Academic literature on the topic 'Criblage ciblé'

L’avènement de la biologie moléculaire et l’achèvement du séquençage du génome humain ont conduit l’industrie pharmaceutique à progressivement implémenter des approches dites cible-centriques pour identifier les candidats médicaments. Cependant, la faible productivité de la recherche et du développement en ce début de millénaire, combinée aux évolutions technologiques dans des domaines tels que l’ingénierie cellulaire, le criblage à haut contenu, la robotique, l’analyse d’images et l’intelligence artificielle, ont nourri un fort regain d’intérêt pour les approches phénotypiques. De plus en plus fréquemment, les approches cible-centriques et phénotypiques sont considérées de façon complémentaire, positionnant ainsi les techniques de déconvolution de cible sur le chemin critique de la découverte et du développement de médicaments. Cette revue analyse l’évolution des approches cible-centriques versus phénotypiques, en se focalisant plus particulièrement sur le criblage à haut contenu et les différentes techniques de déconvolution de cible aujourd’hui disponibles.

Alors que, pour la plupart, les médicaments actuels sont de petites molécules inhibant l’action d’une protéine en bloquant un site d’interaction, la dégradation ciblée des protéines, découverte il y a une vingtaine d’années via les petites molécules PROTAC, connaît aujourd’hui un très grand développement, aussi bien au niveau universitaire qu’industriel. Cette dégradation ciblée permet de contrôler la concentration intracellulaire d’une protéine spécifique comme peuvent le faire les techniques basées sur les acides nucléiques (oligonucléotides antisens, ARNsi, CRISPR-Cas9). Les molécules PROTAC sont des chimères hétéro-bifonctionnelles capables de lier simultanément une protéine spécifique devant être dégradée et une E3 ubiquitine ligase. Les PROTAC sont donc capables de provoquer l’ubiquitinylation de la protéine ciblée et sa dégradation par le protéasome 26S. De nature peptidique, puis non peptidique, les PROTAC sont maintenant administrables par voie orale. Ce détournement du système ubiquitine protéasome permet aux molécules PROTAC d’élargir considérablement le champ des applications thérapeutiques puisque l’élimination de protéines dépourvues de poches ou de crevasses bien définies, dites difficiles à cibler, devient possible. Cette technologie versatile a conduit à la dégradation d’une grande variété de protéines comme des facteurs de transcription, des sérine/thréonine/tyrosine kinases, des protéines de structure, des protéines cytosoliques, des lecteurs épigénétiques. Certaines ligases telles que VHL, MDM2, cereblon et IAP sont couramment utilisées pour être recrutées par les PROTAC. Actuellement, le nombre de ligases pouvant être utilisées ainsi que la nature des protéines dégradées sont en constante augmentation. Deux PROTAC sont en étude clinique pour les cancers du sein (ARV471) et de la prostate (ARV110). La dégradation spécifique d’une protéine par le protéasome peut aussi être induite par d’autres types de molécules synthétiques : colles moléculaires, marqueurs hydrophobes, HaloPROTAC, homo-PROTAC. D’autres constituants cellulaires sont aussi éligibles à une dégradation induite : ARN-PROTAC pour les protéines se liant à l’ARN et RIBOTAC pour la dégradation de l’ARN lui-même comme celui du SARS-CoV-2. Des dégradations induites en dehors du protéasome sont aussi connues : LYTAC, pour des chimères détournant la dégradation de protéines extracellulaires vers les lysosomes, et MADTAC, pour des chimères détournant la dégradation par macroautophagie. Plusieurs techniques, en particulier des plates-formes de criblage, la modélisation mathématique et la conception computationnelle sont utilisées pour le développement de nouveaux PROTAC efficaces.

La pollution de l'environnement par de multiples composés organiques en lien avec les activités humaines est un problème récurrent. Des compartiments environnementaux font l'objet de surveillance continue comme les eaux de surface et d'alimentation humaine et l'air extérieur et intérieur. En revanche, les sols agricoles ne sont contrôlés que dans le cadre de l'épandage d'amendements organiques susceptibles de contenir des hydrocarbures aromatiques polycycliques et des polychlorobiphényles. Des travaux de recherche sont réalisés depuis plusieurs années pour évaluer le devenir des polluants organiques dans les sols agricoles en utilisant des méthodes d'analyse de plus en plus performantes et sensibles grâce à l'essor des couplages de chromatographie en phase gazeuse ou liquide avec des spectromètres de masse quadripolaires à basse résolution. Toutefois, les diverses méthodes développées ne permettent d'analyser que quelques dizaines de molécules organiques. Aussi, la surveillance de matrices environnementales nécessite de faire des choix et ne permet pas d'avoir une vision très large des divers polluants organiques présents.L'objectif des travaux de cette thèse est de proposer une stratégie méthodologique afin d'approcher la composition organique des sols par un criblage ciblé et non ciblé. Le développement méthodologique réalisé en analyse non ciblée peut contribuer à la réflexion sur les modalités du suivi de la qualité des sols en France. L'analyse non ciblée peut permettre d'orienter l'analyse ciblée vers une sélection de composés organiques d'intérêt et de mettre en évidence des marqueurs environnementaux.Le rapport de thèse comporte le développement de méthodes d'analyse dans les sols d'une sélection de produits phytopharmaceutiques, de médicaments et d'hormones extraits à l'aide de l'extraction liquide sous pression (PLE) et du dosage par la chromatographie liquide couplée à un spectromètre de masse quadripolaire à haute résolution et à temps de vol (LC-QTOF-MS). La méthode d'analyse ciblée a été validée pour les produits