Dissertations / Theses on the topic 'Criblages'
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Autour, Alexis. "Amélioration et criblages de propriétés d'ARN aptamères fluorogènes en systèmes microfluidiques." Thesis, Strasbourg, 2018. http://www.theses.fr/2018STRAJ057.
Abstract:
Les ARN (Acide RiboNucléique) remplissent de nombreuses fonctions clés dans le vivant. Ils peuvent être support de l'information génétique, régulateurs de celle-ci. Visualiser ces molécules au sein d'une cellule représenterait une étape importante vers une meilleure compréhension de la régulation de l'expression des gènes. Les ARN fluorogènes tels que Spinach et Mango sont des outils extrêmement prometteurs pour atteindre cet objectif. Cependant ces deux ARN fluorogènes présentent une brillance limitée. La Compartimentation in vitro assistée par microfluidique (µCIV) est un outil très prometteur dont notre groupe a démontré l’efficacité pour l’évolution d’ARN. Dans le cadre de cette thèse, la µCIV a été adaptée à la sélection d'aptamères d'ARN fluorogènes pour en améliorer les propriétés (surtout la brillance). De plus, l’utilisation conjointe du séquençage haut débit a permis l’optimisation très rapide et semi-automatisée à la fois d’aptamères mais aussi de biosenseurs fluorogènes. Ainsi, cette thèse a permis de mettre en place et d’exploiter des technologies de criblage robustes pour la découverte de nouveaux aptamères d'ARN et de biosenseursRNA is a key molecule in gene expression and its regulation. Therefore, being able to monitor RNA through live-cell imaging would represent an important step toward a better understanding of gene expression regulation. RNA-based fluorogenic modules are extremely promising tools to reach this goal. To this end, two light-up RNA aptamers (Spinach and Mango) display attractive properties but they suffer from a limited brightness. Since previous work in the group demonstrated the possibility to evolve RNA using microfluidic-assisted in vitro compartmentalization (µIVC), this technology appeared to be well suited to improve light-up aptamers properties by an evolution strategy. Therefore, the µIVC procedure was adapted to fluorogenic RNA aptamers to improve their properties (especially the brightness). Finally, using µIVC in tandem with high-throughput sequencing (NGS) allowed further developing the technology into a more integrated and semi-automatized approach in which RNAs and biosensors are selected by µIVC screening and the best variants identified by a bioinformatics process upon NGS analysis. To summarize, this thesis allowed establishing robust µIVC screening workflows for the discovery of novel efficient light-up RNA aptamers as well as metabolites biosensors
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Giroux, Valentin. "Criblages systématiques de nouvelles cibles thérapeutiques dans le traitement du cancer pancréatique humain." Aix-Marseille 2, 2008. http://theses.univ-amu.fr.lama.univ-amu.fr/2008AIX22082.pdf.
Abstract:
Le cancer pancréatique est une pathologie avec un pronostic très sombre malgré d’énormes efforts thérapeutiques. Le meilleur agent chimiothérapeutique, la gemcitabine, apporte un bénéfice de survie modeste et un taux de réponse très peu élevé. L’échec des stratégies antitumorales actuelles signifie que de nouvelles voies doivent être explorées. Le stress cellulaire regroupe tous les événements qui éloignent une cellule de son état d’homéostasie. La cellule devra alors mettre en place un programme génique de réponse au stress qui lui permettra de s’adapter à sa nouvelle condition et ainsi de survivre. La protéine p8 est une protéine de stress induite par de nombreux stimuli et pourrait donc avoir un rôle prépondérant dans la résistance aux traitements du cancer pancréatique. Nous avons démontré que la protéine p8 est impliquée dans la résistance à la gemcitabine de cellules pancréatiques cancéreuses humaines. Nous avons d’ailleurs pu décrire un des mécanismes de régulation de l’apoptose par p8 en étudiant son interaction avec la prothymosine α. Il existe plus de 500 protéines kinases chez l’homme qui représentent, par leur rôle central dans la signalisation cellulaire, autant de cibles potentielles pour le traitement du cancer pancréatique. Nous avons défini par criblage systématique sur l’ensemble du kinome humain, un catalogue de kinases impliquées dans la survie des cellules pancréatiques cancéreuses humaines. Après avoir sélectionné plusieurs candidats dans ce catalogue, nous avons démontré que leur inhibition combinée par des siRNA potentialise l’induction de l’apoptose dans des cellules pancréatiques cancéreuses humaines in vitro et dans des xénogreffes intrapancréatiques dans un modèle murin in vivo. Ce travail ouvre des perspectives intéressantes pour l’utilisation de nouvelles cibles thérapeutiques dans le traitement du cancer pancréatiquePancreatic cancer is a disease with a very bleak prognosis despite important therapeutic efforts. The best chemotherapeutic agent, gemcitabine, is making a modest improvement of survival and has a very low response rate. The failure of current antitumoral strategies means that new targets possibilities must be explored. The cellular stress comprises of all events that disrupt cell homeostasis. The cell survival in response to stress involves activation of genes. The p8 protein is a stress protein induced by several stimuli and could therefore have a role in the resistance of pancreatic cancer. Here, we have demonstrated that the p8 protein is involved in resistance to gemcitabine in human pancreatic cancer cells. We have also described one of the mechanisms by which p8 regulates apoptosis by studying its interaction with the prothymosin α. There are more than 500 protein kinases in human cells which represent, by virtue of their central role in cell signaling, potential targets for the treatment of pancreatic cancer. Using a systematic screening of the human kinome, we obtained a catalogue of kinases involved in the survival of human pancreatic cancer cells. After selecting several candidates in this catalogue, we have demonstrated that their combined inhibition with siRNAs improves the induction of apoptosis in human pancreatic cancer cells in vitro and in intrapancreatic xenografts in a mouse model in vivo. This work opens up interesting perspectives for the use of new therapeutic targets for the treatment of pancreatic cancer
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Colin, Boris. "Développement de méthodes de criblages et d'analyses en parallèle appliquées aux polymères modifiés silanes." Thesis, Rennes 1, 2015. http://www.theses.fr/2015REN1S145.
Abstract:
Les travaux ont pour objectif de trouver des catalyseurs capables de remplacer les organo-étains pour la réticulation de matériaux adhésifs. La stratégie employée au laboratoire exploite des outils de la chimie en parallèle afin d’en tester un grand nombre pour accéder plus rapidement à la découverte de systèmes catalytiques performantsThe aim of this work is to discover new catalytic systems to replace organotin compounds. The strategy used on our laboratory exploits tools of high throughput experiments to test a large number of catalysts in the same time in order to discover new catalytic systems more quickly
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Macovei, Cristian-Paul. "Identification de catalyseurs à l'aide de criblages à haut débit basés sur des techniques immunoenzymatiques." Phd thesis, Université Paris Sud - Paris XI, 2008. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00447202.
Abstract:
Le travail décrit dans ce manuscrit présente l'utilisation de deux techniques immunoenzymatiques pour le criblage à haut débit de catalyseurs chimiques et biologiques. Ces méthodes, jusqu'à présent réservées au monde du diagnostic sont employées ici pour la découverte de nouveaux catalyseurs pour des réactions énantiosélectives ainsi que pour des réactions de couplage. Les dosages immunologiques « par compétition » faisant appel aux anticorps monoclonaux se sont avérés des excellents outils pour le criblage à haut débit de catalyseurs asymétriques pour les réactions d'insertion de carbénoïdes dans la liaison OH de l'eau tandis que celles utilisant des anticorps polyclonaux ont été utilisées avec succès pour le criblage de biocaytalyseurs pour la réaction d'ouverture énantiosélective des oxazolones par l'eau. Un autre type de méthode utilisant des anticorps monoclonaux, appelée « sandwich » nous a permis de réaliser le criblage à haut débit de catalyseurs pour la réaction de cycloaddition alcyne-azoture.
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Husson, Guillaume. "Développement de méthodes de criblages et en prallèle pour catalyse hétérogène de polymérisation d'oléfines gazeuses." Rennes 1, 2007. http://www.theses.fr/2010REN1S158.
Abstract:
La stratégie employée au laboratoire exploite des outils de chimie en parallèle afin d’accéder plus rapidement aux systèmes actifs. Dans un premier axe de recherche, deux banques de ligands, les carbonylaminofulvènes déprotonés et les métallocènes pontés synthétisés en parallèle, ont été étudiées pour la catalyse de polymérisation de l���éthylène. Ces travaux ont conduit à la découverte de systèmes actifs en catalyse homogène et hétérogène. Dans un deuxième temps, de nouvelles méthodologies pour le criblage en catalyse hétérogène de polymérisation d’oléfines ont été mises au point : les polymérisations dans des sachets et au format spot sur plaque 2D. Enfin, une nouvelle technique pour l’analyse viscosimétrique de poly(styrène sulfonate) de sodium dans l’eau, par le biais de pinces optiques, a été développée. Des comparaisons entre la rhéologie gouvernée par des lois empiriques et la microrhéologie ont été menées afin de valider cette méthodeIn the first research part, two libraries of ligands have been synthesized in parallel and evaluated in olefin polymerization: bridged ligands for metallocenes and deprotonated carbonylamino fulvene ligands. This work led to the discovery of active systems in homogeneous and heterogeneous catalysis of polymerization. The second part is the development of new high-thoughput methods for heterogeneous catalysis of olefins polymerization. Sealed bags, where the supported catalysts are introduced and the polymer is formed, produce in parallel various polymers from several different catalytic systems. The multi-spot plates method allows a quick and simple evaluation of catalysts in gas-phase polymerization. Finally, the last part is the development of a new technique for viscosimetric analysis with optical tweezers applied to poly(sodium 4-styrene sulfonate) in water. Comparisons between rheology governed by empirical laws and microrheology have been conducted to validate this analysis method
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Serve, Olivier. "Méthodologies de criblages d'interactions protéines-ligands par RMN : inhibitions de la Glms et de Bcl-xL." Paris 11, 2008. http://www.theses.fr/2008PA112134.
Abstract:
La versatilité de la Résonance Magnétique Nucléaire (RMN) lui permet des applications dans des domaines variés. Cette versatilité en fait un instrument de première importance dans la recherche de traitements thérapeutiques. Elle permet de déterminer la structure et la dynamique des molécules en interactions. Nous avons utilisé la RMN sur deux protéines impliquées dans diverses pathologies : Bcl-xL, partiellement responsable de la déficience en apoptose dans certains cancers, et la Glms, connnue pour provoquer des complications chez des patients atteints de diabète de type II et cible dans la lutte anti-bactérienne. Le but était d’améliorer notre compréhension des interactions entre ces protéines et de nouveaux ligands capables d’inhiber leurs activités. Ceux-ci sont soit extraits de plantes, dans le cas de Bcl-xL, soit de synthèse, dans le cas de Glms. Nos résultats ont permis de donner des orientations quant à l’amélioration du pouvoir thérapeutique des ligands étudiésThe versatility of Nuclear Magnetic Resonance (NMR) allows several applications in various domains. This versatility makes it a tool of prime importance in the field of therapeutic treatments research. It allows the determination of the structure and the dynamic of the interacting molecules. We used NMR on two proteins involved in diverse pathologies : Bcl-xL, partially responsible for the apoptosis deficiency for certain cancers, and the Glms, known to give complications to people affected with type II diabetes and target in the anti-microbial fight. The goal was to enhance our understanding of the interactions between those proteins and new molecules able to inhibit their activities. Those molecules are either extract from plants (Bcl-xL study), or synthesized (Glms study). Our results allowed to give orientations about the enhancements of the therapeutic effects of the studied molecules
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Lienhart, Yann. "Analyse et exploitation de données de criblages de réactions chimiques pour la recherche de voies de synthèse." Strasbourg, 2011. http://www.theses.fr/2011STRA6223.
Abstract:
Les bases de données en chimie sont généralement centrées sur les molécules et les informations concernant les réactions sont extraites des publications scientifiques. Ces informations sont généralement disponibles dans des conditions expérimentales particulières et peu de données sont disponibles au sujet des réactions à faible rendement ou qui n’ont pas fonctionnées. En conséquence il peut être difficile de comparer les réactions et les transformations chimiques entre elles en raison de ces conditions expérimentales spécifiques et de ces données manquantes. Cette thèse a été financée par la société NovAlix (CIFRE), spécialisée en chimie organique et en biologie structurale. Afin d’explorer rapidement l’espace chimique et d’améliorer le processus de synthèse de molécules, deux méthodes d’expérimentation à haut débit ont été mises au point au sein de la société. Ces méthodes s’appuient sur la chromatographie en phase gazeuse et sur la spectrométrie de masse pour l’analyse des milieux réactionnels. La plate-forme informatique Magellan développée au cours de cette thèse est mise en œuvre grâce aux technologies Java Enterprise Edition et s’appuie sur une base de donnée centrée autour de la réaction chimique. Cet application permet la lecture, l’analyse et le stockage des données expérimentales récoltées par les méthodes d’expérimentation à haut débit de NovAlix et fournit des outils informatiques facilitant l’analyse des spectres expérimentaux et permettant la formulation de requêtes sur les expériences ainsi enregistréesChemistry databases are centered on chemicals and their reaction data is extracted from scientific literature. They are usually given in non-standardized conditions and in general nothing is available about reactions that did not occur or exhibit a low yield. Thus, it can be difficult to compare reactions and chemical transformations because of the specific experimental conditions and the missing data. This thesis has been funded by NovAlix (CIFRE), a company specialized in organic chemistry synthesis and structural biology. In order to explore the chemical space and improve the chemical synthesis process, two high-throughput reactions screening methods using gas chromatography and mass spectrometry have been set up in NovAlix. The Magellan information system developed during this thesis use a chemical reaction-centric database and is built on Java Enterprise Edition open-source technologies. It allows collecting high-throughput data from mass spectrometry and gas chromatography experimentations realized in standardized conditions. Then, the Magellan application enables the chemist to read and store experimental results, provides tools to help data analysis and query the collected data via a rich-client user interface
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Navarri, Marion. "Métabolites secondaires de champignons de sédiments marins profonds : criblages génétique et fonctionnel et caractérisation structurale de molécules antimicrobiennes." Thesis, Brest, 2016. http://www.theses.fr/2016BRES0127/document.
Abstract:
La propagation des micro-organismes résistants aux antibiotiques menace le système mondial de santé publique. Pour lutter contre ce phénomène, le renouvellement des molécules utilisées en antibiothérapie est devenu une priorité mondiale. Les antibiotiques étant principalement d’origine microbienne, l’étude des micro-organismes et de leurs métabolites s’est donc renforcée et s’oriente vers des écosystèmes peu explorés comme les biotopes marins.Nous avons exploré les activités antimicrobiennes d’une collection de 183 champignons isoles de sédiments marins profonds et collectés entre 4 et 1884 mètres sous le plancher océanique. Le potentiel de production de métabolites de cette collection a été révélé par un criblage génétique ciblant les PolyKetide synthase (PKS), les Non-Ribosomal Peptide Synthetase (NPRS), les TerPene Synthase (TPS) et les hybrides PKS-NRPS. Après avoir regroupé les isolats en fonction de leur profil MSP PCR, 110 ont été sélectionnés pour un criblage fonctionnel, montrant une forte proportion de champignons filamenteux antimicrobiens (32%).Après extraction et fractionnement, les composés bioactifs de 3 souches ont été caractérisés aux niveaux structural et fonctionnel. Ainsi, O. griseum UBOCC-A-114129 produit la fuscine, la dihydrofuscine, la secofuscine et la dihydrosecofuscine, P. bialowiezense UBOCC-A-114097 produit l’acide mycophénolique et Penicillium sp. produit UBOCC-A-114109 la rugulosine.Parallèlement, des analyses en LC-HRMS, réalisées sur des extraits fongiques, ont révélé un grand nombre de métabolites non décrits dans les bases de données. Les champignons des sédiments marins constituent donc un réservoir de structures originales à explorerThe spreading of antimicrobial resistant microorganisms jeopardizes global health caresystem. To counteract this threat the renewal of antibiotic molecules is a global priority. Antibioticcompounds are mainly originated from microorganisms, so microorganisms and their secondarymetabolites received an increasing interest. The search for new natural antimicrobial compoundsfrom microorganisms gained untapped ecosystems as marine biosphere.We investigated the antimicrobial properties of a fungal collection. The 183 fungal isolateswere collected from deep subseafloor sediment and isolated between 4 and 1,884 meters belowthe seafloor. Secondary metabolites production potential was studied for all isolates in thecollection by screening genes coding PolyKetide Synthase (PKS), Non-Ribosomal Peptide Synthetase(NRPS), TerPene Synthase (TPS) and hybrid PKS-NRPS. After isolates dereplication according to theirMSP-PCR fingerprinting, an antimicrobial screening was performed for 110 isolates, highlighting ahigh proportion of filamentous fungi with antimicrobial properties (32%).After extraction and bio-guided fractionation bioactive metabolites isolated from 3 strains,were characterized in a structural and functional manner: O. griseum UBOCC-A-114129 producedfuscin, dihydrofuscin, secofuscin and dihydrosecofuscine, P. bialowiezense UBOCC-A-114097synthetized mycophenolic acid and Penicillium sp. UBOCC-A-114109 produced rugulosin.In the meantime, LC-HRMS analysis, performed on fungal extracts, showed a great proportionof metabolites not detected in interrogated databases. So, deep subseafloor fungi, represent anuntapped reservoir of original structures to explore
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Giganti, David. "Etudes structurales et criblages in silico de chimiothèques sur des cibles thérapeutiques de plasmodium falciparum et mycobacterium tuberculosis." Paris 7, 2008. http://www.theses.fr/2008PA077243.
