une perte de l'ultrasensibilité et réduit, du même coup, l'amplitude et la fidélité de la voie de réponse aux phéromones à la stimulation. Ces changements se reflètent en une réduction de la fidélité et de la précision de la morphologie attribuable à la réponse d'accouplement. La polarisation dans l'assemblage du complexe protéique à la surface de la membrane plasmique est un thème général persistant dans tous les organismes, de la bactérie à l'humain. Un tel complexe est en mesure d'accroître l'efficacité, la fidélité et la spécificité de la transmission du signal. L'ensemble de nos découvertes démontre que l'ultrasensibilité, la précision et la robustesse de la réponse aux phéromones découlent de la régulation de la phosphorylation stoichiométrique de deux groupes de phosphosites sur Ste5, par la phosphatase Ptc1, un groupe effectuant le recrutement ultrasensible de Ste5 à la membrane et un autre incitant la dissociation et l'activation ultrasensible de la MAPK terminal Fus3. Le rôle modulateur de Ste5 dans la décision de la destinée cellulaire étend le répertoire fonctionnel des protéines d'échafaudage bien au-delà de l'accessoire dans la spécificité et l'efficacité des traitements de l'information. La régulation de la dynamique des caractères signal-réponse à travers une telle régulation modulaire des groupes de phosphosites sur des protéines d'échafaudage combinées à l'assemblage à la membrane peut être un moyen général par lequel la polarisation du destin cellulaire est obtenue. Des mécanismes similaires peuvent contrôler les décisions cellulaires dans les organismes complexes et peuvent être compromis dans des dérèglements cellulaires, tel que le cancer. Finalement, sur un thème relié, je présente la découverte d'un nouveau mécanisme où le seuil de la concentration de phéromones est contrôlé par une voie sensorielle de nutriments, ajustant, de cette manière, le point prédéterminé dans lequel la quantité et la qualité des nutriments accessibles dans l'environnement déterminent le seuil à partir duquel la levure s'accouple. La sous-unité régulatrice de la kinase à protéine A (PKA),Bcy1, une composante clé du réseau signalétique du senseur aux nutriments, interagit directement avec la sous-unité α des petites protéines G, Gpa1, le premier effecteur dans le réseau de réponse aux phéromones. L'interaction Bcy1-Gpa1 est accrue lorsque la cellule croit en présence d'un sucre idéal, le glucose, diminuant la concentration seuil auquel la décision d'accouplement est activée. Compromettre l'interaction Bcy1-Gpa1 ou inactiver Bcy1 accroît la concentration seuil nécessaire à une réponse aux phéromones. Nous argumentons qu'en ajustant leur sensibilité, les levures peuvent intégrer le stimulus provenant des phéromones au niveau du glucose extracellulaire, priorisant la décision de survie dans un milieu pauvre ou continuer leur cycle sexuel en choisissant un accouplement.
Evolution has resulted in numerous innovations that allow organisms to maximize their fitness by choosing particular mating partners, including secondary sexual characteristics, behavioural patterns, chemical attractants and corresponding sensory mechanisms. The haploid yeast Saccharomyces cerevisiae selects mating partners by interpreting the concentration gradient of pheromone secreted by potential mates through a network of mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling proteins. The mating decision in yeast is an all-or-none, or switch-like, response that allows cells to make accurate decisions about which among potential partners to mate with and to filter weak pheromone signals, thus avoiding inappropriate commitment to mating by responding only at or above critical concentrations when a mate is sufficiently close. The molecular mechanisms that govern the switch-like mating decision are poorly understood. In this thesis I demonstrate that the switching mechanism arises from competition between the MAPK Fus3 and a phosphatase Ptc1 for control of the phosphorylation state of four sites on the scaffold protein Ste5. This competition results in a switch-like dissociation of Fus3 from Ste5 that is necessary to generate the switch-like mating response. Thus, the decision to mate is made at an early stage in the pheromone pathway and occurs rapidly, perhaps to prevent the loss of the potential mate to competitors. We argue that the architecture of the Fus3–Ste5–Ptc1 circuit generates a novel ultrasensitivity mechanism that resembles “zero-order ultrasensitivity”, which is robust to variations in the concentrations of these proteins. This robustness helps assure that mating can occur despite stochastic or genetic variation between individuals. I then demonstrate that during the mating response, an early event of Ste5 recruitment to plasma membrane is ultrasensitive and that it is generated by dephosphorylation of eight N-terminal phosphosites on Ste5 by the phosphatase Ptc1 when associated with Ste5 via the polarization protein Bem1. Interference with this mechanism results in loss of ultrasensitivity and reduced amplitude and therefore fidelity of the pheromone signaling response. These changes are reflected in reduced fidelity and accuracy of the morphogenic mating response. Polarized assembly of signaling protein complexes at the plasma membrane surface is a general theme recapitulated in all organisms from bacteria to humans. Such complexes can increase the efficiency, fidelity and specificity of signal transduction. Together with our previous findings, our results demonstrate that ultrasensitivity, accuracy and robustness of the pheromone response occurs through regulation of the stoichiometry of phosphorylation of two clusters of phosphosites on Ste5, by Ptc1, one cluster mediating ultrasensitive recruitment of Ste5 to the membrane and the other, ultrasensitive dissociation and activation of the terminal MAP kinase Fus3. The role of Ste5 as a direct modulator of a cell-fate decision expands the functional repertoire of scaffold proteins beyond providing specificity and efficiency of information processing. Regulation of dynamic signal-response characteristics through such modular regulation of clusters of phosphosites may be a general means by which cell fate decisions are achieved. Similar mechanisms may govern cellular decisions in higher organisms and be disrupted in cancer. Finally, in a related theme, I present the discovery of a novel mechanisms by which the threshold of pheromone response is controlled by a nutrient-sensing pathway, thus adjusting the set-point at which the quantity and quality of nutrients available in the environment set the threshold of pheromone at which yeast will mate. The regulatory subunit of protein kinase A (PKA), Bcy1, a key component of a nutrient sensing signaling network, directly interacts with the α subunit of G-protein, Gpa1, the primary effector of the pheromone signaling network. The Bcy1-Gpa1 interaction is enhanced when cells are grown in their ideal carbon source glucose, lowering the threshold concentration at which the mating response is activated. Disruption of Bcy1-Gpa1 interaction or Bcy1 deletion increased the threshold concentration for the mating response. We argue that by adjusting their sensitivity, yeast can integrate pheromone stimulus with glucose levels and prioritize decisions to survive in a nutrient-starved environment or to continue their sexual cycle by mating.