phytopharmaceutiques dans les sols et appliquée à une sélection de 40 sols agricoles français de la région Centre - Val de Loire. Des analyses non ciblées ont également été réalisées pour ces 40 sols par LC-QTOF-MS après deux extractions PLE, l'une à l'acétonitrile et l'autre à l'eau ultrapure. Chaque extrait de sol a été injecté de manière séquentielle en ionisation positive puis négative selon deux paramétrages en masse, l'un en Full scan MS et bbCID MS (suspect screening) et l'autre en Full scan MS et auto MS/MS (non-target screening ou NTS). Le jeu de données final est alors très conséquent avec 8 données différentes pour chaque échantillon de sol dont 4 exploitables en mode suspect et 4 autres en mode NTS. L'analyse non ciblée en mode suspect a permis de détecter et d'identifier 825 composés organiques à l'aide de la base de données TargetScreener adossée au LC-QTOF-MS. Un classement de ces composés selon la valeur de critères de qualité d'identification a pu être établi et a permis une priorisation d'étude de quelques dizaines de composés d'intérêt. L'analyse non ciblée en mode NTS a été exploitée pour les extraits « acétonitrile » ionisés en positif et négatif à l'aide du logiciel chimiométrique Metaboscape utilisant de multiples bases de données indépendantes de l'outil d'analyse. L'identification a pu être confirmée ou renforcée en mode NTS pour des composés organiques déjà identifiés en mode suspect. La répartition des 40 sols en groupes d'échantillons d'usage agricole homogène a permis de mettre en évidence la présence de produits phytopharmaceutiques exclusivement dans un groupe constituant ainsi un marqueur de groupe d'échantillons. Les travaux de la thèse ouvrent sur de nombreuses perspectives d'exploitation des données d'analyse non ciblée obtenues pour les 40 sols, d'études sur la qualité des sols français et de pharmacovigilance des sols représentatifs du territoire national français
The environmental pollution by multiple organic compounds linked to human activities is a recurring problem. Environmental compartments are subject to continuous monitoring such as surface and human supply waters and outdoor and indoor air. On the other hand, agricultural soils are only controlled in the case of the spreading of organic amendments, which could contain polyaromatic hydrocarbons and polychlorobiphenyls. Research work has been carried out for several years to assess the fate of organic pollutants in agricultural soils using more efficient and sensitive analysis methods increases to the development of quadrupole mass spectrometry coupled with gas or liquid chromatography. Nevertheless, many methods are used only to a selection of a few dozen organic molecules. In addition, the possible implementation of monitoring of organic pollutants in environmental matrices requires making choices and does not allow having a very broad knowledge about all the organic pollutants.The objective of this work is to propose a methodological strategy in order to approach the organic composition of soils by target and non-target screening analysis. The methodological development, carried out in non-target analysis, can contribute to the reflection of monitoring the quality of soils. Non-target analysis can make it possible to direct the target analysis towards a selection of organic compounds of interest and to determine environmental markers.The thesis report includes the development of target analysis methods in soils on a selection of pesticides, drugs and hormones extracted by pressurized-liquid extraction (PLE) and analysed by liquid chromatography coupled with a high-resolution time-of-flight quadrupole mass spectrometer (LC-QTOF-MS). The target analysis method has been validated for pesticides in agricultural soils, and applied to a selection of forty French agricultural soils from Centre-Val de Loire region. Non-target analyses were carried out too for these 40 soils by LC-QTOF-MS after two different PLE extractions, one with acetonitrile and the other with ultrapure water. Each soil extract was injected sequentially in positive, then negative ionization according to two mass settings, one in Full scan MS and bbCID MS (suspect screening) and the other one in Full scan MS and auto MS/MS (non-target screening or NTS). The final dataset is then very substantial with 8 different data for each soil sample, of which 4 used in suspect mode and 4 in NTS mode. 825 organic compounds were detected and identified by suspect screening analysis using the TargetScreener database backed by the LC-QTOF-MS. A classification of these compounds according to the value of identification quality criteria could be established and allowed a prioritization of the study of a few dozen compounds of interest. The non-target screening analysis was carried out for the « acetonitrile » soil extracts ionized by positive and negative modes using the Metaboscape chemometric software and by querying multiple databases independent of the analysis tool. The identification could be confirmed or reinforced in NTS mode for organic compounds already identified in suspect mode.The distribution of the 40 soils in groups of homogeneous agricultural use made it possible to highlight the presence of organic compounds exclusively in one group, thus constituting a sample group marker. The work of the thesis opens up many perspectives for the exploitation of non-target analysis data obtained for the 40 French agricultural soils, studies on the quality of French soils and pharmacovigilance of representative soils of the French national territory