Abstract:
De nouvelles voies de recherche de médicament ont favorisé l'émergence de méthodes I capables d'identifier des composés actifs sur des cibles thérapeutiques. A partir de la structure | de la cible, L'une d'elle s'appuie sur le criblage in silico, de milliers de molécules que forment les chimiothèques. L'estimation du mode d'association et de l'affinité de liaison avec la cible s'avère aujourd'hui un outil efficace pour sélectionner un nombre restreint de molécules pertinentes. Leur validation expérimentale nécessaire évite les tests expérimentaux sur l'ensemble de la chimiothèque. Deux le cadre de deux collaborations à l'Institut Pasteur, nous recherchons ainsi de nouveaux antipaludéens et antituberculeux. Notre premier cas d'étude a nécessité la construction d'un modèle structural de l'enzyme SUB2 de Plasmodium falciparum, par homologie à des protéines bactériennes de la même famille. Plusieurs inhibiteurs de cette enzyme essentielle à l'invasion des érythrocytes ont ensuite été confirmés in vitro et in vivo a différents stade du parasite. En ce qui concerne la recherche d'antituberculeux, l'obtention récente par cristallographie aux rayons X d'une structure de PimA, glycosyltransférase impliquée dans la synthèse de constituants essentiels de la paroi des mycobactéries, a rendu possible inhibiteurs prometteurs de PimA. Nous avons également initié une phase d'optimisation des inhibiteurs de ces deux enzymes, nécessaire pour accéder à la prochaine étape de mise au point de médicaments. En parallèle à ces recherches, nos travaux de sont également portés sur le mécanisme d'association à la membrane plasmique de ces deux protéinesNowadays, the identification of leads from a therapeutic target becomes a classic pipeline for drug discovery. In silico virtual screening approaches, based on this target structure allow the enrichment of a large compounds databank in a significantly reduced subset. This selection involves a docking procedure, for each compound, which predicts their binding mode to the target and their affinity, in order to classify them. Finally, the experimental validation of these relevant compounds is a performing substitute to a costly High-Throughput Screening. On two collaborative projects at Institut Pasteur, we apply a structure-based screening to help antimalarial and antituberculous leads finding. The therapeutic target SUB2 is an essential protease in the erythrocyte invasion. We successfully manage to identify compounds able to inhibit its activity, in vitro. Since no experimental structure of SUB2 is available, the screening required a prior comparative modeling of the P. Falciparum on homologous bacterial proteins. The second project concerna PimA, a fundamental glycosyltransférase for the construction of the mycobacteria cell wall. In contract to SUB2, the virtual screening process take advantage of the recent structure frorn PimA crystal and lead the determination of promising inhibitors. For both projects, we also initiate a optimization campaign based on the understanding of the inhibitory mecanism of the leads in the aim to design their chemical structure. Improvement of their efficiency is indeed necessary at this point of the preclinical step. We also study the non specific and superficial association of these enzymes to the plasmatic membrane
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Maréchal, Xavier. "Développement d'inhibiteurs du protéasome à visée pharmacologique : élaboration rationnelle, criblages de collections de molécules et évaluation biologique sur des modèles cellulaires." Paris 6, 2011. http://www.theses.fr/2011PA066351.
Abstract:
Les protéasomes eucaryotes sont les enzymes multicatalytiques responsables majoritairement de l’homéostasie cellulaire des protéines. Le développement d’inhibiteurs spécifiques du protéasome est devenu un enjeu thérapeutique majeur dans plusieurs pathologies (cancers et myopathies). Le travail de thèse a porté sur l’identification, la conception, l’optimisation et les évaluations enzymatiques et cellulaires d’inhibiteurs non covalents originaux du protéasome. Deux grandes stratégies ont été suivies pour développer des séries d’inhibiteurs : (1) conception rationnelle, d’une part, de dérivés linéaires mono- et bivalents du TMC-95A, un inhibiteur cyclique naturel, d’autre part, de pseudopeptides fluorés ; (2) criblage in silico puis in vitro d’une collection de molécules organiques qui a abouti à la découverte de nouveaux inhibiteurs entièrement non peptidiques comme les 1,2,4-oxadiazoles, optimisés ensuite par synthèse chimique. L’inhibition des trois activités du protéasome a été détectée et quantifiée, puis le mécanisme d’inhibition déterminé par des analyses cinétiques. L’inhibition intracellulaire du protéasome a été démontrée ainsi que la sélectivité d’action sur le protéasome. Cinq analogues linéaires du TMC-95A ont été co-cristallisés avec l’enzyme eucaryote. Plusieurs inhibiteurs ont montré un effet favorable dans un modèle cellulaire de la myopathie des ceintures LGMD-2D alors que d’autres ont eu un effet antiprolifératif et antimigratoire sur les cellules cancéreuses humaines. Cette thèse a donc permis d’identifier des inhibiteurs non covalents originaux du protéasome, efficaces au niveau nanomolaire et présentant un potentiel pour un développement thérapeutique
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Maury, Yves. "Utilisation de cellules souches pluripotentes humaines pour le développement de criblages phénotypiques dans le cadre de la dystrophie myotonique de type 1 et l'amyotrophie spinale infantile." Thesis, Evry-Val d'Essonne, 2013. http://www.theses.fr/2013EVRY0019/document.
Abstract:
Les cellules souches pluripotentes (CSP) humaines sont devenues en quelques années des modèles de choix pour étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires qui gouvernent l'apparition de maladies monogéniques, mais également pour le développement de criblages à haut débits afin d'identifier parmi plusieurs milliers de molécules chimiques celles qui ont un potentiel thérapeutique. C'est dans ce contexte de criblage que mes travaux de thèse s'inscrivent, alliant automatisation et miniaturisation de la biologie des CSP dans le cadre de deux maladies monogéniques, l'amyotrophie spinale infantile (SMA) et la dystrophie myotonique de type I (DM1). De manière générale, la mise en place d'une telle stratégie repose sur trois étapes essentielles qui sont l'obtention de CSP porteuses d'une mutation donnée, l'identification d'un modèle d'étude pertinent et la réalisation du criblage à proprement parlé. L'obtention de CSP humaines repose sur deux approches principales. La première consiste en la dérivation de cellules embryonnaires humaine (hES) issues de diagnostiques préimplantatoires et la seconde repose sur la reprogrammation de cellules somatiques par l'induction de pluripotence (iPS). Une partie de mon travail a consisté en la création de cellules iPS modèles de la SMA et leur caractérisation par une approche à haut débit. Par la suite un travail d'optimisation du protocole de génération de motoneurones à partir de CSP humaines a permis d'accélérer et augmenter les rendements de production de ces cellules qui sont principalement affectées dans la SMA. Enfin, l'utilisation de cellules hES porteuses de la mutation causale de la DM1 a permis le criblage de 12000 molécules et a conduit à l'identification d'une famille chimique capable de restaurer plusieurs défauts typiques de cette maladie tels que des défauts d'épissage et de fusion moléculaireFor only few years, Human pluripotent stem cells (PSC) have become wide spread models in order to study and decipher cellular or molecular mechanims involved in monogenic diseases, but also for the development of large scale screening strategies allowing the identification of new therapeutics among thousands of chemicals. Mythesis research aimed at the development of such strategies, miniaturizing and automating PSC biology within the framework of two monogenic diseases, namely spinal muscular atrophy (SMA) and myotonic dystrophy type 1 (DM1).Basically, PSC based screening programs are generally built around three main steps which are the access to a stem cell model, the identification of a relevant cell type and lastly the screening campaign. There is actually two main ways to generate human PSC. Firstly, human embryonic stem cells (hES) can be derived from the inner cell mass of blastocyte through a pre-implantation diagnosis and secondly, induced pluripotent stem cells (iPS) can be generated after somatic cell reprogramming in vitro. A part of my work has consisted in the generation of hiPS cellular models for SMA by reprogramming fibroplasts that carried SMN1 gene deletion, followed bay the characterization of several dozen of independant clones with high throughput. Then an optimization process of the protocol for the generation of Motoneuron from PSC has been done multiplying experimental conditions. This finally allowed the description of a fast and efficient protocol to generate the most affected cell type in SMA. Finally, DM1 mutated hES were uded for the screening of 12.000 compounds among which a chemical family has been identified to rescue DM1 typical splicing and myogenesis defects
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Muller, Pascal. "Criblage virtuel inverse : validation et applications." Strasbourg 1, 2006. http://www.theses.fr/2006STR13137.
Abstract:
La conception de molécules bioactives emploie de plus en plus de méthodes informatiques. Le criblage virtuel par docking à haut débit d’une série de molécules est une étape-clé pour la découverte de candidats-médicament. Il est courant d’utiliser des outils de criblage virtuel pour déterminer les molécules susceptibles de présenter une affinité pour une cible donnée. Il est beaucoup moins usuel d’effectuer l’opération inverse, ou criblage virtuel inverse (CVI), c’est-à-dire rechercher in silico des cibles pour une molécule donnée. Cette méthode a rarement été utilisée pour aider à identifier des cibles et/ou à prévoir des effets indésirables. La ciblothèque sc-PDB, une banque de structures tridimensionnelles de sites de liaison, extraites de la Protein Data Bank, a été créée dans notre laboratoire, aux fins de criblage virtuel inverse. J’ai contribué à la validation de la méthode de CVI, qui retrouve bien les cibles connues de ligands. Dans le cadre de la mise à jour de la sc-PDB, j’ai développé un algorithme de détermination des complexes protéine-ligand, permettant d’affiner la ciblothèque. J’ai également utilisé le CVI pour déterminer des cibles pour des molécules présentant un châssis moléculaire original. Les chimistes inventeurs de cette chimiothèque désiraient savoir si l’espace chimique qu’elle couvre peut avoir des applications pharmaceutiques, de manière à prouver sa haute valeur ajoutée. Cinq cibles ont été sélectionnées in silico, et deux cibles ont pu être validées in vitro. La sc-PDB et le CVI sont de puissants outils pour contribuer à la découverte de nouvelles cibles, en complément aux stratégies expérimentales d’identification de ciblesThe conception of bioactive molecules uses more and more in silico methods. Discovering which ligands, out of a large library, are likely to bind to a protein of interest is slowly turning into routine computational chemistry. Surprisingly, the opposite question is still an issue. Given a known ligand, is it possible to recover its most likely target(s)? Answering this question using the above mentioned docking approach implies the development of a collection of protein active sites. As a database of choice to develop the inverse virtual screening (IVS) procedure, we have chosen the Protein Data Bank. We extracted from the PDB a target library, the sc-PDB. It is a collection of three-dimensional structures of active sites. I contributed to validate the IVS procedure: it is able to find known targets of ligands. In the process of sc-PDB update, I developed an algorithm able to accurately identify protein-ligand complex. I used IVS procedure to discover targets for new molecules: chemists wanted to know if the chemical space of their combinatorial library matches pharmaceutical targets. Five targets were selected in silico, and two targets were validated in vitro. The sc-PDB library and IVS procedure are powerful tools, and the simplicity of the approach makes it particularly attractive for prioritizing a few targets for experimental validation, and is therefore a good complement to experimental target identification strategies
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Paul, Nicodème. "Développement de nouvelles applications en criblage virtuel." Strasbourg 1, 2003. http://www.theses.fr/2003STR13193.
Abstract:
Basé sur le docking moléculaire, le criblage virtuel devient de plus en plus utilisé dans la recherche pharmaceutique. En vue d'améliorer les résultats de docking, nous avons développé Consdock, outil d'analyse des interactions Ligand - Récepteur. Appliqué à trois outils de docking, Gold, FlexX et Gold pour un ensemble de 100 complexes, ConsDock a pu générer des résultats meilleurs que ceux obtenus par chacun des outils utilisés, avec une précision avoisinant 1 Å. Par ailleurs, nous nous sommes intéressés à une application moins connue du criblage virtuel, le criblage inverse. Celui-ci consiste à chercher des cibles pour une petite molécule donnée. Pour cela, nous avons construit sc-PDB (screening PDB) une base de données de cibles à partir de la Protein Data Bank. Pour utiliser la base, nous avons développé une stratégie de criblage inverse basée sur Gold. Dans les tests que nous avons réalisés, les cibles recherchées de molécules connues ont pu toujours être trouvées parmi les meilleures solutions générées. Enfin, nous avons entrepris la simulation du repliement des Récepteurs couplés aux protéines G ou RCPG en présence de ligand par algorithmes génétiques. Nous avons choisi et construit des méthodes de sélection susceptibles de donner de bons résultats, lorsqu'elles sont employées en concordance avec des opérateurs génétiques adéquats sur un nombre suffisant de générationsBased on molecular docking, virtual screening or in silico screening becomes of increasing interest in the pharmaceutical industry. In this study, we propose ConsDock a consensus docking program that takes advantage of three widely used docking tools Dock, Gold and FlexX. ConsDock significantly outperforms single docking with respect to the docking accuracy of the top-ranked pose. Then, for inverse screening purpose, we develop a protein database based on the Protein data Bank (sc-PDB). This database has been used to recover target of known ligands by using an in-house inverse screening process based on Gold. At last, as we were interested in developing activated models of G Protein-Coupled Receptors or GPCRs, we present a simulation process of ligand-based GPCR folding. The simulation is performed by genetic algorithms. By using a GPCR and a ligand, the algorithm tries to find stable conformations of GPCR by rotating and translating helices. Movement is performed according experimental observations. We tested the method on the X-ray structure of rhodopsin complexed with the cis-retinal. We got some good results when used specific genetic operators for a sufficient number of generations
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Varenne, Fanny. "Développements analytiques pour le criblage d'interactions lanthanides/ligands." Phd thesis, Université de Strasbourg, 2012. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00763230.
Abstract:
Ce travail étudie le potentiel de l'électrophorèse capillaire couplée à la spectrométrie de masse à ionisation par plasma (ICP/MS) pour le criblage d'une bibliothèque de ligands en fonction de leur affinité pour l'europium en milieu hydro-organique. Cette méthode permet, d'une part, d'évaluer l'affinité des ligands phosphorés en moins de deux heures et en utilisant moins de 15 ng de ligand, et d'autre part, de déterminer les constantes de complexation. Les résultats sont en accord avec ceux obtenus par titrage spectrophotométrique.Parallèlement, une bibliothèque de copolymères pour l'extraction solide/liquide de l'europium a été étudiée. Le protocole d'extraction mis au point permet de les classer selon leur affinité pour celui-ci en milieu hydro-organique et en utilisant 60 mg de copolymère. Pour les plus prometteurs, les propriétés de reconnaissance et la sélectivité La3+/Eu3+/Lu3+ ont été évaluées.
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Bélanger, Audrey. "Criblage pharmacologique de nouvelles molécules à caractère antipsoriasique." Master's thesis, Université Laval, 2017. http://hdl.handle.net/20.500.11794/27696.
