Dissertations / Theses on the topic 'Correction génique (CRISPR/Cas9)'

L’édition du génome utilisant CRISPR/Cas9 est récemment apparue comme une stratégie thérapeutique potentielle des maladies génétiques. Pour les mutations dominantes de type gain de fonction, la correction allèle-spécifique pourrait être l'approche la plus appropriée. Ici, nous avons testé l'inactivation ou la correction d'une mutation hétérozygote du gène de la dynamine 2 (DNM2) causant la forme autosomique dominante de la myopathie centronucléaire (CNM). Des ARN-guides tronqués ciblant spécifiquement l'allèle muté ont été testés sur des cellules de patients et des myoblastes d'un modèle murin. L'allèle muté a été ciblé avec succès et des clones ont été obtenus avec inactivation ou correction précise du génome. Les myoblastes Dnm2R465W/+ ont montré une altération de l'endocytose et de l'autophagie. L'inactivation ou la correction allèle-spécifique a normalisé ces phénotypes. L'allèle muté a également été ciblé avec succès dans les muscles de la souris Dnm2R465W/+. Ces résultats illustrent le potentiel de CRISPR/Cas9 à cibler et corriger de manière allèle-spécifique les mutations ponctuelles hétérozygotes de type de gain de fonction
Genome editing with the CRISPR/Cas9 technology has emerged recently as a potential strategy for therapy in genetic diseases. For dominant mutations linked to gain-of-function effects, allele-specific correction may be the most suitable approach. Here we tested allele-specific inactivation or correction of a heterozygous mutation in the Dynamin 2 (DNM2) gene causing the autosomal dominant form of centronuclear myopathies (CNM). Truncated single guide RNAs targeting specifically the mutated allele were tested on cells derived from a mouse model and patients. The mutated allele was successfully targeted in patient fibroblasts and Dnm2R465W/+ mouse myoblasts, and clones were obtained with both precise genome correction or inactivation. Dnm2R465W/+ myoblasts showed an alteration in transferrin uptake and autophagy. Specific inactivation or correction of the mutated allele rescued these phenotypes. The mutated allele was also successfully targeted in Dnm2R465W/+ mouse muscles. These findings illustrate the potential of CRISPR/Cas9 to target and correct heterozygous point mutations leading to a gain-of-function effect in an allele-specific manner

L’édition du génome utilisant CRISPR/Cas9 est récemment apparue comme une stratégie thérapeutique potentielle des maladies génétiques. Pour les mutations dominantes de type gain de fonction, la correction allèle-spécifique pourrait être l'approche la plus appropriée. Ici, nous avons testé l'inactivation ou la correction d'une mutation hétérozygote du gène de la dynamine 2 (DNM2) causant la forme autosomique dominante de la myopathie centronucléaire (CNM). Des ARN-guides tronqués ciblant spécifiquement l'allèle muté ont été testés sur des cellules de patients et des myoblastes d'un modèle murin. L'allèle muté a été ciblé avec succès et des clones ont été obtenus avec inactivation ou correction précise du génome. Les myoblastes Dnm2R465W/+ ont montré une altération de l'endocytose et de l'autophagie. L'inactivation ou la correction allèle-spécifique a normalisé ces phénotypes. L'allèle muté a également été ciblé avec succès dans les muscles de la souris Dnm2R465W/+. Ces résultats illustrent le potentiel de CRISPR/Cas9 à cibler et corriger de manière allèle-spécifique les mutations ponctuelles hétérozygotes de type de gain de fonction
Genome editing with the CRISPR/Cas9 technology has emerged recently as a potential strategy for therapy in genetic diseases. For dominant mutations linked to gain-of-function effects, allele-specific correction may be the most suitable approach. Here we tested allele-specific inactivation or correction of a heterozygous mutation in the Dynamin 2 (DNM2) gene causing the autosomal dominant form of centronuclear myopathies (CNM). Truncated single guide RNAs targeting specifically the mutated allele were tested on cells derived from a mouse model and patients. The mutated allele was successfully targeted in patient fibroblasts and Dnm2R465W/+ mouse myoblasts, and clones were obtained with both precise genome correction or inactivation. Dnm2R465W/+ myoblasts showed an alteration in transferrin uptake and autophagy. Specific inactivation or correction of the mutated allele rescued these phenotypes. The mutated allele was also successfully targeted in Dnm2R465W/+ mouse muscles. These findings illustrate the potential of CRISPR/Cas9 to target and correct heterozygous point mutations leading to a gain-of-function effect in an allele-specific manner

L'Epidermolyse bulleuse simplex (EBS) est une maladie cutanée principalement causée par des mutations dominantes dans les gènes codant les kératines 5 (KRT5) ou 14 (KRT14). Elle se caractérise notamment par la présence de cloques causées par un décollement de l'épiderme et une inflammation cutanée. D'un point de vue génétique, les mutations vont altérer l'assemblage du réseau de filaments intermédiaires de kératines dans les kératinocytes basaux de l'épiderme et entrainer une cytolyse cellulaire d'où la formation de cloques intra épidermiques. Il n'existe actuellement aucune approche thérapeutique efficace. La compréhension de la maladie et le développement de thérapies, ont été entravées par le manque de modèles cellulaires humains et murins relevant.Ainsi, l'objectif général de ma thèse a consisté à exploiter les propriétés des cellules souches induites à la pluripotence (hiPSc) pour modéliser l'EBS. Dans ce but, nous avons généré des kératinocytes à partir d'hiPSc provenant de patients EBS porteurs de mutations dans le gène KRT5 (Ker-EBS), et de patients sains (Ker-WT). La comparaison des Ker-EBS et Ker-WT nous a permis de montrer que les Ker-EBS récapitulent les principaux phénotypes associés à l'EBS à savoir une diminution de la prolifération cellulaire, une augmentation de la migration cellulaire, une altération des voies de signalisation (ERK et JNK), ainsi que des agrégats de filaments intermédiaires de kératines dans le cytoplasme, tel qu'observé dans kératinocytes primaires de l'EBS. Ces résultats démontrent que notre modèle cellulaire dérivés d'hiPSc est relevant pour l'étude de l'EBS.Afin d'identifier de nouveaux mécanismes moléculaires, une analyse trancriptomique comparant les Ker-EBS aux Ker-WT, a mis en évidence 138 gènes dérégulés, révélant un enrichissement dans les processus liés à la matrice extracellulaire, au packaging de l'ADN et à la réponse inflammatoire. La composante inflammatoire dans l'EBS n'ayant été que peu décrite, la suite de mes travaux a consisté à étudier le phénotype cytokinique pro-inflammatoire. Ainsi, nous avons pu démontrer, une augmentation de l'expression de l'IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-8 (CXCL8), CXCL5, CXCL10, CXCL11, CCL5 dans les Ker-EBS, au niveau ARN en condition basale ou stimulée à l'IFNγ pour mimer un contexte pro- inflammatoire. Seules les chemokines CXCL10 et CXCL11 sont secrétées à forte concentration dans le surnagent de culture des Ker-EBS stimulés ou non, démontrant l'implication de ces cytokines dans l'EBS. En parallèle, afin de s'affranchir des biais notamment dus au fond génétique, au sexe, à l'âge des patients et à l'épigénétique, nous avons généré une lignée de Ker-EBS isogénique (Ker-EBS corrigée) par la technique CRISPR-Cas9. Nous avons ainsi pu démontrer que la lignée de Ker-EBS corrigée montrait une restauration du niveau d'expression des cytokines pro-inflammatoires citées précédemment, à un niveau proche des Ker-WT, confirmant un lien direct entre les mutations du gène KRT5 et la signature pro-inflammatoire. Pour conclure, notre nouveau modèle cellulaire nous a permis de reproduire les phénotypes pathologiques connus dans la littérature et de mettre en évidence une dérégulation de l'expression des cytokines pro-inflammatoire dans l'EBS, notamment CXCL10 et CXCL11. Enfin, l'ensemble de ces résultats font de ce modèle un outil pertinent pour permettre une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires associés à la pathologie, notamment la composante inflammatoire, ce qui ouvre la voie à de nouvelles approches thérapeutiques
Epidermolysis bullosa simplex (EBS) is a skin disorder caused mainly by dominant mutations in genes coding for keratin 5 (KRT5) or 14 (KRT14) genes. It is characterized by the presence of blisters caused by epidermal detachment, and by other complications such as cutaneous inflammation. From a genetic point of view, the mutations will alter the assembly of the keratin intermediate filament network in basal keratinocytes of the epidermis, leading to cell cytolysis and the formation of intra-epidermal blisters. Currently no effective therapeutic approach it is available. Understanding of the disease and the development of therapies have been hampered by the lack and limitations of relevant human cell and mouse models.So, the general aim of my thesis was to exploit the properties of human induced pluripotent stem cells (hiPSc) to modelling EBS. For this purpose, we generate hiPSc-derived keratinocytes from EBS patients carrying KRT5 mutations (Ker-EBS), and from healthy patients (Ker-WT). Comparison of Ker-EBS and Ker-WT enabled to show that Ker-EBS recapitulates the main phenotypes associated with EBS, namely decreased cell proliferation, increased cell migration, altered signalling pathways (ERK and JNK), as well as aggregates of intermediate keratin filaments in the cytoplasm, as observed in primary EBS keratinocytes. These results demonstrate that our hiPSc-derived cell model is relevant for study EBS.In order to identify new molecular mechanisms, a trancriptomic analysis comparing Ker-EBS with Ker-WT revealed 138 deregulated genes, revealing an enrichment in processes linked to the extracellular matrix, DNA packaging and the inflammatory response. As the inflammatory component in EBS has been poorly described, my next step was to study the pro-inflammatory cytokine phenotype. Thus, we were able to demonstrate increased expression of IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-8 (CXCL8), CXCL5, CXCL10, CXCL11, CCL5 in Ker-EBS, at RNA level under basal or IFNy-stimulated conditions to mimic a pro-inflammatory context. Only the chemokines CXCL10 and CXCL11 are secreted at high concentrations in the culture supernatants of stimulated and unstimulated Ker-EBS, demonstrating the involvement of these cytokines in EBS.In parallel, in order to avoid biases due to genetic background, gender, patient age and epigenetics, we generated an isogenic Ker-EBS line (corrected Ker-EBS) using the CRISPR-Cas9 technique. We were thus able to demonstrate that the corrected Ker-EBS line showed a restoration of the expression level of the pro-inflammatory cytokines mentioned above, to a level close to that of Ker-WT, confirming a direct link between mutations in the KRT5 gene and the pro-inflammatory signature.In conclusion, our new cellular model enabled us to reproduce the pathological phenotypes known in the literature, and to demonstrate deregulation of pro-inflammatory cytokine expression in EBS, notably CXCL10 and CXCL11. Taken together, these results make this model a relevant tool to allow a better understanding of the molecular mechanisms associated with the pathology, particularly the inflammatory component, paving the way for new therapeutic approaches

La thérapie génique est une stratégie thérapeutique prometteuse pour le traitement des maladies monogéniques. Si les premières approches, dites additives, ont reposées sur l’utilisation de vecteurs viraux, une part grandissante se tourne désormais vers l’édition génique. Celle-ci est permise par la mise au point de nouvelles générations d’endonucléases, et en particulier le système CRISPR-Cas9. Moins d’une décennie après sa caractérisation, le système CRISPR-Cas9 a permis de faire passer l’édition génique à un stade clinique. Toutefois, dans le même laps de temps, plusieurs interrogations ont été soulevées vis-à-vis de la génotoxicité pouvant être induite par la Cas9. Une littérature émergente pointe le risque de génotoxicité au site ciblé. Le travail de thèse présentée ici s’inscrit dans cette thématique. La première partie de l’étude a eu pour objectif de décrire la génotoxicité induite par une unique cassure double-brin faite par la Cas9. La caractérisation des effets a été faite à la fois à l’échelle nucléotidique, par le suivi de la balance HDR / InDels, mais également à l’échelle du chromosome. Le suivi de l’intégrité chromosomique a permis de mettre en lumière un nouveau risque de génotoxicité encore non-caractérisé. Un système de détection sensible et spécifique de ce risque a été mis au point pour continuer de le caractériser. Le second objectif a été de répondre aux limites soulevées par la génotoxicité non-voulus, en mettant au point une méthode d’édition génique plus sûre et aussi efficace, via l’utilisation d’une unique cassure simple-brin par la Cas9D10A -nickase
Gene therapy is a promising therapeutic strategy for the monogenic diseases treatment. If the first approaches, called additive, have relied on the use of viral vectors, a growing share is now turning to gene editing. Less than a decade after its characterization, the CRISPR-Cas9 system has moved gene editing to a clinical stage. However, in the same period of time, several questions have been raised regarding the genotoxicity that can be induced by Cas9. An emerging literature points to the risk of genotoxicity at the targeted site. The thesis work presented here is part of this theme. The first part of the study aimed to describe the genotoxicity induced by a single double-stranded break made by Cas9. Characterization of the effects was done both at the nucleotide level, by monitoring the HDR / InDels balance, but also at the chromosome scale. The monitoring of chromosomal integrity has brought to light a new risk of genotoxicity that was not characterized. A sensitive and specific detection system for this risk has been developed to further characterize it. The second objective was to address the limitations of unwanted genotoxicity by developing a safer and more efficient gene editing method through the use of a single single-stranded breakage by Cas9D10A-nickase