Ces travaux mettent en avant le développement de méthodes analytiques afin d'évaluer l'Exposome selon différentes stratégies. Une méthode multirésidus sélective permettant l'analyse d'additifs plastiques et de leurs produits de dégradation pouvant être relargués par des emballages plastiques dans les boissons et les aliments, et ainsi être ingérés par l'Homme, a tout d'abord été mise au point. Cette méthode consiste en une extraction de type Stir Bar Sorptive Extraction sur des barreaux à base de dérivés de polydiméthylsiloxane des additifs plastiques ciblés, suivie d'une analyse par chromatographie liquide ultra-haute performance couplée à un spectromètre de masse en tandem de type triple quadripôle. Afin de détecter et quantifier une plus large gamme de contaminants entrant en contact avec l'Homme, une méthode de screening a été développée par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse haute résolution avec un instrument de type QqToF, à partir d'une matrice urinaire. La méthode de screening ciblé, validée selon les recommandations FDA, a permis de quantifier des contaminants appartenant à diverses familles dans l'urine, sans préparation préalable de l'échantillon, à des concentrations de l'ordre du ng/mL. Appliquée à des urines de volontaires, la méthode de screening non ciblé a permis d'émettre de nombreuses hypothèses d'identification de composés après fragmentation MS/MS. La mise en place de tels outils pour caractériser l'Exposome, associée à des études statistiques et bio-informatiques, contribueront grandement à la compréhension des relations de causalité entre les maladies humaines et les facteurs environnementaux
These research works highlight the development of analytical methods, based on mass spectrometry, to assess the Exposome according to different strategies. A selective multiresidue method for the analysis of plastic additives and their degradation products that may be released by plastic packaging in food and beverages and thus ingested by man was developed. This method consists of a Stir Bar Sorptive Extraction with bars covered by polydimethylsiloxane derivatives, followed by an analysis by liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry with a triple quadrupole instrument. To detect and quantify a wide range of contaminants in contact with man in daily routine, a screening method was developed by liquid chromatography coupled to high resolution mass spectrometry with a quadrupole-time-of-flight instrument from urinary matrix. The targeted screening method validated according to FDA guidelines allows the quantification of contaminants classified according to different families, in urine without sample preparation, at concentrations of the order of ng.mL-1. This method was applied to volunteers’ urine samples. The non-targeted screening method allows issuing numerous assumptions of compound identification after MS/MS fragmentation. The implementation of this tool to measure the Exposome associated with statistical studies, contribute greatly to the understanding of the causal relationships between diseases and environmental factors

L’identification d’antiviraux à large spectre est un des défis majeurs de la rechercheactuelle en virologie. Une des stratégies les plus prometteuses consiste à cibler une interactionvirus/hôte conservée. Ainsi, avec la technique d’AlphaScreen® et le modèle d’interactionprotéine VI de l’Adénovirus (AdV)/Nedd4-2, nous avons réalisé un criblage biochimique àhaut débit contre l’interaction virus/hôte [LP]PxY/Nedd4, commune à différentes familles devirus. Nous avons trouvé des candidats inhibiteurs issus d’une banque de composés approuvéspar les agences de santé. Nous les avons testés, caractérisés et validé leur effet antiviral surdeux familles de virus totalement différentes. Ainsi, les composés C9 (Sulconazole) et C4(Flunarizine) que nous avons identifiés diminuent la réplication de l’AdV, un virus à ADNenveloppé et du virus de Marburg, un virus à ARN, non enveloppé de la famille desFiloviridae. Ces résultats ont permis de valider l’interaction [LP]PxY/Nedd4 comme unecible idéale d’un antiviral à large spectre et de proposer un repositionnement de ces moléculesC9 et C4 comme antiviraux potentiels. Nous avons également synthétisé de nouvellesmolécules analogues du composé C9 et démontré qu’elles étaient tout aussi efficaces que lecomposé lui-même sur la réplication de l’AdV. Ces résultats nous ont permis de présenter laclasse des dérivés imidazolés comme structure de base pour l’élaboration de nouveauxantiviraux, potentiellement à large spectre
Broad-spectrum antiviral identification is considered as one of the major aims of theactual virology research and one strategy consists in targeting virus/host interaction. Using theAlphaScreen® technology and the adenoviral model protein VI/Nedd4-2, we performed highthroughputbiochemical screening targeting the [LP]PxY/Nedd4 interaction, a commoninteraction of different virus families. We identified candidate inhibitors from a librarycompound approved by health agencies. We tested, characterized and validated the antiviraleffect of those compounds on two very different virus families. Indeed, compounds C9(Sulconazole) and C4 (Flunarizine) decrease replication of the adenovirus, a DNA nonenvelopedvirus and the replication of the Marburg virus, an RNA enveloped virus from theFilovirus family. Taken together, those results permit us to validate the [LP]PxY/Nedd4interaction as good target for a broad spectrum antiviral and to propose the “repositioning” ofcompounds C4 and C9 as antivirals. Moreover, we have synthesized new analogues from C9showing similar effect on AdV replication compared to the original molecule (C9). Inconclusion, our work on developing new broad-spectrum antivirals highlights the possibilityto use imidazole derivatives as a new class of antiviral compounds