Abstract:
Le psoriasis est une dermatose érythémato-squameuse d’évolution chronique. Les patients atteints par la pathologie ont à leur disposition de nombreux traitements qui permettent de contrôler la maladie sans toutefois la guérir. Néanmoins, plusieurs de ces traitements présentent des propriétés toxicologiques et des effets indésirables à court ou long terme. Il devient donc impératif de découvrir de nouvelles molécules thérapeutiques afin d’améliorer considérablement la qualité de vie des patients psoriasiques. Or, l’ingénierie tissulaire permet d’approfondir les connaissances en dermatologie et d’investiguer sur de nouveaux agents thérapeutiques topiques, que ce soit dans le domaine cosméceutique ou pharmaceutique. La culture cellulaire tridimensionnelle (3D) est un modèle pertinent afin d’étudier l’architecture d’un tissu sain ou pathologique. La méthode d’auto-assemblage développée au Laboratoire d’Organogénèse Expérimentale (LOEX) permet l’obtention, entre autre, de substituts cutanés bilamellaires autologues sains ou psoriasiques. L’objectif général de ce projet a été de démontrer, via criblage pharmacologique, le potentiel antipsoriasique d’une gamme de molécules dérivées de la biomasse végétale de la forêt boréale en vue d’une possible utilisation dans le traitement du psoriasis. Des tests de toxicité effectués avec 39 molécules à différentes concentrations ont permis d’identifier 9 molécules inhibitrices de la croissance kératinocytaire et ce, à de faibles concentrations. Parmi ces 9 molécules, toutes testées sur des substituts cutanés 3D sains et psoriasiques, 4 ont démontré des propriétés thérapeutiques prometteuses au niveau de la normalisation de la prolifération et de la différenciation kératinocytaire; il y a une diminution significative de l’épaisseur de l’épiderme vivant des substituts psoriasiques traités avec ces 4 molécules comparativement au contrôle. De plus, ces quatre molécules régulent positivement l’expression de plusieurs protéines impliquées dans la différenciation cellulaire (involucrine, filaggrine, loricrine) ou la prolifération cellulaire (Ki-67). Ainsi, ces molécules novatrices de structure polyphénolique pourraient éventuellement être utilisées en tant que traitement efficace du psoriasis.Psoriasis is a chronic skin disease characterized by erythematous plaques with loosely adherent silvery-white scales. Psoriatic patients have at their disposal several treatments that control the disease however, no cure has been found yet., Current treatments for psoriasis are associated with toxicological problems and short- and long-term adverse effects. Hence, it is imperative to discover new therapeutic molecules in order to significantly improve the quality of life of psoriatic patients. Tissue engineering of skin is used to deepen our knowledge in dermatology and to investigate on new topical therapeutics for the cosmeceutical or pharmaceutical fields. Three-dimensional (3D) cell culture recapitulates normal and pathological tissue architectures that provide physiologically relevant models to study normal development or diseases of the tissue. The self-assembly method developed at LOEX allows to produce healthy or psoriatic bilamellar skin substitutes. The aim of this project was to demonstrate, using pharmacological screening, the antipsoriatic potential of a range of compounds derived from the plant biomass of the boreal forest. Toxicity assays were used to screen 39 molecules at different concentrations, and a choice of 9 molecules inhibiting the keratinocyte growth at low concentrations was made to pursue this project. Among these 9 molecules, all tested on healthy and psoriatic 3D skin substitutes, 4 of them have shown promising therapeutic properties for the normalization of keratinocyte proliferation and differentiation; these 4 molecules upregulate the expression of several proteins involved in cellular differentiation (involucrin, filaggrin, loricrin) or cellular proliferation (Ki-67). Histological analyses of psoriatic skin substitutes treated with these 4 molecules showed a significant decrease of the epidermis thickness. Thereby, these innovative molecules with a polyphenolic structure could possibly be used as an effective treatment of psoriasis.
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Mahtal, Nassim. "Criblage de molécules stimulant l'immunité innée et acquise." Thesis, Université Paris-Saclay (ComUE), 2017. http://www.theses.fr/2017SACLS253.
Abstract:
Des produits efficaces pour stimuler le système immunitaire auraient de très nombreuses applications dans le domaine de la santé publique : lutte contre la résistance aux antibiotiques, épidémies, protection des personnels de secours et des populations en cas de crise sanitaire ou d’attentat biologique. Aujourd’hui, les rares produits immunostimulants efficaces sont coûteux, dangereux, et donc réservés au traitement de pathologies graves ciblées comme les cancers, aplasies ou infections virales chroniques. La petite protéine G Rac1 fut identifiée comme une potentielle cible thérapeutique. Activée par de nombreux pathogènes, elle contrôle l’inflammation et la mise en place des défenses de l’hôte. CNF1 est une toxine bactérienne activant fortement Rac1, ce qui conduit à sa dégradation protéasomale. Le maintien d’un pool de Rac1 activé permettrait d’augmenter les défenses immunitaires. En utilisant CNF1 comme un outil permettant de diminuer celui-ci, un test cellulaire fut mis au point pour cribler 17 680 composés. A l’aide de différents paramètres de tri, un ensemble de molécules fut identifié comme capable de prévenir la dégradation de Rac1 médiée par CNF1.De manière inattendue, la plupart des composés semblent posséder un effet anti-inflammatoire, en baissant la sécrétion de cytokines de cellules stimulées. Le potentiel thérapeutique et en recherche de tels composés doit être évalué. En parallèle, deux autres composés montrent une protection anti-toxines large spectre (CNF1, toxine diphtérique, toxine de Shiga, toxine B de C. difficile). De même, leur mécanisme d’action, encore inconnu, pourrait permettre le traitement d’infections variéesImmune system boosters could have many applications in public health: fighting antibiotics resistance, epidemics, protection of health care staff and populations during health crisis or biological warfare. Currently, the rare efficient immune stimulants are costly and dangerous; hence, they are earmarked to severe and targeted pathologies such as cancers, aplasia, or chronic viral infections. The small G protein Rac1 was identified as a potential therapeutic target. Once activated by various pathogens, it controls inflammation and host defenses establishment. CNF1 is a bacterial toxin that strongly activating Rac1, leading to its proteasomal degradation. Maintaining an activated Rac1 pool could enhance immune defenses. By using CNF1 as a tool to reduce it, a cellular bioassay was developed and optimized to screen 17 680 compounds. Through various filters, a group of molecules was identified to prevent CNF1-mediated Rac1 depletion. Unexpectedly, most of them seems to possess anti-inflammatory properties, down-regulating cytokines production from stimulated cells. The therapeutic potential of such compounds must be now evaluated. In parallel, two other molecules show a broad-spectrum anti-toxins protection (CNF1, diphtheria toxin, Shiga toxin, toxin B from C. difficile). Their unknown mode of action may allow the treatment of various infections
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Guillemain, Hélène. "Evaluation et application de méthodes de criblage in silico." Phd thesis, Conservatoire national des arts et metiers - CNAM, 2012. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00814270.
Abstract:
Lors de la conception de médicaments, le criblage in silico est de plus en plus utilisé et lesméthodes disponibles nécessitent d'être évaluées. L'évaluation de 8 méthodes a mis enévidence l'efficacité des méthodes de criblage in silico et des problèmes de construction de labanque d'évaluation de référence (DUD), la conformation choisie pour les sites de liaisonn'étant pas toujours adaptée à tous les actifs. La puissance informatique actuelle le permettant,plusieurs structures expérimentales ont été choisies pour tenter de mimer la flexibilité dessites de liaison. Un autre problème a été mis en évidence : les métriques d'évaluation desméthodes souffrent de biais. De nouvelles métriques ont donc été proposées, telles queBEDROC et RIE. Une autre alternative est proposée ici, mesurant la capacité prédictive d'uneméthode en actifs. Enfin, une petite molécule active sur le TNFα in vitro et in vivo sur souris aété identifiée par un protocole de criblage in silico. Ainsi, malgré le besoin d'amélioration desméthodes, le criblage in silico peut être d'un important soutien à l'identification de nouvellesmolécules a visée thérapeutique.
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Harfouche, Lina. "Criblage de l'état solide chiral et diagrammes de phases." Thesis, Normandie, 2020. http://www.theses.fr/2020NORMR007.
Abstract:
De nombreux principes actifs pharmaceutiques sont des composés chiraux. Les deux énantiomères des molécules correspondantes présentent des propriétés chimiques et physiques identiques mais l’activité biologique est souvent associée à un seul des deux. Les réglementations strictes ont obligé l'industrie pharmaceutique à développer de nouvelles méthodes pour produire des énantiomères purs. Parmi les méthodes de séparation, la cristallisation préférentielle (CP) est une technique ayant une productivité relativement élevée et un faible coût. Elle consiste en une cristallisation alternative hors équilibre des deux énantiomères. Il est communément admis que la CP peut uniquement être appliquée lorsque les deux énantiomères cristallisent sous forme d’'un conglomérat, i.e. un mélange physique de particules homochirales. Pourtant, seulement 5-10% des espèces racémiques cristallisent sous forme de conglomérat ce qui limite fortement l'applicabilité de la CP. Le travail de cette thèse vise à étudier comment réaliser la CP dans les 90-95% restants, pour les énantiomères cristallisants sous forme de composés racémiques, i.e. un composé défini stoechiométrique (1 :1). À la suite de l’identification de critères spécifiques (physico-chimique et moléculaires) la « Proxyphylline » (PXL) a été sélectionnée comme molécule chirale modèle pour cette étude. Après une construction du diagramme de phase entre énantiomères de la PXL, laissant apparaître un riche paysage polymorphique, la PXL a été résolue par selon approches : (a) via la présence d’un conglomérat métastable et en inhibant la nucléation et la croissance du composé racémique (qui présente une large zone de métastabilité dans un solvant donné). Les résultats obtenus étendent l’efficacité de la CP aux systèmes présentant des composés racémiques et qui ont des caractéristiques thermodynamiques (température de fusion) et cinétiques (large zone de métastabilité) particulières. (b) via un conglomérat monohydraté préparé par cocristallisation avec l’acide salicylique. La résolution par CP a été effectuée dans un mélange eau/éthanol avec une certaine efficacité. Cette étude est une des premières à rapporter la mise en place de la CP appliqué à des cocristaux chirauxMany active pharmaceutical ingredients are chiral compounds. The two enantiomers of the corresponding molecules exhibit identical chemical and physical properties, but the desired biological activity is often provided by only one enantiomer. The strict regulations forced the pharmaceutical industry to develop new ways to produce pure enantiomers. Among separation methods, Preferential Crystallization (PC), is a technique with relatively high productivity and low cost. It consists of the out-of-equilibrium alternative crystallization of both enantiomers. It is thought that the application of PC is only possible when the enantiomers crystallize as a conglomerate, i.e. a physical mixture of homochiral particles. Yet, only ca 5-10% of the racemic species crystallize as a conglomerate, which strongly limits the applicability of PC. The work investigates how to perform PC in the remaining 90-95% of cases, for enantiomers crystallizing as racemic compounds, i.e. a 1:1 stoichiometric compound made with both enantiomers. Following an adequate screening procedure based on physico chemical and molecular considerations, one racemic chiral molecule was selected as model compound, namely “proxyphylline” (PXL). After the construction of the binary phase diagram between the enantiomer of PXL reveals a rich polymorphism (double polymorphism for enantiomer and racemic), PXL has been resolved by two approaches: (a) via an unforeseen metastable conglomerate, by inhibiting the spontaneous crystallization and growth of the undesired forms and by achieving a wide metastable zone width due to the selection of a suitable solvent. The obtained results extend the applicability of PC to the racemic forming system with specific thermodynamic (melting temperature) and kinetic (wide metastability) characteristics. (b) via a stable monohydrated conglomerate prepared by cocrystallization with salicylic acid. It was resolved by PC from a water/ethanol mixture with high productivity. This may be the first report of PC applied to such a cocrystal system
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Lerouxel, Olivier. "Criblage de mutants d’Arabidopsis et caractérisation du mutant dgl1." Rouen, 2004. http://www.theses.fr/2004ROUES033.
Abstract:
La paroi forme une matrice composée essentiellement de polysaccharides qui s’avère déterminante pour la morphologie et la croissance des végétaux. A ce jour, malgré ce rôle de la paroi dans le développement des végétaux, presque aucune activité enzymatique (glycosyltransférase ; GT) impliquée dans sa biosynthèse n’a été caractérisée. Afin de détecter des mutants d’Arabidopsis déficients pour ces activités GT, des stratégies de crible biochimique basées sur l’analyse de la paroi ont été développées. Nous avons démontré que l’analyse par chromatographie en phase gazeuse du contenu en monosaccharide de paroi de plantules étiolées d’Arabidopsis fournit des informations reproductibles, imformatives et quantifiables permettant la sélection de mutant arborant des altérations de leur paroi. Par ailleurs, une stratégie innovante d’analyse d’un polymère pariétal, le xyloglucane (XG), par empreinte enzymatique a été développée et validée à l’aide de mutants présentant des variations quantitatives/qualitatives de ce polymère. Cette stratégie permet après une préparation rapide du matériel pariétal, d’hydrolyser le XG par une endoglucanase et d’analyser les fragments oligosaccharidiques par chromatographie, électrophorèse ou spectrométrie de masse. Ces stratégies, appliquées à de nouveaux mutants d’Arabidopsis, ont permis la sélection du mutant dgl1-1 sur la base d’une accumulation de glucose pariétal. L’analyse génétique a révélé l’altération d’une sous-unité protéique du complexe oligosaccharyltransférase (OST) orthologue de la protéine humaine OST48, ou de levure WBP1, qui assure dans chacun de ces systèmes le transfert d’un N-glycanne précurseur sur un résidu asparagine durant la synthèse des protéines dans le RE. La détection d’une protéine du RE, la protéine disulfide isomérase (PDI), chez le mutant dgl1-1 a permis de démontrer l’altération de la N-glycosylation chez ce mutant. Un second allèle dgl1-2 a été caractérisé embryon létal. L’étude phénotypique par microscopie a montré de sévères altérations des parois cellulaires dans le cylindre central des plantules dgl1. Une caractérisation fine de la composition de la paroi chez le mutant a donc été entreprise, démontrant une accumulation de callose dans les tissus vasculaires en cours de différenciationThe plant cell wall is a highly organized matrix, mainly composed of polysaccharides, that is determinant for plant morphology and development. Strikingly little is known about the enzymes that control cell wall biosynthesis and deposition. The characterization of Arabidopsis cell wall mutants is one of the more promising approaches to investigate the synthesis, transport and assembly of cell wall polysaccharides. However, the identification of new cell wall mutants from public collections is a major bottleneck. In this context, the aim of the PhD thesis was first to design new biochemical screening methodologies to detect Arabidopsis cell mutants and second to apply these methodologies to the selection of new mutants. We demonstrated that the quantification by gas chromatography of the monosaccharide contents of Arabidopsis seedling cell wall give reproducible and informative information allowing the selection of plants exhibiting cell wall alteration. Moreover, an innovative enzymatic fingerprinting strategy was developed and validated on previously characterized xyloglucan mutants. In this screening methodology, cell wall material has been treated by an endoglucanase and the generated fragments have been identified by chromatography, electrophoresis or MALDI-TOF mass spectrometry. These strategies have been used for the screening of new cell wall mutants. A mutant called defective glycosylation1-1 (dgl1-1) was identified in Arabidopsis based on a growth defect of the dark-grown hypocotyl and an abnormal composition of the non-cellulosic cell wall polysaccharides. Dgl1-1 is altered in a protein ortholog of human OST48 or yeast WBP1, an essential protein subunit of the oligosaccharyltransferase complex that is responsible for the transfer in the ER of the N-linked glycan precursor onto Asn residues of candidate proteins. Consistent with the known function of the OST complex in eukaryotes, the dgl1-1 mutation led to a reduced N-linked glycosylation of the ER-resident protein disulfide isomerase (PDI). A second more severe allele (dgl1-2) was embryo-lethal. Microscopic analysis of dgl1-1 revealed severe developmental defects including a strongly reduced cell elongation and, collapse and differentiation defects of cells in the central cylinder. These defects were accompanied by changes in the non-cellulosic polysaccharide composition, including the accumulation of ectopic callose. Interestingly, in contrast to other dwarf mutants that are altered in the early steps of the N-glycan processing, dgl1-1 did not exhibit a cellulose deficiency. Together these results confirm the role of DGL1 in N-linked glycosylation, cell growth and differentiation in plants
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Barre, Françcois-Xavier. "Analyse et criblage d'oligonucléotides antigènes dirigés contre le VIH." Châtenay-Malabry, Ecole centrale de Paris, 1998. http://www.theses.fr/1998ECAP0601.