L’adrénoleucodystrophie liée à l’X (X-ALD) est une maladie neurodégénérative sévère caractérisée par une accumulation d’acides gras à très longue chaîne (AGTLC), conséquence d’un défaut de β-oxydation peroxysomale. La maladie est associée à l’absence de la protéine ABCD1, transporteur ABC du peroxysome qui, tout comme son homologue le plus proche, ABCD2, participe à l’import des AGTLC-CoA au sein du peroxysome, l’unique site de leur dégradation par β-oxydation. La compréhension des mécanismes physiopathologiques est aujourd’hui limitée par le manque de modèles expérimentaux pertinents, cellulaires ou animaux. Puisque le défaut peroxysomal dans la microglie apparait comme un événement pathogénique majeur, nous avons généré des lignées de cellules microgliales incapable de transporter et/ou β-oxyder les AGTLC au sein du peroxysome. Quatre lignées cellulaires microgliales BV-2 déficientes en ABCD1, ABCD2, ABCD1 et ABCD2 ou ACOX1 (l’enzyme limitante de la β-oxydation peroxysomale) ont ainsi été générées par édition génique par CRISPR-Cas9. Ces cellules déficientes présentent d’importants défauts biochimiques, une accumulation d’AGTLC mais aussi des changements des contenus en acides gras et cholestérol. Les analyses ultrastructurales effectuées démontrent l’existence d’importantes inclusions lipidiques et indiquent également une augmentation du nombre de peroxysomes et mitochondries dans ces cellules. Les profils transcriptomiques signalent des altérations de la plasticité de ces cellules microgliales et de leur capacité de reprogrammation métabolique en réponse à un stimulus inflammatoire. Les fonctions de phagocytose ou de présentation antigénique des cellules microgliales semblent être affectées par le défaut peroxysomal. Enfin, les résultats obtenus à l’aide de ces modèles suggèrent que l’altération du métabolisme lipidique peroxysomal modifie l’organisation des membranes cellulaires. Ces lignées cellulaires apparaissent donc comme des modèles prometteurs, d’un grand intérêt pour la compréhension de la physiopathologie et l’identification de cibles thérapeutiques de cette maladie neurodégénérative complexe
X-linked adrenoleukodystrophy (X-ALD) is a severe neurodegenerative disorder characterized by very-long-chain fatty acid (VLCFA) accumulation resulting from a peroxisomal β-oxidation defect. The disease is caused by mutations in the ABCD1 gene, which encodes for a peroxisomal half ABC transporter predicted, like its closest homologue ABCD2, to participate in the entry of VLCFA-CoA into the peroxisome, the unique site of their β-oxidation. Progress in understanding the physiopathogenesis of X-ALD suffers from the lack of appropriate cell and animal models. Since peroxisomal defects in microglia seem to be a key element of the onset of the disease, we generated four microglial cell lines unable to transport and/or β-oxidize VLCFA into the peroxisome. BV-2 microglial cells were engineered with CRISPR-Cas9 to generate four microglial cell lines deficient in ABCD1, ABCD2, both ABCD1 and ABCD2 or ACOX-1 (the first rate-limiting enzyme of the peroxisomal β-oxidation system). Biochemical defects and lipid content changes associated with VLCFA accumulation but also fatty acids and cholesterol changes were identified in deficient microglia. Ultrastructural investigations confirmed cytosolic lipid inclusions and an increased number of peroxisome and mitochondria. Transcriptomic profiles of deficient microglia are indicative of an impaired plasticity and an impaired capacity to operate the metabolic shift required upon an inflammatory stimulation. Peroxisomal defect is likely to affect phagocytosis and antigen presentation capacity of microglia. Peroxisomal lipid metabolism defect is also suggested to modify cell membranes organization. Altogether, these novel mutant cell lines represent a promising model that should permit identification of new therapeutic targets for this complex neurodegenerative disease

Le système CRISPR-Cas9 a révolutionné le monde de la génétique. Il est aujourd’hui utilisé dans de nombreux domaines de recherches comme la médecine, l’agronomie, l’environnement etc. Il commence également à être utilisé en clinique. Cependant, depuis quelques années, de plus en plus d’études soulignent les risques génotoxiques de la nucléase Cas9. Alors que les premières études s’intéressaient au manque de spécificité et aux risques hors cibles du système et que des solutions ont été apportées, les nouvelles constatations pointent du doigt les risques de génotoxicité au locus ciblé. En effet, des risques d’apparition d’insertions/délétions non voulue au locus lors d’expériences d’HDR, d’inversion de séquences, de larges délétions chromosomiques terminales ont été décrits. Le travail de thèse présenté ici a pour but de trouver des solutions contre ces évènements génotoxiques au locus ciblé. Dans un premier temps, nous avons développé des solutions dans les lignées cellulaires, et les cellules souches hématopoïétiques en développant le système nickase, puis nous nous sommes intéressés aux cellules humaines pluripotentes induites avec l’utilisation d’un guide allèle-spécifique. Enfin, nous avons mis au point un système sensible de détection des risques génotoxiques dans des cellules diploïdes immortalisées afin de mieux les caractériser. Bien que très efficace, CRISPR-Cas9 nucléase reste un outil à optimiser. Des contrôles qualités doivent être mis en place pour une utilisation correcte de ce nouvel outil révolutionnaire pour la biologie et ses limites doivent être connues pour mieux les maitriser
CRISPR-Cas9 system has revolutionized genetic world. Nowadays, it is used in various research domains as medicine, agronomy, environment… It is also involved in clinic. However, for a few years, more and more studies have underlined the Cas9 genotoxicity risks. As the first studies focused on the system lack of specificity and on its off-target risks, solutions were brought. Now, new ascertainments emphasize the on-target genotoxic risks. Indeed, non-desired insertions / deletions at the locus in HDR experiments, sequence inversions, large chromosomic truncations were described. The thesis work presented here, aims at finding solutions against these on-target genotoxic risks. In a first time, we have developed solutions in cell lines and hematopoietic stem cells with the nickase system development, and then we have focused on human induced pluripotent stem cells with the use of an allele-specific guide. Finally, we have worked out in sensitive detection genotoxic risks system in immortalized diploid cells to characterized them better. Quality controls must be set up to a correct use of this new biologic revolutionary tool and its limits must be known to controlled them better

L'intérêt de l’utilisation des vecteurs viraux comme le Adeno-Associated Virus recombinant (rAAV) dans la recherche pour le traitement des maladies génétiques a conduit à une évolution rapide des méthodes de production d'AAV au cours des deux dernières décennies (Ayuso et al., 2010). Leur large biodisponibilité in vivo et leur efficacité à long terme dans les tissus postmitotiques en font de bons candidats pour de nombreuses applications de transfert de gènes. En plus, la spécificité du traitement peut être augmentée lorsque le sérotype correct est choisi pour cibler un tissu spécifique. Parmi les méthodes de production actuellement utilisées, la tri-transfection de cellules embryonnaires humaines rénales 293 (HEK293) reste la plus populaire pour l'échelle de recherche; Et la production de rAAV médiée par des baculovirus pour des échelles plus importantes. L'importance croissante des vecteurs viraux dans l'application pratique de la thérapie génique exige l'amélioration des processus de production, en particulier en ce qui concerne les rendements et la pureté du produit final. Mon travail au cours de ces quatre années a été axé sur deux points principaux: (1) améliorer les processus biotechnologiques employés dans la production de rAAV pour la recherche et les échelles d'étude préclinique et (2) tester in vitro et in vivo les applications pour le rAAV dans le l’édition de genome. L'édition de gènes médiée par des nucléases spécialement conçues offre de nouveaux espoirs pour le traitement de plusieurs maladies héréditaires monogéniques. Récemment découvert, le système CRISPR Cas9 (Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats) fournit des outils importants nécessaires pour corriger les mutations par homologie. Notre modèle canonique est la souris mdx, un modèle animal naturel de la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD). Les mutations DMD, qui conduisent à l'absence de protéine dystrophine, entraînent une myopathie progressive et fatale. Plusieurs stratégies, allant des stratégies pharmacologiques aux stratégies de saut-d’éxon, ont tenté de renverser le phénotype et ralentisser la progression de la maladie, mais les résultats ne sont pas encore satisfaisants. Ce nouvel et puissant outil d'édition de génome peut être vectorisé par rAAV. Les résultats de la première partie ont été publiés en 2015 et 2016 et seront présentés sous la forme d'articles et pour la deuxième partie, je présenterai les résultats préliminaires et les perspectives du travail qui se poursuivra dans le laboratoire
The interest of recombinant Adeno-Associated Virus (rAAV) vectors for research and clinical purposes in the treatment of genetic diseases have led to the rapid evolution of methods for AAV production in the last two decades (Ayuso et al., 2010). Their broad in vivo biodistribution and long-term efficacy in postmitotic tissues make them good candidates for numerous gene transfer applications. In addition, the specificity of the treatment can be increased when the right serotype is chosen to target a specific tissue. Among the production methods currently in use, tri-transfection of human embryonic kidney 293 (HEK293) cells remains the most popular for research scale; and rAAV production mediated by baculoviruses for larger scales. The increasing importance of viral vectors in the practical application of gene therapy demands the improvement of production processes, especially when it concerns the yields and purity of the final product. My work during these four years was focused in two main points: (1) improve biotechnological processes employed in rAAV production for research and pre-clinical study scales and (2) test in vitro and in vivo the applications for rAAV in the field of genome editing. Gene-editing mediated by engineered nucleases offers new hopes for the treatment of several monogenic inherited diseases. Recently discovered, the CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) Cas9 system provides important tools needed to correct by homology-directed repair mutations. Our canonical model is the mdx mouse, a naturally occurring animal model of Duchenne Muscular Dystrophy (DMD). DMD mutations, which lead to the absence of the protein dystrophin, results in a progressive and fatal myopathy. Several strategies, from pharmacological to exon-skipping strategies, have attempt to revert the phenotype and slow down the disease progress, however results are not yet satisfactory. This new and powerful genome editing tool can be vectorized by rAAV. Results for the first part were published in 2015 and 2016 and will be presented in the form of articles and for the second part I will present preliminary results and perspectives for the work that will be continued in the lab

L’épidermolyse bulleuse simplex (EBS) fait partie d’un regroupement de maladies héréditaires dont le tissu cible est la peau. Cette maladie dermatologique est causée par une mutation dans les gènes KRT5 ou KRT14, laquelle entraîne un problème au niveau de la formation des filaments intermédiaires de la kératine qui composent la peau. Un mésappariement au niveau des kératines 5 et 14 est responsable de l’apparition des symptômes de la maladie incluant la formation de cloques suite au trauma mécanique que subit la peau. Ces cloques entraînent d’importantes douleurs chez le patient, et de l’inflammation et de l’irritation. Actuellement, aucun traitement curatif n’est disponible pour soulager les patients atteints de la maladie. Depuis quelques années, les chercheurs utilisent des technologies pour modifier directement l’ADN des patients afin de réparer la mutation responsable de l’apparition des symptômes. Des technologies d’édition du génome telles que CRISPR/Cas9 constituent donc une avenue prometteuse pour le traitement de maladies héréditaires monogéniques comme l’EBS. Cette technologie permet de cibler un endroit précis dans le génome par la combinaison d’un ARN guide simple brin et d’une protéine Cas9. La réparation de l’ADN se fait par l’induction d’une coupure double brin de l’ADN par la protéine Cas9 et sa réparation par un fragment d’ADN donneur double ou simple brin. Ce projet a pour objectif principal de corriger les mutations causant l’EBS chez deux patients possédant des mutations hétérozygotes. Plus spécifiquement, ce projet de maîtrise a pour objectif d’optimiser la méthode permettant l’utilisation de CRISPR/Cas9 dans un contexte d’EBS. La technologie CRISPR/Cas9 a été utilisée sur des cellules HEK293T, permettant de démontrer que la Cas9 est en mesure d’induire une coupure double brin de l’ADN au site ciblé dans l’ADN. Ensuite, il a été démontré que la coupure de la Cas9 jumelée à l’utilisation d’un ADN double ou simple brin permet de réparer la coupure en réalisant de la recombinaison homologue. Le séquençage a permis de confirmer ces résultats. À ce jour, les résultats dans les cellules HEK293T se sont montrés concluants et ont permis d’initier les travaux dans les fibroblastes de patients.