Afin de pallier l'apparition de souches pathogènes résistantes, de nouveaux traitements aux mécanismes d'action inédits doivent être découverts. Une de ces cibles d'intérêt grandissant est la synthèse de la structure coiffe chez les ARN messagers (ARNm) eucaryotes. Cette structure est l'une des modifications co-transcriptionnelles essentielles pour augmenter la demi-vie des ARNm, promouvoir leur export du noyau vers le cytoplasme et augmenter l'efficacité de leur traduction en protéines. La synthèse de la structure coiffe (m [indice supérieur 7] GpppARN) résulte de trois activités enzymatiques séquentielles qui ajoutent la structure m[indice supérieur 7] Gppp. Initialement, une ARN triphosphatase (RTase) hydrolyse le phosphate gamma de l'ARN. Une ARN guanylyltransférase (GTase) transfert ensuite sur cet ARN un groupement GMP à partir d'un GTP. Finalement, une ARN guanine-N7 méthyltransférase (N7-MTase) vient méthyler cette guanine en position N7. L'activité enzymatique de la GTase est déterminante pour la synthèse de la structure coiffe, ce qui en fait une cible potentiellement puissante afin d'inhiber la synthèse de la structure coiffe. Certaines études ont identifié des analogues de substrat et de produit, la ribavirine et le foscarnet respectivement, comme inhibiteur de GTase. Ces produits agissent sur les différentes GTases puisqu'elles possèdent un site actif très conservés au niveau de la coordination du substrat. Pour augmenter la spécificité des inhibiteurs, il serait avantageux d'identifier des composés ciblant les régions non conservées. Dans la présente étude, la technique du criblage virtuel a permis d'analyser le potentiel d'interaction des molécules à 80 % similaires au substrat naturel avec plusieurs structures de GTases. Parmi les interactions prédites identifiées par le criblage virtuel, une de ces molécules suscitait un intérêt particulier, puisqu'il s'agissait d'un composé utilisé chez l'humain en tant qu'antiviral et immunosuppresseur, l'acide mycophénolique (MPA). L'hypothèse initiale était que ce composé pouvait potentiellement interférer dans l'activité enzymatique des GTases. Pour valider cette prédiction, des essais biochimiques ciblant la réaction complète et les étapes intermédiaires de la GTase de la levure Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae ) ont été utilisées pour définir l'effet du MPA sur la cinétique de cette GTase. En effet, la réaction de GTase se déroule en deux temps : premièrement, une molécule de GTP est hydrolysée par l'enzyme pour former du GMP, lequel est lié de façon covalente à l'enzyme, et deuxièmement, cette molécule de GMP est transférée sur un ARN diphosphorylé. Ces essais ont confirmé l'interaction prédite par le criblage virtuel. En utilisant cette approche, nous démontrons que le MPA peut inhiber la réaction de GTase en prévenant le transfert catalytique du nucléotide GMP sur l'ARNm accepteur. En ce sens, le MPA représente un nouveau type d'inhibiteur d'ARN guanylyltransférase qui inhibe la deuxième étape de l'activité catalytique. Puisque les résultats laissaient présager une inhibition non compétitive, il fallait confirmer que le MPA n'était pas reconnu par l'enzyme comme substrat. Pour ce faire, la technique de l'électrophorèse par capillarité a montré que l'inhibiteur ne formait pas de lien covalent avec l'enzyme. De plus, nous démontrons qu'une culture de Saccharomyces cerevisiae qui croit en présence de MPA dénote une quantité moindre d'ARNm possédant une coiffe. Finalement, des essais biochimiques démontrent que le composé peut également inhiber des enzymes de la même famille que les GTases utilisant des substrats différents : les ligases à ADN. Le MPA inhibe la deuxième étape de la réaction enzymatique d'une ligase, soit le transfert du nucléotide sur l'oligonucléotide. Ce mémoire vise donc à présenter un aperçu du mécanisme d'inhibition de l'ARN guanylyltransférase par un composé allostérique. Nous montrons qu'il est possible de réduire la synthèse de la structure coiffe en affectant les changements conformationnels de cette enzyme.

Au cours des dernières années, le développement de nouvelles thérapies contre les infections bactériennes a suscité un grand intérêt face à l’émergence des nombreuses souches résistantes aux antibiotiques. Le point de départ de cette recherche de nouveaux antibiotiques, pour lesquels les bactéries n’ont pas encore acquis de mécanismes de résistance, est l’identification de nouvelles cibles cellulaires. En 2000, des études génétiques ont identifié engA, un gène bactérien dont le produit est une GTPase, comme une cible pharmacologique pertinente: elle est essentielle à la survie cellulaire, conservée au sein des bactéries et absente chez les eucaryotes.Puisque EngA agit comme un facteur d’assemblage pour le ribosome bactérien, un de nos objectifs a été de développer un test de criblage pour identifier des inhibiteurs des interactions EngA-ribosome. Ces interactions sont modulées par des changements conformationnels d'EngA, qui sont eux-mêmes déclenchés par la fixation de différents nucléotides dans le domaine catalytique. Cependant, les liens entre ces différents changements restent encore méconnus. Nous avons utilisé une approche multi-technique pour étudier ces questions et obtenir des informations utiles pour l’optimisation de notre test de criblage.Des analyses de SAXS et protéolyse limitée ont démontré un changement conformationnel en solution après adition de nucléotides di- ou tri-phosphate. La comparaison des données avec des modèles cristallographiques d'EngA a confirmé la conformation de la protéine liée au GDP. Cependant, la conformation de la protéine liée au GTP ne correspond à aucune structure connue. Des essais d’interaction ont démontré que la fixation de différents nucléotides au niveau des domaines catalytiques régule l’interaction d'EngA avec le ribosome. En outre, les effets des nucléotides se produisent en utilisant des fortes concentrations, ce qui suggère que le rôle d'EngA dans la biogenèse du ribosome peut être contrôlé par la concentration intracellulaire de nucléotides. Les travaux visant la détermination de la structure d'EngA dans sa conformation liée au GTP par cristallographie nous ont permis d’obtenir la structure d’EngA dans différentes formes cristallines. Cependant, ces structures représentent la conformation liée au GDP. L’analyse de l’empilement des cristaux a montré des contacts intermoléculaires conservés qui peuvent stabiliser cette conformation pendant la nucléation. Des mutations spécifiques permettant la rupture de ces contacts peuvent éventuellement aider à promouvoir la cristallisation de conformations alternatives. Des analyses de cryo-microscopie électronique ont débuté afin d’obtenir la structure du complexe EngA:50S de chez B. subtilis. Des résultats préliminaires montrent une carte de densité électronique à 6.4 Å de résolution. L’interprétation de ces résultats est en cours