Abstract:
Des oligonucléotides appropriés peuvent reconnaître certaines séquences d'ADN double brin et former une triple élice d'acide nucléique. Ces oligonucléides formant des triples hélices (OTHS) ont de nombreuses applications en biologie, et pourraient notamment servir d'agents antigènes en ciblant, par exemple, l'action de ligands mutagènes sur des séquences d'ADN génomique. Ils auraient alors des applications en thérapie anti-virale ou anti-cancéreuse. Il est donc important de démontrer que des OTHs peuvent moduler spécifiquement l'action biologique d'un gène. Nous avons mis en place un système cellulaire pour l'analyse et le criblage d'OTHs antigènes dirigés contre une séquence conservée du génome du virus de l'immuno-déficience humaine (VIH), le polypurine tract (PPT). Le système est basé sur la levure comme modèle cellulaire eucaryote et le psoralène comme ligand mutagène couplé aux OTHs. Le psoralène est un intercalant bifonctionnel capalbe de générer plusieurs types de lésion. En utilisant des vecteurs rapporteurs, lésé in vitro grâce à un OTH couplé au psoralène puis transfectés dans les levures, nous avons montré que l'effet génotoxique et mutagène de ces OTHs dépend principalement du type de lésions introduit : un OTH de type phosphodiester permet de cibler l'action mutagène du psoralène, mais ne semble pas interférer avec les processus de mutagenèse de la cellule. En conséquence, ce système nous a permis d'apporter quelque éléments sur la mutagenèse des adduits du psoralène. Nous avons ensuite commencé l'étude de l'effet d'OTHs couplés au psoralène sur une cible endogène. Avec un OTH de type phospodiester, nous n'avons pas observé d'augmentation significative de la mutagenèse sur une telle cible. Ce résultat est sans doute à mettre en relation avec l'affinité relativement faible de ce type d'OTHs et leur sensibilité aux nucléases. Il est maintenant généralement admis que les stratégies basées sur des OTHs nécessitent, dans de nombreux cas, de modifier chimiquement ces derniers de façon à augmenter leur affinité et leur résistance aux nucléases. Dans ce cadre, nous avons entrepris la comparaison de l'effet d'un OTH de type phosphodiester à celui d'un OTH de phophoramidate. Les résultats obtenus avec ce dernier sont beaucoup plus prometteurs.
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Bui, The Quang. "Criblage virtuel sur grille de composés isolés au Vietnam." Thesis, Clermont-Ferrand 2, 2015. http://www.theses.fr/2015CLF22583/document.
Abstract:
L’Institut National des Produits Chimiques de l’Académie des Sciences du Vietnam (INPC) développe depuis plusieurs années une activité autour de la recherche de nouveaux médicaments issus de la biodiversité. Le développement d’un nouveau médicament prend de l’ordre d’une dizaine d’années et passe par plusieurs phases. Dans la phase de découverte, l’activité des composés chimiques sur une cible biologique est mesurée afin de mettre en évidence une action inhibitrice. Le développement d’approches in silico pour le criblage virtuel des composés chimiques est une alternative aux approches classiques in vitro beaucoup plus coûteuses à mettre en œuvre. L’utilisation de la grille a été identifiée comme une voie économiquement prometteuse pour accompagner la recherche de nouveaux médicaments au Vietnam. En effet, le développement de nouvelles stratégies basées sur l’utilisation de plates-formes de soumission de tâches (DIRAC, HTCaaS) a permis d’améliorer considérablement le taux de succès et le confort des utilisateurs, ouvrant la voie à une démocratisation de la grille.Dans ce contexte, l’objectif poursuivi dans le cadre de cette thèse est d’étudier dans quelle mesure des plates-formes multidisciplinaires pouvaient répondre aux besoins des chimistes de l’INPC. Le travail s’est concentré sur les modalités d’un partage équitable d’une plate-forme de soumission de tâches sur la grille par une ou plusieurs communautés d’utilisateurs. L’ordonnancement des tâches sur un serveur commun doit permettre que les différents groupes aient une expérience positive et comparable. Sur les infrastructures de grille EGEE et EGI en Europe , on peut distinguer deux grandes catégories d’utilisateurs : les utilisateurs « normaux » qui vont solliciter les ressources pour des tâches requérant typiquement de quelques dizaines à quelques centaines d’heures de calcul, et les « gros » utilisateurs qui vont lancer des grandes productions nécessitant le traitement de plusieurs milliers de tâches pendant des dizaines, voire des centaines de milliers d’heures de calcul. Les stratégies d’ordonnancement déployées aujourd’hui sur les plates-formes comme DIRAC ou HTCaaS ne permettent pas de servir de façon optimale et simultanée ces deux familles d’utilisateurs.Le manuscrit présente une évaluation par simulation des performances de plusieurs stratégies d’ordonnancement des tâches d’une plate-forme soumettant des jobs pilotes. L’outil SimGrid a permis de simuler l’infrastructure de grille régionale déployée en Auvergne à partir de traces archivées de son utilisation. Après évaluation des performances de plusieurs politiques d’ordonnancement tirées de la littérature, une nouvelle politique a été proposée dans laquelle les utilisateurs normaux et les très gros utilisateurs sont gérés de façon indépendante. Grâce à cette politique, le ralentissement expérimenté par les très gros utilisateurs est réduit significativement sans pénaliser excessivement les utilisateurs normaux. L’étude a été étendue à une fédération de clouds utilisant les mêmes ressources et arrive aux mêmes conclusions. Les performances des politiques d’ordonnancement ont ensuite été évaluées sur des environnements de production, à savoir l’infrastructure de grille européenne EGI et l’infrastructure nationale de supercalculateurs de la Corée du Sud. Un serveur DIRAC a été adossé aux ressources de l’organisation virtuelle biomédicale d’EGI pour étudier les ralentissements observés par les utilisateurs de ce serveur. Pareillement, les ralentissements expérimentés par les utilisateurs de la plate-forme HTCaaS au KISTI ont été observés en excellent accord avec les résultats de simulation avec SimGrid.Ces travaux confirment la faisabilité et l’intérêt d’une plate-forme unique au Vietnam au service des communautés scientifiques consommatrices des ressources académiques de grille et de cloud, notamment pour la recherche de nouveaux médicamentsVirtual Screening (VS) is a computational technique used in the drug discovery process to select the most promising candidate drugs for in vitro testing from millions of chemical compounds. This method can offer an efficient alternative to reduce the cost of drug discovery and platform. The Natural Products Chemistry Institute of the Academy of Sciences of Vietnam (INPC) collects samples from local biodiversity and determines the 3D structure of single molecules. Their challenge is to set up a virtual screening platform on grid computing for their chemists to process their data. However, as the number of users who might have a wide range of virtual screening applications (in terms of the number of tasks and execution time) increases with limited available computing resources, it becomes crucial to devise an effective scheduling policy that can ensure a certain degree of fairness, user satisfaction and overall system throughput. In this context, the thesis focuses on an effective scheduling policy for the virtual screening workflow where multiple users with varying numbers of tasks are actively sharing a common system infrastructure. We have researched in theory and proposed some candidate policies. With the simulation results and the experimentation results in real system, we proposed the best policy for the fairness between users, which can be applied to INPC virtual screening platform
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Playe, Benoit. "Méthodes d'apprentissage statistique pour le criblage virtuel de médicament." Thesis, Paris Sciences et Lettres (ComUE), 2019. http://www.theses.fr/2019PSLEM010/document.
Abstract:
Le processus de découverte de médicaments a un succès limité malgré tous les progrès réalisés. En effet, on estime actuellement que le développement d'un médicament nécessite environ 1,8 milliard de dollars américains sur environ 13 ans. Nous nous concentrons dans cette thèse sur des approches statistiques qui criblent virtuellement un grand ensemble de composés chimique contre un grand nombre de protéines. Leurs applications sont polyvalentes : elles permettent d’identifier des candidats médicaments pour des cibles thérapeutiques connues, d’anticiper des effets secondaires potentiels, ou de proposer de nouvelles indications thérapeutiques pour des médicaments connus. Cette thèse est conçue selon deux cadres d'approches de criblage virtuel : les approches dans lesquelles les données sont décrites numériquement sur la base des connaissances des experts, et les approches basées sur l'apprentissage automatique de la représentation numérique à partir du graphe moléculaire et de la séquence protéique. Nous discutons ces approches et les appliquons pour guider la découverte de médicamentsThe rational drug discovery process has limited success despite all the advances in understanding diseases, and technological breakthroughs. Indeed, the process of drug development is currently estimated to require about 1.8 billion US dollars over about 13 years on average. Computational approaches are promising ways to facilitate the tedious task of drug discovery. We focus in this thesis on statistical approaches which virtually screen a large set of compounds against a large set of proteins, which can help to identify drug candidates for known therapeutic targets, anticipate potential side effects or to suggest new therapeutic indications of known drugs. This thesis is conceived following two lines of approaches to perform drug virtual screening : data-blinded feature-based approaches (in which molecules and proteins are numerically described based on experts' knowledge), and data-driven feature-based approaches (in which compounds and proteins numerical descriptors are learned automatically from the chemical graph and the protein sequence). We discuss these approaches, and also propose applications of virtual screening to guide the drug discovery process
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Aymard, Chloé. "Nouvelles méthodes électrochimiques pour le criblage d’inhibiteurs de transcétolases." Thesis, Lyon, 2018. http://www.theses.fr/2018LYSE1212/document.
Abstract:
Cette thèse a pour objectif de développer une méthode électrochimique permettant de cribler à haut débit des inhibiteurs d'enzymes. Pour cela, une enzyme cible a été sélectionnée pour son intérêt thérapeutique, la transcétolase (TK) : elle est impliquée dans de nombreuses pathologies (cancer, maladies neurodégénératives, diabète…) et dans la survie de certains parasites pathogènes. Afin de mesurer l'activité de la TK, deux systèmes rapporteurs ont été développés, à l'aide de plaques de criblage électrochimique (PCE) constituées de 96 électrodes indépendantes. Le premier système rapporteur repose sur un système bienzymatique nécessitant l'intervention d'une enzyme auxiliaire, la galactose oxydase (GAOx) sous forme libre ou immobilisée dans la laponite. Cette enzyme est capable d'oxyder les produits de réaction de la TK et de produire du peroxyde d'hydrogène. Le format 96 des PCE a permis d'optimiser rapidement la détection électrochimique par ampérométrie pulsée par intermittence (IPA) d'activité oxydase et seulement 10 minutes sont nécessaires pour réaliser 96 mesures simultanées. Parallèlement, afin d'exploiter au maximum le système à 96 électrodes, cette détection d'activité oxydase a également été réalisée, en 10 minutes par électrochimiluminescence. Cette méthode offre l'avantage d'être plus sensible et moins variable que par IPA, mais limite l'utilisation de matrice d'immobilisation d'enzymes. La GAOx a ensuite été utilisée pour mesurer l'activité TK, cependant, les conditions réactionnelles n'étant pas optimales en présence du système bienzymatique (TK-GAOx), des temps d'incubation longs sont nécessaires et sont peu adaptées au criblage d'inhibiteurs de la TK. Un second système rapporteur ne nécessitant plus d'enzyme auxiliaire et faisant intervenir uniquement un seul substrat de la TK a été optimisé. Ce système repose sur l'oxydation de l'intermédiaire réactionnel formé par la fixation du cofacteur (la thiamine pyrophosphate) et du substrat sur l'enzyme par le ferricyanure. Cette méthode permet de mesurer 96 activités TK en seulement 7 minutes et a aisément été utilisée pour cribler une bibliothèque de molécules. Le criblage de 1360 molécules a permis d'identifier un nouvel inhibiteur de cet enzyme, présentant une CI50 de 63 μM. Le système électrochimique a également été utilisé pour déterminer le mécanisme d'inhibition (non compétitive pure partielle) et la constante d'inhibition associée (3,4 μM). Ces résultats sont inédits dans le domaine de l'électrochimie et offrent un large éventail d'applications que ce soit pour le criblage d'activité enzymatiques ou d'inhibiteurs d'enzymesThis thesis focuses on the development of a new electrochemical method allowing the high throughputscreening of enzyme inhibitors. For this purpose, a target enzyme has been selected for its therapeutic interest,transketolase (TK): this enzyme is involved in many diseases (cancer, neurodegenerative diseases, diabetes ...) and inthe survival of pathogenic parasites. To measure TK activity, two reporter systems have been developed by usingelectrochemical plates, composed of 96 independent electrodes.The first one is based on a bienzymatic system, requiring the use of an auxiliary enzyme, galactose oxidase(GAOx), in its soluble form or immobilized in laponite. This enzyme is able to oxidize TK products and producehydrogen peroxide. The 96-well format allowed to quickly optimize the electrochemical detection of oxidase activityby intermittent pulse amperometry (IPA) of oxidase activity and only 10 minutes are required to perform 96simultaneous measurements. In parallel, in order to harness the 96-well electrochemical system, this detection ofoxidase activity was also carried out in 10 minutes using electrochemiluminescence. This method is more sensitiveand less variable than IPA but is limited to the use of soluble enzymes. However, the reaction conditions are notoptimal for the bienzymatic system (TK-GAOx): long incubation times are required and are poorly adapted for thescreening of TK inhibitors.A second reporter system no longer requiring an auxiliary enzyme and involving only one TK substrate hasbeen optimized. This system relies on the oxidation by ferricyanide of the reactional intermediate resulted of thebinding of the cofactor (thiamine pyrophosphate) and the substrate. This method allows to measure 96 TK activitiesin only 7 minutes and was easily used to screen an in-house chemical library. The screening of 1360 molecules leadto the identification of a new TK inhibitor with an IC50 of 63 μM. This electrochemical system was also used todetermine the mechanism of inhibition (partial non-competitive mechanism) and the associated inhibition constant(3.4 μM). These results are innovative in the field of electrochemistry and offer a wide range of applications forenzymatic activity screening or the screening of enzymes inhibitors
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Meslamani, Jamel Eddine. "Développement de nouvelles méthodes de criblage in silico en chémogénomique." Phd thesis, Université de Strasbourg, 2012. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00763448.
Abstract:
La chémoinformatique et la bioinformatique sont des disciplines devenues indispensables à la découverte de médicaments. De nos jours, les industries pharmaceutiques consacrent près de 10% de leur budget de recherche et développement, à la recherche de médicaments assisté par ordinateur (Kapetanovic 2008). Cette émergence peut s'expliquer à la fois par le développement des architectures de calculs mais aussi par le faible coup qu'engendrent des analyses in silico par rapport à des tests in-vitro.Les essais biologiques qui ont été menés depuis des décennies afin d'identifier des médicaments potentiels, commencent à former une source très importante de données et plusieurs bases de données commencent à les répertorier. La disponibilité de ce type de données a favorisé le développement d'un nouvel axe de recherche appelé la "chémogénomique" et qui s'intéresse à l'étude et à l'identification des associations possibles entre plusieurs molécules et plusieurs cibles. Ainsi, la chémogénomique permet de déterminer le profil biologique d'une molécule et nous renseigne sur sa capacité à devenir une touche intéressante mais aussi à identifier ses possibles effets indésirables. Des méthodes de chémoinformatique permettent d'utiliser ces sources de données à des fins d'apprentissage et établir des modèles prédictifs qui permettront par la suite de faire des prédictions pour connaitre l'activité d'une molécule.Cette thèse a porté sur le développement et l'utilisation de méthodes de prédictions d'association protéine-ligand. La prédiction d'une association est importante en vue d'un criblage virtuel et peut s'effectuer à l'aide de plusieurs méthodes. Au sein du laboratoire, on s'intéresse plus particulièrement au profilage de bases de données de molécules (chimiothèques) contre une série de cibles afin d'établir leur profil biologique. J'ai donc essayé au cours de ma thèse de mettre au point des modèles prédictifs d'association protéine-ligand pour un grand nombre de cibles, valider des méthodes de criblage virtuel récentes à des fins de profilage mais aussi établir un protocole de profilage automatisé, qui décide du choix de la méthode de criblage la plus adaptée en s'appuyant sur les propriétés physico-chimiques du ligand à profiler et de l'éventuelle cible.
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Kolodych, Sergii. "Recherche de nouvelles réactions de couplage par criblage immuno-enzymatique." Thesis, Paris 11, 2013. http://www.theses.fr/2013PA112145.