La dystrophie Facio-Scapulo-Humérale est caractérisée par une faiblesse musculaire progressive et asymétrique. Elle affecte principalement les muscles faciaux, scapulaires et huméraux. L’association de plusieurs évènements épigénétiques à trois facteurs génétiques de la région subtélomérique du chromosome 4 résulte en un changement dans l’organisation chromatinienne la rendant permissive à l’expression aberrante des gènes de la région 4q35. Les myoblastes DFSH présentent des défauts de différenciation in vitro et des dérégulations dans des voies majeures comme celle de la réponse cellulaire au stress oxydant et de la différenciation myogénique. L’enjeu génétique et épigénétique complexe dans la DFSH et les limitations de la thérapie cellulaire dans son contexte laissent la DFSH jusque-là incurable. Toutefois les avancées dans les thérapies cellulaires et génétiques des myopathies ouvrent des horizons pour de futures applications dans le cadre de la DFSH.Le travail de thèse s’articule autour de trois thématiques. Premièrement, nous démontrons la faisabilité de la correction phénotypique et fonctionnelle des myotubes DFSH in vitro par la fusion de 50% de myoblastes normaux avec des myoblastes DFSH. Ensuite, nous évaluons deux approches d’édition génomique. Dans la première approche, nous ciblons le site de rattachement du chromosome 4 à la matrice nucléaire, FR-MAR avec la protéine CTCF à l’aide du système CRISPR/dCas9 en vue du rétablissement de l’organisation chromatinienne et de la fonction isolatrice de FR-MAR. Dans la deuxième, nous échangeons par translocation les régions homologues 4q35 et 10q26 dans le but de corriger les myoblastes DFSH comme les trois facteurs génétiques du locus 4q35 ne sont pathogéniques que sur un fond génétique lié au chromosome 4. Finalement, nous étudions le rôle du stress oxydant dans la DFSH
Facio-Scapulo-Humeral dystrophy is characterized by progressive and asymmetrical muscle weakness. It mainly affects the facial, scapular and humeral muscles. The association of several epigenetic events with three genetic factors of the subtelomeric region of chromosome 4 results in a chromatin organization modification making it permissive to the aberrant expression of genes in the 4q35 region. FSHD myoblasts exhibit differentiation defects in vitro and dysregulations in major pathways such as the cellular response to oxidative stress and myogenic differentiation. The limitations of cell therapy and the complex genetic and epigenetic interplay in FSHD leave it, till now, incurable. However advances in cellular and genetic therapies of myopathies open up new horizons for future applications in the FSHD context. The thesis work is structured around three themes. First, we demonstrate the feasibility of phenotypic and functional correction of FSHD myotubes in vitro by fusing 50% of normal myoblasts with FSHD myoblasts. Next, we evaluate two genomic editing approaches. In the first one, we target the site of attachment of chromosome 4 to the nuclear matrix, FR-MAR with the CTCF protein using the CRISPR / dCas9 system for the purpose of restoring the chromatin organization and the insulating function of FR-MAR. In the second one, we exchange the homologous regions 4q35 and 10q26 by translocation in order to correct the FSHD myoblasts as the three genetic factors of the 4q35 locus are pathogenic only on a genetic background linked to chromosome 4. Finally, we study the role of the oxidative stress in the FSHD

La dystrophie musculaire est une maladie génétique monogénique récessive liée au chromosome X. Elle atteint 1 garçon sur 3500 naissances mâles. Le garçon atteint de la maladie présente des troubles de la locomotion à l’âge de 3-4 ans et la perd vers l’âge de 11 ans. La mort survient entre 18-30 ans suite à des complications cardio-pulmonaires. Il n’existe pas à ce jour un traitement curatif efficace contre cette grave maladie. Nous avons développé une approche de thérapie génique appelée CRISPR-induced deletion (CinDel) pour corriger le gène DMD muté. Elle utilise deux ARNg qui ciblent les exons précédant et suivant la délétion responsable du décalage du cadre de lecture. La reconnaissance des sites ciblés par les deux ARNg permet le recrutement de la nucléase Cas9 qui génère des coupures double-brin. Les séquences exoniques et introniques situées entre les deux coupures sont ensuite délétées. Les restes des exons sont joints par la recombinaison non homologue (NHEJ) pour produire un exon hybride, rétablir le cadre de lecture et permettre la synthèse d’un edystrophine tronquée ayant une structure correcte des répétitions de type spectrine (Spectrin-Like Repeat: SLR) et des heptades. Cette approche CinDel a été utilisée dans le cadre de ce projet d’abord pour corriger le gène DMD muté dans les myoblastes d’un patient avec une délétion des exons 51-53. Les exons 50 et 54 ont été ciblés avec deux ARNg et la Spcas9 pour produire des coupures double-brin et déléter les séquences situées entre ces deux sites et produire par NHEJ un exon hybride 50-54. L’approche a également permis de corriger in vivo le gène DMD muté dans le modèle animal, la souris transgénique avec un gène DMD humain ayant une délétion de l’exon 52 (del52hDMD) en utilisant un vecteur viralAAV9 contenant le gène SpCas9 et deux ARNgs. Pour vérifier la localisation par rapport au sarcolemme de la dystrophine tronquée avec ou sans une structure correcte des SLR et des heptades, nous avons électroporé les muscles Tibialis anteriorde souris mdx/mdx avec des plasmides codant pour les gènes normal et tronqué de la dystrophine fusionnée avec le gène de l’EGFP. Les résultats de cette expérience montrent que les dystrophines tronquées et normale se localisent correctement sous le sarcolemme. En vue de réprimer efficacement le gène de la SpCas9 et éviter son expression prolongée qui peut être à la base de coupures aléatoires et inattendues (off-target effects) dans le génome, nous avons mis au point une méthode de répression appelée Hara-Kiri moléculaire. Elle utilise la méthode CinDel et consiste à cibler deux régions du gène de SpCas9 avec deux ARNg. Le recrutement de la nucléase permet à celle-ci de couper son propre gène (Hara-Kiri). La séquence située entre les deux sites de coupures est délétée. Par NHEJ, les restes du gène de SpCas9 sont joints en générant un codon stop TAA au point de jonction. Cette approche a permis de réprimer efficacement le gène de SpCas9 in vitro et in vivo
Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) is an X-linked genetically recessive genetic disorder. It affects 1 boy out of 3500 male births. The boy with the disorder presents walking disorders at the age of 3-4 years and loses it around the age of 11. Death occurs around 18-30 years of age from cardiopulmonary complications. To date, there is no effective cure for this serious disease. We have developed a gene therapy approach called CRISPR-induced deletion (CinDel) to correct the mutated DMD gene. It uses two gRNAs that target the exons preceding and following the deletion responsible for the frame shift. The recognition of the target sites by the two gRNAs allows the recruitment of the Cas9 nuclease, which generates double-strand breaks. The exonic and intronic sequences located between the two cuts are then deleted and the remains of the exons are fused by Non-Homologous End Joining (NHEJ) to produce a hybrid exon and restore the reading frame and to allow the synthesis of the truncated dystrophin with correct SLR structure and heptads. The CinDel approach was used in this project to correct the mutated DMD gene in the myoblasts of a patient with a 51-53 deletion. Exons 50 and 54 were targeted by SpCas9 and two gRNAs and to produce double strand breaks, delete the sequences between the two cleavage sites and produce a hybrid exon 50-54 by NHEJ. This restored the normal reading frame and allowed the expression of truncated dystrophin in the patient's myotubes. The approach also made it possible to correct in vivo the mutated DMD gene in the animal model, the transgenic mouse with a human DMD gene having a deletion of exon 52 (del52hDMD) using an AAV9 viral vector containing the SpCas9 gene and two ARNgs. To verify the location with respect to the sarcolemma of truncated dystrophin with or without a correct SLR structure and heptads, we electroporated the Tibialis anterior muscles of mdx/mdx mice with the plasmids encoding the normal or the truncated dystrophin gene fused with the eGFP gene. The results of this experiment show that truncated and normal dystrophins were well localized under sarcolemma. In order to effectively repress the SpCas9 gene and avoid its prolonged expression that may be the basis of random and unexpected (off-target effects) cuts in the genome, we have developed a method of repression called molecular Hara-Kiri. It uses the CinDel method and consists of targeting two regions of the SpCas9 gene with two gRNAs. Recruiting nuclease allows it to cut its own gene (Hara-Kiri). The sequence between the two cleavage sites is deleted. The residues of the SpCas9 gene are then joined by NHEJ generating a TAA stop codon at the junction point. This approach effectively repressed the SpCas9 gene in vitro and in vivo.

La dystrophie Facio-Scapulo-Humérale (FSHD) fait partie des maladies musculaires génétiques les plus fréquentes. Elle se caractérise par une dégénérescence progressive et asymétrique d’un groupe spécifique de muscles striés squelettiques, dont principalement les muscles faciaux, scapulaires et huméraux. D’un point de vue génétique, la FSHD est une maladie multifactorielle qui résulte d’évènements génétiques situés sur la région sub-télomérique du chromosome 4, ainsi que d’évènements épigénétiques altérant l’organisation chromatinienne du locus 4q35. Ces anomalies provoquent une relaxation chromatinienne et une surexpression de la majorité des gènes du locus 4q35, dont DUX4, gène majeur impliqué dans la FSHD. Les répercussions de l’ensemble de ces altérations se traduisent notamment par une dérégulation de la signature transcriptionnelle des myoblastes primaires issus des patients FSHD, et par des anomalies de leur différenciation myogénique in vitro et leur hypersensibilité au stress oxydant. Plusieurs aspects de la maladie demeurent incompris, et la complexité de cette myopathie rend difficile le choix d’une stratégie thérapeutique optimale. Cependant, la découverte des outils de l’édition du génome et la multiplication de leurs applications à visée thérapeutique dans le cadre de maladies humaines, notamment les myopathies, ouvre de nouvelles perspectives pour la FSHD qui reste, jusque-là, incurable.Le travail de thèse a concerné, dans un premier temps, l’implication des dommages de l’ADN et du stress oxydant dans la pathophysiologie de la FSHD. Nous avons mis en évidence l’omniprésence de ces caractéristiques cellulaires dans les myoblastes FSHD, leur lien à l’expression aberrante de DUX4 et leur participation à la morphologie défectueuse des myotubes FSHD in vitro. Dans un second temps, le travail de thèse a consisté à concevoir et à développer des outils de l’édition génomique et épigénomique, capables de cibler spécifiquement un des évènements génétiques causal de la FSHD, le variant pathogénique 4qA161 touchant un site d’attachement à la matrice nucléaire, FR-MAR. A partir de ces outils développés, deux stratégies de corrections génomique et épigénomique à visée thérapeutique peuvent être alors envisagées in vitro, ayant pour but ultime de rétablir la fonction d’insulation de FR-MAR et la conformation chromatinienne de la région 4q35
Facioscapulohumeral dystrophy (FSHD) is one of the most common genetic myopathies characterized by a progressive and asymmetric weakening of a specific group of skeletal muscles, typically facial, shoulder girdle and upper arms muscles. FSHD is a multifactorial disease that results from the combination of genetic and epigenetic events mapped at the 4q35 locus. These genetic and epigenetic alterations lead to chromatin relaxation and the subsequent overexpression of the majority of 4q35 genes, notably DUX4, the major actor in FSHD pathology. These genomic alterations lead to molecular and cellular defects observed in vitro. Cultured-FSHD myoblasts show a distinct transcription profile, they exhibit morphological differentiation defects and are sensitive to oxidative stress. Several aspects of the disease remain poorly understood, and the elaboration of an appropriate therapeutic strategy is limited by the complexity of this myopathy. However, the discovery of genome editing tools and their successful therapeutic applications in vitro and in animal models of several human diseases, including myopathies, open doors to potential therapeutic strategies for FSHD.This work highlighted the involvement of DNA damage and oxidative stress in the pathophysiology of FSHD, by revealing their constitutive presence in FSHD myoblasts, their link to DUX4 expression and their participation in morphological defects of FSHD myotubes observed in vitro. The second part of this work was aimed at developing genome- and epigenome-editing tools capable of specifically targeting one of the genetic events causing FSHD, a pathogenic variant 4qA161 that contains an insulator and a nuclear matrix attachment site (FR-MAR). These engineered tools will be then used to develop in vitro therapeutic strategies, with the intention of restoring the insulator activity of FR-MAR and the chromatin organization of 4q35 locus