The development of new therapeutics against bacterial infections has aroused great interest over the last years in the context of drug resistance. The starting-point in the pursuit of new antibiotics for which bacterial resistance mechanisms do not exist is the identification of novel cellular targets. Genetics studies in the early 2000s have identified engA as a conserved bacterial gene whose product is a GTPase that could represent a potential drug target: it is conserved among bacteria, essential for cell survival, and absent in humans.Since EngA acts as an assembly factor for the bacterial ribosome, one of our aims was to develop an assay to screen inhibitors of the EngA-ribosome interactions. These interactions are modulated by EngA conformational changes that are in turn triggered by the binding of different nucleotides to the catalytic G-domain. As the interplay between all these events in bacteria is still not resolved, we have used a multi-technique approach to explore these questions in order to obtain useful information for the setting up of a robust screening assay.SAXS and limited proteolysis showed a conformational change occurring in solution upon addition of either di- or tri-phosphate nucleotides. While model validation analysis confirmed the GDP-bound conformation, the GTP-bound state does not match any known EngA structure. Binding studies have revealed modulation of interactions by different nucleotide-bound states. Furthermore, response to nucleotides occurs at high concentrations, suggesting that the role of EngA in promoting ribosome assembly could be monitored by the intracellular nucleotide concentration. Efforts on identifying the GTP-bound state 3D structure by crystallography have resulted in EngA structures in different crystal forms. Although all the obtained structures represent the GDP-bound state, packing analysis has revealed conserved crystal contacts that can potentially stabilise this conformation during nucleation. Specific mutations aiming at disrupting these contacts may help to promote crystallisation of alternative conformations. Cryo-EM investigation has been initiated in order to obtain the structure of the B. subtilis EngA:50S complex. So far, an electron density map at 6.4 Å resolution has been obtained and its interpretation is underway

La variole est l'un des pires fléaux qu'ait connu l'humanité jusqu'à son éradication en 1980. Il existe aujourd'hui une menace terroriste de réémergence du virus de la variole comme arme biologique. Le manque de moyens thérapeutiques, la faible immunité de la population mondiale depuis l'arrêt de la vaccination antivariolique et les complications post-vaccinales liées à l'utilisation du vaccin réplicatif historique ont conduit ces dernières années à une intensification des recherches pour lutter contre la variole et les autres virus du genre orthopoxvirus. En complément d'assurer la production d'un nouveau vaccin antivariolique répondant aux normes sanitaires actuelles, il est indispensable de développer des molécules antivirales efficaces aux modes d'actions différents, utilisables immédiatement en cas d'attaque terroriste et pour pallier les complications post-vaccinales. L'objectif du travail de thèse est d'explorer de nouvelles stratégies thérapeutiques en ciblant plus particulièrement la réplication du virus de la vaccine, utilisé comme modèle substitutif au virus de la variole. La première stratégie est l'utilisation d'aptamères peptidiques ciblant A20, une protéine centrale du complexe de réplication formant avec l'uracile ADN glycosylase D4 le facteur de processivité pour l'ADN polymérase virale. Ces peptides sont sélectionnés in vivo en double-hybride en levure pour interagir avec une cible protéique et potentiellement l'inhiber. Ainsi nous avons sélectionné un aptamère interagissant avec une région critique de la protéine cible A20 et capable d'inhiber significativement la réplication du virus de la vaccine en culture cellulaire. La seconde stratégie est l'utilisation d'un criblage haut débit de molécules chimiques pour leur capacité à rompre les interactions entre notre cible de choix A20 et deux de ses interacteurs connus, la protéine D4 et la primase/hélicase D5, par une approche basée sur l'utilisation de deux rapporteurs luciférase en levure. Nous avons démontré que deux molécules issues du criblage permettaient l'inhibition significative et spécifique de la réplication de plusieurs orthopoxvirus, in vitro. Ces travaux viennent compléter le faible arsenal thérapeutique disponible destiné à lutter contre les infections à orthopoxvirus