Abstract:
La recherche de nouvelles réactions est un des enjeux fondamentaux de la chimie organique. En dehors de l’approche classique basée sur la conception d’une réaction en s’appuyant sur les propriétés chimiques des substrats, une nouvelle approche utilisant le criblage systématique de combinaisons aléatoires de fonctions réactives a été récemment adoptée par plusieurs groupes. Cette stratégie nécessite un outil analytique permettant de cribler un très grand nombre de réactions par jour et d’identifier les meilleures combinaisons conduisant à la formation de produits intéressants. Les travaux de thèse présentés dans ce mémoire s’inscrivent dans le contexte de l’utilisation des techniques de dosages immuno-enzymatiques (ELISA) comme outil de criblage pour la recherche de nouvelles réactions de couplage. Dans un premier temps le criblage de 2688 combinaisons de fonctions réactives et de catalyseurs choisies au hasard a été effectué. Ce criblage a permit de mettre en évidence deux nouveaux couplages en présence de sels de cuivre : une réaction entre les thiourées et les phénols conduisant à la formation des isourées et une réaction entre les N-hydroxythiourées et les alcynes conduisant à la formation des thiazole-2-imines. Dans un second temps le criblage de 2816 combinaisons de fonctions sélectionnées, cette fois-ci, de façon rationnelle a été effectué. Ce criblage a visé la découverte de nouvelles cycloadditions [3+2] répondant aux critères de la chimie « click ». Ainsi l’utilisation de dosage immuno-enzymatique a été étendue à l’optimisation des nouvelles réactions découvertes ainsi qu’à l’évaluation de leurs cinétique, chimiosélectivité et biocompatibilité. Près de 3000 tests complémentaires effectuées sur les « hits » issus du criblage primaire ont ainsi permit de mettre en évidence 4 nouvelles réactions de couplage dont une nouvelle réaction « click » : la cycloaddition sydnone-alcyne catalysée au cuivre (CuSAC). Dans la dernière partie de ce manuscrit les études plus détaillées sur la réaction CuSAC ont été effectuées, notamment l’identification de la structure du produit de couplage et l’étendue du champ d’application de cette réaction. Enfin, l’aspect « click » de la réaction CuSAC a été illustré par l’application de cette réaction au marquage d’une protéineDiscovery of new reactions is one of the fundamental goals in organic chemistry. In addition to the traditional approach to reaction discovery, consisting in designing a reaction on the basis of known chemical properties of reagents, new approaches based on the screening of random combinations of reactive functions and catalysts have been recently developed. The main prerequisite of this strategy is an analytical tool allowing screening of a big number of reactions per day and identifying combinations leading to the formation of unanticipated products. In the work presented herein a high-throughput immunoassay screening has been used for the discovery of new coupling reactions. In the first part of this work a screening of 2688 combinations of randomly chosen reactive functions and catalysts was carried out. This screening led to the discovery of two copper-promoted coupling reactions: a reaction between thioureas and phenols leading to the formation of isoureas through desulfurization; and a reaction between N-hydroxythioureas and alkynes leading to the formation of thiazole-2-imines. In the second part of the work a screening of 2816 combinations of rationally designed chemical functions and catalysts was carried out. This screening was focused on the discovery of catalytic [3+2] cycloadditions that comply with the standards of “click” chemistry. In this study, the use of immunoassay screening was extended to optimize new reactions and to evaluate their kinetics, chemoselectivity and biocompatibility. Therefore, around 3000 complementary tests were carried out on the hits, identified in the primary screening. This allowed the discovery of 3 new coupling reactions and one new “click” reaction: a copper-catalyzed sydnone-alkyne cycloaddition (CuSAC). The last part of the work was focused on detailed studies of the CuSAC reaction. Identification of the structure of the coupling product and substrate scope of this reaction was carried out. Finally, the applicability of the CuSAC reaction for bioconjugation was demonstrated by an example of protein labeling
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Meslamani, Jamel-Eddine. "Développement de nouvelles méthodes de criblage in silico en chémogénomique." Thesis, Strasbourg, 2012. http://www.theses.fr/2012STRAF009/document.
Abstract:
La chémoinformatique et la bioinformatique sont des disciplines devenues indispensables à la découverte de médicaments. De nos jours, les industries pharmaceutiques consacrent près de 10% de leur budget de recherche et développement, à la recherche de médicaments assisté par ordinateur (Kapetanovic 2008). Cette émergence peut s’expliquer à la fois par le développement des architectures de calculs mais aussi par le faible coup qu’engendrent des analyses in silico par rapport à des tests in-vitro.Les essais biologiques qui ont été menés depuis des décennies afin d’identifier des médicaments potentiels, commencent à former une source très importante de données et plusieurs bases de données commencent à les répertorier. La disponibilité de ce type de données a favorisé le développement d’un nouvel axe de recherche appelé la "chémogénomique" et qui s’intéresse à l’étude et à l’identification des associations possibles entre plusieurs molécules et plusieurs cibles. Ainsi, la chémogénomique permet de déterminer le profil biologique d’une molécule et nous renseigne sur sa capacité à devenir une touche intéressante mais aussi à identifier ses possibles effets indésirables. Des méthodes de chémoinformatique permettent d’utiliser ces sources de données à des fins d’apprentissage et établir des modèles prédictifs qui permettront par la suite de faire des prédictions pour connaitre l’activité d’une molécule.Cette thèse a porté sur le développement et l'utilisation de méthodes de prédictions d’association protéine-ligand. La prédiction d’une association est importante en vue d’un criblage virtuel et peut s’effectuer à l’aide de plusieurs méthodes. Au sein du laboratoire, on s’intéresse plus particulièrement au profilage de bases de données de molécules (chimiothèques) contre une série de cibles afin d’établir leur profil biologique. J’ai donc essayé au cours de ma thèse de mettre au point des modèles prédictifs d’association protéine-ligand pour un grand nombre de cibles, valider des méthodes de criblage virtuel récentes à des fins de profilage mais aussi établir un protocole de profilage automatisé, qui décide du choix de la méthode de criblage la plus adaptée en s’appuyant sur les propriétés physico-chimiques du ligand à profiler et de l’éventuelle cibleChemoinformatics and bioinformatics methods are now necessary in every drug discovery program. Pharmaceutical industries dedicate more than 10% of their research and development investment in computer aided drug design (Kapetanovic 2008). The emergence of these tools can be explained by the increasing availability of high performance calculating machines and also by the low cost of in silico analysis compared to in vitro tests.Biological tests that were performed over last decades are now a valuable source of information and a lot of databases are trying to list them. This huge amount of information led to the birth of a new research field called “chemogenomics”. The latter is focusing on the identification of all possible associations between all possible molecules and all possible targets. Thus, using chemogenomics approaches, one can obtain a biological profile of a molecule and even anticipate possible side effects.This thesis was focused on the development of approaches that aim to predict the binding of molecules to targets. In our lab, we focus on profiling molecular databases in order to get their full biological profile. Thus, my main work was related to this context and I tried to develop predictive models to assess the binding of ligands to proteins, to validate some virtual screening methods for profiling purpose, and finally, I developed an automatic hybrid profiling workflow that selects the best fitted virtual screening approach to use according the ligand/target context
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DULAC-BRACQ, EMMANUELLE. "Criblage par dosage immunochimique de souches recombinantes chez penicillium roquefortii." Clermont-Ferrand 2, 1997. http://www.theses.fr/1997CLF21886.
Abstract:
Afin de proposer un choix plus important de souches de p. Roquefortii la technique de fusion de protoplastes a ete utilise et le criblage des souches recombinantes a ete realise par le dosage elisa de l'aspartyl proteinase de ce champignon. Le developpement de ce dosage elisa de type sandwich a necessite la purification de l'enzyme (utilisation successive d'une colonne mono q et d'une colonne superdex 75 ou d'un gel sephadex g100 superfine). La purete de l'enzyme et la specificite des anticorps obtenus ont permis le developpement d'un sandwich elisa tres sensible (0,25 ng/ml), reproductible (cv=3-7%), presentant un taux de recuperation superieur a 98% et une excellente correlation (r=0,995) avec le dosage enzymatique a ph acide. Les conditions optimales de culture ont ensuite ete definies (ph et source de proteine : caseine ou trypticase). La synthese d'aspartyl proteinase est favorisee par les cultures a ph 4,0 contenant du trypticase. Par contre, l'activite specifique de l'enzyme est maximale lorsqu'elle est produite dans une culture a ph 6,0. Les cultures realisees sur czapek trypticase tamponne a ph 4,0, associees au dosage elisa de l'aspartyl proteinase ont permis un criblage simple des souches de p. Roquefortii (50 cultures et 100 dosages en simultane) et reproductible (cv=12,5%). Le croisement a debute par le marquage des souches parentales : l'irradiation aux uv a fourni principalement des mutants biochimiques. La fusion de protoplastes ensuite a permis l'obtention de 2000 colonies. Apres fusion nucleaire puis haploidisation, 300 recombinants ont ete selectionnes et 180 ont pu ensuite rapidement etre caracterises a l'aide du test de criblage. Le tri des recombinants en fonction de leur aspect, de leur croissance et de leur synthese d'aspartyl proteinase a ete realise. 50% des souches presentent des proprietes differentes des parents et l'ecart entre les niveaux extremes de synthese d'aspartyl proteinase a ete multiplie par 10 par la recombinaison.
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Hortholary, Cédric. "Criblage de structures chimiques : modèles de composants pour l'électronique moléculaire." Toulouse 3, 2003. http://www.theses.fr/2003TOU30227.
Abstract:
Le domaine de l'électronique moléculaire suscite un intérêt croissant, aussi bien dans le milieu de la recherche que dans celui de l'industrie. Près de trente années de recherche sur ce thème ont permis de développer des outils théoriques et expérimentaux pour étudier le comportement électrique de molécules susceptibles de remplir, par exemple, les fonctions de fils ou de commutateurs. Durant ce travail de thèse, nous nous sommes intéressés à de telles molécules, tant du point de vue de la synthèse que de celui de la caractérisation de leurs propriétés. Une part conséquente des synthèses réalisées s'appuie sur les propriétés remarquables d'un complexe cyclométallé de ruthénium, qui autorise la mise en œuvre de techniques issues de la chimie organique, comme celles de purification ou de caractérisation. La plupart des molécules obtenues ont été greffées sur des surfaces d'or en couches auto-assemblées. La microscopie à effet tunnel nous a permis de caractériser la morphologie de monocouches électro-actives, avant d'en étudier la réponse cinétique par des techniques électrochimiques. Les constantes de vitesse de transfert électronique hétérogène, à travers des squelettes conjugués de type oligo(phénylèneéthynylène) de différentes tailles, ont ainsi pu être déterminées. Elles renseignent sur l'aptitude de tels oligomères à remplir la fonction de fil moléculaire, et viennent compléter des informations que nous avons obtenues par l'étude de complexes dinucléaires à valence mixteMolecular wires and switches are of crucial interest in the growing field of molecular electronics. Most of the syntheses of this type of molecules, presented in this work, are based on the properties of a cationic cyclometallated ruthenium complex, used as a builiding block. A familly of various length, unsaturated and redox active oligo(phenyl)ethynyl (OPE) has been obtained. We have studied the electrical behaviour of these molecules by electrochemical techniques. Experimentally the molecules probed are embedded in a self assembled monolayer, characterised by scanning tunnelling microscopy. By recording the heterogeneous rate constants of OPE, we have determined the distance dependence of the tunneling parameter
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Marin, Annick. "Pervaporation microfluidique pour le criblage et mesures de concentration in situ." Phd thesis, Université Pierre et Marie Curie - Paris VI, 2009. http://pastel.archives-ouvertes.fr/pastel-00555545.
Abstract:
Ce travail de thèse présente la conception et la réalisation d'un dispositif microfluidique en PDMS (Polydiméthylsiloxane) pour exploration des diagrammes de phase. Le microsystème est basé sur le principe de pervaporation (évaporation à travers une membrane) et comporte des microchambres indépendantes de 5nL de solution dont on fait varier la concentration au court du temps. Il est possible de concentrer jusqu'à l'observation de transitions de phases (démixtion, nucléation, cristallisation, ...). Nous avons montré que la pervaporation est une piste intéressante pour l'exploration de diagrammes de phases. En parallèle, nous avons développé un outil original de mesure in situ en temps réel de la concentration, paramètre essentiel du criblage. Cet outil, basé sur le principe de réfractométrie, a pour avantage d'être non intrusif et ne requiert aucune modification particulière du microsystème. La méthode consiste à utiliser les parois des microcanaux comme éléments optiques. Nous montrons que cette méthode permet de mesurer un coefficient de diffusion et un rapport de viscosité dans une jonction en T sans ajout de traceurs ni utilisation de la fluorescence. Nous avons utilisé cette méthode de mesure de la concentration lors d'expériences sur des systèmes modèles (solutions ioniques, surfactants, polymères, protéines, ...).
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Elkaïm, Judith. "Drug design in silico : criblage virtuel de protéines à visée thérapeutique." Thesis, Bordeaux 1, 2011. http://www.theses.fr/2011BOR14444/document.
Abstract:
Les processus qui mènent à la découverte de nouveaux médicaments sont longs et fastidieux, et les taux de succès sont relativement faibles. L’identification de candidats par le biais de tests expérimentaux s’avère coûteuse, et nécessite de connaître en profondeur les mécanismes d'action de la protéine visée afin de mettre en place des essais efficaces. Le criblage virtuel peut considérablement accélérer ces processus en permettant une évaluation rapide de chimiothèques de plusieurs milliers de molécules afin de déterminer lesquelles sont les plus susceptibles de se lier à une cible. Ces dernières années ont ainsi été témoins de quelques success stories dans ce domaine.Le premier objectif de ce travail était de comparer différents outils et stratégies couramment utilisés dans le criblage virtuel “structure-based”, puis de les appliquer à des cibles protéiques à visée thérapeutique, en particulier dans le cadre du cancer.La protéine kinase GSK3 et un test set de ligands connus ont servi de modèle pour différentes études méthodologiques ayant pour but d’évaluer les programmes de docking et de scoring à notre disposition. En particulier, l’utilisation de plusieurs structures relaxées du récepteur ou l’insertion de torsions sur certains résidus du site actif pendant le docking ont permis d’évaluer l’influence de la flexibilité de la protéine. L’utilité et la pertinence d’outils permettant de générer automatiquement les structures 3D des ligands et de méthodes de consensus scoring ont également été étudiées.Un criblage virtuel de la Pontine, une ATPase impliquée dans la croissance tumorale pour laquelle aucun inhibiteur n’était connu, a permis la sélection de candidats issus de banques de données commerciales. Ces molécules ont été testées dans un essai enzymatique par le biais d’une collaboration, et quatre d’entre elles se sont révélées capable d’inhiber l’activité ATPase de la Pontine. Le criblage de bases de ligands synthétisés et imaginés dans l’équipe a également fourni un inhibiteur original. Au contraire, l’étude de la sPLA2-X humaine, une phospholipase dont l’activité catalytique est dépendante d’un atome de Ca2+ localisé au sein du site actif, a montré les limites de nos outils de docking qui n’ont pas été capables de gérer cet ion métallique et mis en évidence la nécessité de mettre en place d’autres outilsThe process of drug discovery is long and tedious. Besides, it is relatively inefficient in terms of hit rate. The identification of candidates through experimental testing is expensive and requires extensive data on the mechanisms of the target protein in order to develop efficient assays. Virtual screening can considerably accelerate the process by quickly evaluating large databases of compounds and determining the most likely to bind to a target. Some success stories have emerged in the field over the last few years.The objectives of this work were first, to compare common tools and strategies for structure-based virtual screening, and second, to apply those tools to actual target proteins implied notably in carcinogenesis.In order to evaluate the docking and scoring programs available, the protein kinase GSK3 and a test set of known ligands were used as a model to perform methodological studies. In particular the influence of the flexibility of the protein was explored via relaxed structures of the receptor or the insertion of torsions on the side chains of residues located in the binding site. Studies concerning the automatic generation of 3D structures for the ligands and the use of consensus scoring also provided insights on the usability of these tools while performing a virtual screening.Virtual screening of the human protein Pontin, an ATPase implied in tumor cell growth for which no inhibitors were known, allowed the prioritization of compounds from commercial databases. These compounds were tested in an enzymatic assay via a collaboration, and led to the identification of four molecules capable of inhibiting the ATPase activity of Pontin. Additional screens of in-house oriented databases also provided at least one innovative inhibitor for this protein. On the contrary, a study of the human PLA2-X, a phospholipase that requires a Ca2+ atom to bind to its active site in order to catalyze the hydrolysis of its substrate, revealed the limits of our docking tools that could not handle the metal ion and the need for new tools
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Chtchigrovsky, Mélanie. "Préparation, criblage et utilisation de catalyseurs hétérogènes à base de polysaccharides." Paris 11, 2010. http://www.theses.fr/2010PA112144.