Parkinson’s disease (PD) is one of the most common long-term degenerative disorders that affect the nervous system. Clinical symptoms are bradykinesia, resting tremor and postural imbalance due to the loss of dopaminergic neurons in the substantia nigra pars compacta. Heterozygous mutations in the Leucine Rich Repeat Kinase 2 gene (LRRK2) have been identified both in familial and sporadic cases of PD. The most common variant is the p.Gly2019Ser substitution (c.6055G>A). To date there is no effective treatment available. The genome editing tool CRISPR/Cas9 has recently transformed the field of biotechnology and biomedical discovery, posing the basis for the development of innovative treatments. Using CRISPR/Cas9 technology and Homology Directed Repair, our project aims to validate gene editing as an alternative therapeutic approach for PD through the genetic correction of the pathogenic p.Gly2019Ser LRRK2 mutation restoring the wild-type sequence both in human and mouse models. Specifically, we tested various strategies, based on the CRISPR/Cas9-based genome editing technique, for the correction of LRRK2 p.Gly2019Ser (c.6055G>A) variant in primary mouse and human fibroblasts with promising results. If the correction experiments in in vitro models will confirm the good efficiency of the approach, these experiments will represent a fundamental step for the subsequent evaluation of the potential of gene therapy for the treatment of PD as well as other brain disorders for which no therapy is currently available.

L’hyperoxalurie primitive de type 1 (ou HP1) est une maladie héréditaire du métabolisme liée à un déficit en enzyme hépatocytaire AGT (alanine:glyoxylate aminotransférase), codée par le gène AGXT. Ce déficit entraîne, chez les patients atteints d’HP1, une excrétion hépatique accrue d’oxalate ; celui-ci est ensuite éliminé dans les urines où il se complexe avec le calcium pour former des néphrolithiases oxalo-calciques massives, pouvant conduire à une insuffisance rénale chronique. Le seul traitement curatif disponible pour cette pathologie est la greffe allogénique combinée hépatorénale, actuellement limitée par la disponibilité des donneurs de greffons, une morbi-mortalité significative et la nécessité d’un traitement immunosuppresseur au long cours. L’objectif du projet de recherche est de développer une thérapie génique de l’HP1 par greffe de cellules hépatiques autologues génétiquement corrigées. La faible disponibilité et la difficulté d’amplification in vitro des hépatocytes adultes nous a conduit à explorer la piste des cellules souches pluripotentes induites (iPSCs) pour produire des cellules hépatiques humaines utilisables en médecine régénérative. Nous avons dérivé et caractérisé des lignées de cellules iPSCs à partir de fibroblastes de patients atteints d’HP1, après expression transitoire des facteurs de reprogrammation par des vecteurs Sendai. Nous avons développé deux stratégies de thérapie génique additive par insertion d’un minigène codant une séquence optimisée de l’ADNc AGXT au moyen (1) d’un vecteur lentiviral à expression hépato-spécifique et (2) d’un processus de recombinaison homologue au locus AAVS1 facilité par le système de clivage ciblé de l’ADN « CRISPR/Cas9 ». Enfin, nous avons mis en évidence l’expression de la cassette thérapeutique après différenciation hépatocytaire des iPSCs génétiquement corrigées. Ces résultats ouvrent de nouvelles perspectives de médecine régénérative pour l’HP1 par transplantation de cellules hépatocytaires autologues génétiquement corrigées dérivées d’iPSCs de patients
Primary hyperoxaluria type 1 (or PH1) is an inherited metabolic disorder related to the deficiency of the hepatic AGT enzyme (alanine:glyoxylate aminotransferase), which is encoded by the AGXT gene. In PH1 patients, this deficiency leads to oxalate overexcretion by liver, followed by urine filtration and complexation with calcium to form massive calcium-oxalate nephrolithiasis potentially leading to chronic renal failure. The only available curative treatment is combined hepatorenal allogeneic engraftment, which is currently limited by the availability of transplant donors, significant morbidity and mortality, and the need for long-term immunosuppressive treatment. The aim of our research project is to develop gene therapy for PH1, consisting in engraftment of genetically corrected autologous liver cells. Considering that adult hepatocytes are hardly available and expandable in vitro, we chose to explore the use of induced pluripotent stem cells (iPSCs) to produce human liver cells for application in regenerative medicine. We derived and characterized iPSC lines from PH1 patient fibroblasts after transient expression of reprogramming factors delivered by Sendai virus vectors. We developed two additive gene therapy strategies by inserting a minigene encoding an optimized AGXT cDNA sequence using (1) a lentiviral vector designed for liver-specific expression and (2) homologous recombination process at the AAVS1 locus favoured by the targeted DNA cutting system “CRISPR/Cas9”. Finally, we highlighted therapeutic cassette expression after hepatic differentiation of genetically corrected iPSCs. These results pave the way for regenerative medicine for PH1 by transplantation of genetically modified autologous hepatocyte-like cells derived from patient-specific iPSCs

La dyskinésie ciliaire primitive (DCP) est une maladie génétique rare et hétérogène affectant la structure et la fonction des cils motiles. Dans l'épithélium des voies respiratoires, l’altération du mouvement ciliaire entraîne des infections chroniques responsables du déclin progressif et définitif des fonctions pulmonaires. Il n'existe actuellement aucun traitement efficace pour la DCP. Par ailleurs, la recherche de nouvelles thérapies reste limitée par le manque de modèles fiables.Dans ce contexte, les deux objectifs de cette thèse sont : 1) de développer un nouveau modèle in vitro de la DCP basé sur la différenciation dirigée de cellules souches pluripotentes induites (CSPi) en épithélium des voies respiratoires multiciliées, et 2) d'utiliser ce modèle pour étudier le potentiel d'une approche de thérapie génique basée sur la technologie CRISPR/Cas9.Dans ce but, nous avons dérivé deux lignées de CSPi, une d'un individu sain et une seconde d'une patiente atteinte de la DCP contenant des mutations hétérozygotes composites dans le gène CCDC40. En utilisant la lignée « saine » et la technologie CRISPR/Cas9, nous avons généré des contrôles isogéniques knock-out pour trois gènes impliqués dans la DCP incluant CCDC40, DNAH5 et MCIDAS. Parallèlement, la lignée de CSPi dérivée de la patiente a été corrigée à l’aide de la technologie CRISPR/Cas9 et de l'approche de réparation dirigée par homologie. En appliquant à ces lignées cellulaires notre protocole de différenciation préalablement optimisé, nous générons efficacement un épithélium multicilié fonctionnel des voies aériennes récapitulant les phénotypes ciliaires en fonction du génotype. En outre, ce nouveau modèle nous a permis d'étudier le potentiel d'une approche de thérapie génique basée sur la technologie CRISPR/Cas9 pour restaurer le cadre de lecture et de rétablir le phénotype ciliaire dans la lignée DCP.En conclusion, le nouveau modèle développé dans ce travail pourrait représenter un outil majeur pour la modélisation de la DCP in vitro. Ce modèle sera particulièrement intéressant pour étudier directement sur le tissu humain concerné la faisabilité et l'efficacité de thérapies innovantes. Notre pipeline pourrait donc permettre d’accélérer la recherche et le développement de nouvelles thérapies pour la DCP ainsi que d'autres pathologies pulmonaires
Primary Ciliary dyskinesia (PCD) is a rare and heterogeneous genetic disorder affecting the structure and function of motile cilia. In the airway epithelium, impaired ciliary motion results in chronic airway infections responsible for progressive and definitive decline of lung functions. There is currently no effective treatment for PCD, and research is limited by the lack of convenient models to study this disease and investigate innovative therapies.In this context, the main goals of this thesis are: 1) to develop a new in vitro PCD model based on the directed differentiation of patient-derived or genetically-engineered induced pluripotent stem cells (iPSC) into multiciliated airway epithelium, and 2) to use this model to investigate the potential of an innovative CRISPR/Cas9 gene therapy approach.To this aim, we have derived two iPSC lines, one from an healthy individual and a second from a PCD patient harbouring compound heterozygous mutations in the CCDC40 gene. Using the “healthy” iPSC line and the CRISPR/Cas9 technology we have generated isogenic knock-out controls for three PCD genes including CCDC40, DNAH5 and MCIDAS. In parallel, using the CRISPR/Cas9 technology and the homology directed repair approach, we have corrected the patient-derived iPSC line. By applying our optimized differentiation protocol to these cell lines, we are efficiently generating functional multiciliated airway epithelium recapitulating the ciliary phenotypes in function of the genotype. Furthermore, this new model has allowed us to investigate the potential of a CRISPR/Cas9-mediated reframing gene therapy approach to rescue ciliary phenotype in the patient line.In conclusion, the new model developed in this work could represent a major tool for in vitro PCD modelling. This model will be of particular interest for investigating the feasibility and efficacy of personalized therapies directly on the relevant human tissue. Our pipeline could therefore accelerate the development and translation of new therapeutics for PCD and other lung diseases

La génomique chez les bactéries a connu un véritable essor au cours de la dernière décennie grâce aux progrès des méthodes de séquençage de l'ADN. De nouvelles techniques expérimentales sont nécessaires afin de mieux comprendre la fonction des gènes. La découverte des systèmes immunitaires adaptatifs CRISPR-Cas chez les bactéries a conduit au développement de nombreuses technologies pour cibler un acide nucléique de manière séquence-spécifique. En particulier, l’enzyme dCas9 peut être guidée vers une séquence d’ADN par un court ARN nommé sgRNA afin d'inhiber l'expression d'un gène de manière spécifique, un mécanisme nommé CRISPRi. La présente thèse décrit le développement d'une technique de criblage haut-débit basée sur des collections de sgRNAs synthétisées et clonées en parallèle. Nous avons d'abord montré comment cette technique peut être utilisée pour identifier les gènes essentiels chez E. coli. Nous l’avons également utilisée dans le contexte d’une infection par différents bactériophages afin d'identifier les gènes nécessaires à l’infection. Alors que la majorité des études génomiques sont basées sur des souches modèles qui ne représentent pas la diversité de l'espèce, nous avons ensuite adapté un système CRISPRi compatible avec la majorité des isolats d’E. coli ou d’espèces proches. Une collection de sgRNAs ciblant ~3300 gènes conservés d’E. coli a été créée et utilisée dans une collection d'isolats naturels afin de déterminer l’impact de la diversité génétique sur l’essentialité des gènes conservés de l'espèce. Nous avons ainsi montré comment des gènes transférés horizontalement peuvent moduler l'essentialité de gènes conservés. Ces travaux démontrent le potentiel des criblages CRISPRi haut-débit en génomique bactérienne
Advances in sequencing technologies over the past decade have significantly expanded the field of bacterial genomics. In this context, new experimental methods are still required to better understand gene function. The discovery of CRISPR-Cas systems in bacterial adaptive immunity led to the development of a variety of biotechnological tools to target DNA in a sequence-specific manner. In particular, the dCas9 protein can be guided towards a target DNA sequence by short RNAs called sgRNAs to inhibit gene expression in a mechanism called CRISPRi. The present thesis describes the development of a high-throughput screening method based on the pooled synthesis and cloning of sgRNAs libraries. We first showed that CRISPRi screens can confidently predict essential genes in E. coli. We also exploited this method during infection by different bacteriophages to determine which host genes are required for a successful infection. While most genomics studies rely on model strains which fail to represent the genetic diversity of the species, we next developed a CRISPRi platform that is compatible with most isolates from E. coli and closely-related species. A sgRNA library targeting ~3,300 persistent genes from the E. coli species was designed and implemented in a collection of natural isolates to determine the impact of genetic diversity on the essentiality of core genes. We demonstrated how horizontally-transferred genes can modulate core gene essentiality. Altogether, this work shows the potential of high-throughput CRISPRi screens in bacterial genomics