Variola virus (VARV), the etiologic agent of smallpox was responsible of the most devastating infectious disease. Because of successful preventive measures by immunization, the World Health Organization (WHO) declared global eradication of smallpox in 1980. The subsequent discontinuation of vaccination has rendered all children and many adults virtually susceptible to smallpox infection. If variola virus was used in an act of terrorism or warfare it could cause a real catastrophe. So it is essential to develop new antiviral molecules with different mechanisms of action and usable immediately in case of terrorist attack. Here we report the use of two original strategies to identify new effective anti-orthopoxvirus agents targeting specifically the viral replication complex of vaccinia virus (VACV), a valuable surrogate for the smallpox virus. First, through a yeast two-hybrid assay, we have selected peptide aptamers directed against the VACV A20 protein, a central component of the replication complex and shown to form, with the D4 protein, a processivity factor for the viral DNA polymerase. Peptide aptamers are combinatorial protein molecules designed to inhibit the function of target proteins in living cells. We have proved that one selected aptamer interacting with a central region of A20 was able to significantly inhibit viral DNA synthesis and viral production in cell culture. Second, we have performed a high-throughput screening of small molecules to isolate compounds capable of disrupting A20 interaction with either D4, an uracil DNA glycosylase or D5, a DNA-independent nucleoside triphosphatase (NTPase) that contains a helicase domain. The screen is based on an automated dual-luciferase yeast two-hybrid assay, performed in 384-well plates. Among a collection of 27,600 compounds from diverse commercial chemical libraries we have identified two potential inhibitors that exhibit antipoxvirus effect on infected cell culture. These compounds were also found to specifically inhibit DNA replication. Thus, the screening for inhibitors of protein-protein interactions within viral replication complex remains to be a promising strategy for identifying new compounds active against orthopoxvirus infections

Les anticorps monoclonaux anti-tumoraux sont produits en cellules eucaryotes. Pour des raisons de temps et de cout, peu de candidats sont sélectionnés après des tests in vitro pour être produits à large échelle et testés in vivo. Pour tester plus d’anticorps plus rapidement, nous souhaitons produire des fragments variables simple chaine (scFv) chez E. coli. et les coupler à un fragment constant Fc par chimie click pour reconstituer des mimes d’immunoglobulines naturelles. Cette production indépendante des fragments est aussi un outil modulaire permettant de combiner rapidement un grand nombre scFv et de Fc différents.La chimie click est basée sur une réaction spécifique et de haut rendement entre un azide et un cyclooctyne. Les fragments ont donc été fonctionnalisés sur des résidus spécifiques (tags) par des composés chimiques pour introduire ces fonctions à leur extrémité. La première étape a consisté à introduire des tags en C-terminal du scFv anti-HER2 4D5 et en N-terminal du Fc d’IgG1 humaine. Les scFv ont été produits en cytoplasme d’E. coli à hauteur d’au moins 100 mg/L puis oxydés in vitro au sulfate de cuivre. Le fragment Fc a été produit classiquement en cellules humaines. Cinq réactions chimiques ou enzymatiques ont été optimisées et comparées en termes de spécificité et de rendement. La conjugaison d’une amine sur un tag glutamine catalysée par la transglutaminase microbienne a donné les meilleurs résultats. Le scFv a ainsi été dérivé par l’azadibenzocyclooctyne et le Fc par l’azide à hauteur de 60-70%. Lorsqu’ils sont mélangés, ces fragments forment un (scFv)2-Fc et un scFv-Fc avec des rendements globals respectifs de 10-20% et 20-30% après optimisation.Les mélanges scFv + Fc après réaction de chimie click se fixent de la même façon que le (scFv)2-Fc eucaryote au récepteur HER2. Il reste désormais à montrer que leur capacité à inhiber la prolifération d’une lignée exprimant ce récepteur est similaire. L’objectif final est d’obtenir une inhibition de croissance tumorale similaire sur des xénogreffes
Anti-tumoral monoclonal antibodies are currently produced in eukaryotic cells. For cost and time reasons, a limited number of potential candidates are selected after in vitro tests. They are produced at large scale and then tested in vivo. To test more antibodies and more rapidly, we chose to produce single chain variable fragments (scFv) in bacteria, and to couple them to the eukaryotic constant fragment (Fc) thanks to click chemistry to reconstitute immunoglobulin-like compounds. For a given cost, this enables to produce and test in vivo a larger number of clones. This independent production of fragments is also a flexible tool allowing the combination of different Fc isotypes/allotypes with different scFvs.Click chemistry is based on a specific and high-yield reaction between and azide and a cyclooctyne. Therefore, antibody fragments were functionalised on specific residues (tags) by chemical linker so that each part will contain one of these chemical moieties at their extremity. The first step consisted in introducing tags into the anti-HER2 scFv 4D5 C-terminus and human IgG1 Fc N-termini sequences. The scFvs were produced with yields higher than 100 mg/L in the E. coli cytoplasm and in vitro oxidized with copper sulfate. The Fc fragment was classically produced in human cells. Five chemical or enzymatical reactions were optimised and compared in terms of specificity and yield. The coupling between an amine and a glutamine tag catalysed by microbial transglutaminase gave the best results. The scFv fragment was thus functionalised with an azadibenzocyclooctyne and the Fc fragment with an azide at 60-70%. When mixed together, these fragments formed a (scFv)2-Fc and a scFv-Fc with global yields respectively of 10-20% and 20-30% after optimisation.After the click reaction, the scFv + Fc mix binds to the HER2 receptor on the same way as the eukaryotic (scFv)2-Fc in terms of HER2-binding and proliferation inhibition capacity. Now, it must be demonstrated that their proliferation inhibition of a HER2-positive cell line is similar. The final aim is to get a similar tumour growth inhibition on murine xenografts

Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) est l’agent causal de la bactériose vasculaire du riz (BLB), une maladie dévastatrice dans de nombreux pays rizicoles. Chez cette bactérie, les effecteurs de type TAL (Transcription Activator-Like) jouent un rôle majeur dans le pouvoir pathogène. En effet ces effecteurs qui sont secrétés à l’intérieur des cellules eucaryotes hôtes par le système de sécrétion de type III de Xanthomonas agissent comme de véritables facteurs de transcription capables de manipuler le transcriptome de l’hôte via l’induction de gènes spécifiques. L’interaction entre les TALs et le promoteur hôte ciblé est régi selon un code, tel que la région centrale des répétitions des TALs s’associe spécifiquement à sa séquence cible à raison d’une répétition pour un nucléotide. Un TAL peut agir comme une protéine de virulence via l’induction de gènes dits de sensibilité (S) dont l’activation est nécessaire au développement de la maladie, et comme protéine d’avirulence via l’induction d’un gène dit exécuteur (E), dont l’activation promeut les réponses de défense de la plante. L’objectif de cette thèse était d’identifier et de caractériser de nouvelles sources de résistance dépendants des effecteurs de type TAL pour contrôler la BLB. Chez le riz, les gènes de sensibilité à Xoo les mieux caractérisés sont ceux du clade III de la famille SWEET des transporteurs de sucres. L’un d’entre eux, OsSWEET14, est particulièrement important puisqu’il est ciblé par 4 effecteurs TALs différents et issus de souches de Xoo appartenant à des lignées génétiques distinctes et d’origines géographiques différentes. Partant du constat de la convergence pour l’induction de ce gène S majeur, un crible moléculaire du promoteur de OsSWEET14 a été réalisé dans le but d’identifier du polymorphisme pouvant affecter la liaison TAL-ADN et en conséquence entrainer une perte de sensibilité. Ces travaux ont permis l’identification du gène xa41(t) qui confère une forme de résistance récessive et à large spectre contre Xoo. Dans une seconde partie, le criblage phénotypique d’une centaine de variétés de riz résistantes à la souche africaine de Xoo MAI1 a permis d’identifier cinq TALs agissant comme des protéines d’avirulence. C’est le cas des effecteurs Tal2 et Tal9 qui provoquent spécifiquement une réaction de résistance sur la variété de riz IR64 dont le génome a été séquencé. Des analyses de type RNAseq ont été réalisées et ont permis d’identifier une dizaine de gènes exécuteurs E candidats expliquant potentiellement la résistance de IR64 à la souche de Xoo MAI1. Finalement, une troisième stratégie a été menée dans le cadre d’un projet collaboratif, visant à démontrer que PiCO39 conférant la résistance du riz au champignon pathogène Magnaporthe oryzae pouvait aussi contrôler les bactérioses vasculaire et à stries foliaires. Pour ce faire, des TAL artificiels (dTALE) ont été dessinés pour induire spécifiquement l’expression de la construction de M. oryzae AVR1-CO39 dans des riz transgéniques résistant (PiCO39) et sensible (pico39). Nos données montrent que l’induction de AVR1-CO39 par Xoo ou Xoc conduit de manière PiCO39-dépendante à une réduction spectaculaire des symptômes. Ceci démontre que les réactions de défense induites par un gène de résistance à M. oryzae sont également fonctionnelles contre X. oryzae, ouvrant de nouvelles perspectives originales quant aux stratégies de contrôle des bactérioses dues à Xanthomonas
Bacterial blight caused by Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) is the most destructive bacterial disease of rice. Xoo pathogenicity critically depends on the TAL (Transcription Activator-Like) effectors. TALs are type three effectors secreted through a type three secretion system into the eukaryotic cell where they act as transcription factors able to manipulate the host transcriptome via the induction of specific genes. DNA-binding specificity involves a unique central repeated region in the TAL effector whereby each repeat directly binds to one single nucleotide. TALs can act as major virulence effector thtough the induction of so-called susceptibility (S) genes that are essential for disease development, or act as avirulence effector by inducing so-called executor (E) resistance genes that promote host defense responses. The goal of this PhD project was to identify and characterize novel TAL-dependent resistance sources to control BLB. In rice, the best characterized S genes are those of the clade III of the sugar transporters SWEET family. The most important is OsSWEET14 as this gene is targeted at unrelated DNA boxes by four TAL effectors, which belong to strains of different lineages and geographic origins. The evolutionary convergence for the induction of SWEET14 reflects its crucial role as major determinant of rice susceptibility to Xoo. A molecular screening of the OsSWEET14 promoter was performed using the natural diversity of wild African rice in order to identify polymorphism that could affect the TAL/DNA binding and thus lead to loss of susceptibility. This work allowed the identification of xa41(t) that confers broad spectrum recessive resistance to Xoo. In a second part of my PhD project, a phenotypic screen for resistance against the Xoo African strain MAI1 of a hundred of rice accessions enabled to identify five TALs. Among them, Tal2 and Tal9 were shown to trigger resistance on the rice variety IR64 the genome of which is fully sequenced. RNAseq analysis identified a small set of resistance E gene candidates underlying potentially IR64 resistance against Xoo strain MAI1. Finally, as a third strategy we aimed within a collaborative project to investigate if PiCO39 that confers resistance of rice towards Magnaporthe oryzae could also control BLB and BLS (Bacterial leaf streak). To that end, Artificial TAL effectors (dTALe) were designed to induce specifically the M. oryzae AVR1-CO39 construct in resistant (PiCO39) and susceptible (piCO39) transgenic backgrounds. We show that the induction of AVR1-CO39 by Xoo or Xoc drastically impairs bacterial colonization in a PiCO39-dependent manner, highlighting the potential of exploiting rice blast or other resistance genes as novel strategies to control rice pathogenic Xanthomonas bacteria