Abstract:
Les contraintes environnementales poussent les chimistes à développer de nouveaux systèmes générant un minimum de déchets. La mise au point de catalyseurs hétérogènes bien définis permet de répondre à ces contraintes notamment par la récupération et le recyclage du catalyseur. Alors que de nombreux systèmes catalytiques hétérogènes à base de supports inorganiques ou organiques, sont d’ores et déjà rapportés dans la littérature, peu de travaux mettent en œuvre des systèmes à base de matériaux biologiques, tels que des macrostructures polymériques naturelles. Dans cette optique, nous avons entrepris de développer des catalyseurs hétérogènes à base de polysaccharides, en tant que supports renouvelables, sous la forme de billes macroscopiques poreuses. Les différents catalyseurs obtenus ont été criblés à l’aide de tests fluorescents. Dans un premier temps, l’efficacité catalytique d’une douzaine de systèmes hétérogènes à base de chitosane comme support pour des complexes « cuivre-ligand » a pu être étudiée via la réaction de cycloaddition 1,3-dipolaire de Huisgen. Puis dans un second temps, l’efficacité catalytique d’une quarantaine de systèmes hétérogènes à base de nanoparticules de palladium supportées sur alginate a pu être étudiée via la réaction de couplage de Suzuki. Nos résultats montrent que des systèmes hétérogènes fortement actifs peuvent être obtenus en combinant les propriétés texturales des polysaccharides et les propriétés catalytiques de métaux de transition ou de complexes « métal-ligand »Environmental constraints push chemists to develop new systems for generating minimal waste. The development of well-defined heterogeneous catalysts can respond to these constraints in particular by the recovery and the recycling of catalyst. While many heterogeneous catalytic systems based on inorganic or organic materials are already reported in the literature, few works implement systems based on biological materials such as natural polymeric macrostructures. In this context, we have undertaken to develop heterogeneous catalysts based on polysaccharides as renewable materials, in the form of macroscopic porous beads. Different catalysts obtained were screened using fluorescent test. Firstly, the catalytic efficiency of a dozen heterogeneous catalysts based on chitosan as support for « copper-ligand » complexes has been studied through the 1,3-dipolar Huisgen’s cycloaddition. Secondly, the catalytic efficiency of around forty heterogeneous systems based on palladium nanoparticles supported on alginate have been studied through the Suzuki’s coupling reaction. Our results show that highly active heterogeneous systems can be obtained by combining the structural properties of polysaccharides and catalytic properties of transition metals or « metal-ligand » complexes
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Lecat-Guillet, Nathalie. "Identification d’inhibiteurs du symporteur sodium-iode par criblage à haut débit." Paris 11, 2006. http://www.theses.fr/2006PA112345.
Abstract:
Ce travail de thèse a été consacré à la recherche d'inhibiteurs du Symporteur Sodium-Iode ou NIS. Le NIS est une protéine membranaire localisée sur la membrane basolatérale des thyrocytes. Il permet le transport de ions iodures du plasma dans le thyrocyte, ce qui constitue la première étape de la biosynthèse des hormones iodées T 3 et T 4 produites par la thyroïde. La campagne de criblage à haut débit, mise au point sur les cellules HEK-293 sur exprimant la protéine NIS, sur une chimiothèque de 16 720 composés a permis de sélectionner 413 composés bloquant l'entrée d'iodures dans les cellules. Des tests de validation ainsi que la caractérisation de ces composés ont finalement permis d'identifier 10 inhibiteurs puissants et spécifiques du NIS humain, du rat et de la souris possédant des ECSO proches du micro-molaire. Un inhibiteur supplémentaire a été identifié en criblant une chimiothèque interne de 320 peptidomimétiques issus de chimie combinatoire. Parallèlement, un criblage orienté d'une chimiothèque d'organotrifluoroborates a permis de caractériser 3 autres inhibiteurs spécifiques du NIS. Un autre composé a été identifié comme activateur d'entrée d'iodures dans les thyrocytes de rats en culture. L'analyse de son mode d'action a permis de suggérer un mécanisme de maintien des ions iodures dans le thyrocyte. La synthèse d'analogues de ce composé a permis d'identifier un composé encore plus actif et aussi de proposer des relations de structure-activité de cette famille de molécules. Enfin, la synthèse de sondes photoactivables a été initiée afin d'identifier le mode d'action de ce composé sur les thyrocytes.
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Gaignard, Clément. "Criblage, identification et caractérisations physico-chimiques d'exopolysaccharides de microalgues et Cyanobactéries." Thesis, Université Clermont Auvergne (2017-2020), 2019. http://www.theses.fr/2019CLFAC067.
Abstract:
Le principal objectif de cette thèse était d’améliorer les connaissances sur la capacité des microalgues et Cyanobactéries à produire des Exopolysaccharides (EPS). Le criblage effectué sur 166 souches de la Roscoff Culture Collection (RCC) a permis d’identifier 45 nouvelles souches potentiellement productrices d’EPS. Des études biochimiques par Chromatographie Echangeuse d’Anions Haute Performance couplée à un Détecteur Ampérométrique Pulsé (CEAHP-DAP), et par Chromatographie Phase Gaz couplée à de la Spectrométrie de Masse (CPG/SM) ont confirmé la nature polysaccharidique de 20 nouveaux polymères identifiés. Au cours de ce travail, des cultures en Photobioréacteur (PBR) 1,4 et 5 L ont été menées sur quelques souches et de caractériser au plus fin leur EPS (compositions biochimiques et caractéristiques physico-chimiques). Cela a conduit, en autre, à l’identification d’un hétéroxylane issu d’une microalgue Glossomastix. Cet EPS est constitué d’une chaîne principale de β-(1,3)- et β-(1,4)-d-Xylp substituée en positions O-2 et O-3 par diverses chaînes et/ou résidus terminaux tels que d-Xylp-(1→6)-d-Galp, d-Xylp-(1→4)-d-Galp, d-Xylp-(1→3)-d-Galp, Galp-(1⟶SF-Xylp-(1⟶Xylp-(1⟶Glcp-(1⟶.Enfin, des analyses statistiques réalisées sur 81 compositions en monosaccharides d’EPS de microalgues ont permis pour la première fois d’établir un lien entre la composition biochimique et l’appartenance phylogénétique des microalguesThe main objective of this thesis was to improve knowledge on the capacity of microalgae and Cyanobacteria to produce Exopolysaccharides (EPS). Screening carried out on 166 strains from the Roscoff Culture Collection (RCC) made it possible to identify 45 new potentially EPS producers. Biochemical studies using High Performance Anion Exchange Chromatography with a Pulsed Amperometric Detector (HPAEC-PAD), and Gas Chromatography with Mass Spectrometry (GC/MS) confirmed the polysaccharide nature of 20 new identified polymers. During this work, cultures in 1,4 and 5 L Photobioreactors (PBR) were performed on few strains in order to characterize at best their EPS (biochemical compositions and physicochemical characteristics). This word led, in addition, to the identification of a heteroxylan from the microalga Glossomastix. Its EPS consists of a main chain of β-(1,3)- and β-(1,4)-d-Xylp substituted in O-2 and O-3 positions by various chains and/or terminal residues such as d-Xylp-(1→6)-d-Galp, d-Xylp-(1→4)-d-Galp, d-Xylp-(1→3)-d-Galp, Galp-(1⟶SF-Xylp-(1⟶Xylp-(1⟶Glcp-(1⟶. Finally statistical analyzes carried out on 81 monosaccharide compositions of microalgae EPS made it possible for the first time to establish a link between biochemical composition and phylogenetic membership of microalgae
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Seveno, Martial. "Le rhamnogalacturonane II : Développement d’outils de criblage de mutants d’Arabidopsis thaliana." Rouen, 2006. http://www.theses.fr/2006ROUES048.
Abstract:
Le Rhamnogalacturonane II (RG II) est un méga-oligosacharride chargé, hautement complexe, présent principalement sous forme dimérisée via un diester de borate au sein de la paroi végétale. La dimérisation du RG II est un processus fondamental dans la croissance de la plante. De plus, malgré sa complexité, la structure de ce polymère est très conservée chez les végétaux, ce qui laisse présumer une forte implication du RG II dans des fonctions physiologiques importantes. Cependant, l’étude du RG II est délicate puisqu’il ne représente que 4% des composés pariétaux. L’étude de mutants d’insertion d’Arabidopsis thaliana affectés dans la biosynthèse de ce polymère doit permettre de répondre aux nombreuses questions que pose le RG II. Parmi ces mutants « RG II », certains présentent des déficiences pour des enzymes clés de la voie de biosynthèse et de transfert du Kdo, monosaccharide spécifique du RG II. Après avoir développé et validé des protocoles de purification et d’analyse structurale du RG II, des études biochimiques et moléculaires de mutants « Kdo » ont été réaliséesRhamnogalacturonan II is a very complex mega-oligosaccharide which is present in plant primary cell walls, predominantly as a dimer that is cross-linked by a borate-diol ester. RG II dimerization is a fundamental process for plant growth. Furthermore, in spite of its complexity, the structure of this polymer is highly conserved in plants, which presume a strong implication of the RG II in important physiological functions. The RG II represents only 4% of the cell wall components. The study of insertion mutants of Arabidopsis thaliana affected in the biosynthesis of this polymer could allow answering the numerous questions about RG II. Amonf these “RG II” mutants, some present deficiencies for key enzymes of the Kdo biosynthesis pathway. Kdo is a specific monosaccharide present in RG II polysaccharide. RG II purification and structural analysis methodologies have been developed and validated prior to biochemical and molecular studies of “Kdo” mutants
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Choucha-Snouber, Leïla. "Développement d'un bioréacteur microfluidique hépato-rénal pour le criblage des xénobiotiques." Compiègne, 2012. http://www.theses.fr/2012COMP2005.
Abstract:
L'objectif de ma thèse a été de développer un bioréacteur microfluidique hépato-rénal pour tester la toxicité des xénobiotlques sur le rein. Pour cela les cellules MDCK (cellules de rein de chien) ont été choisies comme modèle. L’étude approfondie des mécanismes d’aptabilité des cellules au microenvironnement et aux flux en continue, a montré que les cellules prolifèrent en 3-D et présentent un état inflammatoire. L'analyse du transcriptome a permis de mettre en évidence des gênes des fonctions spécifiques du rein et du métabolisme de phase l et II, ces résultats ont été confirmés par un profil protéomique. Ainsi le microconfinement et le flux participent dans le maintien des fonctions de la cellule rénale et dans la réponse adaptative à l’état inflammatoire. La même approche expérimentale nous a permis de déterminer les principales voies de signalisations cellulaires modulées par l'ifosfamide, un anticancéreux néphrotoxique métabolisé par le foie. De ce fait ces résultats nous ont permis d'utiliser les cellules MDCK dans un modèle de co-culture avec le modèle hépatique préétablis par l’équipe. La co-culture des deux types cellulaire nous a permis de détecter la biotransformation de l’ifosfamide par les cellules hépatiques HepaRG et l'effet toxique de ses métabolites sur les cellules MDCK. L'analyse par chromatographie couplée à la spectrométrie de masse a permis de confirmer que l’effet observé est dû au chloroacétaldéhyde le métabolite néphrotoxique. Les travaux de cette thèse confortent l’utilité de notre outil comme moyen pour évaluer la toxicité et/ou l'efficacité d'un médicament, découvrir de nouvelles cibles thérapeutiques et déterminer de nouveaux biomarqueursThe aim of my thesis was to develop a liver-Kidney microfluidic bioreactor to test the toxicity of xenobiootics on the kidney. For that MDCKcells (kidney dog cells) were selected as the model. The study of the mechanisms of cell adaptability to the microenvironment and continuous flow showed that the cells proliferatein 3-D and have an inflammatory statute. The transcriptome analysis has allowed us to identify genes of the specific kidney functions and the phase I and II of metabolism. These results are supported by a proteomic profile. Thus the microconfinment and the flow are involved in maintaining functions of the renal cells, and adaptive response to the inflammatory condition. By the same experimental approach we have identified the main signaling pathways modulated by ifosfamide, an anticancer nephrotoxic drug metabolized by the liver. Thereby, our results allowed using the MDCK cells within a compound co-culture model with the liver model predetermined by the team. The co-culture of the two cell types allowed us to detect the metabolism of ifosfamide by the HepaRG (live cells) and the toxic effect of its metabolites on MDCK cells. Analysis of culture medium compounds by chromatography mass spectrometry show that the effect observed is due to chloroacetaldehyde, the nephrotoxic metabolite. Works of this thesis confirms the usefulness of our device as a means to evaluate the toxicity and/or the effectiveness of a drug, discover new therapeutic targets and identifying new biomarkers
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Marin, Moumen Annick. "Pervaporation microfluidique pour le criblage et mesures de concentration in situ." Paris 6, 2009. https://pastel.archives-ouvertes.fr/pastel-00555545.
Abstract:
Ce travail de thèse présente la conception et la réalisation d’un dispositif microfluidique en PDMS (Polydiméthylsiloxane) pour exploration des diagrammes de phase. Le microsystème est basé sur le principe de pervaporation (évaporation à travers une membrane) et comporte des microchambres indépendantes de 5nL de solution dont on fait varier la concentration au court du temps. Il est possible de concentrer jusqu’à l’observation de transitions de phases (démixtion, nucléation, cristallisation, …). Nous avons montré que la pervaporation est une piste intéressante pour l’exploration de diagrammes de phases. En parallèle, nous avons développé un outil original de mesure in situ en temps réel de la concentration, paramètre essentiel du criblage. Cet outil, basé sur le principe de réfractométrie, a pour avantage d’être non intrusif et ne requiert aucune modification particulière du microsystème. La méthode consiste à utiliser les parois des microcanaux comme éléments optiques. Nous montrons que cette méthode permet de mesurer un coefficient de diffusion et un rapport de viscosité dans une jonction en T sans ajout de traceurs ni utilisation de la fluorescence. Nous avons utilisé cette méthode de mesure de la concentration lors d’expériences sur des systèmes modèles (solutions ioniques, surfactants, polymères, protéines,. . . ).
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Parez, Vincent. "Criblage phénotypique à l'aide d'intracorps dans un modèle de cancer colorectal." Thesis, Montpellier 2, 2014. http://www.theses.fr/2014MON20109/document.
Abstract:
L'expression intracellulaire des anticorps (intracorps) est une approche qui permet l'étude et le ciblage des antigènes dans les compartiments intracellulaires. Néanmoins, l'expression d'anticorps entiers fonctionnels dans les cellules reste une tâche difficile en raison de leur grande taille et de leur structure, l'environnement réducteur du milieu intracellulaire étant défavorable à la formation des ponts disulfure. Notre groupe a une forte expertise dans le domaine de l'immunisation intracellulaire et son application pour l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques. Pour cela, notre équipe a élaboré des banques de fragments d'anticorps scFv optimisés pour une meilleure expression intracellulaire. Nos travaux antérieurs ont démontré que ces intracorps peuvent cibler spécifiquement des domaines ou des modifications post-traductionnelles de protéines dans des cellules vivantes. Ceci est particulièrement important car il démontre l'un des avantages principaux des intracorps par rapport à l'approche basée sur l'ARNi. Cet avantage a été démontré par un criblage phénotypique dans un modèle d'allergie. En appliquant cette approche à l'étude de l'activation des mastocytes, nous avons pu identifier un nouvel acteur moléculaire impliqué dans la voie de signalisation mise en jeu. Ce travail a été protégé par un brevet européen en 2013 et est publié récemment. Dans le cadre de mon projet de thèse, j'ai construit une nouvelle banque synthétique (HUSCIv) optimisée pour la stabilité, la diversité et l'affinité des scFvs. Pour cela, le scFv 13R4 isolé dans notre équipe a servi de charpente pour le greffage des différentes boucles hypervariables, tout en respectant la diversité des régions CDR observée dans les anticorps naturels humains. Nous avons utilisé la protéine GFP en tant que rapporteur pour étudier le repliement et la solubilité des intracorps. Nos résultats ont clairement démontré que la plupart des intracorps issus de la banque HUSCIv sont soluble dans le cytoplasme des cellules mammifères. Mon projet de thèse décrit ici rapporte l'utilisation de la banque HUSCIv pour un criblage phénotypique dans des cellules de cancer colorectal portant une mutation du gène K-RAS et résistantes au traitement par l'anticorps chimérique Cetuximab. Le projet cherche à sélectionner des scFv capables de restaurer la sensibilité au Cetuximab, avec comme objectif l'identification des cibles intracellulaires impliquées.Pour ce criblage fonctionnel, la banque HUSCIv a été exprimée dans les cellules HCT116 par l'intermédiaire d'un système d'expression rétroviral. Le processus de sélection est basé sur la sélection directe de la prolifération des cellules en utilisant un colorant fluorescent (CMRA). Les cellules dont la prolifération est bloquée sont isolées et un séquençage à haut débit permet de suivre l'évolution des populations de scFv tout au long de l'expérience. Ainsi, ce projet a nécessité un séquençage profond d'un grand nombre de scFv afin de réaliser une analyse statistique. Nous avons réalisé à ce jour deux tours de sélection. Les tests de cytotoxicité réalisés sur les populations sélectionnées ont montré une inhibition significative de la prolifération en présence du Cetuximab d'environ 10%. Ces résultats indiquent l'évolution du phénotype qui tend vers une sélection de scFv inhibiteurs et suggèrent que nous devons réaliser au moins un ou plusieurs tours plus sélectifs avant de formuler des conclusions.L'approche introduite ici est différente de toutes les études existantes en ce qu'elle utilise des banques « naïves », et permet non seulement de répondre à la diversité du protéome, mais aussi d'étudier les messagers secondaires et le métabolisme des cellules. En tant que tel, et par rapport à d'autres approches à grande échelle, celle-ci représente une voie simple pour la découverte de molécules thérapeutiques potentiellesIntracellular expression of antibodies (intrabodies) permitted the study and targeting of antigens in cellular compartments. However, the expression of functional intrabodies remains a difficult task due to their large size, structure, and the reducing intracellular environment. Our group has a strong expertise in the field of intracellular immunization and the identification of new therapeutic targets. For this purpose, we have developed an scFv library optimized for intracellular expression of scFv antibody fragments. Our previous works have shown the successful use of intrabodies for targeting specific domains or post-translational modifications in living cells. This is particularly important because it demonstrates one of the main advantages of intrabodies compared to the approaches using RNAi. This benefit was demonstrated by a phenotypic screen in a model of allergy. Applying this approach to the study of mast cell activation, we identified a new molecular player involved in the signaling pathway implemented. This work was protected by a European patent in 2013 and was recently published. As part of my thesis project, I designed a new synthetic library (HUSCIv) optimized for scFv stability, diversity and affinity. For this, a highly soluble and hyper-stable framework, scFv13R4 isolated in our group, was used as a scaffold for grafting different hypervariable loops, while respecting the diversity of CDRs observed in human natural antibodies. We used protein GFP as a reporter to study the folding and solubility of intrabodies. Our findings clearly demonstrated that most of the intrabodies from HUSCIv library are soluble in the cytoplasm of mammalian cells. My thesis project described here reports the use of HUSCIv in a phenotypic screen of colorectal cancer cells carrying a mutation in the K-RAS gene and resistant to the treatment with the chimeric antibody Cetuximab. The project seeks to select scFv fragments able to restore the sensitivity to Cetuximab, with the objective to identify the intracellular targets involved. For this functional screen, the HUSCIv library was expressed in HCT116 cells via a retroviral expression system. The selection process is based on the direct selection of cell proliferation using a fluorescent dye (CMRA). The cells whose proliferation is blocked are isolated and the evolution of scFv populations throughout the experiment are tracked via high-throughput sequencing. This sequencing requires a large number of scFvs to perform a statistical analysis. So far, we have achieved two rounds of selection. The cytotoxicity tests carried out on the selected populations showed a significant inhibition of proliferation (10%) in the presence of Cetuximab. These results indicate that the evolving phenotypes are tending towards a selection of scFv inhibitors and suggest that we need to perform at least one or more selective rounds before making conclusions. The approach introduced here is different from all existing studies in that it uses "naive" libraries not only to respond to the diversity of the proteome, but also to study secondary messengers and metabolism in cells. As such, and in comparison to other large-scale approaches, it is a simple way for the discovery of potential therapeutic molecules
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Bret, Emmanuelle. "Les anticancéreux d'origine végétale : historique et tests de criblage in vitro." Bordeaux 2, 1995. http://www.theses.fr/1995BOR2P109.