Le poisson-zèbre est devenu un modèle d’étude du cancer de plus en plus répandu au cours des dernières décennies. Alors que la plupart de ces modèles sont générés par l'expression d'oncogènes de mammifères sous des promoteurs tissulaires spécifiques, nous décrivons ici une méthode qui permet un contrôle optique précis de l'activation ou d’inactivation de l’expression de gènes, in vivo, chez le poisson-zèbre. Ainsi, cette méthode permet l’induction de phénotypes tumoraux par l’activation de l’expression constitutive d’un oncogène humain typique, KRASG12V, dans des tissus et des cellules individuelles sélectionnées sans promoteurs tissus-spécifiques, et ce, dans les embryons de poisson-zèbre. Nous démontrons également le contrôle optique de l'expression des oncogènes KRASG12V, CMYC et BRAFV600E ainsi que le contrôle de l’expression et de l’activité du système CRISPR-Cas9. En outre, il convient de noter que la manipulation précise de l'expression des gènes est essentielle pour comprendre la plupart des processus biologiques. De ce fait, notre travail présente une nouvelle approche dont l’objectif est d’initier et d’étudier le cancer chez le poisson-zèbre. De plus, la haute résolution spatio-temporelle de cette méthode en fait un outil précieux pour étudier l'initiation du cancer à partir de cellules uniques
The zebrafish has become an increasingly popular and valuable cancer model over the past decades. While most of these models are generated by expressing mammalian oncogenes under tissue-specific promoters, here we describe a method that allows for the precise optical control of oncogene expression or inactivation in live zebrafish. Thus, this technique allows for the induction of tumor phenotypes by activating the constitutive expression of a typical human oncogene, KRASG12V, in selected tissues and single cells without tissue-specific promoters in live zebrafish. We also demonstrate the optical control of oncogene expression as KRASG12V, CMYC and BRAFV600E as well as the control of the expression and the activity of the CRISPR-Cas9 system. In addition, it should be noted that accurate manipulation of gene expression is essential to understand most biological processes. Therefore, our work presents a novel approach to initiate and study cancer in zebrafish. Finally, it is also worth noting that the high spatio-temporal resolution of this method makes it a valuable tool for studying cancer initiation from single cells

La pomme de terre est une plante de la famille des solanacées qui est cultivée pour ses tubercules. Cet organe de réserve constitue un aliment de base pour de nombreuses populations dans le monde. Il est riche en amidon, un polysaccharide stocké sous forme de grains insolubles dans des organites spécialisés : les amyloplastes. Le métabolisme de l’amidon est complexe et finement régulé par de nombreuses enzymes dont les amidon-synthases. Ces enzymes sont responsables de la création de nouvelles liaisons O-glucosidiques de type α-1,4. Plusieurs isoformes d’amidon-synthases ont déjà été caractérisées chez les plantes (GBSS, SS1, SS2, SS3, SS4 et SS5). De plus, une nouvelle isoforme nommée SS6 (Starch Synthase 6) a récemment été identifiée au laboratoire par analyse protéomique chez la pomme de terre. La génomique fonctionnelle chez la pomme de terre était, jusqu’à récemment, limitée par le caractère tétraploïde et le mode de reproduction uniquement végétatif des variétés cultivées. L’émergence récente de la mutagenèse dirigée et en particulier du système CRISPR/Cas9 lève cette barrière en permettant notamment l’inactivation ciblée de gènes.Dans un premier temps, nous avons séquencé le génome de la variété de pomme de terre tétraploïde Désirée. Cette analyse a révélé un fort polymorphisme intrinsèque. J’ai utilisé ces données pour établir la cartographie des polymorphismes et mettre au point un outil d’assistance au design des cibles lors de l’édition génomique de la pomme de terre. J’ai ensuite caractérisé l’amidon issu de plantes préalablement mutées au locus GBSS par CRISPR/Cas9 et mis en évidence une accumulation de SS2 et GWD dans l’amidon. En conséquence, les contenus en phosphate, notamment en position C6 des résidus de glucose, sont augmentés. Ces résultats ouvrent de nouvelles perspectives dans la compréhension du métabolisme et de l’assemblage des enzymes avec les polysaccharides de l’amidon.Nous avons par ailleurs montré que SS6 est présente chez les dicotylédones à l’exception des Brassicaceae. La version recombinante de la protéine de pomme de terre exprimée chez E.coli est active sur le glycogène et permet l’allongement des glucanes de DP2 à DP5. De plus, la protéine fusionnée avec la GFP et exprimée in planta est localisée dans l’amyloplaste, confirmant les observations initialement faites au laboratoire lors de la caractérisation du protéome associé à l’amidon de pomme de terre. J’ai étudié la fonction de SS6 in planta en produisant des lignées KO pour le gène correspondant par CRISPR/Cas9 et en surexprimant la protéine native sous contrôle du promoteur 35S. La surexpression du gène provoque une diminution du diamètre moyen des grains d’amidon au stade tardif du développement des tubercules suggérant que l’enzyme intervient dans la régulation de la taille et donc supposément du nombre de grains d’amidon. Nous avons de plus observé de légères modifications de la structure de l’amidon dans les lignées knock-out ss6-. En effet, l’amylopectine des lignées mutantes présente une diminution des glucanes de DP6 à DP14 et une augmentation des glucanes de DP15 à DP21. Bien que subtiles, ces modifications corroborent l’activité observée avec la protéine recombinante in vitro. L’inactivation de SS6 pourrait être partiellement compensée par l’activité d’autres amidon-synthases redondantes, comme ceci fut observé dans de nombreux cas et chez de nombreuses espèces. La production de combinaisons de mutations pour SS6 et les autres gènes amidon-synthases permettra de mieux comprendre le rôle de cette enzyme dans le métabolisme de l’amidon de réserve
The potato is a plant of the solanaceae family that is cultivated for its tubers. This reserve organ is a staple food for many populations around the world. It is rich in starch, a polysaccharide stored in the form of insoluble granules in specialized organelles: the amyloplasts. Starch metabolism is complex and finely regulated by many enzymes including starch synthases. These enzymes are responsible for creating new α-1,4-type O-glucosidic bonds. Several isoforms of starch synthases have already been characterized in plants (GBSS, SS1, SS2, SS3, SS4 and SS5). In addition, a new isoform called SS6 (Starch Synthase 6) has recently been identified in the laboratory by proteomic analysis in potato. Functional genomics in potato were, until recently, limited by the tetraploid character and the uniquely vegetative mode of reproduction of cultivated varieties. The recent emergence of site-directed mutagenesis and in particular of the CRISPR/Cas9 system removes this barrier, in particular allowing the targeted inactivation of genes.First, we sequenced the genome of the tetraploid potato variety Désirée. This analysis revealed a strong intrinsic polymorphism. I used this data to map polymorphisms and to develop a target design assistance tool in potato genomic editing. I then characterized the starch from plants previously mutated at the GBSS locus by CRISPR/Cas9 and demonstrated an accumulation of SS2 and GWD in the starch. Consequently, the phosphate contents, in particular at the C6 position of the glucose residues, are increased. These results open new perspectives in understanding the metabolism and assembly of enzymes with starch polysaccharides.We have also shown that SS6 is present in dicotyledons except Brassicaceae. The recombinant version of the potato protein expressed in E.coli is active on glycogen and allows the elongation of glucans from DP2 to DP5. In addition, the protein fused with GFP and expressed in planta is localized in the amyloplast, confirming the observations initially made in the laboratory during the characterization of the proteome associated with potato starch. I studied the function of SS6 in planta by producing KO lines for the corresponding gene by CRISPR/Cas9 and by overexpressing the native protein under the control of the 35S promoter. Overexpression of the gene causes a decrease in the mean diameter of the starch grains at the late stage of tuber development suggesting that the enzyme is involved in the regulation of the size and therefore supposedly the number of starch grains. We also observed slight changes in starch structure in the ss6- knockout lines. Indeed, the amylopectin of the mutant lines shows a decrease in glucans from DP6 to DP14 and an increase in glucans from DP15 to DP21. Although subtle, these changes corroborate the activity observed with the recombinant protein in vitro. Inactivation of SS6 may be partially offset by the activity of other redundant starch synthases, as has been observed in many cases and in many species. The generation of combinations of mutations for SS6 and other starch synthase genes will provide insight into the role of this enzyme in the metabolism of starch storage

Les maladies à triplet sont dues à des expansions de trinucléotides dans l’ADN. Aucun traitement n’existe pour les soigner. Le but de cette thèse est de mettre au point de nouvelles approches de thérapie génique pour supprimer les expansions pathologiques dans le génome humain. Dans une première partie, un système expérimental dans la levure a été construit afin d’évaluer l’efficacité de différentes nucléases associées au système CRISPR sur des microsatellites. La seconde partie est concentrée sur une maladie à triplet en particulier ; la dystrophie myotonique de type 1 (DM1), qui est due à une expansion d’une répétition de triplets CTG dans la région 3’UTR du gène DMPK. Une nucléase, TALENCTG , construite pour induire une cassure double-brin dans les répétitions CTG en 3’UTR du gène DMPK, induit de manière très efficace des contractions de triplets CTG dans la levure. Des événements de contraction ont été observés lorsque cette nucléase est exprimée. Des expériences in vivo dans un modèle de souris contenant un fragment d’ADN génomique humain de patient contenant 1000 CTG ont été menées. Des particules virales AAV recombinantes portant le gène de la TALEN ont été produites. Après injection intramusculaire, les cellules musculaires expriment la nucléase, mais dû à une toxicité ou immunogénicité de la protéine, l’expression est perdue. Enfin, le système mis au point dans la levure a été transposé dans une lignée cellulaire humaine établie, les HEK293FS. Ce système pourra servir à sélectionner des nucléases actives dans les cellules humaines
Microsatellite disorders are a specific class of human diseases that are due to the expansion of repeated sequences above pathological thresholds. These disorders have varying symptoms and pathogenic mechanisms, caused by the expanded repeat. No cure exists for any of these dramatic conditions. This thesis is investigating new gene editing approaches to remove pathological expansions in the human genome. In a first part, a yeast-based screen was constructed to identify potent CRISPR-associated nucleases that can cut these microsatellites. The second part focuses on myotonic dystrophy type 1 (DM1), which is due to and expanded CTG repeat tract located at the 3’UTR of the DMKP gene. A nuclease, TALENCTG was designed to induce a double strand break into the CTG repeats. It was previously shown to be active in yeast cells, inducing contractions of CTG repeats from a DM1 patient integrated into the yeast genome. The TALEN was tested in DM1 patient cells. The nuclease was found to trigger some contraction events in patient cells. In vivo experiments were carried out in a mouse model of myotonic dystrophy type 1 containing a human genomic fragment from a patient and 1000 CTG. Intramuscular injections of recombinant AAV encoding the TALENCTG revealed that the nuclease is toxic and/or immunogenic in muscle cells in the tested experimental conditions. Finally, the reporter assay integrated in yeast to screen nucleases was transposed in HEK293FS cell line. The integrated cassette contains a CTG expansion from a myotonic dystrophy type 1 patient flanked by two halves of GFP genes. This system would enable to find nucleases active in human cells