Toxoplasma gondii, parasite digestif des Félidés, est l'agent de la toxoplasmose, maladie pouvant être grave voire mortelle en cas d'infection fœtale ou chez l'immunodéprimé. Les traitements actuellement disponibles permettent de prévenir ou traiter la plupart des cas, mais peuvent présenter un risque d'effets indésirables relativement sévères et ne permettent pas de détruire les kystes responsables de l'infection chronique et du risque de réactivation chez l'immunodéprimé. Les aminoacyl-ARNt synthétases (aaRS) sont des enzymes essentielles au mécanisme de traduction, où elles participent au chargement d'un acide aminé sur une molécule dédiée d'ARN de transfert, une étape initiale du processus de synthèse protéique. Un gène codant une protéine homologue de p43, un partenaire protéique de certaines aaRS chez les Eucaryotes supérieurs, a été identifié dans le génome de T. gondii. La localisation subcellulaire post-invasion de Tg-p43 montre qu'il ne s'agit pas d'une cytokine sécrétée, contrairement à son homologue humaine ; au contraire, son immunopurification a révélé son association à quatre aaRS, les Méthionyl-, Glutamyl-, Glutaminyl- et Tyrosyl-ARNt synthétases, qui constituent donc le premier complexe multi-aaRS (MARS) décrit chez les parasites Apicomplexes, de localisation exclusivement cytoplasmique. La présence inattendue de la Tyrosyl-ARNt synthétase soulève plusieurs questions sur le plan de l'organisation et de l'assemblage du complexe. Des images de microscopie électronique et des analyses biochimiques soulignent l'hétérogénéité et la structure relâchée du complexe et confirment les récentes données issues des complexes MARS purifiés chez d'autres organismes. L'inactivation du gène Tg-p43 n'induit pas de modifications phénotypiques majeures (capacité d'invasion, prolifération) ni de diminution de la virulence ou de la kystogénèse en modèle murin. Les résultats sur la caractérisation du MARS ont été complétés par une approche thérapeutique. Un criblage in vitro de candidats-médicaments présélectionnés in silico pour inhiber la Glutaminyl-ARNt synthétase toxoplasmique a permis de mettre en évidence un composé parasitostatique, inhibiteur de la croissance des tachyzoïtes, avec une toxicité sur les cellules hôtes in vitro relativement faible. Ce travail de thèse pose les bases moléculaires et structurales du complexe MARS chez T. gondii. Il permet également d'aborder dans une certaine mesure l'histoire évolutive de ce complexe. Sa fonction biologique reste cependant un mystère ; le rôle de Tg-p43 dans le contrôle post-transcriptionnel, voire d'autres fonctions biologiques, est probablement trop subtil pour être mesuré dans nos conditions expérimentales. Le versant thérapeutique de ce travail constitue une étude préliminaire pouvant servir de point de départ pour la recherche de médicaments anti-toxoplasmiques ciblant les aaRS, qui constituent assurément des cibles thérapeutiques intéressantes
Toxoplasma gondii, a parasite of felids gut, is responsible for toxoplasmosis, a disease that can induce severe sequelae or death in the foetus or immune-depressed patients. Currently available treatments can prevent or cure most of the cases, but are at risk for side effects and cannot suppress cysts, which cause the chronic disease and are responsible for disease when the immune status is altered. Aminoacyl-tRNA synthetases (aaRS) are essential for translation, by charging tRNA with cognate aminoacids, a preliminary step of the protein synthesis process.A gene coding for a protein homologous to p43 (which interacts with a subset of aaRSs in higher eukaryotes) was identified in the genome of T. gondii. Following its epitope tagging, we show that Tg-p43 is not secreted nor exported beyond the vacuole as a cytokine, as it is for its human counterpart; however, biochemical analysis of the Tg-p43 interactome reveals four aaRSs as interacting partners, namely Methionyl-, Glutamyl-, Glutaminyl- and Tyrosyl-tRNA synthetases. This is the first description of the multi-aaRS (MARS) complex in the Apicomplexa phylum; it is strictly localized in the parasite cytoplasm. The unexpected presence of the Tyrosyl-tRNA synthetase in the complex raises several questions about how the complex is organised and assembled, and also evolved. Electronic microscopy along with size exclusion chromatography shows heterogeneity and loose structure of the complex, similarly to recent data characterizing higher eukaryotic complexes. Disruption of the complex by knocking-out of the gene Tg-p43 does not induce detectable phenotypic modification, nor alterations of the virulence and cystogenesis in a murine model.Alongside the study on the MARS complex, we used an in silico approach to screen for new compounds to inhibit T. gondii Glutaminyl-tRNA synthetase. We thus identified one parasitostatic compound that was able to significantly slow down parasite growth while having a relatively low in vitro toxicity against the human host cell. The function of the MARS in T. gondii still remains unknown; the role of Tg-p43 in the post-transcriptional control or any other biological function is probably too subtle to be measured under our experimental conditions. However, our data help to some extent to better measure the evolutionary history of the MARS family. The therapeutic side of this work, although preliminary, may serve as a base for anti-T. gondii drug discovery focusing on aaRS inhibitors, which are obviously good candidate targets