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Lombardi, Vincent. "Criblage et caractérisation d'adjuvents pour les vaccins sublinguaux contre les allergies." Paris 6, 2008. http://www.theses.fr/2008PA066332.
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Al, Ibrahim Malak. "Anti-coronavirus potential of halophytes and invasive plants from Northern France : discovery of active terpenoids from Hippophae rhamnoides and Senecio inaequidens." Electronic Thesis or Diss., Université de Lille (2022-....), 2024. http://www.theses.fr/2024ULILS003.
Abstract:
Les coronavirus sont responsables de maladies des voies respiratoires bénignes à graves chez l’Homme. Malgré des progrès significatifs dans la compréhension de la pathologie et de la gestion clinique des coronavirus, ces maladies virales restent un problème de santé publique en raison d’épidémies récurrentes provoquées par l’émergence de variants, d’un accès inégal aux traitements contre la COVID-19, de taux de vaccination inadéquats et de populations à haut risque non vaccinées. Il est donc impératif de développer des solutions antivirales spécifiques et abordables pour contrôler et prévenir de futures pandémies. Les plantes exposées à des facteurs de stress abiotiques et à de nouveaux environnements représentent une vaste source de composés bioactifs. Dans ce projet, nous avons étudié le potentiel antiviral in vitro contre différents coronavirus de plantes halophytes et invasives récoltées dans le nord de la France.Dans la première partie du projet, des halophytes strictes et d’autres relativement tolérantes au sel poussant sur le littoral du nord de la France ont été sélectionnées et testées pour leur activité antivirale in vitro contre différents coronavirus. L'espèce végétale la plus active, Hippophae rhamnoides L. (Eléagnacées), a subi un fractionnement bioguidé pour identifier les composés actifs. Six composés ont été isolés des trois fractions les plus actives par HPLC préparative et ont été identifiés par HRMS et RMN mono- et bidimensionnelle comme étant des triterpènes substitués par des dérivés d’acide cinnamique. Les tests d'infection ont démontré une inhibition dose-dépendante de ces triterpènes contre le HCoV-229E et le SARS-CoV-2, mettant notamment en évidence leur activité contre les deux virus.Dans la deuxième partie du projet, le potentiel antiviral contre les coronavirus de Senecio inaequidens (Asteraceae), une espèce végétale envahissante, a été exploré. Six composés purifiés par CPC et CLHP préparative ont été identifiés comme étant des dérivés de sesquiterpènes. Ils ont présenté un effet inhibiteur dose-dépendant sur le HCoV-229E, et quatre d'entre eux se sont montrés également actifs contre le SARS-CoV-2.Nos résultats suggèrent que Hippophae rhamnoides et Senecio inaequidens pourraient représenter des sources potentielles d’agents antiviraux contre les coronavirus humainsCoronaviruses are responsible for mild to severe respiratory tract illnesses in humans. Despite significant advancements in understanding coronavirus pathology and clinical management, these viral diseases remain a public health concern due to recurrent outbreaks driven by the emergence of variants, unequal access to COVID-19 treatments, inadequate vaccination rates and untreated high-risk populations. Thus, it is imperative to proactively develop specific and affordable antiviral solutions to control and prevent future pandemics. Plants exposed to abiotic stress factors and new environments represent a vast source of bioactive compounds. In this project, we investigated the antiviral potential in vitro of different halophytes, less salt-tolerant plants and invasive plants collected in the North of France against different coronaviruses.In the first part of the project, a variety of strictly halophytes and relatively salt-tolerant plants growing on the coastline in northern France were screened for their in vitro antiviral activity against different coronaviruses. The most active plant species, Hippophae rhamnoides L. (Eleagnaceae), underwent bioguided fractionation to identify active natural products. Six compounds were isolated from the three most active fractions using preparative HPLC and were identified as cinnamoyl triterpenoids through HRMS and mono- and bi-dimensional NMR. Infection tests demonstrated a dose-dependent inhibition of these triterpenes against HCoV-229E and SARS-CoV-2, notably highlighting their activity against both viruses.In the second part of the project, the antiviral potential against coronaviruses of Senecio inaequidens (Asteraceae), an invasive plant species, was explored. Six compounds purified by CPC and preparative HPLC were identified as sesquiterpenoid derivatives. They displayed a dose-dependent inhibitory effect on HCoV-229E and four of them also exhibited inhibition against SARS-CoV-2.Our findings suggest that Hippophae rhamnoides and Senecio inaequidens could represent potential sources of antiviral agents against human coronaviruses
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ledroit, Véronique. "Recherche de principes actifs antitumoraux extraits de spongiaires : sélection par criblage à haut débit." Toulouse 3, 2002. http://www.theses.fr/2002TOU30249.
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Baudoin, R. "Développement et caractérisation d'une puce à cellules pour le criblage d'agents toxiques." Phd thesis, Université de Technologie de Compiègne, 2008. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00342342.
Abstract:
Les développements actuels liés à l'ingénierie tissulaire et aux microtechnologies permettent aujourd'hui de proposer de nouveaux outils de criblages in vitro pour les études de toxicité. Nous proposons de développer une biopuce à cellules mimant un organe in vitro. Afin de valider notre approche, nous présentons l'influence du microenvironnement sur la culture de lignées cellulaires rénales (MDCK) et hépatiques (HepG2/C3A). Dans cette étude, nous avons testé trois débits (0, 10 et 25 µL/min) et trois ensemencements cellulaires. Enfin, nous avons soumis notre biopuce à trois chargements de chlorure d'ammonium (0, 5 et 10 mM) afin de démontrer le potentiel de ce modèle pour de futures applications liées à la toxicité. L'activité cellulaire en biopuce a été suivie par la prolifération des cellules, les consommations de glucose et de glutamine, les productions d'albumine et d'ammoniac et enfin, par l'activité enzymatique de détoxification des CYP 1A.
En condition dynamique, il a été observé une augmentation des consommations et des productions cellulaires au regard des conditions statiques. L'activité de détoxification des CYP 1A a été également accrue. En présence du chlorure d'ammonium les réponses cellulaires furent similaires en biopuce au regard des conditions de culture standard en Pétri. De plus, le chlorure d'ammonium a semblé induire l'activité des CYP 1A en biopuce.
Par cette étude, nous montrons la pertinence de notre biopuce pour des tests de toxicité in vitro en condition dynamique. Ce nouveau modèle de culture cellulaire in vitro pourra à terme être applicable aux études de criblages dans les industries chimiques, pharmaceutiques et cosmétiques.
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Asses, Yasmine. "Conception par modélisation et criblage in silico d'inhibiteurs du récepteur c-Met." Phd thesis, Université Henri Poincaré - Nancy I, 2011. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00653609.
Abstract:
L'enjeu des travaux effectués au cours de cette thèse est l'extraction in silico de molécules potentiellement intéressantes dans le processus d'inhibition du récepteur tyrosine kinase c-Met. La faculté de cette protéine à interagir dans les phénomènes d'embryogenèse et de réparation tissulaires rendent son inhibition cruciale dans les traitements contre les développements tumoraux où c-Met se trouve impliquée. Dans ce but, la stratégie que nous avons employée implique l'utilisation de plusieurs méthodes in silico de conception rationnelle de médicaments. Nous avons utilisé comme support les multiples structures cristallographiques publiées sur la ProteinData Base (PDB). Un travail de modélisation par homologie fut tout d'abord nécessaire pour combler les lacunes des structures cristallographiques collectées. Afin d'échantillonner au mieux l'espace conformationnel du récepteur kinase c-Met et de caractériser sa flexibilité, une longue campagne de simulation de Dynamique Moléculaire (DM) fut menée concernant les formes apo et holo des structures cristallographiques disponibles. Pour compléter ces simulations, une partie du travail consista à utiliser également la méthode des modes normaux de vibration (NM). De ces 2 approches (DM et NM), nous avons extrait un ensemble de 10 conformères considérés comme les plus représentatifs de l'espace conformationnel simulé pour la kinase c-Met et avons proposé un mode de fonctionnement de ce récepteur. Utilisant les conformations extraites de l'échantillonnage conformationnel, nous avons ensuite mené une importante campagne de criblage virtuel sur plusieurs chimiothèques constituant au total environ 70.000 composés. L'analyse des résultats de l'arrimage moléculaire nous a conduits à la sélection de plusieurs molécules intéressantes possédant théoriquement une bonne affinité pour la kinase c-Met. Ces molécules ont été soumises aux tests expérimentaux effectués par l'équipe de biologistes associée à nos travaux.
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Ceccaldi, Alexandre. "Conception d'un criblage d'inhibiteurs des méthyltransférases d'ADN : vers de nouveaux modulateurs épigénétiques." Paris 6, 2011. http://www.theses.fr/2011PA066250.
Abstract:
L’épigénétique étudie les flux d’information cellulaires réversibles et transmissibles, qui ne sont pas directement codés par la séquence de l’ADN. Les principales régulations épigénétiques sont la méthylation de l’ADN, les modifications des histones, la dynamique de la chromatine et les ARN non codant. Elles sont impliquées depuis la gamétogénèse jusqu’à la cognition, en passant par l’empreinte parentale, la différenciation, etc. La dérégulation épigénétique est un trait commun à tous les cancers. On observe dans les tumeurs une hypométhylation globale du génome induisant une instabilité et une hyperméthylation spécifique des gènes suppresseurs de tumeurs qui favorise la progression de la maladie. Les inhibiteurs des méthyltransférases d’ADN (DNMTi) forment une nouvelle classe de grand intérêt, pour leur capacité à reprogrammer les cellules tumorales. Mais leur instabilité chimique et leur toxicité limitent leur usage clinique. Afin de développer des modulateurs épigénétiques plus puissants et plus spécifiques, nous avons conçu un test de criblage innovant de DNMTi à moyen/haut-débit, basé sur la détection d’un signal de fluorescence. Après validation de la méthode sur une collection orientée de dérivés de flavones et flavanones qui se sont révélés plus actifs que les molécules de la littérature sur le complexe catalytique Dnmt3A/3L et ont présenté une activité spécifique sur le développement du poisson-zèbre, nous avons réalisé un criblage manuel (1200 molécules, 5,3% de hits) et un criblage automatisé (4600 molécules, 4% de hits). De nouvelles familles de DNMTi prometteuses ont pu être ainsi découvertes, pour lesquelles des relations structure-activité ont été menées
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Sperandio, Olivier. "Applications et développements informatiques de protocoles de drug design et criblage virtuel." Paris 5, 2007. http://www.theses.fr/2007PA05P612.
Abstract:
Cette thèse de chemoinformatique et bioinformatique structurale s’inscrit dans l’optimisation du processus d’identification de molécules à visée thérapeutique. Elle cible les trois composantes du criblage virtuel de composés chimiques : la préparation d’une version informatique de la chimiothèque ; l’identification de nouveaux composés par similarité avec des ligands actifs (LBVS) ; et l’identification de nouveaux composés actifs à partir de la structure 3D de la cible (SBVS). Ces travaux ont consisté à : créer un programme (MED-3DMC) de génération d’ensembles de conformères 3D de petites molécules; créer un programme LBVS (MED-SuMoLig) qui permet, à partir d’un ligand actif, de cribler une chimiothèque de plusieurs milliers de composés sur la base de leur profil pharmaco-topologique; et enfin appliquer des protocoles de criblage virtuel SBVS hiérarchique afin d’identifier des inhibiteurs d’interaction protéine-membrane avec le facteur Va de la coagulation comme preuve du conceptThis thesis in structural bioinformatics and chemoinformatics concentrates on the optimization of the therapeutics compounds identification process. It relies on the three main components of the chemical compounds virtual screening: preparation of a computational version of the chemical library to be screened; identification of novel active compounds using chemical similarity with respect to known active molecules (LBVS); and identification of novel active compounds using the 3D structure of the target binding site (SBVS). This work implied: to develop a computer program (MED-3DMC) that generates conformation ensembles of small molecules ; then to create a LBVS program (MED-SuMoLig) that can screen thousands of chemical compounds using their pharmaco-topological profile; and finally to use a hierarchical SBVS procedure to identify novel inhibitors for protein-membrane interaction using the coagulation factor Va as a proof of concept
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Amine, Chloe. "Millifluidique à gouttes : un outil pour le criblage des interactions entre biopolymères." Thesis, Nantes, 2017. http://www.theses.fr/2017NANT4120.
Abstract:
Les séparations de phase liquide-liquide entre biopolymères dépendent largement des conditions physico-chimiques du milieu. La coacervation complexe, cas spécifique de séparation de phase liquide-liquide, résulte d'interactions attractives entre deux biopolymères de charges opposées. L'identification des conditions spécifiques d'interactions, qui passe par l'établissement d'un diagramme de phase, est un prérequis indispensable pour aller vers une meilleure compréhension de la séparation de phase et le développement de nouvelles applications tirant profit de ce processus. Cette étape, fastidieuse, requiert toutefois une quantité de matières premières importante, pas toujours disponible et parfois onéreuse. Pour pallier à ces inconvénients, un outil miniaturisé, basé sur l'utilisation de la millifluidique à gouttes, a été développé au cours de ce travail de thèse. L'efficacité de cette approche a été validée à travers l'utilisation d'un couple de protéine et de polysaccharide connu pour être sujet au phénomène de coacervation complexe : le couple ß-lactoglobuline/Gomme Arabique. Ce dispositif millifluidique a ensuite été intégré, dans une approche multi-technique, à l'étude d'un nouveau couple de protéine et de polysaccharide, le couple Napine/Pectine. Le dispositif proposé, basé sur des procédés de fabrication simples et adaptables à tout laboratoire, se positionne comme une alternative efficace aux approches conventionnelles utilisées pour le criblage des interactions. li permet de réaliser une cartographie rapide et peu consommatrice de matières premières d'un système donné pour aller ensuite vers une meilleure compréhension des mécanismes de séparation de phaseLiquid-liquid phase separation of aqueous biopolymers mixtures has been shown to strongly depend on various physico-chemical parameters. One sub-type of liquidliquid phase separation is known as complex coacervation and is primarily driven by attractive electrostatic interactions among two oppositely charged biopolymers. Understanding and characterizing specific conditions and factors leading to phase separated systems is an essential preliminary step in the further development of high values products that take advantage of such phenomenon. However, these screening studies, usually performed in bulk, are highly time consuming and require large quantities of raw materials not always available and sometimes expensive. The aim of this work was to develop a low material consuming droplets-based millifluidic device for the rapid screening of biopolymers interactions. The efficiency of the millifluidic device was demonstrated using a well-known case study of complex coacervation made of a protein-polysaccharide mixture, the ßlactoglobulin/ Gum Arabic mixture. This millifluidic device was then integrated in a multi-technics approach to study a second protein-polysaccharide mixture made of Napin and Pectin. The proposed millifluidic device is easy to implement and is therefore accessible to many laboratories. lt provides a low material consuming approach for rapid screening of biopolymers interactions, which is a prerequisite in the study of phase separation mechanisms
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LEGENDRE, FREDERIC. "Recherche de microorganismes producteurs d'herbicides : criblage, production, purification et identification des produits." Toulouse 3, 1989. http://www.theses.fr/1989TOU30144.