Rare diseases, when considered as a whole, affect up to 7% of the population, which would represent 3.5 million individuals in the United Kingdom alone. However, while 'personalised medicine' is now yielding remarkable results using recent sequencing technologies in terms of diagnosing genetic conditions, we have made much less headway in translating this patient information into therapies and effective treatments. Even with recent calls for greater research into personalised treatments for those affected by a rare disease, progress in this area is still severely lacking, in part due to the astronomical cost and time involved in bringing treatments to the clinic. Gene correction using the recently-described genome editing technology CRISPR/Cas9, which allows precise editing of DNA, offers an exciting new avenue of treatment, if not cure, for rare diseases; up to 80% of which have a genetic component. This system allows the researcher to target any locus in the genome for cleavage with a short guide-RNA, as long as it precedes a highly ubiquitous NGG sequence motif. If a repair sequence is then also provided, such as a wild-type copy of the mutated gene, it can be incorporated by homology-directed repair (HDR), leading to gene correction. As both guide-RNA and repair template are easily generated, whilst the machinery for editing and delivery remain the same, this system could usher in the era of 'personalised medicine' and offer hope to those with rare genetic diseases. However, currently it is difficult to test the efficacy of CRISPR/Cas9 for gene correction, especially in vivo. Therefore, in my PhD I have developed a novel fluorescent reporter system which provides a rapid, visual read-out of both non-homologous end joining (NHEJ) and homology-directed repair (HDR) driven by CRISPR/Cas9. This system is built upon a cassette which is stably and heterozygously integrated into a ubiquitously expressed locus in the mouse genome. This cassette contains a strong hybrid promoter driving expression of membrane-tagged tdTomato, followed by a strong stop sequence, and then membrane-tagged EGFP. Unedited, this system drives strong expression of membrane-tdTomato in all cell types in the embryo and adult mouse. However, following the addition of CRISPR/Cas9 components, and upon cleavage, the tdTomato is rapidly excised, resulting via NHEJ either in cells without fluorescence (due to imperfect deletions) or with membrane-EGFP. If a repair template containing nuclear tagged-EGFP is also supplied, the editing machinery may then use the precise HDR pathway, which results in a rapid transition from membrane-tdTomato to nuclear- EGFP. Thereby this system allows the kinetics of editing to be visualised in real time and allows simple scoring of the proportion of cells which have been edited by NHEJ or corrected by HDR. It therefore provides a simple, fast and scalable manner to optimise reagents and protocols for gene correction by CRISPR/Cas9, especially compared to sequencing approaches, and will prove broadly useful to many researchers in the field. Further to this, I have shown that methods which lead to gene correction in our reporter system are also able to partially repair mutations found in the disease-causing gene, Zmynd10; which is implicated in the respiratory disorder primary ciliary dyskinesia (PCD), for which there is no effective treatment. PCD is an autosomal-recessive rare disorder affecting motile cilia (MIM:244400), which results in impaired mucociliary clearance leading to neonatal respiratory distress and recurrent airway infections, often progressing to lung failure. Clinically, PCD is a chronic airway disease, similar to CF, with progressive deterioration of lung function and lower airway bacterial colonization. However, unlike CF which is monogenic, over 40 genes are known to cause PCD. The high genetic heterogeneity of this rare disease makes it well suited to such a genome editing strategy, which can be tailored for the correction of any mutated locus.

Notre projet consiste à modéliser une forme spécifique de rétinite pigmentaire (RP) en utilisant des cellules iPS de patients. Nous avons d'abord optimisé un protocole de différenciation pour obtenir à partir de cellules iPS des organoïdes rétiniens avec une organisation structurelle plus proche de la rétine in vivo, permettant une maturation avancée des photorécepteurs. Cet outil nous a permis de récapituler entièrement le phénotype RP (dégénérescence des bâtonnets et des cônes), observé chez les patients présentant une mutation du gène RHODOPSINE, codant pour le pigment visuel. Nous avons ensuite utilisé la même approche pour comprendre la pathogénicité des RP liées à des mutations du gène PRPF31, codant pour un facteur d'épissage. Les organoïdes rétiniens ont résumé la dégénérescence des bâtonnets et la perte secondaire des cônes, observées chez les patients. Les cellules de l'épithélium pigmenté de la rétine présentaient également des défauts organisationnels et fonctionnels. Ces phénotypes dégénératifs rétiniens sont corrélés à un niveau d'expression plus faible de la protéine PRPF31, liant la pathogénicité à un mécanisme d'haploinsuffisance. Nous avons donc développé une stratégie d'augmentation du gène, en apportant une copie fonctionnelle de PRPF31 par CRISPR/Cas9 ou en utilisant un vecteur AAV, qui ont permis le sauvetage de la dégénérescence des cellules rétiniennes
Generation of retinal cells from human iPS cells offers the opportunity to study the effects of specific disease-causing mutations in an in vitro human system. Our project consisted of modeling specific form of Retinits Pigmentosa (RP) using patient iPS cells. We first optimized a differentiation protocol to obtain retinal organoids with a structural organization closer to the retina in vivo, allowing advanced photoreceptor maturation. Using this tool, we were able to fully recapitulate the RP phenotype (degeneration of rods and cones), observed in patients with mutation in RHODOPSINE gene, coding for the visual pigment. Then, we used the same approach to understand the pathogenicity of RP related to mutations in PRPF31 gene, coding for a splicing factor. Retinal organoids summarized the degeneration of mature rods and secondary loss of cones, as observed in patients. Furthermore, PRPF31-mutated retinal pigmented epithelial cells exhibited also structural and functional defective phenotype. These retinal degenerative phenotypes are correlated with a lower level expression of PRPF31 protein, linking causal mutations to an haploinsufficiency mechanism. We thus have developed a gene augmentation strategy, bringing an additional wild type copy of PRPF31 through CRISPR/Cas9 or using an AAV vector, that both allowed the rescue of retinal cell degeneration

Les super-amplificateurs et CTCF sont considérés comme des acteurs centraux de l'organisation du génome ayant un impact direct sur la régulation de l'expression génique. Ici, pour mieux comprendre leur conservation fonctionnelle, des analyses de super-amplificateurs et de CTCF chez le poisson zèbre ont été effectuées. Les super-amplificateurs annotés dans le génome du poisson zèbre présentent une grande spécificité cellulaire et tissulaire. Des analyses de conservation indiquent que les super-amplificateurs n'ont pas une conservation de séquence supérieure à celle des amplificateurs. En limitant l'analyse de conservation de séquence aux super-amplificateurs situés à proximité d'orthologues, il est possible d'identifier un sous-ensemble de super-amplificateurs ayant une conservation de séquence plus élevée que le reste des super-amplificateurs. La comparaison d'expression régulée par les régions constitutives de deux super-amplificateurs associés à des orthologues a permis l'identification de régions fonctionnellement conservées, malgré l'absence de conservation évidente de la séquence d'ADN. Analyses des régions de liaison à CTCF situées dans les promoteurs des gènes indiquent une corrélation entre l'abondance de CTCF et l'expression génique, ce qui pourrait s'expliquer par le blocage du dépôt de nucléosomes dans ces promoteurs
Super-enhancers and CTCF are considered as central players in the organization of mammalian genomes that directly impact the regulation of gene expression. Here, to gain insight into their functional conservation, analyses of super-enhancers and CTCF in zebrafish were performed. Super-enhancers annotated in zebrafish show high cell and tissue specificity, and the main difference identified when compared to mammalian super-enhancers is their distribution relative to transcription start sites. Conservation analyses indicate that super-enhancers do not have higher sequence conservation than typical enhancers. By restricting the analysis to those super-enhancers associated with orthologs, a subset of super-enhancers that have higher sequence conservation than the rest was identified. Comparison of the expression patterns driven by constitutive regions of two of these super-enhancers enabled the identification of regions controlling similar expression patterns in spite of no evident sequence conservation. Analyses of CTCF peaks that overlap promoters indicate a correlation between the abundance of CTCF and gene expression, which could be explained by blockage of nucleosome deposition at those promoters. In summary, these results show evidence of conserved and divergent functions of gene regulators in vertebrates and set a precedent for studies of genome organization in zebrafish

La modélisation de maladies métaboliques hépatiques et les approches de thérapie cellulaire nécessitent de disposer d’une source fiable et illimitée d’hépatocytes. Grâce à leurs propriétés spécifiques, les cellules souches pluripotentes peuvent représenter une telle source. Nous avons tout d’abord mis au point une approche originale pour différencier une lignée de cellules souches embryonnaires humaines européenne, générée en conditions GMP-compatibles, en hépatocytes fonctionnels in vitro et in vivo après transplantation dans un modèle murin d'insuffisance hépatique aiguë. Nous avons ensuite utilisé les cellules souches pluripotentes induites (iPSC) spécifiques d’un patient homozygote pour une mutation entrainant une absence de récepteur des lipoprotéines de basse densité (RLDL) afin de modéliser l'hypercholestérolémie familiale (HF) in vitro. Nous avons amélioré notre approche pour différencier ces iPSC en hépatocytes plus matures et polarisés car les hépatocytes sont les seules cellules capables de dégrader le cholestérol via la bile. Nous avons montré que ce modèle reproduit la physiopathologie de l'HF et établit la preuve de concept de la correction génétique ciblée par la technologie CRISPR/Cas au locus AAVS1 par la restauration de l’expression, inductible par les statines, et de la fonctionnalité du récepteur. Nous avons également mis en évidence que le RLDL ne semble pas impliqué dans l'entrée du virus de l'hépatite C (VHC) mais plutôt dans les étapes tardives de la morphogénèse virale. Ce modèle pourra désormais servir à l’étude physiopathologique de différents patients HF, au criblage de nouvelles drogues hypocholestérolémiantes et antivirales ainsi qu'à de nouvelles approches thérapeutiques
Liver metabolic diseases modeling and cell therapy approaches require a a reliable and well-characterized cell source. Due to their specific properties, pluripotent stem cells represent a credible alternative to primary human hepatocytes. Thus, we have defined a new approach to differentiate a European human embryonic stem cell line, generated in GMP-compatible conditions, into hepatocytes that are functional in vitro and in vivo after transplantation into a murine model of acute liver failure. We have then used induced pluripotent stem cells from a homozygous patient with a mutation leading to an absence of the low-density lipoproteins receptor (LDLR) to model familial hypercholesterolemia type IIA (FH) in vitro. As hepatocytes are the only cells able to metabolize cholesterol into bile acids, we have improved our approach to differentiate these iPSC into hepatocytes displaying cell functional organization and polarization. We have shown that our model reproduced FH physiopathology and have also restored, by the genetic targeted correction at the AAVS1 locus using CRISPR/Cas technology and subsequent hepatocyte differentiation, the LDLR expression – inducible by statins - and functionality. Moreover, we have demonstrated that the LDLR does not seem to be involved in hepatitis C virus entry or replication but rather in viral morphogenesis steps. This model will be useful to develop new cholesterol-lowering and antiviral drugs as well as new cell therapy options. Furthermore, it can be applied to similar studies for other liver metabolic disorders