Abstract:
Un test de criblage rapide, simple et selectif a ete mis au point permettant la detection de microorganismes de l'ordre des actinomycetales producteurs de substances herbicides. L'application de ce crible a une collection d'environ 6700 souches a permis l'isolement de 33 d'entre elles presentant les activites recherchees. L'analyse biologique et chimique des produits d'une souche a montre que celle-ci produisait principalement la nigericine et la geldanamycine dont les activites phytotoxiques etaient connues. Cependant, quatre produits proches structuralement de la geldanamycine ont egalement ete purifies et caracterises. Ces antibiotiques n'avaient jamais ete isoles de mout de fermentation et leur activite herbicide n'etait pas connue. Une autre souche de streptomyces presentant une activite herbicide originale a ete particulierement etudiee. Une etude taxonomique a montre qu'elle appartenait a l'espece griseoaurantiacus. La purification du metabolite responsable de l'activite herbicide, a partir de cultures liquides en fermenteur a permis l'etude structurale de cette molecule. Il s'agit d'un compose original n'appartenant pas aux familles chimiques d'antibiotiques connues pour leur phytotoxicite. Ce produit qui ne presente aucune activite antimicrobienne est un herbicide de contact dont le spectre d'activite est principalement limite aux plantes dicotyledones. Des composes hemisynthetiques de cette molecule ont ete synthetises pour mieux cerner les relations structure-activite de ce produit nouveau et pallier son instabilite
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Vézina-Dawod, Simon. "Design, synthèse et criblage de chimiothèques peptidomimétiques pour la découverte d'agents antinéoplasiques." Doctoral thesis, Université Laval, 2018. http://hdl.handle.net/20.500.11794/28267.
Abstract:
Le criblage des interactions protéine-protéine représente une approche thérapeutique prometteuse et novatrice qui est encore sous-exploitées par l’industrie pharmaceutique et la recherche biomédicale. Par contre, la nature étendue de la surface d’interaction complique le développement d’inhibiteurs par les méthodes classiques de criblage avec des chimiothèques de petites molécules. En effet, l’espace chimique couvert par les structures moléculaires retrouvées au sein des chimiothèques disponibles est peu adapté à la réalité des interactions protéine-protéine. Dans le but de développer des structures privilégiées et mieux adaptées, le chimiste médicinal doit comprendre la nature de ces interactions et s’éloigner du dogme traditionnel des molécules dites « drug-like ». Les peptides sont d’excellents candidats pour inhiber et étudier ces interactions, mais leur faible perméabilité membranaire et leur sensibilité aux protéases limitent leur utilisation in vivo. Le peptidomimétisme devient alors un concept plus que pertinent pour combiner la sélectivité et l’efficacité d’interaction des peptides avec la biodisponibilité et la stabilité métabolique des molécules organiques. De nombreuses plateformes peptidomimétiques sont disponibles ou en émergence mais plusieurs défis de taille se présentent à l’horizon. En effet, l’incorporation d’une grande diversité moléculaire et l’adaptation de ces plateformes avec les méthodes de criblage biologique à haut débit ne sont que quelques exemples des défis auxquels les chimistes et biochimistes devront répondre. Cet ouvrage présente des travaux qui ont portés sur le développement et l’exploitation de diversités moléculaires peptidomimétiques de nature diverse, tant macrocyclique qu’hétérocyclique. Dans un premier temps, diverses méthodologies de synthèse novatrices ont été développées pour étendre la diversité moléculaire accessible des peptoïdes et pour permettre le criblage à haut débit de peptoïdes cycliques selon l’approche combinatoire «one-bead-one-compound». Dans un deuxième temps, la méthodologie de synthèse Ugi-deFmoc-SNAr a été développée pour permettre la synthèse rapide et efficace de benzo-1,4-diazépin-3-ones hautement diversifiées. C’est grâce à cette méthodologie qu’une chimiothèque de première génération a pu être produite et criblée sur des lignées cellulaires du cancer de l’ovaire, de la prostate et du pancréas. Un composé a d’ailleurs été identifié pour son activité antiproliférative in vitro et son activité antitumorale in vivo. Ces différents travaux répondent au même but : exploiter des structures privilégiées pour découvrir de nouveaux modulateurs d’interaction protéine-protéine ou simplement des agents bioactifs novateurs avec des propriétés pharmacologiques prometteuses.Targeting protein-protein interactions represents an innovative and under-exploited therapeutic approach by the pharmaceutical industry and biomedical research. Because of their physicochemical nature, protein-protein interactions represent a major challenge for conventional screening methods with small molecule libraries. Indeed, the chemical space covered by the molecular structures found in the available libraries is poorly adapted to the reality of protein-protein interactions. In order to develop privileged and better adapted structures, the medicinal chemist must understand the nature of these interactions and move away from the traditional dogma of the so-called drug-like molecules. Peptides are excellent candidates for studying these interactions, nevertheless their pharmacological properties are generally disappointing in vivo. Peptidomimetism is then a more than relevant concept to combine the selectivity and efficiency of interaction against proteins with the concepts of bioavailability and metabolic stability. Many peptidomimetic platforms are available or emerging, and several major challenges are on the horizon. Indeed, the incorporation of a large molecular diversity and the adaptation of these platforms with the high throughput biological screening methods are only a few examples of the challenges that chemists and biochemists will have to meet. This work deals with the development and exploitation of different peptidomimetic molecular diversities, either macrocyclic or heterocyclic, but which serve the same purpose: to exploit privileged structures to discover new modulators of protein-protein interactions or simply innovative bioactive agents with advantageous pharmacological properties.
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Boussouar, Amina. "Effet de position télomérique et criblage moléculaire : vers de nouvelles cibles télomériques." Lyon, Ecole normale supérieure, 2010. http://www.theses.fr/2010ENSL0597.
Abstract:
Notre laboratoire s’intéresse depuis de nombreuses années à l’implication des télomères en pathologie humaine. Les télomères sont des structures nucléoprotéiques présentes aux extrémités des chromosomes. Ils jouent un rôle important dans le bon fonctionnement et la durée de vie des cellules, et ils nécessitent, de ce fait, une régulation et une protection stricte. De plus, dans différents organismes, les télomères sont associés à la répression des gènes proximaux. Ce phénomène épigénétique appelé effet de position télomérique (TPE) implique la propagation d’une structure chromatinienne répressive. Très étudié chez S. Cerevisiae, cet effet a aussi été démontré chez l’homme et dépend de protéines télomériques et de remodelages chromatiniens. Ainsi, le traitement des cellules humaines par des agents modifiant l’architecture chromatinienne tels que l’inhibiteur des histones déacetylases, la Trichostatine A, permet de lever le TPE et d’induire l’expression d’un gène en position subtélomérique. En revanche, la 5-aza-2’-deoxycytidine, un inhibiteur de la méthylation de l’ADN, n’abroge pas ce type de silencing suggérant l’implication de modifications spécifiques de ces régions dont l’organisation nucléosomale est particulière. Afin d’identifier de nouveaux composant chimiques capables d’inhiber les effets de position télomériques dans les cellules humaines, nous avons effectué le criblage d’une banque de molécules bioactives «Prestwick Chemical Library » sur la plateforme du Centre pour les Molécules Bioactives (CMBA) au CEA de Grenoble. Les criblages primaires et secondaires de cette chimiothèque ont permis à nos collaborateurs de nous livrer une liste de 15 touches confirmées, inhibitrices de la répression transcriptionnelle dépendante des télomères et observée expérimentalement grâce au gène rapporteur de la luciférase. Après avoir testé l’ensemble de ces molécules dans notre laboratoire, deux polyphénols (Acacetine et Chrysine) étaient capables de lever spécifiquement le TPE sans modifier l’expression du gène rapporteur placé hors contrôle télomérique. Nous nous sommes dès lors demandé à quel niveau ces deux molécules agissent sur le TPE (raccourcissement ou prolongement des tailles des télomères, perte ou gain de protéines associées aux télomères et/ou création ou pas d’un dysfonctionnement télomérique). L’ensemble de ces analyses a montré que le traitement des cellules humaines avec ces deux molécules est accompagné par un raccourcissement de la taille des télomères, un dysfonctionnement télomérique et la création de fusion entre chromatides sœurs. La découverte de ces molécules ouvre de nouvelles perspectives sur le traitement des maladies associées à des mécanismes télomériques, le cancer mais aussi des maladies rares comme la dystrophie facio-scapulo-Humérale, dont nous avons parallèlement étudié les mécanismes moléculairesTelomeres are protective structures present at the ends of linear chromosomes and consist of simple repeated DNA sequences and specialized proteins. They are essential for the stable maintenance of eukaryotic chromosomes and they can regulate the lifespan of cells. In addition to their essential functions, telomeres are, in diverse organisms, specialized sites with regard to gene expression. Indeed, the transcription of genes located next to telomeres is repressed: this phenomenon was termed telomere position effect (TPE). As observed in the yeast, S. Cerevisiae -where TPE is best characterized- TPE in human cells depends of both telomere length and architecture. The treatment of cells with Trichostatin A, an inhibitor of class I and II histone deacetylases antagonizes TPE while treating the cells with 5-aza-2’-deoxycytidin, a demethylating agent, has no apparent effect on telomeric repression. Overall, position effects at human chromosome ends are dependent on a specific higher-order organization of the telomeric chromatin. In order to identify new molecules able to modulate TPE in human cells, we carried out the screening of the «Prestwick Chemical Library », a bank of bioactive molecules, on the CMBA-CEA platform in Grenoble. A total of 15 molecules were identified as anti-TPE factors after primary and secondary screening based on the increase in fluorescence measurement. After testing all of these molecules in our laboratory, two polyphenols, Acacetin and Chrysin, were retained as potent inhibitors of TPE and further characterized as drugs targeting telomeres specifically. We then asked whether TPE reversal was dependent on telomere length. The incubation in the presence of Acacetin and Chrysin affects telomere length suggesting that increased expression of the subtelomeric reporters is associated with a shortening of telomeres. To check whether these molecules revert telomeric silencing, by affecting telomere integrity, we analyzed chromosome stability in cells treated with Acacetin or Chrysin. The two molecules exhibit a rapid increase in the frequency of telomere induced DNA damage foci, suggesting that these drugs trigger telomeric dysfunction. Drug treatment also significantly increases the frequency of telomeric abnormalities observed in metaphase with a significant increase of end-to-end fusions between sisters chromatid. The discovery of these new compounds targeting specifically chromosome ends opens new avenue for the targeted treatment of diseases linked to telomeric pathways such as cancer but also rare diseases such as Facio-Scapulo-Humeral dystrophy for which we investigated the molecular mechanisms
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Rozié, Alexandrine. "Criblage de petites molécules d'intérêt thérapeutique et recherche de leur mécanisme d'action." Thesis, Toulouse 3, 2020. http://www.theses.fr/2020TOU30246.
Abstract:
L'identification du mécanisme d'action de petites molécules bioactives permet i) de révéler des cibles pharmacologiques inattendues, contre lesquelles pourront être développées de nouvelles molécules thérapeutiques, ii) de découvrir des modes d'actions originaux qui pourront inspirer le développement de nouveaux médicaments et iii) de développer des biomarqueurs de la réponse à ces traitements. L'objectif de ma thèse était d'appliquer plusieurs approches d'identification de cibles à des petites molécules, soit nouvelles, issues d'un crible phénotypique, soit déjà connues mais dont le mécanisme d'action n'était pas identifié. Dans un premier volet de mes travaux, un crible phénotypique a été développé afin d'identifier dans la Chimiothèque Nationale Essentielle de nouveaux sensibilisateurs au prototype d'une famille d'agent anticancéreux endommageant l'ADN, la camptothécine (CPT). La CPT est un poison de la topoisomérase I, inducteur d'un type particulier de cassures double-brin de l'ADN (CDB) associées aux fourches de réplication. Ce crible a conduit à l'identification d'un nouveau sensibilisateur que nous avons nommé Shuri1. Nous avons établi que Shuri1 induit en soi des CDB sélectivement dans les cellules en réplication. Nous avons démontré que Shuri1 se comporte comme un inhibiteur de la protéine kinase CHK1 impliquée dans la signalisation des dommages de l'ADN. De fait, certaines mutations conférant la résistance à un inhibiteur spécifique de CHK1 confèrent également la résistance à Shuri1. Dans un deuxième volet de cette thèse, nous avons étudié le mécanisme d'action de la Jaspine B, une molécule naturelle issue d'éponges marines et qui présente une forte cytotoxicité contre différentes lignées cellulaires tumorales solides humaines. Précédemment, plusieurs mécanismes ont été proposés pour la Jaspine B, mais aucun ne rend compte de l'ensemble des effets cellulaires de cette molécule. En collaboration avec l'équipe d'Yves Génisson du SPCMIB de Toulouse, un analogue "clickable" de la Jaspine B a été synthétisé et a permis de la localiser par microscopie dans la cellule sous la forme d'agrégats au niveau du réticulum endoplasmique (RE). En utilisant la lipidomique, la génomique fonctionnelle et l'imagerie en temps réel, nous avons établi un modèle du mécanisme d'action de la Jaspine B dans des cellules cancéreuses. Nos travaux montrent que la Jaspine B se comporte comme une prodrogue qui est bioactivée par une des céramides synthases, enzymes impliquées dans la biosynthèse des céramides. La Jaspine B N-Acylée ainsi produite au niveau du RE s'accumule sous forme d'agrégats responsables de la perméabilisation du RE et de la cellule qui conduit à la mort cellulaire. Nous avons montré que ce mécanisme explique également les effets cytotoxiques d'un autre lipide issu des éponges marinesThe identification of the mechanism of action of small bioactive molecules allows (i) to reveal unexpected pharmacological targets against which new therapeutic molecules that can be developed, (ii) to discover original modes of action that can inspire the development of new drugs, and (iii) to develop biomarkers of response to these treatments. The objective of my thesis was to apply several target identification approaches to small molecules, either new, from a phenotypic screen, or already known but the mechanism of action of which was not identified. In a first part of my work, a phenotypic screen was developed in order to identify in the " Chimiothèque Nationale Essentielle ", new sensitizers to the prototype of a family of DNA-damaging anti-cancer agents, camptothecin (CPT). CPT is a poison of topoisomerase I, inducing a particular type of double-strand DNA breaks (DSB) associated with replication forks. This screen led to the identification of a new sensitizer that we named Shuri1. We have established that Shuri1 induces DSB selectively in replicating cells. We demonstrated that Shuri1 behaves as an inhibitor of the CHK1 protein kinase involved in the signaling of DNA damage. Accordingly, some mutations conferring resistance to a specific CHK1 inhibitor also confer resistance to Shuri1. In a second part of my thesis, I studied the mechanism of action of Jaspine B, a natural molecule derived from marine sponges that exhibits strong cytotoxicity against different human solid tumor cell lines. Previously, several mechanisms have been proposed for Jaspine B, but none accounts for the cellular effects of this molecule. In collaboration with Yves Génisson's team at the SPCMIB in Toulouse, a clickable analogue of jaspine B was synthesized and was localized by cell microscopy as aggregates at the endoplasmic reticulum (ER). Using lipidomics, functional genomics and real-time imaging, we have established a model of the Jaspine B mechanism of action in cancer cells. My work supports that Jaspine B behaves as a prodrug that is bioactivated by one of the ceramide synthases, enzymes involved in ceramide biosynthesis. The N-Acylated Jaspine B thus produced at the ER accumulates as aggregates responsible for the permeabilization of the ER and of the cell leading to cell death. We further established that this mechanism also explains the cytotoxic effects of another lipid produced by marine sponges