Trabalho Final do Curso de Mestrado Integrado em Medicina, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, 2020
Drepranocitosis (or sickle cell anemia - SCA) is a genetic hereditary disease that affects millions of people worldwide, bearing significant clinical features and a compromised prognosis with increased recurrences of crisis. Many treatments have been suggested to help dealing with sickle cell anemia, either by reducing and managing the consequences of the disease, or even by trying to solve it (bone marrow transplant). However, until date, there has not been developed a “perfect” therapeutic approach. Gene therapy has been used as the ultimate weapon to treat diseases whose cure cannot be achieved with traditional methods. CRISPR-Cas9 showed to be potentially safer and more efficient in treating SCD than other conventional gene therapies, which is presumed to be a result of the precision of the correction of this tool and the lack of use of viral vectors. Comparing with other available gene-editing techniques, namely zinc finger nucleases (ZFNs) and transcriptional activator-like effector nucleases (TALENs), CRISPR/Cas9 offers some advantages, as well as some limitations and complications. Overcoming these challenges and issues concerning the delivery of such tools to hematopoietic stem cells (HSCs) conserving their engrafting ability, may open the way to available curative approaches for SCD and other hemoglobinopathies
A drepanocitose (ou anemia falciforme) é uma doença genética hereditária que afeta milhões de pessoas em todo o mundo, sendo mais frequente em famílias com ascendência africana. Esta anemia é causada por uma mutação pontual no sexto codão da β-globina que leva à substituição de um ácido glutâmico por uma valina. Tal mutação é responsável pela alteração da forma da hemáciaepela alteração da hemoglobina. Consequentemente, esta torna-se menos solúvel em água e forma precipitados fibrosos, obtendo uma conformação de foice. Esta fragilidade faz com que as hemácias sofram lise com frequência na corrente sanguínea, diminuindo a sua concentração. A hemoglobina é uma proteína tetramétrica composta por dois pares de cadeias de globina, cada uma com o seu grupo heme. Hemácias normais de adultos possuem, maioritariamente, HbA (α2β2), juntamente com pequenas quantidades de HbA2(α2δ2) e hemoglobina fetal (HbF;α2γ2). Cerca de 2 milhões de indivíduos são heterozigóticos para HbS, constituindo uma condição assintomática. Indivíduos homozigóticos para HbS produzem sintomas da anemia falciforme. Nestes indivíduos, quase toda a hemoglobina é HbS. São as propriedades químico-fisiológicas anormais da hemoglobina (HbS –“sickle”) as responsáveis pela doença. A clínica desta patologia inclui crises anemia hemolítica, reticulócitos, e crises vaso-oclusivas, que podem levar a isquémia dos tecidos onde ocorrem. Um aumento do número de crises que necessitem de hospitalização estão associadas a um pior prognóstico e a uma redução da sobrevida, provavelmente devido a lesão crónica de órgãos. A anemia falciforme é endémica nalgumas áreas geográficas, nomeadamente na África Subsariana, devido à sua proteção relativa contra a malária. Anualmente, cerca de 300000 crianças nascem com esta patologia, com uma mortalidade entre 75-90% até aos 5 anos, principalmente devido a doenças infeciosas. É importante salientar que esta proteção relativa contra a malária apenas se verifica em indivíduos heterozigóticos (pois a falciformização das células facilita a sua remoção da circulação sanguínea pelos macrófagos), enquanto que indivíduos homozigóticos estão mais suscetíveis a consequências letais, por exemplo, pela exacerbação da anemia hemolítica e pela reduzida remoção de parasitas (consequência do hiposplenismo funcional). Os tratamentos para esta anemia, atualmente, incluem antibióticos (como a profilaxia com penicilina), vacinação contra Streptococcus pneumoniae, transplante de medula óssea, transfusões de sangue e alguns fármacos que auxiliam no controlo sintomático da doença. A hidroxiureia tem vindo a ser desenvolvida, a qual parece estimular a produção de hemoglobina fetal, prevenindo que as hemácias obtenham a forma de foice. Ao aumentar a concentração de hemoglobina fetal (HbF), que interfere com a formação de HbS, reduz a falciformização das hemácias. Além disso, reduz a inflamação crónica ao diminuir a contagem de neutrófilos. Atualmente, parece ser o melhor tratamento disponível para esta doença. As primeiras técnicas de edição genómica baseavam-se em sistema guiados por proteínas, como os Zinc Finger (ZFNs) e os TALENs (Transcription Activator-Like Effector nucleases). Estas nucleases contêm domínios específicos de ligação a sequências DNA alvo, ligados a um domínio de clivagem de DNA não-específico, o qual induz quebras duplas de cadeias na sequência alvo. As quebras duplas de cadeias são, então, reparadas através de mecanismos de reparação do DNA, estimulando, por exemplo, a recombinação homóloga entre um cromossoma “terapêutico” de DNA e o cromossoma alvo. Recentemente, um novo mecanismo de edição de genoma, o sistema CRISPR/Cas, emergiu como uma alternativa para o tratamento de desordens genéticas. Este sistema usa uma DNA endonuclease guiada por um RNA guia para induzir quebras duplas de cadeias, produzindo o mesmo efeito que as nucleases ZNFs e TALENs, mas possuindo outras vantagens. Ao ser um sistema guiado por RNA, torna-se mais fácil projetar devido à possibilidade de usar uma molécula de RNA complementar ao local preciso de edição genómica, guiando a clivagem. Esta técnica, assim, constitui uma alternativa mais rápida e eficiente que sistemas de edição de genomas guiados por proteínas. Os principais riscos associados às terapias de edição genómica associam-se à possibilidade de ocorrência de mutagénese, caso o gene terapêutico seja inserido noutra parte do genoma diferente do alvo, levando à disrupção do normal funcionamento da célula ao mutar outro gene wild-type. Outro problema associado é o risco de resposta imunes contra os vetores, principalmente se administrados in vivo. Durante décadas, doenças hematológicas como a talassémia e a anemia falciforme têm sido alvo de terapias de edição genómica. No entanto, devido à complexidade da regulação da expressão do gene da globina (devido ao splicing alternativo e à importância dos intrões na regulação deste gene), a utilização destas técnicas tem sido um desafio. Ensaios clínicos de terapia de edição genómica em células estaminais em doentes com talassémia mostraram resultados promissores, com uma correlação entre a eficácia clínica e a eficácia de transferência de genes. Neste trabalho, descrevem-se métodos e resultados alcançados em trabalhos que objetivaram corrigir a mutação causadora da anemia falciforme recorrendo à técnica de CRISPR-Cas9. Sumariamente, procedeu-se à construção de um plasmídeo que contivessea nuclease Cas9 e um RNA guia complementar ao intrão 2 do gene da β-globina HbSe à construção de um vetor dador (terapêutico) que transportava a sequência codificante wild-type do gene da β-globina HbS, flanqueada por dois braços de homologia que irão ter como alvo o intrão 2 do gene. De seguida, procedeu-se à avaliação da eficiência de corte. Após se proceder à cotransfeção para células progenitoras/estaminais hematopoiéticas CD34 + (HSPCs) destes vetores, procedeu-se à avaliação da eficiência desta abordagem, através de técnicas como genotipagem por PCR. Procedeu-se à diferenciação de HSPCs derivadas de pacientes com anemia falciforme em eritrócitos, seguindo-se testes para avaliar a falciformização, mostrando que estas células não eram tão sensíveis à hipoxia e que não adquiriam aforma de foice, contrastando com o controlo de células homozigóticas para HbS. Estes trabalhos mostraram que a utilização da técnica de CRISPR-Cas9 em HSPCs humanas possibilita a correção da mutação HbS (pelo menos num dos alelos), pelo que este método poderá ser utilizado como possível terapia para esta doença. Estudos que utilizaram modelos animais, nomeadamente ratinhos portadores da mutação HbS, mostraram que não só é possível realizara correção da mutação utilizando CRISPR-Cas9, como também que esta técnica parece ser potencialmente mais segura e eficiente comparando com outras técnicas de edição genómica, presumivelmente devido à precisão da correção e ao facto de não recorrer ao uso de vetores virais. Embora existam outras vantagens associadas a esta técnica(como a simplicidade e a facilidade de criação de gRNAs), várias são, também, as limitações que ainda hoje não se conseguiram ultrapassar (nomeadamente a ocorrência de eventos off-site, a baixa taxa de reparação de DNA pela via de reparação homóloga direta em células de mamíferos e a possibilidade de indução de β-talassémia). O futuro da utilização destas técnicas curativas para a anemia falciforme e outras hemoglobinopatias está dependente da capacidade de descobrir técnicas que nos permitam ultrapassar estes desafios e outros problemas relacionados com a entrega destas ferramentas às células hematopoiéticas. Globalmente, a incidência da anemia falciforme tem aumentado, com um foco importante em países como a Nigéria, a República Democrática do Congo e a Índia. Além de ter em conta o potencial que estes novos tratamentos oferecem aos pacientes, é igualmente importante ter noção do enquadramento geral. Nos locais onde a doença é mais prevalente (nomeadamente na África Subsariana), qualquer novo tratamento é praticamente inacessível. Estima-se que, para uma esperança media de vida de setenta anos para um doente com anemia falciforme, que o custo total associado à doença ronde os dez milhões de dólares. Com o aumento da sofisticação das técnicas utilizadas, há, também, um aumento do custo associado. Enquanto fármacos como a hidroxiureia acarretam um custo de aproximadamente 1000 dólares por ano (cerca de 70 000dólaresno total), o transplante de células estaminais e a terapia de edição genómica pode custar mais de 1 000 000 dólares. Embora se verifique uma diferença substancial de valores entre ambos os tratamentos, a terapia de edição genómica parece ser mais custo-efetiva, ao ser um tratamento único com potencial curativo.

A significant fraction of inherited monogenic disorders are caused by patient-specific mutations dispersed over the entire locus of the affected gene. Although correcting these mutations by introducing healthy gene copies into the genome of the diseased cells proved effective in several clinical gene therapy trials and with more advanced vectors safety and efficacy could be improved, insertional mutagenesis and unregulated expression of genes deprived of their endogenous control elements remains a concern when using randomly integrating vectors. As has been shown repeatedly in clinical trials random vector insertions are susceptible to epigenetic silencing and can cause cancer by the activation of adjacent proto-oncogenes. The development of genome editing tools capable of modifying any prespecified genomic sequence with unprecedented accuracy opened up a wide range of new possibilities in gene manipulation including targeted gene repair. In particular, CRISPR/Cas9 system, a prokaryotic adaptive immune system and its swift repurposing for genome editing was widely adopted as the hitherto simplest genome editing tool. In combination with a single guide RNA (sgRNA) the Cas9 endonuclease generates DNA double strand breaks (DSBs) at prespecified genomic loci that are repaired either by homology directed repair (HDR) or nonhomologous end joining (NHEJ). Correction of human disease mutations by this technology has been thus far largely based on homologous recombination requiring an exogenous donor template along with RNA guided (gRNA) Cas9 endonucleases (RGNs). In most applications, RGNs and templates were delivered to the diseased cells by electroporation of several plasmids each expressing one of the functional components needed for targeted gene modification. However, transducing the functional components required for homology directed repair (HDR) on different plasmids and considering that electroporation is quite harmful to the target cells, only a small fraction of the cells survive transfection and even fewer retain all functional components. As a result, the number of gene corrected cells is usually quite low and reduced even further by the inherent bias of the cell's double strand break (DSB) machinery towards NHEJ. This thesis explores the efficiency of gene repair by NHEJ in hematopoietic cells harboring patient specific point mutations in the Cytochrome b-245 heavy chain gene (CYBB) whose inactivation causes chronic granulomatous disease (X-CGD), - a life-threatening immunodeficiency disorder. Although in contrast to HDR, NHEJ is error prone, the present work was based on the theoretical assumption that about, one-third of the insertions/deletions (indels) associated with NHEJ should restore the open reading frame (ORF) disrupted by a particular disease mutation. This would lead to a significant number of ORF reconstitutions of which some, depending on the position and type of the original mutation, should either completely or partially recover protein function. Moreover, donor template free delivery of RGNs on one rather than multiple expression vectors by lentiviral infection was expected to improve gene repair efficiencies and to reduce toxicity of gene transduction. In initial experiments designed to determine the efficiency of gene repair by NHEJ 32D hematopoietic cells expressing four different EGFP reporter transgenes harboring N-terminal frameshift mutations were nucleofected each with Cas9 and corresponding sgRNAs. Consistent with previous genome editing protocols involving transfection, gene repair efficiency was low, ranging from 2.3% to 5.5%. Similar testing was performed in human PLB-985 leukemia cells expressing one copy of a mutationally inactivated EGFP reporter (mEGFP). However, to increase transduction rates and ensure transient RGN expression, the RGNs were delivered by integration defective lentiviruses (IDLVs). Unlike transfection IDLV delivery of RGNs yielded high on-target mutation rates leading to mEGFP repair rates of up to 27%. Collectively, the results demonstrate that mEGFP repair efficiency improved by one order of magnitude after changing the RGN delivery protocol from plasmid nucleofection to IDLV infection. This strategy was tested further in PLB cells harboring bona fide disease mutations. For this, four X-CGD-patient specific CYBB mutations including two frameshift, one nonsense and one missense mutation were individually transduced into CYBB null PLB cells (XCGD-PLB). While subsequent delivery of the corresponding RGNs effectively repaired the frameshift mutations in up to 10% of the treated cells, the repair efficiency of the nonsense and missense mutations was with less than 2% rather ineffective. As about 20 - 25% of most inherited blood disorders are caused by frameshift mutations, the results of this thesis suggest that up to a quarter of all patients suffering from monogenic blood disorders could benefit from a gene therapy employing personalized, donor-template free RGNs.

Dissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia
Machado-Joseph disease (MJD), also known as spinocerebellar ataxia type 3, is a neurodegenerative disorder considered to be the most common form of autosomal dominantly-inherited ataxia in the world. It is a rare disorder, although it has a significative prevalence in some regions of Portugal, especially in the archipelago of Azores. MJD symptoms include a loss of motor coordination and other neurological signs, with the cerebellum being the most affected brain region. MJD arises from an abnormal CAG trinucleotide expansion within the exon 10 of the human ATXN3 gene, which encodes for a protein named ataxin-3 (atxn-3), that bears an aberrant polyglutamine (polyQ) tract in the disease context. The exact biological function of atxn-3 is not fully understood, but it has been described that, when expanded atxn-3 undergoes a toxic gain-of-function that deregulates normal cellular pathways leading to neuronal loss. Recently, it has been suggested that abnormal CAG tracts in mRNA transcripts might also be toxic. As with other polyglutamine diseases, greater numbers of CAG repeats are associated with earlier ages of onset and more severe symptoms.Currently, no therapies capable of delaying or treating the disease are available, and MJD remains a fatal disorder. Many of the therapeutic strategies that have been tested act at a post-transcriptional level, being unable to prevent the putative toxicity of CAG expanded mRNA transcripts. Therefore, new strategies that act at a pre-transcriptional level may be advantageous.However, disease studies can only be robust and feasible when the adequate disease model is used. Yet, the available mouse models used to study MJD either fail to properly mimic the actual genetic context of the disease or are of limited use due to slow and mild symptom progression.In the last decade, the field of gene editing has been thriving. The use of the CRISPR/Cas9 system as a tool for gene editing brought the possibility of performing low-cost, flexible and easy genomic manipulation virtually at any loci. Moreover, CRISPR/Cas9 variants, such as the catalytic inactivated Cas9 (dCas9) have shown promising results regarding gene transcription regulation. In the first part of this work, we planned to establish an in vitro strategy to refine the yeast artificial chromosome (YAC) MJD-Q84.2 mouse, which is the MJD model that best recapitulates the symptoms and the genetic context of the human condition. In this work we proposed to use gene editing tools to overexpand the ATXN3 CAG tract in the exon 10, from 84 to 141 CAG; applying this strategy to the model would be expected to generate a robust mouse model that displayed a more severe phenotype and an earlier disease onset, comparing to the YAC MJD-Q84.2 model. However, the in vitro results here presented, using HEK 293T cells, showed that the strategy used was inefficient at overexpanding the CAG repeats.At the same time, a CRISPR/Cas9-based strategy for correcting the pathogenic ATXN3 gene that could be used to generate isogenic MJD patient-derived cell lines was also tested. The study here presented, using HEK 293T cells, showed that it is possible to integrate a DNA fragment containing 14 CAG repeats plus a selection cassette in the exon 10 of the ATXN3 gene. However, this strategy was not completely infallible, and integration seemed to be independent from Cas9 activity. In the second part of this work, we assessed the effects of dCas9-KRAB as a strategy to pre-transcriptionally silence mutant ATXN3 in a MJD mouse model. In vivo results showed that this approach has a therapeutic potential to improve motor performance in a severely-impaired transgenic mouse model of MJD.
A doença de Machado-Joseph (DMJ), também conhecida por ataxia espinocerebelosa tipo 3, é uma doença neurodegenerativa e a forma mais comum de ataxia hereditária dominante no mundo. É uma doença rara, porém tem uma prevalência significativa em algumas regiões de Portugal, nomeadamente no arquipélago dos Açores. Os sintomas de DMJ incluem perda de coordenação motora bem como outros sinais neurológicos, sendo o cerebelo a região do cérebro mais afetada. A DMJ surge de uma expansão anormal de trinucleótidos CAG no exão 10 do gene ATXN3, que codifica para a proteína ataxina-3 (atxn-3). No contexto da doença, a atxn-3 contém uma sequência de glutaminas (poliQ) anormalmente longa. As funções biológicas da proteína atxn-3 não são totalmente conhecidas, contudo tem sido descrito que a atxn-3 expandida adquire uma função tóxica que desregula o normal funcionamento de diversos sistemas celulares, levando à morte neuronal. Recentemente, tem sido sugerido que tratos CAG anormais presentes em transcritos de mRNA podem também ser tóxicos. Tal como em outras doenças de poliglutaminas, um maior número repetições CAG tem sido associado a sintomas mais severos, com um aparecimento mais precoce.Atualmente, não há terapias capazes de tratar ou atrasar o curso da doença, e, portanto, a DMJ continua a ser fatal. Algumas estratégias terapêuticas que têm sido testadas atuam ao nível pós-transcricional e são por isso incapazes de prevenir os putativos efeitos tóxicos dos transcritos de mRNA que contêm uma cadeia de CAGs expandida. Assim sendo, novas estratégias que atuem a um nível pré-transcricional podem vir a ser vantajosas.O estudo de doenças humanas apenas consegue ser robusto quando é usado um modelo de doença adequado. Porém, os modelos de murganho presentemente usados para estudar a DMJ ou não reproduzem de forma fiel o contexto genético da doença ou apresentam sintomas pouco acentuados e uma progressão lenta que limitam a sua utilização.Na última década, a área da edição genética tem tido desenvolvimentos extraordinários. O uso da CRISPR/Cas9 como uma ferramenta para edição genética trouxe a possibilidade de manipular o genoma virtualmente em qualquer locus, de uma forma barata, fácil e flexível. Além do mais, variantes da CRISPR/Cas9, como é o caso da Cas9 cataliticamente inativa (dCas9), têm mostrado resultados promissores no que diz respeito à regulação da transcrição genética.Na primeira parte deste trabalho pretendemos estabelecer uma estratégia in vitro para aperfeiçoar um modelo de DMJ em murganho designado por yeast artificial chromosome (YAC) MJD-Q84.2, que é considerado como o modelo que melhor recapitula os sintomas e o contexto genético humano em condições de doença. Neste trabalho, utilizámos ferramentas de edição genética para sobreexpandir o trato CAG do exão 10 do gene ATXN3, de 84 para 141 CAGs; ao aplicar esta estratégia ao modelo de murganho seria expectável que se criasse um modelo robusto, com um fenótipo mais severo e em que os sintomas se manifestassem mais cedo em comparação com o já existente modelo YAC MJD-Q84.2. Contudo, os resultados in vitro descritos neste trabalho mostraram que a estratégia usada parece ser ineficiente na sobreexpansão das repetições CAG em células HEK 293T.Paralelamente, usando também a CRISPR/Cas9, foi testada uma estratégia para corrigir o gene ATXN3 mutante, que pudesse ser usada para criar linhas celulares isogénicas derivadas de pacientes de DMJ. O estudo aqui apresentado, usando células HEK 293T, mostrou ser possível integrar um fragmento de DNA contendo 14 repetições do trinucleótido CAG e uma cassete de seleção no exão 10 do gene ATXN3. Contudo, esta abordagem não se mostrou totalmente fiável e que foi detetada integração independente da atividade da Cas9.Na segunda parte deste trabalho foram avaliados os efeitos da dCas9-KRAB como estratégia de silenciamento a nível pré-transcricional do gene humano da ATXN3 num modelo animal de DMJ. Os resultados in vivos mostraram que esta abordagem tem potencial terapêutico, melhorando a performance motora num modelo DJM transgénico severamente afetado.
Outro - This work was funded by the ERDF through the Regional Operational Program Center 2020, Competitiveness Factors Operational Program (COMPETE 2020) and National Funds through FCT (Foundation for Science and Technology) - BrainHealth2020 projects (CENTRO-01-0145-FEDER-000008), ViraVector (CENTRO-01-0145-FEDER-022095), CortaCAGs (PTDC/NEU-NMC/0084/2014|POCI-01-0145-FEDER-016719), SpreadSilencing (POCI-01-0145-FEDER-029716, POCI-01-0145-FEDER-032309) as well as SynSpread, ESMI and ModelPolyQ under the EU Joint Program - Neurodegenerative Disease Research (JPND), the last two co-funded by the European Union H2020 program, GA No.643417; by the National Ataxia Foundation (USA), the American Portuguese Biomedical Research Fund (APBRF) and the Richard Chin and Lily Lock Machado-Joseph Disease Research Fund.

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a severe hereditary disorder caused by a loss of dystrophin, an essential musculoskeletal protein. Decades of promising research have yielded only modest gains in survival and quality of life for these patients and there have been no approved gene therapies for DMD to date. There are two significant hurdles to creating effective gene therapies for DMD; it is difficult to deliver a replacement dystrophin gene due to its large size and current strategies to restore the native dystrophin gene likely require life-long administration of a gene-modifying drug. This thesis presents a novel method to address these challenges through restoring dystrophin expression by genetically correcting the native dystrophin gene using engineered nucleases that target one or more exons in a mutational hotspot in exons 45-55 of the dystrophin gene. Importantly, this hotspot mutational region collectively represents approximately 62% of all DMD mutations. In this work, we utilize various engineered nuclease platforms to create genetic modifications that can correct a variety of DMD patient mutations.

Initially, we demonstrate that genome editing can efficiently correct the dystrophin reading frame and restore protein expression by introducing micro-frameshifts in exon 51, which is adjacent to a hotspot mutational region in the dystrophin gene. Transcription activator-like effector nucleases (TALENs) were engineered to mediate highly efficient gene editing after introducing a single TALEN pair targeted to exon 51 of the dystrophin gene. This led to restoration of dystrophin protein expression in cells from DMD patients, including skeletal myoblasts and dermal fibroblasts that were reprogrammed to the myogenic lineage by MyoD. We show that our engineered TALENs have minimal cytotoxicity and exome sequencing of cells with targeted modifications of the dystrophin locus showed no TALEN-mediated off-target changes to the protein coding regions of the genome, as predicted by in silico target site analysis.

In an alternative approach, we capitalized on the recent advances in genome editing to generate permanent exclusion of exons by using zinc-finger nucleases (ZFNs) to selectively remove sequences important in specific exon recognition. This strategy has the advantage of creating predictable frame restoration and protein expression, although it relies on simultaneous nuclease activity to generate genomic deletions. ZFNs were designed to remove essential splicing sequences in exon 51 of the dystrophin gene and thereby exclude exon 51 from the resulting dystrophin transcript, a method that can potentially restore the dystrophin reading frame in up to 13% of DMD patients. Nucleases were assembled by extended modular assembly and context-dependent assembly methods and screened for activity in human cells. Selected ZFNs had moderate observable cytotoxicity and one ZFN showed off-target activity at two chromosomal loci. Two active ZFN pairs flanking the exon 51 splice acceptor site were transfected into DMD patient cells and a clonal population was isolated with this region deleted from the genome. Deletion of the genomic sequence containing the splice acceptor resulted in the loss of exon 51 from the dystrophin mRNA transcript and restoration of dystrophin expression in vitro. Furthermore, transplantation of corrected cells into the hind limb of immunodeficient mice resulted in efficient human dystrophin expression localized to the sarcolemma.

Finally, we exploited the increased versatility, efficiency, and multiplexing capabilities of the CRISPR/Cas9 system to enable a variety of otherwise challenging gene correction strategies for DMD. Single or multiplexed sgRNAs were designed to restore the dystrophin reading frame by targeting the mutational hotspot at exons 45-55 and introducing either intraexonic small insertions and deletions, or large deletions of one or more exons. Significantly, we generated a large deletion of 336 kb across the entire exon 45-55 region that is applicable to correction of approximately 62% of DMD patient mutations. We show that, for selected sgRNAs, CRISPR/Cas9 gene editing displays minimal cytotoxicity and limited aberrant mutagenesis at off-target chromosomal loci. Following treatment with Cas9 nuclease and one or more sgRNAs, dystrophin expression was restored in Duchenne patient muscle cells in vitro. Human dystrophin was detected in vivo following transplantation of genetically corrected patient cells into immunodeficient mice.

In summary, the objective of this work was to develop methods to genetically correct the native dystrophin as a potential therapy for DMD. These studies integrate the rapid advances in gene editing technologies to create targeted frameshifts that restore the dystrophin gene around patient mutations in non-essential coding regions. Collectively, this thesis presents several gene editing methods that can correct patient mutations by modification of specific exons or by deletion of one or more exons that results in restoration of the dystrophin reading frame. Importantly, the gene correction methods described here are compatible with leading cell-based therapies and in vivo gene delivery strategies for DMD, providing an avenue towards a cure for this devastating disease.

Dissertation